BRPI0214830B1 - método para modificação de planta, morfologicamente, bioquimicamente e fisicamente - Google Patents

Abstract

"método para modificação de planta, morfologicamente, bioquimicamente e fisicamente". a presente invenção se refere a métodos para estimulação do crescimento da raiz e/ou intensificação da formação de raízes laterais ou adventícias e/ou modificação do geotropismo da raiz compreendendo expressão de uma oxidase de citoquinina vegetal ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de planta. também proporcionados pela presente invenção são métodos para aumento do tamanho e/ou peso da semente, tamanho e/ou peso do embrião e tamanho e/ou peso do cotilédone. os métodos compreendem expressão de uma oxidase de citoquinina vegetal ou expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de planta. a invenção também se refere a novas proteínas de oxidase de citoquinina vegetal, seqüências de ácido nucléico que codificam proteínas de oxidase de citoquinina, bem como vetores, células hospedeiras, células transgênicas e plantas compreendendo as referidas seqüências. a invenção também se refere ao uso das referidas seqüências para melhora de características relacionadas à raiz, incluindo aumento do rendimento e/ou intensificação do vigor precoce e/ou modificação da proporção de raiz/broto e/ou melhora da resistência à derrubada por tempestades com vento ou chuva forte e/ou aumento da tolerância à estiagem e/ou promoção da propagação in vitro de explantes e/ou modificação da morte celular e/ou desenvolvimento da planta e/ou morfologia da planta e/ou bioquímica da planta e/ou fisiologia da planta. a invenção também se refere ao uso das referidas sequências nos métodos acima mencionados. a invenção também se refere a métodos para a identificação e obtenção de proteínas e compostos que interagem com proteínas de oxidase de citoquinina. a invenção também se refere ao uso dos referidos compostos como um regulador do desenvolvimento de uma planta ou herbicida.

Description

MÉTODO PARA MODIFICAÇÃO DE PLANTA, MORFOLOGICAMENTE, BIOQUIMICAMENTE E FISICAMENTE

Campo da Invenção A presente invenção se refere, de modo geral, a métodos para modificação das propriedades ou características morfológicas, bioquímicas e fisiológicas de uma planta, tais como um ou mais processos de desenvolvimento e/ou processos adaptativos ambientais incluindo, mas não limitado, à modificação do início ou estimulação ou intensificação do crescimento da raiz e/ou formação de raiz adventícia e/ou dominância apical e/ou ramificações e/ou momento de senescência e/ou tempo para floração e/ou formação de flores e/ou desenvolvimento de sementes e/ou rendimento das sementes. Métodos para aumento do tamanho e/ou peso da semente, aumento do tamanho e/ou peso do embrião e/ou aumento do tamanho e/ou peso do cotilédone também são proporcionados. Os métodos compreendem expressão de uma proteína de controle da degradação de citoquinina, em particular oxidase de citoquinina, na planta, operavelmente sob o controle de uma seqüência promotora regulável, tal como uma seqüência promotora célula-específica, protomora tecido-específica ou promotora órgão-específica. De preferência, as características modificadas pela presente invenção são características citoquinina-mediadas e/ou auxina-mediadas. A presente invenção abrange estruturas genéticas as quais são úteis para concretizar o método da invenção e plantas transgênicas produzidas por meio das mesmas tendo propriedades morfológicas e/ou bioquímicas e/ou fisiológicas alteradas, comparado às suas respectivas contra-partes isogênicas.

Antecedentes da Invenção As raízes são um órgão importante das plantas superiores. Suas principais funções são fixação da planta no solo e captação de água e nutrientes (N-nutrição, minerais, etc.) . Assim, o desenvolvimento da raiz tem uma influência direta ou indireta sobre o desenvolvimento e rendimento de órgãos aéreos, particularmente sob condições de limitação de nutrientes. As raízes também são relevantes para a produção de produtos secundários da planta, tais como compostos de defesa e hormônios vegetais.

As raízes também armazenam órgãos em uma série de safras classificadas importantes. Açúcar de beterraba é a planta mais importante para a produção de açúcar na Europa (260 Mil t/ano; 38 % da produção mundial). Mandioca (cassava), inhames e batata doce (batata) são produtores de amido importantes (aproximadamente 150 Mil t/ano cada um) . Seu teor de amido pode ser duas vezes tão alto quanto aquele da batata. As raízes também são o órgão relevante para consumo em uma série de vegetais (por exemplo, cenouras, rabanete), ervas (por exemplo, gengibre, curcuma) e plantas medicinais (por exemplo, ginseng). Além disso, alguns dos produtos secundários das plantas são de importância econômica para a indústria química e farmacêutica. Um exemplo é inhames, os quais contêm moléculas básicas para a síntese de hormônios esteroidais. Outro exemplo é Shikonin, a qual é produzida pelas raízes da Lithospermum erythrorhizon em culturas de raízes pilosas. A Shikonin é usada por sua atividade anti-inflamatória, propriedades anti-tumor e de cicatrização de feridas .

Além disso, o desenvolvimento aperfeiçoado da raiz de plantas de safra também intensifica a competitividade com ervas daninhas e melhora o desenvolvimento em áreas áridas por meio de aumento da acessibilidade e captação de água. 0 desenvolvimento aperfeiçoado da raiz também é relevante para fins ecológicos, tais como bio-remediação e prevenção/interrupção de erosão do solo. A arquitetura da raiz está em uma área que permanece grandemente inexplorada pela reprodução clássica, em virtude das dificuldades de se avaliar essa peculiaridade no campo. Assim, a biotecnologia podería ter um impacto significativo sobre o aperfeiçoamento dessa característica devido ao fato de que ela não conta com seleções em grande escala no campo. Ainda, as abordagens da biotecnologia requerem uma compreensão básica dos componentes moleculares que determinam uma característica específica da planta. Atualmente, esse conhecimento é apenas fragmentário e, como uma conseqüência, a biotecnologia tem sido, até o momento, incapaz de conseguir uma brecha nessa área.

Um regulador do desenvolvimento da raiz bem estabelecido é a auxina. A aplicação de ácido indola-3-acético (IAA) a plantas em desenvolvimento estimula o desenvolvimento da raiz lateral e alongamento da raiz lateral (Torrey, Am J Bot 37: 257-264, 1950; Blakely e colaboradores, Bot Gaz 143: 341-352, 1982; Muday e Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994). Raízes expostas a uma faixa de concentrações de IAA iniciaram números crescentes de raízes laterais (Kerk e colaboradores, Plant Physiol, 122: 925-932, 2000). Além disso, quando raízes que tinham produzido partes laterais em resposta a uma concentração de auxina exógena em particular foram subseqüentemente expostas a uma concentração maior de IAA, numerosas raízes laterais supernumerárias espaçadas entre aquelas existentes foram formadas (Kerk e colaboradores, Plant Physiol, 122: 925-932, 2000). Inversamente, o desenvolvimento de raízes sobre agar contendo inibidores do transporte de auxina, incluindo NPA, diminui o número de raízes laterais (Muday e Haworth, Plant Physiol Biochem 32: 193-203, 1994).

Mutantes de Arabidopsis contendo níveis aumentados de IAA endógeno foram isolados (Boerjan e colaboradores, Plant Cell 7: 1405-141, 1995,- Celenza e colaboradores, Gene Dev 9: 2131-2142, 1995; King e colaboradores, Plant Cell 7: 2023-2037, 1995; Lehman e colaboradores, Cell 85: 183-194, 1996). Se sabe agora que eles são alelos de um local único localizado sobre o cromossoma 2. Essas mudas mutantes têm raízes adventícias e laterais em excesso, o que está de acordo com os efeitos acima mencionados de aplicação de auxina externa. 0 efeito estimulatório das auxinas sobre a formação de raízes adventícias e laterais sugere que a superprodução de auxinas em plantas transgênicas é uma estratégia válida para aumento do desenvolvimento da raiz. Ainda, também é questionável se isso proporcionaria um produto comercial com características aperfeiçoadas. A despeito de seu efeito estimulatório sobre a formação de raízes adventícias e laterais, a superprodução de auxina dispara outros efeitos, tais como redução no número de folhas, morfologia anormal da folha (folhas estreitas, crespas), inflorescências abortadas, dominância apical aumentada, formação de raiz adventícia sobre o caule, a maioria dos quais são indesejáveis do ponto de vista agronômico (Klee e colaboradores, Genes Devei 1: 86-96, 1987; Kares e colaboradores, Plant Mol Biol 15: 225-236, 1990). Portanto, o principal problema com abordagens que contam com a síntese aumentada de auxina é um problema de contenção, isto é, limitação dos efeitos da auxina à raiz. Esse problema de contenção, provavelmente, não é superado através do uso de promotores tecido-específicos: as auxinas são transportadas na planta e sua ação, conseqüentemente, não está limitada à biomassa da raiz. Para plantas desenvolvidas em agar, foi observado que o aumento das concentrações estimulou progressivamente a formação de raiz lateral mas, concorrentemente, inibiu o desenvolvimento extra dessas raízes (Kerk e colaboradores, Plant Physiol, 122: 925-932, 2000) .

As sementes são a unidade de reprodução das plantas superiores. As sementes das plantas contêm compostos de reserva que asseguram a nutrição do embrião após germinação. Esses órgãos de armazenamento contribuem significativamente para a nutrição humana, bem como alimentação de gado. As sementes consistem de três partes principais, isto é, o embrião, o endosperma e o envoltório da semente. Compostos de reserva são depositados no órgão de armazenamento o qual é o endosperma (forma resultante de fertilização dupla, por exemplo, em todos os cereais), o assim denominado perisperma (derivado do tecido do germe) ou os cotilédones (por exemplo, variedades de vagens). Compostos de armazenamento são lipídios (óleo de semente de colza), proteínas (por exemplo, na aleurona de cereais) ou carboidratos (amido, oligossacarídeos, tal como rafinose). O amido é o composto de armazenamento nas sementes de cereais. As espécies mais importantes são milho (produção anual de aproximadamente 570 mil t; de acordo com FAO 1995) , arroz (540 mil t por ano) e trigo (530 mil t por ano) . Sementes ricas em proteína são diferentes tipos de vagens (Phaseolus spec., Vicia faba, Vigna spec.; aproximadamente 20 mil t por ano), ervilha (Pisum sativum; 14 mil t por ano) e soja (Glycine max; 136 mil t por ano) . Sementes de soja são também uma fonte importante de lipídios. Sementes ricas em lipídios são também aquelas das diferentes espécies Brassica (aproximadamente 30 mil t por ano), algodão, gergelim oriental, linho, papoula, semente de mamona, girassol, amendoim, coco, palma e algumas outras plantas de menor importância econômica.

Após fertilização, a semente em desenvolvimento se torna um órgão "sink" que atrai compostos nutricionais de órgãos-fonte da planta e usa os mesmos para produzir os compostos de reserva no órgão de armazenamento. Aumentos no tamanho e peso da semente são desejáveis para muitas espécies de safras diferentes. Além de reservas aumentadas de amido, proteína e lipídio e, conseqüentemente, nutrição intensificada quando de ingestão, os aumentos no tamanho e/ou peso da semente e tamanho e/ou peso do cotilédone estão correlacionados a um desenvolvimento mais rápido quando de germinação (vigor precoce) e tolerância intensificada ao estresse. As citoquininas são um fator importante na determinação da resistência ao "sink", o conceito comum prevendo que as citoquininas são um regulador positivo da resistência ao "sink".

Numerosos relatos determinam uma função estimulatória ou inibitória para as citoquininas em diferentes processos de crescimento, tais como crescimento da raiz e ramificação, controle de dominância apical no broto, desenvolvimento de cloroplasto e senescência da folha (Mok M.C. (1994) em Cytokines: Chemistry, Activity and Function, Mok, D.W.S. & Mok, M.C. editores (CRC Boca Raton, Fl) , páginas 155-166). Conclusões a respeito das funções biológicas das citoquininas têm sido derivadas principalmente de estudos sobre as conseqüências da aplicação de citoquinina exógena ou níveis de citoquinina endogenamente controlados (Klee, H.J. & Lanehon, M.B. (1995) em Plant Hormones: Physiology, Biochemisry and Molecular Biology, Davies, P.J. editor (Kluwer, Dordrdrocht, Países Baixos), páginas 340-353, Smulling, T., Rupp, H.M. Frank, M. & Schafer, S. (1999) em Advances in Regulation of Plant Growth and Development, Surnad, M. Pac P. & Beck, E. editores (Peres, Praga), páginas 85-96) . Até o momento, não tem sido possível se dirigir à questão inversa: quais são as conseqüências para o crescimento e desenvolvimento da planta se a concentração de citoquinina endógena é aumentada? Espera-se que plantas com um teor reduzido de citoquinina proporcionem informação mais precisa a respeito dos processos que as citoquininas limitam e, portanto, possam regular. Diferentes de outros hormônios vegetais, tais como ácido abscísico, giberelinas e etileno, nenhum mutante biossintético de citoquinina foi isolado (Hooykens, P.J.J., Hall, M.A. & Libbeuga, K.R. editores (1999) Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones (Elsevier, Amsterdã). A enzima catabólica oxidase de citoquinina (CKX) exerce um papel principal no controle dos níveis de citoquinina em tecidos vegetais. A atividade da CKX foi descoberta em um grande número de plantas superiores e em diferentes tecidos vegetais. A enzima é uma oxidoredutase contendo-FAD que catalisa a degradação de citoquininas portando cadeias laterais de isoprenóide insaturadas. As bases livres iP e Z e seus respectivos ribosídeos são os substratos preferidos. Os produtos da reação do catabolismo de iP são adenina e o aldeído insaturado 3-metil-2-butanol (Armstrong, D.J. (1994) em Cytokinins: Chemistry, Activity and Functions, editores Mok. D.W.S & Mok, M.C. (CRC Boca Raton, FL) , páginas 13 9-154) . Recentemente, um gene da oxidase de citoquinina de Zea mays foi isolado (Morris, R.O., Bilyeu, K.D., Laskey, J.G. & Cherich, N.N. (1999) Biochem. Biophys.Res. Commun. 255, 328-333, Houba-Heria, N.,Pethe, C. d'Alayer, J. & Lelouc, M. (1999) Plant J. 17:615-626) . A manipulação da expressão do gene da CKX poderia superar parcialmente a falta de mutantes biossintéticos de citoquinina e pode ser usada como uma ferramenta poderosa para estudar a relevância de citoquininas do tipo IP e Z durante o ciclo de vida todo de plantas superiores. A presente invenção supera os problemas relacionados à contenção dos efeitos da auxina, manutenção do supercrescimento da raiz e promoção de tamanho e/ou peso aumentado da semente, embrião e cotilédone através de redução da concentração de citoquinina endógena.

Sumário da Invenção A presente invenção proporciona proteínas de oxidase de citoquinina vegetal, seqüências de ácido nucleico que codificara tais proteínas e vetores, células hospedeiras e células vegetais transgênicas, plantas e partes de planta compreendendo as proteínas, seqüências de ácido nucleico e vetores. Por exemplo, a presente invenção se refere a uma estrutura genética compreendendo um gene que codifica uma proteína com atividade de oxidase de citoquinina de Arabidopsis thaliana. Esse gene pode ser expresso sob o controle de um promotor regulável. Esse promotor pode ser regulado por fatores endógenos tecido-específicos ou ambiente-específicos ou, alternativamente, ele pode ser induzido através de aplicação de compostos químicos específicos. A presente invenção também se refere a um método para modificar a arquitetura e biomassa da raiz através de expressão de um gene da oxidase de citoquinina ou expressão de um ácido nucleico que codifica uma proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de uma planta. De preferência, a expressão está sob o controle de um promotor que é específico à raiz ou a determinados tecidos ou tipos de células da raiz.

Adicionalmente, a presente invenção se refere a métodos de aumento do tamanho e/ou peso da semente, tamanho e/ou peso do embrião e tamanho e/ou peso do cotilédone. Os métodos envolvem expressão de um gene da oxidase de citoquinina ou expressão de um ácido nucleico que codifica uma proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de uma planta. De preferência, a expressão está sob o controle de um promotor que direciona a expressão, de preferência, na semente, embrião ou cotilédone.

Breve Descrição dos Desenhos Figura 1. Representação Esauemática dos Genes da Qxidase de Citoauinina Vegetal São mostradas as estruturas de diferentes genes da oxidase de citoquinina isolados de milho (ZmCKXl, número de adesão AF044603, Biochem. Biophys. Res. Com. 255:328-333, 1999) e Arabidopsis (AtCKXl a AtCKX4) . Os éxons são denominados por 'E' e representados pelos retângulos sombreados. Os íntrons são representados pelas retângulos brancos. Ainda indicados são os tamanhos dos genes (em kb, acima de cada estrutura), os números de adesão do gene (sob os nomes) em uma barra de tamanho representando 0,5 kb. Figura 2. Alinhamento de Seaüências de Aminoácidos da Oxidase de Citoauinina Vegetal As seqüências de aminoácidos de oxidases de citoquinina de milho (ZmCKXl) e Arabidopsis (AtCKXl a AtCKX4) são alinhadas. Resíduos de aminoácidos idênticos são marcados por um retângulo preto, resíduos de aminoácidos similares estão em um retângulo cinza. Grupos de similaridade de aminoácidos: (Μ,I,L,V), (F,W,Y), (G,A), (S,T), (R,K,Η), (E,D), (N,Q).

Figura 3. Análise por Northern Blot de Plantas de Tabaco e Arabidopsis expressando AtCKXl (A) Análise por Northern blot de plantas de tabaco expressando constitutivamente (raias 1-8) comparado ao tabaco SNN do tipo silvestre (raia 9) (B) Comparação da expressão do gene tetraciclina-induzido em folhas após 12 horas de indução com um clone expressando constitutivamente. Raias 2-9, folhas de quatro clones AtCKXl-W38TetR diferentes ( + , com ou sem tratamento com tetraciclina), raia 1, expressando constitutivamente o clone 35S:: AtCKXl. (C) Análise por Northern blot de plantas Arabidopsis expressando constitutivamente o gene AtCKXl. Raias 2-4, três clones 35S: .-AtCKXl diferentes expressando constitutivamente comparado à planta Arabidopsis do tipo silvestre (raia 1).

Figura 4: Características de Crescimento de Plantas Arabidopsis Transgênicas 35S::AtCKXl. (A) Duas mudas do tipo silvestre (esquerda) comparado a duas mudas expressando 35S::AtCKXl (direita). Observe a formação aumentada de raízes adventícias e ramificação aumentada de raízes nas mudas transgênicas. As fotografias foram tiradas 14 dias após germinação. As plantas foram cultivadas in vitro sobre meio MS em discos de Petri em uma posição vertical. (B) Semelhante a A, mas raízes coradas com azul de toluidina. (C) Vista superior de um disco de Petri com mudas transgênicas 35S::AtCKXl três semanas após germinação. (D) Plantas transgênicas 35S::AtCKXl desenvolvidas em cultura líquida. Raízes de mudas do tipo silvestre cresceram deficientemente sob essas condições (não mostrado). (E) Transf ormantes (TO) que expressam o gene 35S: -.AtCKXl (três plantas â direita), uma planta do tipo silvestre é mostrada à esquerda. (F) Fenótipo de plantas TI desenvolvidas no solo.

Planta do tipo silvestre (esquerda) comparado a duas plantas transgênicas 35S::AtCKXl Figura 5: Fenótioo de Plantas Arabidopsis Superexpressando AtCKX2 Geração TI de plantas Arabidopsis expressando 35S: :AtCKX2 (duas plantas à direita) comparado ao tipo silvestre (planta à esquerda).

Figura 6. Análise por Northern Blot de Plantas de Tabaco e ArabidoOsis Expressando AtCKX2 (A) Analise por Northern blot de plantas de tabaco expressando constitutivamente (raias 1-7) comparado ao tabaco SNN do tipo silvestre (raia 8). (B) Analise por Northern blot de plantas Arabidopsis expressando constitutivamente o gene AtCKX2. Raias 2-8, sete clones expressando constitutivamente 35S::AtCKX2 comparado à planta Arabidopsis do tipo silvestre (raia 1). Figura 7. Fenótioo da Muda de Plantas de Tabaco Expressando AtCKXl e AtCKX2 (A) Vista superior de plantas de seis semanas de idade. (B) Plantas de tabaco no estágio de floração. (C) Cinética de alongamento do caule. As setas marcam o início da floração. A idade das plantas (dias após germinação) e o número de folhas nesse estágio são indicados acima das setas. As barras indicam SD; η = 12. (D) Número de folhas (n = 12) formadas entre o dia 68 e o dia 100 após germinação e área final de superfície dessas folhas (100% do tipo silvestre é 3646 ± 144 cm2; n = 3) . (E) Comparação do tamanho e senescência da folha. As folhas eram dos nódulos números 4, 9, 12, 16 e 20 a partir de cima (da esquerda para direita).

Figura 8. Fenótioo da Raiz de Plantas de Tabaco Transaênicas Expressando AtCKX (A) Mudas 17 dias após germinação. (B) Sistema de raízes de plantas cultivadas no solo no estágio de floração. (C) Comprimento da raiz, número de raízes laterais (LR) e raízes adventícias (AR) no dia 10 após germinação. (D) Curva de dose-resposta da inibição do crescimento da raiz pela citoquinina exógena. As barras indicam ±SD; n = 30.

Figura 9: Crescimento de Meristemas de Brotos Axilares em Plantas de Tabaco Expressando 35S::AtCKXl.

Figura 10: Histologia de Meristemas de Brotos. Folhas e Meristemas de Raízes de Plantas de Tabaco Sunerexpressando AtCKX1 Versus Tabaco do Tipo Silvestre (TS). (A) Seção mediana longitudinal através do meristema apical do broto vegetativo. P, folhas primordiais. (B) Tecido vascular em vasos de segunda grandeza das folhas. X, xilema, PH, um feixe de floema. (C) Seções transversais de folhas totalmente desenvolvidas. (D) Microscopia por exploração de elétrons da epiderme superior da folha. (E) Ápices de raízes coradas com DAPI. RM, meristema da raiz. (F) Seções medianas longitudinais de meristemas de raiz dez dias após germinação. RC, cápsula da raiz; PM, pró-meristema. (G) Seções da raiz transversal 10 mm a partir do ápice. E, epiderme, C1-C4, camada de células corticais, X, xilema, PH, floema. As barras são de 100 μτα.

Figura 11: Análise por Northern Blot de Plantas de Tabaco Expressando AtCKX3 e AtCKX4 (A) Análise por Northern blot de plantas de tabaco expressando constitutivamente AtCKX3. As designações das raias indicam os números das plantas transgênicas individuais, TS é tabaco SNN do tipo silvestre. A mancha superior foi submetida à sonda com uma sonda AtCKX3 específica, a mancha inferior com uma sonda específica para o rRNA de 25S e serve como um controle para a carga de RNA. (B) Análise por Northern blot de plantas de tabaco expressando constitutivamente AtCKX4. As designações das raias indicam os números das plantas transgênicas individuais, TS é tabaco SNN do tipo silvestre. A mancha superior foi submetida à sonda com uma sonda AtCKXé específica, a mancha inferior com uma sonda específica para o rRNA de 25S e serve como um controle para a carga de RNA. Figura 12: Enxertos Recíprocos de Plantas Transgênicas de Tabaco AtCKX2 e Plantas do Tipo Silvestre (A) Duas plantas à esquerda: Controle (enxerto TS enxertado sobre um estoque de raízes TS) . Duas plantas à direita: enxertos TS enxertados sobre um estoque de raízes transgênicas AtCKX2-38. (B) Esquerda: Controle (enxerto TS enxertado sobre um estoque de raízes TS). Direita: Enxerto de planta AtCKX2-38 enxertada sobre estoque de raízes TS. (C) Ampliação da área da raiz. Esquerda: Controle (enxerto TS enxertado sobre um estoque de raízes TS) .

Direita: enxerto TS enxertado sobre um estoque de raízes transgênicas AtCKX2-38. (D) Formação de raízes adventícias. Esquerda: Controle (enxerto TS enxertado sobre um estoque de raízes TS) . Direita: enxerto TS enxertado sobre um estoque de raízes transgênicas AtCKX2-38.

Figura 13: Fenótipo de Sementes. Embriões e Mudas de ArabidoOsis (A) Sementes de uma linhagem transgênica AtCKXl e sementes do tipo silvestre. Tamanho da barra de 1 mm. (B) Sementes de linhagens transgênicas AtCKXl, AtCKX2, AtCKX3 e AtCKXé e sementes do tipo silvestre. Tamanho da barra de 1 mm. (C) embriões maduros de Arabidopsis transgênica AtCKXl e de uma planta do tipo silvestre. Tamanho da barra de 200 μνα. Os embriões foram obtidos a partir de sementes maduras que tinham sido embebidas durante 12 horas em 20% de EtOH, liberadas do envoltório da semente, limpas com cloridrato e fotografadas usando-se lentes de Nomarski. (D) Mudas do tipo silvestre (acima) e de Arabidopsis expressando AtCKXl 4 dias apos germinação. (E) Aproximação de D.

Figura 14: Peso da semente do tipo silvestre e dois clones independentes para cada um dos quatro genes de AtCKX investigados. Peso médio obtido através de análise de cinco lotes diferentes de 200 sementes para cada clone.

Descrição Detalhada da Invenção Para superar os problemas acima mencionados associados à biossíntese aumentada de auxina, decidiu-se seguir uma abordagem alternativa. Nós concluímos que a sub-regulação de antagonistas biológicos da auxina podería induzir a efeitos similares ou mesmo superiores sobre o crescimento da raiz quando comparado a níveis aumentados de auxina. As ações e interações hormonais são extremamente complexas, mas nós teorizamos que as citoquininas poderíam funcionar como antagonistas da auxina no que se refere ao crescimento da raiz. Estudos com hormônios em culturas teciduais vegetais mostraram que a proporção de auxina versus citoquinina é mais importante para a organogênese do que os níveis absolutos de cada um desses hormônios, o que, na verdade, indica que esses hormônios funcionam como antagonistas - pelo menos em determinados processos biológicos. Além disso, a formação de raízes laterais é inibida através de aplicação exógena de citoquininas. De modo interessante, também o alongamento da raiz é negativamente afetado pelo tratamento com citoquinina, o que sugere que as citoquininas controlam a ramificação das raízes e o crescimento das raízes.

Juntos, os dados da literatura atual indicam que o aumento dos níveis de citoquinina afeta negativamente o crescimento da raiz, mas os mecanismos subjacentes a esse processo não são compreendidos. Os locais de síntese de citoquinina na planta são as pontas das raízes e tecidos jovens do broto. As concentrações endógenas de citoquininas estão na faixa de nM. Contudo, uma vez que sua quantificação é difícil, ao contrário, é necessário que grandes quantidades de tecido sejam extraídas e as concentrações locais reais não são conhecidas. Também, a compartimentalização subcelular de citoquininas não é conhecida. Acredita-se, de modo geral, que a base livre e os ribosídeos estão localizados no citoplasma e núcleo, enquanto que os glicosídeos estão localizados no vacúolo. Existem também diferentes citoquininas com estrutura química ligeiramente diferente. Como uma conseqüência, não se sabe se os efeitos das citoquininas exógenas levariam a um aumento na concentração total de citoquinina ou, ao contrário, à competição de outras formas de citoquininas portadas por plantas (as quais diferem quanto ã sua estrutura, localização celular ou subcelular) com receptores, translocadores, transportadores ou enzimas de modificação.

De forma a testar a hipótese de que os níveis de citoquinina na raiz, na verdade, excedem o nível ótimo para o crescimento da raiz, novos genes que codificam oxidases de citoquinina (as quais são enzimas que metabolizam a citoquinina) foram clonados de Arabidopsis thaliana (designados AtCKX) e foram subseqüentemente expressos sob um promotor constitutivo forte em tabaco e Arabidopsis transgênicos. Os transformantes mostrando expressão de mRNA de AtCKX e atividade de oxidase de citoquinina aumentada também manifestaram formação e crescimento intensificados de raízes. Efeitos negativos sobre o crescimento dos brotos também foram observados. Os últimos estão de acordo com a expressão constitutiva do gene da oxidase de citoquinina nessas plantas, ilustrando a importância da expressão limitada do gene da oxidase de citoquinina no que se refere às propriedades gerais de crescimento da planta. A contenção da atividade da oxidase de citoquinina pode ser obtida usando-se promotores célula-, tecido- ou órgão-específicos, uma vez que a degradação de citoquinina é um processo limitado a tecidos ou células que expressam a proteína CKX, isso em contraste a abordagens contando apenas com a síntese de hormônios, conforme explicado acima.

Os efeitos negativos da expressão de citoquinina observados sobre o crescimento do broto demonstram que as oxidases de citoquinina são alvos interessantes para o projeto de ou seleção de compostos químicos que promovem o crescimento. Tais compostos químicos inibiríam a atividade da oxidase de citoquinina, de preferência não seriam transportados para a raiz e seriam rapidamente degradados no solo, de modo que a aplicação desses compostos químicos não inibiría o crescimento da raiz. As citoquininas também retardam a senescência da folha, o que significa que efeitos positivos incluirão crescimento e manutenção de tecidos fotossintéticos. Além disso, a observação de que as citoquininas retardam a senescência, intensificam o esverdeamento (teor de clorofila) de folhas e reduzem a dominância apical mostra que estratégias baseadas na supressão da atividade da CKX (tal como a tecnologia anti-senso, ribozima e co-supressão) nas partes aéreas da planta poderíam resultar em senescência retardada, esverdeamento intensificado da folha e ramificação aumentada.

Similarmente, os efeitos positivos observados da expressão de oxidase de citoquinina sobre o crescimento da raiz demonstram que as oxidases de citoquinina são alvos interessantes para o projeto de ou seleção de herbicidas. Tais herbicidas inibiríam a atividade da oxidase de citoquinina, de preferência não seriam transportados para a raiz e seriam solúveis e relativamente estáveis em um solvente que pode ser administrado à raiz através do solo.

Esses efeitos da superexpressão da oxidase de citoquinina sobre o desenvolvimento e arquitetura da planta eram, até o momento, desconhecidos e, como uma conseqüência, a presente invenção e suas modalidades não poderíam ser consideradas.

Os efeitos negativos observados sobre o crescimento dos brotos demonstram que a manipulação de oxidases de citoquinina também pode ser usada para a obtenção de fenótipos de nanismo. Fenótipos de nanismo são particularmente úteis em safras comerciais, tais como cereais e árvores frutíferas, por exemplo.

De acordo com a presente invenção, descobriu-se também, surpreendentemente, que plantas transgênicas superexpressando um gene da oxidase de citoquinina desenvolvem sementes (incluindo embriões) e cotilédones de tamanho e/ou peso aumentado. Esses resultados são surpreendentes, uma vez que seria de se esperar que um teor reduzido de citoquinina estivesse associado a um crescimento reduzido de órgãos.

Montagens preferidas da invenção se referem ao efeito positivo da expressão da oxidase de citoquinina sobre o crescimento e arquitetura da planta e em particular sobre o crescimento e arquitetura da raiz, tamanho e peso das sementes, tamanho e peso do embrião e tamanho e peso do cotilédone. A família do gene da oxidase de citoquinina contém pelo menos seis membros em Arabidopsis (veja exemplos abaixo) e os presentes inventores mostraram que existem diferenças quantitativas nos efeitos obtidos com alguns desses genes em plantas transgênicas. É previsto que homólogos funcionais das oxidases de citoquinina de Arabidopsis descritas possam ser isolados de outros orgânicos, dada a evidência quanto à presença de atividade de oxidase de citoquinina em muitas plantas verdes (Hare e van Staden, Physiol Plant 91:128-136, 1994; Jones e Schreiber, Plant Growth Reg 23:123-134, 1997), bem como em outros organismos (Armstrong, em Cytokinins: Chemistry, Activity and Function. Mok and Mok Editores, CRC Press, páginas 139-154, 1994). Portanto, a seqüência da oxidase de citoquinina, funcional na invenção, não precisa ser idêntica àquela descrita aqui. A presente invenção é particularmente útil para safras de cereais e safras de monocotiledôneas em geral e genes da oxidase de citoquinina, por exemplo, de trigo ou milho, podem ser usados também (Morris e colaboradores, 1999; Rinaldi e Comandini, 1999). Considera-se que outros genes com atividade de oxidase de citoquinina ou com qualquer outra atividade de metabolização de citoquinina (veja Zazímalová e colaboradores, Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, Hooykaas, Hall e Libbenga (Editores), Elsevier Science, páginas 141-160, 1997) também podem ser usados para fins da presente invenção. Similarmente, genes que codificam proteínas que aumentariam a atividade de metabolização de citoquinina endógena também podem ser usados para fins da presente invenção. Em princípio, fenótipos similares também poderíam ser obtidos através de interferência com genes que funcionam a jusante da citoquinina, tais como receptores ou proteínas envolvidas nas vias de transdução de sinal da citoquinina.

Para fins da presente invenção, deve ser compreendido que o termo 'crescimento da raiz' abrange todos os aspectos do crescimento de diferentes partes que compõem o sistema de raízes em diferentes estágios de seu desenvolvimento, em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Deve ser compreendido que o crescimento intensificado da raiz pode resultar de crescimento intensificado de uma ou mais de suas partes, incluindo a raiz primária, raízes laterais, raízes adventícias, etc., todas as quais caem dentro do escopo da presente invenção.

Para fins da presente invenção, também deve ser compreendido que aumentos no peso da semente ou tamanho da semente podem incluir aumentos no tamanho de um ou mais dos embriões, do endosperma, aleurona e envoltório da semente. Além disso, aumentos no tamanho e/ou peso do embrião podem incluir aumentos em diferentes órgãos associados ao mesmo tais como, por exemplo, cotilédones, hipocótilo e raízes.

De acordo com uma primeira modalidade, a presente invenção se refere a um método para estimulação do crescimento da raiz e/ou intensificação da formação de raízes laterais e/ou adventícias e/ou alteração o geotropismo da raiz compreendendo expressão de uma oxidase de citoquinina de planta ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de uma planta.

Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um método para aumento do tamanho e/ou peso das sementes de uma planta, através de aumento do nível ou atividade de uma oxidase de citoquinina na planta ou através de expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta. De preferência, o nível ou atividade aumentada de uma oxidase de citoquinina ou expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta está localizada na semente, incluindo diferentes tecidos ou tipos de células da semente.

Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um método para aumento do tamanho e/ou peso do embrião da planta, através de aumento do nível ou atividade de uma oxidase de citoquinina na planta ou através de expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta. De preferência, o nível ou atividade aumentada de uma oxidase de citoquinina ou expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta está localizada na semente. Ainda mais preferivelmente, o nível ou atividade aumentada de uma oxidase de citoquinina ou expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta está localizada no embrião.

Em ainda outra modalidade, a presente invenção se refere a um método para aumento do tamanho e/ou peso do cotilédone da planta, através de aumento do nível ou atividade de uma oxidase de citoquinina na planta ou através de expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta. De preferência, o nível ou atividade aumentada de uma oxidase de citoquinina ou expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta está localizada no cotilédone.

No contexto da presente invenção, deve ser compreendido que os termos "expressão" e/ou "superexpressão" são usados permutávelmente e ambos se referem a uma "expressão intensificada e/ou ectópica" de uma oxidase de citoquinina vegetal ou qualquer outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas. Será evidente que, aqui, deve ser entendido uma expressão intensificada da oxidase de citoquinina da planta bem como, "de novo", a expressão de oxidases de citoquinina vegetal ou das referidas outras proteínas. Alternativamente, a referida outra proteína intensifica a atividade de metabolização de citoquinina de uma oxidase de citoquinina vegetal.

Deve ser ainda compreendido que, no contexto da presente invenção, a expressão "raízes laterais e/ou adventícias" pode significar "raízes laterais e adventícias", mas também "raízes laterais ou adventícias". A intensificação pode existir na formação de raízes laterais ou na formação de raízes adventícias, bem como na formação de ambos os tipos de raízes não primárias, mas não necessariamente.

Além disso, conforme usado aqui, "aumento do tamanho e/ou peso da semente" pode significar aumento do tamanho e peso da semente, mas também tamanho ou peso. Assim, a intensificação pode existir em um aumento no tamanho da semente ou no peso da semente ou ambos. Interpretações similares deverão ser aplicadas a "aumento do tamanho e/ou peso do embrião" e "aumento do tamanho e/ou peso do cotilédone".

Os termos "planta" e "partes de uma planta" são usados permutavelmente com os termos "plantas" e "partes de plantas".

De acordo com uma outra modalidade, a presente invenção se refere a um método para estimulação do crescimento da raiz e/ou intensificação da formação de raízes laterais ou adventícias e/ou alteração do geotropismo da raiz e/ou aumento do rendimento e/ou intensificação do vigor precoce e/ou modificação da proporção de raiz/broto e/ou melhora da resistência à derrubada por tempestades com vento ou chuva forte e/ou aumento da tolerância à estiagem e/ou promoção da propagação in vitro de explantes, compreendendo expressão de uma oxidase de citoquinina vegetal ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de uma planta.

De acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um método para estimulação do crescimento da raiz resultando em um aumento da massa da raiz através de superexpressão de uma oxidase de citoquinina, de preferência uma oxidase de citoquinina de acordo com a invenção ou outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de uma planta, de preferência em raízes. A maior produção da biomassa de raiz devido à superexpressão de seqüências que promovem o crescimento tem um efeito direto sobre o rendimento e um efeito indireto sobre a produção de compostos produzidos por células da raiz ou células de raízes transgênicas ou culturas de células das referidas células de raízes transgênicas. Um exemplo de um composto interessante produzido em culturas de raiz é Shikonin, o rendimento do qual pode ser vantajosamente intensificado por meio dos referidos métodos.

De acordo com uma modalidade mais especifica, a presente invenção se refere a métodos para estimulação do crescimento da raiz ou para intensificação da formação de raízes laterais e/ou adventícias ou para alteração do geotropismo da raiz ou para aumento do tamanho e/ou peso da semente ou para aumento do tamanho e/ou peso do embrião ou para aumento do tamanho e/ou peso do cotilédone. Os métodos compreendem expressão de um ácido nucleico que codifica uma oxidase de citoquinina vegetal selecionado do grupo consistindo de: (a) ácidos nucleicos compreendendo uma seqüência de DNA conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 ou 34 ou o complemento das mesmas, (b) ácidos nucleicos compreendendo as seqüências de RNA correspondendo a qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 ou 34 ou o complemento das mesmas, (c) ácidos nucleicos que se hibridizam especificamente a qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 ou 34 ou ao complemento das mesmas, (d) ácidos nucleicos que codificam uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 32 ou 35 ou o complemento das mesmas, (e) ácidos nucleicos conforme definido em qualquer um de (a) a (d) caracterizados pelo fato de o referido ácido nucleico ser DNA, DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou RNA, em que T é substituída por U, (f) ácidos nucleicos os quais são degenerados em um ácido nucleico conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 27, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 25, 26, 28 a 31, 33 ou 34 ou os quais são degenerados em um ácido nucleico conforme definido em qualquer um de (a) a (e) como um resultado do código genético, (g) ácidos nucleicos os quais divergem de um ácido nucleico que codifica uma proteína conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 35 ou os quais divergem de um ácido nucleico conforme definido em qualquer um de (a) a (e) , devido a diferenças no uso de códon entre os organismos, (h) ácidos nucleicos que codificam uma proteína conforme fornecido em ID DE SEQ NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 35 ou ácidos nucleicos conforme definido em (a) a (e) os quais divergem devido a diferenças entre os alelos, (i) ácidos nucleicos que codificam uma proteína conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 35, (j) fragmentos funcionais de ácidos nucleicos conforme definido em qualquer um de (a) a (i) tendo a atividade biológica de uma oxidase de citoquinina e (k) ácidos nucleicos que codificam uma oxidase de citoquinina vegetal, ou compreendem expressão, de preferência em raízes ou em sementes (incluindo partes da semente, tais como embrião, endosperma, envoltório da semente ou aleurona), ou em cotilédones, de um ácido nucleico que codifica uma proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de uma planta.

Na presente invenção, os ácidos nucleicos que codificam as novas oxidases de citoquinina de Arabidopsis thaliana foram isolados e, em princípio, os presentes inventores mostraram que, surpreendentemente, a expressão de oxidases de citoquinina em plantas transgênicas ou partes de uma planta transgênica resultou nas características relacionadas à raiz e à semente acima mencionadas. De forma que as características raiz-relacionadas fossem concretizadas, a expressão da(s) oxidase(s) de citoquinina deveria ocorrer em raízes, de preferência sob o controle de um promotor raiz-específico. De forma que as características semente-relacionadas fossem concretizadas, a expressão da(s) oxidase(s) de citoquinina ocorrería em sementes, de preferência sob o controle de um promotor semente-específico. Um exemplo de tal promotor raiz-específico é proporcionado em ID DE SEQ NO: 36. Exemplos de promotores semente-específicos incluem, mas não estão limitados, àqueles listados na Tabela 4.

De forma que as características cotilédone-relacionadas fossem concretizadas, a expressão da(s) oxidase(s) de citoquinina ocorrería em cotilédones, de preferência sob o controle de um promotor o qual se expressa, de preferência, em cotilédones.

Será evidente que, embora a invenção seja sustentada na seção exemplos por vários novos genes e proteínas de AtCKX, o conceito da invenção também se refere ao uso de outras oxidases de citoquinina isoladas de e expressas em outras plantas, de preferência nas raízes e/ou sementes e/ou cotilédones das referidas outras plantas, a fim de se obter efeitos similares em plantas, conforme descrito na seção exemplos.

Portanto, a presente invenção se refere, mais geralmente, ao uso de um ácido nucleico que codifica uma oxidase de citoquinina vegetal ou codifica uma proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de uma planta para estimulação do crescimento da raiz ou para intensificação da formação de raízes laterais ou adventícias ou para alteração do geotropismo da raiz. A presente invenção também se refere ao uso de um ácido nucleico que codifica uma oxidase de citoquinina vegetal ou codifica uma proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de uma planta para aumento do tamanho e/ou peso da semente ou para aumento do tamanho e/ou peso do embrião ou para aumento do tamanho e/ou peso do cotilédone da planta. Oxidases de citoquinina de uso preferido são codificadas pelos ácidos nucleicos que codificam as oxidases de citoquinina conforme definido acima e são codificadas pelos novos ácidos nucleicos da invenção, conforme definido aqui. A invenção se refere a um ácido nucleico que codifica uma nova proteína vegetal tendo atividade de oxidase de citoquinina selecionado do grupo consistindo de: (a) um ácido nucleico compreendendo uma seqüência de DNA conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 ou 34 ou o complemento das mesmas, (b) um ácido nucleico compreendendo as seqüências de RNA correspondendo a qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 ou 34 ou o complemento das mesmas, (c) um ácido nucleico que se hibridiza especificamente a um ácido nucleico conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 ou 34 ou ao complemento das mesmas, (d) um ácido nucleico que codifica uma proteína com uma seqüência de aminoácidos compreendendo o polipeptídeo conforme fornecido em ID DE SEQ NO: 32 e o qual é pelo menos 70% similar, de preferência pelo menos 75%, 80% ou 85%, mais preferivelmente pelo menos 90% ou 95%, ainda mais preferivelmente pelo menos 99% similar à seqüência de aminoácidos conforme fornecido em ID DE SEQ NO: 4, (e) um ácido nucleico que codifica uma proteína com uma seqüência de aminoácidos a qual é pelo menos 3 5% similar, de preferência 37%, 40%, 45%, 47% ou 50%, similar, mais preferivelmente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 80% similar, ainda mais preferivelmente 85%, 90% ou 95% similar à seqüência de aminoácidos conforme fornecido em ID DE SEQ NO: 6, (f) um ácido nucleico que codifica uma proteína com uma seqüência de aminoácidos a qual é pelo menos 35% similar, de preferência 37%, 40%, 45%, 47% ou 50%, similar, mais preferivelmente 55%, 60%, 65%, 70%, 75% ou 80% similar, ainda mais preferivelmente 85%, 90% ou 95% similar à seqüência de aminoácidos conforme fornecido em ID DE SEQ NO: 10 OU 35, (g) um ácido nucleico que codifica uma proteína compreendendo a seqüência de aminoácidos conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 4, 6, 10, 32 ou 35, (h) um ácido nucleico o qual é degenerado em um ácido nucleico conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 33 ou 34 ou o qual é degenerado em um ácido nucleico conforme definido em qualquer um de (a) a (g) como um resultado do código genético, (i) um ácido nucleico o qual é divergente de um ácido nucleico que codifica uma proteína conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 4, 6, 10 ou 35 ou o qual é divergente de um ácido nucleico conforme definido em qualquer um de (a) a (g) devido a diferenças no uso de códon entre os organismos, (j) um ácido nucleico que codifica uma proteína conforme fornecido em ID DE SEQ NOs: 4, 6, 10 ou 3 5 ou um ácido nucleico conforme definido em (a) a (g) o qual é divergente devido a diferenças entre os alelos, (k) um ácido nucleico que codifica um fragmento imunologicamente ativo de uma oxidase de citoquinina codificada por um ácido nucleico conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 ou 34 ou um fragmento imunologicamente ativo de um ácido nucleico conforme definido em qualquer um de (a) a (j), (l) um ácido nucleico que codifica um fragmento funcional de um oxidase de citoquinina codificada por um ácido nucleico conforme fornecido em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 29, 3, 5, 9, 26, 27, 31, 33 ou 34 ou um fragmento funcional de um ácido nucleico conforme definido em qualquer um de (a) a (j), em que o referido fragmento tem a atividade biológica de uma oxidase de citoquinina e (m) um ácido nucleico que codifica uma proteína conforme definido em ID DE SEQ NOs: 4, 6, 10 ou 35, contanto que o referido ácido nucleico não seja o ácido nucleico conforme depositado sob qualquer um dos seguintes números de adesão ao Genbank: AC005917, AB024035, e AC023754. A invenção também se refere a um ácido nucleico isolado da invenção o qual é DNA, cDNA, DNA genômico ou DNA sintético ou RNA, em que T é substituída por U. A invenção também se refere a uma molécula de ácido nucleico de pelo menos 15 nucleotídeos de extensão que se hibridiza especificamente ou amplifica especificamente um ácido nucleico da invenção.

Diferentes formas de citoquinina podem exercer diferentes papéis nos vários processos de desenvolvimento. Assim, diferentes efeitos da CKX1, CKX2 , CKX3 e CKX4 podem se relacionar a efeitos distintos sobre os reservatórios de diferentes citoquininas. Por exemplo, a CKX1 e a CKX3 promovem, principalmente, o alongamento da raiz e ramificação, enquanto que a CKX2 e a CKX4 estimulam primariamente a formação de raízes adventícias. Além disso, a CKX1 e a CKX3 aumentam o tamanho e peso da semente em um grau maior do que a CKX2 e a CKX4. Sem estar preso a um modo de ação em particular, esse efeito diferencial sobre reservatórios de citoquinina pode resultar de algumas diferenças na especificidade de substrato ou da compartimentalização diferencial de oxidases de citoquinina na célula (prevista como sendo mitocondrial para a CKX1 e a CKX3, enquanto que extracelular para a CKX2, a CKX4, a CKX5 e a CKX6).

De acordo com outra modalidade, a invenção também se refere a um vetor compreendendo um ácido nucleico da invenção. Em uma modalidade preferida, o referido vetor é um vetor de expressão em que o ácido nucleico está operavelmente ligado a uma ou mais seqüências de controle que permitem a expressão da referida seqüência em células hospedeiras procariotas e/ou eucariotas.

Deve ser compreendido que para expressão dos genes da oxidase de citoquinina da invenção em monocotiledôneas, uma seqüência de ácido nucleico correspondendo à seqüência de cDNA deverá ser usada para evitar união errônea de íntrons em monocotiledôneas. Seqüências de cDNA preferidas para expressão em monocotiledôneas têm uma seqüência de ácido nucleico conforme representado em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 25 a 30 e 34. A invenção também se refere a uma célula hospedeira contendo qualquer uma das moléculas de ácido nucleico ou vetores da invenção. A referida célula hospedeira é selecionada do grupo compreendendo células bacterianas, de inseto, fúngicas, vegetais ou de animais.

Outra modalidade da invenção se refere a um polipeptídeo codificável por um ácido nucleico da invenção ou um homólogo ou um derivado do mesmo ou um fragmento imunologicamente ativo ou funcional do mesmo. Polipeptídeos preferidos da invenção compreendem as seqüências de aminoácidos conforme representado em qualquer uma de ID DE SEQ NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 32 e 35 ou um homólogo ou um derivado do mesmo ou um fragmento imunologicamente ativo ou funcional do mesmo. Em uma modalidade mais preferida, a invenção se refere a um polipeptídeo o qual tem uma seqüência de aminoácidos conforme fornecido em ID DE SEQ: NO 2, 4, 6, 8, 10,12 ou 35, 35 ou um homólogo ou um derivado do mesmo ou um fragmento imunologicamente ativo ou funcional do mesmo. Fragmentos funcionais preferidos do mesmo são aqueles fragmentos os quais são desprovidos de seu peptídeo sinal.

De acordo com ainda outra modalidade, a invenção se refere a um método para a produção de um polipeptídeo da invenção compreendendo cultura de uma célula hospedeira da invenção sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo e recuperação do polipeptídeo produzido da cultura. A invenção também se refere a um anticorpo que reconhece especificamente um polipeptídeo da invenção ou um epítopo específico do mesmo. A invenção ainda se refere a um método para a produção de plantas, células de plantas ou tecidos de plantas transgênicas compreendendo a introdução de uma molécula de ácido nucleico da invenção, em um formato expressível ou um vetor da invenção, na referida planta, célula vegetal ou tecido vegetal. A invenção também se refere a um método para a produção de plantas, células vegetais ou tecidos vegetais modificados compreendendo a introdução de um polipeptídeo da invenção diretamente em uma célula, um tecido ou um órgão da referida planta.

De acordo com outra modalidade, a invenção se refere a um método para realizar a expressão de um polipeptídeo da invenção compreendendo a introdução de uma molécula de ácido nucleico da invenção operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de controle ou um vetor da invenção estavelmente no genoma de uma célula vegetal. A invenção ainda se refere ao método conforme descrito acima compreendendo ainda regeneração de uma planta a partir da referida célula vegetal. A invenção também se refere a uma célula de planta transgênica compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da invenção a qual está operavelmente ligada a elementos regulatórios que permitem a transcrição e/ou expressão do referido ácido nucleico em células vegetais ou obteníveis por meio de um método conforme explicado acima.

De acordo com outra modalidade preferida, a invenção se refere a uma célula de planta transgênica, conforme descrito aqui acima, em que o ácido nucleico da invenção é estavelmente integrado no genoma da referida célula vegetal. A invenção ainda se refere a uma planta ou tecido de planta transgênica compreendendo células vegetais, conforme descrito aqui e também a uma parte colhível da referida planta transgênica, de preferência selecionada do grupo consistindo de sementes, folhas, frutos, culturas de caule, raízes, tubérculos, rizomas e bulbos. A invenção também se refere à prole derivada de qualquer uma das referidas plantas ou partes de plantas transgênicas.

De acordo com outra modalidade, a invenção se refere a um método para estimulação do crescimento da raiz compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas.

Em outro aspecto da invenção, é proporcionado um método de aumento do tamanho e/ou peso da semente. 0 método compreende aumento do nível ou atividade de uma oxidase de citoquinina em uma planta ou aumento do nível ou atividade de uma proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta, de preferência sementes. Várias partes (órgãos) da semente também podem ter o tamanho e/ou peso aumentado tais como, por exemplo, embrião, endosperma, envoltório da semente ou aleurona. Por exemplo, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um método de aumento do tamanho e/ou peso do embrião. 0 método compreende aumento do nível ou atividade de uma oxidase de citoquinina em uma planta ou aumento do nível ou atividade de uma proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta, de preferência embriões.

Em ainda outro aspecto da invenção, é proporcionado um método de aumento do tamanho e/ou peso do cotilédone. O método compreende aumento do nível ou atividade de uma oxidase de citoquinina em uma planta ou aumento do nível ou atividade de uma proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em uma planta ou partes de uma planta, de preferência cotilédones.

De acordo com os métodos de aumento do tamanho e/ou peso, há um aumento resultante na velocidade de crescimento de mudas ou um aumento no vigor precoce. Aumentos no rendimento também são obtidos. Similarmente, de acordo com os métodos de aumento do tamanho e/ou peso do embrião e/ou do tamanho e/ou peso do cotilédone, há um aumento resultante na velocidade de crescimento de mudas ou um aumento no vigor precoce. Em muitos casos, aumentos no rendimento também são obtidos. Aumentos no crescimento de mudas ou no vigor precoce estão, muitas vezes, associados a aumentos na tolerância ao estresse. Por exemplo, o desenvolvimento mais rápido de mudas, incluindo os sistemas de raízes de mudas quando de germinação, é crítico para a sobrevivência, particularmente sob condições adversas, tal como estiagem.

Qualquer seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de oxidase de citoquinina pode ser usada nos métodos da invenção. Por exemplo, qualquer uma das várias seqüências proporcionadas aqui que codifica um polipeptídeo com atividade de oxidase de citoquinina pode ser usada nos métodos de aumento do tamanho e/ou peso da semente, embrião ou cotilédone.

De preferência, são produzidas plantas transgênicas as quais expressam um ácido nucleico conforme apresentado em qualquer uma ID DE SEQ NOs:l, 5, 25 ou 27 ou um ortólogo do referido ácido nucleico. De preferência, o ortólogo é derivado de uma espécie relacionada de planta transgênica. Ainda mais preferivelmente, o ortólogo é específico (nativo ou endógeno) à espécie da planta transgênica.

Conforme descrito acima, promotores os quais controlam a expressão específica ou preferencialmente podem ser usados nos métodos da invenção. Assim, onde aumentos no tamanho ou peso da semente são desej ados, um promotor semente-específico pode ser usado. Onde aumentos no tamanho ou peso do embrião são desejados, um promotor embrião-específico pode ser usado. Onde aumentos no tamanho ou peso do cotilédone são desejados, um promotor o qual controla a expressão em cotilédones é preferido. Tais promotores são bem conhecidos, estão amplamente disponíveis e são listados aqui, por exemplo, na Tabela 4.

Em outra modalidade, a invenção se refere a um método para aumento do tamanho ou peso da semente, ou ambos, o referido método compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas.

Em ainda outra modalidade, a invenção se refere a um método para aumento do tamanho ou peso do embrião, ou ambos, o referido método compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas.

Em ainda outra modalidade, a invenção se refere a um método para aumento do tamanho do cotilédone compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas. A expressão localizada de um gene da oxidase de citoquinina em questão ou uma parte do mesmo ou de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas leva a crescimento intensificado dos cotilédones. Em espécies tendo cotilédones como órgãos de armazenamento, tal crescimento intensificado dos cotilédones leva a rendimentos intensificados e/ou a um desempenho intensificado de crescimento das mudas. Ainda a esse respeito, carboidratos, lipídios e proteínas são todos armazenados dentro de sementes e são metabolizados durante a germinação de forma a proporcionar energia e metabólitos durante crescimento posterior da planta. O tamanho da semente está, muitas vezes, associado ao vigor precoce, uma vez que sementes maiores contêm mais carboidratos, lipídios e proteínas e, assim confere crescimento mais rápido. Assim, os métodos da presente invenção levam a um crescimento mais rápido das mudas. Tal vigor precoce está associado à tolerância intensificada ao estresse. Por exemplo, o desenvolvimento mais rápido de um sistema de raízes de uma planta é crítico para a sobrevivência, particularmente sob condições adversas, tal como estiagem. 0 vigor precoce também está relacionado ao rendimento intensificado e tempo reduzido para floração.

Uma cultura de tecido ou célula vegetal é uma cultura artificialmente produzida de células vegetais ou tecidos vegetais que é desenvolvida em um meio especial, quer líquido ou sólido, o qual fornece a esses tecidos ou células vegetais todos os requisitos necessários para crescimento e/ou produção de determinados compostos. Culturas de tecido e/ou células vegetais podem ser usadas para a propagação rápida de plantas e para a produção de plantas transgênicas, para mencionar uns poucos exemplos. A formação de raiz pode ser difícil para alguns explantes ou sob algumas condições nas referidas culturas e a expressão de um gene da oxidase da citoquinina no(s) referido(s) tecido(s) ou células vegetais pode ser usada para intensificar a formação de raiz. A cultura de tecido e/ou células vegetais pode também ser usada para a produção industrial de compostos valiosos. Compostos com produção possível são compostos farmacêuticos, pesticidas, pigmentos, cosméticos, perfumes, aditivos alimentícios, etc. Um exemplo de tal produto é Shikonin, a qual é produzida pelas raízes da planta Lithospermum erythrorhizon. Um exemplo de uma cultura de tecido vegetal é uma cultura de raizes pilosas, a qual é uma massa artificialmente produzida de raízes pilosas. Raízes de L. erythrorhizon são difíceis de coletar em grande número e, através do preparo de culturas de raízes pilosas, o produto final Shikonin podería ser industrialmente preparado em uma taxa mais rápida do que ocorrería normalmente. Conforme divulgado aqui, a expressão de oxidases de citoquinina intensifica o crescimento e desenvolvimento da raiz e, portanto, pode ser usada vantajosamente nos referidos procedimentos de cultura de tecido e células vegetais. Portanto, de acordo com outra modalidade da presente invenção, é proporcionado um método para estimulação do crescimento e desenvolvimento da raiz compreendendo expressão de um ácido nucleico que codifica uma oxidase de citoquinina vegetal, de preferência uma oxidase de citoquinina da invenção, em uma cultura de tecido ou células de uma planta transgênica compreendendo as referidas células de planta transgênica. A invenção ainda se refere a um método para intensificação da formação de raízes laterais ou adventícias compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas. A invenção também se refere a um método para alteração do geotropismo da raiz compreendendo alteração da expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas. A invenção também se refere a métodos para intensificação do vigor precoce e/ou para modificação da proporção raiz/broto e/ou para melhora da resistência à derrubada por tempestades com vento ou chuva forte e/ou para aumento da tolerância à estiagem e/ou para promoção da propagação in vitro de explantes compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas. A invenção ainda se refere a métodos para aumento do tamanho da raiz ou do tamanho do meristema da raiz compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas.

De acordo com ainda outra modalidade, a invenção se refere a um método para aumento do tamanho do meristema da raiz compreendendo sub-regulação da expressão de um ácido nucleico da invenção, de preferência em mudas.

De acordo com uma modalidade preferida, a invenção se refere a um método para retardo da senescência da folha compreendendo sub-regulação da expressão de qualquer uma das oxidases de citoquinina da invenção em folhas, de preferência em folhas senescentes. Também, a invenção se refere a um método para alteração da senescência da folha compreendendo expressão de uma das oxidases de citoquinina em folhas senescentes. A invenção também se refere a métodos para aumento da espessura da folha compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas, de preferência em folhas. A invenção também se refere a um método para a redução do tamanho de vaso compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas, de preferência em vasos. A invenção ainda se refere a um método para aumento do tamanho de vaso compreendendo sub-regulação da expressão de um ácido nucleico da invenção em plantas ou partes de plantas.

De acordo com outra modalidade, a invenção se refere a um método para melhora da capacidade de sustentação de mudas compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção ou compreendendo expressão de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em mudas.

Além disso, a invenção se refere a qualquer um dos métodos descritos acima, o referido método levando a um aumento no rendimento. A invenção ainda se refere a qualquer um dos métodos da invenção em que a referida expressão do referido ácido nucleico ocorre sob o controle de um promotor constitutivo forte. Com relação àqueles aspectos da invenção tendo efeitos sobre as raízes da planta tais como, por exemplo, métodos para estimulação do crescimento da raiz, intensificação da formação de raízes laterais e adventícias ou para alteração do geotropismo da raiz, de preferência, a expressão de um ácido nucleico em questão ocorre sob o controle de um promotor que é, de preferência, expresso em raízes. Na Tabela 5, uma lista não exaustiva de promotores raiz-específicos está incluída. Um promotor de uso preferido nos métodos da invenção é o promotor homólogo de raiz de clavata, tendo uma seqüência conforme fornecido em ID DE SEQ NO: 36.

Com relação aquele aspecto da invenção tendo efeitos sobre as sementes da planta tais como, por exemplo, métodos para aumento do tamanho ou peso da semente, tamanho ou peso do embrião ou tendo efeitos sobre os cotilédones da planta, tais como métodos para aumento do tamanho ou peso do cotilédone, a expressão de um ácido nucleico em questão ocorre sob o controle de um promotor que é, de preferência, expresso em sementes. Um promotor semente-específico pode ser um o qual é expresso em todos os órgãos da semente ou um o qual mostra uma preferência, quanto à expressão, por um ou mais órgãos ou tecidos, tais como o embrião, endosperma ou aleurona. Exemplos de tais promotores são apresentados aqui na Tabela 4.

De acordo com ainda outra modalidade, a invenção se refere a um método para modificação do tipo da célula e/ou modificação do desenvolvimento da planta e/ou modificação da morfologia da planta e/ou modificação da bioquímica da planta e/ou modificação da fisiologia da planta e/ou modificação da taxa de progressão do ciclo celular compreendendo a modificação da expressão, em células, tecidos ou órgãos de uma planta em particular, de um ácido nucleico da invenção. A invenção também se refere a um método para obtenção de crescimento intensificado e/ou rendimento aumentado e/ou senescência alterada de uma célula, tecido e/ou órgão vegetal e/ou freqüência aumentada de formação de órgãos laterais em uma planta, compreendendo a expressão ectópica de um ácido nucleico da invenção. A invenção também se refere a um método para promoção e ampliação da atividade de divisão celular em células em condições adversas de crescimento e/ou sob estresse, compreendendo a expressão ectópica de uma seqüência de ácido nucleico da invenção.

De acordo com ainda outra modalidade, a invenção se refere a um método para identificação e obtenção de proteínas que interagem com um polipeptídeo da invenção compreendendo um ensaio de seleção em que um polipeptídeo da invenção é usado.

Em uma modalidade mais preferida, a invenção se refere a um método para identificação e obtenção de proteínas que interagem com um polipeptídeo da invenção compreendendo um ensaio de seleção com dois híbridos em que um polipeptídeo da invenção como uma isca e uma biblioteca de cDNA como uma presa, são usados. A invenção ainda se refere a um método para modulação da interação entre um polipeptídeo da invenção e interação de parceiros de proteína obteníveis por meio de um método conforme descrito acima.

Em uma outra modalidade, a invenção se refere a um método para identificação e obtenção de compostos que interagem com um polipeptídeo da invenção compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de um sistema com dois híbridos em que um polipeptídeo da invenção e um parceiro de proteína de interação obtenível por meio de um método conforme fornecido acima, (b) interação do referido composto com o complexo formado pelos polipeptídeos expressos conforme definido em a) , e (c) realização de medição (em tempo real) da interação do referido composto com o referido polipeptídeo ou complexo formado pelos polipeptídeos expressos conforme definido em a). A invenção ainda se refere a um método para identificação de compostos ou misturas de compostos os quais se ligam especificamente a um polipeptídeo da invenção compreendendo: (a) combinação de um polipeptídeo da invenção com o referido composto ou misturas de compostos sob condições adequadas para permitir a formação de complexo e (b) detecção da formação de complexo, em que a presença de um complexo identifica um composto ou mistura a qual se liga especificamente ao referido peptídeo. A invenção também se refere a um método conforme descrito acima em que o referido composto ou mistura inibe a atividade do referido polipeptídeo da invenção e pode ser usada para o projeto racional de produtos químicos.

De acordo com outra modalidade, a invenção se refere ao uso de um composto ou mistura identificada por meio de um método conforme descrito acima como um regulador do crescimento da planta ou herbicida. A invenção também se refere a um método para a produção de um regulador do crescimento da planta ou composição herbicida compreendendo as etapas dos métodos de seleção de composto descritas acima e formulação dos compostos obtidos nas referidas etapas em uma forma adequada para aplicação em agricultura ou cultura de tecido ou célula vegetal. A invenção também se refere a um método para aumento da ramificação compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção em plantas ou partes de plantas, de preferência em caules ou brotos axilares. A invenção também se refere a um método para melhora da resistência à derrubada por tempestades com vento ou chuva forte compreendendo expressão de um ácido nucleico da invenção em plantas ou partes de plantas, de preferência em caules ou brotos axilares. A invenção também se refere a um método para o projeto de ou seleção de compostos químicos que promovem o crescimento ou herbicidas compreendendo o uso de um ácido nucleico da invenção ou um vetor da invenção.

De acordo com outra modalidade, a invenção se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico da invenção, um vetor da invenção ou um polipeptídeo da invenção para aumento do rendimento. A invenção também se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico da invenção, um vetor da invenção ou um polipeptídeo da invenção para estimulação do crescimento da raiz. A invenção também se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico da invenção, um vetor da invenção ou um polipeptídeo da invenção para intensificação da formação de raízes laterais ou adventícias. A invenção também se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico da invenção, um vetor da invenção ou um polipeptídeo da invenção para alterar o geotropismo da raiz. A invenção também se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico da invenção, um vetor da invenção ou um polipeptídeo da invenção para aumento de pelo menos um de tamanho da semente, peso da semente, tamanho do embrião, peso do embrião, tamanho do cotilédone e peso do cotilédone. A invenção ainda se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico da invenção, um vetor da invenção ou um polipeptídeo da invenção para intensificação do vigor precoce e/ou para modificação da proporção de raiz/broto e/ou para melhora da resistência à derrubada por tempestades com vento ou chuva forte e/ou para aumento da tolerância â estiagem e/ou para promoção da propagação de explantes in vitro. A invenção também se refere ao uso de uma molécula de ácido nucleico da invenção, um vetor recombinante da invenção ou um polipeptídeo da invenção para modificação do desenvolvimento da planta e/ou para modificação da morfologia da planta e/ou para modificação da bioquímica da planta e/ou para modificação da fisiologia da planta.

De acordo com ainda outra modalidade, a invenção se refere a uma composição diagnostica compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, um vetor da invenção, um polipeptídeo da invenção ou um anticorpo da invenção.

Uma outra modalidade da presente invenção se refere ao uso de um estoque de raízes transgênicas que tem um crescimento e desenvolvimento intensificados da raiz devido à expressão de uma oxidase de citoquinina em procedimentos de enxertagem com um rebento a fim de produzir uma planta ou árvore com características agrícolas ou horticulturais aperfeiçoadas. O rebento pode ser transgênico ou não transgênico. Características específicas consideradas pela presente modalidade são aquelas conferidas pelos sistemas de raizes e incluem fixação aperfeiçoada da planta/árvore no solo e/ou captação aperfeiçoada de água resultando, por exemplo, em tolerância aperfeiçoada à estiagem e/ou captação aperfeiçoada de nutrientes do solo e/ou transporte aperfeiçoado de substâncias orgânicas através da planta e/ou secreção intensificada de substâncias no solo tais como, por exemplo, fitosiderôforos e/ou respiração aperfeiçoada e/ou resistência aperfeiçoada à doenças e/ou rendimento intensificado. Uma vantagem do uso de estoques de raiz AtCKX transformados para enxertagem, além de seu sistema de raízes intensificado, é a senescência retardada das folhas no enxerto, conforme divulgado aqui (veja Figura 12A). Plantas ou árvores preferidas para essa modalidade em particular incluem plantas ou árvores que não crescem bem sobre suas próprias raízes e são enxertadas em ambientes cultivados tais como variedades comercialmente lucrativas de uvas, cítricos, damasco, amêndoa, ameixa, pêssego, maçã, pêra, cereja, noz, figo, avelã e ameixa-amareia.

Conforme mencionado supra, auxinas e citoquininas atuam como antagonistas em determinados processos biológicos. Por exemplo, a proporção de auxina/citoquinina regula a produção de raizes de brotos com uma elevada concentração de auxina, resultando em raízes organizadas e uma elevada concentração de citoquininas resulta em produção de brotos. Conforme divulgado na presente invenção, a expressão de oxidases de citoquininas em tabaco e Arabidopsis resulta em um desenvolvimento intensificado da raiz consistente com os efeitos intensificados da auxina. As auxinas também estão envolvidas no desenvolvimento de frutos. O tratamento das partes femininas da flor com auxina resulta no desenvolvimento de frutos partenocárpicos em algumas espécies de plantas. 0 desenvolvimento de frutos partenocárpicos foi geneticamente manipulado em várias plantas de safras horticulturais através da biossintese aumentada de auxinas nos órgãos reprodutores femininos (W00105985).

Portanto, de acordo com outra modalidade, a presente invenção se refere a um método para a indução da característica partenocárpica em plantas, o referido método consistindo de sub-regulação da expressão de uma ou mais oxidases de citoquinina ou de outra proteína que reduz o nível de citoquininas ativas em plantas ou partes de plantas, de preferência nos órgãos reprodutores femininos tais como a placenta, óvulos e tecidos derivados dos mesmos. A região promotora DefH9 de Antírrhinum majus ou um de seus homólogos, a qual confere elevada especificidade de expressão em placenta e óvulos, pode ser usada para essa finalidade.

Aqueles habilitados na técnica estarão cientes de que a invenção descrita aqui está sujeita a outras variações e modificações que não aquelas especificamente descritas. Deve ser compreendido que a invenção descrita aqui inclui todas de tais variações e modificações. A invenção também inclui todas de tais etapas, características, composições e compostos mencionados ou indicados na presente especificação, individual ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações de qualquer uma ou mais das referidas etapas ou características. A presente invenção é aplicável a qualquer planta, em particular plantas monocotiledôneas e plantas dicotiledôneas, incluindo um legume para forragem, planta ornamental, safra alimentícia, árvore ou arbusto selecionados da lista compreendendo Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp.,Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Bétula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp.,Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetária, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia sguarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp. , Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altíssima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, índigo incarnata, íris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medi cago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratíssima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormíum cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp.Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brócoli, couve-de-bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, verduras, linho, couve, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba-de-açúcar, cana-de-açúcar, girassol, tomate, abóbora e chá, dentre outros, ou as sementes de qualquer planta especificamente mencionada acima ou uma cultura de tecido, célula ou órgão de qualquer uma das espécies acima.

No decorrer da presente especificação, a menos que o contexto requeira de outro modo, a palavra "compreende" e variações tais como "compreendido" e "compreendendo", deverão ser entendidas como implicando na inclusão de uma totalidade ou etapa ou grupo de totalidades ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outra totalidade ou etapa ou grupo de totalidades ou etapas.

Conforme usado aqui, o termo "derivado de" deverá ser tomado para indicar que uma totalidade ou grupo de totalidades se originou da espécie especificada, mas não necessariamente obtida diretamente da fonte especificada.

Os termos "proteína(s)", "peptídeo(s)" ou "oligopeptídeo(s)", quando usados aqui, se referem a aminoácidos em uma forma polimérica de qualquer extensão. Os referidos termos também incluem modificações de aminoácidos, tais como formação de ligação de dissulfeto, cisteinilação, oxidação, glutationilação, metilação, acetilação, farnesilação, biotinilação, estearoilação, formilação, adição de ácido lipóico, fosforilação, sulfatação, ubiquitinação, miristoilação, palmitoilação, geranilgenarilação, ciclização (por exemplo, formação de ácido piroglutâmico), oxidação, desaminação, desidratação, glicosilação (por exemplo, pentoses, hexosaminas, N-acetilhexosaminas, deóxihexoses, hexoses, ácido siálico, etc.) e acilação, bem como resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, resíduos de L-aminoácidos e resíduos de D-aminoácidos. "Homólogos" de uma proteína da invenção são aqueles peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas os quais contêm substituições, deleções e/ou adições de aminoácidos com relação à referida proteína com a qual eles são um homólogo, sem alteração de uma ou mais de suas propriedades funcionais, em particular sem redução da atividade do resultante. Por exemplo, um homólogo da referida proteína consistirá de uma seqüência de aminoácidos bioativa variante da referida proteína. Para produzir tais homólogos, os aminoácidos presentes na referida proteína podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo propriedades similares, por exemplo, hidrofobicidade, hidrofilicidade, momento hidrofóbico, antigenicidade, propensão para formar ou romper estruturas com α-hélice ou estruturas com β-folha e assim por diante. Uma visão geral das propriedades químicas e físicas de aminoácidos é fornecida na Tabela 1.

Variantes com substituição de uma proteína da invenção são aquelas nas quais pelo menos um resíduo na referida seqüência de aminoácidos da proteína tenha sido removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Substituições de aminoácidos são, tipicamente, de resíduos simples, mas podem ser agrupadas dependendo das restrições funcionais colocadas sob o polipeptideo; inserções usualmente serão da ordem de cerca de 1-10 resíduos de aminoácidos e deleções oscilarão de cerca de 1-20 resíduos. De preferência, as substituições de aminoácido compreenderão substituições conservativas de aminoácidos, tais como aquelas descritas supra.

Tabela 1, Propriedades de Aminoácidos que Ocorrem Naturalmente.

Variantes com inserção na seqüência de aminoácidos de uma proteína da invenção são aquelas nas quais um ou mais resíduos de aminoácidos são introduzidos em um local predeterminado na referida proteína. Inserções podem compreender fusões amino-terminais e/ou carbóxi-terminais, bem como inserções intra-seqüência de aminoácidos simples ou múltiplos. Geralmente, inserções dentro da seqüência de aminoácidos serão menores do que fusões amino ou carboxila terminais, da ordem de cerca de 1 a 10 resíduos. Exemplos de proteínas de fusão ou peptídeos amino- ou carbóxi-terminais incluem o domínio de ligação ou o domínio de ativação de um ativador transcricional conforme usado em um sistema com dois híbridos, proteínas do envoltório de fagos (histidina)6-tag, glutationa S-transferase, proteína A, proteína de ligação à maltose, dihidrofolato redutase, epítopo Tag*100 (ETARFQPGYRS), epítopo c-rayc (EQKLISEEDL), FLAG®-ep£topo (DYKDDDK), lacZ, CMP (peptídeo de ligação à calmodulina), epítopo HA (YPYDVPDYA), epítopo de proteína C (EDQVDPRLIDGK) e epítopo VSV (YTDIEMNRLGK).

Variantes com deleção de uma proteína da invenção são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da seqüência de aminoácidos da referida proteína.

Variantes de aminoácidos de uma proteína da invenção podem ser feitas prontamente usando-se métodos de síntese de peptídeo bem conhecidos na técnica, tais como síntese de peptídeo em fase sólida e semelhantes ou através de manipulações de DNA recombinante. A manipulação de seqüências de DNA para produzir proteínas variantes as quais se manifestam como variantes com substituição, com inserção ou com deleção é bem conhecida na técnica. Por exemplo, métodos para se fazer mutações por substituição em locais predeterminados no DNA tendo seqüência conhecida são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, tais como mutagênese por M13, o kit de mutagênese in vitro T7-Gen (USB, Cleveland, OH), o kit de mutagênese QuickChange Site Directed (Stratagene, San Diego, CA), mutagênese sítio-dirigida PCR-mediada ou outros protocolos de mutagênese sítio-dirigida.

Na presente invenção, "identidade" e/ou "similaridade" percentuais entre seqüências de DNA e/ou proteínas são calculadas usando-se programas computadorizados conhecidos na técnica, tais como os programas DNAstar/MegAlign em combinação com o método Clustal. "Derivados" de uma proteína da invenção são aqueles peptídeos, oligopeptídeos, polipeptídeos, proteínas e enzimas os quais compreendem pelo menos cerca de cinco resíduos de aminoácidos contíguos do referido polipeptideo, mas os quais retêm a atividade biológica da referida proteína. Um "derivado" pode ainda compreender resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente, com alteração por glicosilação, acilação ou que não ocorrem naturalmente adicionais comparado à seqüência de uma forma que ocorre naturalmente do referido polipeptídeo, por exemplo, uma molécula repórter ou outro ligante, covalente ou não covalentemente ligado à seqüência de aminoácidos tal como, por exemplo, uma molécula repórter a qual é ligada ao mesmo a fim de facilitar sua detecção.

Por "imunologicamente ativo" entenda-se que uma molécula ou fragmentos específicos da mesma, tais como epítopos ou haptenos específicos são reconhecidos, por exemplo, isto é, se ligam a anticorpos. Epítopos específicos podem ser determinados usando-se, por exemplo, técnicas de triagem de peptídeo conforme descrito em Geysen e colaboradores (1996) (Geysen, H.M., Rodda, S.J. e Mason, T.J. (1986). A priori delineation of a peptide which mimics a discontinuous antigenic determinant. Mol. Immunol. 23, 709-715). O termo "fragmento de uma seqüência" ou "parte de uma seqüência" significa uma seqüência truncada da seqüência original relacionada a ela. A seqüência truncada (seqüência de proteína ou ácido nucleico) pode variar amplamente quanto à extensão; o tamanho mínimo sendo uma seqüência de tamanho suficiente para proporcionar uma seqüência com pelo menos uma função e/ou atividade comparável à seqüência original relacionada a ela (por exemplo, "fragmento funcional"), enquanto que o tamanho máximo não é crítico. Em algumas aplicações, o tamanho máximo usualmente não é substancialmente maior do que aquele requerido para proporcionar a atividade e/ou função desejada da seqüência original. Tipicamente, a seqüência de aminoácidos truncada oscilará de cerca de 5 a cerca de 60 aminoácidos de extensão. Mais tipicamente, contudo, a seqüência terá um máximo de cerca de 50 aminoácidos de extensão, de preferência um máximo de cerca de 60 aminoácidos. Usualmente é desejável selecionar seqüências de pelo menos cerca de 10, 12 ou 15 aminoácidos, até um máximo de cerca de 20 ou 25 aminoácidos.

Fragmentos funcionais também podem incluir aqueles compreendendo um epítopo o qual é específico para as proteínas de acordo com a invenção. Fragmentos funcionais preferidos têm uma extensão de pelo menos, por exemplo, 5, 10, 25, 100, 150 ou 200 aminoácidos.

Deve ser compreendido que fragmentos funcionais também podem ser fragmentos imunologicamente ativos ou não.

No contexto da presente invenção, são concretizados homólogos, derivados e/ou fragmentos imunologicamente ativos e/ou funcionais das oxidases de citoquinina, conforme definido supra. Homólogos, derivados e/ou fragmentos imunologicamente ativos e/ou funcionais das proteínas de oxidase de citoquinina os quais são considerados para uso na presente invenção são derivados de plantas, mais especificamente de Arabidopsis thaliana, ainda mais especificamente as referidas oxidases de citoquinina são as (At)CKX de Arabidopsis thaliana ou são capazes de serem expressas nas mesmas. A presente invenção considera claramente o uso de homólogos funcionais ou derivados e/ou fragmentos imunologicamente ativos das proteínas de AtCKX e não está limitada, quanto à aplicação, ao uso de uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma das referidas proteínas de AtCKX.

Qualquer um das referidas proteínas, polipeptídeos, peptídeos e fragmentos dos mesmos pode ser produzido em um sistema biológico, por exemplo, uma cultura de células. Alternativamente, qualquer um dos referidos proteínas, polipeptídeos, peptídeos e fragmentos dos mesmos pode ser quimicamente fabricado, por exemplo, através de síntese de peptídeo em fase sólida. As referidas proteínas ou fragmentos da mesma podem ser parte de uma proteína de fusão como é o caso, por exemplo, em um ensaio com dois híbridos o qual possibilita, por exemplo, a identificação de proteínas que interagem com uma oxidase de citoquinina de acordo com a invenção.

As proteínas ou fragmentos das mesmas são úteis, além disso, por exemplo, para modular a interação entre uma oxidase de citoquinina de acordo com a invenção e a interação de parceiros de proteína obtidos por meio de um método da invenção. Peptídeos quimicamente sintetizados são particularmente úteis, por exemplo, como uma fonte de antígenos para a produção de anti-soro e/ou anticorpos. "Anticorpos" incluem anticorpos monoclonais, policlonais, sintéticos ou de cadeia pesada, bem como fragmentos de anticorpos tais como os fragmentos Fab, Fv ou scFv. Anticorpos monoclonais podem ser preparados por meio de técnicas conforme descrito, por exemplo, em Liddle e Cryer (1991) as quais compreendem a fusão de células de mieloraa de camundongo a células de baço derivadas de animais imunizados. Além disso, anticorpos ou fragmentos dos mesmos a uma molécula ou fragmentos da mesma podem ser obtidos através do uso de métodos conforme descrito, por exemplo, em Harlow e Lane (1988) . No caso de anticorpos dirigidos contra peptídeos pequenos, tais como fragmentos de uma proteína da invenção, os referidos peptídeos são, geralmente, acoplados a uma proteína carreadora antes de imunização de animais. Tais proteínas carreadoras incluem hemocianina de cepa de esquistossoma mansoni (KLH), albumina de soro bovino (BSA), ovalbumina e toxina do Tétano. A proteína carreadora intensifica a resposta imune do animal e proporciona epítopos para locais de ligação do receptor de células T. 0 termo "anticorpos", além disso, inclui derivados dos mesmos, tais como anticorpos rotulados. Rótulos de anticorpo incluem fosfatase alcalina, PKH2, PKH26, PKH67, fluoresceína (FITC) , Hoechst 33258, R-ficoeritrina (PE), rodamina (TRITC), Quantum Red, Texas Red, Cy3, biotina, agarose, peroxidase e esferas de ouro. Ferramentas em biologia molecular contando com anticorpos contra uma proteína incluem análise por "blot" em gel, seleção de bibliotecas de expressão que permitem identificação do gene, métodos de quantificação de proteína, incluindo ELISA e RIA, purificação de proteínas por imunoafinidade, imunoprecipitação de proteínas (veja, por exemplo, Exemplo 6) e imunolocalização. Outros usos de anticorpos e especialmente de anticorpos peptídicos incluem o estudo do processamento proteolítico (Loffler e colaboradores, 1994; Woulfe e colaboradores, 1994), determinação de locais proteína-ativos (Lerner, 1982), o estudo de precursores e processamento pós-traducional (Baron e Baltimore, 1982; Lerner e colaboradores, 1981; Semier e colaboradores, 1982), identificação de domínios de proteína envolvidos em interações proteína-proteína (Murakami e colaboradores, 1992) e o estudo do uso de éxon em expressão genética (Tamura e colaboradores, 1991) .

Concretizados na presente invenção são anticorpos que reconhecem especificamente uma oxidase de citoquinina ou homólogo, derivado ou fragmento da mesma conforme definido supra. De preferência, a referida oxidase de citoquinina é uma oxidase de citoquinina vegetal, mais especificamente uma das oxidases de citoquinina de Arabidopsis thaliana (AtCKX).

Os termos "gene(s)", "polinucleotídeo(s)", "ácido(s) nucleico(s)", "seqüência(s) de ácido nucleico", "seqüência (s) de nucleotídeo" ou "molécula (s) de ácido nucleico", quando usados aqui, se referem a nucleotídeos, quer ribonucleotídeos ou deóxirribonucleotídeos ou uma combinação de ambos, em uma forma polimérica de qualquer extensão. Os referidos termos, além disso, incluem DNA e RNA fita simples e fita dupla. Os referidos termos também incluem modificações de nucleotídeo conhecidas, tais como metilação, ciclização e 'caps1 e substituição de um ou mais nucleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo, tal como inosina. Modificações de nucleotídeo incluem a adição de acridina, amina, biotina, azul cascata, colesterol, Cy3°, 0γ5®, Cy5.5® Dabcyl, digoxigenina, dinitrof enila, Edans, 6-FAM, fluoresceína, 31-glicerila, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfato psoraleno, rodamina, ROX, tiol (SH) , espaçadores, TAMRA, TET, AMCA-S®, SE, BODIPY®, Marina Blue®, Pacific Blue*, Oregon Green®, Rhodamine Green*, Rhodamine Red*, Rhodol Green° e Texas Red*. Modificações na parte principal do polinucleotídeo incluem metilfosfonato, RNA de 2'-OMe-metilfosfonato, fosforotiorato, RNA, 2'-0MeRNA. Modificações de base incluem 2-amino-dA, 2-aminopurina, 3'-(ddA), 3'dA(cordicepina), 7-deaza-dA, 8-Br-dA, 8-oxo-dA, N6-Me-dA, sítio abásico (dEspaçador), biotina dT, 2'-OMe-5Me-C, 21-OMe-propinil-C, 31 -(5-Me-dC) , 3'-(ddC) , 5-Br-dC, 5-I-dC, 5-Me-dC, 5-F-dC, carbóxi-dT, dA conversível, dC conversível, dG conversível, dT conversível, dU conversível, 7-deaza-dG, 8-Br-dG, 8-oxo-dG, Os-Me-dG, S6-DNP-dG, 4-metil-indola, 5-nitroindola, 21-OMe-inosina, 2'- dl, 06-fenil-dI, 4-metil-indola, 2'-deóxinebularina, 5- nitroindola, 2-aminopurina, dP (análogo de purina), dK (análogo de pirimidina), 3-nitropirrola, 2-tio-dT, 4-tio- dT, biotina-dT, carbóxi-dT, 04-Me-dT, 04-triazol dT, 2'-OMe-propinil-U, 5-Br-dU, 2'-dU, 5-F-dU, 5-I-dU, 04-triazol dU. Os referidos termos também abrangem ácido nucleicos peptídicos (PNAs) , um análogo de DNA no qual a parte principal é um pseudopeptideo consistindo de unidades de N-(2-aminoetil)-glicina ao invés de açúcar. PNAs imitam o comportamento do DNA e se ligam a fitas de ácido nucleico complementar. A parte principal neutra do PNA resulta em ligação mais forte e maior especificidade do que o normalmente obtido. Além disso, as propriedades físicas, química e biológicas únicas do PNA têm sido exploradas para produzir ferramentas biomoleculares poderosas, agentes anti-senso e antigênicos, sondas moleculares e biossensores. A presente invenção também proporciona, vantajosamente, seqüências de ácido nucleico de pelo menos aproximadamente 15 nucleotídeos contíguos de um ácido nucleico de acordo com a invenção e de preferência de 15 a 50 nucleotídeos. Essas seqüências podem, vantajosamente, ser usadas como sondas para se hibridizar especificamente às seqüências da invenção conforme definido acima ou "primers" para iniciar a amplificação ou replicação específica de seqüências da invenção conforme definido acima ou semelhante. Tais seqüências de ácido nucleico podem ser produzidas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, tais como através de meios recombinantes ou sintéticos. Elas também podem ser usadas em kits diagnósticos ou semelhante para a detecção da presença de um ácido nucleico de acordo com a invenção. Esses testes geralmente compreendem contato da sonda com a amostra sob condições de hibridização e detecção da presença de qualquer duplas ou triplas entre a sonda e qualquer ácido nucleico na amostra.

Vantajosamente, as seqüências de ácido nucleico de acordo com a invenção podem ser produzidas usando-se meios recombinantes ou sintéticos tais como, por exemplo, usando-se mecanismos de clonagem por PCR os quais envolvem, geralmente, fabricação de um par de "primers", os quais podem ser de aproximadamente 15 a 50 nucleotídeos até uma região do gene que se deseja clonar, contato dos "primers" com mRNA, cDNA ou DNA genômico de uma célula, realização de uma reação em cadeia de polimerase sob condições as quais levam à amplificação da região desejada, isolamento da região ou fragmento amplificado e recuperação do DNA amplificado. Geralmente, tais métodos conforme definido aqui são bem conhecidos na técnica, tal como descrito em Sambrook e colaboradores (Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 1989).

Uma "seqüência de codificação" ou "rede de leitura aberta" ou "ORF" é definida como uma seqüência de nucleotídeo que pode ser transcrita em mRNA e/ou traduzida em um polipeptideo quando colocada sob o controle de sequências de controle ou seqüências regulatórias apropriadas isto é, quando a referida seqüência de codificação ou ORF está presente em um formato expressível. A referida seqüência de codificação ou ORF é limitada por um códon de início de tradução 5' e um códon de término de tradução 3 1 . Uma seqüência de codificação ou ORF pode incluir, mas não está limitado, a RNA, mRNA, cDNA, seqüências de nucleotídeo recombinantes, seqüências de nucleotídeo siunteticamente fabricadas ou DNA genômico. A referida seqüência de codificação ou ORF pode ser interrompida por seqüências de ácido nucleico intervenientes.

Genes e seqüências de codificação que codificam essencialmente a mesma proteína, mas isolados de diferentes fontes, podem consistir de seqüências de ácido nucleico substancialmente divergentes. De modo recíproco, seqüências de ácido nucleico substancialmente divergentes podem ser projetadas para realizar expressão essencialmente da mesma proteína. As referidas seqüências de ácido nucleico são o resultado, por exemplo, da existência de diferentes alelos de um determinado gene, da degenerância do código genético ou de diferenças no uso de códon. Assim, conforme indicado na Tabela 2, aminoácidos tais como metionina e triptofano são codificados por um único códon, enquanto que outros aminoácidos tais como arginina, leucina e serina podem, cada um, ser traduzidos a partir de até seis códons diferentes. Diferenças no uso de códon preferidas são ilustradas na Tabela 3 para Agrobacterium tumefaciens (uma bactéria), A. thaliana, M. sativa (duas plantas dicotiledôneas) e Oryza sativa (uma planta monocotiledônea) . Para pegar um exemplo, o códon GGC (para glicina) é o códon mais freqüentemente usado em A. tumefaciens (36,2 &), é o segundo códon mais freqüentemente usado em O. sativa mas é usado em frequências muito menores em A. thaliana e M. sativa (9% e 8,4 &>, respectivamente) . Dos quatro códons possíveis para codificação de glicina (veja Tabela 2) , o referido códon GGC é, mais preferivelmente, usado em A. tumefaciens e O. sativa. Contudo, em A. thaliana, esse é o códon GGA (e GGU) , enquanto que em M. sativa esse é o códon GGU (e GGA).

Seqüências de DNA conforme definido na presente invenção podem ser interrompidas por seqüências intervenientes. Por "seqüências intervenientes" entenda-se qualquer seqüência de ácido nucleico a qual rompe uma seqüência de codificação compreendendo a seqüência de DNA da invenção ou a qual rompe o formato expressível de uma seqüência de DNA compreendendo a referida seqüência de DNA da invenção. A remoção da seqüência interveniente restaura a referida seqüência de codificação ou o referido formato expressível. Exemplos de seqüências intervenientes incluem íntrons e seqüências de DNA mobilizáveis, tais como transposons. Por "seqüência de DNA mobilizável" entenda-se qualquer seqüência de DNA que pode ser mobilizada como o resultado de um evento de recombinação.

Tabela 2. Degenerância do Código Genético Tabela 3. Uso dos códons indicados nos diferentes orgânicos dado______como_______f reaüência_____por______mil______códons (http://www.kazusa.or.jp/codon) . "Hibridização" é o processo em que seqüências de nucleotídeo complementares substancialmente homólogas se anelam umas às outras. O processo de hibridização pode ocorrer totalmente em solução, isto é, ambos os ácidos nucleicos complementares estão em solução. Ferramentas em biologia molecular contam com um processo que inclui PCR, hibridização subtrativa e determinação da seqüência de DNA. 0 processo de hibridização também pode ocorrer com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados em uma matriz tal como glóbulos magnéticos, glóbulos de Sepharose ou qualquer outra resina. Ferramentas em biologia molecular contam com um processo que inclui isolamento de RNA poli (A+) . O processo de hibridização pode, além disso, ocorrer com um dos ácidos nucleicos complementares imobilizados em um suporte sólido tal como nitrocelulose ou membrana de náilon ou imobilizados, por exemplo, através de fotolitografia, por exemplo, sobre um suporte de vidro silicoso (o último conhecido como raias ou micro-raias de ácido nucleico ou lascas de ácido nucleico). Ferramentas em biologia molecular contam com um processo que inclui análise de RNA e DNA por "blot" em gel, hibridização de colônia, hibridização de placas e hibridização em micro-raia. De forma a permitir que a hibridização ocorra, as moléculas de ácido nucleico são, de modo geral, térmica ou quimicamente (por exemplo, através de NaOH) desnaturadas para fundir uma fita dupla em duas fitas simples e/ou remover hairpinas ou outras estruturas secundárias de ácidos nucleicos fita simples. A estringência de hibridização é influenciada por condições tais como temperatura, concentração de sal e composição do tampão de hibridização. Condições de elevada estringência para hibridização incluem elevada temperatura e/ou baixa concentração de sal (sais incluem NaCl e Na3-citrato) e/ou a inclusão de formamida no tampão de hibridização e/ou diminuição da concentração de compostos tais como SDS (detergente) no tampão de hibridização e/ou exclusão de compostos tais como sulfato de dextrana ou polietileno glicol (promoção da aglomeração molecular) do tampão de hibridização. Condições convencionais de hibridização são descritas, por exemplo, em Sambrook e colaboradores (1989), mas aqueles habilitados na técnica apreciarão que numerosas condições diferentes de hibridização podem ser projetadas em função da homologia conhecida ou esperada e/ou extensão da seqüência de ácido nucleico. Condições de hibridização de estringência suficientemente baixa são particularmente preferidas para isolar ácidos nucleicos heterólogos às seqüências de DNA da invenção definidas supra. Elementos que contribuem para a referida heterologia incluem alelismo, degeneração do código genético e diferenças no uso de códon preferido, conforme discutido supra. O termo "hibridização específica" ou "hibridização especial" se refere à ligação, formação dupla ou hibridização de uma molécula a uma seqüência de nucleotídeo, em particular sob condições moderadamente estringentes, quando essa seqüência está presente em uma mistura complexa, por exemplo, DNA ou RNA celular total. "Condições estringentes de hibridização" e "condições estrigentes de lavagem em hibridização", no contexto de experimentos de hibridização de ácido nucleico, tais como hibridizações de Southern e Northern, são seqüência-dependentes e são diferentes sob diferentes parâmetros ambientais. Por exemplo, seqüências mais longas se hibridizam especificamente em temperaturas mais elevadas. A Tm é a temperatura, sob resistência ionica e pH definidos, na qual 50% da seqüência alvo se hibridizam a uma sonda perfeitamente equivalente. Especificidade é, tipicamente, a função de lavagens pós-hibridização. Fatores críticos de tais lavagens incluem a resistência iônica e temperatura da solução final de lavagem.

Geralmente, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 50 °C menores do que o ponto de fusão térmica (Tm) com relação à seqüência específica em uma resistência iônica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) na qual 50% da seqüência alvo se hidridizam a uma sonda perfeitamente equivalente. A Tm é dependente das condições de solução e da composição de base da sonda e pode ser calculada usando-se a seguinte equação: Tm = 79,8 °C +(18,5 x Log[Na+]) + (58,4°C x % [G+C] ) - (820 / # bp em dupla) - (0,5 x % formamida) Condições estringentes mais preferidas são quando a temperatura está 20 °C abaixo da Tra e condições estringentes mais preferidas são quando a temperatura está 10 °C abaixo da Tm. A ligação não específica pode também ser controlada usando-se qualquer uma de uma série de técnicas conhecidas tais como, por exemplo, bloqueio da membrana com soluções contendo proteína, adição de RNA heterólogo, DNA e SDS ao tampão de hibridização e tratamento com RNase.

Condições de lavagem são, tipicamente, realizadas em baixa estringência. Geralmente, condições estringentes adequadas para ensaios de hibridização de ácido nucleico ou procedimentos de detecção por amplificação de gene são conforme apresentado acima. Condições mais ou menos estringentes podem também ser selecionadas.

Para fins de definição do nível de estringência, referência pode, convenientemente, ser feita a Sambrook, J., E.F. Fritsch e colaboradores, 1989 "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 2a Edição, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, em 11.45. Um exemplo de condições de baixa estringência é 4-6X SSC/0,1-0,5% peso/volume de SDS a 37°-45° C durante 2-3 horas. Dependendo da fonte e concentração do ácido nucleico envolvido na hibridização, condições alternativas de estringência podem ser empregadas, tais como condições de média estringência. Exemplos de condições de média estringência incluem 1-4X SSC/0,25% peso/volume de SDS a > 45° C durante 2-3 hours. Um exemplo de condições de elevada estringência inclui 0,1-1X SSC/0,1% peso/volume de SDS a 60 °C durante 1-3 horas. Aqueles habilitados na técnica estão cientes dos vários parâmetros os quais podem ser modificados durante hibridização e lavagem e que manterão ou alterarão as condições de estringência. Por exemplo, outra condição de hibridização estringente é hibridização a 4X SSC a 65° C, seguido por uma lavagem em 0,IX SSC a 65° C durante cerca de uma hora. Alternativamente, uma condição de hibridização estringente exemplificativa é em 50% de formamida, 4XSSC, a 42° C. Ainda outro exemplo de condições estringentes incluem hibridização a 62° C em 6X SSC, 0,05X BLOTTO e lavagem a 2X SSC, 0,1% de SDS a 62° C.

Evidentemente, a presente invenção concretiza o uso das seqüências de DNA da invenção que codificam uma oxidase de citoquinina, homólogo, derivado ou fragmento imunologicamente ativo e/ou funcional das mesmas conforme definido em qualquer método de hibrifização. A presente invenção, além disso, também se refere a seqüências de DNA que se hibridizam ãs referidas seqüências de DNA da invenção. De preferência, a oxidase de citoquinina é uma oxidase de citoquinina vegetal, mais especificamente a (At)CKX de Arabidopsis thaliana.

Para realizar a expressão de uma proteína em uma célula, tecido ou órgão, de preferência de origem vegetal, a proteína pode ser introduzida diretamente na referida célula, tal como através de microinjeção ou meios balísticos ou, alternativamente, uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a referida proteína pode ser introduzida na referida célula, tecido ou órgão em um formato expressível.

De preferência, a seqüência de DNA da invenção compreende uma seqüência de codificação ou rede de leitura aberta (ORF) que codifica uma proteína de oxidase de citoquinina ou um homólogo ou derivado da mesma ou um fragmento imunologicamente ativo ou funcional da mesma conforme definido supra. A proteína preferida da invenção compreende a seqüência de aminoácidos da referida oxidase de citoquinina. De preferência, a referida oxidase de citoquinina é uma oxidase de citoquinina vegetal e mais especificamente uma (At)CKX de Arabidopsis thaliana.

Por "vetor" ou "seqüência de vetor" entenda-se uma seqüência de DNA a qual pode ser introduzida em um organismo através de transformação e pode ser estavelmente mantida no referido organismo. A manutenção do vetor é possível, por exemplo, em culturas de Escherichia coli, A. tumefaciens, Saccharomyces cerevisiae ou Schizosaccharomyces pombe. Outros vetores, tais como vetores de fagemídeos e cosmídeos, podem ser mantidos e multiplicados em bactérias e/ou vírus. Seqüências de vetor geralmente compreendem um conjunto de sítios únicos reconhecidos por enzimas de restrição, o múltiplo sítio de clonagem (MCS) , em que uma ou mais de seqüências de não-vetor podem ser inseridas.

Por "seqüências de não-vetor" entenda-se uma seqüência de DNA a qual é integrada em um ou mais dos sítios do MCS compreendido dentro de um vetor. "Vetores de expressão" formam um subconjunto de vetores os quais, em virtude de compreender as seqüências de controle ou regulatórias apropriadas, permitem a criação de um formato expressível para a(s) seqüência (s) de não-vetor inserida, assim, permitindo a expressão da proteína codificada pela(s) referida(s) seqüência(s) de não-vetor. Vetores de expressão que permitem a expressão de proteína em organismos conhecidos na técnica incluem bactérias (por exemplo, E. coli), fungos (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, Pichia pastoris) , células de inseto (por exemplo, vetores de expressão baculovirais), células de animais (por exemplo, células COS ou CHO) e células vegetais (por exemplo, vetores de expressão baseados no vírus X da batata). A presente invenção, evidentemente, inclui qualquer oxidase de citoquinina, homólogo, derivado e/ou fragmento imunologicamente ativo e/ou funcional da mesma, conforme definido supra. De preferência, a referida oxidase de citoquinina é uma oxidase de citoquinina vegetal, mais especificamente uma (At)CKX de Arabidopsis thaliana.

Como uma alternativa à produção de proteína mediada por vetor de expressão em sistemas biológicos, síntese química de proteínas pode ser aplicada. Peptídeos sintéticos podem ser fabricados em fase em solução ou em fase sólida. A síntese de peptídeo em fase sólida (Merrifield 1963) é, contudo, a forma mais comum e envolve a adição seqüencial de aminoácidos a fim de criar uma cadeia peptídica linear. A síntese de peptídeo em fase sólida inclui ciclos consistindo de três tipos: (i) imobilização do aminoácido carbóxi-terminal da cadeia peptídica em desenvolvimento sobre um suporte sólido ou resina; (ii) montagem da cadeia, um processo consistindo de ativação, acoplamento e desproteção do aminoácido a ser adicionado à cadeia peptídica em desenvolvimento; e (iii) divagem envolvendo remoção da cadeia peptídica terminada da resina e remoção dos grupos de proteção das cadeias laterais de aminoácido. Abordagens comuns em síntese de peptídeo em fase sólida incluem Fmoc/tBu (9-fluorenilmethilóxicarbonila/t-butila) e Boc (t-butilóxicarbonila) como os grupos de proteção amino-terminais de aminoácidos. Grupos de proteção da cadeia lateral de aminoácido incluem metila (Me), formila (CHO), etila (Et), acetila (Ac), t-butila (t-Bu), anisila, benzila (Bzl), trifluroacetila (Tfa), N-hidróxisuccinimida (ONSu, OSu), benzoíla (Bz), 4-metilbenzila (Meb), tioanizila, tiocresila, benzilóximetila (Bom), 4-nitrofenila (ONp), benzilóxicarbonila (Z) , 2-nitrobenzoíla (NBz), 2-nitrofenil-sulfenila (Nps), 4-tolueno-sulfonila (Tosila,Tos) , pentafluorofenila (Pfp) , difenilmetila (Dpm) , 2-clorobenzilóxicarbonila (Cl-Z), 2,4,5-triclorofenila, 2-bromobenzilóxicarbonila (Br-Z), trifenilmetila (Tritila, Trt) e 2,5,7,8-pentametil-croman-6-sulfonila (Pmc). Durante montagem da cadeia, Fmoc ou Boc são removidos, resultando em um amino-término ativado do resíduo de aminoácido ligado à cadeia em desenvolvimento. O carbóxi-término do aminoácido que surge é ativado através de conversão a um éster altamente reativo, por exemplo, através de HBTU. Com as tecnologias atuais (por exemplo, sintetizador PerSeptive Biosystems 9050, Sintetizador de Peptídeo Applied Biosystems Model 431A), peptídeos lineares de até 50 resíduos podem ser fabricados. Uma série é diretrizes está disponível para produzir peptídeos que são adequados para uso em sistemas biológicos, incluindo (i) limitação quanto ao uso de aminoácidos difíceis, tais como cys, met, trp (facilemnte oxidados e/ou degradados durante a síntese de peptídeo) ou arg; (ii) minimização de aminoácidos hidrofóbicos (pode prejudicar a solubilidade do peptídeo); e (iii) prevenção de um ácido glutâmico amino-terminal (pode ciclizar em piroglutamato).

Por "formato expressível" entenda-se que a molécula de ácido nucleico isolada está em uma forma adequada para ser transcrita em mRNA e/ou traduzida a fim de produzir uma proteína, quer constitutivamente ou após indução por um sinal intracelular ou extracelular, tal como um estímulo ambiental ou estresse (mitógenos, anoxia, hipoxia, temperatura, sal, luz, desidratação, etc.) ou um composto químico tal como IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo) ou tal como um antibiótico (tetraciclina, ampicilina, rifampicina, canamicina), hormônio (por exemplo, giberelina, auxina, citoquinina, glicocorticóides, brassinoesteróides, etileno, ácido abscísico, etc.), análogos de hormônio (ácido indolaacético (IAA), 2,4-D, etc.), metal (zinco, cobre, ferro, etc.) ou dexametasona, dentre outros. Conforme é conhecido por aqueles habilitados na técnica, a expressão de uma proteína funcional também pode requerer uma ou mais modificações pós-traducionais, tais como glicosilação, fosforilação, desfosforilação ou uma ou mais interações proteína-proteína, dentre outros. Todos de tais processos estão incluídos dentro do escopo do termo "formato expressível".

De preferência, a expressão de uma proteína em uma célula, tecido ou órgão específico, de preferência de origem vegetal, é realizada através de introdução e expressão de uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a referida proteína, tal como uma molécula de cDNA, gene genômico, molécula de oligonucleotídeo sintética, molécula de mRNA ou rede de leitura aberta, na referida célula, tecido ou órgão, em que a referida molécula de ácido nucleico é colocada operavelmente em conexão com seqüências regulatórias ou de controle adequadas, incluindo um promotor, de preferência um promotor expressível em plantas, e uma seqüência terminadora.

Referência aqui a um "promotor" deve ser tomada em seu contexto mais amplo e inclui as seqüências regulatórias transcricionais derivadas de um gene genômico eucariota clássico, incluindo a caixa TATA a qual é requerida para inicio de transcrição precisa, com ou sem seqüências de ativação, intensificadores e silenciadores) , os quais alteram a expressão do gene em resposta a estímulos externos e/ou de desenvolvimento ou de uma maneira tecido-específica. O termo "promotor" também inclui as seqüências regulatórias transcricionais de um gene procariota clássico, caso no qual ele pode incluir uma seqüência de caixa -35 e/ou seqüências regulatórias transcricionais de caixa -10. O termo "promotor" é usado também para descrever uma molécula sintética ou de fusão ou um derivado o qual confere, ativa ou intensifica a expressão de uma molécula de ácido nucleico em uma célula, tecido ou órgão.

Promotores que podem conter cópias adicionais de um ou mais elementos regulatórios específicos, para intensificar adicionalmente a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou a expressão temporal de uma molécula de ácido nucleico à qual eles estão operavelmente conectados. Tais elementos regulatórios podem ser colocados adjacentes a uma sequência promotora heteróloga a fim de acionar a expressão de uma molécula de ácido nucleico em resposta, por exemplo, ao cobre, glicocorticóides, dexametasona, tetraciclina, giberelina, cAMP, ácido abscísico, auxina, ferimentos, etileno, jasmonato ou ácido salicílico ou conferir expressão de uma molécula de ácido nucleico a células, tecidos ou órgãos específicos, tais como meristemas, folhas, raízes, embriões, flores, sementes ou frutos.

No contexto da presente invenção, o promotor é, de preferência, uma seqüência promotora expressível em planta. Promotores que também funcionam ou funcionam unicamente em células não vegetais, tais como bactérias, células de levedo, células de inseto e células de animais não estão excluídos da invenção. Por "expressível em planta" entenda-se que a seqüência promotora, incluindo quaisquer elementos regulatórios adicionados à mesma ou contidos na mesma, é pelo menos capaz de induzir, conferir, ativar ou intensificar a expressão em uma célula, tecido ou órgão vegetal, de preferência uma célula, tecido ou órgão de monocotiledenea ou dicotiledônea.

Os termos "planta-operável" e "operável em uma planta", quando usados aqui com relação a uma seqüência promotora, deverão ser tormados para serem equivalentes à seqüência promotora expressível em planta.

Promotores regulatórios como parte de um sistema viral binário de expressão em planta também são conhecidos por aqueles habilitados na técnica (Yadav 1999 - W09922003; Yadav 2000 - W00017365).

No presente contexto, uma "seqüência promotora regulável" é um promotor que é capaz de conferir expressão de um gene estrutural, em particular a uma célula, tecido ou órgão ou grupo de células, tecidos ou órgãos de uma planta, opcionalmente sob condições específicas que, contudo, geralmente não confere expressão à planta sob todas as condições. Conseqüentemente, uma sequência promotora regulável pode ser uma seqüência promotora que confere expressão de um gene ao qual ela está operavelmente ligada em um local em particular dentro da planta ou, alternativamente, através da planta sob um conjunto específico de condições, tais como após indução da expressão do gene por um composto químico ou outro estimulante.

De preferência, o promotor regulável usado na realização da presente invenção confere expressão em um local específico dentro da planta, quer constitutivamente ou após indução, contudo não na planta toda sob quaisquer circunstâncias. Incluídas dentro do escopo de tais promotores estão seqüências promotoras célula-específicas, sequências promotoras tecido-específicas, seqüências promotoras órgão-específicas, seqüências promotoras gene-específicas ao ciclo celular, seqüências promotoras induzíveis e seqüências promotoras constitutivas que tenham sido modificadas para conferir expressão em uma parte em particular da planta a qualquer momento, tal como através de integração do referido promotor constitutivo dentro de um elemento genético de tranposon (Ac, Ds, Spm, En ou outro transposon).

Similarmente, o termo "tecido-específico" deverá ser tomado para indicar que a expressão é predominantemente em um tecido ou tipo de tecido em particular, de preferência de origem vegetal, embora não necessariamente de modo exclusivo no referido tecido ou tipo de tecido.

Similarmente, o termo "órgão-específico" deverá ser tomado para indicar que a expressão é predominantemente em um órgão em particular, de preferência de origem vegetal, embora não necessariamente de modo exclusivo no referido órgão.

Similarmente, o termo "especifico ao ciclo celular" deverá ser tomado para indicar que a expressão é predominantemente cíclica e ocorre em uma ou mais fases, mas não necessariamente consecutivas, do ciclo celular, embora não necessariamente de modo exclusivo em células em ciclização, de preferência de origem vegetal.

Aqueles habilitados na técnica estarão cientes de que um "promotor induzível" é um promotor cuja atividade transcricional do mesmo é aumentada ou induzida em resposta a um estímulo do desenvolvimento, químico, ambiental ou físico. Similarmente, aqueles habilitados na técnica compreenderão que um "promotor constitutivo" é um promotor que é transcricionalmente ativo através da maioria, mas não necessariamente todas, as partes de um organismo, de preferência uma planta, durante a maioria, mas não necessariamente todas, as fases de seu crescimento e desenvolvimento.

Aqueles habilitados na técnica serão prontamente capazes de selecionar seqüências promotoras apropriadas para uso na regulação da expressão da proteína de oxidase de citoquinina a partir de fontes publicamente disponíveis ou prontamente disponíveis, sem experimentação indevida.

Colocação de uma molécula de ácido nucleico sob o controle regulatório de uma seqüência promotora ou em conexão operável com uma seqüência promotora, significa posicionamento da referida molécula de ácido nucleico de modo que a expressão é controlada pela seqüência promotora. Um promotor é, usual mas não necessariamente, posicionado a montante ou na extremidade 5' e dentro de 2 kb do local de inicio de transcrição da molécula de ácido nucleico a qual ele regula. Na construção de combinações de genes estruturais/promotor heterológos, é geralmente preferido posicionar o promotor em uma distância, a partir do local de início de transcrição do gene, que é aproximadamente a mesma que a distância entre esse promotor e o gene que ele controla em seu ambiente natural (isto é, o gene a partir do qual o promotor é derivado) . Conforme é conhecido na técnica, alguma variação nessa distância pode ser realizada sem perda da função do promotor. Similarmente, o posicionamento preferido de um elemento de seqüência regulatória com relação a um gene heterólogo a ser colocado sob seu controle é definido pelo posicionamento do elemento em seu ambiente natural (isto é, o gene a partir do qual ele é derivado). Novamente, conforme é conhecido na técnica, alguma variação nessa distância também pode ocorrer.

Exemplos de promotores adequados para uso nas estruturas genéticas da presente invenção incluem aqueles listados na Tabela 4, dentre outros. Os promotores listados na Tabela 4 são proporcionados para fins de exemplificação apenas e a presente invenção não deve estar limitada à lista proporcionada aqui. Aqueles habilitados na técnica estarão prontamente em posição de proporcionar promotores adicionais que são úteis para realização da presente invenção.

No caso de promotores constitutivos ou promotores que induzem à expressão através da planta toda, é preferido que tais seqüências sejam modificadas através da adição de seqüências de nucleotídeo derivadas de um ou mais dos promotores tecido-específicos listados na Tabela 4 ou, alternativamente, seqüências de nucleotídeo derivadas de um ou mais dos promotores induzíveis tecido-específicos acima mencionados, para conferir especificidade tecidual às mesmas. Por exemplo, o promotor CaMV 35S pode ser modificado através da adição da seqüência promotora Adhl de milho, para conferir expressão raiz-específica anaerobicamente regulada à mesma, conforme descrito anteriomente (Ellis e colaboradores, 1987). Outro exemplo descreve conferência de expressão de gene abundante em raiz ou raiz-específico através de fusão do promotor CaMV35S a elementos do gene da proteína rica em glicina GRP3 de milho (Feix e Wulff 2000 - W00015662) . Tais modificaçõees podem ser obtidas por meio de experimentação de rotina por aqueles habilitados na técnica. 0 termo "terminador" se refere a uma seqüência de DNA na extremidade de uma unidade transcricional que sinaliza o término de transcrição. Terminadores são seqüências de DNA 31-não-traduzidas contendo um sinal de poliadenilação, o qual facilita a adição de seqüências de poliadenilato à extremidade 3' de um transcrito primário. Terminadores ativos em células derivadas de vírus, levedos, mofos, bactérias, insetos, pássaros, mamíferos e plantas são conhecidos e descritos na literatura. Eles podem ser isolados de bactérias, fungos, vírus, animais e/ou plantas. Tabela 4. Promotores Planta-Exoressíveis Exemolificativos para Uso na Realização da Presente Invenção Exemplos de terminadores particularmente adequados para uso nas estruturas genéticas da presente invenção incluem o terminador do gene da sintase de nopalina de Agrobacterium tumefaciens (NOS), a seqüência terminadora do gene da sintase de octopina de Agrobacterium tumefaciens (OCS), a seqüência terminadora do gene 35S do vírus mosaico de Couve-Flor (CaMV), a seqüência terminadora de ADP-glicose pirofosforilase de Oryza sativa (t3'Bt2), a seqüência terminadora do gene da zeína de Zea mays, o terminador do gene rbcs-ΙΑ e as seqüências terminadoras do gene rbcs-3A, dentre outros.

Seqüências promotoras preferidas da invenção incluem promotores raiz-específicos tais como, mas não limitado, àqueles listados na Tabela 5, Tabela 4 e conforme esboçado nos Exemplos.

Tabela 5. Promotores Raiz-Esnecíficos Exemplificativos para Uso na Realização da Presente Invenção Aqueles habilitados na técnica estarão cientes de seqüências promotoras e seqüências terminadoras adicionais as quais podem ser adequadas para uso na realização da invenção. Tais seqüências podem ser prontamente usadas sem qualquer experimentasção indevida.

No contexto da presente invenção, "expressão ectópica" ou "superexpressão ectópica" de um gene ou uma proteína que está conferindo padrões de expressão e/ou níveis de expressão do referido gene ou proteína que não ocorrem normalmente sob condições naturais significa, mais especificamente, expressão aumentada e/ou níveis de expressão aumentados. A expressão ectópica pode ser obtida através de uma série de formas, incluindo ligação operável de uma seqüência de codificapção que codifica a referida proteína a um promotor heterólogo ou homólogo isolado de forma a criar um gene quimérico e/ou ligação operável da referida seqüência de codificação a seu próprio promotor isolado (isto é, o promotor não isolado que aciona naturalmente a expressão da referida proteína) de forma a criar uma duplicação de gene ou multiplicação de gene recombinante. Por "co-expressão ectópica" entenda-se a expressão ou superexpressão ectópica de dois ou mais genes ou proteínas. 0 mesmo, ou mais preferivelmente diferentes promotores, é usado para conferir expressão ectópica dos referidos genes ou proteínas.

De preferência, a seqüência promotora usada no conexto da presente invenção está operavelmente ligada a uma seqüência de codificação ou uma rede de leitura aberta (ORF) que codifica uma proteína de oxidase de citoquinina ou um homólogo, derivado ou um fragmento imunologicamente ativo ou funcional da mesma, conforme definido supra. "Sub-regulação da expressão", conforme usado aqui, significa diminuição dos níveis de expressão do gene e/ou diminuição do produto do gene ativo e/ou dos níveis de atividade do produto do gene. Diminuições na expressão podem ser realizadas, por exemplo, através da adição de seqüências de codificação ou partes da mesma em uma orientação correta (senso) (se resultando em co-supressão) ou uma orientação invertida (anti-senso) com relação a uma seqüência promotora e, além disso, por exemplo, através de mutagênese por inserção (por exemplo, inserção de T-DNA ou inserção de transposon) ou através de estratégias de silenciamento de gene conforme descrito, por exemplo, por Angell e Baulcombe (1998 - WO9836083), Lowe e colaboradores (1989 - WO9853083), Lederer e colaboradores (1999 W09915682) ou Wang e colaboradores (1999 - W09953050).

Estruturas geneticas objetivadas ao silenciamento da expressão do gene podem ter a seqüência de nucleotídeo do referido gene (ou uma ou mais partes da mesma) contida nas mesmas em uma orientação senso e/ou anti-senso com relação à seqüência promotora. Outro método para sub-regular a expressão do gene compreende o uso de ribozimas.

Modulação, incluindo diminuição, do nível dos produtos do gene ativo ou de atividade do produto do gene, pode ser obtida através de administração ou exposição das células, tecidos ou órgãos ou organismos ao referido produto do gene, um homólogo, derivado e/ou fragmento imunologicamente ativo do mesmo. A imunomodulação é outro exemplo de uma técnica capaz de sub-regulação dos níveis de produto do gene ativo e/ou de atividade do produto do gene a ou em células, tecidos, órgãos ou organismos em que os níveis do referido produto do gene e/ou atividade do produto do gene têm de ser modulados. Tais anticorpos compreendem "planticorpos", anticorpos com cadeia simples, anticorpos IgG e anticorpos de cadeia pesada, bem como fragmentos dos mesmos. A modulação, incluindo diminuição, do nível de produtos do gene ativo ou de atividade do produto do gene, além disso, pode ser obtida através de administração ou exposição das células, tecidos ou órgãos ou organismos a um agonista do referido produto do gene ou da atividade do mesmo. Tais agonistas incluem proteínas (compreendendo, por exemplo, cinases e proteinases) e compostos químicos identificados de acordo com a presente invenção, conforme descrito supra.

No contexto da presente invenção, pretende-se a sub-regulação da expressão de um gene da oxidase de citoquinina conforme definido aqui anteriormente. De preferência, o referido gene da oxidase de citoquinina é um gene da oxidase de citoquinina vegetal, mais especificamente uma AtCKX. A invenção ainda compreende sub-regulação dos níveis de uma proteína de oxidase de citoquinina ou de uma atividade da oxidase de citoquinina, pelo que a referida proteína de oxidase de citoquinina é conforme definido supra. De preferência, a referida proteína de oxidase de citoquinina é uma oxidase de citoquinina vegetal, mais especificamente uma AtCKX.

Por "modificação do tipo de uma célula e/ou desenvolvimento da planta e/ou morfologia da planta e/ou bioquímica e/ou fisiologia" entenda-se que uma ou mais características de desenvolvimento e/ou morfológicas e/ou bioquímicas e/ou fisiológicas de uma planta são alteradas através de realização de uma ou mais etapas pertencendo à invenção descrita aqui. "Tipo de uma célula" se refere ao tipo de célula ou características celulares de uma célula em particular que são produzidas durante o desenvolvimento da planta ou um processo celular da mesma, em particular durante o ciclo celular ou como uma conseqüência de um processo de ciclo celular. "Desenvolvimento da planta" ou o termo "característica de desenvolvimento da planta" ou termo similar, quando usado aqui, deverá ser tomado para significar qualquer processo de uma planta que está envolvido na determinação do tipo de desenvolvimento de uma célula vegetal, em particular o tipo específico de tecido ou órgão no qual uma célula progenitora se desenvolverá. Processos celulares relevantes para o desenvolvimento da planta serão conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Tais processos incluem, por exemplo, morfogênese, fotomorfogênese, desenvolvimento de brotos, desenvolvimento da raiz, desenvolvimento vegetativo, desenvolvimento reprodutivo, alongamento de caule, floração e mecanismos regulatórios envolvidos na determinação do tipo de uma célula, em particular um processo ou processos regulatórios envolvendo o ciclo celular. "Morfologia da planta" ou o termo "característica morfológica da planta" ou termo similar, quando usado aqui, deverá ser compreendido por aqueles habilitados na técnica como se referindo à aparência externa de uma planta, incluindo qualquer uma das características estruturais ou a combinação de características estruturais da mesma. Tais características estruturais incluem o formato, tamanho, número, posição, cor, textura, disposição e padronização de qualquer célula, tecido ou órgão ou grupos de células, tecidos ou órgãos de uma planta, incluindo a raiz, caule, folha, broto, pecíolo, tricoma, flores, pétalas, estigma, estilo, estame, pólen, óvulo, semente, embrião, endosperma, envoltório da semente, aleurona, fibra, fruto, câmbio, madeira, durâmen, parênquima, aerênquima, elemento de peneira, floema ou tecido vascular, dentre outros. "Bioquímica da planta" ou o termo "característica bioquímica da planta" ou termo similar, quando usado aqui, deve ser compreendido por aqueles habilitados na técnica como se referindo aos processos metabólicos e catalíticos de uma planta, incluindo metabolismo primário e secundário e os produtos dos mesmos, incluindo quaisquer moléculas pequenas, macromoléculas ou compostos químicos tais como, mas não limitado, a amidos, açúcares, proteínas, peptídeos, enzimas, hormônios, fatores do crescimento, moléculas de ácido nucleico, celuloses, hemiceluloses, caloses, lectinas, fibras, pigmentos tais como antocianinas, vitaminas, minerais, micronutrientes ou macronutrientes que são produzidos por plantas. "Fisiologia da planta" ou o termo "característica fisiológica da planta" ou termo similar, quando usado aqui, deverá ser compreendido como se referindo aos processos funcionais de uma planta, incluindo processos do desenvolvimento tais como crescimento, expansão e diferenciação, desenvolvimento sexual, reprodução sexual, formação de semente, desenvolvimento de semente, enchimento de grão, reprodução assexual, divisão celular, dormência, germinação, adaptação à luz, fotossíntese, expansão da folha, produção de fibra, crescimento secundário ou produção de madeira, dentre outros; respostas de uma planta a fatores externamente aplicados incluem fatores tais como metais, produtos químicos, hormônios, fatores do crescimento, fatores ambientais e ambientais estressantes (por exemplo, anoxia, hipoxia, elevada temperatura, baixa temperatura, desidratação, luz, duração do dia, alagamento, sal, metais pesados, dentre outros), incluindo respostas adaptativas das plantas aos referidos fatores externamente aplicados.

Meios para a introdução de DNA recombinante em tecido ou células vegetais incluem, mas não estão limitados, à transformção usando-se CaCl2 e variações da mesma, em particular o método descrito por Hanahan (1983), captação direta de DNA em protoplastas (Krens e colaboradores, 1982; Paszkowski e colaboradores, 1984), captação PEG-mediada em protoplastas (Armstrong e colaboradores, 1990), bombardeamento de micropartículas, eletroporação (Fromm e colaboradores, 1985), microinjeção de DNA (Crossway e colaboradores, 1986), bombardeamento de micropartículas de explantes de tecidos ou células (Christou e colaboradores, 1988; Sanford, 1988), infiltração a vácuo de tecido com ácido nucleico ou, no caso de plantas, transferência T-DNA-mediada a partir de Agrobacterium para o tecido da planta, conforme descrito essencialmente por An e colaboradores (1985) , Dodds e colaboradores, (1985) , Herrera-Estrella e colaboradores (1983a, 1983b, 1985). Métodos para a transformação de plantas monocotiledôneas são bem conhecidos na técnica e incluem transformação Agrobacterium-mediada (Cheng e colaboradores, 1997 W09748814; Hansen 1998 - W09854961; Hiei e colaboradores, 1994 - W09400977; Hiei e colaboradores, 1998 - W09817813;

Rikiishi e colaboradores, 1999 - WO9904618; Saito e colaboradores, 1995 - WO9506722), bombardeamento de micropartículas (Adams e colaboradores, 1999 - US5969213;

Bowen e colaboradores., 1998 - US5736369; Chang e colaboradores, 1994 - W09413822; Lundquist e colaboradores, 1999 - US5874265/US59903 90; Vasil e Vasil, 1995 US5405765, Walker e colaboradores, 1999 - US5955362), captação de DNA (Eyal e colaboradores, 1993 - W09318168), microinjeção de células de Agrobacterium (von Holt, 1994 -DE4309203) e ultra-som (Finer e colaboradores, 1997 US5693512) .

Para bombardeamento das células com micropartículas, uma micropart íocula é propelida em uma célula a fim de produzir uma célula transformada. Qualquer metodologia e aparelho de transformação balística de célula podem ser usados na execução da presente invenção. Aparelhos e procedimentos exemplificativos são divulgados por Stomp e colaboradores (Patente U.S. 5.122.466) e Sanford e Wolf (Patente U.S. 4.945.050). Quando do uso de procedimentos de transformação balística, a estrutura genética pode incorporar um plasmídeo capaz de replicação na célula a ser transformada. Exemplos de micropartículas adequadas para uso em tais sistemas incluem esferas de ouro de 1 a 5 μτη. A estrutura de DNA pode ser depositada sobre a micropartícula por meio de qualquer técnica adequada, tal como através de precipitação.

Uma planta inteira pode ser regenerada da célula transformada ou transfectada de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica. 0 tecido da planta capaz de subseqüente propagação clonal, quer através de organogênese ou embriogênese, pode ser transformado com uma estrutura genética da presente invenção e uma planta inteira regenerada a partir da mesma. O tecido escolhido em particular variará, dependendo dos sistemas de propagação dispiniveis e melhor adequados para a espécie que está sendo transformada em particular. Alvos teciduais exemplificativos incluem discos de folha, pólen, embriões, cotilédones, hipocótilos, megagametófitos, tecido do caule, tecido meristemático existente (por exemplo, meristema apical, brotos axilares e meristemas da raiz) e tecido meristemático induzido (por exemplo, meristema de cotilédone e meristema de hipocótilos). 0 termo "organogênese", conforme usado aqui, significa um processo pelo qual brotos e raízes são desenvolvidos seqüencialmente a partir de centros meristemáticos. O termo "embriogênese", conforme usado aqui, significa um processo pelo qual brotos e raízes se desenvolvem juntos de um modo combinado (não seqüencialmente), quer a partir de células somáticas ou gametas.

De preferência, a planta produzida de acordo com o método da invenção é transfectada ou transformada por uma sequência genética ou passível de introdução de uma proteína por meio de qualquer um dos meios reconhecidos na técnica, tais como bombardeamento de micropartículas, microinjeção, transformação Agrobacterium-mediada (incluindo transformação in planta), fusão de protoplasta ou eletroporação, dentre outros. Mais preferivelmente, a referida planta é produzida através de transformação Agrobacterium-mediada.

Transformação Agrobacterium-mediada ou transformação agrolística de plantas, levedo, mofos ou fungos filamentosos é baseada na transferência de parte das seqüências de um vetor de transformção denominada T-DNA para o núcleo e integração do referido T-DNA no genoma do referido eucariota.

Por "Agrobacterium" entenda-se um membro da Agrobacteriaceae, mais preferivelmente Agrobacterium ou Rhizobacterium e ainda mais preferivelmente Agrobacterium tumefaciens.

Por "T-DNA" ou DNA transferido entenda-se que parte do vetor de transformação é flanqueado por bordas de T-DNA, o qual é, após ativação dos genes Agrobacterium vir, entalhado nas bordas de T-DNA e é transferido como um DNA fita simples para o núcleo de uma célula eucariota.

Quando usado aqui, por "bordas de T-DNA", "região de borda de T-DNA" ou "região de borda", entenda-se a borda de T-DNA à direita (RB) ou a borda de T-DNA à esquerda (LB) . Tal borda compreende uma seqüência central flanqueada por uma região interna de borda como parte da borda de flanqueamento de T-DNA e/ou uma região externa de borda como parte da parte principal do vetor que flanqueia a borda. As seqüências centrais compreendem 22 bp no caso de vetores do tipo octopina e 25 bp no caso de vetores do tipo nopalina. As seqüências centrais na região de borda à direita e na região de borda à esquerda formam repetições imperfeitas. As seqüências centrais de borda são indispensáveis para reconhecimento e processamento pelo complexo de entalhe por Agrobacterium, consistindo pelo menos de VirDl e VirD2. As seqüências centrais que flanqueiam um T-DNA são suficientes para promover a transferência do referido T-DNA. Contudo, a eficácia de transformação usando-se vetores de transformação portando o referido T-DNA flanqueado unicamente pelas referidas seqüências centrais é baixa. Regiões interna e externa de borda são conhecidas por modular a eficácia de transferência de T-DNA (Wang e colaboradores, 1987). Um elemento que intensifica a transferência de T-DNA foi caracterizado e reside na região externa da borda à direita e é denominado overdrive (Peralta e colaboradores, 1986; van Haaren e colaboradores, 1987).

Por "vetor de transformação de T-DNA" ou "vetor de T-DNA" entenda-se qualquer vetor abrangendo uma seqüência de T-DNA flanqueada por uma borda de T-DNA â esquerda ou à direita consistindo pelo menos das seqüências centrais de borda à esquerda e à direita, respectivamente, e usado para transformação de qualquer célula eucariota.

Por "seqüência da parte principal do vetor de T-DNA" ou "seqüências da parte principal de vetor de T-DNA" entenda-se todo DNA de um vetor de T-DNA que repousa externamente às bordas do T-DNA e, mais especificasmente, externamente aos sítios de entalhe das repetições centrais imperfeitas da borda.

A presente invenção inclui vetores de T-DNA otimizados, de modo que a integração da parte principal do vetor no genoma de uma célula eucariota é minimizada ou está ausente. Por "vetor de T-DNA otimizado" entenda-se um vetor de T-DNA projetado para diminuir ou eliminar a transferência de seqüências da parte principal do vetor no genoma de uma célula eucariota. Tais vetores de T-DNA são conhecidos por aqueles habilitados na técnica e incluem aqueles descritos por Hanson e colaboradores (1999) e por Stuiver e colaboradores (1999 - WO9901563). A presente invenção considera claramente a inclusão de uma seqüência de DNA que codifica uma oxidase de citoquinina, homólogo, derivado ou fragmento imunologicamente ativo e/ou funcional da mesma, conforme definido supra, em qualquer vetor de T-DNA compreendendo vetores de transformação binários, vetores de transformação super-binários, vetores de transformação co-integrados, vetores de transformação Ri-derivados, bem como em vetores portando T-DNA usados em transformação agrolística. De preferência, a referida oxidase de citoquinina é uma oxidase de citoquinina vegetal, mais especificamente uma (At)CKX de Arabidopsis thaliana.

Por "vetor de transformação binário" entenda-se um vetor de transformação de T-DNA compreendendo: (a) uma região de T-DNA compreendendo pelo menos um gene de interesse e/ou pelo menos um marcador selecionável ativo na célula eucariota a ser transformada; e (b) uma região da parte principal do vetor compreendendo pelo menos origens de replicação ativas em E. coli e Agrobacterium e marcadores para seleção em E. coli e Agrobacterium.

As bordas de T-DNA de um vetor de transformação binário podem ser derivadas de plasmídeos Ti do tipo octopina ou do tipo nopalina ou de ambos. O T-DNA de um vetor binário é transferido para uma célula eucariota apenas em conjunto com um plasmídeo auxiliar.

Por "plasmídeo auxiliar" entenda-se um plasmídeo que é estavelmente mantido em Agrobacterium e porta pelo menos um conjunto de genes vir necessários para possibilitar a transferência do T-DNA. O referido conjunto de genes vir pode ser derivado de plasmídeos Ti do tipo octopina ou do tipo nopalina ou de ambos.

Por "vetor de transformação super-binário" entenda-se um vetor de transformação binário portando adicionalmente na região da parte principal do vetor uma região vir do plasmídeo Ti pTiBo542 do gênero supervirulento de A. tumefaciens A281 (EP0604662, EP0687730). Vetores de transformação super-binários são usados em conjunto com um plasmídeo auxiliar.

Por "vetor de transformação co-integrado" entenda-se um vetor de T-DNA compreendendo pelo menos: (a) uma região de T-DNA compreendendo pelo menos um gene de interesse e/ou um marcador selecionável ativo em plantas; e (b) uma região da parte principal do vetor compreendendo pelo menos origens de replicação ativas em Escherichia coli e Agrobacterium e marcadores para seleção em E. coli e Agrobacterium e um conjunto de genes vir necessários para possibilitar a transferência do T-DNA.

As bordas de T-DNA e o referido conjunto de genes vir de um referido vetor de T-DNA podem ser derivadas de plasmídeos Ti do tipo octopina ou do tipo nopalina ou de ambos.

Por "vetor de transformação de planta Ri-derivado" entenda-se um vetor de transformação binário no qual as bordas de T-DNA são derivadas de um plasmídeo Ti e o referido vetor de transformação binário usado junto com um plasmídeo-Ri 'auxiliar' portando o conjunto necessário de genes vir.

Conforme usado aqui, o termo "gene marcador selecionável" ou "marcador selecionável" ou "marcador para seleção" inclui qualquer gene o qual confere um fenótipo sobre uma célula na qual ele é expresso a fim de facilitar a identificação e/ou seleção de células as quais são transfectadas ou transformadas com uma estrutura genética da invenção ou um derivado das mesmas. Genes marcadores selecionáveis adequados considerados aqui incluem o gene da resistência à ampicilina (Ampr) , da resistência à tetraciclina (Tcr) , gene da resistência à canamicina bacteriana (Kanr) , gene da resistência à fosfinotricina, gene da fosfotransferase de neomicina (nptll), gene da resistência à higromicina, gene da β-glucuronidase (GUS), gene da acetiltransferase de cloranfenicol (CAT), gene da proteína verde fluorescente (gr fp) (Haseloff e colaboradores, 1997) e gene da luciferase, dentre outros.

Por "agrolísticos", "transformação agrolística" ou "transferência agrolística" entenda-se um método de transformação compreendendo características de transformação Agrobacterium-mediada e distribuição biolística de DNA. Como tal, um plasmídeo alvo contendo T-DNA é co-distribuído com DNA/RNA que permite a produção, em plantas, de VirDl e VirD2 com ou sem VirE2 (Hansen e Chilton 1996; Hansen e colaboradores, 1997; Hansen e Chilton 1997 - WO9712046).

Por "DNA estranho" entenda-se qualquer seqüência de DNA que é introduzida no genoma do hospedeiro por meio de técnicas recombinantes. O referido DNA estranho inclui, por exemplo, uma seqüência de T-DNA ou parte da mesma, tal como a seqüência de T-DNA compreendendo o marcador selecionável em um formato expressível. DNA estranho, além disso, inclui seqüências de DNA intervenientes conforme definido supra.

Por "evento de recombinação" entenda-se um evento de recombinação sítio-específico ou um evento de recombinação realizado por 'transição' de transposon.

Por "recombinase" entenda-se uma recombinase ou uma transposase sítio-específica.

Por "sítio de recombinação" entenda-se sítios de recombinação ou seqüências de borda de transposon sítio-especí ficas .

Por "evento de recombinação sítio-específico" entenda-se um evento catalisado por um sistema consistindo geralmente de três elementos: um par de seqüências de DNA (a seqüência ou sítios de recombinação sítio-específicos) e uma enzima específica (a recombinase sítio-específica). A recombinase sítio-específica catalisa uma reação de recombinação apenas entre duas seqüências de recombinação sítio-específicas, dependendo da orientação das seqüências de recombinação sítio-específicas. Seqüências intervenientes entre dois sítios de recombinação sítio-específicos serão invertidas na presença da recombinase sítio-específica quando as seqüências de recombinação sítio-específicas são orientadas em direções opostas uma com relação a outra (isto é, repetições invertidas). Se as seqüências de recombinação sítio-específicas são orientadas na mesma direção uma com relação a outra (isto é, repetições diretas), então, quaisquer seqüências intervenientes serão deletadas quando de interação com a recombinase sítio-específico. Assim, as seqüências de recombinação sítio-específicas estão presentes como repetições diretas em ambas as extremidades de uma seqüência de DNA estranho integrado em um genoma eucariota, de modo que a integração das referidas seqüências pode ser subseqüentemente invertida pela interação das seqüências de recombinação sítio-específicas com a recombinase sítio-especí fica .

Uma série de diferentes sistemas de recombinase sítio-específica pode ser usada incluindo, mas não limitado, ao sistema Cre/lox do bacteriófago Pl, o sistema FLP/FRT de levedo, a recombinase Gin do fago Mu, a recombinase Pin de E. coli, a PinB, PinD e PinF de Shigella e o sistema R/RS do plasmídeo pSRl. Recombinases geralmente são integrases, resolvases ou flipases. Também, recombinases duplamente específicas podem ser usadas em conjunção com repetições diretas ou indiretas de dois sítios de recombinação sítio-específicos diferentes correspondendo à recombinase duplamente específica (WO99/25840). Os dois sistemas de recombinase sítio-específica preferidos são os sistemas Cre/lox de bacteriófago Pl e FLP/FRT de levedo. Nesses sistemas, uma recombinase (Cre ou FLP) interage especificamente com sua respectiva seqüência de recombinação sítio-específica (lox ou FRT, respectivamente) para inverter ou excisar as seqüências intervenientes. As seqüências de recombinação sítio-específicas para cada um desses dois sistemas são relativamente curtas (34 bp para lox e 47 bp para FRT) . Alguns desses sistemas já foram usados com alta eficiência em plantas, tais como tabaco (Dale e colaboradores, 1990) e Arabidopsis (Osborne e colaboradores, 1995) . Sistemas de recombinação sítio-especificos têm muitas aplicações em biologia molecular de plantas, incluindo métodos para o controle de recombinação homóloga (por exemplo, US5527695), para a inserção objetivada, empilhamento de gene, etc. (W099/25821) para a resolução de padrões complexos de integração de T-DNA ou para excisão de um marcador selecionável (WO99/23202).

Embora as seqüências de recombinação sítio-específicas devam ser ligadas às extremidades do DNA a ser excisado ou a ser invertido, o gene que codifica a recombinase sítio-especí fica pode estar localizado em qualquer lugar. Por exemplo, o gene da recombinase podería já estar presente no DNA de eucariotas ou podería ser fornecido por um fragmento de DNA introduzido posteriormente ou introduzido diretamente em células, através de cruzamento ou polinização cruzada. Alternativamente, uma proteína recombinase substancialmente purificada podería ser introduzida diretamente na célula eucariota, por exemplo, através de microinjeção ou bombardeamento de partículas. Tipicamente, a região de codificação da recombinase sítio-específica estará operavelmente ligada a seqüências regulatórias que permitem a expressão da recombinase sítio-especí fica na célula eucariota.

Por "evento de recombinação realizado por transição com transposon" ou "recombinação transposase-mediada" entenda-se um evento de recombinação catalisado por um sistema consistindo de três elementos: um par de seqüências de DNA (as seqüências de borda de transposon) e uma enzima especifica (a transposase). A transposase catalisa uma reação de recombinação apenas entre duas seqüências de borda de transposon as quais estão dispostas como repetições invertidas.

Uma série de diferentes sistemas de transposon/transposase podería ser usada incluindo, mas não limitado, ao sistema Ds/Ac, o sistema Spm e o sistema Mu. Esses sistemas se originam de milho, mas foi mostrado que pelo menos os sistemas Ds/Ac e Spm também funcionam em outras plantas (Fedoroff e colaboradores, 1993; Schlappi e colaboradores, 1993; Van Sluys e colaboradores, 1987). Preferidos são os transposons do tipo Ds e Spm, os quais são delineados por seqüências de borda de 11 bp e 13 bp, respectivamente.

Embora as seqüências de borda de transposon devam ser ligadas às extremidades do DNA para serem excisadas, o gene que codifica a transposase pode estar localizado em qualquer lugar. Por exemplo, o gene da recombinase podería já estar presente no DNA de eucariotas ou podería ser fornecido por um fragmento de DNA introduzido posteriormente ou introduzido diretamente nas células através de cruzamento ou através de polinização cruzada. Alternativamente, uma proteína de transposase substancialmente purificada podería ser introduzida diretamente em células, por exemplo, através de microinjeção ou através de bombardeamento de partículas.

Como parte da presente invenção, sequências de borda de transposon são incluídas em uma seqüência de DNA estranha de modo que elas repousam externamente na referida seqüência de DNA e transformam o referido DNA em uma entidade semelhante a transposon que pode se mover através da ação de uma tranposase.

Uma vez que transposons muitas vezes se reintegram em outro local do genoma do hospedeiro, segregação da prole dos hospedeiros nos quais a transposase foi deixada atuar podería ser necessária para separar hospedeiros transformados contendo, por exemplo, apenas a impressão digital do transposon e hospedeiros transformados ainda contendo o DNA estranho.

Na realização da presente invenção, o elemento genético é, de preferência, induzido a se mobilizar tal como, por exemplo, através da expressão de uma proteína recombinase na célula a qual contata o local de integração do elemento genético e facilita um evento de recombinação na mesma, excisando-se o elemento genético completamente ou, alternativamente, deixando uma "impressão digital", geralmente de cerca de 20 nucleotídeos de extensão ou mais, no local de integração original. Aqueles hospedeiros e partes de hospedeiro que tenham sido produzidos de acordo com o método da invenção podem ser identificados por meio de técnicas padrões de hibridização e/ou amplificação a fim de detectar a presença do elemento genético mobilizável ou uma estrutura genética compreendendo o mesmo. Alternativamente, no caso de células hospedeiras, tecidos e hospedeiros transformados em que o elemento genético mobilizável tenha sido excisado, é possível detectar uma impressão digital no genoma do hospedeiro a qual tenha sido deixada após o evento de excisão usando-se tais técnicas. Conforme usado aqui, o termo "impressão digital" deverá ser tomado para se referir a qualquer derivado de um elemento genético mobilizável ou estrutura genética compreendendo o mesmo, conforme descrito aqui, a qual é produzida através de excisão, deleção ou outra remoção do elemento genético mobilizável do genoma de uma célula previamente transformada com a referida estrutura genética. Uma impressão digital geralmente compreende pelo menos uma cópia simples do local de recombinação ou transposon usado para promover a excisão. Contudo, uma impressão digital pode compreender seqüências adicionais derivadas da estrutura genética, por exemplo, seqüências de nucleotídeo derivadas da seqüência da borda esquerda, da seqüência da borda à direita, origem de replicação, seqüência de codificação de transposase ou de codificação de recombinase se usada ou outras seqüências de nucleotídeo derivadas de vetor. Conseqüentemente, uma impressão digital é identificável de acordo com a seqüência de nucleotídeo do local de recombinação ou transposon da estrutura genética usada tal como, por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos correspondendo ou complementar a um sítio lox ou sítio frt. O termo "ciclo celular" significa os eventos estruturais e bioquímicos cíclicos associados ao crescimento e divisão celular e, em particular, à regulação da replicação de DNA e mitose. O ciclo celular inclui as fases denominadas: GO, Gapl (Gl) , síntese de DNA (S) , Gap2 (G2) e mitose (M) . Normalmente, essas quatro fases ocorrem seqüencialmente, contudo, o ciclo celular também inclui ciclos modificados em que uma ou mais fases estão ausentes, resultando em um ciclo celular modificado, tal como endomitose, acitocinese, poliplóide e endo-reduplicação. 0 termo "progressão do ciclo celular" se refere ao processo de passagem através das diferentes fases do ciclo celular. 0 termo "taxa de progressão do ciclo celular", conseqüentemente, se refere à velocidade com a qual as referidas fases do ciclo celular transcorrem ou os períodos de tempo requeridos para completar as referidas fases do ciclo celular.

Por um "ensaio com dois híbridos" entenda-se um ensaio que é baseado na observação de que muitos fatores de transcrição eucariotas compreendem dois domínios, um domínio de ligação a DNA (DB) e um domínio de ativação (AD) os quais, quando separados fisicamente (isto é, ruptura da ligação covalente) não realizam a expressão do gene alvo. Duas proteínas capazes de interagir fisicamente com uma das referidas proteínas fundidas ao DB e a outra das referidas proteínas fundidas ao AD reunirão os domínios DB e AD do fator de transcrição, resultando em expressão do gene alvo. O gene alvo no ensaio com dois híbridos de levedo é usualmente um gene repórter, tal como o gene da β-galactosidase. A interação entre parceiros de proteína no ensaio com dois híbridos de levedo pode, assim, ser quantificada através de medição da atividade do gene repórter resultante (Bartel e Fields 1997). Alternativamente, um sistema com dois híbridos de mamífero pode ser usado, o qual inclui, por exemplo, uma proteína verde fluorescente quimérica que codifica o gene repórter (Shioda e colaboradores, 2000).

Além disso, simulações de duplicação e remodelagem computadorizada de motivos estruturais da proteína da invenção podem ser realizadas usando-se programas de computador apropriados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 1 (1995), 675-679). O modelamento computadorizado da duplicação da proteína pode ser usado para a análise conformacional e energética de modelos detalhados de proteína e peptídeo (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). Em particular, os programas apropriados podem ser usados para a identificação de locais interativos das oxidases de citoquinina, seus ligantes ou outras proteínas de interação através de buscas auxiliadas por computador por seqüências peptídicas complementares (Fassina, Immunomethods 5 (1994) , 114-120) . Outros sistemas computadorizados apropriados para o projeto de proteínas e peptídeos são descritos na técnica anterior, por exemplo, em Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann, N. Y. Acac. Sei. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Os resultados obtidos das análises computadorizadas acima descritas podem ser usados, por exemplo, para o preparo de peptidomiméticos da proteína da invenção ou fragmentos da mesma. Tais análogos pseudopeptídicos da seqüência de aminoácidos natural da proteína podem imitar muito eficazmente a proteína original (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por exemplo, a incorporação de resíduos de Ω-aminoácidos aquirais facilmente disponíveis em uma proteína da invenção ou um fragmento da mesma resulta na substituição de ligações amino por unidades de polimetileno de uma cadeia alifática, desse modo, proporcionando uma estratégia conveniente para contrução de um peptidomimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777). Análogos peptidomiméticos superativos de hormônios de peptídeos pequenos em outros sistemas são descritos na técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Peptidomiméticos apropriados da proteína da presente invenção também podem ser identificados através da síntese de bibliotecas combinatoriais de peptidomiméticos por meio de alquilação sucessiva e testagem dos compostos resultantes, por exemplo, com relação à sua ligação, propriedades inibitórias de cinase e/ou imunológicas. Métodos para a geração e uso de bibliotecas combinatoriais de peptidomiméticos são descritos na técnica anterior, por exemplo, em Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 e Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715.

Além disso, uma estrutura tridimensional e/ou cristalográfica da proteína da invenção pode ser usada para o proketo de inibidores peptidomiméticos da atividade biológica da presente invenção da invenção (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Ruterber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

Os compostos a serem obtidos ou identificados nos métodos da invenção podem ser compostos que são capazes de se ligar a qualquer um dos ácidos nucleicos, peptídeos ou proteínas da invenção. Outros compostos interessantes a serem identificados são compostos que modulam a expressão dos genes ou das proteínas da invenção de uma forma tal que a expressão do referido gene ou proteína é intensificada ou diminuída pela ação do referido composto. Alternativamente, o composto pode exercer sua ação através de intensificação ou diminuição da atividade de qualquer uma das proteínas da invenção. Aqui, proteínas preferidas são novas oxidases de citoquinina. O referido composto ou pluralidade de compostos pode ser compreendida, por exemplo, de amostras, por exemplo, extratos de células, por exemplo, de plantas, animais ou microorganismos. Além disso, o(s) referido(s) composto(s) pode(m) ser conhecido(s) na técnica mas, até o momento, não conhecido(s) por ser(em) capaz(es)s de suprimir ou ativar proteínas que interagem com a oxidase de citoquinina. A mistura de reação pode ser um extrato isento de células ou pode compreender uma cultura de tecido ou de células. Condições adequadas para o método da invenção são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e são, por exemplo, descritas de modo geral em Alberts e colaboradores, Molecular Biology of the Cell, terceira edição (1994), em particular Capítulo 17. A pluralidade de compostos pode ser, por exemplo, adicionada à mistura de reação, meio de cultura ou injetada na célula.

Se uma amostra contendo um composto ou uma pluralidade de compostos é identificada no método da invenção, então, é possível isolar o composto da amostra original identificada como contendo o composto capaz de atuar como um agonista ou pode-se ainda subdividir a amostra original, por exemplo, se ela consiste de uma pluralidade de diferentes compostos, a fim de reduzir o número de diferentes substâncias por amostra e repetir o método com as subdivisões da amostra original. Dependendo da complexidade das amostras, as etapas descritas acima podem ser realizadas várias vezes, de preferência até que a amostra identificada de acordo com o método da invenção compreenda apenas um número limitado de ou apenas uma substância. De preferência, a referida amostra compreende substâncias ou compostos químicos e/ou propriedades físicas similares e mais preferivelmente as referidas substâncias são idênticas. De preferência, o composto identificado de acordo com o método descrito acima ou seu derivado é ainda formulado em uma forma adequada para a aplicação em cultivo de planta ou cultura de tecido e célula vegetal. O termo "vigor precoce" se refere à capacidade de uma planta de crescer rapidamente durante o desenvolvimento precoce e se refere ao estabelecimento com sucesso, após germinação, de um sistema de raiz bem desenvolvido e um aparelho fotossintético bem desenvolvido. O termo "resistência à derrubada por tempestades com vento ou chuva forte" ou "capacidade de sustentação" se refere à capacidade de uma planta de se fixar no solo. Para plantas com um hábito de crescimento ereto ou semi-ereto, esse termo também se refere à capacidade de manter uma posição erguida sob condições adversas (ambientais). Essa característica se refere ao tamanho, profundidade e morfologia do sistema de raiz. 0 termo 1enxertagem', conforme usado aqui, se refere à união das partes de duas plantas diferentes de modo que elas se ligam e a seiva pode fluir, assim, formando uma nova planta única que pode crescer e se desenvolver. Um enxerto, portanto, consiste de duas partes: (i) a parte inferior é o estoque de raiz, conforme referido aqui, e consiste essencialmente do sistema de raiz e uma parte do caule e (ii) a parte superior, o rebento ou enxerto, o qual dá origem às partes aéreas da planta.

Conforme usado aqui, tblastn se refere a uma ferramenta de alinhamento que é parte da família de programas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). O BLAST busca identificar regiões de alinhamento local ótimo, isto é, o alinhamento de alguma parte de duas seqüências de proteína ou ácido nucleico, a fim de detectar relações entre seqüências as quais compartilham apenas regiões isoladas de similaridade (Altschul e colaboradores, 1990). Na presente invenção, o tblastn do programa BLAST 2.0 suite foi usado para comparar a seqüência da proteína de oxidase de citoquinina de milho contra um banco de dados de seqüências de nucleotídeo dinamicamente traduzidas em todas as redes de leitura (Altschul e colaboradores, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)) .

Os exemplos a seguir são fornecidos à guisa de ilustração da presente invenção e não como forma de limitação. Os conteúdos de todas as referências incluídas no presente pedido são incorporados por referência aqui como se totalmente apresentados.

Exemplos Exemplo 1. Breve Descrição das Seqüências da Invenção Exemplo 2. Identificação de Genes Candidates que Codificam a Oxidase de Citoauinina de Arabidopsis Thaliana Foram identificados seis genes diferentes de Arabidopsis thaliana que portavam similaridade de seqüência a um gene da oxidase de citoquinina de milho (Morris e colaboradores, Biochem Biophys Res Comm 255:328-333, 1999;

Houda-Herin e colaboradores. Plant J 17:615-626; WO 99/06571) . Esses genes foram descobertos através de seleção de traduções em 6 redes de seqüências de nucleotídeo de bancos de dados genômicos públicos com a seqüência da proteína de milho, empregando-se o programa tblastn. Essas seqüências foram designadas como genes semelhantes à oxidase de citoquinina de Arabidopsis thaliana ou AtCKX. Eles foram arbitrariamente numerados como AtCKXl a AtCKX6. A lista abaixo resume a informação sobre esses genes. As bordas de ORF previstas e as seqüências de proteína são indicativas, de forma a ilustrar, por aproximação, a divergência da seqüência de proteína entre as oxidases de citoquinina de Arabidopsis e de milho, bem como entre as diferentes oxidases de citoquinina de Arabidopsis. As bordas de ORF e as seqüências de proteína mostradas não deverão ser tomadas como evidência conclusiva quanto ao modo de ação desses genes AtCKX. Para comparações de DNA e seqüência de proteína, o programa MegAlign da DNAstar foi usado. Esse programa usa o método Clustal para alinhamentos. Para alinhamentos múltiplos de seqüências de proteínas e cDNA, o limite gap e o limite de extensão gap foram ajustados em 10 cada uma. Para alinhamentos aos pares de proteínas, os parâmetros eram como segue: Ktuple em 1; Limite gap em 3; janela em 5; diagnósticos salvos em 5. Para alinhamentos aos pares dos cDNA's, os parâmetros eram como segue: Ktuple em 2; Limite gap em 5; janela em 4; diagnósticos salvos em 4. Os grupos de similaridade para alinhamentos de proteínas eram: (M,I,L,V), (F,W,Y), (G,A), (S,T), (R,K,H), (E,D), (N,Q). Os valores que são indicados entre as seqüências de proteína e cDNA de Arabidopsis representam os maior e menor valores encontrados com todas as combinações. A. Nome do Gene: AtCKXl (proteína 1 semelhante à oxidase de citoquinina de Arabidopsis thaliana, ID DE SEQ NO: 1) Localização no banco de dados (número de adesão, localização no bac): AC002510, seção 225 de 255 da seqüência completa do cromossoma II de Arabidopsis thaliana. Seqüência de clones T32G6. ORF prevista no banco de dados: 15517..16183, 16415..16542, 16631..16891, 16995..17257, 17344..17752 A seqüência do cdna de AtCKXl é listada como ID DE SEQ NO: 25.

Seqüência prevista de proteína: ID DE SEQ NO: 2: Homologias Identidade % com cDna de Z. mays: 31,5% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com proteína de Z. mays: 32,2% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) identidade % com outros cDNA's de Arabidopsis (faixa): 38,2% (AtCKX2) - 54,1% (AtCKX6) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com outras proteínas de Arabidopsis (faixa): 37,1% (AtCKX2) - 58,1% (AtCKX6) (Dnastar/MegAlign -método Clustal) B. Nome do Gene: AtCKX2 (proteína 2 semelhante à oxidase de citoquinina de Arabidopsis thaliana, ID DE SEQ NO: 3) Localização no banco de dados (número de adesão, localização no bac) : AC005917, seção 113 de 255 da seqüência completa do cromossoma II de Arabidopsis thaliana. Seqüência de clones F27F23, F3P11. ORF prevista no banco de dados: complemento, 40721..41012, 41054..41364, 41513..41770, 42535.. 42662, 43153..43711 Por favor observar: A seqüência de cDNA identificada pelo inventor usando o programa de previsão de gene NetPlantGene (http://www.cbs.dtu.dk/Services/NetGene2/) era diferente daquela anotada no banco de dados. Baseado sobre a nova seqüência de cDNA, a ORF prevista no banco de dados foi revista: complemento, 40721..41012, 41095..41364, 41513..41770, 42535.. 42662, 43153..43711 A seqüência de proteína codificada por esse cDNA é listada como ID DE SEQ NO: 4. O cDNA de AtCKX2 foi clonado através de RT-PCR a partir de RNA total de tecido de planta transgênica AtCKX2 com o kit de RT-PCR em uma-etapa (Qiagen, Hilden, Alemanha) e seqüenciado usando-se um kit de reação de seqüenciamento em ciclos ABI PRISM Big Dye Terminator (Perkin Elmer Applied Biosystems Division).

Isso confirmou que a seqüência de cDNA identificada e prevista pelo inventor estava correta. A nova seqüência de cDNA de AtCKX2 é listada como ID DE SEQ NO: 26. Um fragmento de 84-bp correspondendo aos nucleotideos 1171 a 1254 do cDNA de AtCKX2 é listado como ID DE SEQ NO: 31. A seqüência de peptídeo correspondente dessa seqüência de cDNA de 84-bp cDNA é listada como ID DE SEQ NO: 32. Homoloaias Identidade % com cDna de Z. mays: 38,4% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com proteína de Z. mays: 37,5% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) identidade % com outros cDNA's de Arabidopsis (faixa): 34,9% (AtCKX6) - 64,5% (AtCKX4) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com outras proteínas de Arabidopsis (faixa) : 36,5% (AtCKX6) - 66,1% (AtCKX4) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) C. Nome do Gene: AtCKX3 (proteína 3 semelhante à oxidase de citoquinina de Arabidopsis thaliana, ID DE SEQ NO: 5) Localização no banco de dados (número de adesão, localização no bac) : AB024035, DNA genômico de Arabidopsis thaliana, cromossoma 5, clone PI: MHM17, seqüência completa.

Sem previsão da ORF no banco de dados. O gene foi identificado pelo inventor usando-se vários programas de previsão de gene, incluindo GRAIL (ftp: //arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan (http://CCR- 081.mit.edu/GENSCAN html) e NetPlantGene (http://www.cbs.dtu.dk/Services/NetGene2/): complemento, 29415..29718, 29813..30081, 30183 ..30443, 30529. .30656, 32107..32716 A nova sequência de cDNA de AtCKX3 identificado pelo inventor é listada como ID DE SEQ NO: 27 Secrüência prevista de proteína, baseado na previsão da própria ORF: ID DE SEQ NO: 6 Homologias Identidade % com cDNA de Z. mays: 38,7% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com proteína de Z. mays: 39,2% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) identidade % com outros cDNA's de Arabidopsis (faixa): 38,8% {AtCKX6) - 51,0% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com outras proteínas de Arabidopsis (faixa): 39,9% (AtCKX6) - 46,7% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) D. Nome do Gene: AtCKX4 (proteína 4 semelhante à oxidase de citoquinina de Arabidopsis thaliana, ID DE SEQ NO: 7) Localização no banco de dados (número de adesão, localização no bac): 1) AL079344, cromossoma 4 de DNA de Arabidopsis thaliana, clone BAC T16L4 (projeto ESSA) 2) AL161575, cromossoma 4 de DNA de Arabidopsis thaliana, fragmento contíguo No. 71. ORF prevista no banco de dados: 1) 76187..76814, 77189..77316, 77823..78080, 78318.. 78586, 78677..78968 2) 101002..101629, 102004..102131, 102638..102895, 103133.. 103401, 103492..103783 A seqüência de cDNA de AtCKX4 é listada como ID DE SEQ NO: 2 8 Seqüência de proteína prevista: ID DE SEQ NO: 8 Homoloqias Identidade % com cDNA de Z. mays: 41,0% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com proteína de Z. mays: 41,0% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) identidade % com outros cDNA's de Arabidopsis (faixa): 35,2% (AtCKX6) - 64,5% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com outras proteínas de Arabidopsis (faixa): 35,1% (AtCKX6) - 66,1% (AtCKX2) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) E. Nome do Gene: AtCKX5 (proteína 5 semelhante à oxidase de citoquinina de Arabidopsis thaliana, ID DE SEQ NO: 9) Localização no banco de dados (número de adesão, localização no bac): AC023754, F1B16, seqüência completa, cromossoma 1 Sem previsão da ORF no banco de dados. O gene foi identificado pelos inventores usando-se vários programas de previsão de gene, incluindo GRAIL (ftp://arthur.epm.ornl.gov/pub/xgrail), Genscan (http://CCR-081.mit.edu/ GEN SCAN.html) e NetPlantGene (http ://www.cbs.dtu.dk/Services/ NetGene2/) . 43756..44347, 44435..44562, 44700..44966, 45493..45755, 46200..46560 A nova seqüência de cDNA de AtCKX5 identificada e prevista pelo inventor é listada como ID DE SEQ NO: 29. A

seqüência de proteína prevista para esse cDNA é listada como ID DE SEQ NO: 10. Um segundo códon inicial ATG potencial está presente 9 nucleotídeos mais a montante na seqüência genômica. Não é claro qual desses 2 códons iniciais codifica o primeiro aminoácido da proteína. Portanto, um segundo cDNA de AtCKX5 potencial começando nesse códon inicial a montante também é listado na presente invenção como ID DE SEQ NO: 34. A seqüência genômica correspondente é listada como ID DE SEQ NO: 33 e a proteína codificada como ID DE SEQ NO: 35.

Homolocrias Identidade % com cDNA de Z. mays: 39,1% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com proteína de Z. mays: 36,6% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) identidade % com outros cDNA's de Arabidopsis (faixa): 40,1% (AtCKX2) - 44,0% (AtCKX3) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com outras proteínas de Arabidopsis (faixa) : 41,6% (AtCKX4) - 46,4% (AtCKX6) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) F. Nome do Gene: AtCKX6 (proteína 6 semelhante à oxidase de citoquinina de Arabidopsis thaliana, ID DE SEQ NO: 11) Localização no banco de dados (número de adesão, localização no bac) : AL163818, cromossoma 3 de DNA de Arabidopsis thaliana, clone PI MAA21 (projeto ESSA). ORF prevista no banco de dados: 46630..47215, 47343..47470, 47591..47806, 47899..48161, 48244..48565 A seqüência de cDNA de AtCKX6 é listada como ID DE SEQ NO: 3 0 Seqüência de proteína prevista: ID DE SEQ NO: 12 Homologias Identidade % com cDNA de Z. mays: 37,3% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com proteína de Z. mays: 36,1% (Dnastar/MegAlign - método Clustal) identidade % com outros cDNA's de Arabidopsis (faixa): 34,9% (AtCKX2) - 54,1% (AtCKXl) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) similaridade % com outras proteínas de Arabidopsis (faixa): 35,1% {AtCKX4) - 58,1% (AtCKXl) (Dnastar/MegAlign - método Clustal) Os genes AtCKX3 e AtCKX5 não foram anotados como oxidases de citoquinina putativas no banco de dados e as ORFs para esses genes não foram fornecidas. Além disso, a ORF (e, conseqüentemente, as estruturas de proteína) prevista para o AtCKX2 era diferente de sua própria previsão e nossa previsão foi confirmada por meio de seqüenciamento do cDNA de AtCKX2.

Uma comparação da estrutura do genes AtCKX 1 a 4 de Arabidopsis e o gene CKX de milho é mostrada na Fig 1.

As proteínas previstas codificadas pelos genes AtCKX de Arabidopsis mostrou similaridade de sequência entre 32% e 41% com a proteína de milho, ao passo que elas mostraram entre 35% e 66% de similaridade de seqüência umas com as outras. Devido a essa conservação de seqüência reduzida, não está claro, a priori, se os genes AtCKX de Arabidopsis codificam proteínas com atividade de oxidase de citoquinina. Um alinhamento das proteínas previstas 1 a 4 de AtCKX de Arabidopsis e o gene CKX de milho é mostrado na Fig 2.

Exemplo 3. Plantas Transaênicas Superexpressando AtCKXl Mostraram Atividade de Oxidase de Citoquinina Aumentada e Morfologia Alterada da Planta 1. Descrição do Processo de Clonagem Os "primers" a seguir foram usados para amplificar, por meio de PCR, o gene AtCKXl de Arabidopsis thaliana, adesao ao Columbia (as seqüências nao homólogas usadas para a clonagem estão em letras minúsculas): Seqüência do "primer" 5': cggtcgacATGGGATTGACCTCATCCTTACG (ID DE SEQ NO:13) seqüência do "primer" 3': gcgtcgacTTATACAGTTCTAGGTTTCGGCAGTAT (ID DE SEQ NO: 14) Um fragmento de PCR de 2235-bp, amplificado por esses "primer"s, foi inserido no sítio Sal I do pUC19. O inserto foi seqüenciado e confirmou-se que o produto da amplificação por PCR não continha quaisquer mutações. 0 fragmento Sall/Sall desse vetor foi subclonado no sítio Sall a jusante de um promotor CaMV 35S modificado (portando três seqüências operadoras de tetraciclina) no vetor binário pBinHyg-Tx (Gatz e colaboradores., 1992). A estrutura resultante foi introduzida em tabaco e Arabidopsis thaliana através de transformação Agrobacterium-mediada, usando-se protocolos padrões de transformação. 2. Análise Molecular das Linhagens Transgênicas Foram identificadas várias linhagens transgênicas que sintetizam o transcrito AtCKXl em altos níveis (Fig 3). linhagens transgênicas expressando o transcrito AtCKXl também mostraram atividade de oxidase de citoquinina aumentada, quando determinado por meio de um ensaio padrão para atividade de oxidase de citoquinina, baseado na conversão de [2-3H]iP em adenina, conforme descrito (Motyka e colaboradores., 1996). Isso é exemplificado por 2 linhagens de tabaco e 2 de Arabidopsis na Tabela 6. Esse resultado prova que o gene AtCKXl codifica uma proteína com atividade de oxidase de citoquinina.

Tabela 6. Atividade de Oxidase de Citoquinina em Tecidos de Plantas Transgênicas AtCKXl 3. Descrição Fenotípica das Linhagens Transgênicas 3.1 Em tabaco: As plantas tinham um fenótipo de nanismo com dominância apical reduzida (Figuras 7Af B e C) e produção aumentada da raiz (Figura 8).

Cinco categorias de fenótipo: 1) forte - 2 clones 2) intermediário - 3 clones 3) fraco - 4 clones 4) plantas altas (como TS) com inflorescência larga - 5 clones 5) similar ao TS, 9 clones Altura (veja Figs. 7B e C) TS: entre 100-150 cm fraco: aproximadamente 75 cm intermediário: apr. 40-45 cm (caule principal ap. 25 cm mas supercrescimento por ramificações laterais, forte: apr. 10 cm Os transgênicos AtCKXl-48 e AtCKXl-50 mostraram um fenótipo forte. Abaixo estão as medições para alongamento do caule quando comparado a plantas TS: Experimental: As plantas foram desenvolvidas no solo em uma estufa. Os dados foram coletados de pelo menos dez plantas por linhagem.

Folhas (veia Figuras 7D e E) O formato das folhas de expressores transgênicos AtCKXl de era lanceolado (mais longo e estreito): a proporção largura-para-comprimento de folhas maduras foi reduzida de 1:2 nas plantas do tipo silvestre para 1:3 em transgênicos AtCKXl (Figura 7E) . 0 número de folhas e a superfície da folha eram reduzidos, comparado ao TS (veja Figura 7D) . Uma diferença acentuada também foi observada quanto à progressão da senescência da folha. Em tabaco TS, a senescência da folha começa na maioria das folhas basais e leva a uma redução uniforme do pigmento da folha (Figura 7E). Em contraste, o envelhecimento de folhas de plantas que expressam fortemente o AtCKXl permaneceu verde ao longo dos veios da folha e se tornou amarelo nas regiões intercostais, indicando senescência alterada da folha. A textura das folhas mais velhas era mais rígida.

Raízes Plantas desenvolvidas in vitro expressando o gene eram facilmente distinguíveis do TS por sua capacidade de formar mais raízes, as quais eram mais espessas (mais fortes) (Figura 8A) , bem como pela formação de raízes aéreas ao longo do caule. A raiz primária era mais longa e o número de raízes laterais e adventícias era maior, conforme ilustrado na Figura 8C para muda superexpressando AtCKXl-50 (veja também Exemplo 9) . A curva de dose-resposta de inibição do crescimento da raiz por citoquinina exógena mostrou que raízes de mudas transgênicas são mais resistentes à citoquinina do que as raízes TS (Figura 8D). A resistência de transgênicos AtCKXl a iPR era menos acentuada do que para o AtCKX2, o que é consistente com as menores alterações em citoquininas do tipo iP no último (veja Tabela 10).

Um grande aumento na biomassa da raiz foi observada para plantas adultas desenvolvidas no solo (veja Figura 8B para uma planta desenvolvida no solo durante 4 a 5 meses), a despeito do fato de que o crescimento das partes aéreas da planta era altamente reduzido.

Distância internódulo • fenótipo intermediário: o 5o internódulo abaixo da inflorescência tem cerca de 2,5 cm de comprimento e o 9o internódulo tinha cerca de ,5 cm de comprimento, comparado a 5 cm e 2 cm de comprimento para os 5 o e 9o internódulos, respectivamente, em plantas TS.

• fenótipo forte: planta AtCKXl-50 O comprimento do 20° internódulo a partir do fundo medido no dia 131 apos germinação era de 1,3 ± 0,4 mm comparado a 39,2 ± 3,8 mm para TS

Dominância aoical e ramificação Mais ramificações laterais foram formadas, indicando dominância apical reduzida, comparado a plantas TS durante o crescimento vegetativo (veja Figura 9) . As ramificações laterais se superdesenvolveram no caule principal, atingindo uma altura de 40-45 cm para expressores AtCKXl intermediários. Mesmo ramificações secundárias apareceram. Contudo, os brotos não eram completamente liberados de dominância apical, isto é, brotos laterais não continuaram a se desenvolver realmente. A dominância apical reduzida podería ser devido à produção reduzida de auxina pelo menor meristema apical do broto (veja Exemplo 10).

Desenvolvimento reprodutivo O início de floração em transgênicos AtCKXl era retardado, o número de flores e o rendimento de semente por cápsula era reduzido. O tamanho das flores não era alterado em plantas transgênicas e o peso das sementes individuais era comparável ao peso de sementes de plantas do tipo silvestre. Dados para dois transgênicos AtCKXl representativos são resumidos abaixo: A. Início de floração Experimental: Dados coletados para pelo menos 10 plantas por linhagem. O alongamento total da primeira flor foi definido como início de floração. DAG = dias após germinação. B. Número de cápsulas de semente por planta Experimental: O número de cápsulas de semente foi determinado em pelo menos 5 plantas diferentes. Por favor observe que essas plantas foram desenvolvidas sob condições em uma estufa durante o inverno. Isso afeta negativamente o número de flores que são formadas, em particular nos clones transgênicos. Contudo, o quadro geral de que elas formam um número reduzido de flores está correto, n.d., não determinado. C. Rendimento das sementes/cápsula (mg) Experimental; 0 rendimento das sementes foi determinado para pelo menos 12 cápsulas de sementes. O tamanho das cápsulas de semente era muito variável, conseqüentemente, existiam maiores desvios padrões, n.d., não determinado. D. Peso de 100 sementes (mg) Experimental: A biomassa de sementes foi determinada como o peso de 100 sementes de pelo menos 5 cápsulas de sementes diferentes.n.d., não determinado. 3.2 Em Arabidovsis início de germinação era o mesmo para TS o sistema total de raízes era aumentado e o número de raízes laterais e raízes adventícias era aumentado (veja Figuras 4A a D) o crescimento de órgãos aéreos era reduzido, resultando em um fenótipo de nanismo (veja Figuras 4E e F) e a biomassa da folha era reduzida. A formação de folhas e flores é retardada o ciclo de vida era mais longo comparado ao TS e o rendimento das sementes era menor comparado ao TS.

Os dados morfométricos a seguir ilustram esses fenótipos: Desenvolvimento da raiz A. Comprimento Total do Sistema de Raízes B. Comprimento da Raiz Primária C. Comprimento das Raízes Laterais (LR) D. Comprimento das Raízes Adventícias E. Número de Raízes Laterais (LR) F. Número de Raízes Adventícias (AR) Experimental: Medições foram realizadas em plantas 8 dias após germinação in vitro sobre meio MS. Pelo menos 17 plantas por linhagem foram classificadas.

Desenvolvimento do Broto A. Superfície da Folha Experimental: A área da superfície da folha de folhas com rosetas principais formadas 30 dias após germinação foi medida. 3 plantas por clone foram analisadas.

Desenvolvimento reprodutivo Início de floração Experimental: Plantas foram desenvolvidas sob condições de uma estufa. Pelo menos 13 plantas por clone foram analisadas. DAG = dias após germinação.

Conclusão: A análise de plantas Arabidopsis transgênicas AtCKXl confirmou grandemente os resultados obtidos em tabaco e indica a natureza geral das conseqüências de um teor reduzido de citoquinina. O sistema total de raízes foi aumentado (o comprimento total da raiz foi aumentado em aproximadamente 110-140% em transgênicos AtCKXl), o broto se desenvolveu mais lentamente (floração retardada) e a biomassa da folha era reduzida. O rendimento de semente era menor nos transgênicos também.

Exemplo 4. Plantas transgênicas superexpressando AtCKX2 mostraram atividade de oxidase de citoquinina e morfologia alterada da planta. 1. Descrição do processo de clonagem Os "primers" a seguir foram usados para amplificar por meio de PCR o gene AtCKX2 de Arabidopsis thaliana, Columbia adesao (as seqüências nao homólogas usadas para clonagem estão em letras minúsculas): Seqüência do "primer" 5': gcggtaccAGAGAGAGAAACATAAACAAATGGC (ID DE SEQ NO:15) Seqüência do "primer" 3': gcggtaccCAATTTTACTTCCACCAAAATGC (ID DE SEQ NO:16) Um fragmento de PCR de 3104-bp, amplificado através desses "primers", foi inserido no sítio Kpnl do pUC19. 0 inserto foi seqüenciado para verificar que nenhuma diferença na seqüência publicado era introduzida pelo procedimento de PCR. 0 fragmento Kpnl/Kpnl desse vetor foi subclonado no sítio Kpnl a jusante de um promotor CaMV 35S modificado (portando três seqüências operadoras de tetraciclina) no vetor binário pBinHyg-Tx (Gatz e colaboradores., 1992). A estrutura resultante foi introduzida em tabaco e Arabidopsis thaliana através de transformação Agrobacfcerium-mediada, usando-se protocolos padrões de transformação. 2. Análise molecular das linhagens transgênicas Várias linhagens transgênicas foram identificadas, as quais sintetizam o transcrito AtCKX2 em níveis elevados (Fig 6) . linhagens transgênicas expressando o transcrito AtCKX2 também mostraram atividade aumentada de oxidase de citoquinina. Isso é exemplificado para 2 linhagens de tabaco e 3 de Arabidopsis na Tabela 7. Esse resultado prova que o gene AtCKX2 codifica uma proteína com atividade de oxidase de citoquinina.

Tabela 7. Atividade de Oxidase de Citoquinina em Tecidos de Plantas Transgênicas AtCKX2 3. Descrição Fenotíoica das Linhagens Transaênicas 3.1 Em tabaco (veia Fiqs 7 a 10): Três categorias de fenótipo: 1) forte - 15 clones (similar ao fenótipo intermediário de AtCKXl) 2) fraco - 6 clones 3) outros - similar às plantas TS, 7 clones Partes Aéreas da Planta As observações referentes à altura da planta, distância internódulos, forma da folha e amarelamento eram similares aos transgênicos AtCKXl com algumas diferenças quantitativas geralmente mínimas pelo fato de que as características de nanismo eram mais graves nos transgênicos AtCKXl do que nos transgênicos AtCKX2 (comparar plantas AtCKXl com plantas AtCKX2 nas Figuras 7A e B) . Isso é ilustrado abaixo com relação às medições de alongamento do caule e distância internódulo de clones com um fenótipo forte AtCKX2-38 e AtCKX2-40: Alongamento do Caule Experimental: As plantas foram plantas no solo em uma estufa. Os dados foram coletados de pelo menos dez plantas por linhagem.

Distância internódulo Experimental: O comprimento do 20° internódulo a partir da parte inferior foi medida no dia 131 após germinação.

Raízes Plantas desenvolvidas in vitro expressando grandemente o gene eram facilmente distinguíveis das plantas TS por sua capacidade de formar mais raizes, as quais são mais espessas (mais fortes), bem como pela formação de raízes aéreas ao longo do caule. A raiz primária era mais longa e o número de raízes laterais e adventícias era maior, conforme ilustrado na Figura 8C com relação a mudas superexpressando AtCKX2-38 (veja também Exemplo 9) . A curva de dose-resposta de inibição do crescimento da raiz pela citoquinina exógena mostrou que raízes de mudas transgênicas eram mais resistentes à citoquinina do que as raízes TS (Figura 8D). A resistência dos transgênicos AtCKXl-28 à iPR era menos acentuada do que para o AtCKX2-38, o qual é consistente com as menores alterações nas citoquininas do tipo iP no último (veja Tabela 10).

Um aumento no peso fresco e seco da biomassa da raiz de linhagens TO de plantas transgênicas AtCKX2 comparado ao TS foi observado para plantas cultivadas no solo, conforme ilustrado na tabela a seguir: Experimental: Seis plantas TS e seis linhagens TO independentes do clone 35S::AtCKX2 foram cultivadas no solo. Após floração, o sistema de raízes foi lavado com água, o solo foi removido tão logo possível e o peso fresco e peso seco foram medidos. Um aumento no peso fresco e seco da biomassa da raiz também foi observado para a prole F1 de transgênicos AtCKX2 hidroponicamente cultivados quando comparado ao TS, conforme ilustrado na tabela a seguir: Experimental: Plantas cultivadas no solo foram transferidas 60 dias após germinação para um sistema hidropônico (solução de Hoagland) e cultivadas durante mais 60 dias. A solução hidropônica foi aerada continuamente e substituída por solução fresca a cada três dias.

Em resumo, plantas transgênicas desenvolvidas em solução hidropônica formaram aproximadamente 65-150% mais biomassa de raiz (peso fresco) do que as plantas do tipo silvestre. 0 aumento no peso seco era de 10-50%. Essa diferença é possivelmente devido, em parte, ao volume maior de células dos transgênicos. Isso reduz a porção relativa das paredes celulares, as quais formam o grosso da matéria seca. A biomassa dos brotos era reduzida em 20%-70% dos brotos do tipo silvestre. A diferença no peso fresco leva a um desvio na proporção broto/raiz, o qual era de aproximadamente 8 no tipo silvestre, mas aproximadamente 1 nos clones transgênicos.

Conclusão: Um aumento no crescimento e biomassa das raízes foi observado para mudas transgênicas AtCKX2 e plantas adultas desenvolvidas sob diferentes condições, comparado aos controles TS a despeito do fato de o crescimento das partes aéreas das plantas ser reduzido. Diferenças quantitativas foram observadas entre as diferentes plantas transgênicas: maiores aumentos na biomassa da raiz eram observados para os clones com expressão mais forte.

Desenvolvimento Reprodutor 0 início de floração nos transgênicos AtCKX2 era retardado e o rendimento de semente por cápsula era reduzido. Esses efeitos eram muito similares àqueles observados nas plantas transgênicas AtCKXl, mas eles eram menos pronunciados nos transgênicos AtCKX2, conforme indicado nas tabelas abaixo. O tamanho das flores não era alterado em plantas transgênicas e o peso das sementes individuais era comparável ao peso de sementes de plantas do tipo silvestre. A. Início de Floração Experimental: Dados coletados para pelo menos dez plantas por linhagem. O alongamento total da primeira flor foi definido como início de floração. DAG = dias após germinação. B. Número de Cápsulas de Semente por Planta Experimental: 0 número de cápsulas de semente foi determinado em pelo menos 5 plantas diferentes. Favor observar que essas plantas foram desenvolvidas sob condições de uma estufa durante o inverno. Isso afeta negativamente o número de flúores que é formado, em particular nos clones transgênicos. Contudo, o quadro geral de que eles formam um número reduzido de flores está correto, n.d., não determinado. C. Rendimento da Semente/Cápsula (mg) Experimental; 0 rendimento da semente foi determinado para pelo menos 12 cápsulas de semente. O tamanho das cápsulas de semente era muito variável, conseqüentemente, maiores os desvios padrões, n.d., não determinado. D. Peso de 100 Semente (ma) Experimental: A biomassa das sementes foi determinada como o peso de 100 sementes de pelo menos 5 cápsulas de sementes diferentes, n.d., não determinado. 3.2 Em Arabidopsis: Os dados morfométricos a seguir foram obtidos para transgênicos AtCKX2: Desenvolvimento da raiz A. Comprimento Total do Sistema de Raízes B. Comprimento da Raiz Primária C. Comprimento das Raízes Laterais D. Comprimentos das Raízes Adventícias E. Número de Raízes Laterais (LR) F. Número de Raízes Adventícias (AR) Experimental; As medições foram realizadas em plantas 8 d.a.g. in vitro sobre meio MS. Pelo menos 17 plantas por linhagem foram classificadas.

Desenvolvimento de Brotos Superfície da Folha Experimental: A área da superfície da folha de folhas da roseta principal formadas após 30 duas após germinação foi medida. 3 plantas por clone foram analisadas. Desenvolvimento reprodutor Início de Floração Experimental: As plantas foram desenvolvidas sob condições de uma estufa. Pelo menos 13 plantas por clone foram analisadas. DAG = dias após germinação.

Conclusão: Transgênicos de Arabidopsis AtCKX2 tinham uma biomassa da folha reduzida e um fenótipo de nanismo similar aos transgênicos AtCKXl (comparar Figura 5 com a Figura 4F). 0 sistema de raízes total também era aumentado em Arabidopsis transgênica AtCKX2. O comprimento total das raízes é aumentado em aproximadamente 50% em transgênicos AtCKX2. Os transgênicos AtCKXl têm raízes primárias mais longas, mais raízes laterais e formam mais raízes adventícias. Os transgênicos AtCKX2 carecem do crescimento intensificado da raiz primária, mas formam mais raízes laterais e raízes adventícias do que o TS.

Sumário: Os fenótipos observados para os transgênicos AtCKX2 eram muito similares, mas não idênticos, aos transgênicos AtCKXl os quais, por sua vez, eram muito similares, mas não idênticos, is resultados obtidos para os transgênicos de tabaco. Isso confirma a natureza geral das conseqüências de um teor reduzido de citoquinina nessas duas espécies de planta e, portanto, fenótipos similares podem ser esperados em outras espécies de plantas também. A principal diferença entre o tabaco e Arabidopsis é a falta de crescimento intensificado da raiz primária em plantas superexpressando AtCKX2.

Exemplo 5. Plantas transgênicas superexpressando AtCKX3 mostraram atividade aumentada de oxidase de citoquinina e morfologia alterada da planta. 1. Descrição do Processo de Clonagem Os "primers" a seguir foram usados para amplificar por meio de PCR o gene AtCKX3 de Arabidopsis thaliana, Columbia adesao (as seqüências nao homólogas usadas para clonagem estão em letras minúsculas): Seqüência do "primer" 5': gcggtaccTTCATTGATAAGAATCAAGCTATTCA (ID DE SEQ NO:17) Seqüência do "primer" 3': gcggtaccCAAAGTGGTGAGAACGACTAACA (ID DE SEQ NO:18) Um fragmento de PCR de 3397-bp, produzido através dessa amplificação por PCR, foi inserido no sítio Kpnl do pBluescript. O inserto foi seqüenciado a fim de confirmar se o produto de PCR não tinha alterações de seqüência quando comparado ao gene. 0 fragmento Kpnl/Kpnl desse vetor foi subclonado no sítio Kpnl a jusante de um promotor CaMV 35S modificado (portanto três seqüências operadoras de tetraciclina) no vetor binário pBinHyg-Tx (Gatz e colaboradores., 1992). A estrutura resultante foi introduzida em tabaco e Arabidopsis thaliana através de transformação Agrobacterium-mediada, usando-se protocolos padrões de transformação. 2. Análise Molecular das Linhagens Transaênicas Varias linhagens de tabaco transgênico foram identificadas, as quais sintetizam o transcrito AtCKX3 em altos níveis (Fig 11A) . linhagens de tabaco transgênico expressando o transcrito AtCKX3 também mostraram atividade aumentada de oxidase de citoquinina. Isso é exemplificado por três plantas na Tabela 8. Isso prova que o gene AtCKX3 codifica uma proteína com atividade de oxidase de citoquinina.

Tabela 8. Atividade de Oxidase de Citoquinina em Tecidos de Plantas Transqênicas AtCKX4 3. Análise Fenotínica da Planta Os fenótipos gerados através de superexpressão do gene AtCKX3 em tabaco e Arabidopsis eram basicamente similares àqueles de plantas expressando AtCKXl e AtCKX2, isto é, enraizamento intensificado e nanismo. Contudo, a superexpressão do gene AtCKX3 em tabaco resultou em um fenótipo mais forte comparado ao AtCKX2. Nesse sentido, a superexpressão do AtCKX3 era mais similar à superexpressão do AtCKXl.

Exemplo 6. Plantas Transgênicas Superexpressando AtCKX4 Mostraram Atividade de Oxidase de Citoauinina Aumentada e Morfolocria Alterada da Planta 1. Descrição do Processo de Clonagem Os "primers" a seguir foram usados para amplificar por meio de PCR o gene AtCKX4 de Arabidopsis thaliana, Columbia adesao (as seqüências nao homólogas usadas para clonagem estão em letras minúsculas): Seqüência do "primer" 5': gcggtaccCCCATTAACCTACCCGTTTG (ID DE SEQ NO:19) Seqüência do "primer" 3': gcggtaccAGACGATGAACGTACTTGTCTGTA (ID DE SEQ NO:20) Um fragmento de PCR de 2890-bp, produzido através dessa amplificação por PCR, foi inserido no sítio Kpnl do pBluescript. O inserto foi seqüenciado a fim de confirmar se o produto de PCR não tinha aliterações de seqüência quando comparado ao gene. O fragmento Kpnl/Kpnl desse vetor foi subclonado no sítio Kpnl a jusante de um promotor CaMV 35S modificado (portando três seqüências operadoras de tetraciclina) no vetor binário pBinHyg-Tx (Gatz e colaboradores., 1992). A estrutura resultante foi introduzida em tabaco e Arabidopsis thaliana através de transformação Agrobacterium-mediada, usando-se protocolos padrões de transformação. 2 . Análise Molecular das Linhagens Transcrênicas Várias linhagens de tabaco transgênico sintetizaram o transcrito AtCKX4 em níveis elevados (Fig 11B). Linhagens transgênicas expressando o transcrito AtCKX4 também mostraram atividade de oxidase de citoquinina aumentada. Isso é exemplificado por 3 linhagens de Arabidopsis e 3 de tabaco na Tabela 9. Esse resultado prova que o gene AtCKX4 codifica uma proteína com atividade de oxidase de citoquinina.

Tabela 9. Atividade de Oxidase de Citoquinina em Tecidos de Plantas Transgênicas AtCKX4 No geral, os dados mostraram que o valores de Kn, evidentes para as quarto oxidases de citoquinina estavam na faixa de 0,2 a 9,5 μΜ com iP como substrato, o que ainda demonstra que as proteínas codificadas por AtCKXl a 4 são, na verdade, enzimas oxidase de citoquinina conforme divulgado aqui. 3. Análise Fenotípica das Plantas Os fenótipos gerados através de superexpressão do gene AtCKX4 em tabaco e Arabidopsis eram basicamente similares àqueles de plantas expressando AtCKXl e AtCKX2, isto é, enraizamento intensificado, dominância apical reduzida, nanismo e amarelamento de regiões intercostais em folhas mais velhas de tabaco. Um fenótipo adicional em tabaco era folhas lanceoladas (proporção comprimento-para-largura alterada).

Observações Gerais de Plantas de Tabaco Expressando AtCKX

No global, as análises fenotípicas demonstraram que a superexpressão do gene AtCKX causou alterações drásticas no desenvolvimento nos brotos das plantas e no sistema de raízes em tabaco, incluindo desenvolvimento intensificado do sistema de raízes e nanismo da parte aérea da planta. Outros efeitos tais como senescência alterada da folha, formação de raízes adventícias sobre os caules e outros também foram observados, conforme divulgado aqui. As alterações eram muito similares, mas não idênticas, nos diferentes genes. Em tabaco, aquelas que superexpressam AtCKXl e AtCKX3 eram semelhantes às AtCKX2 e AtCKX4. Geralmente, os dois primeiros mostraram maior expressão de traços, particularmente no broto. Portanto, um gene de oxidase de citoquinina em particular pode ser preferido para obtenção dos fenótipos que são descritos nas modalidades da presente invenção.

Exemplo 7. Clonagem do Gene AtCKX5 Os seguintes "primers" foram usados para amplificar por meio de PCR o gene AtCKX5 de Arabidopsis thaliana, Columbia adesao (as seqüências nao homólogas usadas para clonagem estão em letras minúsculas): Seqüência do "primer" 5': qqqqtaccTTGATGAATCGTGAAATGAC (ID DE SEQ NO:21) Seqüência do "primer" 3': ggggtaccCTTTCCTCTTGGTTTTGTCCTGT (ID DE SEQ NO:22) A seqüência do "primer" 5' inclui os dois códons iniciais potenciais da proteína AtCKX5, o códon inicial mais próximo de 5' está sublinhado e um segundo ATG está indicado em itálico.

Um fragmento de 2843-bp, produzido através dessa amplificação por PCR, foi inserido como um produto com extremidade cega no vetor de clonagem pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen).

Exemplo 8. Clonagem do Gene AtCKX6 Os "primers" a seguir foram usados para amplificar por meio de PCR o gene AtCKX6 de Arabidopsis thaliana, Columbia adesao (as seqüências nao homólogas usadas para clonagem estão em letras minúsculas): Seqüência do "primer" 5': gctctagaTCAGGAAAAGAACCATGCTTATAG (ID DE SEQ NO:23) Seqüência do "primer" 3': gctctagaTCATGAGTATGAGACTGCCTTTTG (ID DE SEQ NO:24) Um fragmento de PCR de 1949-bp, produzido através dessa amplificação por PCR, foi inserido como um produto com extremidade cega no vetor de clonagem pCR-Blunt II-TOPO (Invitrogen).

Exemplo 9. Teste de Crescimento de Mudas de Tabaco Demonstrou Vigor Precoce de Transgênicos AtCKX

Sementes de transgênicos superexpressando AtCKXl-50 e AtCKX2-38 e tabaco TS foram plantados in vitro sobre meio MS, em uma sala de cultura 4 dias após tratamento contra frio e germinadas após 6 dias. Observações sobre o crescimento das mudas foram feitas 10 dias após germinação (veja também Figura 8C) e são resumidas abaixo. Pelo menos 20 indivíduos foram classificados por clone. Dados similares foram obtidos em dois outros experimentos. A. Comprimento Total do Sistema de Raízes B. Comprimento da Raiz Primária C. Comprimento das Raízes Laterais D. Comprimento das Raízes Adventícias E. Número de Raízes Laterais (LR) F. Número de Raízes Adventícias (AR) Plantas AtCKXl e AtCKX2, Observações Gerais: Mudas de plantas de tabaco superexpressando AtCKXl e AtCKX2 tinham 60% mais raízes adventícias e três vezes mais raízes laterais do que as plantas de controle não transformadas 10 dias após germinação. O comprimento da raiz primária era aumentado em cerca de 70%. Isso - junto com mais raízes laterais e raízes secundárias e mais longas - resultou em um aumento de 70-100% no comprimento total da raiz. Esses resultados mostraram que a superexpressão de oxidase de citoquinina intensifica o crescimento e desenvolvimento da raiz principal e das raízes adventícias, resultando em vigor precoce.

Exemplo 10. Análise Histológica da Morfologia Alterada da Planta em Plantas de Tabaco Expressando AtCKXl Análises microscópicas de diferentes tecidos revelou que as alterações morfológicas nos transgênicos AtCKX são refletidas por alterações distintas no número de células e taxa de formação de células (veja Figura 10) . O meristema apical da muda (SAM) de transgênicos AtCKXl era menor do que no tipo silvestre e menos células ocupam o espaço entre a zona central e a zona periférica da formação de órgão lateral, mas as células eram do mesmo tamanho (Figure 10A). O número reduzido de células e o tamanho do SAM como uma conseqüência de um teor reduzido de citoquinina indica que as citoquininas têm um papel no controle da proliferação de SAM. Nenhuma alteração óbvia no padrão de diferenciação ocorreu, sugerindo que a organização espacial das zonas de diferenciação no SAM é grandemente independente do número de células e da concentração de citoquinina local. O padrão tecidual global das folhas naquelas que superexpressam oxidase de citoquinina era inalterado. Contudo,o tamanho do floema e xilema era significativamente reduzido (Figura 10B) . Em contraste, o tamanho médio de células do parênquima da folha e células epidérmica era aumentado quatro a cinco vezes (Figuras 10C, D) . Novas células de transgênicos AtCKXl são formadas a 3-4% da taxa das folhas do tipo silvestre e estima-se que o número final de células da folha oscile de 5-6% do tipo silvestre. Isso indica um requisito absoluto por citoquininas nas folhas a fim de manter o ciclo de divisão celular. Nem o tamanho de célula nem a forma de célula dos órgãos florais era alterado e o rendimento de semente por cápsula era similar em plantas do tipo silvestre e transgênicas AtCKX. A população de célula de meristemas de raiz de plantas transgênicas AtCKXl era aumentada em aproximadamente 4 vezes e os números de células nas columelas centrais e laterais eram intensificados (Figuras 10E, F) . O diâmetro final da raiz era aumentado em 60% devido a um diâmetro aumentado de todos os tipos de células de raiz. Os padrões de raiz radial eram idênticos no tipo silvestre e transgênicos, exceto que freqüentemente uma quarta camada de células de córtex era observada em raízes transgênicas (Figura 10G). O número aumentado de células e o comprimento ligeiramente reduzido das células indicam que o crescimento intensificado da raiz se deve a um número aumentado de células cíclicas ao invés de crescimento celular aumentado. Na presença de um teor diminuído de citoquinina, células do meristema da raiz parecem sofrer ciclos adicionais de mitose antes que elas deixem o meristema e comecem a se alongar. A saída do meristema, portanto, é regulada por um mecanismo que é sensível às citoquininas. Evidentemente, as citoquininas têm um papel regulatório negativo no meristema da raiz e as concentrações de citoquinina no tipo silvestre são inibitórias ao desenvolvimento de um sistema de raízes máximo. Portanto, a redução do nível de citoquininas ativas por meio de superexpressão de oxidases de citoquinina estimula o desenvolvimento da raiz, o que resulta em um aumento no tamanho da raiz com mais raízes adventícias e laterais quando comparado a plantas TS.

Exemplo 11. Plantas de Tabaco Superexuressando AtCKXl e AtCKX2 tinham um Teor Reduzido de Citoauinina Dentre os 16 diferentes metabólitos de citoquinina que foram medidos, a maior alteração ocorreu nas citoquininas do tipo iP naquelas que expressam AtCKX2 (Tabela 10) : a diminuição global no teor de citoquininas do tipo iP é mais pronunciada em plantas que expressam AtCKX2 do que em transgênicos AtCKXl. Os transgênicos AtCKXl mostraram um fenótipo mais forte no broto. Não se sabe qual metabólito de citoquinina é relevante para os diferentes traços que foram analisados. Pode ser que diferentes formas de citoquinina desempenhem diferentes papéis nos vários processos de desenvolvimento, alterações menores foram observadas para citoquininas do tipo Z, as quais poderíam ser devido a uma diferente acessibilidade do substrato ou a uma menor especificidade da proteína pelo substrato. O teor total de metabólitos iP e Z em clones transgênicos individuais estava entre 31% e 63% do tipo silvestre. O poço reserva de citoquinina de O-glicosídeos também era diminuído nos transgênicos (Tabela 10) . A concentração de N-glicosídeos e citoquininas do tipo DHZ era muito baixa e não se alterou ou se alterou apenas ligeiramente em mudas transgênicas (dados não mostrados).

Tabela 10. Teor de Citoauinina de Plantas Transaênicas AtCKX.

Os métodos de extração de citoquinina, imunopurificação, separação por HPLC e quantificação através de ELISA foram realizados conforme descrito por Faiss e colaboradores., 1997. Três amostras independentemente empoçadas de aproximadamente 100 mudas de duas semanas de idade (2,5 g por amostra) foram analisadas para cada clone. As concentrações estão em pmol x g de peso fresco'1. Abreviações: iP, N6-(A2isopentenil) adenina; ribosídeo de iPR, N6- (A2isopentenil)adenina; iPRP, 5'-monofosfato de ribosídeo de N6-(A2isopentenil)adenina; Z, trans-zeatina; ZR, ribosídeo de zeatina; ZRP, 5'-monofosfato de ribosídeo de zeatina; ZOG, O-glicosídeo de zeatina; ZROG, O-glicosídeo de ribosídeo de zeatina.

Exemplo 12. Experimentos de Enxertaaem Mostraram que o Nanismo e Desenvolvimento Intensificado da Raiz devido à Superexpressão do AtCKX estão Limitados aos Tecidos Transgênicos.

Para investigar quais efeitos fenotípicos da superexpressão da oxidase de citoquinina estão limitados à expressão em tecidos, isto é, são traços célula- ou órgão-autônomos, experimentos de enxertagem foram realizados. Enxertos recíprocos foram feitos entre uma planta de tabaco transgênica AtCKX2 e um tabaco TS. A planta transgênica usada nesse experimento era AtCKX2-38, a qual mostrou um forte fenótipo caracterizado por crescimento intensificado da raiz e desenvolvimento reduzido das partes aéreas da planta. Conforme descrito nos Exemplos 3 a 6, esses eram dois fenótipos importantes que resultaram da superexpressão de oxidase de citoquinina em tabaco e arabidopsis.

As plantas tinham cerca de 15 cm de altura quando enxertadas e a junção de enxerto era cerca de 10 cm acima do solo. A Figura 12 mostra plantas 15 semanas após a enxertagem. Os principais resultados foram que : (i) o fenótipo aéreo de um enxerto TS enxertado sobre um estoque de raízes transgênicas era similar ao enxerto de controle TS (enxerto TS sobre estoque de raízes TS). De modo importante, isso mostrou que a superexpressão do transgene AtCKX2 no estoque de raízes não induziu ao nanismo das partes aéreas não transgênicas da planta (veja Figura 12A). O crescimento aperfeiçoado da raiz do estoque de raízes transgênicas foi mantido, indicando que o crescimento aperfeiçoado da raiz de transgênicos AtCKX é autônomo e não dependente de um broto transgênico AtCKX (Figura 12C) . De modo interessante, os enxertos TS enxertados sobre os estoques de raízes transgênicas pareciam mais saudáveis e estavam melhor desenvolvidos. Notavelmente, a senescência das folhas basais era retardada nessas plantas (veja Figura 12A); (ii) o enxerto transgênico enxerto sobre o estoque de raízes ST parecia similar à parte aérea da planta transgênica a partir da qual ele foi derivado, isto é, o fenótipo de nanismo do broto também é autônomo e não depende do crescimento aperfeiçoado da raiz (veja Figura 12 B) .

Além da melhor aparência acima mencionada dos brotos TS enxertados sobre um estoque de raízes transgênicas, a formação de raízes adventícias sobre a parte basal de mudas TS foi observada (Figura 12 D, planta da direita). A formação de raízes adventícias também ocorreu no caule de transgênicos AtCKX, mas não nos caules de enxertos de controle TS (Figura 12 D, planta da esquerda) e, portanto, parece ser um traço não autônomo.

Em resumo, é divulgado na presente invenção que a formação intensificada de raiz e o nanismo do broto em tabaco superexpressando AtCKX são traços autônomos e podem ser dissociados por meio de procedimentos de enxertagem. Surpreendentemente, a enxertagem de um enxerto TS sobre um estoque de raízes transgênicas AtCKX resultou em plantas com crescimento mais vigoroso e retardo da senescência da folha.

Como uma alternativa à enxertagem, promotores tecido- específicos poderíam ser usados para dissociação dos efeitos fenotípicos autônomos da superexpressão de citoquinina. Portanto, é divulgado na presente invenção que a superexpressão da oxidase de citoquinina de uma maneira tecido-específica pode ser usada para alterar a morfologia de uma planta, tal como o broto ou sistema de raízes.

Exemplo 13. Expressão de um Gene AtCKX sob um Promotor Raiz-Específico em Plantas Transgênicas leva à Produção Aumentada da Raiz.

Um gene AtCKX (veja exemplo 4) é clonado sob o controle do promotor homólogo de raiz de clavata de Arabidopsis (ID DE SEQ NO: 36), o qual é um promotor que aciona a expressão raiz-específica. Outros promotores raiz-específicos podem também ser usados para a finalidade da presente invenção. Veja Tabela 5 para promotores raiz-específicos exemplificativos.

Plantas transgênicas expressando o gene AtCKX especificamente nas raízes mostram produção aumentada da raiz sem afetar negativamente o crescimento e desenvolvimento das partes aéreas da planta. Efeitos positivos sobre a senescência da folha e crescimento das partes aéreas da planta são observados.

Exemplo 14, Supressão de um Gene AtCKX sob um Promotor Senescência-Induzido em Plantas Transgênicas leva a Senescência Retardada da Folha e Rendimento Intensificado da Semente.

Uma estrutura genética quimérica derivada de um gene AtCKX e projetada para suprimir a expressão de gene(s) da oxidase de citoquinina endógena é clonada sob o controle de um promotor senescência-induzido. Por exemplo, promotores derivados de genes senescência-associados (SAG), tal como o promotor SAG12, podem ser usados (Quirino e colaboradores., 2000) . Plantas transgênicas suprimindo o(s) gene(s) da oxidase de citoquinina endógena, especificamente em folhas senescentes, mostraram senescência retardada da folha e maior rendimento da semente sem afetar negativamente a morfologia e crescimento e desenvolvimento da planta. Exemplo 15. Superexpressão de um Gene AtCKX nos Órgãos Reprodutores_____Femininos_____leva____a_____Desenvolvimento Partenocárpico do Fruto A rede de leitura aberta de um gene AtCKX é clonada sob o controle de um promotor que confere superexpressão nos órgãos reprodutores femininos tal como, por exemplo, o promotor DefH9 de Antirrhinum majus ou um de seus homólogos, o qual tem especificidade de expressão na placenta e óvulos. Plantas transgênicas com atividade intensificada da oxidase de citoquinina nesses tecidos mostram desenvolvimento partenocárpico do fruto.

Exemplo 16. Superexpressão de Genes AtCKX Resulta em Tamanho Aumentado da Semente e do Cotilédone Plantas Arabidopsis thaliana transgênicas que superexpressam genes da oxidase de citoquinina {AtCKX) sob o controle do promotor 35S conforme descrito supra. Plantas transgênicas, em particular aquelas expressando os genes AtCKXl e AtCKX3, desenvolveram sementes com tamanho aumentado, o que era quase inteiramente devido a um embrião maior. Detalhes da semente, embrião e fenótipos pós-embriônicos precoces são mostrados nas Figuras 13A a 13E. A Tabela 11 mostra o peso da semente do tipo silvestre e dois clones independentes para cada um dos quarto genes AtCKX investigados. O peso médio foi obtido através de análise de cinco lotes diferentes de 200 sementes para cada clone. Uma avaliação quantitativa mostrou que o peso da semente de clones expressando AtCKXl e AtCKX3 era aproximadamente 1,8- 2,3 vezes maior do que no tipo silvestre. O ganho de peso para sementes de linhagens expressando AtCKX2 e AtCKX4 estava na faixa de 10-25% (Tabela 11 e Fig. 14).

Os aumentos no tamanho e peso de sementes, embriões e cotilédones são inesperados, uma vez que seria de se esperar que o teor reduzido de citoquinina estivesse associado a um crescimento reduzido do órgão. Uma possível razão para os aumentos no tamanho da semente, embrião e cotilédone é uma função regulatória negativa anteriormente desconhecida das citoquininas nesses órgãos de armazenamento. As funções regulatórias negativas das citoquininas no controle do crescimento do órgão são conhecidas, até o momento, apenas em raízes (Werner e colaboradores 2 001) . Nós propomos, portanto, que a expressão localizada de genes de oxidase de citoquinina em tecidos onde o crescimento é negativamente regulado pelas citoquininas leva a um crescimento intensificado desse tecido. Por exemplo, a expressão localizada de genes CKX durante desenvolvimento do cotilédone provavelmente leva a um crescimento intensificado de cotilédones e, em espécies com cotilédones como órgãos de armazenamento, a um rendimento intensificado e um desempenho de crescimento intensificado das mudas. O número total de sementes é diminuído naquelas que expressam AtCKXl e AtCKX3. Não existem relatos anteriores, contudo, de menor número de sementes em Arabidopsis estando relacionado a um aumento no tamanho.

Exemplo 17 Explantes de folhas de Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN foram transformados com o vetor Bin-Hyg-TX portando o gene AtCKXl ou o gene AtCKX 2 sob o controle de um promotor CaMV 35 S. Várias linhagens de originando dessas plantas transformadas foram ainda cultivadas e seu tamanho de semente foi analisado (Tabela 12).

Plantas de tabaco tendo os transgenes CKX1 e CKX2 mostraram um aumento na área de semente, um parâmetro para o tamanho da semente.

Tabela 11 Tabela 12 Referências W00105985. Method to modulate the expression of genes inducing the parthenocarpic trait in plants.

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Claims (54)

1. Método para estimulação do crescimento da raiz ou para intensificação da formação de raizes laterais ou adventicias ou para modificação do geotropismo da raiz caracterizado pelo fato de compreender a introdução e expressão em uma planta ou célula vegetal de um ácido nucleico que codifica uma oxidase de citoquinina vegetal selecionado do grupo consistindo em: (a) ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de DNA conforme fornecida na SEQ ID NO: 1 ou 25, (b) ácidos nucleicos compreendendo as sequências de RNA correspondendo a SEQ ID NO: 1 ou 25, (c) ácidos nucleicos conforme definidos em (a) ou (b), o referido ácido nucleico sendo DNA, DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou RNA em que T é substituída por U.

2. Vetor caracterizado por compreender (a) ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de DNA conforme fornecida na SEQ ID NO: 1 ou 25, ou (b) ácidos nucleicos compreendendo as sequências de RNA correspondendo a SEQ ID NO: 1 ou 25, ou (c) ácidos nucleicos conforme definidos em (a) ou (b), o referido ácido nucleico sendo DNA, DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou RNA em que T é substituída por U, em que o ácido nucleico está operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle permitindo a expressão do referido ácido nucleico em uma célula hospedeira procariota.

3. Vetor caracterizado por compreender (a) ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de DNA conforme fornecida na SEQ ID NO: 1 ou 25, ou (b) ácidos nucleicos compreendendo as sequências de RNA correspondendo a SEQ ID NO: 1 ou 25, ou (c) ácidos nucleicos conforme definidos em (a) ou (b), o referido ácido nucleico sendo DNA, DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou RNA em que T é substituída por U, em que o ácido nucleico está operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle permitindo a expressão do referido ácido nucleico em uma célula hospedeira fúngica ou de levedura.

4. Célula bacteriana, fúngica ou de levedura caracterizada pelo fato de serem transformadas por um vetor como definido na reivindicação 2 ou 3.

5. Método para a produção de um polipeptídeo tendo atividade de oxidase de citoquinina caracterizado por compreender a cultura de uma célula bacteriana, fúngica ou de levedura, conforme definida na reivindicação 4, sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo e a recuperação do polipeptídeo produzido a partir da cultura.

6. Método para a produção de uma planta transgênica, célula vegetal ou tecido vegetal caracterizado pelo fato de compreender a introdução nos mesmos de (a) ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de DNA conforme fornecida na SEQ ID NO: 1 ou 25, ou (b) ácidos nucleicos compreendendo as sequências de RNA correspondendo a SEQ ID NO: 1 ou 25, ou (c) ácidos nucleicos conforme definidos em (a) ou (b), o referido ácido nucleico sendo DNA, DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou RNA em que T é substituída por U, em um vetor ou formato expressível.

7. Método para realizar a expressão do polipeptídeo representado pela SEQ ID NO: 2 caracterizado pelo fato de compreender a introdução estável, no genoma de uma célula vegetal, de um vetor compreendendo (a) ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de DNA conforme fornecida na SEQ ID NO: 1 ou 25, ou (b) ácidos nucleicos compreendendo as sequências de RNA correspondendo a SEQ ID NO: 1 ou 25, ou (c) ácidos nucleicos conforme definidos em (a) ou (b), o referido ácido nucleico sendo DNA, DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou RNA em que T é substituída por U, operavelmente ligado a uma ou mais sequências de controle.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de ainda compreender a regeneração de uma planta a partir da referida célula vegetal.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ainda compreender a regeneração de uma planta a partir da referida célula vegetal.

10. Método para estimulação do crescimento da raiz caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucleico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta.

11. Método para intensificação da formação de raízes laterais ou adventícias caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucleico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta.

12. Método para alterar o geotropismo da raiz caracterizado pelo fato de compreender a alteração da expressão de um ácido nucleico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de o referido método levar a um aumento no rendimento.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o referido método levar a um aumento no rendimento.

15. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o referido método levar a um aumento no rendimento.

16. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a referida expressão do referido ácido nucleico ocorrer sob o controle de um promotor constitutivo forte.

17. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de a referida expressão do referido ácido nucleico ocorrer sob o controle de um promotor constitutivo forte.

18. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de a referida expressão do referido ácido nucleico ocorrer sob o controle de um promotor que é expresso, de preferência, em raizes.

19. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a referida expressão do referido ácido nucleico ocorrer sob o controle de um promotor que é expresso, de preferência, em raizes.

20. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de a referida expressão do referido ácido nucleico ocorrer sob o controle de um promotor que é expresso, de preferência, em raizes.

21. Método para identificação e obtenção de proteínas que interagem com o polipeptídeo conforme representado pela SEQ ID NO: 2 caracterizado pelo fato de compreender um ensaio de seleção em que o polipeptídeo, conforme representado pela SEQ ID NO:2, é usado.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de compreender um ensaio de seleção com dois híbridos em que o polipeptídeo, conforme representado pela SEQ ID NO:2, é usado como uma isca e uma biblioteca de cDNA é usada como presa.

23. Método para identificação e obtenção de compostos que interagem com o polipeptídeo, conforme representado pela SEQ ID NO:2, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) fornecimento de um sistema com dois híbridos em que o polipeptídeo conforme representado pela SEQ ID NO: 2 e um parceiro de proteína de interação obtenível por um método, conforme definido na reivindicação 21, são expressos, b) interação do referido composto com o complexo formado pelos polipeptídeos expressos conforme definido em (a) e c) realização de medição da interação do referido composto com o referido polipeptídeo ou o complexo formado pelos polipeptídeos expressos conforme definido em (a).

24. Método para identificação de compostos ou misturas de compostos os quais se ligam especificamente ao polipeptídeo, conforme representado pela SEQ ID NO: 2, caracterizado pelo fato de compreender: a) combinação do polipeptídeo, conforme representado pela SEQ ID NO: 2, com o referido composto ou misturas de compostos sob condições adequadas para permitir a formação de complexo e b) detecção da formação de complexo, em que a presença de um complexo identifica um composto ou mistura a qual se liga especificamente ao referido polipeptideo.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de o referido composto inibir a atividade do referido polipeptideo e poder ser usado para o projeto racional de produtos químicos.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de o referido composto ou mistura de compostos inibir a atividade do referido polipeptideo e poder ser usada para o projeto racional de produtos químicos.

27. Método para aumento do tamanho do meristema da raiz caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta, de preferência em raízes.

28. Método para aumento do tamanho da raiz caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta, de preferência em raízes.

29. Método para aumento do tamanho do meristema do broto caracterizado pelo fato de compreender a sub-regulação da expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, de preferência em brotos.

30. Método para retardo da senescência da folha caracterizado pelo fato de compreender a sub-regulação da expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, de preferência em folhas senescentes.

31. Método para alteração da senescência da folha caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em folhas senescentes.

32. Método para aumento da espessura da folha caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta.

33. Método para redução do tamanho de vaso caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta.

34. Método para aumento do tamanho de vaso caracterizado pelo fato de compreender a sub-regulação da expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta.

35. Método para indução de partenocarpia caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta, de preferência na placenta, óvulos e tecidos derivados dos mesmos.

36. Método para melhora da resistência de mudas caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em mudas, de preferência nas raizes de mudas.

37. Método para aumento de ramificações caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta.

38. Método para melhora da resistência à derrubada caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta, de preferência em caules ou brotos axilares.

39. Método para aumento do tamanho ou peso da semente caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta, de preferência sementes.

40. Método para aumento do tamanho ou peso do embrião caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta, de preferência embriões.

41. Método para aumento do tamanho de cotilédone caracterizado pelo fato de compreender a expressão de um ácido nucléico heterólogo, conforme definido na reivindicação 1, em plantas ou partes de planta, de preferência cotilédones.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de o ácido nucléico estar sob o controle de um promotor que controla a expressão de preferência em sementes.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de o ácido nucléico estar sob o controle de um promotor que controla a expressão de preferência em embriões.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de o ácido nucléico estar sob o controle de um promotor que controla a expressão de preferência em cotilédones.

45. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de o promotor ainda ser especifico ao endosperma ou aleurona.

46. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de o referido método levar a um aumento no rendimento.

47. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de o referido método levar a um aumento no crescimento de mudas ou um aumento no vigor precoce.

48. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de o referido método levar a um aumento do rendimento.

49. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de o referido método levar a um aumento no crescimento de mudas ou um aumento no vigor precoce.

50. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de o referido método levar a um aumento no rendimento.

51. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de o referido método levar a um aumento no crescimento de mudas ou um aumento no vigor precoce.

52. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de o aumento no crescimento de mudas ou vigor precoce estar associado à tolerância aumentada ao estresse.

53. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de o aumento no crescimento de sementes ou vigor precoce estar associado à tolerância aumentada ao estresse.

54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de o aumento no crescimento de mudas ou vigor precoce estar associado à tolerância aumentada ao estresse.