JP2005511061A - 筋萎縮性側索硬化症をモニターおよび治療する方法 - Google Patents

筋萎縮性側索硬化症をモニターおよび治療する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、ALSを有する個体の末梢血におけるCD14+単球によるHLA-DR発現レベルおよび／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合および／またはCD14+/CD16+細胞数を決定することによって、筋萎縮性側索硬化症（ALS）疾患の進行のなりゆきをモニターする方法およびALS治療をモニターする方法を提供する。本発明はまた、個々のALSにおける循環中のCD14+単球数および／またはCD14+/CD16+細胞集団および／またはCD14+/CD16+細胞数を減少させる方法にも向けられる。本発明はまた、ALSを有する個体における上昇したHLA-DR発現を有するCD14+単球集団および／またはCD14+/CD16+細胞集団および／またはCD14+/CD16+細胞数を減少させる作用物質をスクリーニングする方法にも向けられる。

Description

本出願は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、2001年11月16日に提出された米国特許仮出願第60/333,263号の優先権を主張する。
技術分野
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）と免疫機能の分野に関する。より詳しく述べると、本発明は、活性化単球または異常なマクロファージ、ならびにALS進行のモニタリング、ALS治療のモニタリング、およびALS患者の治療に関する。
背景技術
筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、口語的にはルー・ゲーリッグ病としても知られ、脳および脊髄における上位および／または下位運動ニューロンの選択的喪失を特徴とする進行性の神経変性障害の不均一なグループである。罹患個体は、筋の攣縮および痙攣、手および腕の運動制御喪失、腕および脚の使用障害、脱力および疲労、トリッピングと転倒、ものを落とす、不明瞭言語、および呼吸困難または嚥下困難を含む多様な症状を示す。ALSによって最終的に罹患個体は死亡する。
一般的に、ALSは、脳幹、脊髄、および大脳皮質における運動ニューロンの変性を神経病理学的に特徴とする。臨床的に、ALSは典型的に、痙性、反射亢進、および病理的な皮質脊髄路所見と共に、筋虚弱、衰弱、および筋束収縮（例えば、痙攣）を特徴とする。
興奮毒性および酸化的ストレスは、ALSにおける運動ニューロン細胞の死に関与する少なくとも二つの病的なメカニズムであるように思われる（Kalraら（1999）、J. Neurol. Sci. 165：S27〜S32）。ALSにおいて興奮毒性が役割を有するという根拠には、ALS患者の脳脊髄液におけるグルタメートレベルの上昇およびALS患者の中枢神経系（CNS）におけるグルタメート受容体の数または機能の変化に関する所見がある（Rothsteinら（1990）Ann. Neurol. 28：18〜25；Shawら（1995）Neurodegeneration 4：209〜216；Gredalら（1996）J. Neurol. Sci. 143：121〜125；Virgoら（1995）Brain Res. 676：196〜204）。ALSにおいて酸化的ストレスおよび反応酸素種が役割を有するという多くの根拠は、ALSのいくつかの家族性症例においてスーパーオキサイドジスムターゼ（SOD1）遺伝子に変異が発見されたことに由来する（Dengら（1993）Science 261：1047〜1051；Rosenら（1993）Nature 362：59〜62）。ヒト変異体SOD1を発現するトランスジェニックマウスの運動ニューロンは、フリーラジカルの障害に対して選択的に易損性であることが示され（Gurneyら（1994）Science 264：1772〜1775）、ALS患者からのCNS組織およびSOD1トランスジェニックマウスにおいて、タンパク質、脂質、および核酸における酸化的変化が同定されている（Ferranteら（1997）J. Neurochem. 69：2064〜2074；Hallら（1998）J. Neurosci. Res. 53：66〜77；Ferranteら（1997）Ann. Neurol 42：326〜334）。
免疫機能障害も同様に、ALSに連鎖していると提唱されている。例えば、ALS脊髄において、細胞性免疫応答の証拠が同定された。例えば、腫瘍組織適合性糖タンパク質HLA-A、B、CおよびHLA-DRを発現するヘルパーおよび細胞障害性のTリンパ球ならびに反応性小膠細胞がALS脊髄において認められた（McGeerら（1991）Can. J. Neurol. Sci. 18：376〜379）。主にTリンパ球とマクロファージからなる細胞浸潤物が、剖検したALS患者からの筋生検標本において認められた（Troostら（1992）Clin. Neuropathol. 11：115〜120）。萎縮した筋繊維周辺のTリンパ球およびマクロファージのほとんどが高レベルのHLA-DRを発現しており、このことは細胞の活性化状態を示し、ALS関連筋萎縮における細胞の役割を示唆している。同様に、HLA-DRを発現するシュワン細胞が、ALSにおける末梢神経の神経内膜において同定されている（Oliveraら（1994）Arq. Neuropsiquiatr. 52：493〜500）。
ALSは、その多くが侵襲性の技法または複雑な造影および分析を伴う筋および神経生検、脊髄穿刺、X線、磁気共鳴画像（MRI）、ならびに電子診断試験を含む多様な試験および検査を用いて診断される。ALSに関する有望な治療の評価のみならず、疾患のモニタリングにおいて用いられるALS疾患の進行を容易に入手できる手段がなおも必要である。
本明細書において引用した全ての出版物および特許出願は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
発明の開示
本発明は、個体の末梢血試料においてCD14+細胞によるHLA-DR発現レベルおよび／または異常なマクロファージレベルを検出することを含む、個体におけるALSの治療をモニターする方法を提供する。
したがって、本発明の一つの局面において、ALS治療の効果は、治療の前および治療中での末梢血におけるCD14+細胞によるHLA-DR発現レベルおよび／またはCD14+/CD16+細胞数および／またはCD14+細胞の集団におけるCD16+細胞の割合を比較することによって決定され、HLA-DR発現および／またはCD14+/CD16+細胞数および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合に減少傾向が認められれば、一般的に陽性作用と一致する。
本発明はまた、ALS患者からの末梢血試料における異常なマクロファージレベルを決定することを含む、ALS患者におけるALSの発症または進行をモニターする方法を提供する。
したがって、本発明のもう一つの局面において、ALSのモニタリングは、疾患の経過における様々な時点での末梢血における、CD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／またはCD14+CD16+細胞数、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を比較することによって行われ、HLA-DR発現の増加および／またはCD14+/CD16+細胞数の増加、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合の増加は、一般的に疾患重症度の増加および／または進行速度の増加と一致する。
本発明はまた、個体におけるCD14+単球数を減少させるために有効なポリアミン類似体の量を個体に投与することによって、ALS個体におけるCD14+単球数、好ましくは循環中の活性化単球数を減少させる方法を提供する。
もう一つの局面において、本発明は、個体における循環中の活性化単球数を減少させるために有効なポリアミン類似体の量を個体に投与することによって、ALS個体における循環中の活性化単球数を減少させる方法を提供する。
本発明はまた、個体におけるHLA-DR発現が増加したCD14+細胞数を減少させるために有効なポリアミン類似体の量を個体に投与することによって、ALS疾患を有する個体における異常なマクロファージ数を減少させる方法を提供する。
本発明はまた、個体におけるCD14+/CD16+細胞数を減少させるために有効なポリアミン類似体の量を個体に投与することによって、ALS疾患を有する個体における異常なマクロファージ数を減少させる方法も提供する。
本発明はまた、ALSに関連したCD14+単球、好ましくは循環中の活性化単球の数を減少させるために有効な作用物質をスクリーニングする方法も提供する。
本発明はまた、HLA-DR発現が増加したCD14+細胞がALSを有する個体の血液試料から得られる、候補物質の存在下および非存在下でのHLA-DR発現が増加したCD14+細胞の生存率の差を決定することによってALSに関連した異常なマクロファージ数を減少させるために有効な作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明はまた、CD14+/CD16+細胞がALSを有する個体の血液試料から得られる、候補物質の存在下および非存在下でのCD14+/CD16+細胞の生存率の差を決定することによってALSに関連した異常なマクロファージ数を減少させるために有効な作用物質をスクリーニングする方法を提供する。
本発明はまた、個体の血液試料からのCD14+細胞によるHLA-DR発現の増加および／またはCD14+/CD16+細胞数の増加、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合の増加を検出することによって、ALSの診断または予測を補助する方法を提供する。いくつかの態様において、そのような異常なマクロファージの検出を、ALSの診断のための一つまたは複数の他の疾患の指標と組み合わせる。
本発明はまた、個体の血液試料において異常なマクロファージを検出することによってALS疾患の診断を補助する方法であって、検出する段階にHLA-DR発現が増加したCD14+細胞を検出することが含まれる方法を提供する。本発明はまた、個体の血液試料において異常なマクロファージを検出することによってALS疾患の診断を補助する方法であって、検出する段階にCD14+/CD16+細胞を検出することが含まれる方法を提供する。
本発明のいくつかの態様において、血液試料は、採血後約12時間以内に異常なマクロファージの存在に関して分析される。
本発明を実践するための様式
本発明者らは、ALS患者における循環中の単球（末梢血から）が、非ALS個体の末梢血試料からの単球と比較して、一般的に異常に活性化および／または分化している（一般的に「循環中の活性化単球」および「異常なマクロファージ」として本明細書において互換的に呼ばれる）ことを発見した。本発明者らはまた、これらの細胞が増殖する証拠を認めた。このように、本発明者らは、ALSを治療するための作用物質の有効性をモニターする方法と共に、ALS疾患の進行および／または活動度をモニターする方法を発見した。本発明者らの発見はまた、これらの異常な細胞が疾患の少なくとも一つの症状を媒介する可能性があることから、治療介入のおそらく有意な標的であることを示している。
ALS患者の末梢血中におけるこれらの活性化単球または異常なマクロファージは、一般的に、CD14発現、および全体的な上昇したHLA-DRレベル、ならびに／またはCD14およびCD16の発現によって示され、一般的にALS個体において同定可能なT細胞同時活性化を認めない。
本発明者らはまた、ALS患者からの末梢血単核球をポリアミン類似体のような抗増殖物質によって処置することによって、ALS患者の末梢血細胞における活性化CD14+単球（または異常なマクロファージ）数が減少することを発見した。
したがって、本発明は、ALS患者からの生体試料、好ましくは血液試料中の異常なマクロファージレベルを決定することによって、治療措置の前、治療措置の間、および／または治療措置の後、または治療を行わない場合を含む、ALS疾患の進行をモニターする方法を提供する。本発明はまた、投与の前、投与の間、および／または投与の後のALS患者からの生体試料、好ましくは血液試料中の異常なマクロファージのレベルを決定することによって、ALS治療物質および／またはプロトコールの有効性をモニターする方法も提供する。本発明はまた、単独または他の治療様相と組み合わせると、ALSの一つまたは複数の症状の発症を遅らせるおよび／または改善する可能性がある、ALS患者における活性化CD14+単球数を減少させる方法も提供する。下記のように、ALS患者における活性化CD14+単球数を減少させる好ましい物質はポリアミン類似体である。
定義
本明細書において用いられるように、「マクロファージ」および「単球」という用語は、「単球」という用語が、CD14細胞表面マーカーを発現する循環中の単核球細胞を記述するためにしばしば用いられ、組織ではこの細胞はマクロファージにも分類されると理解されることから、互換的に用いられる。
本発明において互換的に用いられる「異常なマクロファージ」、「循環中の活性化単球」、または「活性化単球」は、CD14を発現して（すなわち、CD14+）、クラスII主要組織適合抗原であるHLA-DRの上昇したレベルを発現して、および／またはCD16を発現する（すなわち、CD16+）単球を指す。一般的に、異常なマクロファージは末梢血に認められるが、それらはまた、個体からの他の生体試料にも認められる可能性がある。一般的に、これらの異常なマクロファージは、ALS患者において同定可能な同時T細胞活性化を認めることなく存在する。
本明細書において用いられるように、「異常なマクロファージの存在」を検出することは、一般的に異常なマクロファージレベルを検出することを意味する。一般的に、異常なマクロファージ（または活性化単球）レベルは、CD14+細胞集団におけるHLA-DR発現レベルおよび／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数によって示されるが、単球の活性化、分化、および／または増殖を示す他のマーカーも用いることができる。絶対的なまたは相対的レベルでさえ決定する必要はなく、検出可能な異常なマクロファージの観察で十分であると理解すべきである。
「筋萎縮性側索硬化症」または「ALS」は、上位運動ニューロン（脳における運動ニューロン）および／または下位運動ニューロン（脊髄における運動ニューロン）に罹患して、運動ニューロンの死に至る進行性の神経変性疾患を指す、と当技術分野で理解され、本明細書において用いられる用語である。本明細書において用いられるように、「ALS」という用語には、古典的なALS（典型的に下位および上位運動ニューロンの双方に罹患する）、原発性側索硬化症（PLS、典型的に上位運動ニューロンのみに罹患する）、進行性延髄麻痺（PBP、または典型的に嚥下困難、咀嚼困難、および言語困難から始まるALSの延髄発症型）、進行性筋萎縮（PMA、典型的に下位運動ニューロンのみに罹患する）、ならびに家族性ALS（ALSの遺伝型）を含む、当技術分野で既知のALSの分類の全てが含まれる。
「増殖性マクロファージ」とは、分裂するマクロファージを指すと当技術分野において理解され、本明細書において用いられる用語である。通常、マクロファージは、さらに分裂することができない最終分化細胞である。本発明の目的のために、「増殖性マクロファージ」をさらに分裂させることができるか、または最終または末期段階でないと見なされる細胞周期の一部に存在する。増殖性マクロファージを検出する方法を、下記に考察する。
本明細書において用いられるように、「増殖性マクロファージの存在」を検出することは、増殖性マクロファージのレベルを検出することを意味する。絶対的または相対的レベルでさえ決定する必要はなく、検出可能な増殖性マクロファージの観察で十分であると理解される。
「個体」とは、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類には、家畜動物、スポーツ用動物、齧歯類、霊長類、およびペットが含まれるがこれらに限定されない。「ALS個体」または「ALS患者」とは、ALSを有すると診断された、またはALS関連症状を示すことによってALSを有することが疑われると診断された個体である。「非ALS個体」とは、ALSを有しないと診断された、またはALSを有することが疑われない個体である。ALSおよびALSを診断する方法は当技術分野で既知であり、本明細書において考察される。
本明細書において用いられるように、「生体試料」は、個体から得た多様な種類の試料を含み、診断またはモニタリングアッセイ法において用いることができる。定義は、血液および生物起源の他の液体試料、生検標本、または組織培養物もしくはそれに由来する細胞およびその子孫のような固体組織試料を含む。定義にはまた、試薬による処置、可溶化、またはタンパク質もしくはポリペプチドのような特定の成分の濃縮のように、その調達後に任意の方法で操作してもよい試料が含まれる。「生体試料」という用語は、臨床試料を含み、同様に、培養細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液、および組織試料が含まれる。一般的に、試料は、末梢血であるか、またはそれに由来し、その場合は「血液試料」である。いくつかの場合において、血液は、例えば、ガラスまたはプラスチック接着性を用いてマクロファージ分画に関して濃縮される。
「血液試料」は、血液、好ましくは末梢（または循環）血に由来する生体試料である。血液試料は、例えば、全血、血漿、または血清であってもよい。
本明細書において用いられるように、「診断を補助する」方法は、これらの方法がALSの分類または性質に関する臨床的な決定を行うために補助することを意味し、確定診断に関して結論的であってもそうでなくてもよい。したがって、ALSの診断を補助する方法は、個体からの生体試料における異常なマクロファージレベルを検出する段階および／または個体からの生体試料、好ましくは末梢血試料中のCD14+細胞によるHLA-DR発現レベルを決定する段階を含みうる。様々な態様において、異常なマクロファージレベルは、生体試料、好ましくは末梢血試料におけるCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合および／またはCD14+/CD16+細胞数を決定することによって検出することができる。
ALSの「発症」または「進行」は、本明細書において、障害の初回発現および／またはそれに続く進行を意味する。ALSの発症は、検出可能であり、神経および筋生検ならびにMRIのようなCNS走査技術のような、標準的な臨床技術を用いて評価することができる。しかし、発症はまた、検出不可能である可能性がある疾患の進行も意味する。本発明の目的に関して、発症または進行は疾患状態の生物学的経過を意味する。「発症」には、発生、再発、および発病が含まれる。本明細書において用いられるように、ALSの「発病」または「発生」には、初回の発病および／または再発が含まれる。
本明細書において用いられるように、ALSの「発病を遅らせる」とは、疾患の発生を延期する、妨害する、緩徐化する、退行させる、安定化させる、および／または延期することを意味する。この遅延は、障害の既往および／または治療すべき個体の医学的プロフィールに応じて、多様な長さの期間となりうる。当業者に明らかであるように、十分または有意な遅延は、個体が検出可能な疾患を発症しないという点において、事実上予防を含みうる。疾患の発症を「遅らせる」方法は、方法を用いない場合と比較して、所定の期間内での疾患の程度を減少させる方法である。そのような比較は典型的に、統計学的に有意な数の被験者を用いる臨床試験に基づくが、この知識は、不確かな証拠に基づきうる。「発症の遅延」は、物質を投与していない場合と比較して、程度および／または望ましくない臨床発現が減弱して、進行の時間経過が遅れまたは延長することを意味しうる。このように、この用語にはまた、検出可能かまたは検出不能かに関わらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化していない）、疾患進行の遅延または緩徐化する、および寛解（部分的または完全）が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書において用いられるように、（例えば、作用物質の）「有効量」は、所望のおよび／または有用な結果を生じる（作用物質の）量である。有効量は、1回または複数回投与することができる。いくつかの態様において、有効量は、ALS患者におけるまたはALS個体に由来する異常なマクロファージレベルを減少させるために有効な量である。「異常なマクロファージレベルを減少するために十分な量」は、好ましくは異常なマクロファージレベルを少なくとも約25％、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、およびさらにより好ましくは少なくとも約90％減少させることができる。そのような減少は、疾患の進行を和らげる、改善する、安定化する、逆転させる、緩徐化するまたは遅延させる、疾患の発症を遅延および／または予防さえするような所望の同時作用を有してもよい。
他の態様において、「CD14+細胞によるHLA-DR発現レベルを減少させるために十分な量」は、好ましくはHLA-DR発現レベルを少なくとも約25％、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、およびさらにより好ましくは少なくとも約90％減少させることができる。そのような減少は、疾患の進行を和らげる、改善する、安定化する、逆転させる、緩徐化するまたは遅延させる、疾患の発症を遅延および／または予防さえするような所望の同時作用を有してもよい。
本明細書において用いられるように、「異常なマクロファージレベル」を減少させることは、一般的に異常なマクロファージまたは活性化単球の集団数を減少させることおよび／またはCD14+細胞集団におけるHLA-DR発現レベルを減少させることを意味する。様々な態様において、異常なマクロファージレベルは、生体試料におけるCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数を決定することによってアッセイすることができる。絶対レベルを決定する必要はないと理解され、異常なマクロファージの相対レベルの観察で十分である。
本明細書において用いられるように、「作用物質」という用語は、単純もしくは複雑な有機もしくは無機分子、ペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドのような生物もしくは化学化合物を意味する。非常に多様な化合物、例えばオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドのようなオリゴマー、ならびに様々なコア構造に基づく合成有機化合物を合成することができ、これらもまた、「作用物質」という用語に含まれる。さらに、植物または動物抽出物等のような様々な天然資源が化合物を提供しうる。作用物質には、ポリアミン類似体が含まれるがこれらに限定されない。作用物質は、単独または様々な組み合わせで投与することができる。
マクロファージの増殖を「調節する」ことは、マクロファージの増殖を変化させる作用物質を投与しない場合と比較して、増殖速度が変化することを意味する。例えば、ポリアミン類似体を用いることによってマクロファージの増殖を「調節する」ことは、ポリアミン類似体のように、DNAと天然のポリアミンとの相互作用を妨害する（ポリアミン生合成経路の妨害、細胞内スペルミジン濃度の妨害、競合物質、天然のポリアミンによるDNA相互作用の阻害、ポリアミン代謝の妨害等）作用物質を投与しない場合と比較して、増殖速度が変化していることを意味する。好ましくは、マクロファージ増殖の「調節」は、マクロファージ増殖速度の少なくとも25％、好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも75％、およびさらにより好ましくは少なくとも90％変化を意味する。一般的に、本発明の目的に関して、マクロファージの増殖を「調節すること」は、作用物質を投与していない個体における増殖速度と比較して増殖速度が減少していることを意味する。しかし、治療の過程において、例えば、これまでに測定されたレベルから増殖速度を増加させることが望ましい可能性がある。調節の程度は、下記で考察するようにマクロファージ増殖の測定によって評価してもよく、一般的に、マクロファージ集団における増殖マーカーを検出することまたはBrdUまたは3H-チミジンのような特定の物質（増殖の定量的手段を提供すると思われる）の取り込みを検出することを内含する。さらに、マクロファージが遺伝子変化のために増殖する場合には（転移、欠失、または挿入）、この変化は、RFLP（制限断片長多形）のような当技術分野で標準的な技術を用いて検出することができると考えられる。
ポリアミンまたはポリアミン類似体の「標的」は、ポリアミンまたはポリアミン類似体と直接または間接的に相互作用する実体である。標的の例は、DNA、RNA、および／または膜である。
「アルキル」という用語は、明記された炭素原子数を有する、または数が明記されていない場合には、炭素原子12個までを有する直鎖、分岐鎖、環状、およびその組み合わせを含む飽和脂肪族基を意味する。「直鎖アルキル」または「直線状アルキル」基は、「n-アルキル」基として一般的に示される環状でも分岐鎖でもないアルキル基を意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、ブチル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、t-ブチル、ペンチル、n-ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、ネオペンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびアダマンチルが含まれるがこれらに限定されない。環状基は、シクロヘプチルのような基を含むがこれらに限定されない一つの環、またはアダマンチルもしくはノルボルニルのような基を含むがこれらに限定されない多環融合環からなりうる。アルキル基の好ましいサブセットには、C1〜C12、C1〜C10、C1〜C8、C1〜C6、C1〜C4、C1〜C2、C3〜C4、C3、およびC4アルキル基が含まれる。
「置換アルキル」とは、ハロゲン（フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード）、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ、ベンジルオキシ、フェニル、ベンジル、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキサルデヒド、カルボアルコキシ、およびカルボキサミド、または本発明の目的にとって必要であれば保護基によって適切に保護されうる官能基が含まれるがこれらに限定されない一つまたは複数の置換基によって置換されたアルキル基を指す。置換アルキル基の例には、-CF3、-CF2-CF3、および他のペルフルオロおよびペルハロ基が含まれるがこれらに限定されない。
「ヒドロキシアルキル」は、特に、一つの-OH基によって置換された明記された炭素数を有するアルキル基を指す。このように、「C3直鎖ヒドロキシアルキル」は、-CH2CH2CHOH-、-CH2CHOHCH2-、および-CHOHCH2CH2-を指す。
「アルケニル」という用語は、明記された炭素数を有する、または炭素数が明記されていない場合には、炭素原子12個までを含み、少なくとも一つの二重結合（-C=C-）を含む直鎖（直線状）、分岐鎖、環状基、およびその組み合わせを含む不飽和脂肪族基を指す。アルケニル基の例には、エチル基が利用可能な任意の炭素価数でシクロヘキシル部分に結合することができる-CH2-CH=CH-CH3および-CH2-CH2-シクロヘキセニルが含まれるがこれらに限定されない。「アルキニル」という用語は、明記された炭素数を有する、または炭素数が明記されていない場合には、炭素原子12個までを含み、少なくとも一つの三重結合（-C≡C-）を含む直鎖（直線状）、分岐鎖、環状基、およびその組み合わせを含む不飽和脂肪族基を指す。「炭化水素鎖」または「ヒドロカルビル」とは、直鎖、分岐鎖、または環状のアルキル、アルケニル、またはアルキニル基の任意の組み合わせ、およびその任意の組み合わせも指す。「置換アルケニル」、「置換アルキニル」、および「置換炭化水素鎖」または「置換ヒドロカルビル」は、ハロゲン、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ、ベンジルオキシ、フェニル、ベンジル、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキサルデヒド、カルボアルコキシ、およびカルボキサミド、または本発明の目的にとって必要であれば保護基によって適切に保護されうる官能基を含むがこれらに限定されない一つまたは複数の置換基によって置換されたそれぞれの基を指す。
「アリール」または「Ar」は、単環（フェニルのような基を含むがこれらに限定されない）または多環縮合環（ナフチルまたはアンスリルのような基を含むがこれらに限定されない）を有する芳香族炭素環状基を指し、これには非置換および置換アリール基の双方が含まれる。「置換アリール」は、アルキル、アルケニル、アルキニル、炭化水素鎖、ハロゲン、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ、ベンジルオキシ、フェニル、ベンジル、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキサルデヒド、カルボアルコキシ、およびカルボキサミドのような基、または本発明の目的にとって必要であれば、保護基によって適切に保護されうる官能基を含むがこれらに限定されない一つまたは複数の置換基によって置換されたアリールを指す。
「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、および「ヘテロアルキニル」は、その基における主鎖、分岐鎖、または環状鎖の一部として一つまたは複数のヘテロ原子を含む、明記された炭素原子数をそれぞれ含むアルキル、アルケニル、およびアルキニル基を指す（数が明記されていない場合には、炭素原子12個まで）。ヘテロ原子には、N、S、O、およびPが含まれるがこれらに限定されない；NおよびOが好ましい。ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、およびヘテロアルキニル基は、ヘテロ原子（価数が利用できる場合）または炭素原子のいずれかで分子の残りに結合してもよい。ヘテロアルキル基の例には、-O-CH3、-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-O-CH3、-S-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH(CH3)-S-CH3、-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-、1-エチル-6-プロピルピペリジノ、2-エチルチオフェニル、およびモルフォリノが含まれるがこれらに限定されない。ヘテロアルケニル基の例には、-CH=CH-NH-CH(CH3)-CH2-のような基が含まれるがこれらに限定されない。「ヘテロアリール」または「HetAr」は、単環（ピリジル、チオフェン、またはフリルのような例が含まれるがこれらに限定されない）、または多環縮合環（イミダゾリル、インドリジニル、またはベンゾチエニルのような例を含むがこれらに限定されない）を有し、かつN、O、P、またはSのようなヘテロ原子を含むがこれらに限定されない少なくとも一つのヘテロ原子を環の中に有する、芳香族炭素環基を指す。特に明記していない限り、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、およびヘテロアリール基は、ヘテロ原子1〜5個と炭素原子1〜12個とを有する。「置換ヘテロアルキル」、「置換ヘテロアルケニル」、「置換ヘテロアルキニル」、および「置換ヘテロアリール」基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ベンジル、炭化水素鎖、ハロゲン、アルコキシ、アシルオキシ、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシ、ベンジルオキシ、フェニル、ベンジル、シアノ、ニトロ、チオアルコキシ、カルボキサルデヒド、カルボアルコキシ、およびカルボキサミドのような基、または本発明の目的にとって必要であれば、保護基によって適切に保護されうる官能基を含むがこれらに限定されない一つまたは複数の置換基によって置換されたヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、およびヘテロアリール基を指す。そのような置換ヘテロアルキル基の例には、フェニルまたはベンジル基によって窒素または炭素で置換され、炭素または窒素上の利用できる価数によって分子の残りに結合したピペラジン、-NH-SO2-フェニル、-NH-(C=O)O-アルキル、-NH-(C=O)O-アルキル-アリール、および-NH-(C=O)-アルキルが含まれるがこれらに限定されない。化学的に可能であれば、ヘテロ原子のみならず基の炭素原子を置換することができる。ヘテロ原子は、化学的に可能であれば、酸化型となりうる。
「アルキルアリール」という用語は、アリール基1、2、または3個が付随した指定された炭素原子数を有するアルキル基を指す。
本明細書において用いられる「アルコキシ」という用語は、酸素原子に結合して、明記された炭素数を有する、または炭素数が明記されていない場合には炭素原子12個までを含む、アルキル、アルケニル、アルキニル、または炭化水素鎖を指す。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、およびt-ブトキシのような基が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書において用いられる「アルカノエート」という用語は、アセテート（CH3(=O)-C(-1)）、プロピオネート（CH3CH2C(=O)-O(-1)）等のようなイオン化カルボン酸基を指す。「アルキルアルカノエート」は、酢酸エチル（CH3C(=O)-O-CH2CH3）のようなアルコキシ基によってエステル化したカルボン酸を指す。「ω-ハロアルキルアルカノエート」は、カルボキシル基から最も遠い位置に存在するアルカノエート炭素原子上にハロゲン原子を有するアルキルアルカノエートを指し、このように、エチルω-ブロモプロピオネートはエチル3-ブロモプロピオネートを指し、メチルω-クロロn-ブタノエートは、メチル4-クロロn-ブタノエート等を指す。
本明細書において用いられる「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、Cl、Br、F、またはI置換基を指す。
前述の定義の全てに関して、好ましい基のサブセットには、、C1〜C12、C1〜C10、C1〜C8、C1〜C6、C1〜C4、C1〜C2（化学的に可能であれば）、C3〜C4、C3、およびC4アルキル基が含まれる。
「保護基」は、以下の特徴を示す化学基を指す：1）それに対する保護が望ましい、計画される反応にとって安定である保護基質を生じるために良好な収量で所望の官能基と選択的に反応する；2）所望の官能基を生じるために保護された基質から選択的に除去することができる；および3）そのような計画される反応において存在または生成された他の官能基と適合性の試薬によって良好な収率で除去することができる。適した保護基の例は、Greeneら（1991）「Protective Groups in Organic Synthesis」、第3版（John Wiley＆Sons, Inc.、ニューヨーク）に認められうる。アミノ保護基には、メシチレンスルホニル（Mts）、ベンジルオキシカルボニル（CBzまたはZ）、t-ブチルオキシカルボニル（Boc）、t-ブチルジメチルシリル（TBSまたはTBDMS）、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）、トシル、ベンゼンスルホニル、2-ピリジルスルホニル、または6-ニトロベラトリルオキシカルボニル（Nvoc）、ニトロピペロニル、ピレニルメトキシカルボニル、ニトロベンジル、ジメチルジメトキシベンジル、5-ブロモ-7-ニトロインドリニル等のような適した感光保護基が含まれるがこれらに限定されない。ヒドロキシル保護基には、Fmoc、TBS、感光保護基（ニトロベラトリルオキシメチルエーテル（Nvom）のような）、Mom（メトキシメチルエーテル）、およびMem（メトキシエトキシメチルエーテル）、NPEOC（4-ニトロフェネチルオキシカルボニル）およびNPEOM（4-ニトロフェネチルオキシメチルオキシカルボニル）が含まれるがこれらに限定されない。
「ポリアミン類似体」は、スペルミンおよび／またはスペルミジンおよびその前駆体、ジアミンプトレッシンのようなポリアミンと構造的に類似であるが同一でない有機陽イオンとして定義される。「ポリアミン」は、アミノ酸からの生合成に由来する脂肪族の直鎖アミンの任意の群として定義される；いくつかのポリアミンは、Martonら（1995）Ann. Rev. Pharm. Toxicol. 35：55〜91において参照されている。ポリアミンであるカダベリンおよびプトレッシンはそれぞれ、リジンまたはオルニチンの脱カルボキシル化によって産生されたジアミンである。プトレッシンは、アミノプロピル基の付加によってスペルミジンに変換され、スペルミジンはスペルミンに変換される。この基は、脱カルボキシル化S-アデノシルメチオニンによって提供される。
「配座による拘束」とは、ポリアミン類似体において、少なくとも二つのアミノ基の空間的立体配置が互いに対して固定されるまたは制限されることを意味する。二つのアミノ基の相対的運動は、例えば、隣接する窒素が配座によって拘束される基に含まれない場合、隣接する窒素（例として、3炭環、4炭環、5炭環、6炭環のような環、または二重もしくは三重炭素結合のような二重もしくは三重結合が挙げられるがこれらに限定されない）の間に環状または不飽和部分を組み入れることによって制限することができる。立体妨害による配座の柔軟性を制限するがなおも抗増殖作用にとって構造的に好ましい置換基も同様に、配座による拘束のために用いることができる。「配座により拘束された」ポリアミン類似体は、互いに対して配座によって拘束された少なくとも二つのアミノ基を含みうるが、同様に、互いに対して配座によって拘束されないアミノ基をさらに含みうる。スペルミンおよびBE-444のような柔軟な分子は、無数の配座を有することができ、したがって、配座によって拘束されない。ポリアミンおよびポリアミン類似体の双方において、配座による拘束の有無によらず、アミノ基は脂肪族であって芳香族ではない。
本明細書において用いられるように、「一つ（a）」、「一つ（an）」、および「その（the）」は、特に明記していない限り、単数または複数（すなわち、一つまたは複数を意味しうる）を意味しうる。
発明の方法
本発明は、個体の末梢血試料におけるCD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／または異常なマクロファージレベル、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数を検出することを含む、個体におけるALSの治療をモニターする方法を提供する。本発明はまた、ALS患者の末梢血試料における異常なマクロファージレベル、および／またはCD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数を決定することを含む、ALS患者におけるALSの発症または進行をモニターする方法も提供する。本発明はまた、ALS患者におけるCD14+単球、好ましくは循環中の活性化単球の数を減少させる方法も提供する。本発明はまた、ALS患者におけるCD14+単球、好ましくは循環中の活性化単球の数を減少させるために有効な物質をスクリーニングする方法も提供する。
CD14+細胞上のHLA-DR発現の上昇、および／またはCD14+/CD16+細胞数の増加、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合はALSに関連しているため、これらのレベルをモニターすることによって、治療の適当な用量と共に初回反応性および／または有効性が示される可能性がある。治療のモニタリングは、例えば治療の適用の間の異なる時間に生体試料を得て、互いと、対照値と、および／または所望の値とのいずれかと比較することを意味すると理解される。一つの態様において、治療のモニタリングには、末梢血からのCD14+細胞によるHLA-DR発現レベルを決定する段階が含まれる。もう一つの態様において、治療のモニタリングには、血液試料、好ましくは末梢血試料において上昇したHLA-DRを発現するCD14+細胞レベルを決定する段階が含まれる。もう一つの態様において、治療のモニタリングには、血液試料、好ましくは末梢血試料においてCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を決定する段階が含まれる。もう一つの態様において、治療のモニタリングには、血液試料、好ましくは末梢血試料においてCD14+/CD16+細胞数を決定する段階が含まれる。もう一つの態様において、治療の間および／または治療終了時に決定した血液試料中の異常なマクロファージレベル（様々な態様において、上昇したHLA-DRを発現するCD14+細胞レベル；CD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合および／またはCD14+/CD16+細胞数）を、一般的に対照試料におけるレベルおよび／または所望の値と比較する。もう一つの態様において、治療のモニタリングにはまた、異常なマクロファージの増殖を測定する段階が含まれる。
一つの態様において、ALS治療をモニターする目的のために、治療を受けている患者から特定の時間に採取した試料および／または治療後もしくは治療終了時に採取した試料における異常なマクロファージレベルを、一般的に、治療前に患者から採取した試料におけるレベルおよび／または治療の異なる時点で患者から採取した試料におけるレベルと比較する。例えば、治療前または治療のより初期の時点で採取した試料と比較して、治療の間に採取した試料における異常なマクロファージレベルの減少は、一般的にALS治療の陽性作用と一致すると考えられる。
一つの態様において、ALS治療をモニターする目的のために、異常なマクロファージレベルを、末梢血試料のような血液試料からのCD14+細胞によるHLA-DR発現レベルを決定することによって評価する。例えば、治療効果は、治療前および治療中の末梢血におけるCD14+細胞によるHLA-DR発現レベルを比較することによって決定され、HLA-DR発現が減少する傾向は、一般的に陽性作用と一致する。
一つの態様において、ALS治療をモニターする目的のために、異常なマクロファージレベルを、末梢血試料のような血液試料からのCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を決定することによって評価する。例えば、治療効果は、治療前および治療中の末梢血中のCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を比較することによって決定され、CD14+/CD16+細胞の割合の減少傾向は、一般的に陽性作用と一致する。
一つの態様において、ALS治療をモニターする目的のために、異常なマクロファージレベルを、末梢血試料のような血液試料におけるCD14+/CD16+細胞数を決定することによって評価する。例えば、治療効果は、治療前および治療中の末梢血におけるCD14+/CD16+細胞数を比較することによって決定され、CD14+/CD16+細胞数の減少傾向は、一般的に陽性作用と一致する。
ALSを有する個体において、生体試料、例えば末梢血におけるCD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数を決定することはまた、疾患の発症または進行をモニターするために役立つ可能性がある。このように、本発明にはまた、その個体からの末梢血試料におけるCD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数、および／または異常なマクロファージレベルを決定することを含む、ALSを有する個体における疾患の発症または進行をモニターする方法が含まれる。好ましくは、個体は、ALSに「罹患している」（例えば、ALSの一つまたは複数の臨床症状を有する、それらを患う、および／またはそれらを示すと診断されている）。
CD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数はALSに関連しているため、これらのレベルをモニターすれば、疾患の発症または進行における変化の指標を提供する可能性がある。ALSを有する個体のモニタリングは一般的に、生体試料を、異なる時間、例えば、数週間、数ヶ月、および／または数年の間に得て、互いに、対照値、および／または所望の値と比較することを意味する。もう一つの態様において、ALSを有する個体における疾患の発症または進行のモニタリングにはまた、異常なマクロファージの増殖を測定する段階が含まれる。ALSのモニタリングにおいて、CD14+細胞によるHLA-DR発現レベルの増加、および／またはCD16+/CD14+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数の増加は、一般的に疾患の重症度および／または進行速度の増加と一致する。
ALSを発症するリスクが高いまたは有意であると見なされる個体において、生体試料におけるCD14+細胞によるHLA-DR発現の上昇、および／またはCD16+/CD14+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数はまた、可能性がある前兆疾患について個体および／または医師に警告するために役立つ可能性がある。このように、本発明にはまた、その個体からの生体試料におけるCD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／またはCD14+/CD16+細胞数、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を決定することを含む、ALSを発症するリスクがあるまたはリスクが高い個体をモニターする方法が含まれる。好ましくは、個体は、ALSまたはALSの「リスク」（例えば、ALSに対して遺伝的素因を有する、ALSの家族歴がある、またはALSを獲得する可能性を増加させる要因に環境的に曝露されている）に関連した一つまたは複数の臨床症状を示す。ALSを発症するリスクがある、またはリスクが高い個体をモニターする場合、CD14+細胞によるHLA-DR発現レベルの上昇、および／または血液中のCD14+/CD16+細胞の割合の増加、および／またはCD14+/CD16+細胞数の増加は、一般的に、ALS疾患症状の発症のリスクの増加と一致する。
（高い）リスクがある個体のモニタリングは一般的に、生体試料を異なる時間、例えば数週間、数ヶ月、および／または数年にわたって得て、これを互いに、対照値と、および／または所望の値と比較することを意味するが、必ずしもその必要はないと理解される。一つの態様において、（高い）リスクがある個体のモニタリングには、CD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／または試料中のCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／または末梢血のCD14+/CD16+細胞数を決定する段階が含まれる。もう一つの態様において、（高い）リスクがある個体のモニタリングにはまた、異常なマクロファージの増殖を測定する段階が含まれる。
治療のモニタリング、疾患の発症または進行のモニタリング、または（高い）リスクがある個体のモニタリングを目的とする場合、一般的に、試料中のCD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／またはCD16+/CD14+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数を、必要であれば性別および／または年齢を一致させた健康な個体または非ALS患者から採取した試料中のレベルの平均値または中央値と比較してもよい。または、これらの指標の結果を、同じモニターした個体から様々な時点で採取した試料からの結果の値、値の平均値または中央値と比較することができる。非ALS試料と比較した場合の、ALS試料からのCD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／またはCD14+/CD16+細胞数、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合の差または変化は、一般的に疾患の発症または活動度の変化と相関する。例えば、CD14+細胞によるHLA-DR発現、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数の増加は、ALS進行の増加と相関する。
一つまたは複数の他の疾患の指標と組み合わせて、CD14+細胞によるHLA-DR発現レベルの上昇、および／またはCD14+/CD16+細胞数の増加、および／または試料中のCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合の増加は、ALSの診断または予測において役立つ可能性がある。鑑別診断には、原因または重大な作用としてALSに関連した任意の病態も含まれると考えられ、確定診断は主治医または臨床医の責任である。したがって、本発明には、ALSの診断を補助する方法が含まれる。これらの方法は一般的に、ALSを有することが疑われる個体からの血液試料における、CD14+細胞によるHLA-DR発現レベル、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数、および／または異常なマクロファージレベルを決定する段階を含む。
HLA-DR発現レベルの上昇を決定するために、HLA-DR発現レベルの平均値または中央値を、ALS個体からのCD14+細胞集団において決定する。HLA-DR発現レベルは、血液試料から得た細胞あたりのHLA-DR分子数として計算することができる。より通常には、レベルは、試料中の細胞のCD14+集団に関してHLA-DR検出シグナル（例えば、蛍光強度）の細胞あたりの平均値として計算される。レベルは、異なる時間および／または異なる条件で測定される同じ個体からのHLA-DRレベルと比較してもよい（治療前、異なる用量等のような）。
いくつかの態様において、HLA-DRレベルを、非ALS標準体、例えば、非ALS個体または複数の非ALS個体からのCD14+細胞集団について決定されたHLA-DR発現レベルの平均値または中央値と比較する。HLA-DR発現レベルが非ALS標準体の約1.4倍より大きいという知見は、ALS個体におけるHLA-DR発現レベルが上昇していることを示している。一般的に、HLA-DR発現レベルが非ALS標準体の約1.5倍より大きい、約1.6倍より大きい、約1.7倍より大きい、約1.8倍より大きい、約1.9倍より大きい、約2.0倍より大きい、約5.0倍より大きい、または約10倍より大きいという知見は、ALS個体におけるHLA-DR発現レベルの上昇を示している。
CD14+単球によるHLA-DR、すなわちクラスII主要組織適合性抗原の発現レベルは、「Current Protocols of Immunology」（J.E. Coliganら編、1999）に記述されるように一般的なフローサイトメトリー技術のような当技術分野で既知の方法を用いて決定することができる。一般的なフローサイトメトリーを含む当技術分野で既知の方法も同様に用いて、CD14+細胞を含む細胞上におけるCD16発現を決定するために用いることができる。一般的に、個体の血液試料からの細胞を、抗CD14抗体、抗CD16抗体、および抗HLA-DR抗体を含む抗原に対して特異的な一つまたは複数の抗体を用いて、一つまたは複数の細胞抗原に関して染色することができる。細胞を複数の抗原の発現に関してアッセイする場合、細胞を、抗原特異的抗体によって同時または連続的に染色してもよい。または、特定の抗原を発現する細胞を発現していない細胞から分離して、次に、単離された細胞集団を他の任意の抗原の発現に関して染色することができる。抗原特異的抗体は、蛍光体によって直接標識するか、または蛍光体結合抗抗体抗体（すなわち、第二抗体）を用いて間接的に標識することができる。抗原特異的抗体と反応させて、蛍光標識した後、Becton DickinsonのFACスキャンのようなフローサイトメトリーを用いて細胞を分析する。CD14+細胞上のHLA-DR発現レベルは、フローサイトメーターから回収したデータに基づいて定量することができる。例えば、実施例1を参照されたい。細胞上でのCD14およびCD16の同時発現も同様に、フローサイトメトリーデータに基づいて決定することができる。
CD14+単球におけるHLA-DR発現レベルも同様に、当技術分野で既知の他の技術によって決定することができる。例えばCD14+細胞は、例えば、「Current Protocols of Immunology」（J.E. Coliganら編、1999）に記述されるように、例えば抗体に基づく電気的セルソーティング技術を用いて、他の血液細胞および成分から単離することができる。単離されたCD14+細胞によるHLA-DR発現レベルは、細胞からのmRNAおよび／またはタンパク質の分析によって決定することができる。CD14+細胞におけるHLA-DR RNAの量は、例えば「Current Protocols in Molecular Biology」（F.M. Ausubelら編、1987）に記述されるように、S1ヌクレアーゼ分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法、プライマー伸長アッセイ法、RNAブロット分析（例えば、ノザンおよび／またはスロットブロットハイブリダイゼーション）、および定量的RT-PCRを含むがこれらに限定されない当技術分野で既知の様々な技術によって測定することができる。CD14+細胞表面内および／または表面上のHLA-DRタンパク質の量は、「Current Protocols of Immunology」（J.E. Coliganら編、1999）に記述されているように、ラジオイムノアッセイ法、免疫蛍光アッセイ法、酵素イムノアッセイ法、化学発光アッセイ法、ELISA、またはウェスタンブロットアッセイ法を含むがこれらに限定されない当技術分野で既知の様々な技術を用いて測定することができる。これらのような技術はまた、CD14+単球内またはCD14+単球上でのCD16の発現を測定するためにも用いることができる。
分析すべき生体試料は、異常なマクロファージが試料中に存在する場合、分析時に検出可能であるように分析前に適当な条件で維持される。いくつかの態様において、分析すべき生体試料の細胞は、生体試料が採取される容器および試料の細胞が分析まで保存される培地を含むがこれらに限定されないものの中において、十分な非キレート化カルシウムと共に維持される。これは、カルシウムキレート剤が存在し得ない、およびカルシウムがキレート化され得ないと伝えることを意味しているのではない。例えば、いくつかの態様において、分析すべき生体試料の細胞と共に存在する任意のカルシウムキレート剤も、血液凝固を妨害するために十分な量より少ない量で存在する。逆に、いくつかの態様において、血液凝固を妨害するために十分なカルシウムキレート剤の量で分析すべき細胞を維持することは避けるべきである。いくつかの態様において、分析すべき生体試料の細胞は、カルシウムキレート剤の非存在下で維持される。実施例2に示すように、カルシウムキレート剤の非存在下では、ALS試料におけるCD14+/CD16+細胞の割合は、非ALS試料におけるCD14+/CD16+細胞の割合より4倍を超えて高かった。しかし、生体試料中にカルシウムキレート剤が存在すると、ALS試料における検出可能なCD14+/CD16+細胞の数は、非ALS試料におけるCD14+/CD16+細胞の範囲内まで減少した。このように、これらの末梢血試料にカルシウムキレート剤が存在すると、ALSの指標としてのCD14+/CD16+細胞数の有用性を妨害した。
いくつかの態様において、分析した細胞のCD14、CD16、および／またはHLA-DR発現の決定は、生体試料を採取した当日に行われる（すなわち、「当日」分析）。他の態様において、CD14、CD16、および／またはHLA-DR発現の決定は、試料を採取した翌日に行われる（すなわち、「2日目」の分析）。いくつかの態様において、分析される細胞のCD14、CD16、および／またはHLA-DR発現の決定は、血液採取の約96時間、約72時間、約60時間、約48時間、約36時間、約24時間、約18時間、約12時間、約6時間以内、血液採取の約4時間以内、または血液採取の約2時間以内に行われる。いくつかの態様において、分析される生体試料は、血液、好ましくは末梢血である。いくつかの態様において、末梢血試料は、ヘパリンを含む容器に採取される。
いくつかの態様において、CD14+/CD16+細胞数、またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を、非ALS標準体、例えば非ALS個体または複数の非ALS個体からの生体試料におけるCD14+/CD16+細胞レベルの平均値または中央値と比較する。試料中のCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合、および／またはCD14+/CD16+細胞数が、非ALS標準体の約1.5倍より大きい、約1.6倍より大きい、約1.7倍より大きい、約1.8倍より大きい、約1.9倍より大きい、約2.0倍より大きい、約3.0倍より大きい、約4.0倍より大きい、約5.0倍より大きい、または約10倍より大きいという知見は、ALS個体におけるCD14+/CD16+細胞数の増加を示している。
一般的に、これらの異常なマクロファージは、当業者がCD14+単球によるHLA-DR発現の上昇、および／またはCD14+/CD16+細胞数の増加、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合の増加について認められると予想されることに関して、T細胞の同時活性化を検出することなく、またはT細胞活性化のレベルの減少と共に、ALSを有する個体またはALSを発症するリスクを有する個体において検出される。T細胞の活性化は、当技術分野で既知の方法および標準物質を用いて評価することができる。例えば、T細胞活性化レベルは、CD4、CD8、および／またはCD38を含むがこれらに限定されない細胞上の特定の細胞活性化マーカーの発現によって、およびそのようなマーカーを発現する集団に存在する細胞数によって決定することができる。実施例1に示すように、ALS個体からの末梢血におけるT細胞集団は、CD4/CD38およびCD8/CD38細胞集団によって示されるように、正常な（非ALS）個体からの集団と同等であった。
先に記述したように、いくつかの場合において、上昇したHLA-DRを発現するCD14+細胞集団には増殖性のマクロファージが含まれる。同様に先に記述したように、いくつかの場合において、CD14+/CD16+細胞集団には増殖性のマクロファージが含まれる。増殖性のマクロファージの測定は、任意のいくつかの技術を用いて得ることができる。本発明のいくつかの態様において、異常なマクロファージの増殖は循環中の総マクロファージと比較して測定され、これは末梢血からの白血球調製物において行われる。本発明の他の態様において、増殖は、組織固定マクロファージに関して測定され、典型的には組織切片上で行われる。増殖性のマクロファージは、例えば、PCNA、Ki67のような細胞増殖マーカーをアッセイすることによって、またはブロモデオキシウリジン（BrdU）もしくは3H-チミジンの取り込みによって検出してもよい。これらのマーカーは、CD69およびCD25のような「活性化」マクロファージ（増殖性のマクロファージとは対照的に）のみを特定するマーカーとは異なる。マクロファージを表す細胞サブセットは、次に、CD14、CD68、CD16、または非特異的エステラーゼのような特定の細胞特異的マーカーの検出によって同定してもよい。これらの細胞の種類および／または増殖マーカーの検出は、染色技術ならびにFACSソーティングおよび分析のような当技術分野で標準的な方法を利用する。これらの方法を実施例3にさらに説明する。さらに、これらの増殖性マクロファージは、細胞密度（例えば、PERCOLL（商標）勾配）のような他の特徴に基づいて区別することができる。これらの決定は、当技術分野で標準的な技術を用いて経験的に確立してもよい。
本発明は、ALS患者における異常なマクロファージレベルを減少させる物質をスクリーニングする方法を提供する。例として、ALSに関連した異常なマクロファージレベルを減少させるために有効な作用物質の全般的スクリーニングを行うために、末梢血細胞をALSに罹患した個体から単離する。異常なマクロファージのレベルおよび／または生存率を試料において決定し、細胞の試料を候補物質によって処理して、その作用を処置していない細胞と比較する。例えば、無処置の試料と比較して処置した試料における異常なマクロファージのレベルおよび／または生存率が減少すれば、候補物質が、ALS患者における異常なマクロファージのレベルおよび／または生存率を減少させるために有効である可能性があることを示すと考えられる。患者に投与する場合、候補物質の作用は、治療前および治療中の異常なマクロファージのレベルを比較することによって決定され、異常なマクロファージの減少傾向は一般的に陽性作用と一致する。様々な態様において、異常なマクロファージレベルの決定には、生体試料中のHLA-DR発現が上昇したCD14+単球レベル、および／またはCD14+/CD16+細胞数、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を決定することが含まれる。一般的に、CD14+細胞の生存率を含む細胞生存率を評価するための技術および試薬は、当技術分野で周知である。
本発明は、ALS患者からのCD14+単球数、好ましくは活性化したCD14+単球数および／またはHLA-DR発現が上昇したCD14+単球数、および／またはCD14+/CD16+細胞数、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を減少させる作用物質をスクリーニングする方法を提供する。ALS患者からのそのようなCD14+細胞数を減少させる指標には、生体試料における細胞の生存率を減少させることおよび／または細胞数を減少させることが含まれるがこれらに限定されない。例として、ALSに関連したCD14+単球数を減少させるために有効な作用物質の一般的スクリーニングを行うために、ALSに罹患した個体から末梢血細胞を単離する。試料中のCD14+単球数を決定し、細胞の試料を候補物質によって処置して、その作用を処置していない細胞と比較する。例えば、無処置の試料と比較して処置試料中のCD14+単球数のレベルが減少すれば、候補物質がALS患者におけるCD14+単球数レベルを減少させるために有効である可能性があることを示すと思われる。患者に投与する場合、候補物質の作用は、治療前および治療中のCD14+単球、好ましくは活性化CD14+単球数のレベルを比較することによって決定され、CD14+単球数の減少傾向は、一般的に陽性作用と一致する。
本発明は、ポリアミン類似体、ポリアミン類似体の塩、またはポリアミン類似体の保護された誘導体を、個体におけるCD14+単球数、好ましくは活性化したCD14+単球数および／またはHLA-DR発現が上昇したCD14+単球数のレベル、および／またはCD14+/CD16+細胞数、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を減少させるために十分な量（すなわち、有効量）で投与することを含む、ALS患者におけるCD14+単球数、好ましくは活性化CD14+単球数を減少させる方法を提供する。「CD14+単球数を減少させるために十分な量」は、好ましくは、CD14+単球数を少なくとも約25％、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、およびさらにより好ましくは少なくとも約90％減少させることができる。そのような減少は、疾患の進行を和らげる、改善する、安定化する、逆転させる、緩徐化するまたは遅延させる、疾患の発症を遅延および／または予防さえするような望ましい同時作用を有する可能性がある。
もう一つの態様において、ポリアミン類似体またはポリアミン類似体の保護誘導体を含む組成物を、マクロファージ増殖を調節するために十分な量（すなわち、有効量）でALS患者に投与する。ポリアミン類似体は下記および本明細書において考察する。
本明細書に開示の様々な化合物を本発明の方法において用いることができる。化合物は、遊離の塩基または遊離の酸の形で用いることができる（すなわち、塩ではなくて遊離の化合物として）。さらに、化合物の任意の薬学的に許容される塩も同様に用いることができる。薬学的に許容される塩は、遊離の化合物の生物活性を保持して、生物学的またはそれ以外に望ましくないことがない塩である。塩基化合物の所望の塩は、化合物を酸によって処置することによって、当業者に既知の方法によって調製してもよい。無機酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸が含まれるがこれらに限定されない。有機酸の例には、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、スルホン酸、およびサリチル酸が含まれるがこれらに限定されない。アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩のような、塩基化合物のアミノ酸との塩も同様に調製することができる。酸性化合物の所望の塩は、化合物を塩基によって処置することによって当業者に既知の方法によって調製することができる。酸化合物の無機塩の例には、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩のようなアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、ならびにアルミニウム塩が含まれるがこれらに限定されない。酸性化合物の有機塩の例には、プロカイン、ジベンジルアミン、N-エチルピペリジン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、およびトリエチルアミン塩が含まれるがこれらに限定されない。リジン塩のような酸性化合物のアミノ酸との塩も同様に調製することができる。
開示された化合物の立体異性体も同様に、本発明において用いることができ、これらには、ラセミ混合物を含むがこれらに限定されない立体異性体の混合物と共に、ジアステレオマーおよびエナンチオマーが含まれる。立体化学が構造において明確に示されている場合を除き、構造は、示した化合物の全ての起こりうる立体異性体を含むと意図される。
本発明の目的に関して、ポリアミン類似体の投与に適した個体は、ALSを有すると診断された個体、またはそのような障害を発症するリスクが高いと判断された個体である。「リスクがある」または「リスクが高い」個体は、ALSを発症する明確かつ有意なリスクを有する個体である。「リスクがある」または「リスクが高い」個体は、検出可能な疾患を有するまたは有しなくてもよく、本明細書に記載の方法を受ける前に検出可能な疾患を示してもよく示さなくてもよい。「リスクが高い」（または「リスクがある」）は、個体が、疾患の発症に相関する測定可能なパラメータであるいわゆる危険因子を一つまたは複数有することを指す。これらの危険因子の一つまたは複数を有する個体は、これらの危険因子を有しない個体より疾患を発症する確率が高い。これらの危険因子には、遺伝的（すなわち、遺伝性）検討事項（家族歴および遺伝子マーカーを含む）が含まれるがこれらに限定されない。たった一つの危険因子を有することがしばしば高いリスクを示しうると理解される。当業者としての医師は、リスクがある個体に関して作用物質を用いる治療が適応されるか否かを決定する自由裁量を有する。
もう一つの態様において、本発明は、DNA、RNA、および／または膜のような増殖性のマクロファージ標的とのポリアミンの相互作用を妨害する作用物質の有効量を含む組成物を投与することを含む、ALSを有する個体におけるマクロファージ増殖を調節する方法を提供する。増殖性のマクロファージ標的とのポリアミンの相互作用を妨害する作用物質は、天然のポリアミン合成および／または代謝、細胞内濃度の調節、および／または機能（すなわち、DNAとの相互作用）の任意の局面を妨害する作用物質である。
CD14+単球を減少させる作用物質
本発明のいくつかの態様において、好ましくは異常なマクロファージレベルの減少を行うこと（すなわち、ALS患者からのHLA-DRの発現が上昇したCD14+単球、および／またはCD14+/CD16+単球、および／またはCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合）は、ポリアミン類似体（立体異性体、塩、およびその保護された誘導体を含む）を用いて行われる。他の態様において、異常なマクロファージ増殖を減少させる任意の作用物質も用いてもよい。そのような抗増殖物質は当技術分野で既知である。ポリアミン類似体に関して、考察はまた、立体異性体、塩、およびその保護された誘導体に対しても行われると理解される。
ポリアミン類似体
本発明において用いられるポリアミン類似体には、構造1、2、3、4、および5の化合物、ならびに対応する立体異性体、塩、およびその保護された誘導体が含まれる：
Figure 2005511061
式中、R1、R2、R4、R6、およびR7は、水素、アルキル、およびアリールからなる群より独立して選択され、R3およびR5はアルキル基である；
Figure 2005511061
式中、R1、R2、R4、R6、R8、およびR9は、水素、アルキル、およびアリールからなる群より独立して選択され、R3、R5、およびR7はアルキル基である；
Figure 2005511061
式中、R1、R2、R4、R6、R8、R10、およびR11は、水素、アルキル、およびアリールからなる群より独立して選択され、R3、R5、R7、およびR9はアルキル基である；
Figure 2005511061
式中、R1およびR5は、メチル、エチル、n-プロピル、およびイソプロピルからなる群より独立して選択される；
式中、R2、R3、およびR4は、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C3〜C6シクロアルキル、C1〜C6アルキル-C3〜C6、シクロアルキル-C1〜C6アルキル、C3〜C10アリール、およびC1〜C6アルキル-C3〜C10アリール-C1〜C6アルキルからなる群より独立して選択され；かつ
式中、R6、R7、R8、およびR9は、H、メチル、およびエチルからなる群より独立して選択される；
Figure 2005511061
式中、R1およびR6は、メチル、エチル、n-プロピル、およびイソプロピルからなる群より独立して選択され；
式中、R2、R3、R4、およびR5は、C1〜C6アルキル、C2〜C6アルケニル、C3〜C6シクロアルキル、C1〜C6アルキル-C3〜C6、シクロアルキル-C1〜C6アルキル、C3〜C10アリール、およびC1〜C6アルキル-C3〜C10アリール-C1〜C6アルキルからなる群より独立して選択され；かつ
式中R7、R8、R9、R10、およびR11は、H、メチル、およびエチルからなる群より独立して選択される。
いくつかの態様において、ポリアミン類似体には、R3、R5、R7、およびR9が独立して(CH2)xであって、xが2〜6の整数であり、さらにR4、R6、およびR8が水素原子である構造3の化合物が含まれると考えられる。
いくつかの態様において、ポリアミン類似体には、R3、R5、R7、およびR9が独立して(CH2)xであって、xが2〜6の整数であり、R4、R6、およびR8が水素原子であり、R1およびR10がアルキル基であって、さらにR2およびR11が水素原子である構造3の化合物が含まれると考えられる。
いくつかの態様において、ポリアミン類似体には、R3、R5、R7、およびR9が独立して(CH2)xであって、xが2〜6の整数であり、R4、R6、およびR8が水素原子であり、R1およびR10がアルキル基であって、R2およびR11が水素原子であり、さらにポリアミン類似体の分子量が500未満である構造3の化合物が含まれると考えられる。
いくつかの態様において、化合物には、構造4の化合物も含まれる；
式中、R6、R7、R8、およびR9はHである；
式中、R1およびR5はエチルである；
式中、R6、R7、R8、およびR9はHであって、R1およびR5はエチルであり；かつ／または
R2およびR4は、C1〜C6アルキルからなる群より独立して選択され、R3はC1〜C6、C2〜C6アルケニル、C3〜C6シクロアルキル、C1〜C6アルキル-C3〜C6、シクロアルキル-C1〜C6アルキル、C3〜C10アリール、およびC1〜C6アルキル-C3〜C10アリール-C1〜C6アルキルからなる群より独立して選択される。
本発明において有用なさらなるポリアミン類似体には、式6の化合物、および対応する立体異性体、塩、およびその保護された誘導体が含まれる。
Figure 2005511061
式中、R4はC2〜C6 nアルケニル、C3〜C6シクロアルキル、C3〜C6シクロアルケニル、またはC3〜C6アリールであり；
R3およびR5は、単結合、C1〜C6アルキル、またはC1〜C6アルケニルから独立して選択され；
R2およびR6は、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、C3〜C6シクロアルキル、C3〜C6シクロアルケニル、またはC3〜C6アリールから独立して選択され；
R1およびR7は、水素、C1〜C6アルキル、またはC2〜C6アルケニルから独立して選択され；かつ
R8、R9、R10、およびR11は、Hである。
式6の化合物のいくつかの態様において、R1およびR7は、C1〜C6アルキル、またはC2〜C6アルケニルから独立して選択される。
本発明において有用なさらなるポリアミン類似体には、式7の化合物、ならびに対応する立体異性体、塩、およびその保護された誘導体が含まれる；
Figure 2005511061
式中、R4はC1〜C6 nアルキル、またはC1〜C6分岐アルキルであり；
R3およびR5は、単結合またはC1〜C6アルキルから独立して選択され；
R2およびR6は、C1〜C6アルキル、C1〜C6アルケニル、C3〜C6シクロアルキル、C3〜C6シクロアルケニル、またはC3〜C6アリールから独立して選択され；
R1およびR7は、水素、C1〜C6アルキル、またはC2〜C6アルケニルから独立して選択され；かつ
R8、R9、R10、およびR11は、Hである。
いくつかの態様において、式7の化合物において、R1およびR7はC1〜C6アルキルまたはC2〜C6アルケニルから独立して選択され、R4はC1〜C6飽和n-アルキル、またはC1〜C6飽和分岐アルキル、ならびにR3およびR5は、単結合、またはC1〜C6飽和n-アルキルから独立して選択される。
いくつかの態様において、ポリアミン類似体の窒素は全て、独立して二級、三級、または四級アミノ基である。
いくつかの態様において、本発明において用いられるポリアミン類似体は配座による拘束を受けうる。
環状ポリアミン化合物および環状ポリアミン類似体は、国際公開公報第02/10142号に開示されている。これらの環状ポリアミン化合物の特定のものにおいて、脂肪族窒素の一つまたは複数がアミド基の一部を形成する。
本発明において用いられるポリアミン類似体は、細胞において天然に存在するポリアミンレベルの調節能が証明された化合物である。理論に拘束されることを意図しないが、可能性があるメカニズムには、ポリアミン生合成経路における競合；SSATのようなポリアミン異化剤のアップレギュレーション；およびポリアミン代謝への影響が含まれる。
以下のポリアミン類似体は特に重要である：
・11,1-ビス(エチル)ノルスペルミン（1,11-ビス(エチルアミノ)-4,8-ジアザウンデカン；BE-3-3-3）
・1,8-ビス(エチル)スペルミジン（BES）
・1,12-ビス(エチル)スペルミン（BESm；DESPM（N1,N12-ジエチルスペルミン；SunPharm）；
・1,14-ビス(エチルアミノ)-5,10-ジアザテトラデカン（BE-4-4-4）（ジエチルホモスペルミン、N1,N14-ジエチルホモスペルミン；DEHOPまたはDEHSPM；SunPharm）
・ジエチル-ノルスペルミン（DENOP；SunPharm）
・1,19-ビス(エチルアミノ)-5,10,15-トリアザノナデカン（BE-4-4-4-4）
・N-エチル-N'-(2-(3'-エチルアミノ-プロピルアミノメチル)-シス-シクロプロピルメチル)-プロパン1,3-ジアミンテトラハイドロクロリド（SL-11037）、S'LIL、マディソン、ウィスコンシン州による提供
・N-エチル-N'-(2-(3'-エチルアミノ-プロピルアミノメチル)-トランス-シクロブチルメチル)-プロパン1,3-ジアミンテトラハイドロクロリド（SL-11038）、S'LIL
・N-エチル-N'-(2-(3'-エチルアミノ-プロピルアミノメチル)-トランス-シクロプロピルメチル)-プロパン1,3-ジアミンテトラハイドロクロリド（SL-11044）、S'LIL
・N,N'-ビス(3-エチルアミノプロピル)-シス-ブト-2-エン-1,4-ジアミンテトラハイドロクロリド（SL-11047、S'LIL）およびその対応するトランス異性体（国際公開公報第95/18091号を参照されたい）
・(5,10,15,20,25,30,35,40-オクタアザテトラテトラコント-22-エン-1,44-ジアミン、N,N'-ジエチル-、デカハイドロクロライド、(22E)-)（SL-11144）、これはS'LIL、化学物質登録番号（Chemical Abstracts Registry No.）304911-07-7を割り当てられた
・(5,10,15,20,25,30,35,40-オクラアザテトラテトラコント-22-エン-1,44-ジアミン、N,N'-ジエチル-、デカ塩酸塩、(22Z)-)（SL-11150）、これはS'LIL、化学物質登録番号304911-08-8を割り当てられた。
SL-11037、SL-11038、SL-11044、SL-11047、SL-11144、およびSL-11150の構造を下記に示す。
Figure 2005511061
さらに、米国特許第5,889,061号、第5,880,161号、および第5,541,230号ならびに国際公開公報第00/66587号、第00/66175号、および第02/10142号に記載されるポリアミン類似体を、本発明において用いてもよい。
分岐または非分岐となりうるポリアミン類似体には、BE-4444[1,19-ビス(エチルアミノ)-5,10,15-トリアザノナデカン]；BE-333[N1,N11-ジエチルノルスペルミン；DENSPM；1,11-ビス(エチルアミノ)-4,8-ジアザウンデカン；テルミン；Warner-Parke-Davis]；BE-33[N1,N7-ビス(エチル)ノルスペルミジン]；BE-34[N1,N8-ビス(エチル)スペルミジン]；BE-44[N1,N9-ビス(エチル)ホモスペルミジン]；BE-343[N1,N12-ビス(エチル)スペルミン；ジエチルスペルミン-N1-N12；DESPM]；BE-373[N,N'-ビス(3-エチルアミノ)プロピル)-1,7-ヘプタンジアミン、Merrell-Dow]；BE-444[N1,N14-ビス(エチル)ホモスペルミン；ジエチルホモスペルミン-N1-N14]；BE-3443[1,17-ビス(エチルアミノ)-4,9,14-トリアザヘプタデカン]；BE-4334[1,17-ビス(エチルアミノ)-5,9,13-トリアザヘプタデカン]；1,12-Me2-SPM[1,12-ジメチルスペルミン]；国際公開公報第98/17624号および米国特許第5,889,061号に開示される様々なポリアミン類似体；ならびに国際公開公報第00/66175号および国際公開公報第00/66587号に開示の様々な新規ポリアミン類似体であり、以下のように命名される化合物を含むがこれらに限定されない：
Figure 2005511061
。O'Sullivanら（1997）Bioorg. Med. Chem. 5：2145〜2155；およびMukhopadhyayaら（1995）Exp. Parasit. 81：39〜46；および米国特許第4,935,449号に記載されるような、さらなるポリアミン類似体が当技術分野で既知である。
上記のポリアミン類似体の他に、立体異性体、塩、または保護されたその誘導体を用いてもよい。本発明はまた、ALSに関連した異常なマクロファージ数を減少させるために、またはマクロファージの増殖を減少させるために（または、ALSを治療もしくは発症を遅らせるために）有効な、上記の任意のポリアミン類似体、または立体異性体、塩、もしくは保護されたその誘導体（または、上記の任意のポリアミン類似体、またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体の有効量を含む組成物）の有効量を用いる方法を含む。本発明はまた、ALSを治療するために有用な組成物（すなわち、医薬品）を調製するために用いられる上記の任意のポリアミン類似体、またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体を含む。
上記の任意のポリアミン類似体、またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体（または上記の任意のポリアミン類似体、もしくはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体の有効量を含む組成物）を、インビトロまたはインビボで用いてもよい。インビトロにおいて、適した生体試料（異常なマクロファージ集団に関して濃縮してもしなくてもよい血液試料のような）を組成物に接触させる。インビボにおいて、本発明の組成物は、一般的に、製造元／供給元の説明書に従って投与される。一般的にポリアミン類似体は、皮下または静脈内注射によって投与される。それらはまた、経口投与してもよい。
投与されるポリアミン類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体）の量は、用いる特定の類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体）、投与の時間経過、個体の状態、所望の目的、疾患の程度、投与回数、および他の物質を投与すべきか否かのような、いくつかの変数に依存すると考えられる。一般的に、用いる量は、製造元によって推奨されるようにおよび／または経験的な研究に基づくと思われる。ポリアミン類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体）の場合、量は一般的に約1〜約300 mg/m2/日の間であり、おそらく約15〜約150 mg/m2/日であると考えられる。投与は一般的に間欠的であり、類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体）が少なくとも1〜2日間の間投与されるが、その後少なくとも1〜2日間の間投与されず、このサイクルが指示通り繰り返されることを意味する。一つの態様において、ポリアミン類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体）は、3週間毎に6日間投与される。
投与経路は一般的に、用いられる特定のポリアミン類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体）の特性に依存し、例えば、経口または注射（皮下もしくは静脈内）であってもよい。投与は一般的に静脈内または皮下注射によって行う。
好ましくは、ポリアミン類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体）、またはポリアミン合成経路、ポリアミン代謝、および／もしくはスペルミン細胞内濃度の維持を妨害する他の適した作用物質を、適した薬学的賦形剤において投与する。薬学的賦形剤は、当技術分野で既知であり、Remington「The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、マック出版社（2000）に記載されている。ポリアミン類似体は、マクロファージへの作用物質の輸送を促進するまたはマクロファージに対する作用物質の特異性を増加するもう一つの物質に会合させてもよい。例えば、作用物質をリポソームに会合させてもよい。リポソームは、当技術分野で既知である。次に、リポソームをIgGFc受容体のような標的化物質に結合させてもよい。ザイモサンもしくはテトラクロロデカオキシゲン（TCDO）のようにマクロファージ貪食を増加させるおよび／またはMCSF、GMCSF、もしくはIL-3のように活性化を増加させる物質を用いて、抗増殖作用物質の取り込みを増加させてもよい。
ポリアミン類似体（またはその立体異性体、塩、もしくは保護された誘導体）は、投与の状況（すなわち、所望の最終結果、個体の状態、および適応）に応じて、単独または他の物質および／もしくは治療と組み合わせて投与してもよい。「組み合わせて」とは、作用物質が他の物質または治療の前、治療と同時、または治療の後に投与されることを意味する。作用物質と共に投与してもよい物質の例には、リルゾール（RILUTEK（登録商標））が含まれるがこれらに限定されない。ALSの治療に関して米国食品医薬品局によって承認されたリルゾールによる試験は、ALS患者の生存に対して統計学的に有意な作用を示した。（Bensimonら（1994）、New Eng. J. Med. 330：585〜591；Lacomblezら（1996）Lancet 347：1425〜1431）。ALS治療にはしばしば症状の制御をねらいとした治療が含まれる。したがって、作用物質と共に投与してもよいALSに関連した症状を治療するための物質の例には、バクロフェン、ジアゼパム、トリヘキシフェニジル、および／またはアミトリプチリンが含まれるがこれらに限定されない。
様々なポリアミン類似体および酵素阻害剤の機構的有効性は、少なくとも部分的にそれらが細胞内ポリアミンプールを枯渇させることによって、特定の細胞株において決定することができる。Kramerら（1995、Biochem. Pharmacol. 50：1433）は、ポリアミン生合成経路を介した代謝の流れをモニターするために、4-フルオロ-L-オルニチンを用いることを記述している。フッ化ポリアミンの出現速度によって示される代謝の流れが細胞の増殖状態を反映したことが示された。米国特許第5,498,522号は、予後指標または腫瘍反応マーカーとしてSSATを用いることを概説している。SSAT酵素活性、SSAT酵素タンパク質、もしくはmRNA転写物のいずれかを直接測定することができ、またはSSAT共因子アセチルCoA、およびSSAT産物N1-アセチルスペルミンおよびN1-アセチルスペルミジンのような、SSAT誘導に関連した他の決定因子を測定することができる。ポリアミン類似体の投与の作用をさらに決定するために、個体を、疾患（または前兆疾患）の生化学および／または遺伝子マーカーと共に疾患（または前兆疾患）の進行に関してモニターしてもよい。疾患の進行に関して、多数の採点尺度（すなわち、臨床機能の指標）が確立され、ALSに関して当技術分野で既知である。
ALSに関連した症状は当技術分野で既知である（例えば、Rowlandら（2001）、N. Engl. J. Med. 344：1688〜1700）。そのような症状には、筋の虚弱、筋力および筋協調運動の低下、麻痺、こむらがえり、声の変化および／またはしゃがれ声、言語障害、嚥下困難、容易に喉を詰まらせるまたは窒息する、呼吸困難、筋攣縮、筋萎縮、頻尿／切迫尿、ならびに足首、足、および脚の腫脹が含まれるがこれらに限定されない。神経筋検査に基づいて示されるALS症状には、例えば、片方の脚または近位の群（例えば、肩、股関節）に始まる脱力、筋振せん、痙攣、筋束収縮、筋萎縮、ぎこちない歩行、および異常な反射が含まれてもよい。
マクロファージ増殖を調節する他の作用物質
上記のポリアミン類似体の他に、ALSの状況においてマクロファージを調節するために用いられる適した作用物質には、一般的な抗増殖剤（すなわち、増殖調節物質）が含まれる。これらには、ダウノマイシン、マイトマイシンC、ダウンロルビシン（daunrorubicin）、ドキソルビシン、5-FU、シトシンアラビノシド、コルヒチン、サイトカラシンB、ブレオマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メソトレキセート、シスプラチナ、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、およびサポニンが含まれるがこれらに限定されない。
他の適した作用物質は、ポリアミン合成経路を阻害もしくは妨害する、またはポリアミンの代謝に影響を及ぼす作用物質であると思われる。他の適した作用物質は、厳密に調節されたスペルミジンの細胞内濃度に影響を及ぼす作用物質である。そのような作用物質の例は、ポリアミンを産生するために必要であるS-アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼを阻害するMGBG（ミトグアゾンジハイドロクロライド；XYRKAMINE（登録商標）；Ilex、テキサス州）である。DNA、RNA、および／または膜のような増殖性マクロファージ標的とのポリアミンの相互作用を妨害する任意の物質も同様に適していると思われる。もう一つの種類の有用な作用物質は、DNAとのポリアミンの相互作用を妨害する作用物質である。そのような作用物質は、例えば上記の任意の作用によってこの機能を発揮する（すなわち、ポリアミノ合成経路および／または代謝を妨害する、細胞内スペルミン、競合剤、の濃度を障害する等）と共にDNAとの干渉の点から見たポリアミンの機能に影響を及ぼす。本明細書に記載のこれらおよび他の任意の作用物質に関して、作用物質をどのように、および／またはどのような量で用いるべきかを決定する場合には、毒性に関する検討も考慮に入れなければならないと理解される。
上記の物質に関して、ポリアミン類似体として妥当に見なすことができるものもあれば、ポリアミン類似体であると見なされるものもあると理解される。
投与および他の検討は上記の通りである。
以下の実施例は本発明を説明するために提供するのであって、本発明を制限するために提供するものではない。
実施例
一般的に、以下の実施例において用いられ、本発明において用いるために適当なフローサイトメトリー法は、当技術分野で周知である。例えば、「Flow Cytometry：A Practical Approach」、第2版、M.G. Ormerod（編）オックスフォード大学出版、1997；「Handbook of Flow Cytmetry Methods」、J. Paul Robinson（編）、John Wiley & Sons（1993）；「Current Protocols in Cytometry」、J. Paul Robinson（編）、John Wiley & Sons（1997年10月、定期的に更新）；「Becton Dickinson Cytometry Source Book」、Becton Dickinson Immunocytometry Systems（1998年、定期的に更新）（サンノゼ、カリフォルニア州）を参照されたい。
実施例1：ALS患者からの末梢血における異常な単核細胞の検出
筋萎縮性側索硬化症（ALS）および非ALS患者からの末梢血単核球（PBMC）において、共通の細胞分化抗原の発現を調べた。調べた細胞分化抗原のパネルには、単球およびリンパ球における変化をモニターするために特異的な抗原が含まれた。ALS患者15人からの血液の分析結果を、正常な非ALSファミリーメンバー（3人）の分析結果、ならびにリンパ腫患者（患者11人）およびAIDS痴呆患者（患者2人）から収集した歴史的なデータと比較した。参加者またはその代理人はインフォームドコンセントを提出した。
表記の抗原に指向する以下のパネルの蛍光体標識抗体を分析に用いた：
フルオレセイン結合抗CD8（Becton Dickinson）；
フィコエリトリン結合抗HLA-DR（Becton Dickinson）；
フィコエリトリン結合抗CD38（Becton Dickinson）；
ペリジニンクロロフィルタンパク質結合抗CD4（Becton Dickinson）；
ペリジニンクロロフィルタンパク質結合IgG1（アイソタイプ対照、Becton Dickinson）
フルオレセイン結合抗CD14（DACO Corp.）；
フィコエリトリン結合抗CD16（DACO Corp.）；
フィコエリトリン結合抗PCNA（DACO Corp.）；
フィコエリトリン結合抗Ki67（DACO Corp.）；
フルオレセイン結合IgG1（アイソタイプ対照、DACO Corp.）；
フィコエリトリン結合IgG1（アイソタイプ対照、DACO Corp.）。
全ヘパリン加血100 μlを上記の標識抗体の一つまたは複数によって室温で遮光して20分間染色した。FACSLYSE溶液（Becton Dickinson）2 mlを加えて5分間インキュベートすることによって赤血球を溶解した。細胞懸濁液を400×gで5分間遠心した。細胞沈殿物をFACSLYSE 1 mlによって洗浄した後、0.01 Mリン酸緩衝生理食塩液（PBS）1 mlによって洗浄した。
細胞内抗原に関して染色していない細胞に関して、細胞を、0.1％アジ化ナトリウムを含む1％パラホルムアルデヒドの0.01 M PBS溶液1 mlによって固定した。
細胞内抗原に関して染色した細胞に関して、細胞を「透過溶液」（Becton Dickinson）0.5 ml中で再懸濁することによって透過性にして、室温で10分間インキュベートした。細胞をPBS 2 mlによって洗浄して、PBS 0.1 ml中に再懸濁した。洗浄した細胞を、室温で遮光して30分間細胞内抗原に対する抗体によって染色した。PBS 1 ml中で洗浄した後、染色した細胞を、0.1％アジ化ナトリウムを含む1％パラホルムアルデヒドの0.01 M PBS溶液1 mlによって固定した。
細胞をFACSCANフローサイトメーター（Becton Dickinson）によって分析した。細胞の抗体染色は、1試料あたり細胞少なくとも10,000個をフローサイトメーターの中に通過させることによって決定した。表現型の分析は、CELLQUESTソフトウェア（Becton Dickinson）を利用して行った。
ALS患者からの細胞表面CD14+単球上のクラスII主要組織適合抗原（HLA-DR）の発現レベルを、非ALS個体からのCD14+単球上のHLA-DRの発現レベルと比較した。CD14+細胞上のHLA-DR発現レベルを、Becton DickinsonのQuantibrite Kitおよび蛍光標準物質を用いて定量した。HLA-DR発現レベルは、CD14+集団の平均／細胞蛍光強度として測定した。対応のないT検定を用いる統計学的分析を用いて、非ALS個体からの細胞をALS個体からの細胞と比較した。結果を表1に示す。
（表１）CD14+ PBMCにおけるHLA-DRの定量的発現
Figure 2005511061
表1に示すように、ALS患者からのCD14+単球は、非ALS個体からのCD14+単球と比較してその細胞表面上に有意により高いレベルのHLA-DRを発現したことを示している。定量時の表面HLA-DRの発現は、表面HLA-DRレベルの64％の増加を示し、統計学的に有意であった（P≦0.01）。
一般的に、単球は、活性化および組織マクロファージへの分化の際に高レベルのHLA-DRを発現し、刺激していない循環中の単球は、低レベルのHLA-DRを発現する。このように、本明細書に示したデータは、ALS患者における循環中の単球が一般的に活性化されて、それらがマクロファージへと分化しつつあることを示している。
採血後1日で（「2日目」の細胞）上記のように、細胞マーカー発現に関してヘパリン加血をアッセイした。これらのALS患者および非ALS個体からの単球を増殖マーカーである増殖細胞核抗原（PCNA）およびKi67反応性を用いて増殖の証拠について分析した。PBMCを抗CD14および抗PCNAまたは抗Ki67によって染色して、上記のように分析した。結果を表2に示す。
（表２）CD14+ PBMCにおける抗原の発現
Figure 2005511061
表2に示すように、PCNA反応性はALS患者において正常範囲内であった。しかし、Ki67陽性CD14+細胞は、ALS患者において上昇しているように思われる。Ki67およびPCNAは、細胞周期の様々な段階で発現される。このように、ALS患者のCD14+細胞のKi67反応性は、細胞が分裂性であったことを示している。
PBMCをまた、Tリンパ球マーカーについても分析し、結果を表3に示す。
（表３）CD14+ PBMCにおけるリンパ球抗原の発現
Figure 2005511061
表3に示すように、Tリンパ球マーカーによるPBMCの分析では、Tリンパ球活性化のいかなる証拠も示されなかった。CD4およびCD8レベルは正常範囲内であった。CD4/CD38およびCD8/CD38反応比によって測定したリンパ球の活性化状態も同様に正常範囲内であり、免疫系のこの成分が一般的に正常であることを示唆している。
もう一つの実験において、ALS患者20人からの血液の分析結果を、正常な非ALS個体20人からの血液の分析結果と比較した。全ヘパリン加血を、採血した当日に（「当日」の細胞）上記の細胞マーカー発現に関して分析した。図1は、当日の血液試料からのCD14+単球上のHLA-DR発現レベルの結果を示す。図2は、当日の血液試料におけるCD16を同時発現するCD14+細胞の割合を示す。
図1に示すように、ALS患者からのCD14+単球は、非ALS個体からのCD14+単球と比較してその細胞表面上に有意に高いレベルのHLA-DRを発現した。図2は、CD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合が、非ALS個体の血液中と比較してALS患者の血液中では有意に上昇していることを示している。
要約すると、ALS患者のPBMCからのCD14+細胞は、細胞の活性化、分化、および増殖における異常を示唆する表面マーカーの変化を示している。例えば、リンパ球の活性化状態には主要な変化を認めなかったが、単球分画は活性化の証拠を示している。
実施例2：ALS患者からの異常な循環中マクロファージの同定に及ぼす採血条件の影響
先に記述したように、ヘパリン含有試験管に採取したALS患者からの血液試料7本と、カルシウムキレート剤であるクエン酸デキストロースを含む試験管（「ACD」試験管）に採取した血液試料について、細胞マーカー発現分析を行った。ヘパリン含有試験管に採取した正常な非ALS個体からの血液試料10本も同様に、採血した当日に上記のように細胞マーカー発現に関して分析した。
図3は、ヘパリン試験管に採取したALS血液試料 対 ACD試験管に採取したALS血液試料からのCD14+単球上のHLA-DRの発現レベルを示す。図4は、ヘパリン試験管に採取したALS血液試料 対 ACD試験管に採取したALS血液試料におけるCD16を同時発現するCD14+細胞の割合を示す。図3および4において、ヘパリン中に採取した正常な試料からの値を中央値に関して水平の実線で示し、標準偏差を中央値の上下の破線で示す。
図3および4に示すように、採取した血液試料中のカルシウムのキレート化によって、CD14+細胞上でのHLA-DR発現レベルとCD16+/CD14+細胞の割合のレベルはいずれも、当日分析したALS血液において正常レベル内である。EDTAをカルシウムキレート剤として用いた場合にも類似の結果が得られた。このことは、細胞培地におけるカルシウムのキレート化によって、ALSの特徴である異常なマクロファージが失われることを示している。これはまた、ALS試料を対照試料と区別する二つの有意なマクロファージ活性化パラメータを検出するために、細胞培地における十分な非キレート化カルシウムが必要であることを示唆している。
実施例3：ALS患者からのCD14+単球上のポリアミン類似体の影響
末梢血単核球（PBMC）を、密度1.087のパーコール（Pharmacia）、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州）に重層化させた後800×gで遠心することによってヘパリン処理した全血から単離する。パーコール／血漿界面に集められた細胞を採取して、0.01 Mリン酸緩衝生理食塩液（PBS）によって洗浄した。単離した細胞を、10％ウシ胎児血清を含むRPMI 1640培養培地において細胞約1×106個/mlの濃度で懸濁した。細胞をポリビニル培養チューブに1 ml/チューブの割合で加えた。SL-11047のようなポリアミン類似体を、最終濃度を1.0、0.1、および0.01マイクロモル濃度となるようにチューブ3本に加えた。対照として、第四のチューブには薬剤を加えない。チューブは全て、37℃で5％二酸化炭素の湿潤インキュベータ内に5日間入れる。
インキュベーション5日目に、細胞をインキュベータから取り出して、PBSによって洗浄し、PBS中に0.1 ml/チューブの割合で再懸濁した。単球の検出は、フルオレセイン結合抗CD14（DACO Corp.、カーペンテリア、カリフォルニア州）を遮光した室温で20分間加えることによって検出する。同時に少量を対照フルオレセイン結合IgG1（アイソタイプ抗体対照、DACO Corp.）によって染色して、これを陰性染色対照として用いる。細胞をPBSによって洗浄して、0.1％アジ化ナトリウムを含む1％パラホルムアルデヒドのPBS溶液1 mlを加えることによって固定した。CD14+単球は、CELLQUESTソフトウェア（Becton Dickinson）によって駆動させたFACSCANフローサイトメーター（Becton Dickinson、サンノゼ、カリフォルニア州）によってチューブ1本あたり細胞20,000個を処理することによって同定する。薬物処置試料におけるCD14+単球数を無処置対照と比較して、50％枯渇を得るために必要な薬物用量を計算した（ED50）。
上記の実験は、ALS患者6人、多発性硬化症（MS）患者1人、および正常な（非ALS）対照被験者1人からの循環中のCD14+単球について行った。本実験において、患者からの細胞をポリアミン類似体SL-11047の存在下または非存在下で6日間インキュベートして、CD14+細胞の生存を決定した。図5は、様々な細胞試料に関して1.0 μM SL-11047の存在下で死滅する細胞の割合の結果を示す。この実験は、ALS患者からの循環中のCD14+単球が、正常被験者またはMS患者の循環中のCD14+単球よりポリアミン類似体による障害に対して実質的に感受性が高いことを示している。殺細胞に対する感受性のこの差は、おそらく、ALS患者における循環中のCD14+単球の異常なマクロファージ集団に及ぼすポリアミン類似体の殺細胞作用による。このように、ポリアミン類似体は、ALS患者における異常なマクロファージレベルを減少させるためにおそらく有用である。
ALS患者（ALS）および非ALS個体（正常対照）の末梢血試料からの、CD14+単球上のHLA-DR発現レベルを示す棒グラフである。 ALS患者（ALS）および非ALS個体（正常対照）の末梢血試料からの、CD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を示す棒グラフである。 カルシウムキレート剤ACDを含む試験管に採血した場合に対するヘパリンを含む試験管に採血した場合の、ALS患者の末梢血試料に由来するCD14+単球上でのHLA-DR発現レベルを説明する棒グラフである。ヘパリンを加えた試験管に採取した末梢血試料からの非ALS個体（正常）のCD14+細胞のHLA-DR発現値を、中央値に関して実線で示し、標準偏差を中央値の上下に破線として示す。 カルシウムキレート剤ACDを含む試験管に採血した場合に対するヘパリンを含む試験管に採血した場合の、ALS患者の末梢血試料に由来するCD14+細胞集団におけるCD16+細胞の割合を説明する棒グラフである。ヘパリンを加えた試験管に採取した末梢血試料からの非ALS個体（正常）のCD14+/CD16+細胞の割合を、中央値に関して実線で示し、標準偏差を中央値の上下に破線として示す。 1 μMポリアミン類似体による処置後の末梢血試料からのCD14+細胞の死滅(％)を示す棒グラフである。示した試料は、ALS患者6人（Pt 1〜Pt 6）、多発性硬化症患者（MS Pt）1人、正常個体1人から得た。

Claims (7)

  1. 個体の血液試料における異常なマクロファージを検出する段階を含む、ALS疾患の診断を補助する方法であって、検出する段階が、HLA-DR発現が上昇したCD14+細胞またはCD14+/CD16+細胞を検出することを含む方法。
  2. 検出する段階が、HLA-DR発現が上昇したCD14+細胞を検出することを含む、請求項1記載の方法。
  3. 検出する段階が、CD14+/CD16+細胞を検出することを含む、請求項1記載の方法。
  4. 血液試料が、採血後約12時間以内に異常なマクロファージの存在に関して分析される、請求項1記載の方法。
  5. HLA-DR発現が上昇したCD14+細胞、またはCD14+/CD16+細胞が、ALSを有する個体の血液試料から得られる、候補物質の存在下および非存在下におけるHLA-DR発現が上昇したCD14+細胞またはCD14+/CD16+細胞の生存率の差を決定することを含む、ALSに関連した異常なマクロファージ数を減少させるために有効な作用物質をスクリーニングする方法。
  6. HLA-DR発現が上昇したCD14+細胞の生存率が決定される、請求項5記載の方法。
  7. CD14+/CD16+細胞の生存率が決定される、請求項5記載の方法。
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