JP2005511090A - 植物サイトカイニンオキシダーゼの発現を包含する、植物の形態学、生化学および生理学を改変するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、一般的に、植物の形態学的、生化学的、および生理学的な、特性または特徴を改変するための方法(例えば、1つ以上の発生プロセスおよび/または環境適合プロセス(根の成長、および/または不定根形成および/もしくは側根形成、および/または根屈地性、および/または根の成長、および/または頂芽優性、および/または分枝、および/または老衰の時期、および/または開花の時期、および/または花形成、および/または種子発生、および/または種子生成の、開始もしくは刺激もしくは増強の改変を含むが、これらに限定されない))に関する。種子の大きさおよび/または重量を増加するための方法、胚の大きさおよび/または重量を増加するための方法、ならびに子葉の大きさおよび/または重量を増加する方法もまた、提供される。これらの方法は、植物において、調節可能なプロモーター配列(例えば、細胞特異的プロモーター配列、組織特異的プロモーター配列、または器官特異的プロモーター配列)の制御下で作動可能である、サイトカイニン分解制御タンパク質(特に、サイトカイニンオキシダーゼ)を発現する工程を包含する。好ましくは、本発明により改変される特徴は、サイトカイニン媒介性特徴および/またはオーキシン媒介性特徴である。本発明は、本方法を実施するために有用である遺伝子構築物、およびその遺伝子構築物により生成された、他の同系対応物と比較して変化した形態学的特性および/または生化学的特性および/または生理学的特性を有するトランスジェニック植物に及ぶ。
根は、高等植物の重要な器官である。その主要な機能は、土壌における植物の固定、ならびに水および栄養素(N栄養、無機質など)の取り込みである。従って、根の成長は、特に栄養素制限条件下で、空気中にある器官の成長および収穫量に対して直接的または間接的な影響を有する。根はまた、二次植物産物(例えば、防御化合物および植物ホルモン)の生成に関係する。
本発明は、植物サイトカイニンオキシダーゼタンパク質、そのようなタンパク質をコードする核酸配列、およびベクター、宿主細胞、ならびにそのタンパク質、核酸配列およびベクターを含む、トランスジェニック植物細胞、植物、および植物部分を提供する。例えば、本発明は、Arabidopsis thaliana由来のサイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む遺伝子構築物に関する。この遺伝子は、調節性プロモーターの制御下で発現され得る。このプロモーターは、内因性組織特異的因子もしくは環境特異的因子によって調節され得るか、あるいは、特定の化学物質の適用により誘導され得る。
オーキシン生合成の増加に関連する上で言及した問題を回避するために、代替のアプローチに従うことに議論の余地はなった。本発明者らは、オーキシンの生物学的アンタゴニストのダウンレギュレートが、オーキシンレベルの増加と比較して、根の成長に対して類似の効果またはより優れた効果を誘発し得ることを理論付けた。ホルモン作用および相互作用は、非常に複雑であるが、本発明者らは、サイトカイニンが根の成長に対してオーキシンアンタゴニストとして機能し得ると仮定した。植物組織培養についてのホルモン研究は、サイトカイニンに対するオーキシンの割合が、これらホルモンの各々の絶対レベルよりも器官形成のために重要であることを示しており、このことは、実際に、これらのホルモンが、少なくとも特定の生物学的プロセスにおいてアンタゴニストとして機能することを示している。さらに、側根形成は、サイトカイニンの外因性適用によって阻害される。興味深いことに、根伸長は、サイトカイニン処理によってネガティブの影響を受け、このことは、サイトカイニンが根分枝形成と根の成長との両方を制御することを示唆している。
(a)配列番号27、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号25、配列番号26、配列番号28〜31、配列番号33もしくは配列番号34、またはそれらの相補体のいずれかで与えられるDNA配列を含む核酸:
(b)配列番号27、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号25、配列番号26、配列番号28〜31、配列番号33もしくは配列番号34、またはそれらの相補体のいずれかに対応するRNA配列を含む核酸;
(c)配列番号27、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号25、配列番号26、配列番号28〜31、配列番号33もしくは配列番号34、またはそれらの相補体のいずれかに特異的にハイブリダイズする核酸;
(d)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号32もしくは配列番号35、またはそれらの相補体のいずれかで与えられるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸;
(e)上記核酸が、DNA、ゲノムDNA,cDNA、合成DNAまたはRNAであることによって特徴付けられる、(a)〜(d)のいずれかにおいて定義される核酸(ここで、Tは、Uで置き換えられている);
(f)配列番号27、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号25、配列番号26、配列番号28〜31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかで与えられる核酸に退化される核酸、または遺伝暗号の結果として(a)〜(e)のいずれかにおいて定義される核酸に退化される核酸;
(g)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列番号35のいずれかで与えられるタンパク質をコードする核酸から分岐される核酸、または生物間でのコドン用法における差異に起因して、(a)〜(e)のいずれかにおいて定義される核酸から分岐される、核酸;
(h)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列番号35で与えられるタンパク質をコードする核酸、または対立遺伝子間の差異に起因して分岐される、(a)〜(e)に定義される核酸;
(i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12または配列番号35のいずれかで与えられるタンパク質をコードする核酸;
(j)サイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、(a)〜(i)のいずれかにおいて定義される核酸の機能的フラグメント;ならびに、
(k)植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸。
(a)配列番号29、3、5、9、26、27、31、33または34のいずれかに示されるようなDNA配列を含む核酸、またはそれらの相補体、
(b)配列番号29、3、5、9、26、27、31、33または34のいずれかに示されるようなRNA配列を含む核酸、またはそれらの相補体、
(c)配列番号29、3、5、9、26、27、31、33または34のいずれかに示されるような核酸に特異的にハイブリダイズする核酸、またはそれらの相補体、
(d)配列番号32に示されているようなポリペプチドを含み、そして配列番号4に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも70%類似の、好ましくは、少なくとも75%、80%または85%、より好ましくは、少なくとも90%または95%、最も好ましくは、少なくとも99%類似のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
(e)配列番号6に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも35%類似の、好ましくは、37%、40%、45%、47%または50%類似の、より好ましくは、55%、60%、65%、70%、75%または80%類似の、最も好ましくは、85%、90%または95%類似のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
(f)配列番号10または35に示されるようなアミノ酸配列に、少なくとも35%類似の、好ましくは、37%、40%、45%、47%または50%類似の、より好ましくは、55%、60%、65%、70%、75%または80%類似の、最も好ましくは、85%、90%または95%類似のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
(g)配列番号4、6、10、32または35のいずれかに示されるようなアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、
(h)配列番号29、3、5、9、26、27、33または34のいずれかに示されるような核酸に対して縮重しているか、または遺伝コードの結果として(a)から(g)のいずれかで規定されたような核酸に対して縮重している核酸、
(i)配列番号4、6、10または35のいずれかに示されるようなタンパク質をコードする核酸から分岐するか、または生物間でのコドン用法の差異に起因する(a)から(g)のいずれかに規定されるような核酸から分岐する核酸、
(j) 配列番号4、6、10または35に示されるようなタンパク質をコードする核酸、または対立遺伝子間の差異に起因して分岐する、(a)から(g)のに規定されるような核酸、
(k)配列番号29、3、5、9、26、27、31、33または34のいずれかに示されるような核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの免疫学的活性フラグメントをコードする核酸、または(a)から(j)のいずれかに規定されるような核酸の免疫学的活性フラグメントコードする核酸、
(l)配列番号29、3、5、9、26、27、31、33または34のいずれかにおいて示されるような核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの機能的フラグメントをコードする核酸、または(a)から(j)のいずれかにおいて規定されるような核酸の機能的フラグメントコードする核酸であって、ここで当該フラグメントは、サイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、核酸、および
(m)配列番号4、6、10または35に規定されるようなタンパク質をコードする核酸であって、ここで、当該核酸は、以下のGenbank登録番号AC005917、AB024035、およびAC023754のいずれかの下で登録された核酸ではない、核酸。
(a)ツーハイブリッド系を提供する工程であって、本発明のポリペプチドおよび相互作用タンパク質パートナーが上記の方法によって得られる、工程;
(b)この化合物を、a)に記載の発現されたポリペプチドによって形成された複合体と相互作用させる工程;ならびに
(c)この化合物の、ポリペプチドまたはa)に記載の発現されたポリペプチドによって形成された複合体との相互作用の(リアルタイムの)測定を実行する工程。
(a)複合体形成を可能にするのに適切な条件下で、本発明のポリペプチドをこの化合物または化合物の混合物と結合する工程;および
(b)複合体形成を検出する工程であって、この複合体の存在が、このポリペプチドを特異的に結合する化合物または混合物を同定する、工程。
Tm=79.8℃+(18.5×Log[Na+])+(58.4℃×%[G+C])−(820/#二重鎖中のbp)−(0.5%×ホルムアミド)。
(a)形質転換されるべき真核生物細胞において活性な目的の少なくとも1つの遺伝子および/または少なくとも1つの選択可能なマーカーを含むT−DNA領域;ならびに
(b)E.coliおよびAgrobacteriumにおいて活性な少なくとも1つの複製の起源ならびにE.coliおよびAgrobacteriumにおける選択についてのマーカーを含むベクター骨格領域、
を含む、t−DNA形質転換ベクターを意味する。
(a)植物において活性な、少なくとも1つの目的遺伝子および/または少なくとも1つの選択可能なマーカーを含むT−DNA領域;ならびに
(b)Escherichia coliおよびAgrobacteriumにおいて活性な少なくとも1つの複製の起源ならびにE.coliおよびAgrobacteriumにおける選択についてのマーカー、ならびにT−DNAの輸送を可能にするのに必要なvir遺伝子セットを含むベクター骨格領域、
を少なくとも含む、t−DNAベクターを意味する。
6個の異なる遺伝子を、トウモロコシ由来のサイトカイニンオキシダーゼに対する配列類似性を保有するArabidopsis thalianaから同定した(Morrisら、Biochem Biophys Res Comm 255:328−333,1999;Houda−Herinら、Plant J 17:615−626;WO99/06571)。これらの遺伝子を、トウモロコシタンパク質の配列を含む公的なゲノムデータベースからのヌクレオチド配列の6−フレーム翻訳を、tblastnプログラムを使用して、スクリーニングすることによって見出した。これらの配列を、Arabidopsis thalianaサイトカイニン−様遺伝子またはAtCKXと指定した。これらは、AtCKX1〜AtCKX6として任意に番号を付けた。以下のリストは、これらの遺伝子に対する情報を要約する。予測されたORF境界およびタンパク質配列は、Arabidopsisサイトカイニンオキシダーゼとトウモロコシサイトカイニンオキシダーゼとの間および異なるArabidopsisサイトカイニンオキシダーゼの間のタンパク質配列相違を近似することによって示すための指標である。示されるORF境界およびタンパク質配列は、これらのAtCKX遺伝子の作用の様式に対する決定的な証拠として取られないべきである。DNAとタンパク質配列との比較に対して、DNAstar製のプログラムMegAlignを使用した。このプログラムは、アライメントのためにClustal法を使用する。タンパク質配列とDNA配列とのマルチプルアライメントについて、ギャップペナルティーおよびギャップ長を、各10に設定した。タンパク質のペアワイズアライメントについて、パラメーターは、以下の通りであった:1で保存されたKtuple;3で保存されたギャップペナルティー;5で保存されたウィンドウ;5で保存されたダイアゴナル。cDNAのペアワイズアライメントについて、パラメーターは、以下の通りであった:2で保存されたKtuple;5で保存されたギャップペナルティー;4で保存されたウィンドウ;4で保存されたダイアゴナル。タンパク質のアライメントについての類似する群は以下である:(M,I,L,V)、(F,W,Y)、(G,A)、(S,T)、(R,K,H)、(E,D)、(N,Q)。Arabidopsis cDNA配列およびタンパク質配列の間で示される値は、全ての組み合わせを用いて示される最小値および最大値を示す。
データベース中での位置(登録番号、bacの位置):AC002510、Arabidopsis thaliana 第II染色体、255の完全配列の第225節。クローンT32G6由来の配列。
15517..16183、16415..16542、16631..16891、16995..17257、17344..17752
AtCKX1 cDNA配列は、配列番号25として列挙される。
相同性
Z.mays cDNAとの%同一性:
31.5%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
Z.maysタンパク質との%類似性:
32.2%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsis cDNAとの%同一性(範囲):
38.2%(AtCKX2)−54.1%(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsisタンパク質との%同一性(範囲):
37.1%(AtCKX2)−58.1%(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
(B.遺伝子名:AtCKX2(Arabidopsis thalianaサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質2(配列番号3)))
データベース中での位置(登録番号、bacの位置):AC005917、Arabidopsis thaliana第II染色体、255の完全配列の第113節。F27F23,F3P11クローン由来の配列。
相補体、40721..41012、41054..41364、41513..41770、42535..42662、43153..43711
留意してください:遺伝子予測プログラムNetPlantGene(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)を使用して本発明者らによって同定されたcDNA配列は、データベースにおいて注釈をつけられた配列とは異なる。新規のcDNA配列に基づいて、データベースにおいて予測されたORFを改訂した:
相補体、40721..41012、41095..41364、41513..41770、42535..42662、43153..43711
このcDNAによってコードされるタンパク質配列を、配列番号4に列挙する。AtCKX2のcDNAを、1工程RT−PCRキット(Qiagen,Hilden,Germany)を用いてAtCKX2トランスジェニック植物組織の全RNAからRT−PCRによってクローン化し、ABI PRISM Big Dye Terminator cycle sequencing reactionキット(Perkin Elmer Applied Biosystems Division)を使用して配列決定した。これは、本発明者らによって同定され、予想されたcDNA配列が正しいことを確認した。新規AtCKX2 cDNA配列を、配列番号26として列挙する。AtCKX2 cDNAのヌクレオチド1171〜1254に対応する84bpのフラグメントを、配列番号31として列挙する。この84bp cDNA配列の対応するペプチド配列を、配列番号32として列挙する。
Z.mays cDNAとの%同一性:
38.4%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
Z.maysタンパク質との%類似性:
37.5%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsis cDNAとの%同一性(範囲):
34.9%(AtCKX6)−64.5%(AtCKX4)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsisタンパク質との%類似性(範囲):
36.5%(AtCKX6)−66.1%(AtCKX4)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
(C.遺伝子名:AtCKX3(Arabidopsis thalianaサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質3(配列番号5)))
データベース中での位置(登録番号、bacの位置):AB024035、Arabidopsis thalianaゲノムDNA、第5染色体、P1クローン:MHM17、完全配列。
相補体、29415..29718、29813..30081、30183..30443、30529..30656、32107..32716
本発明者らによって同定された新規のAtCKX3 cDNA配列を、配列番号27として列挙する。
相同性
Z.mays cDNAとの%同一性:
38.7%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
Z.maysタンパク質との%類似性:
39.2%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsis cDNA%同一性(範囲):
38.8%(AtCKX6)−51.0%(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsisタンパク質との類似性(範囲):
39.9%(AtCKX6)−46.7%(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
(D.遺伝子名:AtCKX4(Arabidopsis thalianaサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質4(配列番号7)))
データベース中での位置(登録番号、bacの位置):
1)AL079344、Arabidopsis thaliana DNA 第4染色体、BACクローンT16L4(ESSAプロジェクト)
2)AL161575、Arabidopsis thaliana DNA 第4染色体、コンティグフラグメント第71番目。
1)76187..76814、77189..77316、77823..78080、78318..78586、78677..78968
2)101002..101629、102004..102131、102638..102895、103133..103401、103492..103783
AtCKX4 cDNA配列を、配列番号28として列挙する。
相同性
Z.mays cDNAとの%同一性:
41.0%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
Z.maysタンパク質との類似性
41.0%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsis cDNAとの%同一性(範囲):
35.2%(AtCKX6)−64.5%(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsisタンパク質との%相同性(範囲):
35.1%(AtCKX6)−66.1%(AtCKX2)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
(E.遺伝子名:AtCKX5(Arabidopsis thalianaサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質5(配列番号9)))
データベース中での位置(登録番号、bacの位置):AC023754、F1B16、完全配列、第1染色体
データベース中にORFの予測はなし。
43756..44347、44435..44562、44700..44966、45493..45755、46200..46560
本発明者らによって同定され、予測された新規のAtCKX5 cDNA配列を、配列番号29として列挙する。このcDNAについての予測されたタンパク質配列を、配列番号10として列挙する。第2の潜在的なATG開始コドンは、ゲノム配列中に9ヌクレオチドを超えて上流に存在する。これら2つの開始コドンのうちどちらが、タンパク質の第1のアミノ酸をコードするかは不明である。従って、この上流開始コドンで開始する第2の潜在的なAtCKX5 cDNAをまた、本発明において配列番号34として列挙する。対応するゲノム配列を、配列番号33として列挙し、コードされるタンパク質を配列番号35として列挙する。
Z.mays cDNAとの%同一性:
39.1%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
Z.maysタンパク質との%類似性:
36.6%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsis cDNAとの%同一性(範囲):
40.1%(AtCKX2)−44.0%(AtCKX3)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsisタンパク質との%類似性(範囲):
41.6%(AtCKX4)−46.4%(AtCKX6)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
(F.遺伝子名:AtCKX6(Arabidopsis thalianaサイトカイニンオキシダーゼ様タンパク質6(配列番号11)))
データベース中での位置(登録番号、bacの位置):AL163818、Arabidopsis thaliana DNA 第3染色体、P1クローンMAA21(ESSAプロジェクト)
データベース中に予測されるORF:
46630..47215、47343..47470、47591..47806、47899..48161、48244..48565
AtCKX6 cDNA配列を、配列番号30として列挙する。
相同性
Z.mays cDNAとの%同一性:
37.3%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
Z.maysタンパク質との%類似性:
36.1%(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のArabidopsis cDNAとの%同一性(範囲):
34.9%(AtCKX2)−54.1%(AtCKX1)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
他のタンパク質との%類似性(範囲):
35.1%(AtCKX4)−58.1%(AtCKX1)(Dnastar/MegAlign−Clustal法)
遺伝子AtCKX3およびAtCKX5を、データベース中の推定サイトカイニンオキシダーゼとして注釈を付けず、これらの遺伝子に対するORFを与えなかった。さらに、AtCKX2について予測されたORF(従って、タンパク質構造)は、本出願人らの独自の予想とは異なり、本出願人らの予測を、AtCKX2 cDNAを配列決定することによって確認した。
(1.クローニングプロセスの記載)
以下のプライマーを使用し、Arabidopsis thaliana(登録Columbia)由来のAtCKX−1遺伝子をPCR増幅した(クローニングのために使用された非相同配列は、下の場合である):
5’プライマーの配列:cggtcgacATGGGATTGACCTCATCCTTACG(配列番号13)
3’プライマーの配列:gcgtcgacTTATACAGTTCTAGGTTTCGGCAGTAT(配列番号14)。
高いレベルでAtCKX1転写物を合成するいくつかのトランスジェニック株を、同定した(図3)。AtCKX1転写物を発現するトランスジェニック株はまた、記載されるように(Motykaら、1996)、[2−3H]iPのアデニンへの変換に基づくサイトカイニンオキシダーゼ活性に対する標準的なアッセイによって決定される場合、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表6の2つのタバコ株および2つのArabidopsis株について例示される。この結果は、AtCKX1遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを示す。
1)強−2クローン
2)中間−3クローン
3)弱−4クローン
4)大きな花部を有する高い植物(WTとして)−5クローン
5)WTに類似、9クローン
(高い(図7BおよびCを参照のこと))
− WT:100〜150cmの間
− 弱:約75cm
− 中間:約40〜45cm(主幹 約25cmであるが、側枝がより大きくなる)
− 強:約10cm
トランスジェニックAtCKX1−48およびAtCKX1−50は、強表現型を示した。以下は、WT植物と比較される場合の幹伸長についての測定である。
AtCKX1トランスジェニック発現体(expressor)の葉の形状は、皮針形(狭く細長い)であり:成葉の幅 対 長さの比は、1:2(野生型植物)から1:3(AtCKX1トランスジェニック)まで減少した(図7E)。葉のおよび葉表面の数は,WTと比較して減少した(図7Dを参照のこと)。顕著な差異はまた、葉の老化の進行の間にも観察された。WTタバコにおいて、葉の老化は、最も基本の葉で始まり、そして葉色素の均一な減少を生じる(図7E)。対照的に、強力に発現するAtCKX1植物の老化している葉は、葉脈に沿って緑色のままであり、そして葉脈間領域において黄色に変わり、このことは変化した葉の老化を示している。より古い葉の手触りは、より堅かった。
遺伝子を高度に発現するインビトロで栽培された植物は、より厚い(より強い)より多くの根を形成する能力(図8A)によって、および茎に沿った気根の形成によって、WTから容易に区別可能であった。
・中間表現型:WT植物における第5節間および第9節間の、それぞれ、5cmおよび2cmの長さと比較して、花の下から5番目の節間は、約2.5cmの長さであり、そして9番目の節間は、約0.5cmの長さであった。
・強力な表現型:植物AtCKX1−50。発芽の131日後に測定した根元からの20番目の節間の長さは、WTの39.2±3.8mmと比較して、1.3±.0.4であった。
より多くの側枝が、形成され、このことは、栄養成長の間の、WT植物と比較して減少した頂芽優性を示している(図9を参照のこと)。側枝は、主茎を過剰に生長させ、中間AtCKX1発現体について、40〜45cmの高さに達した。さらに二次枝が現れた。しかし、芽は、頂芽優性から完全には解放されなかった(すなわち、側枝は、現実に、伸び続けなかった)。減少した頂芽優性は、より小さな苗条の頂端分裂組織の頂芽成長点による減少したオーキシン産生に起因し得る(実施例10を参照のこと)。
AtCKX1トランスジェニック体における開花の開始は、遅れ、そしてさく果1つあたりから得られる花および種子の数が、減少した。花のサイズは、トランスジェニック植物において変化せず、そして個々の種子の重量は、野生型植物由来の種子の重量に匹敵した。2つの代表的なAtCKX1トランスジェニック体のデータを、以下にまとめる:
(A.開花の開始)
・発芽の開始は、WTについてと同じであった。
・全根系は、伸長し、そして側根および不定根の数が、増大した(図4A〜Dを参照のこと)。
・気生器官(aerial organ)の成長は減少して、縮小した表現型を生じ(図4Eおよび4Fを参照のこと)、そして葉生物体量は、減少した。葉および花の形成は、遅れる。
・生活環は、WTと比較して長く、そして種子の収穫量は、WTと比較して少なかった。
(根の発生)
(A.根系の全長)
(A.葉表面)
開花の開始
AtCKX1トランスジェニックArabidopsis植物の分析は、タバコから得られた結果を大部分確認し、そして減少したサイトカイニン含量の結果の一般的な性質を示す。全根系は、伸長し(根の全長は、AtCKX1トランスジェニック体において、約110〜140%増加した)、そして苗条は、よりゆっくりと発生し(開花の遅れ)そして葉生物体量は、減少した。種子の収穫量も同様に、このトランスジェニック体においてより低かった。
(1.クローニングプロセスの説明)
以下のプライマーを使用して、Arabidopsis thaliana(受託 コロンビア)由来のAtCKX2遺伝子をPCR増幅した(クローニングのために使用される非相同配列は、小文字である):
5’プライマーの配列:gcggtaccAGAGAGAGAAACATAAACAAATGGC(配列番号15)
3’プライマーの配列:gcggtaccCAATTTTACTTCCACCAAAATGC(配列番号16)。
AtCKX2転写物を高レベルで合成するいくつかのトランスジェニック株を、同定した(図6)。AtCKX2転写物を発現するトランスジェニック株もまた、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表7中の2つのタバコ株および3つのArabidopsis株について例示される。この結果は、AtCKX2遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明する。
(3.1 タバコについて(図7〜10を参照のこと))
表現型の3つのカテゴリー:
1)強い−15クローン(AtCKX1の中間表現型と類似);
2)弱い−6クローン;
3)その他−WT植物と類似、7クローン。
植物の高さ、節間距離、枝分かれ、葉の形態および黄変に関する観察は、矮性特徴が、AtCKX2トランスジェニック体よりもAtCKX1トランスジェニック体においてより激しいという点で、一般に小さい量的差異を有するAtCKX1トランスジェニック体についての観察と類似していた(図7Aおよび7Bにおいて、AtCKX1植物とAtCKX2植物とを比較のこと)。このことは、強力な表現型であるAtCKX2−38およびAtCKX2−40を有するクローンの幹伸長および節間距離の測定について、以下に例示される。
遺伝子を高度に発現するインビトロで栽培された植物は、より厚い(より強い)より多くの根を形成する能力によって、および茎に沿った気根の形成によって、WT植物から容易に区別可能であった。
気生植物部分の成長が減少するという事実にもかかわらず、WTコントロールと比較して、根の成長および生物体量の増加が、AtCKX2トランスジェニック実生および異なる条件下で栽培した成体植物について観察された。異なるトランスジェニック植物の間の量的差異が観察された:根生物体量のより大きな増加が、最も強力に発現するクローンについて観察された。
AtCKX2トランスジェニック体における開花の開始は、遅れ、そして1さく果あたりの花の数および種子の収穫量が、減少した。これらの効果は、AtCKX1トランスジェニック植物において観察された効果と非常に類似していたが、これらは、以下の表に示されるように、AtCKX2トランスジェニック体においてあまり顕著でなかった。花の大きさは、トランスジェニック植物においては変化せず、そして個々の種子の重量は、野生型植物の種子の重量に匹敵した。
以下の形態計測データは、AtCKX2トランスジェニックスについて得られた:
根発育
(A.根系の全長)
(葉表面)
(開花の開始)
AtCKX2トランスジェニックスについて観測された表現型は、AtCKX1トランスジェニックスと非常に類似するが、同一ではなく、これは、タバコトランスジェニックスについて得られた結果と非常に類似するが、同一ではない。これは、これらの2つの植物種における減少したサイトカイニン含有量の結果の一般的な性質を確認し、従って、類似の表現型は、同様に他の植物種において予期され得る。タバコとArabidopsisとの間の主要な違いは、AtCKX2過剰発現植物における増加した主根増殖の欠如である。
(1.クローニングプロセスの説明)
以下のプライマーを使用して、Arabidopsis thaliana(Columbia許諾)由来のAtCKX3遺伝子をPCR増幅した(クローニングのための使用した非相同性配列は、小文字である):
AtCKX3転写物を高レベルで合成する、いくつかのトランスジェニックタバコ株を同定した(図11A)。AtCKX3転写物を発現するトランスジェニックタバコ株はまた、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表8において3つの植物で例示される。これは、AtCKX3遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明する。
タバコおよびArabidopsisにおけるAtCKX3遺伝子の過剰発現によって生成される表現型は、AtCKX1発現植物およびAtCKX2発現植物の表現型と基本的に類似した(すなわち、増強された根付きおよび矮化)。しかし、タバコにおけるAtCKX3遺伝子の過剰発現は、AtCKX2と比較してより強力な表現型を生じた。この意味において、AtCKX3の過剰発現は、AtCKX1過剰発現とより類似した。
(1.クローニングプロセスの説明)
以下のプライマーを使用して、Arabidopsis thaliana(Columbia許諾)由来のAtCKX4遺伝子をPCR増幅した(クローニングのための使用した非相同性配列は、小文字である):
いくつかのトランスジェニックタバコ株は、AtCKX4転写物を高レベルで合成した(図11B)。AtCKX4転写物を発現するトランスジェニック株はまた、増加したサイトカイニンオキシダーゼ活性を示した。これは、表9において3つのArabidopsisおよび3つのタバコ株で例示される。この結果は、AtCKX4遺伝子が、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを証明する。
タバコおよびArabidopsisにおけるAtCKX4遺伝子の過剰発現によって生成される表現型は、AtCKX1発現植物およびAtCKX2発現植物の表現型と基本的に類似した(すなわち、増強された根付き、減少した頂芽優性、矮化、およびタバコの規則的な葉の葉脈間領域の黄変)。タバコにおけるさらなる表現型は、披針形の葉であった(変化した、長さ対幅の比)。
全般的に、表現型分析は、AtCKX遺伝子過剰発現が、タバコにおける苗条および根系における劇的な発育の変化(増強された根系の発育、および着生植物部分の矮化を含む)を引き起こしたことを実証した。他の効果(例えば、変化した葉の老化、茎における不定根の形成、および他のもの)もまた、本明細書中に記載されるように観察された。異なる遺伝子について、変化は非常に類似するが、同一ではなかった。タバコにおいて、AtCKX1およびAtCKX3の過剰発現は、AtCKX2およびAtCKX4とは異なる。一般的に、2つの前者は、特性(特に、苗条)のより高い発現を示した。従って、特定のサイトカイニンオキシダーゼ遺伝子は、本発明の実施形態に記載される表現型を達成するために好ましくあり得る。
以下のプライマーを使用して、Arabidopsis thaliana(Columbia許諾)由来のAtCKX5遺伝子をPCR増幅した(クローニングのための使用した非相同性配列は、小文字である):
以下のプライマーを使用して、Arabidopsis thaliana(Columbia許諾)由来のAtCKX6遺伝子をPCR増幅した(クローニングのための使用した非相同性配列は、小文字である):
AtCKX1−50およびAtCKX2−38を過剰発現トランスジェニックスおよびWTタバコの種子を、MS培地にインビトロで播き、冷却処理の4日後、培養室に持って行き、6日後に、発芽した。実生生育に対する観察を、発芽の10日後に行い(図8Cもまた参照のこと)、以下に要約した。少なくとも20の個体を、クローン当たりで評価した。類似のデータが、2つの他の実験において得られた。
AtCKX1過剰発現タバコ植物およびAtCKX2過剰発現タバコ植物の実生は、発芽の10日後の非形質転換コントロール植物よりも60%多くの不定根および3倍多くの側根を有した。主根の長さは、約70%増加した。これは、より多くて長い横根および第2根とともに、全体の根の長さの70〜100%の増加を生じた。これらの結果は、サイトカイニンオキシダーゼの過剰発現が、主根および不定根の両方の生育および発育を増強し、早期の生長力を生じることを示した。
種々の組織の顕微鏡分析は、AtCKXトランスジェニックスにおける形態学的変化が、細胞数および細胞形成速度における明瞭な変化によって反映されることを明らかにした(図10を参照のこと)。AtCKX1トランスジェニックスの苗条頂端分裂組織(SAM)は、野生型より小さく、そして中心区域(zone)と側方器官形成の周辺区域との間の空間をより少ない細胞が占めるが、細胞は同じサイズであった(図10A)。減少したサイトカイニン含有量の結果としての、SAMの減少した細胞数およびサイズは、サイトカイニンが、SAM増殖においてある役割を有することを示す。分化パターンにおける明確な変化は生じず、SAMにおける分化区域の空間的組織化が、細胞数および局所サイトカイニン濃度から大きく独立することを示唆する。サイトカイニンオキシダーゼ過剰発現における葉の全体的な組織パターンは、変化しなかった。しかし、師部および木部のサイズは、有意に減少した(図10B)。対照的に、葉の柔組織および表皮細胞の平均細胞サイズは、4〜5倍増加した(図10C、D)。AtCKX1トランスジェニックスの新たな細胞は、野生型の葉の速度の3〜4%で形成され、そして最終的な葉の細胞数は、野生型の5〜6%の範囲であると推定された。これは、葉におけるサイトカイニンが、細胞分裂サイクルを維持するための絶対的な要件であることを示す。花器官の細胞サイズも細胞形態も、変化せず、そしてカプセル当たりの種子収穫量が、野生型およびAtCKXトランスジェニック植物において類似した。AtCKX1トランスジェニック植物の根分裂組織の細胞集団は、約4倍拡大し、そして中心カラムネラ(columnella)および側方カラムネラの両方における細胞数が増加した(図10E、F)。最終根直径は、全ての型の根細胞の増加した直径に起因して、60%増加した。半径方向の根のパターンは、しばしば第4層の皮層細胞が、トランスジェニックの根において注目されたことを除いて、野生型およびトランスジェニックスと同一であった(図10G)。増加した細胞数およびわずかに減少した細胞長は、増強された根の生育が、増加した細胞の生育よりもむしろ増加した数のサイクリング細胞に起因することを示す。低下したサイトカイニン含有量の存在下において、根の分裂組織細胞は、分裂組織を残し、伸長を開始する前に、さらなる回の有糸分裂を受けなければならない。従って、分裂組織からの出口は、サイトカイニンに感受性の機構によって調節される。明らかに、サイトカイニンは、根の分裂組織においてネガティブな調節の役割を有し、そして野生型サイトカイニン濃度は、最大の根系の発育に対して阻害性である。従って、サイトカイニンオキシダーゼを過剰発現することによる活性サイトカイニンのレベルの減少は、根の発育を刺激しこれは、WT植物と比較してより多くの側根および不定根を有する根のサイズの増加を生じる。
測定した16の異なるサイトカイニン代謝のうち、最も大きな変化は、AtCKX2過剰発現物のiP型サイトカイニンにおいて生じた(表10):iP型サイトカイニンの含有量の全体的な減少は、AtCKX1トランスジェニックスにおけるよりもAtCKX2発現植物においてより明白である。AtCKX1トランスジェニックスは、苗条においてより強力な表現型を示した。どのサイトカイニン代謝物が、分析された異なる性質に関連するかは、分からない。それは、異なるサイトカイニンが、種々の発育プロセスにおける異なる役割を演じることであり得る。より小さな変化がZ型サイトカイニンについて注記され、これは、基質の異なる接近性またはタンパク質のより低い基質特異性に起因し得る。個体トランスジェニッククローンにおけるiPおよびZ代謝物の合計の含有量は、野生型の31%と63%との間であった。O−グルコシドのサイトカイニン保存プールはまた、トランスジェニックスにおいて低下した(表10)。N−グルコシドおよびDHZ型サイトカイニンの濃度は、非常に低く、そしてトランスジェニックの実生において変化しないか、またはほんのわずかに変化した(データは示さず)。
どのサイトカイニンオキシダーゼ過剰発現の表現型の効果が、発現組織に制限されるか(すなわち、細胞自律性または器官自律性の性質)を調査するために、接ぎ木実験を行った。AtCKX2トランスジェニックタバコ植物とWTタバコとの間で、相互接ぎ木を行った。この実験で使用されたトランスジェニック植物は、AtCKX2−38であり、これは、増強された根の生育および着生植物部分の減少した発育によって特徴付けられる強い表現型を示した。実施例3〜6に記載されるように、これらは、タバコおよびarabidopsisにおけるサイトカイニンオキシダーゼ過剰発現から生じる2つの重要な表現型であった。
AtCKX遺伝子(実施例4を参照のこと)を、Arabidopsisの根clavataホモログプロモーター(配列番号36)(これは、根特異的発現を駆動するプロモーターである)の制御下にクローニングする。他の根特異的プロモーターもまた、本発明の目的のために使用され得る。例示的な根特異的プロモーターについては、表5を参照のこと。
AtCKX遺伝子に由来し、かつ内因性サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子の発現を抑制するように設計したキメラ遺伝子構築物を、老化誘導性プロモーターの制御下にクローニングする。例えば、老化関連遺伝子(SAG)由来のプロモーター(例えば、SAG12プロモーター)を使用し得る(Quirinoら、2000)。葉の老化において特異的に内因性サイトカイニンオキシダーゼ遺伝子を抑制するトランスジェニック植物は、植物の形態および成長および発達に負に影響することなく、葉の老化の遅延ならびにより多い種子収穫量を示す。
AtCKX遺伝子のオープンリーディングフレームを、雌性生殖器官における過剰発現付与するプロモーター(例えば、Antirrhinum majus由来のDefH9プロモーターまたはそのホモログのうちの1つであり、これは、胎座および胚珠における特異的に高発現特異性を有する)の制御下にクローニングする。これらの組織において増強されたサイトカイニンオキシダーゼ活性を有するトランスジェニック植物は、単為結実果実の発達を示す。
トランスジェニックArabidopsis thaliana植物は、上記のように、35Sプロモーターの制御下で、サイトカイニンオキシダーゼ(AtCKX)遺伝子を過剰発現する。トランスジェニック植物(特に、AtCKX1遺伝子およびAtCKX3遺伝子を発現する)は、サイズが大きくなった種子を発達させた。この種子のサイズが大きくなった原因はほとんど完全に、胚が大きくなったことによるものである。種子、胚および初期後胚表現型の詳細は、図13A〜13Eに示される。表11は、野生型および4つの調査したAtCKX遺伝子の各2つの独立したクローンの種子重量を示す。平均重量は、各クローンについて200種子の5つの異なるバッチを分析することによって得た。定量評価は、AtCKX1発現クローンおよびAtCKX3発現クローンの種子重量が、野生型よりも約1.8〜2.3倍高いことを示した。AtCKX2発現系統およびAtCKX4の発現系統の種子収穫重量は、10〜25%の範囲であった(表11および図14)。
Nicotiana tabacum L.cv.Samsun NNの葉外植片を、CaMV35 Sプロモーターの制御下に、AtCKX1遺伝子またはAtCKX2遺伝子を備えるベクターBin−Hyg−TXで形質転換した。これらの形質転換した植物に由来するいくつかの系統をさらに培養し、そしてこれらの種子サイズを分析した(表12)。
Claims (137)
- 根の成長を刺激するか、または側根もしくは不定根の形成を増強するか、または根の横地重力屈性を変更するための方法であって、該方法は、植物または植物の一部において活性なサイトカイニンのレベルを低減させる、植物サイトカイニンオキシダーゼまたは他のタンパク質のレベルを、植物または植物の一部において増加させる工程を包含する、方法。
- 根の成長を刺激するか、または側根もしくは不定根の形成を増強するか、または根の横地重力屈性を変更するための方法であって、該方法は、以下:
(a)配列番号27、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号25、配列番号26、配列番号28〜31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに示されるDNA配列またはこれらの相補体を含む、核酸;
(b)配列番号27、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号25、配列番号26、配列番号28〜31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに示されるRNA配列またはこれらの相補体を含む、核酸;
(c)配列番号27、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号25、配列番号26、配列番号28〜31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに特異的にハイブリダイズする核酸、またはこれらの相補体;
(d)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号32もしくは配列番号35のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、またはその相補体;
(e)(a)〜(d)のいずれかにおいて規定される核酸であって、該核酸は、DNA、ゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたはRNAであるという点で特徴付けられ、該RNAにおいて、TはUで置換されている、核酸;
(f)遺伝子コードの結果として、配列番号27、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号25、配列番号26、配列番号28〜31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに示される核酸に対して縮重しているか、または(a)〜(e)のいずれかにおいて規定される核酸に対して縮重している、核酸;
(g)種間のコドン用法の差異に起因して、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列番号35のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸に由来する核酸、または(a)〜(e)のいずれかにおいて規定される核酸に由来する核酸;
(h)対立遺伝子間の差異に起因して分岐している、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列番号35のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸、または(a)〜(e)のいずれかにおいて規定される核酸;
(i)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12もしくは配列番号35のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸;
(j)サイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、(a)〜(i)のいずれかにおいて規定される核酸の機能的フラグメント;ならびに
(k)植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸、または植物もしくは植物の一部における活性なサイトカイニンレベルを低減するタンパク質をコードする核酸の、好ましくは根における発現を構成する核酸、
からなる群より選択される、植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸の発現を包含する、方法。 - 単離された核酸であって、以下:
(a)配列番号29、配列番号3、配列番号5、配列番号9、配列番号26、配列番号27、配列番号31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに示されるDNA配列を含む、核酸、またはこれらの相補体;
(b)配列番号29、配列番号3、配列番号5、配列番号9、配列番号26、配列番号27、配列番号31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに示されるRNA配列を含む、核酸、またはこれらの相補体;
(c)配列番号29、配列番号3、配列番号5、配列番号9、配列番号26、配列番号27、配列番号31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに示される核酸に特異的にハイブリダイズする核酸、またはこれらの相補体;
(d)配列番号32に示されるポリペプチドを含み、そして配列番号4に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも70%類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、核酸;
(e)配列番号6に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも47%類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、核酸;
(f)配列番号10もしくは配列番号35に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも47%類似するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、核酸;
(g)配列番号4、配列番号6、配列番号10、配列番号32もしくは配列番号35のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする、核酸;
(h)遺伝子コードの結果として、配列番号29、配列番号3、配列番号5、配列番号9、配列番号26、配列番号27、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに示される核酸配列に対して縮重しているか、または(a)〜(g)のいずれかにおいて規定される核酸に対して縮重している、核酸;
(i)生物間のコドン用法の差異に起因して、配列番号4、配列番号6、配列番号10もしくは配列番号35のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸とは異なるか、または(a)〜(g)のいずれかにおいて規定される核酸とは異なる、核酸;
(j)対立遺伝子間の差異に起因して分岐している、配列番号4、配列番号6、配列番号10もしくは配列番号35のいずれかに示されるタンパク質をコードする核酸、または(a)〜(g)のいずれかにおいて規定される核酸;
(k)配列番号29、配列番号3、配列番号5、配列番号9、配列番号26、配列番号27、配列番号31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに示される核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの免疫学的に活性なフラグメントをコードするか、または(a)〜(j)のいずれかにおいて規定される核酸の免疫学的に活性なフラグメントをコードする核酸、
(l)配列番号29、配列番号3、配列番号5、配列番号9、配列番号26、配列番号27、配列番号31、配列番号33もしくは配列番号34のいずれかに示される核酸によってコードされるサイトカイニンオキシダーゼの機能的フラグメントをコードするか、または(a)〜(j)のいずれかにおいて規定される核酸の機能的フラグメントをコードする核酸であって、該フラグメントは、サイトカイニンオキシダーゼの生物学的活性を有する、核酸;ならびに
(m)配列番号4、配列番号6、配列番号10もしくは配列番号35に規定されるタンパク質をコードする核酸であって、但し、該核酸は、以下のGenbank登録番号:AC005917、AB024035およびAC023754のいずれかのもとで登録された核酸ではない、核酸、
からなる群より選択される、サイトカイニンオキシダーゼ活性を有する植物タンパク質をコードする、核酸。 - DNA、cDNA、ゲノムDNAまたは合成DNAもしくは合成RNAであって、該RNAにおいて、TはUで置換されている、請求項3に記載の単離された核酸。
- 請求項3または4に記載の核酸と特異的にハイブリダイズする、少なくとも15ヌクレオチド長の核酸分子。
- 請求項3または4に記載の核酸を特異的に増幅する、少なくとも15ヌクレオチド長の核酸分子。
- 請求項3または4に記載の核酸を含む、ベクター。
- 発現ベクターである、請求項7に記載のベクターであって、前記核酸は、原核生物宿主細胞における該核酸の発現を可能にする1つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、ベクター。
- 発現ベクターである、請求項7に記載のベクターであって、前記核酸は、真核生物宿主細胞における該核酸の発現を可能にする1つ以上の制御配列に作動可能に連結されている、ベクター。
- 請求項3または4に記載の核酸を含む、宿主細胞。
- 請求項7に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項8に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項9に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項10に記載の宿主細胞。
- 細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項11に記載の宿主細胞。
- 細菌細胞である、請求項12に記載の宿主細胞。
- 昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項13に記載の宿主細胞。
- 請求項3もしくは4に記載の核酸によってコードされる単離されたポリペプチド、またはそのホモログもしくは誘導体、またはその免疫学的に活性なフラグメントもしくは機能的フラグメント。
- 配列番号4、配列番号6、配列番号10もしくは配列番号35のいずれかに示されるアミノ酸配列、またはそのホモログもしくは誘導体、またはその免疫学的に活性なフラグメントもしくは機能的フラグメントを含む、請求項18に記載のポリペプチド。
- サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、請求項11に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程、および該培養物から生成されたポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
- サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、請求項12に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程、および該培養物から生成されたポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
- サイトカイニンオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法であって、該方法は、請求項13に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程、および該培養物から生成されたポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
- 請求項18に記載のポリペプチドまたはその特異的エピトープを特異的に認識する、抗体。
- 請求項19に記載のポリペプチドまたはその特異的エピトープを特異的に認識する、抗体。
- トランスジェニックの植物、植物細胞または植物組織の生成のための方法であって、発現可能な形式またはベクター中の請求項3または4に記載の核酸の、該植物、植物細胞または植物組織への導入を包含する、方法。
- 変更された植物、植物細胞または植物組織の生成のための方法であって、該植物の細胞、組織または器官への、請求項18に記載のポリペプチドの直接的導入を包含する、方法。
- 変更された植物、植物細胞または植物組織の生成のための方法であって、該植物の細胞、組織または器官への、請求項19に記載のポリペプチドの直接的導入を包含する、方法。
- 請求項18に記載のポリペプチドの発現をもたらす方法であって、該方法は、1つ以上の制御配列に作動可能に連結された、該ポリペプチドをコードする核酸、または1つ以上の制御配列に作動可能に連結された、該ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターの、植物細胞のゲノムへの安定な導入を包含する、方法。
- 請求項19に記載のポリペプチドの発現をもたらす方法であって、該方法は、1つ以上の制御配列に作動可能に連結された、該ポリペプチドをコードする核酸、または1つ以上の制御配列に作動可能に連結された、該ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターの、植物細胞のゲノムへの安定な導入を包含する、方法。
- 前記植物細胞から植物を再生する工程をさらに包含する、請求項25に記載の方法。
- 前記植物細胞から植物を再生する工程をさらに包含する、請求項28に記載の方法。
- 前記植物細胞から植物を再生する工程をさらに包含する、請求項29に記載の方法。
- 請求項3または4に記載の核酸を含むトランスジェニック植物細胞であって、該核酸は、植物細胞またはトランスジェニック植物細胞における該核酸の転写および/または発現を可能にする調節エレメントに、作動可能に連結されている、トランスジェニック植物細胞。
- 請求項33に記載のトランスジェニック植物細胞であって、前記核酸は、該植物細胞のゲノムに安定に組み込まれている、トランスジェニック植物細胞。
- 請求項33に記載の植物細胞を含む、トランスジェニックの植物、植物の一部または植物組織。
- 請求項34に記載の植物細胞を含む、トランスジェニックの植物、植物の一部または植物組織。
- 請求項35に記載の植物の、収穫可能な部分。
- 請求項36に記載の植物の、収穫可能な部分。
- 種子、葉、果実、幹培養物、根茎、根、塊茎および球茎からなる群より選択される、請求項37に記載の植物の収穫可能な部分。
- 種子、葉、果実、幹培養物、根茎、根、塊茎および球茎からなる群より選択される、請求項38に記載の植物の収穫可能な部分。
- 請求項35に記載の植物または植物の一部由来の子孫。
- 請求項36に記載の植物または植物の一部由来の子孫。
- 根の成長を刺激するための方法であって、該方法は、請求項3もしくは4に記載の核酸の発現を包含するか、または植物もしくは植物の一部において活性なサイトカイニンのレベルを低減する別のタンパク質の発現を包含する、方法。
- 側根または不定根の形成を増強するための方法であって、該方法は、請求項3もしくは4に記載の核酸の発現を包含するか、または植物もしくは植物の一部において活性なサイトカイニンのレベルを低減する別のタンパク質の発現を包含する、方法。
- 根の横地重力屈性を変更するための方法であって、該方法は、請求項3もしくは4に記載の核酸の発現の変更を包含するか、または植物もしくは植物の一部において活性なサイトカイニンのレベルを低減する別のタンパク質の発現を包含する、方法。
- 収穫量の増加をもたらす、請求項43に記載の方法。
- 収穫量の増加をもたらす、請求項44に記載の方法。
- 収穫量の増加をもたらす、請求項45に記載の方法。
- 前記核酸の発現が、強力な構成的プロモーターの制御下で生じる、請求項43に記載の方法。
- 前記核酸の発現が、強力な構成的プロモーターの制御下で生じる、請求項44に記載の方法。
- 前記核酸の発現が、強力な構成的プロモーターの制御下で生じる、請求項45に記載の方法。
- 前記核酸の発現が、根において優先的に発現されるプロモーターの制御下で生じる、請求項43に記載の方法。
- 前記核酸の発現が、根において優先的に発現されるプロモーターの制御下で生じる、請求項44に記載の方法。
- 前記核酸の発現が、根において優先的に発現されるプロモーターの制御下で生じる、請求項45に記載の方法。
- 請求項18に記載のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および獲得するための方法であって、請求項18に記載のポリペプチドが使用されるスクリーニングアッセイを包含する、方法。
- 請求項19に記載のポリペプチドと相互作用するタンパク質を同定および獲得するための方法であって、請求項19に記載のポリペプチドが使用されるスクリーニングアッセイを包含する、方法。
- ツーハイブリッドスクリーニングアッセイを包含する、請求項55に記載の方法であって、ここで、請求項18に記載のポリペプチドはベイトとして、そしてcDNAライブラリーはプレイとして使用される、方法。
- ツーハイブリッドスクリーニングアッセイを包含する、請求項56に記載の方法であって、ここで、請求項19に記載のポリペプチドはベイトとして、そしてcDNAライブラリーはプレイとして使用される、方法。
- 請求項18に記載のポリペプチドと、該ポリペプチドが使用されるスクリーニングアッセイによって獲得可能な、相互作用するタンパク質パートナーとの間の相互作用を、調節するための方法。
- 請求項19に記載のポリペプチドと、該ポリペプチドが使用されるスクリーニングアッセイによって獲得可能な、相互作用するタンパク質パートナーとの間の相互作用を、調節するための方法。
- 請求項18に記載のポリペプチドと相互作用する化合物を同定および獲得するための方法であって、該方法は、以下の工程:
a)請求項18に記載のポリペプチドと、請求項55に記載の方法によって獲得可能な、相互作用するタンパク質パートナーとが発現される、ツーハイブリッドシステムを提供する工程、
b)(a)に規定されるように発現されたポリペプチドによって形成される複合体と、該化合物とを相互作用させる工程、ならびに
c)該化合物と該ポリペプチドとの相互作用、または(a)に規定されるように発現されたポリペプチドによって形成される該複合体の測定を実施する工程、
を包含する、方法。 - 請求項19に記載のポリペプチドと相互作用する化合物を同定および獲得する方法であって:
a)ツーハイブリッドシステムを提供する工程であって、ここで、請求項19に記載のポリペプチドおよび請求項56に記載の方法によって獲得可能な相互作用するタンパク質パートナーが発現される、工程、
b)該化合物と、(a)において規定される該発現されたポリペプチドにより形成される複合体とを相互作用させる工程、および
c)該化合物と、該ポリペプチドまたは(a)において規定される該発現されたポリペプチドにより形成される複合体との相互作用の測定を実施する工程、
を包含する、方法。 - 請求項18に記載のポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定する方法であって、
a)請求項18に記載のポリペプチドと、該化合物または化合物の混合物を、複合体の形成を可能にするのに適した条件下で合わせる工程、および
b)複合体の形成を検出する工程であって、ここで、複合体の存在は、該ポリペプチドに特異的に結合する化合物または混合物を同定する、工程、
を包含する、方法。 - 請求項19に記載のポリペプチドに特異的に結合する化合物または化合物の混合物を同定する方法であって、
a)請求項19に記載のポリペプチドと、該化合物または化合物の混合物を、複合体の形成を可能にするのに適した条件下で合わせる工程、および
b)複合体の形成を検出する工程であって、ここで、複合体の存在は、該ポリペプチドに特異的に結合する化合物または混合物を同定する、工程、
を包含する、方法。 - 前記化合物が、前記ポリペプチドの活性を阻害し、そして合理的な化学物質設計のために使用され得る、請求項61に記載の方法。
- 前記化合物が、前記ポリペプチドの活性を阻害し、そして合理的な化学物質設計のために使用され得る、請求項62に記載の方法。
- 前記化合物または化合物の混合物が、前記ポリペプチドの活性を阻害し、そして合理的な化学物質設計のために使用され得る、請求項63に記載の方法。
- 前記化合物または化合物の混合物が、前記ポリペプチドの活性を阻害し、そして合理的な化学物質設計のために使用され得る、請求項64に記載の方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項55に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項56に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項57に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項58に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項59に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項60に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項61に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項62に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項63に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 植物成長調節因子または除草剤組成物の生成方法であって、請求項64に記載の方法の工程、および農業における適用に適した形態で、該工程から得られる前記化合物または植物細胞または組織培養物を処方する工程、を包含する、方法。
- 請求項3または4に記載の核酸分子を含む、診断組成物。
- 請求項7に記載のベクターを含む、診断組成物。
- 請求項8に記載のベクターを含む、診断組成物。
- 請求項18に記載のポリペプチドを含む、診断組成物。
- 請求項19に記載のポリペプチドを含む、診断組成物。
- 請求項23に記載の抗体を含む、診断組成物。
- 請求項24に記載の抗体を含む、診断組成物。
- 根の成長点の大きさを増大する方法であって、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは根において活性なサイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
- 根の大きさを増大する方法であって、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは根において活性なサイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする別の核酸の発現を含む、方法。
- 根の成長点の大きさを増大する方法であって、好ましくは苗条における、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現のダウンレギュレーションを含む、方法。
- 葉の老化を遅らせる方法であって、好ましくは、葉の老化における、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現のダウンレギュレーションを含む、方法。
- 葉の老化を変化させる方法であって、葉の老化における、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含む、方法。
- 葉の厚みを増大する方法であって、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部において活性なサイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
- 道管の大きさを減少させる方法であって、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部において活性なサイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
- 道管の大きさを増大する方法であって、植物または植物の一部における、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現のダウンレギュレーションを含む、方法。
- 単為結実を誘導する方法であって、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部において、好ましくは胎座、胚珠、およびそれら由来の組織において活性なサイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
- 実生の直立性を改善する方法であって、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含むか、または実生、好ましくは実生の根において活性なサイトカイニンのレベルを減少させるタンパク質をコードする核酸の発現を含む、方法。
- 植物または植物の一部における、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含む、枝分かれを増大する方法。
- 植物または植物の一部、好ましくは幹または腋芽における、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含む、倒伏耐性を改善する方法。
- 植物サイトカイニンオキシダーゼを過剰発現するトランスジェニック台木を含む、トランスジェニック植物。
- 接ぎ穂をさらに含む、請求項98に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項98または99に記載の植物の収穫可能な一部分。
- 根の成長および発達を刺激する方法であって、トランスジェニックの植物細胞または組織培養物における植物サイトカイニンオキシダーゼをコードする核酸の発現を含む、方法。
- 前記核酸が、請求項3に記載の核酸または請求項2に規定される核酸のうちの少なくとも1つである、請求項61に記載の方法。
- 種子の大きさまたは重量を増大する方法であって、植物におけるサイトカイニンオキシダーゼのレベルまたは活性を増大する工程、または植物または植物の一部、好ましくは種子における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質のレベルまたは活性を増大する工程を包含する、方法。
- 胚の大きさまたは重量を増大する方法であって、植物におけるサイトカイニンオキシダーゼのレベルまたは活性を増大する工程、または植物または植物の一部、好ましくは胚における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質のレベルまたは活性を増大する工程を包含する、方法。
- 子葉の大きさを増大する方法であって、植物におけるサイトカイニンオキシダーゼのレベルまたは活性を増大する工程、または植物または植物の一部、好ましくは子葉における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質のレベルまたは活性を増大する工程を包含する、方法。
- 種子の大きさまたは重量を増大する方法であって、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは種子における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質をコードする核酸の発現を包含する、方法。
- 胚の大きさまたは重量を増大する方法であって、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは胚における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質をコードする核酸の発現を包含する、方法。
- 子葉の大きさを増大する方法であって、請求項3もしくは4に記載の核酸または請求項2において規定される核酸の発現を含むか、または植物または植物の一部、好ましくは子葉における活性サイトカイニンのレベルを減少するタンパク質をコードする核酸の発現を包含する、方法。
- 前記核酸が、種子において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、請求項106に記載の方法。
- 前記核酸が、胚において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、請求項107に記載の方法。
- 前記核酸が、子葉において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、請求項108に記載の方法。
- 前記プロモーターがさらに、内乳またはアリューロンに対して特異的である、請求項109に記載の方法。
- 前記方法が、収穫量の増加を導く、請求項106に記載の方法。
- 前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、請求項106に記載の方法。
- 前記方法が、収穫量の増加を導く、請求項107に記載の方法。
- 前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、請求項107に記載の方法。
- 前記方法が、収穫量の増加を導く、請求項108に記載の方法。
- 前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、請求項108に記載の方法。
- 実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、請求項114に記載の方法。
- 実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、請求項116に記載の方法。
- 実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、請求項118に記載の方法。
- 植物において種子の大きさまたは重量を増大する方法であって、配列番号1、5、25、もしくは27のいずれかに示される核酸または該核酸のオルソログの発現を含み、該オルソログが、該植物の種に特異的である、方法。
- 植物において胚の大きさまたは重量を増大する方法であって、配列番号1、5、25、もしくは27のいずれかに示される核酸または該核酸のオルソログの発現を含み、該オルソログが、該植物の種に特異的である、方法。
- 植物において子葉の大きさを増大する方法であって、配列番号1、5、25、もしくは27のいずれかに示される核酸または該核酸のオルソログの発現を含み、該オルソログが、該植物の種に特異的である、方法。
- 前記核酸が、種子において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、請求項122に記載の方法。
- 前記核酸が、胚において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、請求項123に記載の方法。
- 前記核酸が、子葉において優先的に発現を制御するプロモーターの制御下にある、請求項124に記載の方法。
- 前記プロモーターがさらに、内乳またはアリューロンに対して特異的である、請求項125に記載の方法。
- 前記方法が、収穫量の増加を導く、請求項122に記載の方法。
- 前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、請求項122に記載の方法。
- 前記方法が、収穫量の増加を導く、請求項123に記載の方法。
- 前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、請求項123に記載の方法。
- 前記方法が、収穫量の増加を導く、請求項124に記載の方法。
- 前記方法が、実生の成長の増大または早期強勢の増大を導く、請求項124に記載の方法。
- 実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、請求項130に記載の方法。
- 実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、請求項132に記載の方法。
- 実生の成長の増大または早期強勢の増大が、増大したストレス耐性に関連する、請求項134に記載の方法。
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