KR20050055760A - 질병 치료를 위한 캡슐화 생물학적 물질의 이식 - Google Patents

질병 치료를 위한 캡슐화 생물학적 물질의 이식 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치료를 필요로 하는 환자의 체내로 캡슐화 생물학적 물질을 이식함으로써 당뇨병과 같은 질환을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 여러 가지 다양한 생물학적 물질을 코팅하기 위한 몇몇 방법이 제시되었다. 본 코팅법은 생물학적 물질 표면 또는 생물학적 물질을 보유한 다른 코팅 물질 표면과 직접적으로 위치될 수 있다. 코팅물을 제조하기 위한 중합반응의 구성요소는 천연 및 합성 중합체, 다량체, 촉진제, 조촉매, 광개시제 및 발광을 포함한다. 이러한 캡슐화된 생물학적 물질은 피하 부위를 포함한 부위에 이식되어 다양한 인간 및 동물 질환 또는 장애를 치료하는데 사용된다. 코팅 물질은 장기간의 항염 또는 항면역성 치료에 대한 필요성이 없이 숙주 염증성 및 면역성 보호기전에 의한 캡슐화 생물학적 물질의 파괴되지 않게 보호하면서 숙주에게 캡슐화된 이식물로부터 생물학적 물질의 운반을 적정하게 하기 위하여 서로 상이한 생체 적합성 정도, 단백질 확산 특성, 세기 및 생분해성을 제공하기 위하여 조작될 수 있다.

Description

질병 치료를 위한 캡슐화 생물학적 물질의 이식{IMPLANTATION OF ENCAPSULATED BIOLOGICAL MATERIALS FOR TREATING DISEASES}
본 발명은 치료를 필요로 하는 환자의 체내로 캡슐화 생물학적 물질을 이식함으로써 당뇨병과 같은 질환을 치료하기 위한 조성물 및 그 치료방법에 관한 것이다.
당뇨병은 인슐린 생성 부족이나 감소된 인슐린 반응으로 인하여 체내의 세포 내로 포도당 수송능력이 소실됨으로써 발생하는 질병이다. 건강한 사람에 있어서 미세한 혈당 상승은 세포내로 포도당의 수송을 증가시켜 혈당을 정상수준으로 회복시키는 역할을 하는 인슐린의 생성 및 분비를 촉진시킨다. 인슐린은 간과 골격근 세포를 자극함으로서 혈액으로부터 포도당을 흡수하여 에너지 저장 인자인 글루코겐으로 전환시키는 것을 촉진시킨다. 또한, 인슐린은 골격 근 섬유조직이 혈액으로부터 아미노산을 흡수하여 단백질로 전환시키는 작용을 촉진하며, 지방세포의 지방 합성을 촉진시키는 역할을 수행한다. 당뇨병의 경우, 포도당이 혈류를 포화시키나 포도당을 필요로 하며 사용하고자 하는 세포 내로 수송이 이루어지지 않을 수 있다. 그 결과, 체내 세포는 필요한 에너지의 결핍으로 인하여 불완전하게 조절되는 인슐린 의존적 당뇨병 질환을 갖는 많은 환자들의 쇠약한 모습을 초래한다.
당뇨병의 치료요법으로서 인슐린 발견 및 그 사용 전에 있어서, 유일한 치료법은 예견되는 바대로 사망에 이르게 되는 기아였다. 오늘날 여전히 과량의 인슐린 투여로 인한 사망이 초래되며, 그 환자에게 포도당을 신속하게 투여할 수 있는지에 의해 회복되지 않는 한, 극심한 저혈당 및 혼수 상태를 유발한다. 또한, 저용량의 인슐린 투여로 인해 사망이 일어나며, 이는 만약 적절하게 치료되지 않거나 신속하게 치료 되지 않는다면 혼수상태나 사망에 이르게 할 수 있는 고혈당증 및 케토산증 (ketoacidosis)을 유도한다.
오늘날 적절한 당뇨병 치료 덕분에 당뇨병은 일반적으로 치명적인 질환이 아니나, 표준 치료법 중 어느 것도 인체의 인슐린의 점진적 (minute-to-minute) 생성과 정확한 포도당 신진대사 조절 기능을 대체할 수 없다. 따라서, 일반적으로 당뇨병환자에 있어 평균적인 혈당 수준은 매우 높다.
만성적으로 상승된 혈당 수준은 많은 장기 합병증을 유발한다. 당뇨병은 새로운 실명 (blindness), 신장질병 (renal failure), 심장의 미성숙 발달 질환, 발작, 탈저정 (gangrene), 절단 (amputation), 발기부전 (impotence)을 야기하는 원인이 된다. 당뇨병은 환자의 기대 수명을 10년 내지 20년 정도 감소시킨다.
당뇨병은 세계에서 가장 일반적인 만성 질환 중의 하나이다. 미국에서 당뇨병은 약 1600만명의 사람들, 45세 이상의 성인인구의 12 % 이상에게 영향을 미치고 있다. 새롭게 발병하는 환자의 수는 연간 약 15만 명으로 늘어나고 있다. 더군다나 병상에서 당뇨병을 앓고 있는 환자들 이외에 비정상적인 포도당 저항성 징후를 보이고 있는 약 2000만 명의 사람들이 있다. 이들은 당뇨병 환자 경계선 상의 사람들로 명확하게 당뇨병인 환자들과 정상인 사람들 사이의 중간에 있다. 그들 중 많은 사람들이 당뇨병으로 발전될 것이다.
향후 당뇨병 및 당뇨병으로 가능성 있는 일부 추정 수치는 3600만 명 혹은 45세 이상의 성인인구 25-30 % 정도로 높다.
당뇨병과 이로 의한 합병증은 현대 사회에 주요한 사회 경제적인 충격을 미치고 있다. 오늘날 미국에서는 건강관리에 약 7000억 달러를 소비하고 있으며, 그중에서 대략 1000억 달러 정도를 당뇨병 및 그 합병증 치료를 위해 소비하고 있다. 당뇨병 발병률이 증가하고 있기 때문에 만일 즉시 각 단계가 이러한 도전에 신속하게 따라 주지 않는다면, 당뇨병 치료 비용이 총 건강관리 지출에 있어 계속 증가하는 비중을 차지하게 될 것이다. 당뇨병의 의학적, 정서적, 그리고 경제적인 비용은 막대하며 당뇨병 질환을 앓고 있는 사람들의 수가 늘어남에 따라 증가된다.
당뇨병은 두 가지 유형 즉, 제 1형 당뇨병과 제 2형 당뇨병으로 나눌 수 있다. 제 1형 당뇨병은 인슐린 분비 결핍 또는 무인슐린증으로 특징 지워 지며, 주로 사춘기 초반이나 청년층에서 주로 빈번하게 나타난다. 제 1형 당뇨병에 대한 유전적 요인이 있다. 제 1형 당뇨병은 위 후면에서 역방향으로 연장된 곳에 위치한 분비선인 췌장의 전반에 분포해 있는 랑게르한스 섬에서 인슐린을 생성하는 베타 세포의 파괴에 의해 유발된다. 베타 세포는 아직 미확인된 환경적 요인에 의해 개시되는 자가면역반응에 의해 공격 받는다. 아마 바이러스 감염이나 비감염성 시약 (독소 또는 식품)은 췌장에서 환자의 베타 세포에 면역시스템이 반응하여 파괴하도록 유도한다. 제 1형 당뇨병을 유도하는 병리학적인 일련의 사건들은 여러 단계들로 이루어져 있을 것으로 여겨진다.
첫째, 유전적 감수성은 병리학적 과정의 초기의 기본적인 요구사항일 것으로 생각된다.
둘째, 식품의 경우 바이러스나 비감염성 병원균에 의해 매개되는 환경적인 손상은 세 번째 단계인 췌장의 랑게르한스 섬에서의 염증반응 (인슐린염)을 유발한다. 네 번째 단계는 면역 시스템에 의해 더 이상 "자기"로서 인식되어지지 않고 오히려 외래 세포 또는 "비자기"로 인식되는 베타 세포의 변환 또는 전환이다. 마지막 단계는 인슐린 생성 베타 세포의 파괴에 있어, 세포독성 항체와 세포 매개성 면역기전이 협력하는 동안 타게트된 베타 세포에 대한 강한 면역 반응의 발달 단계이다. 이러한 면역 공격에도 불구하고 일정기간 동안 새로운 베타 세포의 생산은 면역 시스템에 의해 파괴되는 속도를 앞설 만큼 빠르며 혈당 수치 조절을 위해 충분히 많은 베타 세포가 존재한다. 그러나, 베타 세포의 수가 점차적으로 감소하여 위험한 수치(정상의 10 %)까지 떨어질 때 혈당 수치는 더 이상 조절될 수 없으며 총 인슐린 생성 부족 현상으로의 진행은 불가피해지게 된다. 기능적인 인슐린 생성이 중단된 이후에도 베타 세포의 재생은 몇 년 동안 진행되나, 베타세포들은 성숙되면서 파괴되는 것으로 여겨진다.
급성 및 만성적인 당뇨병 합병증, 양쪽 모두에 대한 감수성 (susceptibility)을 감소시키기 위하여 제 1형 당뇨병인 사람들은 날마다 다양한 인슐린 주사를 맞아야 하며 손가락을 찔러 혈액을 취함으로써 하루에 여러 번 그들의 혈당을 검사해야 한다. 그리고 나서 그들이 얼마나 많은 인슐린을 주사 맞아야 할지를 그들이 먹는 음식과 신체적 활동성, 스트레스 양, 그리고 다음 몇 시간 이상 어떤 질병의 존재에 기초해서 결정해야 한다. 매일 수회 투여하는 인슐린 요법은 우리 인체의 점진적인 (minute-to-minute) 인슐린 생성 및 포도당 신진 대사의 정확한 조절을 적합하게 모방하지 못한다. 혈당 수치는 대개 정상 수치보다 높으며 이는 실명 (blindness), 신장질병 (renal failure), 심장의 미성숙 발달 질환, 발작, 탈저정 (gangrene), 절단 (amputation), 발기부전 (impotence)을 포함하는 합병증을 유발한다. 인슐린과 더불어 당뇨병 환자의 평균 수명은 건강한 사람보다 15-20년 정도 짧다.
제 2형 당뇨병은 대개 중년 또는 그 이후 연령의, 특히 과체중인 사람들에게 영향을 미치는 것으로 보인다. 그러나 지난 몇 년에 걸쳐 청년층 에 제 2형 당뇨병의 발병이 급격하게 증가하고 있다. 지난 수년간 비만인 사람들에 있어 제 2형 당뇨병의 발병 연령은 40대에서 30대로 낮아졌으며 이들이 제 2형 당뇨병 질환의 새로운 젊은 희생자들인 것이다. 제 2형 당뇨병에서 정상적으로 인슐린을 요구하던 체내 세포는 인슐린에 대한 감수성을 잃게 되며 인슐린에 대하여 정상적으로 반응을 하지 못하게 된다. 이 인슐린 저항성은 췌장의 베타 세포에 의한 여분의 인슐린 생성에 의해 수년간 극복되어져 왔을 지도 모른다. 그러나 베타 세포는 점점 상승되는 혈당 수치로 인해 막대한 양의 인슐린을 생성하여야 하기 때문에 결국 점차적으로 소진되게 된다. 과대하게 인슐린을 생성하게 된 베타 세포는 사멸하거나 인슐린 분비하지 못하게 되며, 외부에서 주입되는 인슐린에 의해서만 유일하게 혈당 수치를 조절할 수 있게 된다. 높은 혈압과 비정상적인 콜레스테롤 수치는 대개 제 2형 당뇨병을 수반한다. 고혈당과 함께 이러한 상태들은 심장 마비, 발작 및 절단을 유도할 수 있는 다리 부위에서의 혈액순환 장애 와 같은 위험성을 증가시킨다. 제 2형 당뇨병을 치료하는 약제들로는 장관으로부터 포도당 흡수를 감소시키거나 또는 간에 의한 포도당 생성을 감소시키는 작용을 하는 것들이 있으며, 간세포 및 근세포에 의해 더 많은 포도당이 생성되는 것을 감소시키면서 베타 세포가 더 많은 인슐린을 직접 생성하도록 촉진하는 것들이 있다. 그러나, 높은 혈당 수치는 베타 세포에 독성을 나타내어 베타 세포의 기능을 떨어뜨리고 세포사멸에 이르게 한다. 결국, 제 2형 당뇨병 질환을 가진 많은 환자들은 점점 외부로부터 많은 인슐린을 필요로 하게 된다.
당뇨병의 다른 형태는 MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young)라 불려진다. 이러한 형태의 당뇨병은 특이적인 포도당 수용체를 경유해서 들어온 포도당을 처리하는 능력을 제한하는 데 관여하는 인슐린 생성 세포상의 많은 유전적 결함 중의 하나로 인해 일어나는 당뇨병이다. MODY 형태의 당뇨병인 환자들의 베타세포는 포도당에 반응하여 인슐린을 적절하게 생성할 수 없으므로 고혈당증에 걸리게 되며 결국 환자들은 인슐린 주사를 필요로 하게 된다.
현재 인슐린 의존적인 당뇨병을 위해 의학적으로 가능한 치료요법은 인슐린 주사와 췌장의 전체이식 또는 부분 이식들로 한정되어져 있다.
인슐린 치료요법은 췌장 이식보다 훨씬 더 일반적으로 행해지고 있다. 인슐린 주사는 약간의 혈당 측정 및 피하주사에 의해, 다양한 혈당에 의해 집중적으로, 그리고 인슐린의 다양한 피하주사를 통해 이루어지거나 펌프를 이용한 지속적인 인슐린 피하 주사에 의한 치료법들이 통상적으로 이루어지고 있다. 통상적인 인슐린 치료요법은 소량의 일정한 인슐린 첨가 또는 첨가 없이 중간 농도의 인슐린을 하루에 한번 또는 두 번 주사하는 것과 관련이 있다.
집중적인 인슐린 치료요법은 식사 전에 정규 용량 또는 단기간 작용형 인슐린과 함께 하루 내내 중기간-작용형 인슐린 또는 장기간 작용형 인슐린의 수회 투여하는 방법이다. 지속적인 인슐린 피하 주사는 보통 표준 치수 27 게이지 바늘을 통해 복벽 (abdominal cell)으로 끊임없이 인슐린을 이동시키는 소건전지용 펌프를 사용하여 이루어진다. 이 치료 방법은 식사 전에 프로그램된 증강 비율로 하루 내내 연속적으로 기저 농도로 인슐린을 보충해주는 것이다. 이러한 방법들 각각의 경우 포도당 수치를 자주 체크해 주어야 하며 필요하다면 인슐린 양을 조절해 주어야 하기 때문에 인내력이 필요하다. 그러나 혈당을 조절하는 일은 간단하지 않다. 건강한 식단 유지하기, 운동 요법, 항상 적절한 양의 인슐린 주사하기 등과 같은 세심한 주의에도 불구하고, 스트레스, 호르몬 변화, 성장 기간, 질병, 감염 및 피로와 같은 많은 요인들이 사람들의 혈당에 불리한 영향을 미칠 수 있다. 제 1형 당뇨병은 지속적으로 저혈당증 및 고혈당증에 대해 주의를 해야 한다. 인슐린 의존적 당뇨병은 결코 경계를 늦추어서는 안 되는 생명에 위협적인 질환인 것이다.
인슐린 주사와는 반대로, 췌장 전체이식 또는 부분이식을 통하여 당뇨병 환자는 새로운 췌장으로부터 분비되는 인슐린을 조절함으로써 상승된 포도당 수치를 떨어뜨리는 것으로 알려져 있다. 조직학적으로 췌장은 세 가지 형태의 기능적인 세포, a) 작은 관 내로 그들의 효소를 분비하는 외분비 세포, b) 소화관으로 효소를 운반하는 관세포, c) 혈류 내로 그들의 호르몬을 분비하는 내분비 세포들로 이루어져 있다. 외분비 일부분은 선방세포 (acinar cell)로 알려져 있는 각추 상피세포의 원주형을 가지는 다양한 소 분비선으로 구성된다. 선방 세포는 약 췌장 세포의 80 %를 차지하고 있으며, 췌장관 시스템 안으로 아밀라아제, 리파아제, 포스포리파아제, 트립신, 키모트립신, 아미노펩티다아제, 엘라스타아제와 같은 소화 효소 및 다양한 단백질들을 분비한다. 소화를 돕기 위하여 담관 내부로 하루에 알카리성 용액 약 1.5-3 ??를 방출한다.
췌장관 시스템은 지맥 (tributary)과 같은 네트워크 형식으로 관들이 서로 복잡하게 연결되어 있으며, 각각의 분비성 선방 세포들을 점진적으로 더 큰 관으로 배출하여 결국 주요 췌장관으로 배출하게 한다. 췌장관 시스템의 상피조직은 관세포들로 이루어져 있다. 췌장세포의 약 10 %가 관세포들로 이루어져 있다. 관세포의 형태는 분비성 선방 세포를 배출하는 미세한 소근에 있는 입방형 형태에서부터 주요 관 시스템 내의 길고 원주형인 점액을 분비하는 세포에 이르기까지 그 범위가 다양하다.
호른몬을 생성하는 랑게르한스 섬은 췌장 전반에 분포하며 이 호르몬은 관보다 혈류 쪽으로 분비된다. 랑게르한스 섬에는 많은 혈관이 존재한다. 랑게르한스 섬은 췌장의 1-2 %를 구성하고 있으나, 췌장 혈액의 약 10-15 %를 받는다. 랑게르한스 섬에는 서로 다른 내분비물을 생성하는 주요한 세 가지 형태의 세포, 글루카곤 호르몬을 분비하는 알파 세포, 인슐린을 생성하며 랑게르한스 섬에 가장 풍부하게 존재하는 베타 세포, 소마토스타틴 호르몬을 분비하는 델타 세포가 있다. 이러한 세포들은 랑게르한스 섬에 무분별하게 분포되어 있지 않다. 베타 세포들은 랑게르한스 섬의 중앙부에 위치하며 알파와 델타 세포의 외층으로 둘러싸여 있다. 인슐린, 글루카곤, 그리고 소마토스타틴 외에 가스트린 및 VIP (vasoactive intestinal peptide)이 췌장의 랑게르한스 섬 생성물로 발견되어 왔다.
췌장 이식은 일반적으로 오직 신장 이식이 요구될 때만 시행되어져 왔으며, 췌장 이식은 상대적으로 빈번하지 않은 수술이다. 췌장 이식은 비록 인슐린을 주사할 필요 없이 혈당 조절을 가능하게 하며 장기적인 합병증을 감소시킴으로써 인슐린 의존적인 당뇨병 환자들의 치료에 매우 유익하긴 하나, 췌장 전체이식은 많은 취약점을 갖고 있다. 가장 중요한 점은 이식할 췌장을 습득하는 것과 수술을 하는 것으로서, 체내의 면역 시스템이 췌장을 파괴하는 것을 방지하기 위하여 장기간의 면역 반응 억제제 사용을 필요로 한다. 췌장은 면역 반응 억제제 투여 없이 하루에 어느 정도 파괴가 이루어지고 있다. 면역 반응 저해를 일으키는 약제들이 가지고 있는 위험성은 감염률과 종양의 발생률을 증가시킬 수 있다는 것이다. 수술 과정에 포함된 내재된 위험 즉, 이식거부반응을 방지하기 위해 장기간의 면역억제요법의 필요성, 외부 감염에 수반되는 발병률 및 사망률이 당뇨병 치료를 위한 전체 췌장이식과 연관되어 심각한 단점으로 야기되고 있다. 따라서, 인슐린 주사와 췌장 이식을 대체할 수 있는 대체 방안이 대중의 건강유지를 성취하기 위하여 요구될 것이다.
랑게르한스 섬 이식은 췌장 전체이식보다 보다 간단한 방식으로서, 파괴된 베타 세포들을 대체함으로써 췌장 전체이식과 동일한 효과를 가질 수 있다. 상기에서 언급한 바와 같이, 근본적인 원인들에도 불구하고, 비효율적인 수많은 베타 세포 또는 비효율적인 인슐린 분비가 존재할 때 당뇨병이 발생한다. 정상적인 포도당 반응 인슐린 생성을 복원하기 위해 당뇨병 환자들의 랑게르한스 섬 베타 세포들을 재구축하는 것이 인슐린 주사 및 주요한 장기 이식과 관련된 문제점에 대한 해결 방안이 될 것이다. 당뇨병 환자들에게 미세 캡슐화 (microencapsulation) 및 랑게르한스 섬 세포의 이식은 당뇨병 환자들의 치료를 위한 가능성을 가질 것이다.
수많은 질환 및 장애들을 치료할 가능성을 안고 있는 세포의 캡슐화 (encapsulation)가 문헌에서 논의되어져 왔다. 그 개념은 100년 전보다 앞서 제안되었으나, 1950년대 면역학자들이 면역 시스템의 또 다른 면을 좀더 잘 이해하기 위하여 숙주로부터 세포를 분리하기 위해 세포막으로 캡슐화 시킨 세포를 이용하기 전까진 거의 연구된 바가 없었다. 이식에 대한 연구는 1984년에 처음 리뷰(review)가 발표됨과 동시에 1970-1980년대 내내 진행되었다. 서로 다른 시도들과 개발 진행 중인 기구들을 설명하는 여러 추가적인 문헌들이 공개되어 왔다. 세포 캡슐화 기술은 의학의 많은 분야에 있어 응용 가능성을 가지고 있다. 예를 들면, 일부 중요한 응용 가능성으로 당뇨병 치료 (Goosen, M. F. A., et al., Biotechnology and Bioengineering, 27, pp146, 1985), 생물학적으로 중요한 화합물의 생성 (Omata, T., et al., "Transformation of Steroids by Gel-Entrapped Nacardia rhodocrous Cells in Organic Solvent" Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechonl. 8, pp143-155, 1979) 및 항 인체면역결핍 바이러스 약제 (McMahon, J., et al., J. Nat. Cancer Inst., 82(22), pp1761-1765, 1990) 가 있다.
세가지 주요한 캡슐화 고안 기술이 있으며, 캡슐화 형태에 따라 분류된다. 이 세가지 유형은 (a) 거대기구(macrodevices), (b) 미세캡슐(microcapsules), 및 (c) 균일 코팅(conformal coatings)이다.
거대기구는 침투선택성(perm selectivity)을 위한 시이트 또는 튜브 형태 안에 막 및 통상적인지지 구조물을 포함하는 보다 큰 기구이다. 이는 캡슐화된 세포를 위해 하나 또는 여러 개로 나누어진 구획들을 포함하고 있다. 이 기구는 외부 혈관 또는 혈관 다발 부위로의 이식을 위해 설계 되었다. 일부는 이 거대기구 내로 산소 확산을 증가시키기 위해 숙주 내에서 성장하도록 설계 되었다. 이외의 것들은 숙주에 의해 반응성을 갖지 않도록 디자인함으로써 다른 부위로부터 제거의 용이성을 증가시켰다. 지금까지 개발되어 온 거대기구로는 (a) 편평한 시이트 (b) 속이 빈 섬유조직 등 두가지 형태가 있다.
편평한 시이트형 중 어느 하나의 형태(Baxter, Theracyte)는 내구성을 위해 여러 층으로 이루어져 있으며, 세포를 대체하는 적재부 및 지지체 사이에 확산막을 갖는다. 또 다른 형태는 설계면에 있어 보다 더 간단하다. 그 기구는 알지네이트 및 시이트 사이의 알지네이트 매트릭스 내에서 섬 세포를 캡슐화하기 위한 기타 지지막으로 구성된다. 복잡한 기구는 산소의 확산을 증가시키기 위해 인체 내에 성장하도록 설계되었다. 상대적으로 큰 크기 때문에 당뇨병과 같은 질환 치료를 위해 이를 수용할 수 있는 인체 부위는 거의 없다. 그 기구는 신체 내로 성장하고 함유 세포가 몇 년 이상 생존할 것으로 예상되지 않기 때문에 이 기구의 장기간 사용을 위해 다중 세포의 제거 및 신생 세포의 재적재가 필요하다. 산소확산을 위한 주요한 세포분획 거리를 유지함과 동시에 이러한 기구를 선택하고 재장착하는 것은 상당히 어려운 것으로 증명되었다.
두 번째 편평한 시이트 형태 기구는 숙주와 거의 반응하지 않는 "모든 것을 포함한/ 모든 것을 제외한 (all in/all out)" 기구 형태로 설계된다. 당뇨병 치료용 기구를 위하여, 그 본래 형태를 유지하면서 거대 동물의 내부 복강 내로 이 기구를 위치시키는 것은 매우 힘들다. 기구를 손상시키거나 파괴시킬 수 있는 정도의 이동 또는 구부러짐 현상을 방지하도록 복부 내에서 이를 안전하게 포획하는 것은 어렵기 때문이다.
또 다른 주요 거대기구 형태는 열가소성 물질을 속이 빈 섬유 조직 내로 밀어 넣어 만든 속빈 섬유조직(hollow fiber) 형태이다. 이 속이 빈 섬유 조직은 혈관과 같은 역할을 할 만큼 크게 제조될 수 있다. 한 가지 모델은 숙주의 큰 혈관 내로 고정되게 설계되었으며, 캡슐화 된 세포는 기구내 침투선택적인 막 후면 부분에 위치한다. 이 형태는 거대동물에 대한 당뇨병 실험에서 효능을 나타냈으나, 혈관부위로 접근하는 데에 문제점이 있는 것으로 나타났다. 혈전증 및 출혈증 모두가 개발 도중 임상적으로 관련된 제품중 현재 폐기되는 문제점을 유발하는 질환들이다. 따라서 속빈 섬유 조직형의 또 다른 모델은 좀더 구경이 작어지고 혈관 외부 장착형 제품으로 사용되도록 설계되었다. 낮은 패킹 밀도 때문에 캡슐화를 위해 요구되는 세포 덩어리는 속이 빈 섬유조직 형태 길이가 수 미터에 근접되도록 요구한다. 따라서, 임상학적으로 관련성이 없기 때문에 이러한 접근법으로는 당뇨병을 치료할 수 없다. 추가적으로 섬유 조직 말단의 열린 부분을 봉합하는 것은 쉽지 않으며 외부 혈관 다발 부위에 따라 그 강도가 문제점이 되어 왔다.
미세 캡슐은 임상학적인 효율 가능성을 처음 제시한 것 중의 하나이다. 알지네이트 미세 캡슐은 랑게르한스 섬을 캡슐화하기 위해 사용되었으며, 이는 설치류의 내부 복막으로 이식되어 당뇨병을 치유하여 왔다. 그러나 임상학적인 효능을 설명할 수 없었기 때문에 첫 발표 이후 거의 25년의 세월이 지나가 버렸다. 특히, 당뇨병을 치료하는데 있어서, 미세캡슐과 관련된 문제점 중의 하나는 세포의 낮은 패킹 밀도와 결합하는데 있어 상대적으로 큰 그 크기였다. 또 다른 문제점은 알지네이트의 사용; 알지네이트의 가교결합정도에 따른 칼슘 농도 의존적으로 이온적으로 가교 결합된 하이드로겔이다. 순수한 알지네이트 캡슐의 침투선택성은 대부분이 분자량 한계에 따른 넓은 구경으로 인하여 조절상의 문제점이 있어 왔다. 폴리리신과 같은 다양한 양전하성 이온성 가교화제는 캡슐에 침투선택성을 제공하기 위하여 2차 코팅용으로 첨가되었다. 그러나, 폴리리신 및 대부분의 기타 다른 유사 분자들은 캡슐에 대한 숙주의 거부반응을 경감시키기 위한 알지네이트의 부가적인 3차 코팅을 필요로 하는 염증반응을 초래한다. 추가적으로, 이식 후에도 숙주 내에서 거부 반응을 나타내지 않는 매우 순수한 알지네이트를 제조하는 것은 어려운 일이다. 알지네이트 미세캡슐의 크기를 줄이기 위한 노력은 두가지 주요한 문제점을 발생시켰다. 첫째는 세포가 없는 빈 캡슐의 대량 생산이며, 둘째는 불완전한 캡슐화 세포로 인한 작은 크기의 캡슐 형성이다. 미세캡슐 내에 포함된 세포를 유지할 힘이 없어 세포크기의 감소와 비례하여 증가하는 불완전한 캡슐을 유발한다. 알지네이트 미세캡슐에 있어서 균일한 코팅 생성은 언급되어 있지 않았다.
세포 캡슐화의 최후 카테고리는 균일코팅법이다. 균일하게 코팅된 세포 응집물은 응집물의 크기 및 모양에도 불구하고 세포 응집물 주위에 실질적으로 균일한 세포 코팅을 갖는 것 중 하나이다. 이 코팅은 두께에 있어서도 균일할 뿐만 아니라 균일한 면역 보호효과를 제공하는 코팅제의 보호적인 침투선택성도 균일할 수 있다. 게다가 강도 및 안정성에 있어서도 균일할 수 있으며 코팅 물질이 숙주의 면역 시스템에 의해 방해받는 것도 방지한다.
이러한 다양한 방법들의 실현 가능성에 대한 중요한 측면은 15,000 IEQ/kg-BW의 생리적인 결과를 얻는데 요구되는 적절한 크기 및 이식부위이다. 분리한 랑게르한스 섬을 문맥 내로 주입하는 것은 농축 세포 2-3 ㎖을 필요로 한다. 랑게르한스 섬 두께 (-500 ㎛)를 갖는 1개 편평한 시이트로 구성되는 거대-기구는 미국 달러 지폐 2장 정도의 표면적과 동일한 면적을 필요로 한다. 5 %의 적재 밀도를 갖고 있는 속이 빈 섬유 조직형 거대-기구는 30 미터의 섬유조직이 필요할 것이다. 평균 400-600 ㎛의 직경을 갖는 알지네이트 미세 캡슐은 50-170 ㎖ 정도의 부피를 필요로 할 것이다. 그러나, 25-50 ㎛ 두께 외피를 생산하는 랑게르한스 섬의 균일한 PEG 코팅은 오직 6-12 ㎖ 부피만 필요로 하게 되므로 신체의 거의 모든 부위에 주입이 가능할 것이다.
생체적합성 (biocompatibility), 화학적 안정성, 면역 방어 및 세포의 과대 성장에 대한 저항성을 위한 캡슐화 중합체에 대한 엄격한 요구조건이 세포 및 다른 생물학적 물질을 캡슐화하는 선행 기술 방법의 적용 범위를 제한한다. 이 막은 선택적 투과성을 가지며, 화학적으로 안정하고, 매우 높은 생체적합성을 갖고 세포내에서 비독성적으로 생성되어야 한다.
생물적 액체 또는 조직에 노출될 의도를 갖는 합성 또는 천연 물질은 생체물질(biomaterial)로서 폭넓게 분류된다. 이러한 생체물질이 신체 내에서 최소한 또는 아무런 부작용을 발생하지 않는다면 생체에 적합한 것으로 간주된다. 생체물질의 많은 사용을 위해 생리적인 환경과 물질간의 반응을 최소화시켜야 하는 것이 바람직하다. 이러한 사용을 위하여, 이 물질은 사용중 이식후 생체 적합물질 표면에서 세포 성장이 최소화되어야 하며, 최소한의 염증 반응 및 과민성 반응에 대한 징후가 없어야 한다. 따라서, 이 물질은 특이적인 체액성 면역 또는 세포 매개성 면역 반응뿐만 아니라 비특이적인 외부 신체 반응을 나타내지 않아야 한다.
상기한 모든 반응을 예방하는데 성공적인 물질은 상대적으로 드물다. 생체 적합성은 완전무결한 상태보다는 오히려 그 정도의 문제다. 생물학적액체를 둘러싸는 모든 이식부위의 경계면에서 발생한 최초의 현상은 단백질 흡수이다 (Andrade, J. D. et al., V. Adv. Polym. Sci, 79, pp1-63, 1986). 천연으로부터 얻은 생체 적합물질의 경우는 그 물질에 대해 특이적인 항체가 숙주의 면역방어기전 과정 내에 존재한다는 것을 예상할 수 있다. 이 경우에 강한 면역반응을 유발시킬 수 있다.
그러나, 대부분의 합성 재료들은 그러한 반응을 일으키지 않는다. 합성된 생체 적합물질들은 보체의 단계적인 과정 (complement cascade)을 활성화하거나 세포 부착을 매개하는 세포 부착 분자 (cell adhesion molecules, CAMS)와 같은 혈청 단백질들을 흡수시킬 수 있다 (Buck, C. A. et al., Ann. Rev. Cell Biol., 3, pp179-205, 1987).
단백질들은 거의 모든 형태의 물질상에 흡착할 수 있다. 이들은 친수성 또는 소수성일 뿐만 아니라 양전하 및/또는 음전하를 띠는 부위를 가질 수 있다. 따라서, 이 단백질들은 다양한 부위를 통해 이식된 물질들과 결합될 수 있으며, 결과적으로 이식 표면에서 세포 증식이 일어난다. C3b와 같은 보체 성분은 이식 표면에서 고정될 수 있으며 주화성 물질로서 작용할 수 있다. 보체 성분은 대식세포, 중성구와 같은 염증 세포를 활성화시킬 수 있으며, 염증 세포가 이식 부위에 흡수되어 활성화되는 것을 유발한다. 이 염증 세포들은 외부 물질을 분해하거나 소화시키려고 한다.
만일 이 이식물이 분해되지 않고 하나의 활성화된 거대 대식 세포에 의해 소화되기에 너무 큰 경우 이 염증성 세포들은 탐식작용을 좌절시킬 수 있을 것이다. 이러한 몇몇 세포들은 모여 외부 거대 세포를 형성할 수 있다. 이 과정에서 이 염증 세포들은 페록시드 (peroxide), 가수분해 성 효소 및 주화성 물질 그리고 인터루킨과 같은 과민반응 유발 인자를 분비하며 이는 염증 반응을 악화시킨다. 또한 염증 세포들은 외부 표면상에서 섬유아 세포의 증식을 유도한다.
물질의 생체 적합성을 향상시키기 위한 지난 연구 접근방법들을 살펴보면, 생체 적합 물질과 그것의 수용성 주변부 사이의 계면 에너지 (interfacial energy)를 최소화하는 것으로부터 시작한다. 고체와 액체의 유사한 계면 장력은 단백질 흡수를 유도하는 힘을 최소화할 것으로 예상되며 또한 이는 감소된 세포의 흡착 및 표면의 혈전성을 유발하는 것으로 예상된다. 예를 들면, 아무데스와리 (Amudeshwari) 등은 HEMA와 MMA의 존재 내에서 가교 결합된 콜라겐 겔을 사용한 바 있다 (Amudeshwari, S., et al., J. Biomed. Mater. Res., 20, pp1103-1109, 1986). 데자이(Desai) 및 허벨(Hubbell)은 폴리(HEMA)-MMA 공중합체가 약간 비혈전성 (non-thrombogenic)을 나타냄을 보고한 바 있다 (Desai, N. P., et al., J. Biomaterials Sci., Polym. Ed., 1, pp123-146, 1989; Desai, N. P. et al., Polym. Materials Sci. Eng., 62, pp731, 1989).
허벨 (Hubbell)은 수용성 분자의 광중합반응을 이용하여 생물학적인 물질 주변부에 생체적합성 막을 형성시키는 방법을 개시하였다 (미국 특허 제 5,529.914 호 및 관련 특허). 개개의 이 방법들은 수용성 거대단량체를 포함하는 광중합 시스템, 염료와 같은 광 개시제 및 가시광선 또는 장파장 자외선 형태의 조사를 이용한 중합반응들을 사용한 것이다.
성공적인 세포 캡슐화의 하나 이상의 중요한 특성을 제공하기 위한 당업계에 알려진 종래기술들의 무능력에 기인하여 과거부터 개발되어 온 캡슐화 방법들 중에 임상적으로 성공한 예는 없다. 이러한 특성들은 하기한 카테고리로 분류될 수 있다: 생체 적합성- 캡슐화 기구를 제조하기 위해 사용되는 물질들은 숙주에 대한 반응을 일으키지 않아야 하며, 이는 이러한 물질 단독으로 비특이적인 면역 시스템 활성을 야기한다. 면역반응을 차단시키는 방법을 생각해 볼 때, 이 물질에 대한 숙주 면역 세포의 활성화가 없는 상태에서 작업이 이루어져야함을 당업자는 인식해야 한다. 만약 그 물질에 의해 숙주 면역세포의 활성화가 일어난다면 이에 반응하는 면역세포들은 이 기구를 둘러싸서 파괴하려고 할 것이다. 이러한 과정은 캡슐을 통해 확산되며 캡슐화된 세포들을 파괴할 가능성이 있는 수많은 시토카인을 생성한다. 지금까지 시험된 대부분의 기구들은 숙주 내 생체 적합성 결여 때문에 일부분 실패되어 왔다.
침투선택성- 캡슐화 세포는 세포 파괴를 방지하기 위하여 면역시스템의 모든 요소를 캡슐화 세포로부터 벗어나도록 최대한 작은 구멍 및 적절한 생존 및 기능을 허용하도록 모든 영양분 및 노폐물이 캡슐을 통과하도록 최대한 큰 구멍간에 균형이 중요하다. 면역성 시토카인을 방지할 수 잇는 작은 구멍은 영양분 및 폐기물의 확산능 결여 때문에 캡슐화 세포 사멸을 유도한다. 적절한 세포 캡슐화는 정확하고 일정한 침투선택성을 갖게 하여 숙주의 면역 반응을 차단시킬 뿐만 아니라 최대한 세포 생존 및 기능을 제공하도록 한 것이다. 이상적으로, 이러한 캡슐화 기술은 세포가 타가 이식 세포인지 이종이식 세포인지에 따라 구멍 크기의 변화뿐만 아니라 캡슐화 된 세포 및 세포의 기능에 따라서 구멍의 크기를 고르거나 변화시킬 수 있는 능력을 제공할 것이다.
캡슐화된 세포의 생존력 및 기능- 캡슐화 물질은 코팅 형성 또는 형성 중 어느 한 동안 캡슐화된 세포에 세포독성을 보이지 않아야 하는데 그렇지 않으면 캡슐화된 세포의 수는 감소하여 질환 및 장애를 치료하기에 효과적인 수에 미달할 위험성이 있다.
관련된 크기- 많은 기구들은 숙주내의 실제 이식장소에서의 수가 제한되는 큰 크기이다. 또 다른 요소는 캡슐화 된 세포와 숙주 사이의 상대적인 확산 거리이다. 세포 생존을 위해 가장 중요한 확산 작용제는 산소이다. 이 확산 거리는 인체 조직에서 최초 부분 산소압이 인체 내 조직 상에서 30-40 mm Hg의 범위를 갖기 때문에 최소화되어야 한다. 초기의 저산소 부분 분압 (initially low oxygen partial pressure) 덕분에 확산 거리 감소에 대한 저항성은 없다. 세포들이 적절하게 기능을 할 수 없거나 충분히 생존할 수 없는 한도까지 산소의 농도를 더욱 감소시킬 것이다.
세포 회복 또는 교체- 캡슐화 기구는 세포 교체 또는 보충을 가능하도록 회복가능, 재보충가능 또는 생분해성이 있어야 한다. 많은 기구 디자인들은 캡슐화 세포가 숙주 내에서 제한된 수명을 갖고 있고 일정한 교체를 필요로 한다는 사실을 고려해 오지 않았다.
치료 효과- 이식물은 숙주 내 질환에 적용하기 위한 치료학상의 효과를 갖는 충분히 기능적인 세포들을 포함해야 한다.
임상적 관련성- 세포 캡슐화 기구는 작용을 위해 최소한의 침윤 또는 가장 생리적인 부위로 이식이 가능할 정도의 총 부피 또는 크기를 가져야 할 것이며, 이는 현재 질환 또는 장애를 갖고 있는 숙주에 의해 직면하는 낮은 위험성(risk)/장점(benefit) 비율을 갖는다.
통상적 관련성- 세포 캡슐화 기구는 발병 과정의 장기간 치료 기간 중에 진행 기간동안 생산되게 하기 위하여 상기의 요구사항들을 충족시킬 수 있어야 할 것이다.
상기의 모든 요소들은 당뇨병의 영향을 완화하기 위하여 랑게르한스 섬 이식을 위해 사용하는 특별한 기술, 방법 또는 생성물을 평가할 때 고려되어져야 할 것이다.
면역억제 상태의 인체 랑게르한스 섬의 이식은 늑골사이 간 내부로 그리고 문맥 사이의 피부를 통해서 직접 주입 및 형광투시법에 의한 간문맥으로의 주입 방법을 이용하여 문맥 내부로 비캡슐화 랑게르한스 섬 세포를 주입함으로써 완료된다.
본질적으로 절개를 통해 배꼽의 위치에 정맥을 통해 주사하는 점만을 제외하고, 모든 인간 랑게르한스 섬 이식은 상기 기술을 이용함으로써 이루어져 왔다. 이 과정중에 가장 위험한 점은 문맥 정맥 내부로의 랑게르한스 섬 주입이 주입액의 비율과 주입되는 양에 의존적으로 증가되는 문맥 정맥의 압력 증가를 야기한다는 점이다. 또 다른 위험 요소는 충분히 정제하지 않은 채 주입되는 랑게르한스 섬 조직의 큰 부피로부터 오는 문맥정맥 압력의 증가이다. 또한 이는 이식과정상의 합병증으로서 문맥 정맥 혈전증을 야기한다. 중도에 참가한 방사능 연구자가 도뇨관 (catheter)을 끄집어 내기위해 준비함으로써 주입 부위로부터 다량 출혈이 일어나는 것을 방지하기 위해 젤라틴의 둥근 덩어리를 남겨 두었다. 유감스럽게도 여러 환자들이 이 시술 뒤에 출혈 과정을 겪어 오게 되었다.
랑게르한스 섬을 문맥 정맥 내부로 주입하는 것 외에, 몇몇의 환자들은 비장 내로 주입된 랑게르한스 섬을 갖게 되었다. 비장은 간보다 훨씬 더 연약하다. 따라서 이 주입방법은 개복 과정으로서 비장 주입이 이루어지는신장 이식과 동시에 수행되어졌다. 랑게르한스 섬을 복막강 내로 자유롭게 주입하는 것은 마우스 이식술에서 별다른 어려움 없이 수행되어져 왔다. 좀더 큰 동물이나 사람의 이러한 부위를 사용함에 있어서, 문맥 정맥 이식에 요구되는 섬 세포 분량보다 복막내 이식시 요구되는 양이 두 배 정도 된다는 사실이 발견되어 왔다. 만약 거부 반응이나 염증 반응이 일어난다면 부착이 복강내 망뿐만 아니라 소장 루프 사이에서 형성되려는 경향이 있다. 이 반응은 장폐색증과 같은 장기간의 부차적인 문제를 야기할 수 있다. 따라서 캡슐화 된 랑게르한스 섬 이식을 피하 내로 수행하는 능력은 이러한 기타 부위에서 수반되는 합병증을 상당히 감소시킬 것이다.
아마도 상기에서 언급되었던 일부 또는 모든 과학적인 문제점들 때문에 캡슐화 랑게르한스 섬의 피하 이식에 대한 시도는 당뇨병 치료에 있어 지속되는 결과를 만들어 내지 못해 왔다. 타타르키윅즈 (Tatarkiewicz) 등 은 조직 확산 경유 기구 내에 캡슐화된 래트 랑게르한스 섬을 마우스 피하 내로 이식하는 기술을 개시하였다 (Transplantation Proceedings, 30, pp479-480, 1998). 가와카미(Kawakami) 등은 아가로스-PSSa로 캡슐화된 췌장 베타 세포를 래트의 피하 내로 이식한 바 있다 (Cell Transplantation, 6, 5, pp541-545, 1997). 세포로부터의 인슐린 분비는 이식 후에 지속되었다. 그러나, 이 연구는 오직 일주일의 기간에 걸친 캡슐화된 랑게르한스 섬의 피하 이식만을 조사하였다. 세포의 인슐린 분비 반응이 피하 이식 후 장기간 지속되는지 여부에 관해서는 아무런 근거를 제시하지 못하고 있다. 카와카미(Kawakami) 등은 래트 랑게르한스 섬을 아가로스/폴리스티렌 설폰산으로 혼합된 겔로 래트 랑게르한스 섬을 캡슐화 하였으며 캡슐화된 세포를 혈관화되기 전의 피하 조직 부위 내로 이식하였다 (Kawakami et al. Transplantation, 73, pp122-129, 2002). 스톡클리(Stockley) 등은 인간 성장 호르몬을 분비하도록 설계된 동종 이계의 MDCK 세포를 알지네이트-폴리-L-라이신-알지네이트로 캡슐화한 다음 피하 내로 이식한 바 있다 (J. Lab. Clin. Med., 135, pp484-492). 사용된 캡슐 부피는 100 ㎛로서 이 부피는 캡슐화된 세포 이외의 구성성분으로 이루어지지 않은 것으로 추정되나, 스톡클리 등의 캡슐화된 세포는 약 1.5 mm 정도의 직경을 가지는 것으로 측정될 수 있었다. 스톡클리 등은 적용된 캡슐화된 세포의 실질적인 부피에 관한 어떠한 정보도 제공하지 않는다. 당업자라면 종래 기술 중에 하나로는 치료 대상에 투여할 캡슐화된 세포의 필요한 부피를 결정할 수 없을 것이다.
발명의 요약
하나의 바람직한 구현 예로서, 본 발명은 약 900 내지 3000 달톤 (Dalton)의 분자량을 갖는 폴리 에틸렌 글리콜(PEG) 코팅을 함유하는 다수 캡슐화 기구 및; 캡슐화 기구 내에 캡슐화된 다수의 세포를 포함하는, 약 100,000 cells/㎖의 세포 밀도를 가지는 세포 치료를 위한 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예로서, 상기 캡슐 기구는 미세캡슐이다. 보다 바람직한 구현 예로서, 상기 미세캡슐은 균일하게 코팅된 세포 응집물이다. 바람직하게는, 상기 세포 응집물은 약 6,000,000 cells/㎖ 이상의 세포 밀도를 갖는 췌장 섬 세포이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 세포는 신경계, 심혈관계, 간장, 내분비선계, 피부, 조혈계, 면역계, 신경 분비계, 대사계, 전신조직계 또는 유전적 세포들이다. 바람직하게는, 상기 세포는 자가 조직성, 동종 이계, 이종 개체성 또는 유전공학적으로 변형된 세포들이다.
다른 측면에서, 본 발명은 캡슐화 물질에 캡슐화된 세포를 포함한 400 ㎛ 이하의 평균 직경을 갖는 다수 캡슐 기구를 포함하고, 500,000 cells/㎖이상의 세포밀도를 갖는 치료적으로 효과적인 조성물을 제공한다. 바람직한 구현 예로서, 상기 캡슐화 기구의 평균 직경은 300 미크론(micron)이하인 것이다. 보다 바람직한 구현 예로서, 캡슐 기구의 평균 직경은 200 미크론 이하 인 것이다. 보다 바람직한 추가적인 구현 예로서, 상기 캡슐 기구의 평균 직경은 100 미크론 이하인 것이다. 보다 더 바람직한 추가적인 구현 예로서, 상기 캡슐 기구의 평균 직경은 50 미크론 이하인 것이다.
본 발명은 캡슐화 물질에 캡슐화된 세포를 포함한 400 ㎛ 이하의 평균 직경을 갖는 다수 캡슐 기구를 포함하고, 캡슐화 기구 부피: 세포부피가 약 20:1 이하의 부피비를 갖는 치료적으로 효과적인 조성물을 제공한다. 바람직한 구현 예로서, 상기 캡슐화 기구 부피: 세포부피가 약 10:1 이하의 부피비를 갖는 것이다. 보다 바람직한 구현 예로서, 캡슐화 기구 부피: 세포부피가 약 2:1 이하의 부피비를 갖는 것이다.
다른 구현 예로서, 본 발명은 질환 또는 장애 치료가 필요한 동물의 이식부위 내로 본원에 기재된 치료용 조성물을 이식하는 단계를 포함하는 사용 방법을 제공한다.
바람직한 구현 예로서, 본 발명은 질환 또는 장애 치료가 필요한 동물의 이식부위 내로 약 900 내지 3000 달톤 (Dalton)의 분자량을 갖는 폴리 에틸렌 글리콜(PEG) 코팅을 함유하는 다수 캡슐화 기구 및; 캡슐화 기구 내에 캡슐화된 다수의 세포를 포함하는, 약 100,000 cells/㎖의 세포 밀도를 가지는 세포 치료를 위한 조성물을 이식하는 단계를 포함하는 사용 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 이식은 주사로 하는 것이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 질환 또는 장애는 신경계, 심혈관계, 간장, 내분비선계, 피부, 조혈계, 면역계, 신경 분비계, 대사계, 전신조직계 또는 유전성 질환 또는 장애이다. 가장 바람직한 구현예로서, 상기 장애 또는 질환은 당뇨병과 같은 내분비계 질환이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 포유류들은 우제류(Artiodactyla), 육식류 (Carnivora), 고래류(Cetacea), 기제류(Perissodactyla), 영장류(Primate), 프로보시드류(Proboscides), 또는 라고모르파류(Lagomorpha)와 같은 수류 (Order of Subclass Theria)목 동물이다. 바람직하게는 상기 포유동물은 인간이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 이식부위는 피하, 근육내, 내부장기, 장기 동맥의/정맥의 혈관질, 뇌-척수액 또는 림프액이다. 보다 바람직하게는, 상기 이식 부위는 피하이다. 가장 바람직한 구현 예로서, 상기 방법은 캡슐화된 랑게르한스 섬을 피하이식부위 내로 이식하는 것을 포함한다.
바람직한 구현 예로서, 면역억제제 또는 항염증제를 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애 치료가 필요한 동물의 이식부위 내로 상기 조성물을 이식하는 이식 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 면역억제제 또는 항염증제는 6개월 이내로 투여하는 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 면역억제제 또는 항염증제는 1개월 이내로 투여하는 것이다.
또 다른 바람직한 구현 예로서, 본 발명은 질환 또는 장애 치료가 필요한 동물의 이식부위 내로 캡슐화 물질에 캡슐화된 세포를 포함한 400 ㎛ 이하의 평균 직경을 갖는 다수 캡슐 기구를 포함하고, 500,000 cells/㎖이상의 세포밀도를 갖는 치료적으로 효과적인 조성물을 이식하는 단계를 포함하는 사용 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 이식은 주사로 하는 것이다.
바람직하게는, 상기 질환 또는 장애는 신경계, 심혈관계, 간장, 내분비선계, 피부, 조혈계, 면역계, 신경 분비계, 대사계, 전신조직계 또는 유전성 질환 또는 질병이다. 가장 바람직한 구현예로서, 상기 장애 또는 질환은 당뇨병과 같은 내분비계 질환이다.
바람직하게는, 상기 포유류들은 우제류(Artiodactyla), 육식류 (Carnivora), 고래류(Cetacea), 기제류(Perissodactyla), 영장류(Primate), 프로보시드류 (Proboscides), 또는 라고모르파류(Lagomorpha)와 같은 수류 (Theria) 목 동물이다. 바람직하게는 상기 영장류는 인간이다.
바람직하게는, 상기 이식부위는 피하, 근육내, 내부장기, 장기 동맥의/정맥의 혈관질, 뇌-척수액 또는 림프액이다. 보다 바람직하게는, 상기 이식 부위는 피하이다. 가장 바람직한 구현 예로서, 상기 방법은 캡슐화된 랑게르한스 섬을 피하이식부위 내로 이식하는 것을 포함한다.
바람직한 구현 예로서, 본 발명은 면역억제제 또는 항염증제를 투여하는 단계를 포함하는, 질환 또는 장애 치료가 필요한 동물의 이식부위 내로 상기 조성물을 이식하는 이식 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 면역 억제제 또는 항염증제는 6개월 이내로 투여하는 것이다. 보다 바람직하게는, 상기 면역억제제 또는 항염증제는 1개월 이내로 투여하는 것이다.
다른 구현 예로서, 본 발명은 1차 완충액을 포함하는 용액을 생물학적인 물질에 첨가하는 단계; 생물학적인 물질을 원심분리하여 펠렛화 생물학적 물질(pelleted biological material)을 수득하는 단계; 상층액을 제거하는 단계; 세포 흡착 물질과 결합된 광개시제 염색약을 포함하는 용액을 펠렛화 생물학적인 물질에 첨가하는 단계; 적절한 시간동안 상기 펠렛화 생물학적인 물질세포을 흡착 물질과 결합된 광개시제 염색약을 포함하는 용액과 재부유하고 배양하는 단계; 상기 혼합물을 원심분리하는 단계; 상기 세포 흡착 물질과 결합된 광개시제 염색약을 포함하는 용액을 제거하는 단계; 2차 완충액을 포함하는 2차 용액으로 상기 펠렛화 생물학적인 물질을 재부유하는 단계; 상기 2차 완충액을 원심분리 및 제거하는 단계; 광개시제 중합체 용액과 함께 생물학적인 물질을 재부유 및 혼합하는 단계; 및 캡슐화된 생물학적인 물질을 형성하기 위하여 상기 재부유된 생물학적 물질을 에너지원을 동반한 광활성 중합체 용액으로 조사하는 단계를 포함하는 생물학적 물질을 캡슐화하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 캡슐화된 생물학적 물질은 균일하게 PEG 코팅된 랑게르한스 섬 동종이식물이다.
바람직하게는, 상기 세포 흡착 물질은 다중 양이온 중합체(polycationic polymer)이다. 바람직한 구현 예로서, 상기 다중 양이온 중합체는 PAMAM 덴드리머 (Dendrimer)이다. 대체가능한 바람직한 구현 예로서 , 상기 다중 양이온 중합체는 폴리 에틸렌 이민이다.
바람직하게는, 상기 생물학적인 물질은 장기, 조직 또는 세포이다. 보다 바람직하게, 상기 조직은 인슐린 생성 세포의 집합체(cluster)이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 세포는 인슐린 생성 세포이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 1차 및 2차 완충액은 1 내지 200 mM 농도이다. 보다 바람직하게는, 상기 1차 및 2차 완충액은 10 내지 50 mM 농도이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 1차 및 2차 완충액은 20 mM 농도이다.
바람직한 구현예로서, 상기 광개시제는 카르복시에오신 (carboxyeosin), 에틸 에오신 (ethyl eosin), 에오신 Y (eosin Y), 플루오르세인 (fluorescein), 2,2-디메톡시, 2-페닐아세토페논, 2-메톡시, 2-페닐아세토페논, 캄퍼퀴논 (camphorquinone), 로즈 벤갈 (rose bengal), 메틸렌 블루 (methylene blue), 에리쓰로신 (erythrosin), 플록신 (phloxine), 티오닌 (thionine), 리보플라빈 (riboflavin) 또는 메틸렌 그린 (methylene green)이다. 보다 바람직하게는, 상기 광개시제는 카르복시에오신 (carboxyeosin)이다.
바람직한 구현예로서, 상기 광활성 중합체 용액은 중합가능한 고밀도 에틸렌성 불포화 PEG 및 설포네이트 공단량체이다. 보다 바람직한 구현 예로서, 상기 중합가능한 고밀도 에틸렌성 불포화 PEG는 고밀도 아크릴레이트 PEG이다. 바람직하게는, 상기 중합가능한 고밀도 아크릴레이트 PEG는 1.1 kD의 분자량을 가진 것이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 설포네이트 공단량체는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰 산, 비닐 설폰산, 4-스티렌 설폰 산, 3-설포 프로필 아크릴레이트, 3-설포 프로필 메타크릴레이트 또는 n-비닐 말레이미드 설포네이트이다. 보다 바람직한 구현 예로서, 상기 설포네이트 공단량체는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 설폰 산이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 광활성 중합 용액은 추가적으로, 트리에탄올아민, 트리에틸아민, 에탄올아민, N-메틸 디에탄올아민, N, N-디메틸 벤질아민, 디벤질 아미노 N-벤질 에탄올아민, N-이소프로필 벤질아민, 테트라메틸 에틸렌디아민, 과황산 칼륨, 테트라메틸 에틸렌디아민, 리신, 오르니틴, 히스티딘 또는 아르기닌 등과 같은 조촉매를 첨가할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 조촉매는 트리에탄올아민이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 광활성 중합체 용액은 추가적으로 N-비닐피롤리다논, 2-비닐 피리딘, 1-비닐 이미다졸, 9-비닐 카르바존, 9-비닐카르보졸 아크릴 산, n-비닐카르포락탐, 2-알릴-2-메틸-1, 3-시클로펜탄 디온, 또는 2-하이드록시 에틸 아크릴레이트 등과 같은 촉진제를 첨가할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 촉진제는 N-비닐피롤리디논이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 광활성 중합체 용액은 추가적으로, 천연 및 합성 중합체를 포함하는 그룹으로부터 선택된 점도 증강제를 포함한다. 보다 바람직한 구현 예로서, 상기 점도 증강제는 3.5 kD PEG-트리올 또는 4 kD PEG-디올이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 광활성 중합체 용액은 추가적으로 밀도 조정제를 포함한다. 보다 바람직하게, 상기 밀도 조정제는 니코덴즈 (Nycodenz) 또는 피콜 (Ficoll)이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 광활성 중합체 용액은 또한 "굿 (Good)" 완충액을 포함한다. 보다 바람직한 구현 예로서, 상기 굿 완충액은 HEPES 또는 MOPS이다. 가장 바람직한 구현 예로서, 상기 굿 완충액은 MOPS이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 에너지원은 아르곤 레이져 (Argon laser)이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 캡슐화 방법을 위한 생물학적인 물질은신경계, 심혈관계, 간장, 내분비선계, 피부, 조혈계, 면역계, 신경 분비계, 대사계, 전신조직계 또는 유전적 물질이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 생물학적인 물질은 포유동물 강 수류 아강에 속하는 동물로부터 유래된 것이다. 보다 바람직하게는 상기 동물은 우제류, 육식류, 고래류, 기제류, 영장류, 프로보시드류, 또는 라고모르파류와 같은 수류 목 동물이다. 가장 바람직하게는, 상기 포유류는 인간이다.
다른 구현 예로서, 본 발명은 900 내지 3000 달톤의 분자량 범위의 중합 가능한 고밀도 에틸렌성 불포화 PEG 및 설포네이트 공단량체를 포함하는, 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 조성물을 제공한다. 바람직한 구현 예로서, 상기 중합가능한 고밀도 에틸렌성 불포화된 PEG는 중합가능한 고밀도 아크릴레이트 PEG이다. 보다 바람직한 구현 예로서, 상기 중합가능한 고밀도 아크릴레이트 PEG는 1.1 kD의 분자량을 갖는 것이다.
바람직한 구현 예로서, 상기 설포네이트 공단량체는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 설폰 산, 비닐 설폰 산, 4-스티렌 설폰 산, 3-설포 프로필 아크릴레이트, 3-설포 프로필 메타크릴레이트 또는 n-비닐 말레이미드 설포네이트이다. 가장 바람직한 구현 예로서, 상기 설포네이트 공단량체는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 설폰산이다.
바람직한 구현 예로서, 상기한 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 조성물은 추가적으로 트리에탄올아민, 트리에틸아민, 에탄올아민, N-메틸 디에탄올아민, N, N-디메틸 벤질아민, 디벤질 아미노, N-벤질 에탄올아민, N-이소프로필 벤질아민, 테트라메틸 에틸렌디아민, 과황산 칼륨, 테트라메틸 에틸렌디아민, 리신, 오르니틴, 히스티딘 또는 아르기닌 등과 같은 조촉매를 첨가할 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 조촉매는 트리에탄올아민이다.
보다 바람직한 구현 예로서, 상기한 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 조성물은 추가적으로 N-비닐피롤리디논, 2-비닐 피리딘, 1-비닐 이미다졸, 9-비닐 카르바존, 9-비닐카르보졸 아크릴 산, n-비닐카르포락탐, 2-알릴-2-메틸-1, 3-시클로펜탄 디온, 또는 2-하이드록시에틸 아크릴레이트 등과 같은 촉진제를 첨가할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 촉진제는 N-비닐피롤리디논이다.
바람직한 구현 예로서, 상기한 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 조성물은 약 2 점 이상의 점수를 가진 생체 적합한 것이다. 보다 바람직하게, 상기 조성물은 포유류에서, 보다 훨씬 더 바람직하게는 인간과 가까운 존재의 영장류에서, 그리고 가장 바람직하게는 인간에서, 약 2 점 이상의 점수를 가진 생체 적합한 것이다.
바람직한 구현 예로서, 상기한 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 조성물은 침투 선택성을 갖는 것이다. 보다 바람직하게, 상기 침투 선택성은 조성물을 조작함으로써 제조될 수 있다.
바람직한 구현 예로서, 상기한 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 조성물은 약 2 점 이상의 점수를 가진 세포 기능 허용성을 갖는 것이다. 보다 바람직한 구현 예로서, 상기 조성물은 포유류에서, 보다 훨씬 더 바람직하게는 인간과 가까운 존재의 영장류에서, 그리고 가장 바람직하게는 인간에서, 약 2 점 이상의 점수를 가진 세포 기능 허용성을 갖는 것이다.
바람직한 구현 예로서, 상기한 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 조성물은 생분해성을 갖는 것이다. 보다 바람직하게는 상기 조성물은 포유류에서 생분해성을 갖는 것이다. 보다 더 바람직하게는 상기 조성물은 인간과 가까운 존재의 영장류에서 생분해성을 갖는 것이다. 가장 바람직하게는 인간에서 생분해성을 갖는 것이다.
본 발명의 구체적인 측면, 특징 및 장점은 하기한 바람직한 구현예에 대한 상세한 기재로부터 명백해 질 것이다.
도 1A는 분리된 시노몰거스 (Cynomolgus) 영장류의 랑게르한스 섬을 나타낸다.
도 1B는 PEG로 균일하게 코팅된 시노몰거스 영장류의 랑게르한스 섬을 보여준다.
도 2는 덴드리머 에오신 Y 접합체의 합성을 보여준다.
도 3은 2 세대 덴드리머를 나타낸다. 실시예에서, 4 세대 덴드리머가 사용되었으며, 이는 2 세대 덴드리머보다 많은 가지친(branched) 형태로 뻗어 있다.
도 4는 1, 2 및 4 로 점수화한 FDA/EB 검사에 의해 측정된 캡슐화 세포의 생존력을 보여준다.
도 5는 PEG 코팅의 형성과 관련된 변수를 변경하면서 알지네이트/PEG의 침투투과성 양상이 변화되는 능력을 나타낸다. 알지네이트/PEG로 캡슐화된 랑게르한스 섬은 충분히 배양되었으며 세포로부터 분비된 단백질은 분자량을 결정하기 위하여 분석되었다. 비 캡슐화 랑게르한스 섬으로부터 분비된 단백질은 왼쪽 가장 하단 부분에 보여지는 것이며, 그 다음이 칼럼 또는 분자량 마커이다. 다음 칼럼은 알지네이트/PEG로 캡슐화된 랑게르한스 섬으로부터 분비된 단백질을 보여주며, 이는 분자량 100 kD이상, 100 kD, 60 kD이하, 30 kD이하 및 0 kD의 단백질을 분비하였다.
도 6은 개방형 코팅 (>200 kD)은 "1", 중간형 코팅 (100-200 kD) "2", 치밀한 코팅(<100 kD)은 "3"으로 점수화된 서로 상이한 대표적인 단백질 확산 양상을 나타내는 정적 포도당 자극 시험에 의한 캡슐화된 랑게르한스 섬의 기능성을 보여준다.
도 7은 균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스 섬이 복강 내로 이식된 무흉선 마우스에서 측정된 혈당치를 도식화한 것이다.
도 8은 균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스 섬이 피하로 이식된 무흉선 마우스에서 측정된 혈당치를 도식화한 것이다.
도 9는 균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스 섬 동종이식 조직물이 복강 내로 이식된 CD1 마우스에서 측정된 혈당치를 도식화한 것이다.
도 10은 균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스 섬 동종이식 조직물이 고용량으로 피하로 이식된 CD1 마우스에서 측정된 혈당치를 도식화한 것이다.
도 11은 PEG로 일정하게 코팅된 마우스 랑게르한스 섬 동종이식 조직물이 이식된 두 당뇨성 NOD 마우스에서 측정된 혈당치를 도식화한 것이다.
도 12는 인간과 가까운 존재의 영장류 (sub-human primate)에서 균일하게 코팅된 랑게르한스 섬이 피하 내로 이식된 당뇨성 무흉선 마우스에서 측정된 혈당치를 도식화한 것이다.
도 13은 인간에서 균일하게 코팅된 랑게르한스 섬이 복강 내로 이식된 당뇨성 무흉선 마우스에서 측정된 혈당치를 도식화한 것이다.
도 14는 인간에서 균일하게 코팅된 랑게르한스 섬이 피하 내로 이식된 당뇨성 무흉선 마우스에서 측정된 혈당치를 도식화한 것이다.
도 15는 PEG로 일정하게 코팅된 랑게르한스 섬 동종이식 조직물을 피하 이식한 후, 부분적으로 췌장 절제한 시노몰거스 영장류의 혈당치 및 인슐린 요구량에 대해 도식화한 것이다.
도 16A는 항-인슐린 염색후, 100일 경과한 후 캡슐화 된 랑게르한스 섬 동종이식 조직물을 피하 이식한 조직도를 나타낸 것이다.
도 16B는 항-인슐린 염색후, 100일 경과한 후 캡슐화 된 랑게르한스 섬 동종이식 조직물을 피하 이식한 조직도를 나타낸 것이다.
도 16C는 항-글루카곤 염색후, 부분적으로 췌장절제된 시모몰거스 영장류로부터 얻은 췌장 조직에 대한 조직도를 나타낸 것이다.
도 16D는 항-글루카곤 염색후, 부분적으로 췌장절제된 시모몰거스 영장류로부터 얻은 췌장 조직에 대한 조직도를 나타낸 것이다.
도 17은 면역 억제제 투여 없이, 캡슐화된 랑게르한스 섬 동종이식 조직물을 피하 이식한 스테렙토조토신에 의해 유도된 당뇨성 시노몰거스 영장류에서의 혈당치 (㎎/㎗) 및 인슐린 요구량을 도식화한 것이다 [◆=혈당, ●=인슐린].
도 18은 저용량 시클로스포린 (cyclosporine) 및 메트포르민 (Metformin)을 30일 동안 투여한 캡슐화된 랑게르한스 섬 동종 이식 조직물을 피하 이식한 스테렙토조토신에 의해 유도된 당뇨성 시노몰거스 영장류에서의 혈당치 (㎎/㎗) 및 인슐린 요구량을 도식화한 것이다 [◆=혈당, ●=인슐린].
도 19는 저용량의 시클로스포린 및 메트포르민을 30일 동안 투여한 캡슐화된 랑게르한스 섬 동종이식 조직물을 피하 이식한 스테렙토조토신에 의해 유도된 당뇨성 시노몰거스 영장류에서의 피하 이식 부위를 285일째 되는 날 조직도로 나타낸 것이다.
도 20은 항-인슐린 스테이닝한 다음 저용량의 사이클로스포린 (cyclosporine) 및 메트포르민 (Metformin)을 30일 동안 투여한 캡슐화된 랑게르한스 섬 동종이식 조직의 피하 이식이 이루어진 스테렙토조토신에 의해 유도된 당뇨성 시노몰거스 영장류에서의 피하 이식 부위를 248일째 되는 날 조직도로 나타낸 것이다.
도 21은 당뇨병 유도 전 (대조군, n=4), 그리고 이식 후 85일 (n=3), 114일 (n=1)인 시노몰거스 영장류로부터 당화 헤모글로빈 수치를 도식화한 것이다.
도 22는 저용량 사이클로스포린 및 메트포르민을 30일 동안 투여한 캡슐화된 랑게르한스 섬 동종이식 조직의 피하 이식이 이루어진 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨성 비비 원숭이 (baboon)에서의 혈당치 (㎎/㎗) 및 인슐린 요구량을 도식화한 것이다 [◆=혈당, ●=인슐린].
도 23은 저용량 사이클로스포린 및 메트포르민을 30일 동안 투여한 캡슐화된 랑게르한스 섬 동종이식 조직의 피하 이식이 이루어진 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨성 비비 원숭이에서의 당화 헤모글로빈 A1에 대하여 도식화한 것이다.
도 24는 저용량 사이클로스포린 및 메트포르민을 30일 동안 투여한 캡슐화된 랑게르한스 섬 동종이식 조직의 피하 이식이 이루어진 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨성 비비 원숭이에서의 혈당치 (㎎/㎗) 및 인슐린 요구량을 도식화한 것이다 [◆=혈당, ●=인슐린].
도 25는 저용량 사이클로스포린을 30일 동안 투여한 캡슐화된 랑게르한스 섬 동종이식 조직의 피하 이식이 이루어진 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨성 비비 원숭이에서의 당화 헤모글로빈 A1에 대하여 도식화한 것이다.
도 26은 7일 동안 정상적인 시노몰거스 영장류로 이식한 이후, 코팅의 서로 상이한 침투 선택성 양상을 가진 알지네이트/PEG 마이크로캡슐의 서로 다른 외형뿐만 아니라 알지네이트 내부에 캡슐화된 돼지의 랑게르한스 섬 생존율을 나타낸다. 서로 상이한 침투선택성 수치는 0 kD, 30 내지 60 kD, 100kD 및 200 kD 이상이다.
도 27은 30일 동안 항-CD154 항체 치료를 받은 당뇨성 시노몰거스 영장류의 복강 내부로 이식되었던 알지네이트/PEG 마이크로 캡슐로 캡슐화된 돼지 랑게르한스 섬 이식 결과를 나타낸다.
도 28A 및 도 28B는 응집성을 갖는 서로 상이한 도선종 종양 세포주 (NIT)를 코팅하기 위한 균일한 PEG 코팅 기술의 사용이 2주 동안 조직 배양하면서 생존할 수 있음을 설명해준다. 일상광하 (도 26A) 및 형광하 (도 26B)에서 FDA/EB로 염색 세포를 나타낸다.
도 29A 및 도 29B는 소아 원숭이 폐 세포의 PEG로 균일하게 코팅된 또 다른 세포주가 캡슐화후 생존력을 유지함을 보여준다. 일상광하 (도 88A) 및 형광하 (도 88B)에서 FDA/EB로 염색 세포를 나타낸다.
도 30A 내지 도 30D는 인간 및 마우스 유래 간세포로부터 생산되는 세포 응집물을 PEG로 균일하게 코팅된 또 다른 세포주가 캡슐화후 배양 2주 동안 생존력을 유지함을 보여준다. 도 28A 는 FDA/EB 염색후 형광하에서 2주간 배양후 인체 세포를 나타내며, 도 28B 는 FDA/EB 염색후 일상광하에서 2주간 배양후 인체 세포를 나타내며, 도 28C 및 28D 는 FDA/EB 염색후 각가 형광하 (89C) 및 일상광 (89D) 에서 2주간 배양후 마우스 세포를 나타낸다.
도 31A 내지 도 31D는 빈 알지네이트/PEG 미세 캡슐을 서로 상이한 부위에 이식한 네 가지 다른 종 (마우스 91A-IP, 돼지 91BPV, 개 91C-PV 및 영장류 91D-PV)에서의 생체적합성 반응을 보여준다. 이 도는 1.1 kD PEG 트리아크릴레이트로 코팅된 빈 알지네이트 마이크로 캡슐을 간문맥 내로 주입한 결과를 나타낸다.
도 32는 1, 2 및 3 점수를 나타내는 대표적인 조직도를 갖는 소 동물에서의 캡슐화된 세포의 생체적합성을 보여준다.
도 33은 1, 2 및 3 점수를 나타내는 대표적인 조직도를 갖는 거대 동물에서의 캡슐화된 세포의 생체적합성을 보여준다.
도 34는 1, 2 및 3 점수를 나타내는 대표적인 조직도를 갖는 스트렙토조토신으로 유도된 당뇨성 무흉선 마우스 내로 이식된 캡슐화된 랑게르한스 섬의 기능성을 보여준다.
본 발명의 바람직한 구현 예는 신경계 질환 (예를 들면, 파키슨씨 병, 알츠하이머 질환, 헌팅톤 질환, 다발성 경화증, 시각장애, 말초신경손상, 척수손상, 통증 및 중독), 심장혈관계 질환 (예를 들면, 관상동맥, 신생혈관이식, 판막 및 소관), 간장계 질환 (예를 들면, 급성간부전, 만성간부전 및 간에 영향을 주는 유전질환), 내분비선계 질환 (예를 들면, 당뇨병, 비만, 스트레스 및 부신, 부갑상선, 고환 및 난소 질환), 피부계 질환 (예를 들면, 만성궤양 및 피부 및 모발 줄기 세포 질환), 조혈계 질환 (예를 들면, 제 8인자, 조혈호르몬), 또는 면역성 질환 (면역 불내성 또는 자가 면역 질환) 등과 같은 하나 이상의 질환 또는 질병의 치료가 치료한 환자에게 있어: 췌장 랑게르한스 섬, 간조직, 내분비 조직, 피부 조직, 조혈 세포, 골수 줄기 세포, 신장 조직, 근육 세포, 신경 세포, 줄기 세포, 배아 줄기 세포 또는 장기 특이적인 전구세포, 특별한 인자를 생산하도록 유전적으로 제조된 세포 또는 이로부터 유래된 세포 또는 조직을 제공하는 단계; 알지네이트, 아가로오스, 키토산, 폴리 (아미노산), 히알루론산, 황산콘드로이친, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 셀페이트, 헤파란 설페이트 (heparan sulfate), 겔란 검 (gellan gum), 산탄 검 (xanthan gum), 구아 검 (guar gum), 수용성 셀룰로오즈 유도체, 카라기난과 같은 다당체 또는 젤라틴, 콜라겐, 알부민과 같은 단백질 또는 에틸렌성 불포화기를 갖는 수용성 합성 중합체 또는 폴리 (메틸 메타아크릴레이트, PMMA) 또는 폴리 (2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트)(HEMA), 폴리 (에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리 (에틸렌 옥시드)(PEO), 폴리 (비닐 알코올) (PVA), 폴리 (비닐 피롤리돈) (PVP), 폴리 (틸록사졸린)(PEOX)와 같은 이들의 유도체; 또는 PEG 또는 폴리 (글리콜 산)(PGA), 폴리 (락트 산)(PLA), 또는 이들의 공중합체 (PLA-GA), 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)과 같은 보다 소수성을 갖거나 수불용성을 갖는 중합체와 알지네이트와 같은 상기물질들과의 조합을 포함하는 물리학적 또는 화학적으로 가교결합 가능한 중합체로 제조된 하이드로 겔과 같은 적어도 하나 이상의 캡슐화 물질내 상기 세포 또는 조직을 봉합하는 단계 및 치료학적으로 효과적인 양의 상기 캡슐화된 세포 또는 조직을 치료가 필요한 대상에게 피하주사 또는 이식, 또는 장기로의 직접 주사 또는 이러한 장기의 순환계를 통한 주사 중 어느 하나의 방법으로 장기내로 직접 투여하는 상기 질환을 치료하는 방법 및 조성물을 제공한다.
상기 장기는 이에 제한되지는 않으나 간, 비장, 신장, 폐, 심장, 뇌, 척수, 근육 그리고 골수로부터 선택될 수 있다. 상기 치료가 필요한 대상들은 이에 제한되지는 않으나 인간, 인간과 가까운 존재의 영장류 (sub-human primate), 소, 양, 말, 돼지, 개, 고양이 그리고 토끼와 같은 포유류뿐만 아니라 닭, 칠면조, 물고기와 같은 기타 동물로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예로서, 상기 캡슐화된 세포 또는 조직은 면역 억제제 및/또는 항염증 제제과 조합되어 치료를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 상기 면역 억제제는 이에 제한되지는 않으나 사이클로스포린 (cyclosporine), 시롤리무스 (sirolimus), 라파마이신 (rapamycin), 오르타크롤리무스 (ortacrolimus)로부터 선택될 수 있다. 상기 항염증 제제는 이에 제한되지는 않으나 아스피린, 이부프로펜, 스테로이드 및 비스테로이성 항염증 제제로부터 선택된다. 바람직하게는 면역 억제제 및/또는 항염증 제제는 캡슐화된 세포 또는 조직의 이식 또는 주입후 6개월 동안 투여됨이 바람직하다. 보다 바람직하게는 면역 억제제 및/또는 항 염증 제제는 캡슐화된 세포 또는 조직의 이식 또는 주입후 1개월 동안 투여됨이 바람직하다.
바람직한 구현 예로서, 상기 캡슐화된 랑게르한스 섬 세포는 간 또는 비장내로 또는 피하로 이식 또는 주입되는 것이다. 본 발명의 한 측면으로서, 상기 균일하게 코팅된 랑게르한스 섬 세포는 피하로 투여되는 것이다.
바람직하게, 상기 캡슐화 물질은 아크릴레이트 PEG 및 N-비닐피롤리다논, 2-비닐 피리딘, 1-비닐 이미다졸, 9-비닐 카르바존, 9-비닐카르보졸 , 아크릴 산, 2-알릴-2-메틸-1, 3-시클로펜탄 디온, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰 산, 비닐 설폰 산, 3-설포 프로필 아크릴레이트, 3-설포프로필 메타크릴레이트 그리고 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 설폰 산과 같은 하나 이상의 공단량체를 포함한다. 가장 바람직하기로는 상기 캡슐화 물질은 계면 광중합반응과 같은 공정에 의해 균일하게 코팅된 캡슐화된 세포 또는 조직을 제조하기 위하여 아크릴레이트 PEG와 공단량체인 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰 산 (AMPS) 및/또는 N-비닐 피롤리디논을 포함한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 성분 농도 및 캡슐화 용액의 조성은 변화될 수 있다. 바람직한 농도 범위는 하기와 같다.
본 발명의 바람직한 완충용액 농도는 1 내지 200 mM, 보다 바람직한 농도는 5 내지 100 mM, 및 보다 더 바람직한 농도는 10 내지 50 mM이다. 본 발명의
본 발명의 바람직한 CaCl2 농도는 0.1 내지 40 mM, 보다 바람직한 농도는 0.5 내지 20mM, 및 보다 더 바람직한 농도는 1 내지 5 mM이다.
본 발명의 바람직한 만니톨 농도는 10 mM 내지 6 M, 보다 바람직한 농도는 50 mM 내지 3 M, 보다 더 바람직한 농도는 100 mM 내지 1 M, 및 더욱 보다 바람직한 농도는 200 내지 300 mM이다.
본 발명의 바람직한 CaCl2/만니톨 (manitol) 용액의 pH 수치는 6 내지 8, 보다 바람직하게는 6.4 내지 7.6, 및 보다 더 바람직하게는 6.6 내지 7.4이다.
본 발명의 바람직한 DEN-EY 농도는 0.005 내지 8 ㎎/㎖, 보다 바람직한 농도는 0.01 내지 4 ㎎/㎖, 및 보다 더 바람직한 농도는 0.05 내지 2 ㎎/㎖이다.
본 발명의 바람직한 DEN-EY 결합 (conjunction) 수치는 0.15 내지 68, 보다 바람직한 수치는 1 내지 34, 및 보다 더 바람직한 수치는 1.5 내지 15이다.
본 발명의 바람직한 고분자 (macromer) 용액의 pH 수치는 6.5 내지 9.5, 보다 바람직한 수치는 7 내지 9, 및 보다 더 바람직한 수치는 7.5 내지 8.5이다.
본 발명의 바람직한 PEG TA 농도는 0.1 내지 100 %, 보다 바람직한 농도는 0.2 내지 50 %, 및 보다 더 바람직한 농도는 1 내지 25 %이다.
본 발명의 바람직한 PEG TA 밀도는 0.05 내지 20 K, 보다 바람직한 밀도는 0.1 내지 10 K, 보다 더 바람직한 밀도는 0.5 내지 5 K, 및 더욱 보다 바람직한 밀도는 0.8 내지 2.5 K이다.
본 발명의 바람직한 PEG-트리올 (triol) 농도는 0.1 내지 100 %, 보다 바람직한 농도는 1 내지 75%, 및 보다 더 바람직한 농도는 2 내지 50 %이다.
본 발명의 바람직한 PEG-트리올 (triol) 밀도는 0.15 내지 70 K, 보다 바람직한 밀도는 0.3 내지 35 K, 보다 더 바람직한 밀도는 1.5 내지 15 K, 및 더욱 보다 바람직한 밀도는 2.3 내지 7.5 K이다.
본 발명의 바람직한 PEG-디올 (diol) 농도는 0.1 내지 100 %, 보다 바람직한 농도는 1 내지 75 %, 및 보다 더 바람직한 농도는 2 내지 50 %이다.
본 발명의 바람직한 PEG-디올 (diol) 밀도는 0.2 내지 80 K, 보다 바람직한 밀도는 0.5 내지 40 K, 보다 더 바람직한 밀도는 1 내지 20 K, 및 더욱 보다 바람직한 밀도는 2 내지 10 K이다.
본 발명의 바람직한 TEoA을 위한 바람직한 농도는 5 mM 내지 2 M, 보다 더 바람직한 농도는 10 mM 내지 1 M, 보다 더 바람직한 농도는 50 내지 500 mM, 및 더욱 보다 바람직한 농도는 75 내지 125 mM이다.
본 발명의 바람직한 AMPS 농도는 2 내지 640 ㎎/㎖, 보다 바람직한 농도는 5 내지 300 ㎎/㎖, 및 보다 더 바람직한 농도는 10 내지 150 ㎎/㎖이다.
본 발명의 바람직한 NVP 농도는 0.01 내지 40 ㎕/㎖, 보다 바람직한 농도는 0.1 내지 20 ㎕/㎖, 및 보다 더 바람직한 농도는 0.5 내지 10 ㎕/㎖이다.
본 발명의 바람직한 니코덴즈 (Nycodenz) 농도는 0.1 내지 100 %, 보다 바람직한 농도는 1 내지 50 %, 및 보다 더 바람직한 농도는 5 내지 25 %이다.
본 발명의 바람직한 레이져 세기는 10 mW/㎠ 내지 4 W/㎠, 보다 바람직한 세기는 25 mW/㎠ 내지 2 W/㎠, 및 보다 더 바람직한 세기는 75 mW/㎠ 내지 1 W/㎠이다.
본 발명의 바람직한 광원 조사 시간은 3초 내지 20분, 보다 바람직한 시간은 6초 내지 10분, 및 보다 더 바람직한 시간은 12초 내지 3분이다.
본 발명의 구현 예로서, 상기 캡슐화 물질은 하나 이상의 세포 또는 조직 주변에 구형물을 형성하는 하이드로겔을 포함한다. 본 발명의 보다 구현된 예로서, 상기 캡슐화 물질은 알지네이트 마이크로 캡슐로 이는 아크릴레이트 PEG를 함유한 다른 캡슐화 물질로 균일하게 코팅된 알지네이트 미세캡슐이다. 또 하나의 구현 예로서, 상기 세포 또는 조직은 히알루론 산과 같은 생체 적합성 물질내의 알지네이트를 코팅하고, 이 알지네이트를 정제하고 폴리-리신 (poly-lysine)을 제거하고/하거나, 이를 PEG로 대체하는 공정을 통하여 생체 적합성을 갖는 알지네이트 미세 캡슐에서 캡슐화될 수 있다.
가장 바람직하게는, 상기 치료되어야 할 질환은 당뇨병이고, 상기 세포 또는 조직은 인슐린 생성 세포 또는 조직, 췌장 세포 또는 조직 유래 세포 또는 조직, 인슐린 생성 세포로 전환되는 전구체 또는 줄기 세포로부터 유래되는 세포 또는 조직이고 상기 캡슐화된 세포 또는 조직은 피하 또는 간내로의 주입 또는 이식을 통하여 치료가 필요한 대상에게 투여된다.
본 발명의 구현 예에 따르면 본 발명의 캡슐화된 인슐린 생성 세포 또는 조직용 미세 캡슐의 평균 직경이 10 내지 1,000 ㎛, 바람직하게 100 내지 600 ㎛, 보다 바람직하게 150 내지 500 ㎛, 및 가장 바람직하게 200 내지 300 ㎛인 것일 수 있다. 또 다른 구현 예에서, 본 발명의 캡슐화된 인슐린 생성 세포 또는 조직용 미세 캡슐의 농도가 2,000 IEQ (섬 세포 등가물)/㎖ 이상, 바람직하게는 9,000 IEQ/㎖ 이상, 및 보다 바람직하게는 200,000 IEQ/㎖ 이상인 것일 수 있다. 본 발명의 다른 구현 예에서, 대상의 체중 kg 당 투여되는 미세 캡슐내 캡슐화된 인슐린 생성 세포 또는 조직의 부피는 0.001 내지 10 ㎖, 바람직하게 0.01 내지 7 ㎖, 보다 바람직하게 0.05 내지 2 ㎖인 것이다. 본 발명의 또 다른 구현 예로서, 본 발명의 미세캡슐 부피 대비 인슐린 생성 세포 또는 조직 부피의 비는 300:1 미만, 바람직하게는 100:1 미만, 보다 바람직하게는 50:1 미만 및 가장 바람직하게 20:1 미만인 것이다.
본 발명의 구현 예에 따르면, 본 발명의 균일하게 코팅된 인슐린 생성 세포 또는 조직의 평균 두께는 1 내지 400 ㎛, 바람직하게 10 내지 200 ㎛, 및 보다 바람직하게 10 내지 100 ㎛인 것이다. 또 다른 구현 예로서, 본 발명의 균일하게 코팅된 인슐린 생성 세포 또는 조직의 농도는 10,000 IEQ/㎖ 이상, 바람직하게는 70,000 IEQ/㎖ 이상, 보다 바람직하게 125,000 IEQ/㎖ 이상, 및 가장 바람직하게는 200,000 IEQ/㎖ 이상인 것이다. 본 발명의 구현 예에 따르면, 본 발명의 대상 체중 kg 당 투여되는 균일하게 코팅된 인슐린 생성 세포 또는 조직 부피는 0.01 내지 7 ㎖, 바람직하게 0.01 내지 2 ㎖, 그리고 보다 바람직하게 0.04 내지 0.5 ㎖인 것이다. 본 발명의 다른 구현 예로서, 균일한 코팅 부피 대비 인슐린 생성 세포 또는 조직 부피의 비는 13:1 미만, 바람직하게는 8:1 미만, 보다 바람직하게는 5:1 미만 및 가장 바람직하게는 2.5:1 미만인 것이다.
본 발명의 구현 예에 따르면, 캡슐화된 세포 또는 조직의 미세 캡슐의 평균 직경은 10 내지 1000 ㎛, 바람직하게 100 내지 600 ㎛, 보다 바람직하게 150 내지 500 ㎛, 그리고 가장 바람직하게 200 내지 300 ㎛인 것이다. 본 발명의 보다 구현된 예에 따르면, 미세 캡슐 부피 대비 인슐린 생성 세포 또는 조직 부피의 비는 300:1 미만, 바람직하게는 100:1 미만, 보다 바람직하게는 50:1 미만, 및 가장 바람직하게는 20:1 미만인 것이다.
본 발명의 구현 예에 따르면, 균일하게 코팅된 세포 또는 조직의 막두께는 1 내지 400 ㎛, 바람직하게는 10 내지 200 ㎛, 및 보다 바람직하게는 10 내지 100 ㎛인 것이다. 본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 균일한 코팅 부피 대비 세포 또는 조직 부피의 비는 13:1 미만, 바람직하게는 8:1 미만, 보다 바람직하게는 5:1 미만, 및 가장 바람직하게는 2.5:1 미만인 것이다.
본 발명의 구현 예는 캡슐화된 세포 또는 조직 세포 밀도가 약 100,000 cells/㎖ 이상인 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 캡슐화된 세포는 균일하게 코팅된 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 세포는 아크릴레이트 PEG로 이루어진 캡슐화 물질로 균일하게 코팅된 것이다. 본 발명의 보다 구현된 예에 따르면, 본 발명은 세포 밀도가 적어도 약 6,000,000 cells/㎖ 이상의 세포 밀도, 바람직하게는 대상 체중 kg 당 약 2 ㎖ 미만의 유효투여량의 캡슐화된 랑게르한스 섬 세포를 투여함을 포함하는 대상 내 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구현 예로는, 동물 또는 가축 성장률을 변화시키거나 동물의 상태 (예를 들면, 육류 또는 낙농제품을 증가시킴)를 전환시키거나 이러한 동물의 다양한 질병을 치료 또는 이로부터 보호 또는 치료하기 위한 소, 양, 말, 돼지, 닭, 칠면조, 토끼, 물고기 또는 개 그리고 고양이와 같은 농장 동물 또는 애완동물에 관한 것이다. 본 발명의 구현 예에 따르면, 본 발명의 세포 또는 조직을 농업적으로 관련 있는 동물에게 상기 세포 또는 조직을 제공하는 방법은: (a) 세포 또는 조직을 제공하는 단계; (b) 알지네이트, 아가로오스, 키토산, 폴리 (아미노산), 히알루론산, 황산콘드로이친, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 셀페이트, 헤파란 설페이트 (heparan sulfate), 겔란 검 (gellan gum), 산탄 검 (xanthan gum), 구아 검 (guar gum), 수용성 셀룰로오즈 유도체, 카라기난과 같은 다당체 또는 젤라틴, 콜라겐, 알부민과 같은 단백질 또는 에틸렌성 불포화기를 갖는 수용성 합성 중합체 또는 폴리 (메틸 메타아크릴레이트, PMMA) 또는 폴리 (2-하이드록시에틸 메타아크릴레이트)(HEMA), 폴리 (에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리 (에틸렌 옥시드)(PEO), 폴리 (비닐 알코올) (PVA), 폴리 (비닐 피롤리돈) (PVP), 폴리 (틸록사졸린)(PEOX)와 같은 이들의 유도체; 또는 PEG 또는 폴리 (글리콜 산)(PGA), 폴리 (락트 산)(PLA), 또는 이들의 공중합체 (PLA-GA), 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)과 같은 보다 소수성을 갖거나 수불용성을 갖는 중합체와 알지네이트와 같은 상기물질들과의 조합을 포함하는 물리학적 또는 화학적으로 가교결합 가능한 중합체로 제조된 하이드로 겔과 같은 적어도 하나 이상의 캡슐화 물질내 상기 세포 또는 조직을 봉합하는 단계 및 치료학적으로 효과적인 양의 상기 캡슐화된 세포 또는 조직을 치료가 필요한 대상에게 피하주사 또는 이식, 또는 장기로의 직접 주사 또는 이러한 장기의 순환계를 통한 주사 중 어느 하나의 방법으로 장기내로 직접 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 정의되는 바와 같이, 본원 정의는 하기와 같이 적용된다:
동종이식 (allografts)-하나 이상의 부위에서 (일반적으로 조직 적합성 부위와 관련하여) 서로 다른 HLA 또는 BLC 면역 항원 조립을 갖는 2 이상의 개체간의 이식.
무흉선 마우스 (athymic mice)- 불완전한 면역 시스템을 가진다.
자가이식 (autograft)-신체의 한 부위로부터 얻어 동일한 개체로 돌려주는 이식.
ApoE2- 신체를 통하여 지질을 옮기는 단백질.
생체 적합성 (biocompatibility)- 해를 주지 않고 기존 생존물과 같이 존재하는 능력.
세포 응집물 (cell aggregate)- 물질, 세포 간질, 또는 구조를 접합함으로써 결합된 세포 덩어리, 단위체 (unit) 또는 세포 기관으로의 집합체.
임상학적으로 관련되고 임상학적 적절성 (Clinically relevant and Clinical relevance)- 세포 또는 조직을 캡슐화하는 기구는 현재의 질환 및 장애를 당면한 질환 및 장애를 가진 숙주보다 낮은 위험/이익 비율을 갖는 기능을 갖기 위하여 최소한 침윤 또는 최대한 생리적인 부위에 이식이 가능한 그러한 총 부피 및 크기여야 한다.
CMRL (Connaught Medical Reserch Labs) 배양액- 말 또는 송아지 혈청이 풍부할 때, 복제 원숭이 신장 세포 배양의 성장 및 다른 포유류 세포 주의 성장을 위해 적합한 배양액. 특히 뉴클레오타이드 및 일부 비타민이 풍부.
상업적으로 관련된 그리고 상업적인 적절성-세포를 캡슐화하는 기구는 시장에서 성공적인 상품으로서 수용되는 범위 내에서 설계되어야 하며 질병 진행중의 치료를 위하여 계속적으로 생산되기 위해 생체 적합성, 침투선택성, 캡슐화된 세포의 생존성 및 기능, 크기, 세포 회복 또는 교체, 그리고 치료적인 효과와 같은 요구를 충족시킬 수 있어야 한다.
균일한 코팅- 코팅된 입자의 모양과 크기에 따르는 상대적으로 얇은 중합체 코팅.
C-펩티드 (C-peptide)- 활성 인슐린의 알파 및 베타 사슬을 결합하는 인슐린의 전구물질 (proinsulin) 내 폴리펩티드 사슬. 인슐린은 초기에 인슐린 전구물질의 형태로 합성된다. 혈액 내 모든 인슐린 분자들에 대한 하나의 C-펩티드 분자가 있다. 혈액 내 C-펩티드 수치는 외부 인슐린 (주사로부터)이 존재하여 내부인슐린 (신체에 의해 생성되는)과 혼합될 때, 인슐린 생성 표시자로서 측정 및 이용될 수 있다. C-펩티드 시험법은 또한 고혈당이, 감소된 인슐린 생성 또는 세포에 의해 흡입되는 감소된 포도당 때문인지 여부를 알아보기 위하여 평가하는데 사용될 수 있다. 제 1형 당뇨병은 거의 또는 전혀 혈액 내에 C-펩티드를 갖고 있지 않으며, 반면 제 2형 당뇨병은 감소된 또는 정상의 C-펩티드 수치를 가질 수 있다. 비당뇨성에서 C-펩티드의 농도는 0.5-3.0 ng/㎖이다.
시노몰거스 영장류 -영명: crab-eating macaque, 학명: 짧은 꼬리 원숭이 (Macacafascicularis)는 동남아시아에 분포한다.
사이토덱스 비드 (cytodex beads)- 양전하로 표면에 트리메틸-2-하이드록시아미노프로필 기를 갖는 덱스트란의 마이크로캐리어 비드 (microcarrier beads).
덴드리머 (dendrimer)- 단량체라고 불리는 가지가 뻗은 단위체로부터 조립된 인공적으로 제조된 또는 합성된 중합체 분자. 단분산 (monodisperse), 나무형 (tree like) 또는 세대간(generational) 구조를 유도하는 일정하고 매우 가지가 많은 단량체로 정의됨. 덴드리머를 하나의 단량체 층 또는 동시에 "세대"로 구성하는 단계적인 반응을 통하여 합성됨. 각 덴드리머는 각 기능적인 부위에 부착된 나뭇가지 모양의 쐐기 (dendritic wedge)를 갖는 다양한 기능의 핵심 분자로 이루어져 있다. 핵심 분자는 "세대 0"로 기재된다. 모든 가지 형태를 따라 개개의 연속적인 반복 단위체는 다음 세대, 즉 "세대 1", "세대 2" 등 세대가 종료될 때까지 후속 세대를 형성한다.
당뇨병- 유전적 결합과 환경적 요인에 의해 야기되고 일반적으로 인슐린의 부적절한 분비 또는 이의 이용, 과도한 소변 생성, 혈액과 소변내의 과도한 당량, 그리고 목마름 배고픔, 체중의 감소 등의 특징화 되는 탄수화물 대사의 다양한 장애. 디페닐티오카르바존- 인슐린 입자 내에서 아연과 결합하는 염색시료. 에오신 Y- C2OH605Br4Na2 [MW 691.914]의 화학식으로 표기되며, 물(40%)에서 용해되고 강한 형광을 띠는 빨간 염색시료. 구조는 에오신(Eosin) Y ws, 에틸 에오신(Ethyl eosin), 에오신 B(Eosin B), 플로신(Phloxine), 에리트로신 B(Erythrosin B), 플르오르신(Fluorescein), 로제 벤갈(Rose bengal), 그리고 머큐로크롬(Mercurochrome)과 유사하다.
에반스 불루 염색약(Evan's blue staining)- 염색시료 희석 방법에 의해 혈액 부피와 심장의 산출량 측정 사용되는 아조(azo)계 염색 시약. 매우 용해가 잘 되고 원형질 알부민과 강하게 결합하며 매우 천천히 소실된다.
피콜(Ficoll)- 세포들을 분리하는데 사용되는 고분자 중량 자당-중합체.
플루오르신 디아세테이트/ 브롬화 에티듐(fluorescein diacetate/ethidium bromide) 염색- 염색시, 살아 있는 세포들은 녹색을 띤 세포로 보여지는 반면, 세포파괴와 손상된 세포 막 기능을 갖는 세포는 핵이 빨간 색을 띤다.
"굿"("Good") 완충제- 굿(N.E. Good) 및 이자와(S.lzawa)에 의해 개발된 완충제의 그룹 (수소 이온 완충제, Methods Enzymol(1972) 24, 53-68).
HbA1c 시험법 [Hemoglobin A1C ; 당화 헤모글로빈과 동등]- 당뇨병에서 장기간 포도당 조절을 평가하기 위해 사용되는 시험법. 이 시험법에 대한 대체가능한 명칭은 글리코실화된 헤모글로빈(glycosylated hemoglobin) 또는 Hgb, 헤모글로빈 글리케이티드 (hemoglobin glycated) 또는 글리코실화된 단백질(glycosylated protein) 그리고 프룩토사민(fructosamine)이 존재. HbA1c는 적혈구내에 존재하는 총 글리코실화된 헤모글로빈(glycosylated hemoglobin)을 나타낸다. 포도당이 세포의 생명을 위해 부착된 채로 있기 때문에 (약 3개월), 시험은 4-8주 기간 이상의 사람의 평균 혈당치를 나타낸다. 이것은 장기간 안정적인 조절을 유지할 능력이 있는 환자를 감시하기에 더욱 적절한 시험법이다. 시험 결과는 백분율로 표현되고 4-6%가 정상으로 간주된다.
HbA1c "큰 그림(big picture)"- 혈당(mg/dL)의 자기모니터링으로부터 얻어진 일상적인 "스냅샷 (snapshots)"을 보완한 것. 두 시험법은 다음의 변환 방정식으로 연관시킬 수 있다.:즉, HbA1c=(혈장당+77.3)/35.6. 혈청/혈장 내 당화 단백질은 1-2주의 기간 이상의 당화 대조군을 측정한다. 하기한 정상측정 대상 수치는 환자의 저혈당 상태를 확인하는데 도움이 된다.
HEMA(2-hydroxyethyl methacrylate)- 스크래칭 (scraching), 용매, 헐음(weathering)에 대하여 고 광택을 유지시키기 위한 고성능의 코팅 및 광 경화 중합체 시스템에서 사용된다. 가교결합 가능한 착색용 수지 및 직물 및 종이용 결합제, 유제로 사용된다. 금속 코팅을 위한 점도 증강제로써 사용된다.
IBMX- 강력한 c-뉴클레오티드 포스포 디에스테라제 저해제; 이 화합물들은 그 활성으로 인하여 조직 내 c-AMP 및 c-GMP 농도를 증가시키고 다중 세포 과정들을 활성화시킨다.
복강내(Intraperitoneal)- 복부의 기관을 포함하는 복막강 내부.
IEQ (섬세포 등가물)- 인슐린 양과 형태/크기에 기초한 정의. 디페닐티오카바존(DTZ)과 같은 염색시료와 결합하는 인슐린 입자는 통상 베타 세포를 동정하는데 사용된다. 베타 세포는 랑게르한스 섬 세포를 구성하기 위해 필요한 많은 다른 세포 형태 중 하나이기 때문에, 평균 직경 150m에 바탕을 둔 형태학적 평가는 랑게르한스섬 세포 등가물을 정의하기 위해서 DTZ에 의한 염색과 함께 사용된다.
M199- 병아리 배아(chick embryo?) 섬유아세포의 영양 연구를 위해 최초로 조제된 것. 얼씨 염(Earle's salt), L-글루타민, 및 2,200mg/L 나트륨 중탄산염을 함유한다.
어린이의 성숙기 발병 당뇨병(Maturity Onset Diabetes of the Young; MODY)- 조기 발병(통상 25세 미만), 환자 가족 2세대이상에서 당뇨병을 갖는 상염색체의 우성 유전(즉, 부모의 아이들에게 50% 유전된다)으로 특징되는 당뇨병의 한 형태, MODY 당뇨병- 당뇨병의 초기 단계에서 식이요법 혹은 당뇨병약으로 조절가능한 당뇨병. 환자가 인슐린 분비 혹은 포도당 대사에 있어서 결함을 가지고 있으나 인슐린에 대한 저항성은 없다는 점에서 2형 당뇨병과 상이하다. MODY는 전 세계적으로 알려진 당뇨병의 약 2%를 차지하고 모든 MODY 환자들이 이 유전자 중 하나를 가지고 있지 않음에도 불구하고 MODY의 원인이 되는 6개의 유전자들이 지금까지 발견되었다. MODY는 유전적이기 때문에 당뇨병 유전자를 연구하기에 매우 유용하고, 연구자에게 인슐린이 생성되고 췌장에 의해서 조절되는 방법에 대한 유용한 정보를 준다.
MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포- 다수 바이러스종에 많은 바이러스 종에 감염되기 쉬운 정상개의 신장으로부터 얻어지는 상피세포유사 세포주.
미세 캡슐 (Microcapsules)- 코팅 또는 껍질에 의해 둘러 싸여있는 활성화 제 또는 핵심 물질을 포함하는 작은 입자.
MMA (methylmethacrylate)- 약간의 자극성 냄새를 지닌 무색 액체인 아크릴 단량체.
NIT (NOD insulinoma tumor) 세포 주- 유전변이적 NOD 쥐의 췌장 베타 세포로부터 발생된 세포주.
NVP (N-vinyl pyrrolidinone)- 2-피롤리돈과 아세틸렌과의 반응에 의해 생성된 단량체. 이응 다양한 적용분야에서 반응 희석제로 사용된다.
니코덴즈 (Nycomed Pharma, Oslo, Norway))- 밀도 경사(density gradients)를 만들기 위해 사용되는 비이온성 X-선 조영 배지일종인 디아트리조인 산 (diatrizoic acid), 니코덴즈(Nycodenz) 용해제의 장점은 넓은 범위에 걸친 삼투몰 농도 및 밀도가 쉽게 제조된다. 효과적인 척수조영술(myelography), 관절조영술(arthrography), 신장조영술(nephroangiography), 동맥조영술(arteriopraphy), 및 기타 방사선 조영술(radiography)에 사용되는 효과적인 비이온성 물-수용성 조영제.
경구용 포도당 내성 시험법 (Oral Glucose Tolerance Testing; OGTT)- 포도당 75 g을 함유한 액제를 마신 후, 사람의 혈장 포도당 수치를 검사하는 것을 포함하는 당뇨병에 대한 스크리닝 시험법. 현재, 만약 포도당을 섭취한 후 두시간이 경과 후 그 혈장 포도당 수치가 200 mg/dL 이상이라면 그 사람은 당뇨병으로 진단된다. 200 mg/dL보다 적지만 140 mg/dL보다 크거나 같은 혈장 포도당 수치를 갖는 사람은 약한 포도당 내성으로 불리는 상태로 진단된다. 이런 상태의 사람들은 포도당을 대사시키는 데에 문제점이 있지만 그 문제점은 당뇨병 환자로 분류될 만큼 심각한 것으로 여겨지지는 않는다. 약한 포도당 내성을 갖는 사람들은 고혈압, 혈중 지질 장애, 및 2형 당뇨병으로 진행될 위험성이 약간 높은 상태로 판단한다.
침투 투과성 (Permselectivity)- 막을 통한 특정 이온의 선택적인 투과성.
PoERV (porcine endogenousretrovirus)- 본 바이러스는 모든 포유류에서 DNA의 일부분으로 존재하는 내인성 바이러스로 수세대를 통해 후손에게 물려줌.
식후 (postprandial)- 식사후에 발생함. 전인슐린 (proinsulin)- 3개의 단위 즉, C-펩티드, 알파사슬 및 베타사슬로 쪼개지는 췌장 베타 세포에 의해 만들어진 단백질. 이 알파 및 베타 사슬은 인슐린의 기능적 단위임.
SGS (Static glucose stimulation; 정적 포도당 자극)- 서로 상이한 포도당 농도에 반응하여 인슐린을 분리하기 위한 랑게르한스섬 세포의 능력을 평가하는 정적 포도당 자극.
스트렙토조토신 (streptozotosin)- 방선균(Streptomyces achromogenes)에 의해서 생성되고 종양에 대하여 효력이 있지만 인슐린-생산 세포에 손상을 주고 또한 발암성 물질로 여겨지는 항생물질, C8H5N307.
테오필린 (Theophylline)- 카테콜아민 분비를 자극하고 뇌혈류량을 감소시키고 그것에 의해서 보다 강한 대사 반응 및 혈당치 감소의 인지를 촉진시킴.
치료학적으로 효과적인 양- 필요로 하는 객체에게 투여 시, 질병 또는 질환을 치료하기에 충분한 동물의 성장률을 효과적으로 변화시키거나 동물의 상태를 바꾸기에 충분한, 세포 혹은 조직으로부터 생성되는 치료제의 양. "치료학적으로 효과적인 양"에 상응하는 캡슐화된 세포나 조직의 양은 질병 상태 및 상태의 심각성, 필요로 하는 객체의 주체, 질병 또는 질환을 위해 세포 또는 조직으로부터 운반된 치료제의 종류 등과 같은 인자에 따라 변화될 수 있으나, 당업자에 의해 용이하게 결정되어질 수 있을 것이다.
치료 및 치료법- 치료학적으로 효과적인 양의 상기 캡슐화된 세포 또는 조직을 치료가 필요한 대상에게 피하주사 또는 이식, 또는 장기로의 직접 주사 또는 이러한 장기의 순환계를 통한 주사 중 어느 하나의 방법으로 장기내로 직접 투여함으로서 질병 또는 질환을 경감시키는 것으로 다음을 포함한다: (a) 특히 객체가 아직 질병 또는 장애를 가지고 있다는 진단 받지 않았으나 질병 또는 장애를 가지기 쉽다는 것이 발견되었을 때 객체에서의 예방적 치료; (b) 질병 또는 장애를 억제하는 것; 및/또는 (c) 전체 또는 부분적으로 질병 또는 장애를 제거하는 것; 및/또는 (d) 객체의 건강과 복지를 개선시키는 것.
1형 당뇨병 (또한 인슐린-의존적 당뇨병, 인슐린의존적 당뇨병 멜리투스; insulin dependent diabetes, insulin-dependent diabetes mellitus)- 보통 유아기나 청년기 동안 발생하고 랑게르한스섬세포의 퇴화의 결과로써 인슐린 분비의 심각한 결함의 특징을 보이고 고혈당과 케토산증으로의 진행을 야기시키는 당뇨병 멜리투스(mellitus)의 일반적인 형태.
2형 당뇨병 (또한 인슐린-비의존적 당뇨병, 인슐린 비의존적 당뇨병 멜리투스; non-insulin dependent diabetes, non-insulin-dependent diabetes mellitus)- 성인 또는 종종 비만자에서 특히 빈발하고 증가된 인슐린 생산을 보상하는 신체상의 무능력증과 함께 인슐린 사용상의 결함으로 인한 고혈당증으로 특징되는 당뇨병 멜리투스(mellitus)의 일반적 형태.
이종이식- 한 종의 조직을 서로 상이한 종, 속, 또는 과에게 외과적 이식하는 것. 또는 이종조직 이식술 (heteroplastic graft)로써 알려짐.
본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에게 캡슐화된 생물학적 물질을 이식함으로서 질환 또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 인슐린-요구성 당뇨병에 있어서 혈당 조절상의 결함으로 인한 합병증을 예방하는데 요구되는 방법이기 때문에 당병은 본 발명에 있어서 특히 중요한 분야이다.
구체적으로는, 영장류에서 PEG로 균일하게 코팅된 랑게르한스섬 세포 동종이식은 본원에서 주사에 의해 피하 부분에 성공적으로 이식되고 이식후 220일 정도까지 상대적으로 정상적인 혈당치를 달성할 수 있는 것으로 나타냈다. 임상적 랑게르한스섬 세포 이식에 의한 현재의 합병증 및 심각한 위험요소 및 연속되는 면역억제투여에 의한 불편함은 인슐린-요구성 당뇨병 질환 환자에게 있어 본원에 기재된 방법을 적용시킴으로서 제거될 수 있을 것이다. 덧붙여, 캡슐화된 랑게르한스 섬 세포 이식은 이러한 인슐린-요구성 당뇨병 환자들을 보호하고 외인성 인슐린 치료에도 불구하고 부적절한 혈당 조절과 관련된 당뇨병에서 유래되는 합병증 진행을 방지할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에 따른 방법은 당뇨병 이외에 다양한 질병과 장애에 대하여 치료학적 효과를 제공할 것이고, 이러한 질환 또는 장애로 인하여 소실된 주요한 세포-기반 물질들을 신체 내로 세포 또는 조직의 이식을 통해 교체될 수 있을 것이다. 본 발명의 바람직한 구현 예로서, 인슐린 요구성 환자의 인체 피하부위로의 이식을 위한 세포 집단으로서의 캡슐화되는, 췌장으로부터 분리되는 인간 인슐린-생성 세포, 또는 췌장으로부터 분리되는 인간 인슐린-생성 세포로부터 유래된 세포들의 사용이다. 치료상의 효과가 나타나기 전에 치료받을 환자의 면역 시스템이 파괴하지 않을 정도로 생물학적물질을 통한 질병치료는 캡슐화된 생물학적 물질이 생체적합적인 코팅으로 코팅되어야 함을 요구한다.
코팅의 침투 선택성은 세포 또는 조직에 영양분의 유용성을 조절하고 생물학적 물질의 거부반응을 방지하는 역할을 하기 때문에 이러한 치료의 효능에 있어 하나의 인자가 된다. 코팅의 침투 선택성은 세포 또는 조직의 기능성뿐만 아니라 캡슐화된 세포 또는 조직에 유용한 영양분에 영향을 끼친다. 침투선택성은 생체 적합적 코팅제의 조성을 변화시키거나 그 조성이 세포 코팅을 하는데 사용된 방법을 변화시킴으로서 조절될 수 있다. 본 발명에 따른 캡슐화된 생물학적 물질의 주사를 통한 치료는 치료상 안정하고 안전한 치료방법을 제공한다.
캡슐화된 물질의 교체 및/또는 보충뿐만 아니라 이식물의 크기와 이식부위는 본원에 기재된 방법에 있어서 또한 고려되어야 할 사항이다. 이러한 방법들은 기타 치료방법에 의해 수반되는 합병증을 회피하면서 다양한 이식 부위에서의 질병 치료 상에서 넓은 범위의 적용을 갖는 치료방법을 제공한다.
본원에 기재된 균일한 코팅은 항체의 외포를 포함한 폭넓은 분자량 범위를 갖는 단백질에 의한 세포로의 접근을 제한할 수 있는 서로 다른 구멍 크기로 제조될 수 있다. 이러한 조절은 숙주의 면역 시스템상의 구성요소를 제외하면서 캡슐화된 물질의 기능을 유지시키고 생존하게 한다. 균일한 코팅의 적절한 구멍 크기는 각각의 세포 또는 조직 형태 및 치료대상 질환 또는 장애에 대한 일상적인 실험 과정을 통하여 결정될 수 있다. 본원에 기재된 균일한 코팅은 코팅 물질의 최소 부피를 갖는 작은 캡슐화된 세포 생성물을 제공함으로서 코팅된 물질이 간, 비장, 근육 또는 기타 기관 내로의 직접 주사, 기관에 접근하기 위한 혈관 주사, 복강 내로의 주사 및 피하 부위로의 이식을 포함하여 신체의 다양한 부위로 이식되도록 한다.
성공적인 캡슐화된 세포 치료를 위한 중요한 인자는 세포를 캡슐화하는데 사용되는 침투 선택적 코팅이 숙주에서 염증을 일으키는 반응을 야기시키는 것에 대해 불활성을 갖도록 해야 한다. 대부분의 기존 캡슐화 물질들은 완벽하게 생체조직과 잘 결합되지 않았다. 큰 상처를 내지 않는 몇몇 기구들이면 충분하다. 그러나 캡슐화된 세포와 숙주의 면역 시스템 사이의 침투 선택적 보호를 위한 코팅방법을 사용시 숙주의 보체 시스템 또는 대식세포에 대한 어떠한 비특이적 염증반응이 생기지 않아야 한다. 만약 염증 반응이 발생한다면, 이러한 염증 반응 및/또는 면역성 반응이 쉽게 세포막을 가로 질러 통과함으로서 캡슐화된 세포의 손실을 가져올 수 있는 시토카인을 분비할 우려가 충분하다. 작업상 어려움이 있었던 대부분의 랑게르한스섬 세포 캡슐화 기술은 코팅 물질에 대한 생체적합성으로 인하여 비특이적 염증반응을 일으키는 문제점을 갖는다.
본원에 기재된 세포 및 조직을 캡슐화하는데 사용된 생체적합적인 균일한 코팅에 대한 숙주반응의 결핍 덕분으로 때문에 만성 염증과 같은 문제점은 크게 감소된다. 본원에 기재된 균일한 코팅을 만드는데 사용된 구성요소들은 설치류, 개, 돼지 및 영장류와 같은 동물에게 주사될 때 완전히 생체적합적임을 나타냈다.
본 발명자는 많이 아크릴화된 PEG로부터 합성된 하이드로겔의 생체 결합성이 매우 우수하고, 중정도로 아크릴화된 PEG 하이드로겔이 더욱 생체적합성이 탁월함을 발견했다. 많이 아크릴화된 PEG는 상업적으로 구입 가능하거나상응하는 PEG를 아크릴화한 수작업으로 제조가능하다. 많이 아크릴화된 PEG를 갖는 하이드로겔은 계면 광중합기술을 이용하여 알지네이트 미세비드 표면상에 균일하게 코팅된다. 이러한 발견은 기구 또는 조제상의 생체적합성이 요구되는 기타 생의학 분야, 생물공학 분야 및 약학 분야로 응용이 가능하다.
본원에 기재된 PEG 균일한 코팅은 시간이 지나도 생체적합성을 가지므로 신체는 시간이 경과하면 물질을 신체 내에서 안전하게 분해시키고 다른 치료법에서 요구되는 캡슐화된 물질을 회수할 필요가 없다. 캡슐화된 물질의 기존 용량이 기능을 소실하기 시작할 때마다 세포 교체가 가능하다. 캡슐화된 랑게르한스섬 세포는 2년 내지 5년 또는 더 오랜 기간 동안 지속될 것으로 예상된다. 피하 주사 시, 캡슐화된 물질의 교체는 기존 용량의 손실이 발생하기 전에 다른 부위에 환자에게 새로운 물질을 추가로 피하주사를 함으로서 쉽게 이루어질 수 있을 것이다. 캡슐화된 랑게르한스섬 세포의 경우에, 이러한 교체는 저혈당을 방지하기 위해 랑게르한스섬 세포 스스로 자가조절을 하기 때문에, 저혈당에 대한 위험이 없이 랑게르한스섬 세포의 최초투여 용량상의 기능 손실이 있기 전에 수행될 수 있다. 서로 상이한 이식시간 조절은 생성물분비를 자가 조절하지 않는 세포 또는 조직을 이용함으로서 질병 및 장애의 치료를 위해 결정되어야 할 수도 있다.
캡슐화된 세포 생성물을 생성하는 하나의 인자는 세포원(cell source)이다. 상기 세포는 1차 세포, 팽창된 세포, 분화 세포, 세포주 또는 유전공학 기술에 의한 세포들이 될 수 있다. 인간의 랑게르한스섬 세포의 경우, 1차 섬 세포는 기부된 시체 췌장으로부터 분리가능하다; 그러나 랑게르한스섬세포를 분리를 위해 유용한 인간 췌장의 수는 매우 제한되어 있다. 세포 캡슐화 및 주사를 위한 세포를 제공하는 데에 있어 대체가능한 다른 세포원도 사용 가능하다.
특히 인슐린 세포에 있어 대체가능한 세포원은 배아 줄기 세포이다. 인간 배아 줄기 세포는 초기 태아로부터 유래된다. 체외 수정을 성공적으로 수행하고 더 이상의 자녀가 필요하지 않아 이러한 수정란을 필요로 하지 않는 성인 커플로부터 수집된 냉동된 수정란으로부터 배양되는 경우만 이러한 줄기 세포의 수집이 가능하다. 배아 줄기 세포는 이식 시 필요한 조직 덩어리가 요구되는 것을 잠재적으로 회피하고 무제한적으로 성장하는 능력을 갖는다. 이러한 배아줄기 세포가 임상적 적절성을 갖는 인슐린 생성 세포로 분화시키는데 요구되는 일련의 단계가 있다. 소수의 연구를 통하여 쥐 및 인간 배아 줄기 세포는 다양한 요소를 갖는 조직 배양 하에서 인슐린을 생성시킬 수 있다는 것을 발견했다. 배아 줄기 세포로부터 발생한 인슐린-생성 세포는 이식, 캡슐화된 세포 또는 조직 이식을 위한 적합한 세포원이 될 수 있을 수 있다.
세포원 (cell sourcing)- 뇌, 간, 및 장으로부터 유래된 기관 특이적 원종 세포와 같은 추가적인 세포원들이 인슐린을 생성하는 것으로 나타났다. 인슐린을 생성하기 위해 각각의 이러한 기관 특이적 원종 세포들은 다양한 성장 및 분화 인자로 조직 배양 처리가 수행되었다. 골수, 신장, 비장, 근육, 뼈, 연골, 혈관과 같은 다수 기타 기관 및 기타 내분비 기관으로부터 유래된 기관 특이적 원종 세포들이 인슐린 생성 세포를 추가적으로 제공하는데 유용하다.
췌장성 원종 세포가 본 발명의 방법에 따라 사용 가능하다. 췌장은 정상 및 회복 조건하의 신체에서 3가지 췌장 세포 형태를 생산할 수 있는 기관 특이적 줄기 세포를 갖는 것 같다. 구분되는 랑게르한스섬 세포를 형성하기 위해 도관 세포로부터 랑게르한스섬 세포가 발생하는 것으로 믿어진다. 기타 호르몬 생성 세포뿐만 아니라 인슐린 생성 베타 세포는 분화성 도관 세포로부터 직접적으로 형성되거나 도관 세포 중에 존재하는 췌장 원종 세포로부터 형성될 수 있다. 이러한 췌장 원종 세포는 본원에 기재된 방법에 따른 이식 및 캡슐화를 위한 인슐린-생성 세포를 제공하는데 사용될 수 있다.
인슐린을 생성하지 못하는 세포로 하여금 인슐린을 생성하게 하기 위해 유전공학적으로 인슐린을 생성하지 못하는 세포 내부에 유전자를 삽입하는 수 많은 연구들이 시행되어 왔다. 인슐린을 생성할 수 있는 유전공학적으로 설계된 세포는 본원에 기재된 방법에 따라 캡슐화 및 이식에 사용 가능하다.
일반적으로 당뇨병 환자에 이식을 위한 랑게르한스섬 세포원으로서 의 소스로써 돼지 세포의 사용이 고려되어 왔다. 미국에서만 식용으로 일년에 9천만 마리 이상의 돼지가 사육되고 있다. 따라서 인슐린 요구성 당뇨병을 갖는 수백만 환자를 치료할 수많은 랑게르한스 섬 세포를 캡슐화를 위해 성인 돼지 췌장을 정제된 돼지 랑게르한스섬 세포내부로의 거대 규모의 가공을 통해 쉽게 수득 가능하다. 이런 선택을 제한하는 하나의 고려사항은 돼지들이 잠복성의 내생 리트로바이러스(PoERV)를 갖고 있다는 것을 인식해야 한다는 점이다. 돼지의 계통으로부터의 내생 리트로바이러스를 제거하기 위한 노력이 있어 왔다. 바이러스제거 돼지 랑게르한스섬세포 이종이식물은 쉽게 캡슐화되고, 인간의 당뇨병의 치료를 위한 바람직한 세포원으로서 이용될 수 있다.
인체 이식을 위한 대안적인 이종이식원으로는 돼지가 아닌 다른 종의 1차 세포로부터 수득 가능하다. 이런 다른 종들은 소, 양, 심지어 물고기와 같은 농업상으로 적절한 동물들이 될 수 있다. 췌장원 또는 다른 줄기 또는 원종 세포로부터 유래된 인슐린 생성 세포를 분화하고 확대할 수 있는 방법으로 영장류, 설치류, 토끼, 어류, 유대류, 유제류 등과 같은 수많은 다른 이종이식원 및 기타 근원으로부터 유래된 인슐린-생성 세포를 사용할 수 있음은 당업자가 있어 용이하게 생각될 수 있을 것이다.
질환 치료 - 국부적인 혹은 순환하는 인자가 결핍되거나 소실된 당뇨병 및 기타 질병들은 본원에 기재된 방법에 의해 치료가능하다. 캡슐화 세포 치료법은 신경계, 심혈관계, 간장, 내분비계, 피부, 조혈계, 및 면역성 질환 및 질환 치료에 적용가능하다.
파킨슨씨 병, 알츠하이머 병, 헌팅톤 병, 다발성 경화증, 시력장애, 척수 손상, 말초신경 손상, 통증 및 중독과 같은 신경계 질병 및 손상들은 이러한 문제점을 치료하는데 필요한 국부적 및/또는 순환하는 인자들을 분비시킬수 있는 세포를 캡슐화함으로서 치료 가능하다. 관상 동맥과 같은 심혈관계 조직뿐만 아니라 심근, 판막 그리고 작은 혈관들에게 혈류 공급능을 회복시키는데 필요한 혈관 신생 성장 인자 분비 세포들도 치료가능하다. 급성 간기능 부전, 만성 간기능 부전 및 간에 영향을 미치는 유전병들이 치료가능하다. 당뇨병, 비만, 스트레스와 같은 내분비 질환 및 장애 부신, 부갑상선, 고환, 난소계 질환들도 치료 가능하다. 만성 궤양과 같은 피부질환 및 진피 및 모발 줄기 세포 질병도 치료가능 하다. Ⅷ 인자 및 조혈생성인자(EPO)와 같은 조혈인자들도 환자내에서 조혈 반응을 자극시킬 수 있는 세포들을 투여함에 의해 조절 또는 통제가 가능하다. 캡슐화된 생물학적 물질들은 골수 줄기 세포 생성에 있어서도 또한 유용할 수 있다. 1차 세포로부터 유래된 항원 또는 유전공학적 세포들과 같은 캡슐화된 물질들은 면역 내성을 형성시키거나 자가면역 질환을 예방하는 데에 유용할 수 있다. 또한 이런 물질들은 백신에 있어서도 사용가능하다.
균일한 코팅 구성요소 - 코팅의 구성요소는 특정 세포 형태 및 원하는 침투 선택성에 따라 변경 가능하다. 다양한 중합가능한 단량체 또는 다량체(macromer), 광개시용 염료, 조촉매 및 촉진제들이 균일하게 세포 및 조직을 코팅하는데 사용 가능하다.
단량체 또는 다량체- 단량체 또는 다량체들은 본원에 개시된 방법으로 사용하기 위해 생체적합적인 코팅물을 중합시키기 위한 구조물로서 사용가능하다. 단량체들은 본 발명의 좀 더 큰 중합체막으로 중합되기 쉬운 작은 중합체이다. 상기 단량체는 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 에타크릴레이트, 2-페닐 아크릴레이트, 2-클로로 아크릴레이트, 2-브로모 아크릴레이트, 이티코네이트(itaconate), 아크릴아미드, 메타크릴아미드 및 스티렌기와 같은 탄소-탄소 이중 결합 잔기를 포함하기 때문에 중합반응이 가능하다.
단량체 또는 다형체들은 중합반응 전후에 생물학적 물질에 대해 무독성이 었다.
단량체의 예로는 메틸 메타크릴레이트(MMA) 및 2-히드록실에틸 메타크릴레이트(HEMA)를 들 수 있다. 다량체의 예로는 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(비닐피롤리돈)(PVP), 폴리(틸록사졸린)(PEOX), 폴리(아미노산), 알지네이트, 히알루론 산, 콘드로틴 황산염, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 헤파린, 헤파린 황산염, 헤파란 황산염, 키토산, 젤란검, 크산탄검, 구아 검과 같은 다당체, 수용성 셀룰로오스 유도체 및 카라기난, 및 젤라틴, 콜라겐, 알부민과 같은 단백질 등의 에틸렌성 불포화 유도체들을 들 수 있다.
이런 다량체들은 분자량 및 사슬 개수를 변화시킬 수 있다. 최소한의 조직 거부 반응을 갖도록 세포 또는 조직을 캡슐화하기 위하여 바람직한 기본 다량체로는 분자량 1.1K를 갖는 PEG-트리 아크릴레이트이다.
분자량의 지정은 혼합된 길이 중합체의 평균 분자량이다.
광개시용 염색제 - 광개시용 염색제는 빛 에너지를 포획하고 다량체 및 단량체로의 중합반응을 개시한다. 염색시료는 320nm 내지 900nm 사이의 주파수대의 광을 흡수하고, 자유라디칼을 생성할 수 있고, 중합반응시 사용되는 농도에서 생물학적 물질에 무독성인 어떠한 염료도 사용가능하다.
적절한 염색제의 예로는 에틸 에오신, 에오신 Y, 플르오레신(fluorescein), 2-디메톡시 -2-페닐아세토페논, 2-메톡시-2-페닐아세토페논, 캄퍼퀴논, 로즈 벤갈(rose bengal), 메틸렌 블루, 에리트로신, 플록신(phloxine), 티오닌, 리보플라빈 및 메틸렌 그린을 들 수 있다. 염색제-세포 표면 결합을 강화하기 위해서 본원에서 사용되는 염색제는 다중양이온성 (polycateonic) 중합체, 부착된 다중성 페닐 보론 산(multiple phenyl boronic acid) 기를 갖는 중합체와 같은 세포 표면과 강한 상호작용을 갖는 중합체와 결합되는 것이다. 다중양이온성 중합체의 예로는 PAMAM 덴드리머, 직선상, 가지상, 또는 돌기상 폴리(에틸렌이민)(PEI), 폴리비닐아민, 폴리알릴아민, 폴리리신, 키토산, 및 폴리히스티딘을 들 수 있다. 바람직한 개시용 염색제는 PAMAM 덴드리머 세대4와 결합한 카르복시에오신이다.
조촉매 또는 라디칼 생성제- 조촉매는 자유 라디칼 반응을 촉진시킬 수 있는 질소-기반 화합물이다.
1급, 2급, 3급 및 4급 아민은 질소 원자를 함유한 전자-풍부 분자이기 때문에 조촉매로 적당하다. 조촉매로는 이에 제한하지는 않으나, 트리에탄올아민, 트리에틸아민, 에탄올아민, N-메틸 디에탄올아민, N-디메틸 벤질아민, 디벤질 아미노-N-벤질 에탄올아민, N-이소프로필 벤질아민, 테트라메틸 에틸렌디아민, 과황산 칼륨, 테트라메틸 에틸렌디아민, 리신, 오르니틴, 히스티딘, 및 아르기닌을 포함한다. 바람직한 조촉매는 트리에탄올아민이다.
촉진제 또는 공단량체- 중합반응 혼합물에 선택적으로 포함되는 촉진제는 알릴기, 비닐기 또는 아크릴기를 갖는 작은 분자이고, 자유 라디칼 반응을 촉진시킬 수 있다. 촉진제에 술폰산기를 도입시킴으로서 최종 목적물의 생체적합성을 개선시킬 수 있다. 바람직한 촉진제로는 이에 제한되지는 않으나, N-비닐 피롤리디논, 2-비닐 피리딘, 1-비닐 이미다졸, 9-비닐 카르바존, 9-비닐 카르보졸, 아크릴 산, 2-알릴-2-메틸-1, 3-사이클로펜탄 디온, 2-히드록시에틸 아크릴레이트, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판술폰 산, 비닐술폰 산, 4-스티렌 술폰 산, 3-설포 프로필 메타크릴레이트, n-비닐카르폴락탐 및 n-비닐 말레이미드 술포네이트 (SurModics사 제품)를 포함할 수 있고 바람직한 혼합물로 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판술폰 산 및 N-비닐피롤리디논 혼합물을 들 수 있다.
점도 증강제- 세포 응집시 긴 테일(tail)이 안 나타나도록 균일하게 코팅하기 위하여, 마크로머(macromer) 용액의 점도는 최적화될 수 있다. 이는 마크로머 용액에 점도 증강제(viscosity enhancer)를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 점도 증강제로는 분자량 3.5 kD의 PEG-트리올(triol)과 4 kD PEG-디올(diol)을 들 수 있다.
밀도 조정제- 세포 응집시 긴 테일(tail)이 안 나타나도록 균일하게 코팅하기 위하여, 마크로머(macromer) 용액의 점도는 최적화될 수 있다. 이는 마크로머 용액에 밀도 조정제(Density adjusting agnet)를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 바람직한 밀도 조정제로는 니코덴즈(Nycodenz)와 피코트F (FicotF)를 들 수 있다.
방사선 파장- 중합반응을 개시하는 방사선은 320 - 900 nm, 바람직하게는 350 - 700 nm, 더욱 바람직하게는 365 - 550 nm 의 파장 범위를 갖는 장파장 자외선(UV) 또는 가시광선이다. 이 빛은 수은램프, 장파장 자외선램프, 헬륨(He)-네온(Ne) 레이저 및 아르곤이온 레이저, 또는 적정하게 여과된 크세논 광원 등과 같은 바람직한 복사선을 생성할 수 있는 모든 적절한 광원에 의해 제공될 수 있다.
하기의 예들은 단지 본 발명의 설명의 목적을 설명하고자 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1
마우스로부터 랑게르한스섬(islet) 세포의 분리
공급업자로부터 평균 체중 33 g의 18 주된 공여 마우스[C57BL/6]를 공급받았다. 췌장은 안락사 개복수술로 적출되었다. 췌장은 시그마 콜라게나제 타입 V로 펼쳐 놓았다. 췌장은 분리된 후 격리 실험실로 수송되는 동안 차가운 콜라게나제에서 보관되었다. 이 분리 과정은 소화 과정을 위해 30개 췌장에 적용하였다. 이 소화물(digestate)은 RPMI 배지하 10%의 소태아혈청으로 세척한 후 원심분리하였다. 정제를 위해 COBE를 준비하였으며 밀도 구배를 만들기 위해 연속적인 구배 마커를 준비하였다. COBE에 구배를 유도하고 정제 과정을 수행하기 위해 췌장 소화물을 상단에 로딩하였다. 이 정제된 랑게르한스섬 세포를 모아서 RPMI배지로 세척하였다. 랑게르한스섬 세포는 캡슐화를 하기까지 10%의 소태아혈청이 포함된 변형 ICM배지가 담겨진 T75 플라스크에서 배양되었다.
영장류에서 랑게르한스섬 세포의 분리
2.5-4.5 kg 의 어린 시노몰구스 영장류(Macaca fascicularis)와 10 - 30 kg의 성인 비비(Paio anubis)의 췌장을 이용하였다(표 1 참조). 이 췌장을 적출하고, 캐뉼레이션한후에 차가운 UW 용액으로 팽창시킨 다음 산소를넣은 과불화탄소(perfluorocarbon)을 포함한 UW 용액에 보관하여 랑게르한스섬 세포를 분리하기 위해 설비가 있는 곳으로 이동하였다.
랑게르한스섬 세포를 최소한의 기계적인 손상과 COBE의 연속적인 밀도 구배로부터 벗어나게 하기 위해 인체 리버라제(Liberase)를 사용하는 변형된 영장류 랑게르한스섬 세포의 분리 과정을 이용하였다(O'Neil, J., Cell Transplantation, 10, pp539, 2001). 정제된 랑게르한스섬 세포는 공정과정 중의 손상으로부터 회복가능하도록 캡슐화하기 전, 10%의 소태아혈청이 포함된 변형된 CMRL배지가 담겨있는 T75 플라스크에서 3-7일간 37 ℃에서 배양되었다.
도 1A는 공여 췌장으로부터 정제된 시노몰구스(Cynomolgus) 영장류의 랑게르한스섬 세포의 전형적인 수득량을 나타낸다.
영장류 및 비비 랑게르한스섬 세포 분리 공정 비교
영장류 (Cynomolgus) 비비
방법 어린 공여자 4 g 췌장 다중 췌장 가공공정 콜라게나제 농도 (0.5 mg/ml) 소화시간= 40분결과 췌장 당 30,000-50,00 IEQ 섬 지수 (islet index)= 0.80 이식물 당 공여자수= 5-10 마리 방법 10-20년 성인 공여자 25 g 췌장 단일 췌장 가공공정 콜라게나제 농도 (0.20 mg/ml) 소화시간= 20분미만결과 췌장 당 150,000-200,00 IEQ 섬 지수 (islet index)= 1.00 이식물 당 공여자수= 2 마리
실시예 2
균일한 코팅 재료 준비
캡슐화될 세포 형태에 따라, 세포는 균일한 코팅으로 직접 코팅되거나 알지네이트(alginate)와 같은 매트릭스 내에서 내포시킨 후, 선택적 투과성이 있는 PEG 캡슐로 코팅된다. 도 2는 이 코팅의 바람직한 구현예로서 덴드리머(dendrimer) 에오신 Y 접합체(덴드리머-EY)의 합성을 나타내며 하기와 같이 설명된다.
덴드리테크(Dendritech)사에서 구입한 PAMAM 덴드리머 세대 4를 캡슐화에 사용하였다(도 3 참조). 5(6)-카르복시에오신(Carboxyeosin)은 5(6)-카르복시플루오레세인(Carboxyfluorescein)의 브롬화에 의해 제조되었고, 히드록실기와 1-카르복실기는 아세테이트를 형성시켜 보호하였다. 보호된 5(6)-카르복시에오신은 N,N,N'N'-테트라메틸-O-(N-(숙시니미딜)우라늄 테트라플루오로보레이트(TSTU)으로 활성시켰다. 더 이상의 정제공정이 없이, 활성화된 5(6)-카르복시에오신 디아세테이트는 덴드리머-EY 접합체를 제조하기 위해 PAMAM 덴드리머와 혼합되었다. 보호기는 액상 암모니아와 반응시켜 제거했다. 최종 반응물은 세포막을 이용한 극정제법(ultra-purification)인 세척용 완충액 5K MWCO 및 (NH4)2CO3로 정제되었다. EY와 덴드리머(dendrimer) 또는 덴드리머-EY의 화학량적인 비율은 서로 다른 배합 수준으로 변화시켜 얻어질 수 있다. 랑게르한스섬 세포의 캡슐화를 위해 이용되는 최적의 접합 수준은 3.4 EY/덴드리머였다.
덴드리머-EY의 접합 수준은 UV-Vis에 의해 결정되었다. 523 nm에서의 최대 흡광도는 50 mM (NH4)2CO3에서의 덴드리머-EY 용액에서 측정되었다. 배합 수준은 5 (6) -카르복시에오신의 소멸 계수 (Σ=8.4 x 104)를 이용하여 계산했다.
트리에탄올아민(TEoA), 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산(AMPS) 및 N-비닐피롤리디논(NVP)은 알드리치(Aldrich)사로부터 구입. 더 이상의 정제없이 사용하였고, 트리메틸올프로판 에톡실레이트 트리아크릴레이트(Trimethylolpropane ethoxylate triacrylate)(PEG 1.1K-TA)는 사르토너사(Sartomer)로부터 구입,더 이상의 정제 없이 사용되었다. 아크릴화 도는 60s 이상부터 80s 이상으로 다양했고 분자량은 1100 -1300 사이였다.
에톡실화 트리메틸올프로판(Ethoxylated trimethylolpropane; PEG 3.5K-Triol)은 카르보테크(Carbotech)사에 의뢰해 주문 제작하였다. 폴리(에틸렌 글리콜) 3400 (PEG 4K-Diol)은 유니온 카르비드사(Union Carbide)로부터 구입하였다. PEG 3.5K-트리올과 PEG 4K-디올은 주사용 물에 녹인 후, 사용 전에 동결건조하였다.
실시예 3
랑게르한스섬 세포의 캡슐화
마우스 랑게르한스섬 세포의 캡슐화
마우스 랑게르한스섬 세포를 코팅하는 바람직한 방법은 하기와 같다.
20 mM의 저이온성 HEPES 버퍼(1.8 mM CaCl2 및 260 mM 만니톨 포함, pH = 7.0) 15 ml를 10 ㎕의 랑게르한스섬 세포가 담겨있는 15 ml 용량의 원뿔형 튜브에 첨가하였다. 상층액은 원심분리 후에 제거하였다. Den-EY 용액(저이온성 HEPES 버퍼 0.1 mg/ml 내지 0.4 mg/ml ) 15 ml을 침전물에 첨가하고 그 튜브를 실온에서 10-30분 동안 수평으로 유지하였다. 염색된 랑게르한스섬 세포는 저이온성 20 mM HEPES 버퍼로 두 번 세척한 후, 30분 이상 아르곤 가스와 함께 분무하였다. 염색된 랑게르한스섬 세포는 광활성의 폴리머 용액 10 ml과 혼합하고, 아르곤가스로 분무하고, 8 ℃ 중탕냄비에서 30분 이상 예열을 수행하였다. 20% PEG, 100 mM TEoA, 32 mg/ml AMPS와 2 ml/ml NVP와 13% Nycodenz를 포함된 광활성의 중합체 용액은 20 mM HEPES 버퍼, pH = 8.0로 제조하였다. 이 현탁액을 페트리디쉬로 옮기고, 200 mW/cm2의 조사 밀도의 아르곤 레이저로 1분 동안 조사하였다. 페트리디쉬에 M199 1-2 ml을 첨가한 후 중합반응은 종료하였다. 페트리디쉬에 있는 내용물은 M199 40 ml가 들어있는 50 ml용량의 원뿔형 튜브에 옮겼다. M199로 세척후, 캡슐화된 랑게르한스섬 세포를 다시 배양하였다.
영장류의 랑게르한스섬 세포의 캡슐화
랑게르한스섬 세포를 광개시자(Eosin Y)와 함께 로딩하고, 아크릴화PEG 단량체와 TEoA와 NVP를 포함하는 PEG 캡슐화 용액에 넣었다. 아르곤 레이저를 랑게르한스섬 세포에 조사할 때, 결합된 에오신 Y는 TEoA에 의해 더 높은 에너지상태로 활성화되어 자유 라디칼을 생성하였다. 이 TEoA 전자는 랑게르한스섬 세포의 표면으로 확산되어 아크릴화 PEG와 각각의 랑게르한스섬 세포 주위에서 균일한 PEG 코팅을 형성하는 공유 결합인 탄소 이중결합(C=C)을 파괴한다. 캡슐화된 랑게르한스섬 세포는 이식 전 4-21일 동안 10% 열-비활성의 시노몰거스 영장류 동종이식 혈청이 포함된 CMRL 배지에서 37 ℃의 배양온도로 배양하였다.
시노몰거스 영장류에서 분리된 랑게르한스섬 세포는 모양이나 크기에 상관없이 세포를 에워싸는 주변을 균일한 방법으로 용이하게 캡슐화되었다. 도 1A는 시노몰거스 영장류로부터 분리된 비 캡슐화 랑게르한스섬 세포를 나타낸다. 도 1B는 현미경상의 시노몰거스 영장류로부터 분리된 PEG 캡슐화 랑게르한스섬 세포의 균일하고 일치되는 코팅을 보여준다.
실시예 4
캡슐화 랑게르한스섬 세포의 시험관내에서의 특성연구
캡슐화 랑게르한스섬 세포의 코팅 효율은 에반스 블루 염색법으로 평가된다. 캡슐화 랑게르한스섬 세포 현탁액 0.5ml에 0.008 %의 M199에 녹인 에반스 블루시약 용액 15ml을 첨가하였다. 이를 3분 동안 배양한 후, 상층액은 원심분리 및 흡입(aspiration)으로 제거하고, M199으로 3번 세척하였다. M199 내 랑게르한스섬 세포 현탁액을 현미경으로 관찰한 결과 PEG 하이드로겔은 푸른색으로 염색되었다.
캡슐화 랑게르한스섬 세포의 생존능력은 플루오로에신(fluorescein diacetate; FDA) / 에티디움 브로마이드(EB) 염색법으로 평가했다. EB 저장액(50 ml PBS 속에 1 mg) 2.5 ml과 FDA 저장액(아세톤용매 하 5 mg/ml) 12.5 ml을 무혈청배지 하에서 캡슐화된 랑게르한스섬 세포의 현탁액 0.5 ml에 첨가했다. 염료를 첨가하고 10분 후, 시료를 플루오로에신의 필드 블록(field block)을 이용하는 형광 현미경상에 위치시켰다. 사멸 세포는 붉은색, 생존 세포는 초록색으로 각각 염색되었다. 생존력이 있는 랑게르한스섬 세포의 백분율을 측정하였다. 그 예는 도 4에 나타냈다.
캡슐화된 랑게르한스섬 세포의 투과성은 SDS-PAGE에 의해 평가했다. 혈청을 포함하는 배지에 첨가하기 전, 캡슐화 랑게르한스섬 세포의 소량을 SDS-PAGE 분석하였다. 하나 또는 둘의 평균 크기의 랑게르한스섬 세포를 현미경 검사로 선정하여 실온에서 약 14-16 시간 동안 0.1 % SDS 용액을 포함한 96-웰 플레이트에서 별도로 배양했다. 일반적으로, 랑게르한스섬 세포 8 세트 이상을 선정하여 배양하였다. 추가적으로, 10개의 랑게르한스섬 세포의 풀(pool)을 선정하여 동시에 배양하였다. 배양 후에, 그 상층액을 분리하여 5분 동안 100 ℃에서 배양했다. 냉각 후, 9개의 상층액은 각각 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. 마지막 웰(well)은 표준 분자량 마커 혼합물과 함께 로딩했다. 웰 내의 시료 물질을 전기영동한 후, 그 겔을 고정시키고 일정 조절기간 동안 염료로 염색했다. 캡슐화 랑게르한스섬 세포 각 세트에서의 PEG 겔의 분획 분자량은 표준 분자량 마커와 비교하여 결정하였다. 그 예는 도 5에 나타냈다.
캡슐화 랑게르한스섬 세포의 기능은 정적글루코스 자극법 (SGS) 또는 관류 연구법을 통하여 평가했다. 정적글루코스 자극에 있어서, 20개의 랑게르한스섬 세포의 4조각을 직접 선정하여 12-웰 플레이트의 4개에 위치시켰다. 랑게르한스섬 세포를 2회 세척하고, G50 기초 용액(글루코스 농도-50 mg/DL)에서 45분, G300 자극 용액(글루코스 농도-300 mg/DL)에서 45분, IBMX 용액에서 45분, G50 기초 용액에서 45분 동안 배양했다. 상층액의 시료 0.5 ml는 각각의 배양 말에 회수했다. 이 랑게르한스섬 세포는 각각의 배양사이 2회씩 세척했다. 마지막 기초 시료를 회수한 후, 모든 랑게르한스섬 세포는 인슐린 추출하기위해 산성 알콜에 하룻밤동안 배양했다. 상층액의 시료 0.5 ml를 인슐린 추출 후 수득하였다. 전체 시료를 수득하는 동안, 인슐린 농도는 적절한 인슐린 RIA 및 ELISA 키트를 이용하여 측정했다. 캡슐화된 몇몇의 랑게르한스섬 세포는 인슐린 분비가 지연되었고, 단지 G300 자극 배지에서 45 분 동안 배양한 배지만이 최소량의 인슐린이 검출되었다. 랑게르한스섬 세포를 시간을 늘려가면서 G300 자극 배지에서 배양하였고, 상층액의 시료는 인슐린 분비 동역학에 따라 1시간, 2 시간, 3시간 등과 같은 다양한 시점에서 수득하였다. 그 예는 도 6에 나타냈다.
관류 연구는, 랑게르한스섬 세포 절편은 관류 시스템의 필터상에 위치시켜 G50 기초 용액에 처음 40분 노출시키고, G300 자극 용액에서 40분 동안 자극시킨 후, G300과 테오필린 또는 IBMX를 더하여 추가적으로 자극하였다. 관류실험 결과는 글루코스는 기초 수준으로의 회복되었다. 시료는 5분 간격으로 회수되었고 인슐린 농도를 측정하기 위해 적절한 RIA나 ELISA 키트를 이용하여 평가했다.
실시예 5
마우스로의 균일하게 코팅된 랑게르한스섬 세포 이식
마우스의 랑게르한스섬 세포는 상기 실시예 2와 유사한 방법으로 균일하게 코팅했다.
캡슐화된 랑게르한스섬 세포는 무흉선(athymic) 마우스의 복강(IP)및 피하(SQ) 위치에 이식하고, 이식 전후에 혈당치를 측정하였다.
도 7은 균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스섬 세포 [2805 IEQ]가 복강위치에 이식된 두 마리의 무흉선 마우스에서의 혈중 글루코오스 수준을 나타낸다. 이식된 랑게르한스섬 세포는 이식 후 130일 이내에 정상적인 수준으로 조절되었다.
도 8은 균일하게 코팅된 마우스의 랑게르한스섬 세포 [3300 IEQ]가 피하위치에 이식된 두 마리 무흉선 마우스에서의 혈중 글루코오스 수준을 나타낸다. 모두 이식 후 20-30일 사이에 약간의 스파이크(spikes)만 나타냈을 뿐, 감소된 혈당치를 나타냈다. 이중 하나는 이식 후 145일까지 일관되고 정상에 가까운 혈당치를 나타냈고, 다른 마우스는 혈중 글루코오스에서 일시적인 스파이크를 나타냈지만 이식된 랑게르한스섬 세포는 30 일 후에 정상에 가까운 수준으로 감소될 수 있었다.
균일한 코팅은 IP 위치의 랑게르한스섬 세포가 장기간 생존하게 했으며, SQ 이식조직에서 역시 랑게르한스섬 세포 도입량에 따라 기능을 잘 수행하였다. SQ 위치는 무흉선 마우스에서 월등한 생체적합성을 나타냈다.
균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스섬 세포 동종이식물들도 역시 CD1 마우스의 IP와 SQ 영역 모두에 각각 이식되었다. 도 9는 균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스섬 세포의 동종이식물[3300 IEQ 및 2160 IEQ]이 복강 위치에 이식된 두 CD1 마우스에서 측정된 혈당치를 나타낸다. 3300 IEQ의 이식은 혈당치를 정상으로 빠르게 회복시켰고 이식 후 90일까지 이 수준을 유지할 수 있었다.
2160 IEQ 이식은 일상적인 수준에서 큰 변동없이 600 mg/dL 내지 100-300 mg/dL의 일전 수준의 혈당치로 감소시켰다.
도 10은 균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스섬 세포 동종이식물을 피하 영역에 고용량의 주입량 [3623 IEQ 및 2000 IEQ]으로 이식된 두 CD1 마우스에서 측정된 혈당치를 나타낸다. 3623 IEQ 이식은 혈당치를 정상에 가깝게 감소시켰고, 이식 후 35일까지 이 수준을 유지할 수 있었다. 2000 IEQ 이식은 혈당치를 정상으로 감소시켰고, 이식 후 30일까지 이 수준을 유지할 수 있었다.
균일한 코팅은 IP 및 SQ 위치에서의 모든 동종이식물의 면역 거부 반응을 방지했다. 캡슐화된 랑게르한스섬 세포가 기능을 갖는 최소량은 SQ 위치에서 ~1500 IEQ/마우스로 나타났다. 비 캡슐화된 마우스 랑게르한스섬 세포 동종이식물들은 SQ 위치에서 생존하지 않았다.
또한, PEG로 균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스섬 세포 동종이식물을 NOD 마우스(마리당 600-700개 랑게르한스섬 세포)에 이식하였다. 이 균일한 코팅은 인간의 I 형 당뇨병의 본 마우스 실험모델에서 동종 이식물의 면역 거부 반응을 방지할 뿐만 아니라 당뇨병의 자가면역증 재발을 방지하였다.
도 11은 균일하게 코팅된 마우스 랑게르한스섬 세포를 이식한 당뇨성 NOD 마우스에서 측정된 혈당치를 나타낸다.
도 12은 균일하게 코팅된 인간이하 영장류 랑게르한스섬 세포를[5,000 IEQ] 피하 위치에 이식한 무흉선 마우스에서 측정된 혈당치를 나타낸다. 혈당치는 이식후 15일부터 105일이 될 때까지 600 mg/dL 내지 ~35 mg/dL로 급속하게 감소되었다.
도 13은 균일하게 코팅된 인간 랑게르한스섬 세포를 [11,573 IEQ 및 14, 688 IEQ] 복강 위치에 이식한 두 마리 무흉선 마우스에서 측정된 혈당치를 나타낸다. 혈당은 정상수준으로 감소하고 이식후 110일이 될 때까지 정상수준을 유지하였다.
도 14는 균일하게 코팅된 인간 랑게르한스섬 세포를 [10,000 IEQ] 피하 위치에 이식한 두 마리 무흉선 마우스에서 측정된 혈당치를 나타낸다. 혈당은 정상수준으로 감소하고 이식후 40일이 될 때까지 정상 수준을 유지하였다. 이러한 결과는 인간이하의 영장류와 인간의 균일하게 코팅된 랑게르한스섬 세포들은 모두 무흉선 마우스의 IP와 SQ 위치 내에서 랑게르한스섬 세포의 생존이 가능함을 확인해 준다.
실시예 6
시노멀거스 영장류에서의 랑게르한스섬 세포의 피하이식
정상적인 시노멀거스 영장류는 균일하게 코팅된 랑게르한스섬 동종이식물의 피하이식 전에 부분적으로 췌장이 절제되었다(95%).
도 15는 균일하게 PEG로 코팅된 랑게르한스섬 동종이식물의 피하이식 10일전 및 105일 후의 부분적으로 췌장이 절제된 시노멀거스 영장류의 글루코오스 수준 및 인슐린 요구량을 나타낸 것이다. 이 동물은 어떤 추가적 인슐린에 대한 필요 없이도 정상 혈당치로 회복되었다.
부분-췌장-절제시술 며칠 후, 혈당치는 인슐린의 투여와 함께 300 mg/dL 수준으로 증가되었다.
PEG로 균일하게 코팅된 랑게르한스섬 세포 동종이식물의 피하이식시에, 혈당치는 감소되기는 하나 정상수준에는 미치지 못하였다. 이식 후 에도 혈당치를 유지하기 위해 인슐린은 여러 날 동안 필요했지만, 인슐린 주입이 더 요구되지 않는 이식 후 55일까지 서서히 그 필요량은 감소되었다.
이식후 55~105일까지 영장류에서의 혈당치는 부분-췌장-적출 전의 기저수준 위로 약간 상승되었으나; 그 수준은 이식된 PEG 코팅된 랑게르한스섬 세포에 의해 더 이상 인슐린 주입 필요없이 유지되었다. 검시상, 최소한의 숙주 반응과 함께 잘 과립화된 캡슐화 랑게르한스섬 세포들이 피하이식 위치에서 발견되었다.
랑게르한스섬 세포를 함유한 캡슐안의 글루코오스 및 인슐린 염색은 도 16A-D에 보여진다. 캡슐화된 많은 랑게르한스섬 세포에서 랑게르한스섬 세포 조직이 결핍되었는데, 이는 아마도 후속되는 이식동안 파괴되었을 것이다. 이러한 캡슐과 관련되는 외과적 삽입술 및 동종이식에 의한 거부반응으로부터의 염증성 사이토카인들은 숙주로부터 차단되었다. 어린 영장류의 부분-췌장-적출 모델의 한계점의 하나는 남아있는 랑게르한스섬 세포의 팽창에 의해 당뇨에서 회복할수 있는 가능성을 가진 남은 췌장이 있는 반면, 남아있는 췌장에서 확대된 랑게르한스섬세포의 팽창을 거의 확인할 수 없었다는 것이다.
영장류는 부분-췌장-적출로 유발되는 다양한 당뇨모델에 췌장의 남아있는 랑게르한스섬 세포에 의해 자발적 회복능력을 가졌기때문에, 스트렙토조토신은 당뇨병을 유발하는데 사용되어 왔다. 이후 연속된 4명의 피험동물들은 스트렙토조토신 정맥주사로 당뇨병이 유발되었다.
기타 다른 이식된 동물에서의 당뇨병을 유도하기 위해 스트렙토조토신 150 mg/kg을 정맥주사로 투여하였다. 정상 시노멀거스 영장류를 당뇨병 유발 1주일간 혈당 내성 시험을 하였다. 당뇨병 유발 3-4 주 후 이식에 앞서 혈당 내성 시험이 다시 수행되었다.
당뇨병을 유발한 두 마리 시노멀거스 영장류들은 캡슐화 랑게르한스섬의 투여없는 양성대조군으로 당뇨를 유지시켰다. 500 mg/dL에 이르는 수준에서 혈당 항상성이 급격히 감소하였다. 혈당치를 거의 정상수준으로 감소시키는 데에는 고용량의 인슐린이 필요하였다.
혈당치와 인슐린 요구는 함께 큰 변동을 보였다. 또한 유의적으로 낮은 혈당 또는 저혈당증이 연속적으로 계속되었다. 이 동물은 매일 인슐린을 투여해도 정상적이고 일정한 혈당수준을 유지할 수 없었다. 스트렙토조신 주사는 혈중 글루코오스 항상성을 유지할 수 없는 동물에 급격한 베타-세포의 파괴를 유도한다.
랑게르한스섬 세포 이식
케타민(Ketamine), 자일로진(zylozine), 및 아트로핀(atropine) 주사후에, 시노몰거스 영장류의 복부를 멸균주사를 위해 면도, 준비 및 드레핑하였다. 14-게이지 인트라카테타(intracatheter)를 중앙선의 피부아래에 삽입했다. 바늘은 제거하여 투관침으로 대체하였고, 4-5개의 포켓(pocket)들은 투관침을 피하 조직으로 투관침을 밀어 넣음으로서 방사형 으로 삽입면으로부터 측면 배열되도록 제조되었다. 포켓 제조 후, 투관침은 카테터를 남기고 제거되었다.
캡슐화 랑게르한스섬 세포를 플라스크들에서 회수하여 삽입된 피하 카테터에 부착된 10 ml 주사기에 로딩하였다. 캡슐화된 랑게르한스섬 세포를 피하주위로 주입하는 동안 각각의 장소에 카테터를 옮김으로써 다른 통행로는 만들어진 피하포켓 안에 만들어졌다. 4-0 프로렌(prolene) 퍼스(purse) 스트링(string) 봉합선으로 피부의 주입구를 봉합하였다.
모든 세포들이 완전하게 주사될 때까지 중앙선의 양쪽을 따라 캡슐화된 랑게르한스섬 세포 주사 과정은 각각의 피투여군에서 반복되었다. 추가적인 글루코스 모니터과정을 위해 피투여군이 회복되도록 실험용 케이지로 돌려 보냈다.
약물 투여
부분-췌장-적출을 한 피험자 및 스토렙토조토신 피투여군은 어떠한 약물도 투여하지 않았고, 캡슐화 랑게르한스섬 세포 동종이식물의 스트렙토조토신 피투여군 4마리 중 3마리에게 저용량의 시클로스포린을 이식전 7일부터 이식후 30일까지 투여되었다.
저용량의 네오랄(Neoral) 시클로스포린 (10 - 30 mg/kg/day)을 식사시간에 시노멀거스 영장류 빰 주머니으로 경구로 1일 2회 뿜어 넣어 투여 하였다.
12시간 여울통 투여방법으로 ELISA를 이용하여 25 - 100 ng/ml 범위를 유지시켰다. 이 용량은 시노몰거스 영장류 신장의 콩팥의 동종이식 거부증을 방지하지 못하는 것으로 확인되었다.
대사 시험
매일 오전 단식후 혈당 측정 및 오후 식후 2 시간 혈당 측정은 아큐체크(Accucheck) 모니터를 사용하였고 매일 평균치를 계산하였다. OGTT는 케타민, 질라진(zylazine) 및 아트로핀으로 마취하고, 위관 내 7 kcal/kg의 부스팅(Boost) 및 2 gm/kg 포도당 투여에 의해 수행되었다. 시료는 각 0, 60, 90 분에 포도당 및 C-펩티드 측정을 위해 채취되었다.
검 시
부분-췌장-적출 동물을 조직 이식 후 100일 후 검시하였다. 주요한 모든조직은 제거되었고 조직검사를 하기위해 처리하였다.
어세이법
매일의 혈당을 측정하는데 아큐첵 글루코오스 모니터기를 사용하였다. C-펩티드는 링코사(Linco)의 ELISA 에세이기로 측정되었다. 인간 C-펩티드 항체는 100% 수준에서의 시노몰거스 영장류 C-펩티드와 교차반응함을 확인하였다. 글리케이트화 헤모글로빈 측정은 방사성 면역시험법으로 수행되었다. 통상적인 혈청 화학검사는 모든 당뇨병 환자와 피험군에게 규칙적인 간격으로 수행하였다. 캡슐화 랑게르한스섬 세포의 생존 능력 시험은 풀루오로레신 디아세테이트 (Fluorescein diacetate) / 불화 에티디움 (Ethidiumbromide)(FDA/EB) 어세이법에 의하여 수행하였다.
약물 무처치 스트렙토조토신-유도 당뇨병 피험군
스트렙토조토신-유도 당뇨병을 갖는 시노몰거스 영장류 피험군은 극심한 당뇨병을 유발하였고(150 - 350 mg/dL), 이러한 현상은 부분 췌장-적출군보다 심하게 나타나 이식전 매일 16-18 U 인슐린이 필요하였다.
또한 혈당의 넓은 영역에서의 가동역 및 저혈당이 빈발하게 발생하였다. 글루코오스 내성 시험을 통하여 이러한 당뇨병 대조군에서 발견되는 C-펩티드 수치는 매우 낮았으며 포도당 투약에 반응하지 않았다.
캡슐화 랑게르한스섬 세포는 면역억제제없이 피하위치에 이식되었다.이 결과는 도 17에 나타내었다.
피하 이식 후에, 인슐린 요구량의 50% 감소 효과가 80 내지 90일 동안 관찰되었고 랑게르한스섬 세포 기능의 약간의 감퇴가 뒤따랐다.
인슐린 비의존성이 달성되지 않았을지라도, OGTT로부터의 C-펩티드 결과는 전-당뇨 또는 정상수치와 유사하였으며, 이는 이식된 랑게르한스섬 세포의 기능을 확인할 수 있었다.
이 결과는 현재 임상 시험에서 충분한 면역억제를 수반하여 랑게르한스섬 세포 이식을 하면, 부분적인 기능을 갖는 당뇨병성 환자에게서 나타질 것이다. 다수의 빈 캡슐 중 이식 장소에서 흩어진 인슐린 및 글루카곤 염색된 캡슐화 랑게르한스섬 세포를 피험군의 피하 이식물의 조직학적 소견에서 보여 주고 있다.
이는 매우 많은 캡슐화된 랑게르한스섬 세포가 소실된 이유에 관한 의문을 불러 일으킨다. 한가지 가능성은 숙주 비만세포에 의하여 파괴되는 캡슐화 랑게르한스섬 세포는 비만세포에 파괴되지 않는 잘못된 캡슐 주위에 위치한 병소 동종이식 거부반응을 유발하는 점이다.
대신에, 이러한 캡슐화 랑게르한스섬 세포는 그 부서진 캡슐에 반응하는 면역성 세포의 국소적 시토카인에 의하여 사멸될 수 있을 것이다. 다른 가능성은 많은 랑게르한스섬 세포가 저산소증하에서 이식 후 곧바로 죽지 않도록 하는 혈관신생이 충분히 일어나지 않는다는 점이다. 세 번째는 어린 공여자로부터 유래되는 캡슐화 시노몰거스 영장류 랑게르한스섬 세포의 약한 기능이 이들이 생체 내에서 생존과 기능을 방해한다는 점이다. 이 질문의 대답을 위해, 부분적 기능을 개선하기 위해 다른 접근법들이 수행되었다.
스트렙토조토신-유도 당뇨유도군에 대한 저용량 시클로스포린의 30일간 처치
연속적인 스트렙토조토신-유도된 당뇨병 동물들은 이전 피투여군들과 마찬가지로 심한 당뇨병을 유발되었다. 모든 동물들은 전방 복부 벽의 피하 위치 안으로 이식된, 약 45,000 IEQ PEG로 균일하게 코팅된 랑게르한스섬 세포를 처치받았다. 부서진 캡슐 주위에서의 병소 동종이식 거부반응을 경감시키고 랑게르한스섬 세포 기능이 개선될 수 있는지 여부를 결정하기 위하여 저용량의 시클로스포린을 실험 6일전 내지 30일후까지 처치하였다.
저용량이란 면역억제제 치료용량인 100-300 ng/ml이하인 50-90 ng/ml농도로 24시간 여울통 혈중 수준을 갖게 되는 용량이다.
30일 후, 피투여군에게 주어지는 유일한 약인 저용량의 시클로스포린 투여를 중단하였다(수술후 통증치료를 위해 인슐린이 필요한 경우 및 시험과정을 위한 케타민 칵테일요법을 사용하는 경우는 제외함). 첫 번째 피험군은 처음 10일 동안 혈당치 및 인슐린 용량이 50 % 감소되었다. 이수치는 이식후 30일째의 인슐린 중단시까지 감소를 유지하였고 220일째까지 75 - 150 mg/dL 범위내의 혈당을 유지하였다. 이 실험결과 및 인슐린 요구량은 도 18에 나타내었다.
이식 120일째, 일부 과혈당 수치가 얻어졌다. 메트포민(Metformin) 투여를 시작하여 과혈당 수치가 정상범위로 회복되었다. 메트포민은 II형 당뇨병환자에게 통상적으로 투여되는 간 및 근육성 포도당 신생을 감소시키는 약물이다. 이는 랑게르한스섬 세포 이식을 위해 면역 억제된 I형 환자의 혈당을 개선하는데 사용되었다. 이는 이식되는 랑게르한스섬 세포가 크기가 감소된 상태로 그 기능이 서서히 소실된다는 점을 나타내었다.
두번째 캡슐화 랑게르한스섬 세포 동종이식물이 피하에 이식되었고 30일간 저용량의 시클로스포린을 투여하였다. 그 동물은 다른 120일동안 정상 혈당으로 회복되었다. 첫번째 이식후 235일까지, 감소된 포도당성 대조군을 의미하는 좀 더 높은 고혈당이 나타나 저용량의 인슐린 투여가 다시 시작되었다. 그 다음의 두 달 동안, 그 랑게르한스섬 세포는 충분한 인슐린 처치가 요구되는 느린 기능상의 소실을 나타냈다. 생존하는 랑게르한스섬 세포 투여가 당뇨병성 피투여군을 장기간 유지하는 정도의 한계용량이라면 두 번째 30일 처치기간 동안 저용량 시클로스포린 수준하에서 이식후 30일째 피하로 두 번째 캡슐화 이식을 수행되었다. 두번째 이식과 저용량 시클로스포린 투여가 따르면서 혈당은 150-225 mg/dL에서 머물렀다. OGTT의 결과는 인슐린 처치 후, 이식된 랑게르한스섬 세포로부터 C-펩티드 유리를 확인하여 준다.
이 동물은 조직학적인 관찰을 위해 285일째 희생시켰다(도 19 참조).
이 동물로부터 얻은 조직시료는 피하장소에서 랑게르한스섬 세포가 많이 생존함을 나타냈다. 파괴된 캡슐의 흔적은 없고, 이들 주위에 병소 임파구를 갖는 몇몇의 랑게르한스섬 세포가 발견되었다. 명확하지 않으나 이러한 캡슐들이 이식 후의 9 달째부터 생분해를 시작하고 있음을 추정할 수 있었다. 캡슐에 인접한 많은 모세관들이 명백한 증거로 나타났다.
캡슐화 랑게르한스섬 세포는 피하의 장소에서 투관침유도 포켓 내에정렬한다. 외부 거대세포나 잘 캡슐화된 랑게르한스섬 세포에 대한 진행중인 염증반응은 발견되지 않았다.
세번째 당뇨병성 시노몰거스 영장류에게 캡슐화 랑게르한스 섬 세포를 이식하고 30일간 저용량의 시클로스포린을 투여하였다.
랑게르한스섬 세포에 대한 시클로스포린 독성이 첫 번째 이식 이후에 관찰되었다. 30일째 한번 시클로스포린 투여를 중단하면, 단기간 동안 관찰되는 정상 혈당수준의 낮은 수준으로 떨어뜨리기 위한 인슐린 요구량도 급격하게 감소하였다. 120 일째 인슐린 필요량은 증가하기 시작했고, 낮은 용량의 시크롤로스포린의 투여를 수행하여 인슐린 요구량을 이식전 요구량의 50 %로 안정화시켰다. 인슐린 필요는 혈당성 대조군을 감소시킴을 의미하는 230일로 증가되기 시작했다. 인슐린 요법에도 불구하고, C-펩티드 반응은 캡슐화 랑게르한스 섬 세포 그래프트(graft) 기능이 진행중임을 확인하여 준다.
248일째 동물을 희생시키고 얻은 조직학적 결과는 도 20에 나타냈다. 적은 파워(power)에서 캡슐화 랑게르한스 섬들은 삽입 동안 투관침에 의해 제조된 소-포켓에 정렬되었다. 다수의 빈 캡슐뿐만 아니라 이 위치에서 생존하는 다수의 캡슐화 랑게르한스 섬 세포 동종이식물들도 발견되었다. 임파구와 대식세포 환에 숙주에 의해 에워싸인 형태로 캡슐화 랑게르한스 섬 세포들도 몇몇 발견되었다. 더 높은 파워에서의 시험에서, 랑게르한스 섬 세포의 강한 인슐린 염색을 포함하여 우수한 조직학적 형상을 갖는 다수의 섬 세포들이 발견되었다. 몇몇 캡슐들은 비어 있고 어떤 경우는 섬 세포의 소실을 나타냈다. 높은 파워에서의 이식 위치를 관찰한 결과, 있는 이식 장소의 시험은 그 캡슐화 랑게르한스 섬 세포들을 둘러싸는 이식 장소 전체에 높은 밀도로 흩어져 있는 모세관들을 확인할 수 있었다. 현저하게 증가된 밀도로 퍼져 있는 PEG 코팅 외면을 둘러싸고 있는 이 모세관 베드(bed)는 주변 이식되지 않은 피하 장소에 있는 모세관들과 비교되었다. 캡슐화 랑게르한스 섬 세포주위의 새로운 모세관들은 캡슐화 랑게르한스 섬 그래프트의신호에 반응하여 성장을 자극했고, 이러한 캡슐화 랑게르한스 섬 세포들이 장기간 섬 세포 기능을 지탱할 수 있다는 능력을 설명해 준다. 빈 캡슐들은 아마도 섬 세포 이식에 따른 첫 몇 주 동안의 혈관 신생 작용에 앞서 그 자신들을 지탱할 수 없는 섬 세포들에 기인한 것일 것이다. 또한, 숙주에 의해 침입된 캡슐에 대한 초기 면역반응단계로부터 이러한 캡슐과 근접한 장소에서 시토카인이 손상되었을 것이다.
4 번째 스트렙토조신 당뇨병성 시노몰거스 영장류에게 저용량 시클로스포린을 사용한 피하 지점으로의 이식을 수행하였다.
2주 간격으로 두개의 별도로 이식된 피하 이식물들은 동물에서 인슐린 비의존성을 얻고자 초기에 수행되었으며 이는 30일째에 획득되었다. 이식후 약 115일째, 상승되는 포도당 수치 때문에 인슐린 처치가 다시 시작되었다. 추가의 피하 이식을 저용량 시클로스포린하에서 수행되었다. 일시적인 개선증상이후에, 고혈당증은 인슐린 필요성을 수반하며 재발되었다.
C-펩티드 반응들은 인슐린 비의존 시점 전반 및 부분 섬 세포 기능의 회복 이후에도 수행된 OGTT 동안에 관찰되었다. 이 피험군으로부터 얻은 조직형상은 건강한 섬 세포를 포함하는 다수 캡슐을 갖는 것들 및 이 세포가 없는 다른 것들의 형상과 유사했다. 몇몇의 캡슐들은 임파구로 둘러싸여 있었다.
경구용 포도당 내성 시험법 결과
4마리 시노몰거스 영장류에서의 C-펩티드 수치는 서로 다른 시점, 즉 :(a) 당뇨 유도전 (기저부), (b) 당뇨 유발후 (이식전), (c) 캡슐화 섬 세포 이식후 30일째, (d) 캡슐화 섬 세포 이식후 60일째, 및 (d) 캡슐화 섬 세포 이식후 90일째에 각각 측정되었다. 부스트(Boost) 및 포도당의 강제 투입전에, 케타민 투여하지 않은 피험군에서 투여전 시료의 상당한 수치에 비하여 상승된 수치인 ~2.5 ng/ml 내외의 C-펩티드 농도를 투여전에 나타냈다. 강제투여후 몇몇 동물들이 모세혈관 C-펩티드 반응을 상승시킴에도 불구하고 평균치는 실질적으로 동일한 수치를 유지했다. 강제투여 120분에 평균치는 거의 4 ng/ml로 상당하게 증가하였다. 스트렙토조토신 투여 적어도 3주째, 4마리 당뇨병성 시노몰거스 영장류중 OGTT 시도에 반응하는 C-펩티드 수치가 증가한 것은 한 마리도 없었다. 당뇨병 상태에서 포도당 투여에 대한 매우 좁은 범위의 표준 오차는 C-펩티드 반응 결핍을 나타내었다. 당뇨 상태에서의 C-펩티드의 절대값은 문헌에 기재된 보고내용과 약간의 변화범위 내였다. 이는 30 % 내지 100 % 범위의 인간 C-펩티드 내지 시노몰거스 영장류 C-펩티드간의 교차 반응성 차이를 갖는 서로 다른 제조사들의 6가지 사용 C-펩티드 키트에 기인한 것으로 보인다. 린코(Linco)에 의해 사용된 항체는 100% 교차 반응성을 나타내었다. 모든 4 마리 당뇨병성 피험군에서의 후속되는 피하 섬 세포 이식은 비록 30일째 서로 다른 인슐린 필요성에도 불구하고 C-펩티드 수치가 당뇨병성 상태에 비하여 각 측정시간에 있어 상당하게 증가되었다. 이는 이식 후 60일 동안에도 계속되었다. 이식 전 30일 및 60일에 이러한 피하성 랑게르한스 섬 이식물에 대한 통사의 기저 C-펩티드 반응에 비하여 이러한 4마리 피투여군들 사이에는 별다른 차이가 나타나지 않았다.
당화 헤모글로빈 결과
도 21은 당뇨 유도전에 시노몰거스 영장류로부터 얻은 당화 헤모글로빈 수치를 나타낸다 (기저선, n=4; 85일후, n=3; 및 114 일후, n=1).
당화 헤모글로빈수치는 90일간 유지하는 단백질을 측정하는 것이므로 전의 시험으로는 얻을 정보가 거의 없다. 3.0 HbgA1c의 기저선 수치는 당뇨 유도전 시노몰거스 영장류로부터 얻었다. 이식후 85일째, 반복된 당화 헤모글로빈 수치는 약간 상승된 3.8이었으나 그 증가는 별다른 유의성이 없었다. 114일째 한 마리 동물에서의 관찰 수치는 4.1로 약간 높았다. 시노몰거스 영장류 당화 헤모글로빈 수치에 대하여 잘 알려져 있지는 않으나, 85일째 결과는 유의성있게 상승된 포도당 수치를 갖는 30일째 당뇨 수치뿐만아니라 기저부 수치이상의 유의적인 상승이 없는 이식후 85일째도 포함한다. 이는 포도당 수치에서 주목된 몇몇의 과혈당에도 불구하고 나타났다.
시노몰거스 영장류에서 캡슐화 랑게르한스 섬의 피하 이식 요약
4마리 스트렙토조토신-당뇨병성 시노몰구스 영장류의 피하 지점으로의 균일하게 PEG로 코팅된 랑게르한스 섬 동종이식물을 이식하는 것은 장기간의 면역억제가 필요없이 120일까지 동안 인슐린 처치를 안해도 거의 정상혈당치를 얻을 수 있음을 입증하는 것이다.
이식후 첫 30일동안 저용량 시클로스포린의 사용은 이식된 섬 세포의 일부 기능을 갖는 시클로스포린을 투약받지 않은 동물에 비하여 이를 투약받는 모든 피투약군중에서 피하 지점에서의 생존 캡슐화된 섬 세포 비율을 증가시켰다. 캡슐화 섬 세포 동종이식물의 피하 이식후의 피험군의 OGTT 처치에 의한 대사 시험은 당뇨병성 수치에 비하여 강제투여가 뒤따를 때마다 유의적으로 증가된 C-펩티드 반응을 나타내고 동종이식물 섬 세포 피하이식에 뒤따르는 C-펩티드 반응은 당뇨 유도 전에 정상 반응과 통계적으로 상이하지 않았다. 시노몰거스 영장류 이식 연구 결과는 표 2에 요약하였다.
시노몰거스 영장류 이식물
장점- 생체적합성이 우수- 섬 세포가 캐슐화 및 기능을 부활- 피하 지점작업- 시클로스포린이 섬세포의 조기소실을 도움- 코팅은 면역방어를 장기 연장시킴- 어려움없이 재-이식이 가능- 남은 C-펩티드가 인슐린 비의존성 소실후 부분적 기능수행- 캡슐화 섬세포가 거의 300일 동안 회수 가능- 피하 지점에서의 캡슐화 섬 세포의 혈관신생화는 장기간 역할 기전을 제시
실시예 7
바비에서의 캡슐화 랑게르한스섬 세포 피하 이식
수술 과정
비비 췌장을 공여자로부터 적출한후, 캐뉼레이션하고 췌장 방부 용액에 담근 후, 섬 세포 제조 및 캡슐화를 위해 노보셀사(NOVECELL)로 이동시켰다. 이들을 연속하여 배양하고, 이식용 보유시설로 이동하고 인간 랑게르한스섬 세포 제조를 위해 제시된 유사한 프로토콜을 사용하여 배양액상에서의 현탁법으로 외과 수술적인 이식준비를 하였다. 비비를 마취하고, 16 게이지 카테터를 전방 복부의 피하 지점으로 위치하였다. 투관침을 복부피부하의 "팬모양"의 5개 피하 통로를 만들기 위해 (각 길이 ~3" ) 이식된 카테터를 통하여 삽입되었다. 시험 재료 (~2.5 mL 부피내 총 섬 세포 이식물의 ~17 %)를 부드럽게 현탁하고, 5cc 주사기에 넣고 포켓을 통한 짝수형태의 축적물 형태로 피하 통로(또는"포켓")를 따라 처치하였다. 바늘 삽입 지점을 그 삽입 지점으로부터의 누출을 막기위해 4-0 퍼스 끈 봉합선으로 봉합하였다. 이는 시험 물질과 완충액의 길고 낮은 편평한 영역을 제공하였다. 그 액체인 부분을 곧바로 재흡수하고 약간 과립형의 표면 직물에 스며 들었다. 총 6개 지점에서 완전한 이식 과정을 수행하였다. 이 지점을 주사부위를 표시하였다. 염증 소견을 나타낸 국소반응은 없었다.
약물 처치
시클로스포린(면역억제용량이하의 50-95 ng/ml의 24시간 여울통 처치 농도)을 이식 7일전부터 이식후 30일까지 투여하였다. 이식물의 약간 덜 캡슐화된 랑게르한스섬 세포에 대해 즉각적인 병소 동종이식 거부 반응으로 인한 측부 소실을 방지하기 위해 시클로스포린을 투여하였다. 추가적으로 임상상의 병용투여를 모방하여 메트포민을 다음날부터 시험 기간동안 내내 투여하였다. 당뇨 유도를 위한 스트렙토조토신 투약 4주 후에 처치되는 코팅된 랑게르한스섬 세포의 처치량은 약 40K IEQ/체중(kg)이었다.
시험 기간 동안 사용된 유효한 랑게르한스섬 세포 처치량 및 임상연구(15K IEQ/kg)시 처치량 간의 차이는 이식 장소(피하 대문맥정맥) 및 이식에 따른 랑게르한스섬 세포 소실에서 기인한 것으로 보여진다.
모니터
생활시 모니터링의 목적은 당뇨 관리 및 이식물 활성뿐만 아니라 국소 내성의 기준 표시자 및 전체 건강/안전성 정보의 국제적인 표시자를 추적하기 위하여 필요한 정보의 납득 가능한 통계 수집을 제공하고자 함이다.
이 군들은 전-당뇨 기간, 당뇨기간 및 이식후기간 동안 모니터링되었다. 전-당뇨, 당뇨 및 매월 이식후 측정에는 OGTT, AST (Arginine Stimulation test; 혈당, 인슐린 및 c-펩티드 어세이), 및 헤모글로빈 A1c 측정이 포함되었다.
당뇨기간 및 이식후기간에 대한 매일의 모니터링은 혈당(절식, 점심 및 저녁식사 2시간), 뇨당 및 케톤체(아침 절식 및 저녁식사전), 식사량(탄수화물, 지방 및 단백질 g수), 주사된 인슐린량 (당뇨관리) 및 기타 투약량에 대하여 수행하였다. 주간 측정은 체중 및 임상적 관찰을 포함하였다.
검 시
피하 이식 지점 및 이식 안한 대조 지점에 대한 조직병리 검사는 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색법 및 면역 조직화학 염색법(인슐린, 글루카곤, 혈관 신생성 액틴, 대식세포 및 임파구, CD3, CD4, CD8)들을 수행하였다. 모든 표준 기관 및 조직에 대한 조직병리 검사는 H&E 염색법을 이용하여 수행하였고, 공인 수의학 병리학자들에 의해 평가되었다. 췌장에 대한 면역조직학 염색법은 인슐린 및 글루카곤을 조사하기 위해 수행되었다.
스트렙토조토신 당뇨병성 바비의 캡슐화 랑게르한스섬 세포 동종이식물
도 22는 시험기간 중 캡슐화 랑게르한스 섬 세포를 이식한 처음 당뇨 바비에서의 초기 시험 결과를 나타낸다. 이 당뇨 바비 피험동물은 캡슐화 랑게르한스섬 세포 동종이식물의 피하이식 후 17일 이내에 인슐린 비의존성을 획득할 수 있는 능력을 나타내었다. 이 결과는 시노몰거스 영장류 당뇨병이 캡슐화 랑게르한스섬 세포 동종이식물의 피하이식 후 30일까지도 인슐린 비의존성을 갖지 못하는 결과와 대비되었다. 시노몰거스 영장류에서의 시클로스포린 경구 주사투여법를 사용하는 것과 달리하여 큰 바비 원숭이에게는 근육주사를 사용하였다. 이는 24시간 여울통 투약 수준의 시노몰거스 영장류에서 관찰되는 편차를 제거한 것이다. 도 23은 이 피험동물이 이식후 60일째 정상 헤노글로빈 A1c 수준을 달성했고 인슐린투여를 중단한 180일 동안 정상 수준으로 유지됨을 나타내었다.
OGTT 및 AST 시험 결과는 이식후 모든 측정시간 이후 상당한 C-펩티드 분비를 확인하여 주었다. 30분 시간 프레임 이후 모든 시간 프레임에서 정상 혈당치를 나타내는 혈당치 감소를 보여주는 C-펩티드 피크를 나타냈다. 당뇨기간 중 혈당은 포도당 변화에 무반응하는 매우 낮은 C-펩티드 농도로 인하여 상승세를 유지했다. 이식후에, 포도당 변화에 C-펩티드의 큰 반응이 있었으나, 이 반응은 변화 후 60분 및 90분 시점에 피크를 나타내면서 지연되었다. 혈당측정 시 30분 및 60분 시점의 수치는 C-펩티드 반응성의 이러한 지연덕분에 정상치보다 높았다. 그러나 90 및 120 분에 거의 정상수준으로 회복되었다. 이러한 C-펩티드 반응의 지연이 이식하는 피하 지점 또는 랑게르한스 섬 세포의 캡슐화에 기인하는지 여부는 알려지지 않았다. 이결과는 면역억제 하에서 인간 당뇨환자의 문맥정맥에서 이식된 랑게르한스 섬 세포의 결과와 매우 유사했다.
두번째 비비에게 매우 저농도 시클로스포린을 다시 투약하면서, 피하 지점에 랑게르한스 섬 세포가 이식되었다. 혈당저하는 거의 동일하게 인슐린 요구와 함께 발생했다. 인슐린 요구는 100일째 느리게 감소했으나, 낮은 혈당상태를 유지하면서 거의 200일 동안 서서히 상승하였다. 헤모글로빈 A1c 수치 검사를 통하여, 부분 기능이 90일까지 12% 내지8.0%까지 저하되고 120일째 정상치로 변화하는 결과를 확인했다. 이 수치는 8%로 서서히 증가하고 180일까지 유지되었다. 이는 인슐린 비의존성을 달성되지는 않으나, 이식후 헤모글로빈 A1c 수준은 거의 정상 수준을 유지하여 랑게르한스섬 세포 이식자와 일치하는 부분적 기능을 나타냈다.
OGTT 및 AST 시험결과는 최초 피험동물과 비견되는 이식후 기간내내 좀 더 낮은 C-펩티드 수치 및 좀 더 높은 포도당 수치를 나타냈다. 그러나 C-펩티드 반응성은 당뇨기간 중 수득되는 수치보다 상당히 높았다. 세 번째 피험동물에게도 저용량 시클로스포린으로 피하 지점에서 캡슐화 랑게르한스 섬 동종 이식물을 이식했다 (도 24). 이 피험동물도 당뇨기간중의 결과와 비견되는 포도당 및 인슐린 수치 모든 면에서 50% 이상의 이식후 부분 반응성을 확인하여 주었다. 이는 이식후 140일까지 유지되었다.
이 피험동물의 헤모글로빈 A1c 수치(도 25)는 이식후 60일째 정상 범위내로 도달했으나, 120일째까지 당뇨병 수준으로 상승됨을 나타내었다. 이는 그 기간이후 감소된 반응성을 갖는 90일간의 부분 랑게르한스 섬 세포 기능을 확인해 주는 결과이다. OGTT 및 AST 모두에 대한 반응은 이식후 상승되고 60 내지 90분 시간 프레임에 발견되는 C-펩티드 수치 피크를 갖는 이전의 부분적 피험동물에서 발견되는 결과와 유사했다. 한 마리의 정상 랑게르한스 섬 세포 이식 피험동물 및 두 마리의 부분 피험동물에게 있어, 이러한 시험 결과는 당뇨병성 피험동물의 문맥정맥으로의 이식한 군에서의 결과와 어떻게 비견되는가가 중요했다.
허용 가능한 농도수준을 달성한 비비 랑게르한스 섬 분리결과, 전에 피하 지점에서의 캡슐화 랑게르한스 섬 이식받은 첫 사례인 실험 전 비비 피험동물을 본 시험에 사용하였다. 이식을 위한 췌장 및 캡슐화 랑게르한스 섬 세포의 수송 병참론을 수행하기 위하여 한 마리 피험동물이 더 사용되었다. 두개의 한계 피하 캡슐화 섬 세포 이식은 좋지 않은 결과를 나타냈다. 피험동물은 시험에 사용된 최초 3마리의 피험 동물에서 사용된 바와 유사한 조건하에서 분리되고 캡슐화된 캡슐화 랑게르한스 섬 세포 동종이식물을 문맥정맥을 통해 투여하여 잠재력을 시험하는데 사용되었다.
첫 번째 한계 이식은 첫날 및 110일후에 수행되었다. 예견되는 대로 두 가지 모두 이식된 한계 그래프트들로부터 일시적인 개선을 나타냈다. 그러나 첫이식 후 240일째, 수술과정의 하나로서 문맥정맥으로의 직접주사로 문맥정맥압의 유의성있는 상승 또는 간기능상의 변화없이 캡슐화 섬 세포 동종이식물의 문맥정맥 주사를 수행하였다.
며칠 내에 인슐린 필요량의 50% 하강보다 더 강한 이식에 대한 현저한 반응을 나타냈다. 시클로스포린을 이식 30일 후에 중지하고, 이식 후 290일까지 정상 혈당수준으로 인슐린 처치를 피험동물에게 수행했다.
이 피험 동물에 대한 헤모글로빈 A1c 수치 검사를 통하여, 이 한계성 피하 이식에 따른 수치 감소가 있었으나 정상수준까지는 도달하지 않았다.문맥정맥이식시까지 얻어진 유일한 수치는 이식 30일후 얻었고, 이는 기대한 개선효과를 보기에는 너무 이른 시기였다. 비비의 임상결과 헤모글로빈 A1c 수치는 대략 30 일 후에 나타났다. 한계적 피하 랑게르한스섬 세포 이식에 있어서, 당뇨병 수치보다 명백하게 더 높은 수준을 유지하고, 명백하게 낮은 수준의 C-펩티드를 나타내나, 그 반응성은 감소되었음도 불구하고 헤모글로빈 A1c의 정상수준에 도달하지 못하였다. 문맥정맥이식까지 오로지 30일간의 수치만 유용하다. 포도당을 검사한 결과, C-펩티드의 유의적인 상승과 함께 뚜렷한 하강을 나타냈다.첫 번째 문맥정맥이식 시 유의성있는 개선효과를 얻기 위하여 피하지점을 개선시킬 가능성이 있다.
실시예 8
PEG 유무에 따른 알지네이트 미세캡슐로 캡슐화된 세포
세포 및 조직들은 알지네이트 (Alginate)또는 기타 하이드로겔을 포함하는 매트릭스내에서 코팅될 수 있다. PEG 유무에 따른 알지네이트 미세캡슐에서의 랑게르한스섬 세포를 코팅하는 바람직한 방법은 하기에 예시한다:
알지네이트 미세 캡슐로의 섬 세포 코팅
100 ㎕의 배양된 섬 세포를 10 mM HEPES 버퍼에 있는 1.6% 나트륨 알지네이트 용액 1.25 ml에서 균일하게 현탁시켰다. 랑게르한스섬 세포를 포함하는 알지네이트 미세캡슐은 일정기압(10.5 PSI [72,394.95 Pa (N/m2)로 세트된 아르곤 가스 압력하에서 21-게이지 니들을 통한 주사기 펌프/아르곤 제트 분출법에 의한 생산되고 10 mM HEPES 용액에 80 mM 염화칼슘이 용해된 용액 100 ml에 회수하였다. 알지네이트(alginate) 마이크로캡슐들은 15분 동안 중력으로 정착시키는 방법으로 M199로 3회 세척하였으며 따라냈다. 알지네이트 마이크로캡슐은 250 내지 350㎛ 범위의 크기 분포를 갖고 있다.
알지네이트 미세캡슐을 포함하는 섬 세포의 PEG 코팅
20 mM 저 이온성 HEPES 버퍼 (1.8 mM CaCl2 및 260 mM 만니톨, pH = 7.0) 15ml를 미세캡슐을 포함하는 섬 세포 100 ml을 담은 15 ml 원추형 튜브에 넣었다. 이 튜브를 원심 분리하여 펠렛을 제조하고, 상층액을 제거한 후, 15 ml Den-EY 용액 (저이온성 HEPES 완충액 0.1 mg/ml)을 이 펠렛에 넣어 튜브를 실온에서 10분간 편평하게 방치하였다. 이 염색된 섬 세포를 저이온성 20 mM HEPES 완충액으로 세척하였고, 30분 이상 동안 아르곤 가스로 분사했다. 염색된 섬세포를 20ml 광활성 중합체 용액에 혼합하고, 아르곤 가스를 분사시킨 후, 수조에서 80 ℃의 온도로 30분 이상 전평형화를 시켰다. 20 mM HEPES 버퍼, pH = 8.0에서 만들어졌습니다. 이 용액은 5% PEG 1.1K-TA, 10% PEG 3.5K-트리올 또는 PEG 4K-디올, 100 mM TEoA, 32 mg/ml AMPS, 2 ml/ml NVP 및 13 % 니코덴즈(Nycodenz)를 포함한 20 mM HEPES (pH=8.0)에서 제조되었다. 이 현탁액을 10 ml 비이커에 옮기고 이 비이커를 1분 동안 200 mW/cm2의 조사밀도를 갖는 아르곤 레이저로 조사시켰다. 2 ml M199를 페트리디쉬에 가하여 본 중합반응을 중지시키고 비이커 내의 내용물을 40 ml M199를 넣은 50 ml 원뿔형 튜브로 옮겼다. M199로 3회 세척후, 캡슐화 섬 세포를 배양물에 집어 넣었다.
비당뇨병성 영장류 피하 지점으로의 이종이식물인 돼지 섬세포의 알지네이트 미세캡슐 및 알지네이트/PEG 미세캡슐 이식
영장류 시험에서, 알지네이트 미세캡슐 및 알지네이트/PEG 미세캡슐을 세 마리 비당뇨병성 영장류에 이식을 수행하였다. 이 PEG 코팅된 미세캡슐들은 그 침투선택성을 달리한 다양한 형태로 제조되었다. 모든 이식되는 미세캡슐(알지네이트 단독 및 알지네이트/PEG)은 영장류에 대한 이종이식물로서 1차 돼지랑게르한스섬 세포를 포함하였다. 이러한 피험동물을 실험적 항-CD 154 단일 항체로 처리하였다. 이 피하 이식물을 이식 7일후 절개하고 서로 상이한 미세캡슐상에서 생존하는 캡슐화 돼지 섬 세포의 생존율을 측정하였다.
도 26은 정상 시노몰거스 영장류로 7일간 이식한 후, 코팅의 서로 다른 침투선택성 양상 및 서로 상이한 알지네이트/PEG 미세캡슐 구조뿐만 아니라 아리네이트 단독으로 캡슐화된 돼지 섬세포의 생존율을 나타낸다. 상이한 침투투과성 수치는 각각 0 kD, 30 - 60 kD, 100 kD, 및 200 kD 이상이었다. 알지네이트 단독 캡슐상의 돼지 섬 세포의 생존율은 55 %이었다. 알지네이트/ PEG 코팅 미세캡슐간에는 섬세포 생존율이 차이가 있었다. 매우 강한 침투선택성 확산능을(0 kD 또는 <30 kD 크기 단백질) 갖는 24시간째 생존율은 37 %로 나타났다. 30 kD 내지 60 kD 크기 단백질에 대한 침투선택성 확산능을 미세캡슐의 24시간째 섬 세포 생존율은 70 %로 증가하였다. 100kD 이하 크기 단백질을 확산을 가능케하는 메세캡슐른 24시간째 58 %의 생존율을 갖는다. 넓은 구경을 갖는 미세캡슐(200kD 크기 이상의 단백질 확산)은 24시간째 낮은 섬 세포 생존율인 32%를 나타냈다. 7일간 정상 시노몰거스 영장류의 피하지점으로 이식된 알지네이트 / PEG 캡슐화 신생 돼지 섬 세포 조직상의 인슐린 및 글루카곤에 대한 염색 결과는 저농도 시클로스포린의 7일간 알지네이트 / PEG 캡슐화 신생 돼지 섬 세포 조직의 생존을 가능케하는 알지네이트/PEG 미세캡슐 능력을 확인시켜 준다.
당뇨병성 영장류 복강내로의 돼지 섬세포 이종이식물의 알지네이트/PEG 미세캡슐 이식
당뇨병성 영장류로의 추적된 연구결과는 알지네이트 / PEG 미세캡슐로 캡슐화된 돼지 섬 세포가 항-CD154 전신 처치를 수반한 30일간의 인슐린 필요성을 증가시킴을 증명하였다. 도 27은 30일간 항-CD154 항체 처치를 받은 당뇨병성 시노몰거스 영장류의 복강 내로의 알지네이트/PEG 미세캡슐 로 캡슐화한 돼지 섬세포의 이식 결과를 설명한다. 이 이식된 섬 세포는 인슐린 주사없이 정상 혈당치 유지를 가능하도록 하였다.
서로 상이한 단백질 침투 선택성을 갖는 알지네이트/PEG 미세캡슐 함유 섬 세포 생산
코팅제 내의 구멍크기를 변화시키기 위하여 서로 다른 캡슐화 조건하에서 알지네이트/ PEG 미세캡슐에서 섬세포를 캡슐화하고 조직배양액에 위치하였다. 이 캡슐화 세포를 제거하고 단백질을 용해시키기 위하여 세제 (SDS)로 캡슐화 섬 세포를 처치하였다. 이러한 처치된 미세캡슐을 단백질이 없는 배양액 및 서로 다른 시간에 모아진 배양액에 위치하였다. 단백질 크기는 폴리아크릴아미드 겔상에 그 확산체를 위치하고 PAGE 전기영동법으로 서로 다른 단백질을 분리하는 과정을 통하여 측정하였다. 결과는 PEG 농도, PEG 크기, 공단량체 농도, 레이저 강도 및 섬세포로의 조사기간을 변화시키는 것은 PEG 코팅제의 침투선택성을 변화시키는 다수 방법 중의 일부 방법임을 확인할 수 있었다.
도 5는 PEG 코팅 형성과 관련된 변수들을 변화시킴으로서 알지네이트/ PEG 미세캡슐의 침투선택성 양상을 변화시키는 능력을 나타낸다. 알지네이트 / PEG 캡슐화 섬 세포를 배양하고 세포로부터 분비된 단백질의 분자량을 측정하였다. 비캡슐화 섬세포로부터 분비된 단백질은 가장 왼쪽열을 나타내고 분자량 마커 컬럼이 그 열에서 보인다. 그 다음 열은 알지네이트 / PEG 캡슐화 섬 세포로부터 분비된 단백질을 나타낸다. 분비된 단백질들은 각각 100 kD 이하, 100 kD, 60 kD 이하, 30 kD 이하, 및 0 kD 이었다.
실시예 9
섬 세포 조직 이외 세포 형태들의 알지네이트 캡슐화/PEG 코팅
섬 세포들에 더하여 유사하게 응집 세포들도, 서로 상이한 크기의 알지네이트 미세캡슐상의 캡슐화 섬 세포를 위한 상기한 기술을 이용하기 전에 클러스터로 제조한다는 점만 제외하고는 실시예 3에 기재된 방법과 유사하게 알지네이트 미세 캡슐로 캡슐화하였다. 이러한 방법으로 PEG로 인슐린 생성 종양 세포주, BHC8 마우스 도선종 세포를 균일하게 코팅시킬 수 있다. 또한 쉽게 응집되지 않는 몇몇 세포 형태를 이용하여 세포들을 세포성 클러스터로 응집되지 않아도 알지네이트 캡슐로 가장 먼저 캡슐화 시켰다. 이러한 방법으로 PEG로 인슐린 생성 종양 세포주, 래트 도선종 (RIN) 세포를 균일하게 코팅시킬 수 있다.
ApoE2를 생산하기 위해 제조되는 C-127 세포주로부터 얻은 세포들은 클러스터상이 아닌 알지네이트 매트릭스 상에서 배양되었다. 그리고 알지네이트 메트릭스에서 배양된 세포에 PEG 코팅을 수행하였다.
추가적으로 알지네이트 미세캡슐에서의 비응집성 세포(CHO)를 포획할 수 잇는데, 이는 배양물에서 이러한 알지네이트구 내에서 팽창되도록 하며 이후 알지네이트/PEG 코팅을 완성하는 PEG 코팅을 수행한다.
실시예 10
알지네이트 및 PEG 중합체 혼합물의 공동-돌출법(Co-extrusion) 사용에 의한 섬 세포 또는 기타 세포에 대한 알지네이트/PEG 코팅 형성
집합세포 또는 단일 세포를 주사기 펌프/아르곤 분사 시스템 내 한 주사기에 채운 알지네이트 용액과 혼합하였다.
이 주사기의 배출구를 바늘 세개를 포함하는 동일 축선상의 니들 시스템을 갖는 #21-게이지 바늘과 연결하였다. 두번째 주사기에는 단지 PEG 캡슐화 혼합물만 넣었으며 이를 동일 축의 니들 시스템을 갖는 중간 크기의 #18 게이지 바늘에 연결하였다. 아르곤 가스를 외부 #16-게이지 바늘에 연결하였다. 두 주사기의 유속이 일치되도록 세포를 넣은 알지네이트 주사기 및 PEG 주사기를 동일 펌프로 연결하였다. 작은 방울을 형성하는 가스의 양은 그 작은 방울의 크기를 제어하도록 설계되어졌다. 이 두 개의 주사기/ 아르곤 가스 분출기로부터 생성된 작은 방울들은 상단 3/4에 오일과 같은 비수용성 용매로 채워지고, 하단 1/4에는 80mM 칼슘 또는 바륨 함유 용액으로 채워진 긴 유리 컬럼에서 회수하였다.
회수 컬럼의 비수용성 부분에 캠슐화된 캡슐을 넣기 전에 PEG 외면 코팅을 가교화시킨 회수 컬럼의 비수용성 부분에 아르곤 레이저 빛을 조사하였다. 세포를 넣은 PEG 가교화 캡슐이 회수 컬럼 하단 1/4에 도달했을 때, 캡슐 핵상의 알지네이트가 가교화되었다. 이 가교화 알지네이트 코아/ PEG 코팅 캡슐을 컬럼 바닥으로부터 회수하고 비수용성 용매를 제거하기 위하여 세척하였다. 필요시 추가의 에오신 y의 존재 하에서 액상에서 추가적인 아르곤 레이져 빛을 캡슐에 조사시킴으로써 추가적인 PEG 가교반응을 완성하였다. 본 실시예는 (1) 단일 세포를 캡슐화할 수 있는 능력 및 (2) 캡슐화된 새로운 세포 성장을 가능하도록 PEG 캡슐 내에 성장 장소를 제공한다는 사실을 증명한 것이다. 이 코팅 유형을 사용한 실시예는 적혈구세포 (RBC's)로 수행하였다.
PEG 미세캡슐에서의 랑게르한스섬 세포의 캡슐화
10% 소태아혈청(FBS)을 함유한 M199 배지에서 현탁된 500개의 랑게르한스섬세포를 3분 동안 100 g로 원심분리하여 펠렛화하였다. 펠렛을 에오신 Y (1 mg/ml), 비닐 피롤리돈 (16 mg/ml) 및 트리에탄올아민 (100 mM)을 함유하는 M199 배지에 녹인 PEG 3.5 KD 트리아크릴레이트 마크로머의 1 ml 10% w/v 용액에 재현탁시켰다. 미네랄 오일(20 ml)을 튜브에 넣고 200-500 um 크기의 작은 방울 분산제를 형성시키기 위해 강력하게 교반하였다. 이 분산액을 514 nm 빛을 60초간 방출하면서 200 mW/㎠의 세기를 갖는 아르곤 이온 레이저에 조사시켰다. 미세캡슐이 정착되도록 미네랄 오일이 분리되었고 얻어진 미세 캡슐을 PBS로 2회, 헥산으로 1회, 마지막으로 배지로 3회 세척하였다.
실시예 11
섬 세포 또는 기타 세포들의 마이크로비드(Microbead)상의 균일한 코팅
응집되지 않으면서 균일한 코팅 형성을 저해하는, 세포 캡슐화 방법 중의 한 가지 방법이 미세담체 비드 (microcarrier beads)상에서 배양하는 것이다. 이 배양법에 따라, 실시예 2에 기재된 바와 유사한 분리된 섬 세포를 위한 PEG 균일 코팅기술을 종양 세포의 외부층을 함유하는 이러한 미세 담체 비드 (microcarrier beads)의 균일한 PEG 코팅을 형성하는데 사용하였다. 균일한 코팅물이 이 방법에 의해 생산되었고 허용 가능한 생존율을 나타내었다. 그 표면상의 서로 상이한 다양한 형태로 성장시키는데 사용되는 서로 상이한 형태의 미세 담체 비드가 본원에 기재된 균일한 코팅 공정면에서 성공적일 것이라고 간주될 것이다. 표면상에서 세포 성장을 목적으로 생산되는 다양한 형태의 미세담체 비드가 있다. 실시예 7에 기재된 ApoE2를 생산하기 위해 제조된 AC-127 세포주는 응집되지 않고 시토덱스 비드(Cytodex beads)상에서 배양된다. 미세담체 비드를 포함한 이러한 세포들은 담체 비드 및 부착 세포들 표면상에 직접적으로 균일한 PEG 코팅법에 의해 용이하게 캡슐화된다.
실시예 12
균일한 PEG 코팅법에 의해 캡슐화된 기타 세포 유형
응집되고 PEG로 균일하게 코팅가능한 또 다른 세포의 형태로는 NIT, 마우스 도선종, 세포주를 들 수 있다. 섬세포 응집을 위한 상기 기술이 적용되고 2주간 조직 배양상에서 파괴되지 않고 유지된 얇고 균일한 코팅된 결과를 도 28에 나타냈다. 배양 일주일 후, 캡슐화된 세포는 불화 에티디움 (ethidium bromide) / 풀루오레신 디아세테이트(fluorescein diacetate) 염색에 의해 명백하게 생존함을 나타냈다. 코팅된 세포는 FDA/EB 염색법으로 일상 광(도 28A) 및 형광 (도 28B)하에서 보여진다. 원숭이 신장 세포주를 조직 배양에서 응집되도록 하여 PEG로 성공적인 균일한 코팅을 수행하였다. 도 29A는 일상광하에서의 FDA/EB으로 염색된 세포를 나타내고 도 29B는 형과하에서의 FDA/EB으로 염색된 세포를 나타낸다. 또한 이러한 캡슐화 암세포의 생존력은 FDA/EB 염색으로 확인되었다.
또 다른 예로서, 췌장 랑게르한스섬 세포가 아닌 원시 세포를 응집화하였으며 PEG에 의해 성공적으로 균일하게 코팅하였다. 도 30은 인간 및 쥐로부터 얻은 원시 간세포(hepatocytes)로부터 생산되고 PEG가 균일하게 코팅된 세포의 응집물을 나타내고 이는 배양 2주 동안 생존을 유지하고 있음을 보여준다.
도 30A는 배양 2주 후 일상 광하에서의 2주후, 도 30B는 형광하에서 2주 배양되고 FDA/EB로 염색된 인간 세포를 나타낸다. 도 30C는 일상광에서, 도 30D는 형광에서 FDA/EB으로 염색된 마우스 세포를 나타낸다. 인간 및 마우스 간세포 응집물들은 모두 균일한 PEG 코팅이 성공적으로 수행되었으며, 배양 2주후에도 생존함을 보여준다.
실시예 13
미세캡슐 또는 균일하게 코팅된 캡슐화 섬 세포의 치료 유효량 측정
표 3 및 표 4는 당업자가 객체에 대한 랑게르한스섬의 치료 유효량을 결정하는데 지침을 제공한다. 하기 자료는 몇몇 가정들; 즉 (a) 모든 마이크로캡슐은 구형이다; (b) 하나의 랑게르한스섬 당 1,500개의 세포가 있다; (c) 체중 당 최저 치료효과를 갖는 일회분량은 15,000 IEQ/Kg이다; (d)마이크로캡슐의 5%, 균일한 코팅캡슐의 0%는 비어있다; (e) 미세캡슐/ 균일코팅캡슐의 최대 포장량은 전체부피의 75%이다; (f) 각각의 마이크로캡슐/ 균일 코팅 캡슐은 직경 150㎛의 한 개의 랑게르한스섬을 함유한다라는 가정하에 계산되었다. 세포의 최대 밀도( 8.2 x 108 세포/ml)를 균일하게 코팅된 랑게르한스섬세포 1mm 캡슐에서 수득 가능하다.
부피는 현탁액 또는 매트릭스 부피를 포함하지 않는다.
당업자에게 있어, 하기 자료들은 치료 유효량을 계산하는 지침서로 사용가능할 것이나, 하기 수치는 사용될 수 있는 그 수치 범위 및 섬 세포 농도를 제한하고자 함이 아님은 자명할 것이다. 이러한 계산을 하는 데 있어서 형성된 가정들이 본 발명의 범위를 한정하지는 않는다. 이러한 수치들은 단순하게 본 발명의 구현예에 포함되는 것이다 (V 세포(ml) = 0.0264938).
미세캡슐에 캡슐화된 랑게르한스 섬 세포
미세캡슐 직경[㎛] 미세캡슐 부피[㎖X106] 섬세포 부피[㎖X106] 섬세포에대한 미세캡슐의 부피비 섬세포수/ml 유효량[㎖/㎏] 유효량[100㎏ 성인당 ㎖] 췌장 섬세포 밀도[106/㎖]
1000 523.60 1.77 296 1,910 7.8540 785 2.0
900 381.70 1.77 216 2,620 5.7256 573 2.8
800 268.08 1.77 151 3,730 4.0212 402 4.0
700 179.59 1.77 101 5,568 2.6939 269 6.0
600 113.10 1.77 64 8,842 1.6965 170 9.4
500 65.45 1.77 37 15,279 0.9817 98 16.3
400 33.51 1.77 19 29,842 0.5027 50 31.9
300 14.14 1.77 8 70,736 0.2121 21 75.6
200 4.19 1.77 2 238,732 0.0628 6 255.1
균일 코팅된 랑게르한스섬 세포
코팅두께[㎛] 미세캡슐 부피[㎖X106] 섬세포 부피[㎖X106] 섬세포에 대한 미세캡슐 부피 비 섬세포수/ml 유효량[㎖/㎏] 유효량[100㎏ 성인당 ㎖] 췌장 섬세포 밀도[106/㎖]
400 448.92 1.77 254 2,228 6.7338 673 2.5
350 321.56 1.77 182 3,110 4.8233 482 3.5
300 220.89 1.77 125 4,527 3.3134 331 5.1
250 143.79 1.77 81 6,954 2.1569 216 7.8
200 87.11 1.77 49 11,479 1.3067 131 12.9
150 47.71 1.77 27 20,959 0.7157 72 23.6
100 22.45 1.77 19 44,545 0.3367 34 50.1
75 14.14 1.77 8 70,736 0.2121 21 79.6
50 8.18 1.77 5 122,231 0.1227 12 137.5
25 4.19 1.77 2 238,732 0.0628 6 268.6
10 2.57 1.77 1 388,736 0.0386 4 437.3
표 3 및 표 4는 당업자가 객체에 대한 치료 유효량을 결정하는데 지침을 제공할 것이다. 하기 자료는 몇몇 가정들; 즉 (a) 캡슐화되거나 균일하게 코팅된 세포는 평균직경이 50 mm이다; (b) 각 미세캡슐에서 세포응집물의 전체 부피는 1.77 x 10-6 ml이다; (c) 마이크로캡슐에는 5%, 균일하게 코팅된 캡슐에는 0 %가 비어있다; (d) 미세캡슐 /균일하게 코팅된 캡슐의 최대 포장량은 전체 부피의 75%이다; (e) 각 미세 캡슐 /균일하게 코팅된 캡슐은 직경 150 ㎛의 한개 랑게르한스 섬세포를 함유한다라는 기반하에 계산되었다. 세포의 최대 밀도( 1.36 x 107 cells/ml)를 균일하게 코팅된 랑게르한스 섬세포 1 mm 캡슐에서 수득 가능하다.
부피는 현탁액 액체나 세포질을 포함하지 않는다.
당업자에게 있어, 하기 자료들은 치료 유효량을 계산하는 지침서로 사용가능할 것이나, 하기 수치는 사용될 수 있는 그 수치 범위 및 섬 세포 농도를 제한하고자 함이 아님은 자명할 것이다. 이러한 계산을 하는 데 있어서 형성된 가정들이 본 발명의 범위를 한정하지는 않는다. 이러한 수치들은 단지 본 발명의 구현예에 포함되는 것이다.
미세캡슐에 캡슐화된 세포
미세캡슐 직경[㎛] 미세캡슐 부피[㎖×106] 세포 부피[㎖×106] 세포에 대한 미세캡슐의 부피비 세포밀도(평균성인세포)[103/㎖]
1000 523.60 1.77 296 34.0
900 381.70 1.77 216 46.7
800 268.08 1.77 151 66.4
700 179.59 1.77 101 99.2
600 113.10 1.77 64 157.5
500 65.45 1.77 37 272.2
400 33.51 1.77 19 531.6
300 14.14 1.77 8 1,260.0
200 4.19 1.77 2 4,252.4
균일하게 코팅된 세포
코팅 두께[㎛] 미세캡슐 부피[㎖×106] 세포 부피[㎖×106] 세포에 대한 미세캡슐 부피비 세포밀도(평균성인세포)[103/㎖]
400 448.92 1.77 254 41.8
350 321.56 1.77 182 58.3
300 220.89 1.77 125 84.9
250 143.79 1.77 81 130.4
200 87.11 1.77 49 215.2
150 47.71 1.77 27 393.2
100 22.45 1.77 13 835.2
75 14.14 1.77 8 1,326.3
50 8.18 1.77 5 2,291.8
25 4.19 1.77 2 4,476.2
10 2.57 1.77 1 7,288.8
실시예 14
알지네이트/PEG 미세캡슐의 특징
캡슐화 후 캡슐화 세포의 결과적인 기능 및 생존능, 조성물의 생물학적 적합성과 침투선택성을 측정하기 위하여 많은 다양한 형태, 길이, 및 크기의 PEG 아크릴레이트들이 동물에서 시험되었다. 아크릴화 PEG 코팅물 중 하나는 1.1 kD PEG 트리아크릴레이트였다. 이 매우 짧은 PEG 아크릴레이트는 가교시 특이한 생체적합 특성을 보인다.
하이드로겔 캡슐화 알지네이트 비드를 면역억제법을 사용하지 않을 때 14일 동안 정상 작은 동물 및 큰 동물에 각각 모두 이식하였다. 캡슐을 외식(explanted)하고 이러한 캡슐에 대한 조직 거부반응의 성질 및 강도를 조직검사로 조사하였다. 이러한 하이드로겔(hydrogel)조성은 생체에서 매우 좋은 생체 적합성을 나타내면서 어떠한 조직 거부반응도 없음이 조사 시료상에서 확인되었다. 도 31은 마우스, 돼지, 개, 그리고 영장류에서 생체적합성반응을 나타내고 서로 상이한 부위에 이식된 알지네이트 / PEG 미세캡슐을 비어 있음을 나타낸다. 1.1 kD PEG 트리아크릴레이트로 코팅된 빈 알지네이트 미세캡슐을 간문맥에 주사하였다. 이식 2주 후에 이러한 빈 PEG 미세 캡슐에 대한 거부 반응이 돼지 및 영장류 실험에서 나타나지 않았다. 개는 모든 PEG 주사시에 가장 강한 거부 반응을 나타냈지만, 반응성을 갖는 세포는 거의 없었다.
캡슐화 원료의 조성은 생체적합성, 침투선택성, 기능성 및 생존능을 평가하기 위하여 계산되고 수치화되었다. 수치화 시스템은 캡슐화 세포 이식에 대한 동물의 거부 반응의 양을 평가하는 데 사용되었다 (1 내지 4). 표 7은 대식세포, FB 거대세포, 염증 반응, 임파구 및 호산구의 존재를 수치로 나타낸 것이다. 생체적합성을 위한 전체 수치는 이러한 다섯 개 범주의 평균수치로 나타내었다. 도 32는 대표적인 조직형상을 1, 2 및 3의 수치로 표현한 소 동물에서의 캡슐화 세포의 생체적합성을 나타낸다. 도 33은 대표적인 조직형상을 1, 2 및 4의 수치로 표현한 대 동물에서의 캡슐화 세포의 생체적합성을 나타낸다.
수치 대식세포 FB 거대세포 염증반응 임파구 호산구
1 없거나 거의 없음 없음 없음 없음 없음
2 혼성 활성 분산됨,50% 미만 거의 없음 거의 분산됨 거의 분산됨
3 활성화, 약간 밀집됨 50% 초과 중정도 중정도 중정도
4 둘러싸임 포말상 강력함 강력함 강력함
표 8은 조성물의 성분 및 성분비의 변화에 따라 침투선택성이 어떻게 처리될 수 있는지를 나타낸다. 10 % 3.5K-TA 및 10 % 10K-TA의 배합조성물은 겔 구조를 매우 단단하게 하며, 혈액과 캡슐화 세포 사이의 거의 모든 단백질의 통로를 막는다. 만일 조성물이 5 % 3.5K-TA 및 5% 8K-DA로 변화되면, 이 겔 구조는 중간 크기 단백질(100 to 60 kD)이 혈액과 캡슐화 세포 사이를 통과하는 것을 허용한다. 20 % 10K-TA의 조성물은 거대 분자량의 단백질(>100 kD)이 혈액과 캡슐화 세포 사이를 통과하는 것을 허용하는 겔을 생성한다.
조성물 >100K <100K <60K <30K <18K No Bands
10% 3.5K-TA + 10% 10K-TA 0 0 0 0 0 100
0 0 0 0 0 100
5% 3.5K-TA + 5% 8K-DA 0 0 100 0 0 0
0 11 88 0 0 0
20% 10K-TA 75 25 0 0 0 0
100 0 0 0 0 0
88 0 12 0 0 0
캡슐화 재료 조성물은 캡슐화 세포의 작용 결과 및 세포생존율에 막대한 영향을 미친다. 겔을 제조하는데 사용되는 화학 약품 및 제조방법은 세포에 독성을 나타내거나 세포를 파괴시킬 수 있다. 도 34는 스트렙토조토신-유발 당뇨병 무흉선 마우스에 캡슐화 랑게스한스섬 세포를 이식한 결과를 나타낸다. 점수 "1"은 당뇨증상이 제거되고 150ng/ml 미만 혈당치의 캡슐화 세포를 나타내고, "2"는 당뇨증상은 감소시키나 매일 항상성을 유지하지는 못하고 150 ~ 300ng/ml 범위의 혈당치의 캡슐화 세포를 나타내고,"3"은 당뇨증상 조절이 어렵고 300 ng/ml 이상 혈당치의 캡슐화 세포를 나타낸다.
또한, 캡슐화 세포의 기능은 정적 포도당 자극시험법(Static Glucose Stimulation test)으로 측정될 수 있다. 본 시험법은 고농도 포도당(자극)을 이용한 인슐린 생성에 비교한 저농도 포도당을 이용한 기저 생성과 IBMX를 이용한 높은 포도당 사이의 인슐린 생성을 비교한 것이다. 도 6은 정적 포도당 자극시험법 상의 점수를 나타낸다. 점수 "1"은 기저의 두 배 이상의 자극성 인슐린 생성과 기저의 10배 이상의 IBMX 인슐린 생성을 나타낸다. 점수 "2"는 기저의 1.5 ~ 2배의 자극성 인슐린 생성 및 기저의 5 ~10배의 IBMX 인슐린 생성을 나타낸다. 점수 "3"은 기저의 1.5배 미만의 자극성 인슐린 생성 및 기저의 5배 미만의 IBMX 인슐린 생성을 나타낸다.
세포생존율은 캡슐화 과정을 측정하였다.
점수 시스템은 세포생존율을 "1" = >90%, "2" = <90% 내지 75%, "3" = <75% 내지 50%, "3" = <50% 내지 25%, 및 "4" = <25%로 분류한다. 도 4는 점수 1, 2 및 4의 캡슐화 세포의 세포생존율 및 조직 구도를 나타낸다.
실시예 15
혈관신생 성장인자를 생성하는 유전공학적으로 설계되고 균일하게 PEG 코팅된 허혈성 근육 이식물
다양한 세포 유형이 서로 다른 혈관신생 성장인자를 생성하기 위하여 유전학적으로 설계될 수 있다. 이러한 세포로는 사람 또는 동물의 섬유아세포, 혈관세포, 또는 다양한 비발암성 세포주를 들 수 있다.
VEGF, bFGF, 및 PDGF와 같은 혈관신생 성장인자의 선택은 캡슐화를 위해 유전학적으로 설계된 세포주로서 사용하기 위한 것이다.
허혈성 근육의 동물 모델로의 이식을 고려하기 전 필요한 것은 허혈성 근육의 미세 환경에 대한 임상 반응을 제공할 것으로 예상되는 수준에서 선택된 혈관신생 성장인자의 방출 결과의 측정이다. 만일 세포가 응집되도록 제조되었다면, 이러한 세포 응집물의 균일한 코팅물은 상기 실시예 2에서 기재된 바와 같은 유사한 조건을 사용하여 제조되었다.
이러한 캡슐화 혈관 신생 성장인자 생성 세포의 이식은 실험적으로 유발시킨 허혈성 심근 또는 실험적으로 유발시킨 허혈성 다리 근육을 갖는 설치류 모델에서 제조되었다. 결과 측정은 증가된 근육량의 조직학적 검사 및 심근을 포함하는 선택된 허혈성 근육의 향상된 작업의 기능 검사를 대상으로 수행하였다.
인간을 포함한 대형 동물에서 이러한 혈관신생 인자 생성 세포의 이식은 예를 들어, 어떠한 개복수술과정 없이 심근으로의 직접 주사가 가능한 혈관 접근 및 형광검사법적 조절법을 통해 완성되었다.
실시예 16
다양한 질병 치료를 위한 균일하게 PEG 코팅된 섬 세포, 간세포 또는 유전공학적으로 설계된 세포들의 비장 이식
랑게르한스섬 세포의 경우, 비캡슐화 섬 세포가 당뇨병성 개 비장뿐만 아니라 당뇨병성 인체 비장에 성공적으로 이식되었고, 간장 내부로의 비캡슐화 랑게르한스섬 세포 이식과 비교할 때, 유사하게 당뇨병을 성공적으로 치료하였다. 현재 캡슐화 랑게르한스섬 세포는 비장 및 피하 부위에서 성공적인 기능 수행을 가능케 하였다. 유사하게, 비장내의 간세포와 같은 유전공학적으로 설계된 세포의 비장으로의 이식은 세포에 혈관이 잘 생성되도록 하는 부위를 제공할 뿐만 아니라, 유전공학적으로 설계된 생성물이 간장으로 분비되게 하는 최초 사례를 제공한다. 비장에 이식된 유전학적으로 설계된 세포 생성물을 조작하거나 이용하는데 있어 간이 중요한 역할을 갖는 질환들에 있어서 중요하다. 비장에 대한 용이한 접근 및 세포부피의 수용능력은 캡슐화 세포 치료법을 위한 매력적인 요건을 제공한다.
실시예 17
질병 또는 질환 치료용 CNS 제제를 전달하기 위한 캡슐화 세포의 초내 주입
다양한 CNS 질병들이 캡슐화 세포의 의해 치료되었다
캡슐화된 도파민 생성 세포를 파킨슨병 환자의 흑색질에 주입하는 것과 같은 병든 뇌의 특정 위치에 직접 주입할 필요가 있는 환자들도 있다.
그러나, 요구되는 CNS 인자를 생성하는 캡슐화된 세포를 척추 또는 그 하부를 따라 위치하는 척수액에 간단히 주입함으로서 캡슐화된 세포 생성물 방출을 가능하게 함으로서 다양한 서로 상이한 CNS 질병 또는 질환들은 치료된다. 척수액의 순환은 관련된 뇌 또는 척수의 원하는 위치로 생성물을 운반시킨다. 본 연구방법의 또 다른 바람직한 예로서, 전이성 암 환자에게서 발생되는 만성 통증 상태의 치료를 위한 요추 도관 내로 삽입된 구멍있는 섬유조직 내에서 도파민 생성 세포를 캡슐화하는 것이다. 이러한 균일한 코팅제의 사용은 다량의 세포 운반을 가능하게 한다. 또 다른 적용법은 외부로 떨어져 나갈 수 있으나 어떠한 면역보호를 위한 이러한 튜브에 의존하지 않는 구멍성 튜브 내에 이 캡슐화 세포를 함유하는 것이다. 또 하나의 질병으로 다발성 경화증이 있는데, 이는 회돌기 교세포 또는 질병으로부터의 미엘린의 손상을 치료하는데 필요한 물질을 만드는 것으로 알려진 다른 인자를 만드는 기타 세포를 캡슐화함으로서 치료된다. 또 다른 예로서는 이 캡슐화 형태가 도파민 생성 세포의 양을 증가시킴으로서 치료되는 통증 치료이다. 도파민의 사용은 환자의 척수액에서 순환하는 도파민 수치를 증가시킴으로서 여러 형태의 약물 및 알콜 중독을 치료하는데 또한 도움이 된다. NGF 및 기타 제제의 사용은 척수 손상 환자의 치료에 도움이 된다. NGF 또는 기타 제제가 척수의 척수액에서 캡슐화된 세포로부터 방출된다.
실시예 18
실제 종양 또는 잠재적인 종양 위험으로부터의 질병 및 외과 수술적 제거로 인한 부갑상선 또는 부신 세포의 기능이 상실된 환자의 근육, 비장 또는 간장으로의 캡슐화된 부갑상선 또는 부신 세포의 이식
어떤 환자들은 실제 종양이 제거된 부갑상선 또는 부신을 갖고 있는 환자들이 있다. 환자들의 두 번째 군은 유전되는 유전적 질병에 기인한 향후 종양 생성 위험을 제거한 기관들을 갖는 군이다. 기관 기증자로부터의 정상인의 부갑상선 또는 부신 세포의 PEG 캡슐화가 기관 기증시 이러한 조직의 제거와 함께 수행되었다. 이러한 기관들은 실험적 작업을 위해 이러한 기관들로부터 얻은 얼마간의 세포 조직 절편이 있으며, 당업자라면 이러한 기관으로부터 세포들을 용이하게 제조할 수 있다. PEG 캡슐화는 실제 종양 또는 잠재적인 종양 형성을 통한 이러한 조직들중 하나의 기능을 상실한 환자에게 캡슐화된 세포를 균일한 코팅 또는 알지네이트 기반으로 한 PEG 코팅을 수행함으로서 완성된다.
실시예 19
유전적 질환 치료를 위한 캡슐화 세포 이식
유전적 결함에 기인한 수많은 인간 및 동물의 질환이 존재한다.
신체의 여러 조직으로 이러한 유전자를 직접 주입하는 유전자 치료법의 역할은 현재까지 안전하게 개발되지 않은 상태이다. 많은 유전 질환은 생성물을 만드는 원시 세포를 이용하거나 생성물을 만드는 유전공학적 세포를 이용하여 결실된 유전자를 생성하는 캡슐화 세포로 치료된다. 이러한 세포들의 캡슐화는 본원 명세서의 기재된 기술들에 의해 수행될 수 있을 것이다. 이러한 캡슐화 세포의 이식은 생성물 위치가 특정 위치에서 요구되지 않는다면 대부분의 위치에서 수행이 가능할 것이다. 따라서, 캡슐화된 세포는 간에서의 문맥정맥 또는 직접적 주입, 비장에서의 혈관 또는 직접적 주입, 근육에서의 혈관 또는 직접적 주입, 신장에서의 혈관 또는 직접적 주입, 심장에서의 혈관 또는 직접적 주입, 척추 도관으로의 주입, 뇌에서의 혈관 또는 직접적 주입, 폐에서의 혈관 또는 직접적 주입, 갑상선에서의 혈관 또는 직접 주입, 골수에서의 직접 주입, 관절에서의 직접 주입, 또한 상처에서의 직접 주입 또는 도포에 의한 직접 피하 주입이 가능하다.
실시예 20
농장에서 사용하기 위한 성장호른몬 생산 또는 우유 생산 증가용 동물 생산 을 위한 캡슐화 세포의 사용
성장 호르몬은 우유의 생산을 증가시키기 위해 낙농소에 사용되고 있다. 육류 생성 및 크기를 증가시키기 위하여, 또한 시장으로까지의 소요 시간을 줄이기 위하여 막 젓을 뗀 돼지에게 이 호르몬을 주입하는 것이 유용하다고 잘 알려져 있다. 성장호르몬 생산 세포의 캡슐화 및 이를 동물들에게 이식하는 것은 매일 비싼 주사 없이도 동일한 결과를 얻을 수 있다. 돼지 모델의 경우, PEG 코팅은 도축시 성장호르몬이 제거되어 식육용으로 소비되도록 6주내에 생분해가 가능하게 설계될 수도 있다.
선택적으로, 캡슐화 세포는 성장 호르몬 생성을 제거하기 위하여 즉시 제거 가능한 삽입형 용기에 보관된다.
상술한 기재는 성질상 원래 예시하고 설명하고자 함이며 본 발명 및 그 바람직한 구현예를 설명하고자 하는 것으로 이해되어야 할 것이다. 통상적인 실험방법을 통하여, 당업자는 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 당업계에 명백한 변화 및 변경들을 알아낼 것이다. 따라서, 본 발명의 형식은 실례가 되는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하고자 함이 아님이 명확히 이해되어야 한다. 본원에서 인용한 모든 참고문헌은 명백히 참고문헌으로 인용된다.
본 발명은 치료를 필요로 하는 환자의 체내로 캡슐화 생물학적 물질을 이식함으로써 당뇨병과 같은 질환을 치료하기 위한 조성물에 관한 것으로서, 본 코팅법은 생물학적 물질 표면 또는 생물학적 물질을 보유한 다른 코팅 물질 표면과 직접적으로 위치될 수 있다. 코팅물을 제조하기 위한 중합반응의 구성요소는 천연 및 합성 중합체, 다량체, 촉진제, 조촉매, 광개시제 및 발광을 포함한다. 이러한 캡슐화된 생물학적 물질은 피하 부위를 포함한 부위에 이식되어 다양한 인간 및 동물 질환 또는 장애를 치료하는데 사용된다. 코팅 물질은 장기간의 항염 또는 항면역성 치료에 대한 필요성이 없이 숙주 염증성 및 면역성 보호기전에 의한 캡슐화 생물학적 물질의 파괴되지 않게 보호하면서 숙주에게 캡슐화된 이식물로부터 생물학적 물질의 운반을 적정하게 하기 위하여 서로 상이한 생체 적합성 정도, 단백질 확산 특성, 세기 및 생분해성을 제공하기 위하여 조작될 수 있다.

Claims (92)

  1. 약 900 내지 3000 달톤 (Dalton)의 분자량을 갖는 폴리 에틸렌 글리콜(PEG) 코팅을 함유하는 다수 캡슐화 기구 및; 캡슐화 기구 내에 캡슐화된 다수의 세포를 포함하는, 약 100,000 세포/㎖의 세포 밀도를 가지는 세포 치료를 위한 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 캡슐화 기구는 미세캡슐인 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 미세캡슐은 균일하게 코팅된 세포 응집물인 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 세포 응집물은 췌장 섬 세포인 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 세포의 밀도는 약 6,000,000 세포/ml인 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포는 신경계, 심혈관계, 간장, 내분비선계, 피부, 조혈계, 면역계, 신경 분비계, 대사계, 전신조직계 또는 유전적 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 세포는 자가 조직성, 동종 이계, 이종 개체성 또는 유전공학적으로 변형된 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 내분비선 세포는 인슐린 생성 세포인 조성물.
  9. 질환 또는 질병 치료가 필요한 동물의 이식부위 내로 캡슐화 물질에 캡슐화된 세포를 포함한 400 미크론(micron) 이하의 평균 직경을 갖는 다수 캡슐 기구를 포함하고, 500,00 세포/㎖이상의 세포밀도를 갖는 치료적으로 효과적인 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 캡슐화 기구의 평균 직경은 300 미크론 이하인 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 캡슐화 기구의 평균 직경은 200 미크론 이하인 조성물.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 캡슐화 기구의 평균 직경은 100 미크론 이하인 조성물.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 캡슐화 기구의 평균 직경은 50 미크론 이하인 조성물.
  14. 캡슐화 물질에 캡슐화된 세포를 포함한 400 미크론 이하의 평균 직경을 갖는 다수 캡슐 기구를 포함하고, 캡슐화 기구 부피: 세포부피가 약 20:1 이하의 부피비를 갖는 치료적으로 효과적인 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 캡슐화 기구 부피: 세포부피가 약 10:1 이하의 부피비를 갖는 치료적으로 효과적인 조성물.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 캡슐화 기구 부피: 세포부피가 약 2:1 이하의 부피비를 갖는 치료적으로 효과적인 조성물.
  17. 동물 질환 또는 장애 치료에 사용하기 위한 전기 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애는 신경계, 심혈관계, 간장, 내분비선계, 피부, 조혈계, 면역계, 신경 분비계, 대사계, 전신조직계 또는 유전적 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 내분비선계 질병은 당뇨병인 조성물.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 동물은 우제류(Artiodactyla), 육식류 (Carnivora), 고래류(Cetacea), 기제류(Perissodactyla), 영장류(Primate), 프로보시드류 (Proboscides), 또는 라고모르파류(Lagomorpha)와 같은 수류 (Theria) 목 동물인 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 동물은 인간인 조성물.
  22. 제 17 항에 있어서,
    상기 조성물은 주사용인 조성물.
  23. 제 20 항에 있어서,
    상기 조성물은 피하, 근육내, 내부장기, 장기 동맥의/정맥의 혈관질, 뇌-척수액 또는 림프액으로 구성된 군으로부터 선택된 이식 부위에 사용하기 위한 조성물.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 조성물은 경피 부위에 이식되는 조성물.
  25. 제 22 항에 있어서,
    상기 조성물은 주사기내에 있는 조성물.
  26. 제 17 항에 있어서,
    상기 조성물은 면역억제제 또는 항염증제와 같이 사용하기 위한 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 면역억제제 또는 항염증제를 6개월 미만동안 투여하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 면역억제제 또는 항염증제를 1개월 미만동안 투여하는 방법.
  29. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 이식가능한 약제를 제조하기 위한 제 1항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 기재된 조성물의 사용.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 질환 또는 장애는 신경계, 심혈관계, 간장, 내분비선계, 피부, 조혈계, 면역계, 신경 분비계, 대사계, 전신조직계 또는 유전적 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 사용.
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 내분비계 질병은 당뇨병인 사용.
  32. 제 29 항에 있어서,
    상기 동물은 우제류(Artiodactyla), 육식류 (Carnivora), 고래류(Cetacea), 기제류(Perissodactyla), 영장류(Primate), 프로보시드류 (Proboscides), 또는 라고모르파류(Lagomorpha)와 같은 수류 (Theria) 목 동물인 사용.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 동물은 인간인 사용.
  34. 제 32 항에 있어서,
    상기 약제는 주사용인 사용.
  35. 제 29 항에 있어서,
    상기 약제는 피하, 근육내, 내부장기, 장기 동맥의/정맥의 혈관질, 뇌-척수액 또는 림프액으로 구성된 군으로부터 선택된 이식 부위에 사용하기 위한 사용.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 약제는 경피 부위에 이식되는 사용.
  37. 제 34 항에 있어서,
    상기 약제는 주사기내에 있는 사용.
  38. 제 29 항에 있어서,
    상기 약제는 면역억제제 또는 항염증제와 같이 투여하기 위한 사용.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 약제는 면역억제제 또는 항염증제와 같이 6개월 미만 투여하기 위한 사용.
  40. 제 39 항에 있어서,
    상기 약제는 면역억제제 또는 항염증제와 같이 1개월 미만 투여하기 위한 사용.
  41. 제 45 항에 있어서,
    상기 조직은 인슐린 생성 세포 덩어리인 방법.
  42. 제 46 항에 있어서,
    상기 세포는 인슐린 생성 세포인 방법.
  43. 제 41 항에 있어서,
    상기 캡슐화된 생물학적 물질은 균일하게 PEG 코팅된 섬 세포 동종이식물인 방법.
  44. 제 41 항에 있어서,
    상기 1차 및 2차 완충액 농도가 1 내지 200mM 인 방법.
  45. 제 49 항에 있어서,
    상기 1차 및 2차 완충액 농도가 10 내지 50mM 인 방법.
  46. 제 50 항에 있어서,
    상기 1차 및 2차 완충액 농도가 20 mM 인 방법.
  47. 제 41 항에 있어서,
    상기 광개시제는 카르복시에오신 (carboxyeosin), 에틸 에오신 (ethyl eosin), 에오신 Y (eosin Y), 플루오르세인 (fluorescein), 2,2-디메톡시 2-페닐아세토페논, 2-메톡시 2-페닐아세토페논, 캄퍼퀴논 (camphorquinone), 로즈 벤갈 (rose bengal), 메틸렌 블루 (methylene blue), 에리쓰로신 (erythrosin), 플록신 (phloxine), 티오닌 (thionine), 리보플라빈 (riboflavin) 또는 메틸렌 그린 (methylene green)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  48. 제 52 항에 있어서,
    상기 광개시제는 카르복시에오신인 방법.
  49. 제 41 항에 있어서,
    상기 광활성 중합체 용액은 중합가능한 고밀도 에틸렌성 불포화 PEG 및 설포네이트 공단량체을 포함하는 방법.
  50. 제 54 항에 있어서,
    상기 중합가능한 고밀도 에틸렌성 불포화 PEG가 중합성 고밀도 아크릴레이트 PEG인 방법.
  51. 제 55 항에 있어서,
    상기 중합성 고밀도 아크릴레이트 PEG가 1.1 kD의 분자량인 방법.
  52. 제 54 항에 있어서,
    상기 설포네이트 공단량체는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰 산, 비닐 설폰산, 4-스티렌 설폰 산, 3-설포 프로필 아크릴레이트, 3-설포 프로필 메타크릴레이트 및 n-비닐 말레이미드 설포네이트로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  53. 제 57 항에 있어서,
    상기 설포네이트 공단량체는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 설폰 산인 방법.
  54. 제 54 항에 있어서,
    상기 광활성 중합 용액은 추가적으로, 트리에탄올아민, 트리에틸아민, 에탄올아민, N-메틸 디에탄올아민, N, N-디메틸 벤질아민, 디벤질 아미노 N-벤질 에탄올아민, N-이소프로필 벤질아민, 테트라메틸 에틸렌디아민, 과황산 칼륨, 테트라메틸 에틸렌디아민, 리신, 오르니틴, 히스티딘 및 아르기닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 조촉매를 첨가하는 방법.
  55. 제 59 항에 있어서,
    상기 조촉매는 트리 에탄올 아민인 방법.
  56. 제 54 항에 있어서,
    상기 광활성 중합체 용액은 추가적으로 N-비닐피롤리다논, 2-비닐 피리딘, 1-비닐 이미다졸, 9-비닐 카르바존, 9-비닐카르보졸 아크릴 산, n-비닐카르포락탐, 2-알릴-2-메틸-1, 3-시클로펜탄 디온, 및 2-하이드록시 에틸 아크릴레이트로 구성된 군으로부터 선택되는 촉진제를 첨가하는 방법.
  57. 제 61 항에 있어서,
    상기 촉진제는 N-비닐 피롤리디논인 방법.
  58. 제 54 항에 있어서,
    상기 광활성 중합체 용액은 천연 및 합성 중합체를 포함하는 그룹으로부터 선택된 점도 증강제를 첨가하는 방법.
  59. 제 63 항에 있어서,
    상기 점도 증강제는 3.5 kD PEG-트리올 및 4 kD PEG-디올로 구성되는 군으로부터 선택된 방법.
  60. 제 54 항에 있어서,
    상기 광활성 중합체 용액이 밀도 조정제를 추가로 포함하는 방법.
  61. 제 65 항에 있어서,
    상기 밀도 조정제는 니코덴즈 (Nycodenz) 및 피콜 (Ficoll)로 구성되는 군으로부터 선택된 방법.
  62. 제 54 항에 있어서,
    상기 광활성 중합체 용액이 추가적으로"굿 (Good)" 완충액을 포함하는 방법.
  63. 제 67 항에 있어서,
    상기 굿 완충액은 HEPES 및 MOPS로 구성되는 군으로부터 선택된 방법.
  64. 제 68 항에 있어서,
    상기 굿 완충액은 MOPS인 방법.
  65. 제 54 항에 있어서,
    상기 에너지원은 아르곤 레이져 (Argon laser)인 방법.
  66. 제 54 항에 있어서,
    상기 캡슐화 방법을 위한 생물학적인 물질은 신경계, 심혈관계, 간장, 내분비선계, 피부, 조혈계, 면역계, 신경 분비계, 대사계, 전신조직계 및 유전적 물질로 구성되는 군으로부터 선택된 방법.
  67. 제 41 항에 있어서,
    상기 생물학적 물질은 포유동물 강 수류 아강에 속하는 동물로부터 유래된 것인 방법.
  68. 제 72 항에 있어서,
    상기 생물학적 물질은 우제류, 육식류, 고래류, 기제류, 영장류, 프로보시드류, 및 라고모르파류로 구성되는 군으로부터 선택된 동물로부터 유래된 방법.
  69. 제 73 항에 있어서,
    상기 영장류는 인간인 방법.
  70. 900 내지 3000 달톤의 분자량 범위의 중합 가능한 고밀도 에틸렌성 불포화 PEG 및 설포네이트 공단량체를 포함하는, 생물학적 물질을 캡슐화하기 위한 조성물.
  71. 제 75 항에 있어서,
    상기 중합가능한 고밀도 에틸렌성 불포화된 PEG는 중합가능한 고밀도 아크릴레이트 PEG인 조성물.
  72. 제 76 항에 있어서,
    상기 중합가능한 고밀도 아크릴레이트 PEG는 1.1 kD의 분자량을 갖는 것인 조성물.
  73. 제 75 항에 있어서,
    상기 설포네이트 공단량체는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 설폰 산, 비닐 설폰 산, 4-스티렌 설폰 산, 3-설포 프로필 아크릴레이트, 3-설포 프로필 메타크릴레이트 및 n-비닐 말레이미드 설포네이트로 구성되는 군으로부터 선택된 조성물.
  74. 제 78 항에 있어서,
    상기 설포네이트 공단량체는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 설폰산인 조성물.
  75. 제 75 항에 있어서,
    상기 조성물은 추가적으로 트리에탄올아민, 트리에틸아민, 에탄올아민, N-메틸 디에탄올아민, N, N-디메틸 벤질아민, 디벤질 아미노, N-벤질 에탄올아민, N-이소프로필 벤질아민, 테트라메틸 에틸렌디아민, 과황산 칼륨, 테트라메틸 에틸렌디아민, 리신, 오르니틴, 히스티딘 및 아르기닌로 구성되는 군으로부터 선택된 조촉매를 첨가한 조성물.
  76. 제 80 항에 있어서,
    상기 조촉매는 트리에탄올아민인 조성물.
  77. 제 75 항에 있어서,
    상기 조성물은 추가적으로 N-비닐피롤리디논, 2-비닐 피리딘, 1-비닐 이미다졸, 9-비닐 카르바존, 9-비닐카르보졸 아크릴 산, n-비닐카르포락탐, 2-알릴-2-메틸-1, 3-시클로펜탄 디온, 및 2-하이드록시에틸 아크릴레이트로 구성되는 군으로부터 선택된 촉진제를 첨가한 조성물.
  78. 제 82 항에 있어서,
    상기 촉진제는 N-비닐피롤리디논인 조성물.
  79. 제 75 항에 있어서,
    상기 조성물이 약 2 점 이상의 점수를 가진 생체 적합한 것인 조성물.
  80. 제 84 항에 있어서,
    상기 조성물이 포유류에서 생체 적합한 것인 조성물.
  81. 제 85 항에 있어서,
    상기 조성물이 인간과 가까운 존재의 영장류에서 생체 적합한 것인 조성물.
  82. 제 84 항에 있어서,
    상기 조성물이 인간에서 생체 적합한 것인 조성물.
  83. 제 75 항에 있어서,
    상기 조성물이 침투 선택성을 갖는 것인 조성물.
  84. 제 88 항에 있어서,
    상기 침투 투과성은 조성물을 조작함으로써 제조된 것인 조성물.
  85. 제 75 항에 있어서,
    상기 조성물은 약 2 점 이상의 점수를 가진 세포 기능 허용성을 갖는 것인 조성물.
  86. 제 90 항에 있어서,
    상기 세포 기능 허용성은 포유류에서 갖는 것인 조성물.
  87. 제 91 항에 있어서,
    상기 세포 기능 허용성은 인간과 가까운 존재의 영장류에서 갖는 것인 조성물.
  88. 제 92 항에 있어서,
    상기 세포 기능 허용성은 인간에서 갖는 것인 조성물.
  89. 제 75 항에 있어서,
    상기 조성물은 생분해성을 갖는 것인 조성물.
  90. 제 94 항에 있어서,
    상기 조성물은 포유류에서 생분해성을 갖는 것인 조성물.
  91. 제 95 항에 있어서,
    상기 조성물은 인간과 가까운 존재의 영장류에서 생분해성을 갖는 것인 조성물.
  92. 제 96 항에 있어서,
    상기 조성물은 인간에서 생분해성을 갖는 것인 조성물.
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