JP2014074041A - 成熟セルトリ細胞およびその使用 - Google Patents

Abstract

【課題】移植細胞に対する免疫反応を軽減するための医薬組成物の提供。
【解決手段】非齧歯類の動物に由来する非新生児セルトリ細胞を含む医薬組成物。該セルトリ細胞は、新生児セルトリ細胞よりも多くのＦａｓＬを発現し、新生児セルトリ細胞よりも強い免疫特権を提供する。いくつかの実施形態において、セルトリ細胞は、生物学的因子を発現するように改変される。他の実施形態において、医薬組成物は、非セルトリ細胞をさらに含む。また、医薬組成物を含む埋め込みデバイス、医薬組成物の作製方法、および効果的な量の組成物の投与による医薬組成物の使用方法を提供する。前記セルトリ細胞がインスリンの様な生物学的因子を発現する様に改変した組成物。更に、前記組成物が非セルリ細胞を含み、該非セルトリ細胞を含み、該非セルトリ細胞がインスリン分泌細胞であるベータ細胞又は、改変肝細胞である。
【選択図】図１Ａ

Description

本願は、２００６年７月２８日出願の米国仮特許出願第６０／８２０，７６０号からの優先権、およびその利益を主張し、参照することにより本明細書に組み込まれる。

本発明は、対象への細胞の投与を伴う治療法、ならびに組織および細胞移植の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、セルトリ細胞に関する。

眼、脳、および睾丸などの体内のいくつかの部位は、免疫反応を制限する、または阻止することができ、それは、免疫特権として既知の現象である。セルトリ細胞は、哺乳動物の睾丸の主要な構成要素を含み、免疫特権の提供に関与する。セルトリ細胞は、生殖細胞の精子への発達において免疫保護し、役立つため、「ナース」または「シャペロン」細胞であると考えられている。免疫特権機能は、生殖細胞が、そうでなければ対象の免疫系により異質であると認識される、細胞表面マーカーを発現するため、生殖細胞にとって重要である。免疫系は、周産期の発達期間中に有能になり、その時点で現存するすべての抗原を「自己」として認識するように「学習」する。生殖細胞は、思春期以降発達するため、免疫系により「自己」として認識されない新規の抗原を発現する。従って、免疫系から生殖細胞を保護するセルトリ細胞の能力がなければ、生殖細胞は破壊されてしまう。

セルトリ細胞における概説に関しては、例えば、Ｓｅｒｔｏｌｉ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＳｋｉｎｎｅｒおよびＧｒｉｓｗｏｌｄ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００５を参照のこと。セルトリ細胞の免疫防御の特性は、広範に研究されているが、免疫特権の正確な機構は、理解し難いままである。証拠によれば、局所性免疫寛容は、セルトリ細胞により産生および／または分泌される因子により、少なくとも部分的に媒介されることが示唆される（Ｂｅｌｌｇｒａｕら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７７：６３０−２、Ｄｅ Ｃｅｓａｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９２）１８６：１６３９−４６；Ｋｏｒｂｕｔｔら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２０００）４３：４７４−８０、Ｓｅｌａｗｒｙら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（１９９１）５２：８４６−５０、Ｓｕａｒｅｚ−Ｐｉｎｚｏｎら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２０００）４９：１８１０−１８、Ｗｙａｔｔ ら、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４：２７−４０）。例えば、セルトリ細胞は、
１）免疫防御特性を有すると考えられる、ＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）としても知られる）（Ｂｅｌｌｇｒａｕら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７７：６３０−２、Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２７０：１１８９−９２１６、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００１）２（１２）：９１７−２４）と、
２）抗炎症性特性を有すると考えられる、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）（Ａｖａｌｌｅｔら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．（１９９４）１３４：２０７９−８７、Ｃｕｐｐら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．（１９９９）１５１：１７−２３、Ｍｅｒｌｙら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（１９９８）６５：８９３−７９９、Ｗａｈｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ（１９８９）１０：２５８−２６１）と、
３）寛容特性を有すると考えられる、クラステリン（Ｂａｉｌｅｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（１９９９）１５１：１７−２３、Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．（１９９７）１８：２５７−６７，Ｌｙｍａｒら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．（２０００）６３：１３４１−５１、Ｊｅｎｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：７１２３−２７）と、を生成することが知られている。

１９９３年に、Ｓｅｌａｗｒｙらは、糖尿病ラットの腎臓被膜下に共移植されたセルトリおよび膵島細胞が無期限に生存し得たことを報告した（Ｓｅｌａｗｒｙ ら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（１９９３）２：１２３−９）。以来、例えば、糖尿病の治療のための膵島と共に、またはパーキンソン病の治療のためのドーパミン組織と共に、セルトリ細胞の共移植等の、セルトリ細胞に関与する細胞療法の開発に、多くの努力が注がれてきた。セルトリ細胞は、同種異系および異種環境に移植されると、再生および自己防衛することができ（Ｂｅｌｌｇｒａｕら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７７：６３０−２、Ｄｕｆｏｕｒら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２００３）１０：５７７−５８６、Ｇｏｒｅｓら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２００３）７５：９１３−１８、Ｓａｐｏｒｔａら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒａｌ．（１９９７）１４６：２９９−３０４、Ｙａｎｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（１９９９）６７：８１５−８２０、Ｋｏｒｂｕｔｔら、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（２０００）４３：４７４−８０）、共移植された同種異系および異種細胞を免疫介在破壊から保護する（Ｄｕｆｏｕｒら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２００３）７５：１５９４−６、Ｋｏｒｂｕｔｔら、，Ｄｉａｂｅｔｅｓ（１９９７）４６：３１７−２２、Ｓａｎｂｅｒｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）１４：１６９２−１６９５、Ｓｅｌａｗｒｙら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（１９９３）２：１２３−９、Ｙａｎｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（１９９９）６７：８１５−２０、Ｉｓａａｃら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．（２００５）３７（１）；４８７−８、Ｗａｎｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．（２００５）３７（１）：４７０−１）ことを示すかなりの量の証拠が、集められている。

齧歯類モデルにおける前述の研究は、性的に成熟した齧歯類から得られたセルトリ細胞を使用した。しかし、より大型の動物モデルにおいて使用されたセルトリ細胞は、恐らく、情報源が豊富に入手可能であるため、新生児動物、例えばブタの睾丸から得られた（例えば、Ｉｓａａｃら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．（２００５）３７（１）：４８７−８、Ｗａｎｇら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．（２００５）３７（１）：４７０−１、Ｄｕｆｏｕｒら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．（２００５）７（５）：１２２４−３１、Ｖａｌｄｅｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２００５）１５３（３）：４１９−２７、Ｄｕｆｏｕｒら、Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２００３）１０（６）：５７７−８６を参照のこと）。

細胞療法一般の新規および改善された方法、特に、セルトリ細胞を使用する方法を開発する必要が、引き続き存在する。

本発明は、セルトリ細胞およびその使用に関する。一実施形態において、本発明は、非齧歯類動物に由来する非新生児セルトリ細胞を含む医薬組成物を提供する。該非新生児セルトリ細胞は、新生児セルトリ細胞よりも多くのＦａｓリガンドを発現し、新生児セルトリ細胞よりも強い免疫特権を提供する。

本発明は、免疫防御特性を増大させた非新生児セルトリ細胞の選択方法を提供する。いくつかの実施形態において、該非新生児セルトリ細胞は、成熟セルトリ細胞である。一実施形態において、該非新生児で非齧歯類のセルトリ細胞は、例えば成豚から得られ得る、ブタ細胞を含む。他の実施形態において、該非新生児で非齧歯類のセルトリ細胞は、生物学的因子、例えば、インスリン等を発現するように改変され得る。

さらなる実施形態において、該医薬組成物はさらに、非セルトリ細胞を含み得る。一実施形態において、非セルトリ細胞は、ベータ細胞等のインスリン分泌細胞である。別の実施形態において、インスリン分泌細胞は、改変肝細胞または他の非インスリン依存のグルコース反応性細胞等の、インスリンを産生するように改変された細胞である。

本発明はまた、該医薬組成物の作製方法および使用方法を提供し、効果的な量の組成物をそれを必要とする対象に投与する方法も含む。いくつかの実施形態において、本発明は、糖尿病の治療方法を提供する。本発明はまた、該医薬組成物を投与するための埋め込みデバイス、および埋め込みデバイスの使用方法を提供する。

本発明のさらなる詳細が、本明細書に開示される。

図１Ａは、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定された、成熟睾丸に対する新生児睾丸の、相対ＣＤ９５Ｌ（ｐＦａｓＬ）ｍＲＮＡ発現レベルを示すグラフである。結果は、４つの異なる新生児睾丸および５つの別の成豚の睾丸に対する統合値を示し、ｃＤＮＡの調製は、各睾丸に対して少なくとも２回繰り返された。すべての発現レベル（循環閾値（Ｃ_Ｔ））は、まず、ベータアクチンの発現レベルに対して、正規化され、新生児睾丸における発現レベルは、１００％で設定された。本実施例において、成熟睾丸におけるＣＤ９５Ｌの発現レベルは、新生児睾丸における発現レベルよりも少なくとも８倍高い。

図１Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ法により測定された、様々な時間にわたり培養されたセルトリ細胞におけるＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）ｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフである。すべての発現レベル（循環閾値（Ｃ_Ｔ））は、まず、ベータアクチンの発現レベルに対して正規化され、２日間の培養後に採取された細胞が、異なる期間にわたって培養された細胞と比較するために、任意に１００％に設定された。高グルコースＤＭＥＭ培地において１０％のウシ血清で培養された培養物中の発現レベル（成豚２日目から成豚２１日目）は、培養期間にわたって増加した。成豚９日目（１０７７）の培養物は、小細胞分離手順を使用して別々に調製され、高グルコースＤＭＥＭ培地で培養された培養物と比較して、ＣＤ９５Ｌ発現の増加を示した。成豚２５日目の培養物は、ＤＭＥＭ高グルコース中の１５％のＦｅｔａｌＣｌｏｎｅＩＩで培養し、ＣＤ９５Ｌ発現の低下を示した。

図２Ａは、フローサイトメトリを使用して測定された、ラット血清におけるラット抗ブタＩｇＧレベルを示すグラフである。血清は、２００，０００の新生児セルトリ細胞に加えて２，０００の膵島細胞、あるいは２００，０００の成熟セルトリ細胞に加えて２，０００の膵島細胞のいずれかでの移植前後の様々な時点でラットから採取された。各試料における蛍光レベルは、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定された。最大蛍光発光波長が算出され、結果は、この最大値の、各実験に実施された対照血清の最大蛍光発光波長に対する比率として示された。本実施例において、より高い蛍光比で示される、抗ブタＩｇＧ抗体レベルは、膵島細胞および成熟セルトリ細胞を移植されたラットからの血清よりも膵島細胞および新生児セルトリ細胞を移植されたラットからの血清の方が高かった。

図２Ｂは、フローサイトメトリを使用して測定された、ラット血清におけるラット抗ブタＩｇＧレベルを示すグラフである。血清は、１１×１０^６の新生児セルトリ細胞に加えて２，０００の膵島細胞、あるいは１１×１０^６の成熟セルトリ細胞に加えて２，０００の膵島細胞のいずれかで、移植前後の様々な時点でラットから採取された。蛍光発光は、上記に記載のように測定された。本実施例において、より高い蛍光比で示される、抗ブタＩｇＧ抗体レベルは、膵島細胞および成熟セルトリ細胞を移植されたラットからの血清よりも膵島細胞および新生児セルトリ細胞を移植されたラットからの血清の方が高かった。

図３Ａは、２，０００の新生豚膵島を非免疫抑制ラットに移植するために使用される室からの、断面の顕微鏡写真である。該室は、移植してから７日後に除去され、切断され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。細胞浸潤物が、本切断面に存在する。

図３Ｂは、２，０００の新生豚膵島に加えて２００，０００の新生豚のセルトリ細胞を非免疫抑制ラットに移植するために使用される移植室からの、断面の顕微鏡写真である。該室は、移植してから７日後に除去され、切断され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。細胞浸潤物が、本切断面に存在する。

図３Ｃは、２，０００の新生豚膵島に加えて２００，０００の成豚のセルトリ細胞を非免疫抑制ラットに移植するために使用される移植室からの、断面の顕微鏡写真である。該室は、移植してから７日後に除去され、切断され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。細胞浸潤物は、本切断面に存在しない。

図４Ａは、２，０００の膵島に加えて２００，０００の新生児セルトリ細胞を非免疫抑制ラットに移植するために使用される、移植室からの断面の顕微鏡写真である。該室は、移植してから１週間後に除去され、切断され、インスリン産生細胞の存在に対して免疫染色された。インスリン産生細胞は、矢印で示される。

図４Ｂは、２，０００の膵島に加えて２００，０００の新生児セルトリ細胞を非免疫抑制ラットに移植するために使用される、移植室からの断面の顕微鏡写真である。該室は、移植してから５週間後に除去され、切断され、インスリン産生細胞の存在に対して免疫染色された。インスリン産生細胞は、矢印で示される。

図５は、２，０００の膵島に加えて２００，０００の成熟セルトリ細胞を非免疫抑制ラットに移植するために使用される移植室からの、断面の顕微鏡写真である。該室は、移植してから６週間後に除去され、切断され、インスリン産生細胞の存在に対して免疫染色された。インスリン産生細胞は、矢印で示される。

図６Ａから６Ｆは、ブタ膵島細胞とブタのセルトリ細胞との様々な組み合わせをラットに移植するために使用される移植室からの、断面の顕微鏡写真である。該室は、移植してから７日後に除去され、切断され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された。図６Ａから６Ｃは、５０倍に拡大されている。図６Ｄから６Ｆは、４００倍に拡大されている。図６Ａおよび６Ｄにおいて、４，０００の膵島細胞が室に移植された。図６Ｂおよび６Ｅにおいて、４，０００の膵島細胞に加えて４００，０００の新生児セルトリ細胞が室に移植された。図６Ｃおよび６Ｆにおいて、４，０００の膵島細胞に加えて４００，０００の成熟セルトリ細胞が室に移植された。矢印は、単核細胞を示し、図６Ｄにおいて最大密度で、図６Ｅにより小さい密度で、図６Ｆにおいては最小密度で存在する。

図７は、４，０００の膵島細胞に加えて４００，０００の成熟セルトリ細胞をラットに移植するために使用される移植室からの、断面の顕微鏡写真である。断面は、免疫組織化学によるインスリン産生細胞に対して染色された。インスリン産生細胞は、矢印で示される濃く染色された細胞として現れている。

図８Ａ〜８Ｆは、ブタ膵島細胞とブタのセルトリ細胞との様々な組み合わせをラットに移植するために使用される移植室からの、断面の顕微鏡写真である。該室は、移植してから４日後に除去され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色（図８Ａ〜８Ｃ）、あるいは、免疫組織化学によるインスリン産生細胞に対して染色された（図８Ｄ〜８Ｆ）。図８Ａ〜８Ｃは、５０倍に拡大されている。図８Ｄ〜８Ｆは、４００倍に拡大されている。図８Ａおよび８Ｄにおいて、４，０００の膵島細胞が室に移植された。図８Ｂおよび８Ｅにおいて、４，０００の膵島細胞に加えて４００，０００の新生児セルトリ細胞が室に移植された。図８Ｃおよび８Ｆにおいて、４，０００膵島細胞に加えて４００，０００の成熟セルトリ細胞が室に移植された。矢印は、インスリン産生細胞を示し、それは、図８Ｄ、８Ｅ、および８Ｆのそれぞれに存在する。

図９Ａ〜９Ｆは、ブタ膵島細胞とブタのセルトリ細胞との様々な組み合わせをラットに移植するために使用される移植室からの、断面の顕微鏡写真である。該室は、移植してから１日後に除去され、免疫組織化学によるインスリン産生細胞に対して染色された。図９Ａ〜９Ｃは、５０倍に拡大されている。図９Ｄ〜９Ｆは、２００倍に拡大されている。図９Ａおよび９Ｄにおいて、４，０００の膵島細胞が室に移植された。図９Ｂおよび９Ｅにおいて、４，０００の膵島細胞に加えて４００，０００の新生児セルトリ細胞が室に移植された。図９Ｃおよび９Ｆにおいて、４，０００の膵島細胞に加えて４００，０００の成熟セルトリ細胞が室に移植された。矢印は、インスリン産生細胞を示し、それは、図９Ｄ、９Ｅ、および９Ｆのそれぞれに存在する。

図１０は、２つの移植室で移植されたラットからのブタインスリン血清のレベルを示すグラフであり、該移植室は、２，０００の新生児膵島細胞および１１×１０^６の成豚のセルトリ細胞をそれぞれ含む。ブタインスリンは、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出された。血清試料は、移植前、移植してから１週間後、および２週間後に得られた。ブタインスリンレベルは、移植後増加した。

図１１Ａは、睾丸から分離した新生豚および成豚のセルトリ細胞からの溶解物のウェスタンブロットを示す。セルトリ細胞は、新生豚および成豚の睾丸から分離され、培養され、溶解された。溶解タンパク質は、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、ＰＶＤＶ膜に移され、抗ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）抗体またはβ−チューブリン抗体で分析された。ウェスタンブロットは、化学発光により発現された。サイズマーカーは、可溶性および膜結合型のＣＤ９５Ｌとして、ウェスタンブロットの側面に示される。成体組織における膜結合型のＣＤ９５Ｌは、新生児組織に見られる移動度と比べて、異なる移動度を有する。

図１１Ｂは、新生および成体の精巣組織からのＰＣＲ増幅ＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）ｃＤＮＡを示す。ＲＮＡは、分離され、ｃＤＮＡに逆転写された。該ｃＤＮＡは、ＧＡＰＤＨあるいはＣＤ９５のいずれかにプライマーを用いて、増幅された。ＰＣＲ生成物は、１２％のアクリルアミド・ゲルに溶解され、エチジウムブロマイドで染色された。ゲルのデジタル画像は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて、帯強度を定量化するために使用された。ＣＤ９５Ｌの発現レベルは、ＧＡＰＤＨ発現レベルに正規化され、新生と成熟との間でセルトリ組織を比較された。この際、ＣＤ９５Ｌは、新生児組織と比較して、成熟組織において少なくとも６倍多く発現した。

発明の詳細な説明
本発明は、一部において、性的に成熟したブタから得られるセルトリ細胞が、新生豚からのセルトリ細胞と比較して、実質的により免疫防御能があるという、意外な発見に基づいている。本発明はさらに、一部において、成熟セルトリ細胞が新生児細胞と比較して、有意により高いＦａｓＬレベルを発現するという、意外な発見に基づいている。従って、成熟セルトリ細胞の使用は、新生児細胞等の非成熟セルトリ細胞の使用に優る利点を提供する。

それ故に、本発明は、非新生児で非齧歯類のセルトリ細胞を含む医薬組成物を提供する。本発明の該セルトリ細胞は、同一種の新生児セルトリ細胞よりも強い免疫特権を提供し得る。

いくつかの実施形態において、該非新生児セルトリ細胞は、ＲＮＡにおいておよび／またはタンパク質レベルで、同一種の新生児セルトリ細胞よりも多くのＦａｓＬを発現する。本発明の該細胞は、ＲＮＡにおいておよび／またはタンパク質レベルで、同一種の新生児セルトリ細胞と比較して、少なくとも５０％多い（例、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上の）ＦａｓＬを発現し得る。

いくつかの実施形態において、本発明は、医薬組成物の作製方法を提供し、非新生児で非齧歯類の動物からセルトリ細胞を分離するステップを含む。例えば、該細胞は、少なくとも１、２、３、６、７、８、９、１２、１８、または２４月齢以上である、非新生豚から分離され得る。

いくつかの実施形態において、該非新生児セルトリ細胞は、成熟セルトリ細胞である。本明細書において、「成熟」とは、細胞が由来するする性的に成熟した雄の検体の年齢を意味する。性的成熟とは、有機体が繁殖し得る段階である。例えば、雄ブタは、６〜９月齢で性的成熟に到達し、雄ラットは、３月齢で性的成熟に到達し、雄マウスは、５〜７週齢で性的成熟に到達する。例示となる実施形態において、該セルトリ細胞は、約１〜２年齢の雄ブタから生じるブタ細胞である。あるいは、本発明の該セルトリ細胞は、いかなる適した発生源、例えば、ウシ、馬、犬、猫、ウサギ、霊長類（ヒトまたは非ヒト（例、サル、チンパンジー））等からも得られ得る。

いくつかの実施形態において、本発明の該セルトリ細胞は、１つまたは双方の特性を有する、即ち、ａ）それらが成熟細胞である、および／またはｂ）それらがより高いレベルのＦａｓＬを発現する。

分離されたセルトリ細胞は、内皮細胞、ライディッヒ細胞等を含む、睾丸に自然に存在する他の細胞型を含み得、多くの場合、実際に含む。従って、本発明の医薬組成物は、睾丸に自然に存在する、故に、セルトリ細胞とともに分離される細胞を含む、非セルトリ細胞をさらに含み得る。

本発明の該セルトリ細胞は、初代細胞またはこのような初代細胞から生じる細胞株であり得る。

本発明の該セルトリ細胞は、例えば、遺伝子操作されて発現する、および任意に、ウイルスまたは生物学的因子を分泌し得る等、遺伝子組み替えをし得る。このような生物学的因子の例は、インスリン、甲状腺ホルモン、ニュートロフィン、第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子等を含む。細胞トランスフェクションおよび細胞形成の方法は、当技術分野において周知である。セルトリ細胞を用いた遺伝子治療法は、例えば、Ｄｕｆｏｕｒら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２００４）１３（１）：１−６およびＴｒｉｖｅｄｉら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２００６）１９８，８８−１００に記載される。

さらに、本発明の医薬組成物は、非睾丸細胞を含み得る。例えば、セルトリ細胞は、別の細胞型とともに培養、および／または移植され得、その細胞型は、該セルトリ細胞の免疫防御効果の恩恵を受ける。このような他の細胞型の特定の例は、自然に生産される、あるいは所望のウイルス、または上記に記載のもの等の生物学的因子を生成するように改変されるものを含む。

本発明の医薬組成物は、緩衝剤、賦形剤、阻害剤、および保存剤等をさらに含み得る。

本発明は、本発明の医薬組成物を含む埋め込みデバイスをさらに提供する。例えば、該デバイスは、例えば米国特許第６，７１６，２４６号に記載のように、哺乳動物に埋め込まれると、繊維カプセルの形成を誘発するように適合され得る。例えば、該デバイスは、可撤性コア（例、機械的に可撤性または分解性）を含む網室を含み得る。該デバイスはまた、対象の体系に細胞の放出を阻止し、防ぐが、可溶性因子の交換を可能にするように構成され得る（例、治療法において形質転換した細胞株を使用する場合、安全性リスクを軽減するため）。

本発明は、医薬組成物および本発明のデバイスの使用方法さらに提供する。このような方法は、効果的な量の組成物を対象（例、非齧歯類の対象、例えばヒト）に投与するステップを含む。該効果的な量は、例えば、疾病または望ましくない状態の少なくともいくつかの側面の進行において、改善、または遅延を生じるものであり得る。

該細胞は、予め埋め込まれたデバイスを用いて、または用いずに対象の部位に投与され得る（例、デバイスで、またはデバイスを用いずに懸濁細胞として）。該細胞は、例えば、腎臓カプセル下、皮膚下、または病変した臓器または組織に直接投与され得る。該セルトリ細胞は、対象に対して、自家、同種異系または異種であり得る。

いくつかの実施形態において、該対象は、２型糖尿病、自己免疫疾患（例、関節リウマチ、狼瘡、１型糖尿病）、神経変性障害および神経障害および疾患（例、パーキンソン病、脊髄損傷）、血友病、または癌等の１つ以上の疾患を有する。さらに、本発明の方法は、臓器または組織の移植と併用して使用され得る。

特定の実施形態において、本発明は、糖尿病の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、投与後、膵島細胞が生存し、インスリンを生成することを可能にする条件下で、本発明のセルトリ細胞および非セルトリインスリン分泌細胞（例、膵島のベータ細胞）を併用投与するステップを含む、方法を提供する。あるいは、セルトリ細胞は、通常、インスリンを生成しないが、それを生成するように改変された細胞（例えば、改変肝細胞または他の非インスリン依存のグルコース反応性細胞、例えば、特定の腸細胞腎臓細胞、およびアルファ細胞等）と共移植され得る。

本発明は、免疫防御特性を増大させた非新生児セルトリ細胞の選択方法をさらに提供する。該方法は、セルトリ細胞により発現されるＦａｓＬの量を決定するステップと、より多くのＦａｓＬ量を発現する細胞を選択するステップと、を含む。ＦａｓＬの発現レベルの決定方法は、当技術分野において周知であり、例えば、ＦＡＣＳ、ＲＴ−ＰＣＲ等を含む。例示方法は、以下の実施例に記載される。

セルトリ細胞の分離方法およびセルトリ細胞を使用する他の方法は、当技術分野において周知であり、具体的な事例となる方法は、下記の実施例に記載される。様々な治療指標および細胞と共に使用されるデバイスを含む、セルトリ細胞の作製方法および使用方法は、特許文献：ＷＯ９５／２８１６７号、ＷＯ９６／２８１７４号、ＷＯ９８／２８０３０号、ＷＯ００／２７４０９号、ＷＯ２０００／０３５３７１号、ＷＯ２００５／０１８５４０号、米国特許第５，７２５，８５４号、米国特許第５，８４３，３４０号、米国特許第５，８４９，２８５号、米国特許第５，９４８，４２２号、米国特許第５，９５８，４０４号、米国特許第６，１４９，９０７号、米国特許第６，３０３，３５５号、米国特許第６，６４９，１６０号、米国特許第６，７１６，２４６号、米国特許第６，７８３，９６４号、米国特許第６，７９０，４４１号、米国特許第６，９５８，１５８号、米国特許公開公報第２００５／０１１８１４５号に記載される。

以下の参考文献は、追加の詳細を提供する。
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以下の実施例は、例証を目的とするものであり、特許請求の範囲に記載されるように本発明を限定しない。
実施例

成豚からのセルトリ細胞は、新生豚からのセルトリ細胞よりも大幅にＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）を多く発現する。
セルトリ細胞培養−分離されたセルトリ細胞は、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含有する、ＤＭＥＭ高グルコース（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中の１０％のＦｅｔａｌＣｌｏｎｅＩＩ、またはＤＭＥＭ高グルコース中の１０％のウシ血清（Ｓｉｇｍａ）で、２５ｃｍ^２のコラーゲンコート培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）に、５×１０^５で、播種された。細胞培養物は、５％のＣＯ_２を含有する、低酸素（５％）、３７℃の加湿された保育器中で維持された。試料は、各継代において３週間採取され、ＣＤ９５Ｌの発現レベルを検査した。

小細胞分離――分離セルトリ細胞（４×１０^８）は、ＤＭＥＭ高グルコース中の１０％のウシ血清を用いて、１７５ｃｍ^２のコラーゲンコートなしのフラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）に培養された。２日後、小（約２〜５μｍ）細胞の鎖が生じ、これらは、標準勾配遠心分離（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７，Ｓｉｇｍａ）を用いて、分離された。分離された細胞は、その後、コラーゲンコート培養フラスコに戻して播種され、上記のようにＣＤ９５Ｌ発現レベルを検査した。

睾丸のＲＮＡ分離―異なる品種（デュロック種（Ｄｕｒｏｃ）および大ヨークシャー種（Ｌａｒｇｅ Ｗｈｉｔｅ）を含む）の１８〜２１日齢の子豚および１〜２年齢の成豚から得た新鮮な睾丸を２つに切断し、中央の薄片面を除去し、重さを量った。均質化は、凍結融解、ならびに細い２３ゲージ針およびＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）を順次通過させることにより、実施された。ＲＮＡは、製造業者の指示によってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて分離された。ＲＮＡは、ベックマンコールター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＤＵ５３０分光光度計上で２６０ｎｍで、定量化された。

リアルタイムＰＣＲ発現プロファイル―リアルタイムＰＣＲは、ＭＸ４０００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、１００ｎｇの逆転写された総細胞ＲＮＡで３重に実施された。つまり、１．５μｇの総細胞ＲＮＡは、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）より指示されるようにランダムヘキサマーを利用する、３０μＬの体積のストラタスクリプト（Ｓｔｒａｔａｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素を用いて、転写された。リアルタイムＰＣＲに関して、ＳＹＢＲ グリーン マスター ミックス キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が、３０μＬの反応体積において、製造業者に従い、すべての反応に使用され、ＲＯＸ基準染料（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含めた。標準化された循環パラメータは、９５℃で１０分、続いて、９５℃３０秒で４０サイクル、６０℃で３０秒、７２℃で１分であった。データは、７２℃で分析のために回収された。プライマーは、２５０ｎＭの最終濃度に添加され、公開された配列からのエキソン−イントロンの境界を越えて設計された以下のセットを含んだ。ブタＦａｓＬは、３つの異なるプライマーセットを用いて以下のように定量化された。ｑＦ１：５’ＡＣＴ ＧＡＡ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ Ｃ（配列番号１）およびｑＲ１： ５’ＧＧＡ ＴＧＧ ＡＴＣ ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＡＧ ＧＣＴ ＴＧＣ Ｃ （配列番号２）、ｑＦ２： ５’ＴＧＡ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＡ ＴＧＧ ＴＴＣ ＴＧＧ ＴＧＧ Ｃ （配列番号３）およびｑＲ２： ５’ＧＣＴ ＴＣＴ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＴＧ ＡＴＴ ＣＴＧ ＴＡＴ ＧＣＣ Ｔ（配列番号４）、ｑＦ３： ５’ＴＣＴ ＴＣＣ ＡＣＣ ＴＡＣ ＡＧＡ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＧＡ ＣＴＧ （配列番号５）およびｑＲ３： ＣＣＡ ＴＴＣ ＣＡＧ ＡＧＧ ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＣＴ ＴＧＡ Ｇ （配列番号６）。生成物は、融解曲線解析により分析された。すべてのプライマーは、単一の生成物を生成し、予測された融解温度と、近く合致した。ベータアクチン発現レベルは、プライマーセット：ＴＴＧ ＣＣＧ ＡＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣ ＡＧＡ ＡＧＧ（転送）（配列番号７）およびＧＡＣ ＡＧＣ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＧＧ ＡＴＧ ＧＡＧ（逆）（配列番号８）を用いて実験と動物との間の発現を正規化するために利用された。

結果
図１Ａは、新生豚または成豚の新鮮な睾丸におけるリアルタイムＰＣＲにより、ＣＤ９５Ｌ（ｐＦａｓＬ）ｍＲＮＡの相対発現を示す。成熟睾丸は、新生児睾丸よりも約８倍高い発現レベルを一貫して示した。リアルタイムＰＣＲは、記載のように実施された。

図１Ｂは、培養されたセルトリ細胞におけるブタＣＤ９５Ｌの相対発現を示す。成豚細胞は、３７℃、５％のＣＯ_２、および５％のＯ_２で高グルコースＤＭＥＭ培地における１０％のウシ血清に培養された（細胞分離に対して、下記の実施例２を参照）。ＣＤ９５Ｌは、培養期間にわたって、有意に増加していることに留意されたい。９日目（１０７７）は、小細胞分離手順（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配）を用いて別個に調製され、７日目にＣＤ９５Ｌ発現において有意な増加を示した。これらのレベルは、２１日目に標準培養物に見られるものと類似していた。２５日目からの細胞（ＦＣＩＩ）は、高グルコースＤＭＥＭにおける１５％のＦｅｔａｌＣｌｏｎｅＩＩに継続して培養され、ＣＤ９５Ｌ発現のほぼ完全な喪失を示した。

成豚のセルトリ細胞を伴うブタ膵島のラットへの相互移植は、新生豚のセルトリ細胞よりも低い抗体反応を生じる。
新生豚の膵島分離
膵臓回復―膵臓が、新生豚の心拍のあるドナーから得られた。非接触手技を用いて一塊切除を行い、膵臓は、４℃で、ハンクス液輸送培地（ＨＢＳＳ輸送培地、０．５％のウシ血清アルブミン、１％のＨＥＰＥＳ緩衝液、および１％のペニシリン−ストレプトマイシン）を含有する滅菌容器に移された。

膵島分離―膵臓は、分割され、継続的な温式の激しい撹拌（１４０ｒｐｍ、３７℃で１５分間）を通じてコラゲナーゼ（２ｍＬ／ｇの膵臓、リベラーゼＰｌ、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）で機械的に消化された。消化された組織は、その後、４５０μｍのステンレス製の網を通して濾された。消化されなかった組織は、１０分間、再度消化させた（残留した組織１ｇあたり１ｍＬのリベラーゼＰｌ）。すべての留分は、複合され、１０００ｒｐｍで、１分間、遠心分離された。ペレットは、その後、ＨＢＳＳ輸送培地中で３回洗浄された。膵島は、０．５％のＢＳＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌのニコチンアミド、１％のペニシリン−ストレプトマイシンで補給されたＲＰＭＩ １６４０培地に培養された。

また、Ｖａｌｄｅｓ−Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｎｅｏｎａｔａｌ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｃｌｕｓｔｅｒｓ．Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．（２００５）１２：２４０−２４４も参照のこと。

新生豚のセルトリ細胞分離
睾丸は、無菌で切除され、滅菌０．９％の生理食塩水のスラッシュを含有する滅菌のステンレス製の瓶に設置された。輸精管および精巣上体は、白膜を損なわないように、睾丸から切り取られた。白膜は、その後、除去され、睾丸組織は、重さを量り、１〜２ｍｍの断片に分割された。組織は、３０〜４０ｍＬのＨＢＳＳ輸送培地と共に、５０ｍＬの遠心分離管に移された。管の内容物は、４回軽く反転させて混合し、次いで、５分間重力により沈殿させた。ピペット上の培地の５ｍＬを除いたすべてが除去され、組織は、４０のガラス球（２ｍｍ）と共に、滅菌された１００ｍＬのＰｙｒｅｘ培地瓶に移された。消化は、２００ｒｐｍで、３〜５分間設定された３７℃の撹拌用水浴中に、２．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼおよび０．１５ｍｇ／ｍのＤＮａｓｅ Ｉ溶液を含有するＨＢＳＳ（フェノールレッドなしの１０ｍＬ／ｇの睾丸）において、実施された。消化に必要な時間の長さを決定するために、３分後、その後は２分ごとに、１０μＬの消化試料のアリコートを１：１の割合でトリパンブルーと混合した。反応は、細管の長さが１５０μｍ以下となった際、停止された。ＦＢＳと共に３０〜４０ｍＬのＨＢＳＳが添加され、コラゲナーゼを不活性化した。消化は、４００μｍでふるいにかけた。試料は、４００ｘｇで、４分間、４℃で遠心分離された。浮遊物は除去され、細胞ペレットは、５０ｍＬのＨＢＳＳ／ＦＢＳに再懸濁された。遠心分離および洗浄工程は、２回以上繰り返され、合計４回の洗浄が行われた。細胞は、完全培地（１０％のウシ血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシンを有するＤＭＥＭ）に再懸濁され、数えられ、トリパンブルー（一般に、＞９５％）で生存率を確認した。２５〜３０×１０^６の分離されたセルトリ細胞は、その後、３７℃、５％のＣＯ_２下で、Ｔ７５ 培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）の２５〜３０ｍＬの完全培地中で、一晩培養された。

成豚のセルトリ細胞分離
睾丸は、無菌で切除され、輸精管および精巣上体は、白膜を損なわないように、睾丸から切り取られた。組織は、ＨＢＳＳ輸送培地中で氷上で隔離施設に移された。約１０ｇの組織が睾丸から得られた。組織は、１〜２ｍｍの断片に分割され、消化は、ＨＢＳＳ（フェノールレッドなし、ＣｅｌｌＧｒｏｗ）中で、１００ｍＬのフィルター滅菌された（０．２μｍ）２．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（Ｔｙｐｅ Ｖ，Ｓｉｇｍａ）および０．１５ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）を用いて実施された。組織は、４０のガラス球（２ｍｍ）をそれぞれに含有する２つの滅菌された１００ｍＬのＰｙｒｅｘ培地瓶に移され、２００ｒｐｍで３〜１５分間設定された３７℃の撹拌用水浴中に、培養された。反応は、顕微鏡検査で測定して、細管の長さが１５０μｍ以下となった際、停止された。ＦＢＳと共に約３０〜４０ｍＬのＨＢＳＳが添加され、コラゲナーゼを不活性化し、消化は、４００μｍの網でふるいにかけられた。細胞は、その後、２×５０ｍＬの円錐管に移され、１０ｍＬのピペットを使用して４回再懸濁された。全体積は、その後、ＨＢＳＳを使用して、１管あたり約４５ｍＬを提供した。試料は、７００ｇで、１５分間、４℃で遠心分離され、ペレットはその後、５０ｍＬのＨＢＳＳを使用して、３回洗浄された。直径３μｍより大きい細胞を数え、トリパンブルー（生存率、一般に、＞９５％）を用いて、生存率の染色をすべての調製に実施した。２５×１０６細胞（大きさ、＞３ｕｍ）は、７５ｃｍ^２の培養フラスコの２５〜３０ｍＬの完全培地中で播種され、３７℃で、５％のＣＯ_２下で、一晩培養された。

ラットの移植研究
動物―体重が少なくとも２００ｇである、メスのＬｅｗｉｓラットが移植対象として使用された（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ）。動物は、ウェスタンオンタリオ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｏｎｔａｒｉｏ）の動物飼育施設で従来の条件下で収容され、カナダ動物管理協会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）における指針に従って、飼育された。

手術―細胞移植する４週間前に、移植対象は、テフロン（登録商標）ステントを含む、全長２０ｍｍの２つのポリプロピレンの網室を移植された。全身麻酔下で、室は、動物の腹部の皮下に設置され、皮膚は、縫合された。細胞移植日に、ラットは麻酔をかけられ、小さな切開は、移植された室からテフロン（登録商標）ステンを除去するために行われた。細胞は、新しく血管が新生されたコラーゲンの袋に移植され、室内に位置され、室は、テフロン（登録商標）製ねじ蓋を使用して密閉され、切開は、縫合された。

４つの異なる処置群を以下のように構築した。１）各室に２，０００の新生児膵島に加えて２００，０００の新生児セルトリ細胞、２）各室に２，０００の新生児膵島に加えて１１×１０^６の新生児セルトリ細胞、３）各室に２，０００の新生児膵島に加えて２００，０００の成熟セルトリ細胞、４）２，０００の新生児膵島に加えて１１×１０^６の成熟セルトリ細胞。

結合アッセイ―血液試料は、移植してから５週間、ラットの伏在静脈から毎週採血された。血液は、回転させ、血清は、−８０℃で、アッセイの時まで保存された。アッセイの当日、血清は、３０分間、５６℃で、熱不活性化された。２０μＬの無血清ＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中の２×１０^５ＰＫ１５細胞（ＡＴＣＣ）は、３０分間、４℃で、熱不活性化された、２０μＬの２倍希釈のラット血清で培養された。細胞懸濁液は、洗浄液（１％のウシ血清アルブミン（ＥＭＤ Ｓｃｉｅｎｃｅ）および０．０１％のアジ化ナトリウム（ＶＷＲ）含有のリン酸緩衝生理食塩水（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ））中で洗浄された。５０μＬのヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、１／４００の希釈で使用され、３０分間、４℃で培養された。細胞懸濁液は、洗浄液中で２回洗浄された。各試料の蛍光は、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００フローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定された。

結果
新生豚または成豚のセルトリ細胞（ＳＣ）は、新生豚膵島（２００，０００のＳＣ／２，０００の膵島）と混合され、非免疫抑制ラットに移植された。ラット血清は、示されている様々な時点で採血され、ラット抗ブタＩｇＧ抗体の量について分析された。熱不活性化された血清は、ＰＫ１５細胞（ブタの腎臓細胞株）とともに培養された後、フルオロフォアに接合したヤギ抗ラット抗体とともに培養された。ラット抗ブタＩｇＧの量は、フローサイトメトリを使用して定量化された。図２Ａに示されるように、膵島が新生児セルトリ細胞とともに移植された際と比較して、膵島が成熟セルトリ細胞とともに移植される場合、ラット抗ブタＩｇＧの有意な低下が観察された。

上記に記載の実験はまた、１１×１０^６のＳＣ／２，０００の膵島の割合で、混合された細胞でも実施された。新生児セルトリ細胞と比較して、成熟セルトリ細胞をとともに、膵島が移植された際、ラット抗ブタＩｇＧの有意な低下が観察された（図２Ｂ）。さらに、１１×１０^６の成熟セルトリ細胞への抗ブタ反応は、２００，０００の成熟セルトリ細胞に対する反応と比較すると、若干減少した（図２Ａ）。

ブタ膵島およびコラーゲン袋中の成熟に対する新生児セルトリ細胞の相互移植に続く免疫病理学
方法
手術―動物およびプロトコルは、実施例２に記載されるとおりである。
６つの異なる治療群がある研究において検査された。
１）各室に、２，０００の新生児膵島に加えて２００，０００の新生児セルトリ細胞、
２）各室に、２，０００の新生児膵島に加えて１１×１０^６の新生児セルトリ細胞、
３）各室に、２，０００の新生児膵島に加えて２００，０００の成熟セルトリ細胞、
４）各室に、２，０００の新生児膵島に加えて１１×１０^６の成熟セルトリ細胞、
５）２，０００の新生児膵島のみ、
６）２００，０００の新生児セルトリ細胞のみ。
別の研究において、３つの他の治療群が検査された。
１）４，０００のブタ膵島のみ、
２）４，０００のブタ膵島に加えて４００，０００の新生児セルトリ細胞、および
３）４，０００のブタ膵島に加えて４００，０００の成熟セルトリ細胞。

組織採取―すべてのラットは、細胞移植してから１日から６週間後に、ＣＯ_２室において、殺処分された。室は、殺処分した動物から除去され、１０％の緩衝中性ホルマリン液（ＶＷＲ）において固定された。少なくとも３日後、室は、断面において切断され、パラフィンに埋め込まれた。

ヘマトキシリン／エオシン染色―５ミクロンの断面に切断され、ポリエルリジンのスライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ）上に設置された。その後、スライドは、脱蝋され、再水和された。断面は、ヘマトキシリン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）で５分間染色された。それらは、その後、１％の酸アルコールに５回浸され、次いで、１％のアンモニア酸に１０回浸された。組織は、エオシン（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ）を使用して、２分間対比染色され、その後、脱水され、除去され、標本にされた。

免疫染色―５ミクロンの断面に切断され、ポリエルリジンのスライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ）上に設置された。その後、スライドは、脱蝋され、再水和された。抗原回復は、ＥＤＴＡを伴うスライドの培養を通して、ｐＨ８．０の高圧で、３分間、実施された。３％のＨ_２Ｏ_２溶液にスライドを１０分間培養させ、非特異的結合を遮断した。断面は、１：５０の希釈で１時間、モノクローナルマウス抗インスリン（Ｎｏｖａｓｔｒａ）と共に培養された。断面は、二次抗体抗マウスエンビジョン・システム（ｅｎｖｉｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｄａｋｏ）で３０分間、培養された。ＤＡＢ（Ｄａｋｏ）は、着色用の基質として使用された。断面は、その後、ヘマトキシリン（Ｄａｋｏ）で５分間対比染色され、脱水され、除去され、標本にされた。

結果
図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ。非免疫抑制ラットは、２，０００の新生豚膵島（図３Ａ）、あるいは２，０００の新生豚膵島および２００，０００の新生豚のセルトリ細胞（図３Ｂ）、あるいは２，０００の新生豚膵島および２００，００の成豚のセルトリ細胞（図３Ｃ）のいずれかを新しく血管が新生された室に移植した。移植してから７日後、動物は、殺処分され、室は、除去され、組織断面は、Ｈ＆Ｅ染色により検査された。細胞浸潤物が、膵島のみの移植、新生児セルトリ細胞とともに移植された膵島において観察された（図３Ａおよび図３Ｂ）。しかし、膵島が新生児セルトリ細胞とともに移植された場合（図３Ｂ）、反応が減少し、また、膵島が成熟セルトリ細胞ととともに移植された場合（図３Ｃ）、完全に反応がなくなることが、観察された。

図４Ａおよび４Ｂ。新しく血管が新生された室において、２，０００の膵島および２００，０００の新生児セルトリ細胞を移植された非免疫抑制ラットは、上記に記載のように、移植してから１週間および５週間後に、インスリン陽性細胞の存在について検査された。陽性細胞は、移植してから１週間後（図４Ａ）と残りの５週間後（図４Ｂ）の両方で観察された。

図５。新しく血管が新生された室において、２００，０００の成熟セルトリ細胞および２，０００の新生児膵島と共に移植された非免疫抑制ラットは、上記に記載のように、インスリン陽性細胞の存在に対して検査された。移植してから６週間後、多数の陽性細胞が観察された。

図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ、６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、および７：非免疫抑制ラットは、４，０００のブタ膵島（図６Ａおよび図６Ｄ）、あるいは４，０００の膵島に加えて４００，０００の新生児セルトリ細胞（図６Ｂおよび６Ｅ）、あるいは４，０００の膵島に加えて４００，０００の成熟セルトリ細胞（図６Ｃ、６Ｆ、および７）のいずれかを移植された。室は、移植してから７日後にラットから除去され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された（図６Ａ〜６Ｆ）。図６Ａに示されるように、７日後、炎症細胞の広範囲の浸潤物が、４，０００の膵島のみ、ラットに移植した場合、存在した。より高い倍率では（図６Ｄ）、浸潤細胞は、密に充填された単核細胞として見られる。各膵島細胞に対して、１００のセルトリ細胞の比率での、新生児セルトリ細胞と膵島細胞の同時移植は、移植片を浸潤する炎症細胞数の減少を生じた（図６Ｂ）。これらの単核細胞は、膵島移植のみ浸潤したものと比較して、若干密度の低い充填であった（図６Ｅ）。成熟セルトリ細胞が、膵島との組み合わせで使用された場合（各膵島に対して１００のセルトリ細胞の比率）、炎症細胞数は、極小であった（図６Ｃ）。より高い倍率で検出可能ないくつかの単核細胞があったものの（図６Ｆ）、該細胞は、膵島のみの移植、または膵島と新生児セルトリ細胞の同時移植を浸潤した単核細胞と比較すると、さらに低い密度で存在した。

移植してから７日後、ラットから除去された室はまた、以下のように、免疫組織化学によりインスリンに対して染色された。５ミクロンの断面に切断され、ポリエルリジンのスライドガラス（ＶＷＲ）上に設置された。その後、スライドは、脱蝋され、再水和された。抗原回復は、ｐＨ８．０、高圧での、３分間のＥＤＴＡを伴うスライドの培養を通して、実施された。次いで、いかなる内因性ペルオキシダーゼ活性をも遮断するため、３％のＨ_２Ｏ_２溶液にスライドを１０分間培養させた。断面は、１：７５の希釈で１時間、モノクローナルマウス抗インスリン（Ｎｏｖａｓｔｒａ，Ｎｏｒｗｅｌｌ，ＭＡ）を伴い、培養された。断面は、二次抗体抗マウスＡＢＣ（アビディン：ビオチン標識酵素複合体）法（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）で６０分間、培養された。ＡＢＣ系に存在するペルオキシダーゼ酵素に適合するＡＥＣ基質キット（３−アミノ−９−エチルカルバゾール、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、赤色反応生成物を得るために使用された。断面は、その後、ヘマトキシリン（Ｄａｋｏ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ）で５分間対比染色され、脱水され、除去され、標本にされた。４，０００の膵島細胞および４００，０００の成熟セルトリ細胞の移植のみが、本研究において、図７の濃く染色された細胞として示されるように、ブタインスリンに対して染色陽性であった。

図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅ、および８Ｆ：非免疫抑制ラットは、４，０００のブタ膵島（図８Ａおよび図８Ｄ）、あるいは４，０００の膵島に加えて４００，０００の新生児セルトリ細胞（図８Ｂおよび８Ｅ）、あるいは４，０００の膵島に加えて４００，０００の成熟セルトリ細胞（図８Ｃ、および８Ｆ）のいずれかを移植された。該室は、移植してから４日後に除去され、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色される（図８Ａ、８Ｂ、および８Ｃ）、あるいは図７に記載のように、免疫組織化学（図８Ｄ、８Ｅ、および８Ｆ）によるインスリンに対して染色された。

移植された室が移植してから４日後、ラットから除去された際、治療群のいずれかにおいて、浸潤性炎症細胞の欠如によって示される、免疫反応の証拠がほとんど認められなかった（図８Ａ〜８Ｆ）。インスリン陽性細胞が、図８Ｄ、８Ｅ、および８Ｆの濃く染色された細胞により証明されるように、３つすべての治療群において存在した。

図９Ａ、９Ｂ、９Ｃ、９Ｄ、９Ｅ、および９Ｆ：非免疫抑制ラットは、４，０００のブタ膵島（図９Ａおよび図９Ｄ）、あるいは４，０００の膵島に加えて４００，０００の新生児セルトリ細胞（図９Ｂおよび９Ｅ）、あるいは４，０００の膵島に加えて４００，０００の成熟セルトリ細胞（図９Ｃ、および９Ｆ）のいずれかを移植された。室は、移植してから１日後にラットから除去され、図７に対して上記に記載のように、免疫組織科学によるインスリンに対して染色された。インスリン陽性細胞が、移植してから１日後の３つすべての治療群において検出された。

成熟セルトリ細胞と共に移植された新生豚膵島によるインスリンの産生
ヒトインスリンＥＬＩＳＡは、生体内でブタインスリンの定量的決定を提供する方法である。ヒトインスリンおよびブタインスリンは、１つのアミノ酸のみ異なるため、この特定のアッセイは、１％未満のラットインスリンの検出による、ブタインスリンの検出に有用であることを証明している。追加情報に関しては、Ｊａｙら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．（２００４）３６（４）：１１３０−３２、Ｌａｋｅｙら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００２）７３（７）；１１０６−１０を参照のこと。

非免疫抑制ラットは、実施例２に記載のように、２室型デバイスが埋め込まれた。４週間後、該動物は、各室に、２０００の新生豚膵島細胞および１１００万の成豚セルトリ細胞と共に移植された。血清試料は、移植してから１週間および２週間後（非絶食）、これらの動物から得られた。製造業者の指示によってヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ／ＡＬＰＣＯ）を使用し、ブタインスリンが、移植してから１週間、および２週間後に検出され、移植してから２週間後に最大レベルを得た。

ブタ膵島および成熟セルトリ細胞と共に移植された非絶食の、非免疫抑制ラットにおけるブタインスリンのレベルは、ＥＬＩＳＡにより測定された。図１０に示されるように、移植前のブタインスリンのレベルは、陰性であった。ブタインスリンの生理的レベルの存在は、移植してから２週間後に明らかであり、ポリプロピレン製の網室において、ブタベータ細胞を機能する生存を暗示する。

組織から分離される初代新生児および成熟セルトリ細胞におけるＣＤ９５Ｌ（ＦａｓＬ）の発現プロファイル
２日齢の新生豚の睾丸は、被膜剥離され、分割され、１０分間、３７℃で撹拌しながら、ＨＢＳＳにコラゲナーゼＶで初期消化された。消化に続いて、組織は、ＨＢＳＳで数回洗浄され、最終的に、０．３３μｇ／ｍＬのトリプシンおよび０．０２μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉを含有する細胞分裂緩衝剤に懸濁された。該組織は、撹拌水浴中で、３７℃で１０分間培養された。消化された組織は、４２０ミクロンのフィルターを通して通過し、新生児セルトリ細胞を得た後、加湿した５％のＣＯ_２雰囲気の培養器内で、３７℃の温度で、０．５％のＢＳＡ、１０％のウシ胎児血清、１００ｕｇ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン、５０ｕｇ／ｍＬの硫酸ゲンタマイシン、１０ｍＭのニコチンアミド、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ｕＭの３−イソブチル−１−メチル−キサンチン（ＩＢＭＸ）で補完されたＨａｍ’ｓ Ｆ１０で培養された。新生児セルトリ細胞は、２日間培養され、その後、タンパク質溶解緩衝剤（０．５％のトリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ７．５、１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）、５ｕｇ／ｍＬのアプロチニン、１ｕｇ／ｍＬのペプスタチンＡおよび１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム）で溶解され、除去され、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷された。タンパク質は、その後、ＰＶＤＦ膜に移され、１：５００のＦａｓＬ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、あるいは１：１００のβ−チューブリン抗体（Ｄｒ． Ｕｎａ Ｄａｇｎｉｎｏからの寛大な贈呈物）のいずれかで探査された。ブロットは、洗浄され、適切な二次ＨＲＰ結合抗体と共にさらに培養された。ウェスタンブロットは、強化された化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し、暴露された。

成豚の睾丸組織が、上記に記載のように、得られ、１０Ｍの尿素、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ７．５、ならびにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤の溶液中に、短パルスで均質化された。可溶化された成熟組織の抽出物は、分割され、新生児セルトリ細胞に対して上に記載と、類似の方法によって、処理され、ＣＤ９５Ｌおよびβ−チューブリンウェスタンブロットプロファイルを得た（図１１Ａ）。図１１Ａに示されるように、成熟組織内に膜結合型のＣＤ９５Ｌは、ウェスタンブロット内のタンパク質の移動度シフトに基づくと、新生児組織に見られるものとは異なることが認められる。観察された移動度の変化は、新生児睾丸組織と成熟睾丸組織との間での、ＣＤ９５Ｌ上でリン酸化および／またはグリコシル化の違いによるものであり得る。

ウェスタンブロット分析に対して上記に記載のように得られた新生児セルトリ細胞の一定分量は、溶解され、総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ社製のＭｉｎｉ ＲＮＡキットを使用して、分離された。１μｇの総ＲＮＡは、増幅に対してｃＤＮＡに逆転写された。ｍＲＮＡの逆転写の一定定量は、以下の条件（９５℃３０秒を３５サイクル、５８℃５秒アニ−リング、６８℃１５秒延長）を用いて、Ｑｉａｇｅｎ ＦａｓｔサイクリングＰＣＲキットを使用して、ＣＤ９５Ｌ（プライマーｑＦ１：５’ＡＣＴ ＧＡＡ ＣＴＣ ＡＧＡ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＣＣ ＡＧＣ Ｃ（配列番号１）およびｑＲ１： ５’ＧＧＡ ＴＧＧ ＡＴＣ ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＡＧ ＧＣＴ ＴＧＣ Ｃ（配列番号２））、あるいはブタＧＡＰＤＨプライマー（順方向プライマー ＧＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＴＧＡＣＡＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＴ（配列番号９）、逆方向プライマー＝ＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡＡＡＴＴＣＡＴＴＧＴＣＧＴＡＣＧ（配列番号１０）のいずれかのプライマーで増幅された。ＰＣＲ生成物は、１２％のアクリルアミド・ゲルに溶解され、エチジウムブロマイドで１０分間染色された。ゲルのデジタル画像は、Ｉｍａｇｅ Ｃａｐｔｕｒｅステーションを用いて、取得された。

ウェスタンブロット分析に対して上記に記載のように得られた成豚睾丸組織の一定分量は、均質化され、以下の製造業者の指示によって、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉ総ＲＮＡキットを使用して、ＲＮＡを得た。成熟組織ＲＮＡは、新生児組織ＲＮＡと類似の方法によって処理され、ＰＣＲ増幅されたＣＤ９５ＬおよびＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡを得た。ゲル電気泳動により溶解された増幅されたＣＤ９５ＬおよびＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡのデジタル画像は、ｔｉｆ画像として保存された後、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔバージョン５．２の画像ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して定量化された。ＧＡＰＤＨの増幅された生成物のレベルは、まず、新生児と成熟組織との間で正規化され、新生児組織に対する相対倍率の増加が算出された（図１１Ｂ）。正規化されたＣＤ９５Ｌ ｍＲＮＡのレベルは、新生児組織と比較して、成熟睾丸組織において少なくとも６倍高かった。

本明細書に引用されるすべての刊行物および特許出願は、参照することにより、その全体が組み込まれる。参照することにより組み込まれる資料が本明細書に対して矛盾する、または一貫性を欠く場合、本明細書がいかなる該資料よりも優先される。

Claims (29)

1. 非新生児で非齧歯類のセルトリ細胞および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
2. 前記非新生児セルトリ細胞は、ＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベルで、同一種の新生児セルトリ細胞よりも多くのＦａｓＬを発現する、請求項１に記載の組成物。
3. 前記セルトリ細胞が成熟セルトリ細胞である、請求項１に記載の組成物。
4. 前記セルトリ細胞がブタ細胞である、請求項１に記載の組成物。
5. 前記セルトリ細胞が成豚から得られる、請求項４に記載の組成物。
6. 前記セルトリ細胞が霊長類細胞である、請求項１に記載の組成物。
7. 前記セルトリ細胞が非ヒト霊長類細胞である、請求項６に記載の組成物。
8. 前記セルトリ細胞がヒト細胞である、請求項６に記載の組成物。
9. 前記セルトリ細胞が初代細胞である、請求項１に記載の組成物。
10. 前記セルトリ細胞が同一種の新生児セルトリ細胞よりも強い免疫特権を提供する、請求項１に記載の組成物。
11. 前記細胞が生物学的因子を発現するように改変される、請求項１に記載の組成物。
12. 前記生物学的因子がインスリンである、請求項１に記載の組成物。
13. 前記組成物が非セルトリ細胞をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
14. 前記非セルトリ細胞がインスリン分泌細胞である、請求項１に記載の組成物。
15. 前記インスリン分泌細胞がベータ細胞である、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記インスリン分泌細胞が改変肝細胞である、請求項１４に記載の組成物。
17. 請求項１に記載の医薬組成物を含む、埋め込みデバイス。
18. 前記デバイスが、哺乳動物に埋め込まれると、繊維カプセルの形成を誘発するように適合される、請求項１７に記載のデバイス。
19. セルトリ細胞を非新生児で非齧歯類の哺乳動物から分離するステップを含む、請求項１に記載の組成物の作製方法。
20. 前記哺乳動物が成熟している、請求項１９に記載の方法。
21. 効果的な量の前記組成物を対象に投与するステップを含む、請求項１に記載の組成物の使用方法。
22. 前記セルトリ細胞が、デバイス内で、または予め埋め込まれたデバイスを用いて部位に投与される、請求項２１に記載の方法。
23. 前記セルトリ細胞が前記対象と同種異系である、請求項２１に記載の方法。
24. 前記セルトリ細胞が前記対象に対して異種である、請求項２１に記載の方法。
25. 前記対象がヒトである、請求項２１に記載の方法。
26. 前記対象が非ヒト哺乳動物である、請求項２１に記載の方法。
27. 前記対象が糖尿病を患っている、請求項２１に記載の方法。
28. 糖尿病の治療方法であって、それを必要とする哺乳動物に、成熟セルトリ細胞および膵島細胞を併用投与するステップを含み、前記投与後、膵島細胞が生存し、インスリンを生成することを可能にする条件下で併用投与する、糖尿病の治療方法。
29. 免疫防御特性を増大させた非新生児セルトリ細胞の選択方法であって、セルトリ細胞により発現されるＦａｓＬの量を決定するステップと、より多くのＦａｓＬ量を発現する細胞を選択するステップと、を含む、方法。

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