JP2005519585A5 - - Google Patents
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Claims (25)
- ヒト単核食作用性白血球の製造法であって:
(i)個体の血液試料から単球を単離し、その単球を適当な培地(本明細書において「培地」)に懸濁する;
(ii)同じ個体から皮膚切片を処理し、表皮を取り出し、真皮切片を培地中で抗生物質の存在下で超音波処理し、超音波処理した真皮切片を、新鮮な培地に抗生物質の存在下で浸漬し、新鮮な培地で抗生物質の非存在下で洗浄する;
(iii)工程(i)の単球と工程(ii)の洗浄した真皮切片を同時インキュベートする;
(iv)インキュベーション混合物から真皮切片を除去し、得られた活性化単核食作用性白血球を遠心分離により沈降させる;
(v)活性化単核食作用性白血球を培地で洗浄し懸濁する;
(vi)ヒトへの投与の適切性について培養物を評価する、
ことを含む方法。 - 工程(ii)において、ヒト皮膚切片の処理は、個体からの皮膚断片を凍結し、皮膚断片を融解し、培地と抗生物質からなる洗浄溶液に浸漬し、こうして約0.1〜5cm2、好ましくは約0.5〜2.0cm2の真皮切片を得ることにより行われる、請求項1の方法。
- 真皮切片を無菌容器に入れ、抗生物質を含有する培地に浸漬し、この容器を脱イオン水を含む超音波浴に導入して超音波処理し、次に超音波処理した真皮切片を、同じ抗生物質を含有する新鮮な適当な培地に浸漬し、抗生物質の非存在下で新鮮な培地で洗浄する、請求項2の方法。
- 培地はIMDMまたはRPMI1640であり、該抗生物質はオフロキソシン、バンコマイシンおよびゲンタマイシンである、請求項1〜3のいずれか1項の方法。
- 真皮切片は、周波数35〜40kHzで超音波浴で超音波処理される、請求項1の方法。
- 工程(iii)において、単球の真皮切片とのインキュベーションは、36〜38℃で5%CO2雰囲気で最大38時間、さらに好ましくは最大24時間行われる、請求項1の方法。
- 単球と真皮切片は自己由来である、請求項1〜6のいずれか1項の方法。
- 工程(ii)において、ヒト皮膚切片の代わりに、組織工学で作成した皮膚または組織工学で作成した皮膚相当物が使用される、請求項1の方法。
- 工程(vi)において、活性化ヒト単核食作用性白血球のヒト投与に対する適切性は、少なくとも以下の試験により評価される請求項1〜8のいずれか1項の方法:(a)無菌性;(b)細胞生存能力;(c)細菌エンドトキシン試験;(d)グラム染色;(e)形態分析による細胞質顆粒の計数;(f)CD14+細胞の存在;および(g)IL-1βの分泌レベル。
- 産生された活性化ヒト単核食作用性白血球のヒト投与に対する適切性は、以下の試験の1つ以上によりさらに評価される請求項9の方法:マンノース受容体発現、ICAM-1発現、IL-6とBDNF分泌。
- 産生された活性化ヒト単核食作用性白血球は少なくとも以下の特徴を示す、請求項1〜10のいずれか1項の方法:
(a)14日間の無菌性;
(b)トリパンブルー染色排除法を使用して、少なくとも80%の培養物生存能力;
(c)細菌エンドトキシン試験で200Eu/ml未満;
(d)グラム染色により細菌が存在しない;
(e)形態分析により、ほとんどの顆粒細胞の少なくとも25%は、少なくとも4顆粒/細胞を示す;
(f)少なくとも40%、好ましくは60%またはそれ以上の細胞は、CD14陽性である(CD14+);および
(g)細胞により産生されるIL-1βのレベルは、少なくとも17pg/106 CD14+ 細胞である。 - 産生される活性化ヒト単核食作用性白血球はさらに、1つ以上の以下の特徴を示す請求項11の方法:
(h)活性化細胞は、これらが由来する非活性化単球と比較して、マンノース受容体発現の統計的に有意な上昇を示す;
(i)細胞は、幾何平均蛍光が約200またはそれ以上のICAM-1受容体を発現する;
(j)細胞は、10pg/106CD14+ 細胞より高レベルのBDNFを分泌する;および
(k)活性化細胞によるIL-6の分泌は、これらが由来する非活性化単球によるIL-6分泌と比較して、約4〜15倍である。 - 請求項1〜12のいずれか1項の方法により得られるヒト単核食作用性白血球の培養物。
- ほとんどの顆粒細胞の少なくとも25%は、位相差顕微鏡下で1つの細胞当たり少なくとも4つの顆粒を示し、細胞の少なくとも40%、好ましくは60%またはそれ以上の細胞はCD14+である、請求項13のヒト単核食作用性白血球の培養物。
- 細胞により産生されるIL-1βのレベルは、少なくとも17pg/106 CD14+ 細胞である、請求項14の培養物。
- 少なくとも以下の特徴を示す、請求項14のヒト単核食作用性白血球の培養物:
(a)14日間の無菌性;
(b)トリパンブルー染色排除法を使用して、少なくとも80%の培養物生存能力;
(c)細菌エンドトキシン試験で200Eu/ml未満;
(d)グラム染色により細菌が存在しない;
(e)形態分析により、ほとんどの顆粒細胞の少なくとも25%は、少なくとも4顆粒/細胞を示す;
(f)少なくとも40%、好ましくは60%の細胞は、CD14陽性である(CD14+);および
(g)細胞により産生されるIL-1βのレベルは、少なくとも17pg/106 CD14+ 細胞である。 - 1つ以上の以下の特徴を示す、請求項16のヒト単核食作用性白血球の培養物:
(h)活性化細胞は、これらが由来する非活性化単球と比較して、マンノース受容体発現の統計的に有意な上昇を示す;
(i)細胞は、幾何平均蛍光が約200またはそれ以上のICAM-1受容体を発現する;
(j)細胞は、10pg/106CD14+ 細胞より高レベルのBDNFを分泌する;および
(k)活性化細胞によるIL-6の分泌は、これらが由来する非活性化単球によるIL-6分泌と比較して、約4〜15倍である。 - 請求項13から17のいずれかの活性化ヒト単核食作用性白血球と薬剤学的に許容される担体とを含む、細胞療法調製物。
- 軸索再生の促進のための、好ましくは、CNSの軸索傷害を引き起こすかまたはこれを伴う損傷または疾患後の軸索の再増殖のための、または創傷治癒のための、好ましくは、慢性皮膚潰瘍治癒のための、請求項18の細胞療法調製物。
- 脊髄の創傷における軸索の再増殖のための、請求項19の細胞療法調製物。
- 心筋梗塞症例の壊死組織の容量を低下させるための、請求項19の細胞療法調製物。
- 損傷した脊髄の軸索再生の促進のための、創傷治癒のための、または、心筋梗塞症における壊死組織の低下のための細胞療法調製物を製造するための、請求項13から17のいずれかのヒト単核食作用性白血球の培養物の使用。
- 該細胞療法調製物は、脊髄実質に、損傷の部位またはその近傍に、または静脈内に投与するための、または、創傷にまたは静脈内投与するための、またはin situで心筋にまたは静脈内投与するためのものである、請求項22の使用。
- 該細胞療法調製物は、糖尿病性創傷潰瘍および慢性足潰瘍のような慢性皮膚潰瘍の治癒のための、請求項22または23の使用。
- 単核食作用性白血球は自己由来である、請求項22から24のいずれかの使用。
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