JP2005504263A - タンデム質量分析によるタンパク質同定、特徴付けおよび配列決定のための改良された方法 - Google Patents

タンデム質量分析によるタンパク質同定、特徴付けおよび配列決定のための改良された方法 Download PDF

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Abstract

親和性捕捉レーザー脱離／イオン化タンデム質量分析法を使用する、タンパク質の特徴付け、同定、および配列決定のための新規な装置および方法が提供される。既存の親和性捕捉レーザ脱離イオン化質量分光計と比較して、感度、質量精度、および質量分析能が増加された親和性捕捉プローブレーザ脱離イオン化質量分析のための装置を提供することが、本発明の目的である。ＭＳ／ＭＳ性能を加えた親和性捕捉プローブレーザ脱離イオン化質量分析のための装置を提供することが、本発明のさらなる目的である。これらの改善された分析性能を利用する、生分子分析、特に、タンパク質分析の新規方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。

Description

【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、仮出願番号第６０／２８３，８１７号（２００１年４月１３日出願）および同第６０／２６５，９９６号（２００１年２月１日出願）（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、化学分析および生化学分析の分野であり、そして、特に、タンデム質量分析によるタンパク質分析物の改良された同定、特徴付けおよび配列決定のための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
質量分析計の改良された性能および低コスト化と合わせて、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）技術およびマトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）技術の出現によって、過去１０年間に、質量分析（ＭＳ）は、生物学的関連高分子（複雑な生物学的系から精製したタンパク質を含む）の研究における標準的分析手段の代表となった。
【０００４】
例えば、ペプチド質量フィンガープリント法としての公知の技術において、質量分析計は、生物学的サンプルから精製されたタンパク質の同定のために使用される。同定は、以前にデータベースに登録された一次配列から予想される質量と精製タンパク質のタンパク質分解されたフラグメントの質量スペクトルとを一致させることによって、達成される。Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ、Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １１７：２９９〜３０３（１９９２）；Ｐａｐｐｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．３（６）：３２７〜３３２（１９９３）；Ｍａｎｎら、Ｂｉｏｌ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２２：３３８〜３４５（１９９３）；Ｙａｔｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３：３９７〜４０８（１９９３）；Ｈｅｎｚｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５０１１〜５０１５（１９９３）；Ｊａｍｅｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９５：５８〜６４（１９９３）。
【０００５】
精製したタンパク質を同定するために、衝突誘起解離（ＣＩＤ）またはＭＡＬＤＩポストソース分解（ＰＳＤ）から得られたフラグメント質量スペクトルを使用する同様のデータベースマイニングアプローチが、開発されている。Ｅｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．５：９７６〜９８９（１９９４）；Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．９：１５４６〜１５５１（１９９５）；Ｙａｔｅｓら、米国特許出願番号第５，５３８，８９７号および同第６，０１７，６９３号；Ｍａｎｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：４３９０〜４３９９（１９９４）。
【０００６】
単離されたタンパク質の少なくとも部分的なデノボ配列決定を可能にする質量分析技術もまた、開発されている。Ｃｈａｉｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：８９〜９２（１９９３）；Ｋｅｏｕｇｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：７１３１〜６（１９９９）Ｂｅｒｇｍａｎ，ＥＸＳ ８８：１３３〜４４（２０００）における論評。
【０００７】
タンパク質の質量分析スペクトルの解析および公のドメイン配列データベースマイニングを容易にする、ソフトウェア源は、タンパク質の同定を容易にするために、インターネット上で現在容易に利用できる。これらの中には、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ／ｅｄｕ）、ＰＲＯＷＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ）、およびＭａｓｃｏｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｅｎｇｉｎｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）がある。
【０００８】
高精度の質量アサインメントは、有用な情報（例えば、上記の技術によって精製されたタンパク質の同定を促進する情報）を提供するが、このような情報は、それにもかかわらず、制限される。ＭＳ分析と標的タンパク質の酵素学的なおよび／または化学的修飾との組み合わせによって、かなりのさらなる分析能力が、発揮され、構造的構成要素の解明、翻訳後修飾およびさらなるタンパク質の同定を可能にする。
【０００９】
さらに、複雑な生物学的物質（例えば、血液、血清、血漿、リンパ、間質液、尿、滲出液、細胞全体、細胞溶解物および細胞分泌産物）は、代表的には数百もの生物学的分子を含み、加えて直接的な質量分析を妨げる有機塩および無機塩を含む。従って、有意なサンプル調製および精製工程が、代表的にはＭＳ研究に先立って必要である。
【００１０】
液体クロマトグラフィー（イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー）、膜透析、遠心分離、免疫沈降および電気泳動のようなサンプル精製の従来の方法は、代表的には、大量の開始サンプルを必要とする。大量のサンプルが利用可能の場合でさえ、微量成分は、これらの精製プロセスにおいて、非特異的結合および希釈効果に起因する分析物の損失を被り、失われがちである。これらの方法はまた、しばしば非常に手間がかかる。
【００１１】
従って、不均質サンプル中に存在する主要タンパク質および微量タンパク質の両方の質量分析検出を、液相精製の前に大量に必要とせずに、容易にする方法および装置が、明らかに必要とされる。さらに、サンプルの精製を容易にするだけではなく、質量分析の前に連続的にかつ並列のサンプル修飾アプローチを可能にするＭＳプラットフォームが、必要とされる。
【００１２】
このような要求は、親和性捕捉レーザー脱離イオン化法の発達により、部分的には満たされる。Ｈｕｔｃｈｅｎｓら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：５７６−５８０（１９９３）；米国特許第５，７１９，０６０号、同第５，８９４，０６３号、同第６，０２０，２０８号および同第６，０２７，９４２号。高分子のＭＳ分析のためのこの新しいストラテジーは、少なくとも１つの表面上に親和性試薬を有する新規のレーザー脱離イオン化プローブを使用する。この親和性試薬は、不均質なサンプルから所望の分析物を吸着し、分析物を続くレーザー脱離イオン化のために適切な形態でプローブの表面上に濃縮する。分析物の吸着および脱離の関係は、非直結の精製アプローチを排除し、より微量の初期サンプルの分析を可能にし、そして質量分析に先立つプローブ表面上での直接的なサンプルの修飾アプローチをさらに容易にする。
【００１３】
親和性捕捉レーザー脱離イオン化アプローチは、質量分析法が、多数の伝統的な生物分析的技術（免疫アッセイ、Ｎｅｌｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１１５３−１１５８（１９９５）および親和性クロマトグラフィー、Ｂｒｏｃｋｍａｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：４５８１−４５８５（１９９５）を含む）の性能において支持されることを可能にする。この親和性捕捉レーザー脱離イオン化アプローチは、ペプチドおよびタンパク質の研究（Ｈｕｔｃｈｅｎｓら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：５７６−５８０（１９９３）；Ｍｏｕｒａｄｉａｎら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８６３９−８６４５（１９９６）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．９：１３８０−１３８５（１９９５）；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ １２：７７−９３（１９９９）；Ｂｒｏｃｋｍａｎら、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３３：１１４１−１１４７（１９９８）；Ｙｉｐら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３２８２５−３３（１９９６））だけではなく、オリゴヌクレオチド（Ｊｕｒｉｎｋｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６９：９０４−９１０（１９９７）；Ｔａｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３１２６−３１３１（１９９５）；Ｌｉｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：３４８２−９０（１９９５））、細菌（Ｂｕｎｄｙら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：１４６０−１４６３（１９９９））ならびに低分子（Ｗｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２４３−２４６（１９９９））の研究にも適応されている。商業レベルで、親和性捕捉レーザー脱離イオン化は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ’ｓ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）において具体化される。
【００１４】
親和性捕捉レーザー脱離イオン化技術は当該分野の重大な問題を解決するが、難問は残る。
【００１５】
例えば、このアプローチが生物学的サンプル由来のタンパク質を捕捉するために適用される場合、捕捉される全タンパク質の約１ピコモルが調査され、引き続く分析に利用可能であることが一般的である。代表的に、クロマトグラフ表面の親和性捕捉プローブ上の親和性捕捉は、完全な精製を生じない。さらに、遊離の溶液または２−Ｄゲルの変性環境において実施された消化物と比較した場合、固相抽出したサンプルに見られる消化効率は低い。従って、約５０％が目的のタンパク質であり、そしてこのタンパク質の約１０％を消化するのに成功した場合、せいぜい約５０フェムトモルのペプチドが検出のために利用可能である。
【００１６】
さらに、データベースマイニング（ｍｉｎｉｎｇ）実験におけるウシ胎仔の仮想トリプシン消化物を用いて、この複合体（真核生物ゲノム）に対して調査する場合、１．０ｐｐｍの最大精密度（大部分のＭＳ技術によって現在達成し得ないレベル）でさえ、信頼性の低いタンパク質ＩＤマッチは、単一のペプチド質量で達成されることが実証されている。２つのペプチドについて、信頼性の低い結果が同様に達成される。３つのペプチドが提示されて初めて、３００ｐｐｍ誤差よりも少ない質量数決定について確信のある結果が生じる。この場合、大部分のデバイスは内部標準キャリブレーションを必要とする。しかし、さらにペプチドを用いても、信頼性が１０００ｐｐｍ誤差より良好な質量の精度で提供されることはない。
【００１７】
さらに、複数のタンパク質が同時に消化される場合、異種のペプチドプールが作製され、そして首尾よいデータベースマイニングは最大精密度だけでなく、多くの場合において一次配列情報も同様に必要とする。タンデムＭＳ／ＭＳアプローチは、一次配列情報を提供する上での有意な有用性を実証した（Ｂｉｅｍａｎｎら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２７：３７０−３７８（１９９４）；Ｓｐｅｎｇｌｅｒら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９１，５：１９８−２０２（１９９１）；Ｓｐｅｎｇｌｅｒら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．６：１０５−１０８（１９９２）；Ｙａｔｅｓら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１４２６−１４３６（１９９５）；Ｋａｕｆｍａｎら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：９０２−９１０（１９９３）；Ｋａｕｆｍａｎら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ １３１：３５５−３８５（１９９４））が、複数のタンパク質由来のタンパク質切断産物の混合物は、しばしばタンデムＭＳ配列分析の前に、さらなるオフライン精製を必要する。
【００１８】
さらに、近年まで、レーザ脱離に基づく分析に利用可能な唯一のＭＳ／ＭＳアプローチは、ポストソース分解分析（ＰＳＤ）であった。ＰＳＤは、ピコモルレベルのペプチドについての適切な配列情報を提供し得るが、この切断プロセスの全効率は低く、このアプローチの間にしばしば示される、乏しい質量精度と感度とが組み合わさった場合、親和性捕捉レーザ脱離イオン化プローブにおいて見られる低量のタンパク質の分析へのその適用性は、大いに制限される。
【００１９】
従って、親和性捕捉レーザ脱離質量分析法の感度および質量精度を増加させる、装置および方法の必要性が存在する。プローブ上での消化効率を増加させ、タンパク質の不均質混合物の消化により生成されるペプチドを容易に分析することを可能にする、方法および装置の必要性が存在する。親和性捕捉レーザ脱離直列型質量分光測定分析の効率を増加させる、装置および方法の必要性が存在する。
【００２０】
近年、レーザ脱離イオン化四重極飛行時間質量分光計（ＬＤＩＱｑ−ＴＯＦ）が開発されており、これにより、衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳ／ＭＳ分析が、行われ得る。Ｋｒｕｔｃｈｉｎｋｓｙら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１２：５０８〜５１８（１９９８）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
既存の親和性捕捉レーザ脱離イオン化質量分光計と比較して、感度、質量精度、および質量分析能が増加された親和性捕捉プローブレーザ脱離イオン化質量分析のための装置を提供することが、本発明の目的である。ＭＳ／ＭＳ性能を加えた親和性捕捉プローブレーザ脱離イオン化質量分析のための装置を提供することが、本発明のさらなる目的である。これらの改善された分析性能を利用する、生分子分析、特に、タンパク質分析の新規方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００２２】
本発明は、第一の局面において、分析機器を提供することによって、当該分野における、これらおよび他の目的および必要性を満たす。
【００２３】
本発明の分析機器は、レーザ脱離イオン化供給源、親和性捕捉プローブインターフェイス、および直列型質量分光計を備え、ここにおいて、この親和性捕捉プローブインターフェイスは、親和性捕捉プローブと係合し、かつこのプローブを位置付けることが可能であり、その結果、これは、直列型質量分光計と連絡しつつ、レーザ脱離供給源による応答を受け、それによって、イオンが、プローブから脱着されて、質量分光計に入るのを可能にする。
【００２４】
代表的には、レーザー脱離イオン化供給源は、レーザー励起供給源およびレーザー光学トレインを備える。レーザー光学トレインは、励起されたフォトンを、レーザー励起供給源からプローブインターフェースに伝達するように機能する。このような実施形態において、レーザー光学トレインは、代表的に、検索されるプローブ表面の１平方ｍｍ当たり、約２０〜１０００μＪのエネルギーを送達する。
【００２５】
レーザー励起供給源は、短く刻まれた（ｃｈｏｐｐｅｄ）連続レーザーおよびパルス化レーザーからなる群より選択され、そして種々の実施形態において、窒素レーザー、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー、エルビウム：ＹＡＧレーザーおよびＣＯ２レーザーからなる群より選択される。現在好ましい実施形態において、レーザー励起供給源は、パルス化窒素レーザーである。
【００２６】
１つのセットの実施形態において、レーザー光学トレインは、レンズ、ミラー、プリズム、減衰器、およびビームスプリッターからなる群より選択される光学成分を備える。
【００２７】
別のセットの実施形態において、レーザー光学トレインは、入力端部および出力端部を有する光ファイバーを備え、そしてレーザー励起供給源は、光ファイバー入力端部に接続される。
【００２８】
いくつかの光ファイバーレーザー光学トレインの実施形態において、レーザー光学トレインは、さらに、光学減衰器を備える。減衰器は、レーザー励起供給源と光ファイバーの入力端部との間に配置され得るか、レーザー励起供給源を光ファイバーの入力端部に接続するために役立ち得るか、または光ファイバー出力端部とプローブとの間に配置され得る。
【００２９】
特定の光ファイバー光学トレインの実施形態において、光ファイバー出力端部は、約２００〜４００μｍの間の最大直径を有し、そして入力端部は、約４００〜１２００μｍの間の直径を有する。
【００３０】
分析機器はまた、プローブインターフェースでのプローブの係合の後にプローブが可視化され得るように、プローブ観察光学機器を備え得る。
【００３１】
特定の実施形態において、レーザー光学トレインは、レーザー励起供給源を光ファイバー入力端部に接続するレーザーカップラーを備え得る。上記のように、カップラーは、光学減衰器として働き得る。他の実施形態において、カップラーは、プローブインターフェースでのプローブの係合の後に、プローブの可視化を促進するのに役立ち得る。
【００３２】
特定のこれらの後者の実施形態において、カップラーまたは光ファイバーのいずれかが、二又であり、レーザー励起供給源からエネルギーの一画分を分離する。あるいは、このような二又は、脱着部位を照射するための可視光の導入を可能にする。
【００３３】
可視化光学機器が光学トレインに含まれる場合、またはファイバー含有レーザー光学トレインが二又または三又を含む場合、分析機器は、さらに、プローブから反射された光を検出するために位置付けられるＣＣＤカメラを備える。
【００３４】
代表的な実施形態において、親和性捕捉プローブインターフェースは、親和性捕捉プローブを可逆的に係合し得るプローブホルダーを備える。インターフェースはまた、代表的には、プローブホルダーをそれ自身可逆的に係合し得るプローブ導入ポートを備える。
【００３５】
代表的な実施形態において、このプローブインターフェースは、プローブ位置アクチュエーターアセンブリおよびインターフェースイオン回収システムをさらに備える。このプローブホルダーがこの導入開口部中に係合される場合、それは、このプローブ位置アクチュエーターと接触しながら配置され；次いで、このプローブ位置アクチュエーターは、このレーザーイオン化源（代表的には、レーザー光学トレイン（ｌａｓｅｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｔｒａｉｎ）に関する）およびイオン回収システムの両方に関するプローブホルダー（代表的には、係合されたプローブ）を移動可能に位置決めし得る。代表的な実施形態において、このアクチュエーターは、このプローブホルダーを、移転可能かつ回転可能に配置する。
【００３６】
このプローブインターフェースはまた、代表的に、このプローブ導入口に組み合わせた真空排出システムも備え、このインターフェースは、このプローブが、雰囲気より低い圧力でレーザー脱離イオン化供給源による応答指令信号を送られることを可能にする。
【００３７】
本発明の分析機器は、タンデム質量分析計を含み、このタンデム質量分析計は、種々の実施形態において、ＱｑＴＯＦ ＭＳ、イオントラップＭＳ、イオントラップＴＯＦ ＭＳ、ＴＯＦ−ＴＯＦ ＭＳ、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴ＭＳからなる群より選択される。ＱｑＴＯＦ ＭＳが、本発明の分析機器の使用のために現在好ましい。
【００３８】
好ましい実施形態において、このタンデム質量分析計は、ＱｑＴＯＦ ＭＳであり、そしてこのレーザー励起源は、パルス化窒素レーザーであり、プローブでのレーザーの影響は、最小の脱離閾値の約２〜４倍であり、そしてこのタンデム質量分析計は、約２０〜５０ｐｐｍの外部標準質量（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｍａｓｓ）の精度を有する。
【００３９】
本発明の分析機器は、親和性捕捉レーザー脱離イオン化プローブを係合するように設計されている。従って、任意の上記の実施形態は、親和性捕捉プローブインターフェースに係合された親和性捕捉プローブを含み得る。
【００４０】
これらの実施形態における親和性捕捉プローブは、代表的には、レーザー供給源に応答指令信号送信可能な関係に配置された少なくとも１つのサンプル吸着表面を有し、このサンプル吸着表面は、クロマトグラフ脱離表面および生体分子親和性表面からなる群より選択される。代表的には、そのようなクロマトグラフの吸着表面は、逆相、アニオン交換、カチオン交換、固定化金属親和性捕捉、および混合モードの表面からなる群より選択され、そして生体分子親和性表面の生体分子は、抗体、レセプター、核酸、レクチン、酵素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ＳｔａｐｈプロテインＡおよびＳｔａｐｈプロテインＧからなる群より選択される。
【００４１】
この親和性捕捉レーザー脱離イオン化プローブは、レーザー供給源に対して応答指令信号送信可能な関係に配置され得る、複数の別々にアドレス可能なサンプル脱離表面を有し得、そしてこのプローブは、少なくとも２つの異なる、このような脱離表面を備え得る。
【００４２】
他の実施形態において、本発明の分析機器は、このタンデム質量分析計の検出器と連結されたデジタルコンピューターを備える。いくつかの実施形態において、この機器はまた、このデジタルコンピューターにより実行可能なソフトウェアプログラムをさらに備え得、このソフトウェアプログラムは、このコンピューターにローカルであるか、またはこのコンピューターに連絡可能にアクセス可能であるかのいずれかである。このような実施形態におけるソフトウェアプログラムは、このレーザー脱離イオン化供給源の制御を可能にし得るか、またはこのタンデム質量分析計によるデータの獲得の少なくとも１つの局面の制御を可能にし得る、またはこのタンデム質量分析計により獲得したデータに関する少なくとも１つの分析的ルーチンの実施を可能にし得るか、またはこれらの機能の任意のサブセットを可能にし得る。
【００４３】
第２の局面において、本発明は、他のタンパク質の切断産物と混合された、複数の切断産物として存在するタンパク質分析物を分析する方法を提供する。
【００４４】
一般的に、本発明のこの局面の方法は、以下の工程を包含する：（ａ）親和性捕捉プローブへの吸着により、この混合物由来の複数の切断産物を捕捉する工程であって、この複数の吸着された切断産物が、このタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を含む工程；（ｂ）このプローブを、複数の吸着された切断産物の複雑性を減少させるのに十分な時間および条件下で、第１の溶出剤で少なくとも１回洗浄する工程であって、複雑性の減少した、吸着された切断産物が、このタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を含む工程；および、次いで（ｃ）タンデム質量分析計測定によりこのタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を特徴づける工程。
【００４５】
タンデム質量分析計による切断産物の特徴付けは、タンパク質分析物の分析を提供する。必要に応じて、この方法は、タンパク質分解剤を用いて混合物中のタンパク質を切断産物に切断する前工程を包含する。
【００４６】
この洗浄工程は、切断産物の混合物の複雑性を減少させるように作用し、結果としてタンデム質量分析計による分析を容易にする。いくつかの実施形態において、第１の溶出剤で洗浄した後およびタンデム質量分析計による特徴付けを実施した前に、第二の洗浄工程の少なくとも１回の反復が実施される。この第２の洗浄は、少なくとも１つの溶出特性おいて第１の溶出剤と異なる第２の溶出剤を用いて、複数の吸着されたタンパク質切断産物の複雑性をさらに減少させるのに十分な時間および条件下で行われ、複雑性のさらに減少した、吸着された切断産物は、このタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を含む。
【００４７】
親和性捕捉プローブの性質に依存して、本方法の特定の実施形態において、エネルギー吸収分子が、洗浄後およびタンデム質量分析計による分析の前に、このプローブに適用される。エネルギー吸着分子は、タンパク質切断産物が接触するように適用される。
【００４８】
代表的に、このタンデム質量分析計による特徴付けは、以下の工程を包含する：（ｉ）このプローブからタンパク質切断産物を脱離およびイオン化し、従って、この切断産物に対応する親のペプチドイオンを産生する工程；（ｉｉ）質量分析計の第１相中で所望の親のペプチドイオンを選択する工程；（ｉｉｉ）気体相中で、選択された親ペプチドイオンをフラグメントイオンにフラグメント化する工程；次いで（ｉｖ）質量分析計の第２相中で、この選択された親ペプチドイオンのフラグメントイオンの質量スペクトルを測定する工程。本発明のＱｑＴＯＦ機器を用いて実施される方法の実施形態において、この気体相フラグメント化は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって達成される。
【００４９】
このタンパク質分析物の同定が所望される方法の特定の実施形態において、本方法は、このタンパク質分析物のアミノ酸配列の少なくとも１部分を決定する工程をさらに包含する。
【００５０】
この配列情報は、代表的に、このフラグメントイオン質量スペクトルにおいて表現される、一連の特定のフラグメントの、フラグメントイオンの中での質量の差異を算出することによって得られる。同定は、部分的な配列情報を用いることによって促進され得、質量分析により予想されるアミノ酸配列と配列データベース中に以前にアクセスした配列との間で算出された一致の密接さ（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）に基づくタンパク質正体候補を得ることが可能である。いくつかの実施形態において、この一致の密接さは、親のペプチドイオンの質量および必要に応じてタンパク質分析物の起源の属または種からさらに算出される。
【００５１】
この正体候補が、タンパク質分析物と同一であるという見込みは、（ｉ）選択された親のペプチドイオンについて測定された質量と（ｉｉ）タンパク質分解剤を用いて正体候補を切断することにより得られる切断産物について予測される質量を比較することによって評価され得、予測される質量と測定された質量との間のマッチング（ｍａｔｃｈ）は、正体候補がこのタンパク質分析物と同一であるという増大された見込みを示す。
【００５２】
タンパク質正体候補のさらなる確認は、予測される切断産物質量と、フラグメント化および質量分析の第２相により特徴付けられた切断産物以外の、プローブから脱離された切断産物について測定された質量とを比較することによって得ることが可能であり；この実施形態において、予測される質量と測定された質量との間の更なるマッチングは、この正体候補が、このタンパク質分析物と同一であるという増大された見込みを示す。
【００５３】
反対に、この予想される質量および測定された質量がマッチしない場合、本方法の工程は、この特徴付けされた切断産物以外の脱離された切断産物に対して繰り返され得る。
【００５４】
配列データは、タンパク質同定のために必要とされない。
【００５５】
従って、他の実施形態において、少なくとも１つのタンパク質正体候補は、このタンパク質分析物について、その代わりに、フラグメントイオン質量スペクトルと配列データベース中に以前にアクセスされた配列から予測される質量スペクトルとの間で算出された一致の密接さに基づき決定される。いくつかの実施形態において、この一致の密接さは、親のペプチドイオンの質量および必要に応じてタンパク質分析物の起源の属または種からさらに算出される。
【００５６】
この正体候補が、このタンパク質分析物と同一であるという見込みは、（ｉ）選択された親のペプチドイオンについて測定された質量と（ｉｉ）タンパク質分解剤を用いて正体候補を切断することにより得られる切断産物について予測される質量とを比較することによって評価され得、予測される質量と測定された質量との間のマッチングは、正体候補がこのタンパク質候補と同一であるという増大された見込みを示す。
【００５７】
タンパク質正体候補のさらなる確認は、予測される切断産物質量と、フラグメント化および質量分析の第２相により特徴付けられた切断産物以外の、プローブから脱離された切断産物測定したの質量とを比較することによって得ることが可能であり；この実施形態において、予測される質量と測定された質量との間の更なるマッチングは、この正体候補が、このタンパク質分析物と同一であるという増大された見込みを示す。
【００５８】
反対に、この予想される質量および測定された質量がマッチしない場合、本方法の工程は、この特徴付けされた切断産物以外の脱離された切断産物（親のペプチドイオン）に対して繰り返され得る。
【００５９】
本発明のこの局面における方法の種々の実施形態は、種々のタンデム質量分析計（例えば、ＱｑＴＯＦ質量分析計、イオントラップ質量分析、イオントラップ飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計、飛行時間 飛行時間（ＴＯＦ−ＴＯＦ）質量分析計、またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計）を含む分析機器を用いて実施され得る。上記のように、ＱｑＴＯＦタンデム質量分析計を含む分析機器は、利点を提供する。
【００６０】
本発明のこの局面における方法の種々の実施形態において、この親和性捕捉プローブは、クロマトグラフィーの吸着性の表面（例えば、逆相表面、アニオン交換性表面、カチオン交換性表面、固定化金属親和性捕捉表面、および混合モードの表面）を有し得るか、または生体分子親和性表面を有し得る。
【００６１】
代表的には、本発明のこの局面の方法において、このタンパク質混合物は、生物学的サンプル（例えば、血液、血液画分、リンパ、尿、脳脊髄液、滑液、乳汁、唾液、硝子液、房水、粘液、精液）であるか、またはこれらの生物学的サンプル由来である。この生物学的サンプルはまた、便利には、細胞溶解物であり得る。
【００６２】
第３の局面において、本発明は、タンパク質混合物中に存在するタンパク質分析物を分析するための方法を提供する。
【００６３】
本方法は、以下の工程を包含する：（ａ）親和性捕捉プローブへの吸着により、この混合物から少なくとも切断産物を捕捉する工程、（ｂ）溶出剤を用いて、この親和性捕捉プローブに吸着されたタンパク質を、タンパク質切断産物へと切断する工程、（ｃ）このプローブに吸着されたタンパク質切断産物中の、タンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物の相対濃度を増加させるのに十分な時間および条件下で、第１の溶出剤で少なくとも１回プローブを洗浄する工程；次いで（ｄ）タンデム質量分析計測定によりこのタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を特徴づける工程。切断産物のタンデム質量分析計による特徴づけは、タンパク質分析物の分析を提供する。
【００６４】
この洗浄工程は、切断産物の混合物の複雑性を減少するように作用し、かつ検出されたペプチドの集合的配列範囲を増大させ得、続くタンデム質量分析計による分析を容易にする。いくつかの実施形態において、第１の溶出剤で洗浄した後およびタンデム質量分析計による特徴付けを実施する前に、第二の工程の少なくとも１回の反復が実施される。この第２の洗浄は、少なくとも１つの溶出特性において第１の溶出剤と異なる第２の溶出剤を用いて、このプローブに吸着されたタンパク質切断産物中の、タンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物の相対濃度をさらに増加させるのに十分な時間および条件下で、行われる。
【００６５】
親和性捕捉プローブの性質に依存して、本方法の特定の実施形態において、エネルギー吸収分子が、洗浄後およびタンデム質量分析計による分析の前に、このプローブに適用される。このエネルギー吸収分子は、このタンパク質切断産物と接触し、そしてこのタンパク質切断産物を、マトリクス結晶中に組み込むように適用され、従って、レーザー脱離イオン化供給源を用いる最終的な検出を可能とする。
【００６６】
代表的に、このタンデム質量分析計による特徴付けは、以下の工程を包含する：（ｉ）このプローブからタンパク質切断産物を脱離およびイオン化し、従って、この切断産物に対応する親のペプチドイオンを生じさせる工程；（ｉｉ）質量分析計の第１相において、所望の親のペプチドイオンを選択する工程；（ｉｉｉ）気体相中で、選択された親ペプチドイオンをフラグメントイオンにフラグメント化する工程；次いで（ｉｖ）質量分析計の第２相中で、この選択された親ペプチドイオンのフラグメントイオンの質量スペクトルを測定する工程。本発明のＱｑＴＯＦ機器を用いて実施される方法の実施形態において、この気体相フラグメント化は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によって達成される。
【００６７】
タンパク質分析物の同定が所望される方法の特定の実施形態において、本方法は、タンパク質分析物のアミノ酸配列の少なくとも１部分を決定する工程をさらに包含する。
【００６８】
この配列情報は、代表的に、このフラグメント質量スペクトルにおいて示される一連の特定のフラグメントの、フラグメントイオンの中の質量の差異を算出することによって得られる。同定は、部分的な配列情報を用いることによって促進され得、質量分析により予想されるアミノ酸配列と配列データベース中に以前にアクセスした配列との間で算出される一致の密接さに基づくタンパク質正体候補を得ることが可能である。いくつかの実施形態において、この一致の密接さは、親のペプチドイオンの質量および必要に応じてタンパク質分析物の起源の属または種からさらに算出される。
【００６９】
この正体候補が、このタンパク質分析物と同一であるという見込みは、（ｉ）選択された親のペプチドイオンについて測定された質量と（ｉｉ）タンパク質分解剤を用いて正体候補を切断することにより得られる切断産物について予測される質量を比較することによって評価され得、予測される質量と測定された質量との間のマッチングは、正体候補がこのタンパク質候補と同一であるという増大された見込みを示す。
【００７０】
タンパク質正体候補のさらなる確認は、予測される切断産物質量と、フラグメント化および質量分析の第２相により特徴付けされた切断産物以外の、プローブから脱離された切断産物について測定された質量とを比較することによって得ることが可能であり；この実施形態において、予測される質量と測定された質量との間の更なるマッチングは、この正体候補が、このタンパク質分析物と同一であるという増大された見込みを示す。
【００７１】
逆に、推定された質量と測定された質量が一致しないとき、この方法の工程が、特徴付けられた切断産物以外の脱離切断産物に対して繰り返され得る。
【００７２】
配列データは、タンパク質同定には要求されない。
【００７３】
従って、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのタンパク質正体候補が、それに代わって、フラグメントイオン質量スペクトルと、配列データベース中の先に受託された配列から推定される質量スペクトルとの間で算出された一致の密接さを基に、タンパク質分析物について決定される。いくつかの実施形態では、この一致の密接さは、さらに、親ペプチドイオンの質量から、および、必要に応じてタンパク質分析物起源の属または種から算出される。
【００７４】
正体候補がタンパク質分析物と同じである可能性は、（ｉ）選択された親ペプチドイオンについて測定された質量を（ｉｉ）タンパク質分解因子で正体候補を切断することにより生成され得る切断産物について推定される質量に対して比較することにより評価され得、推定される質量と測定された質量との間の一致が、正体候補がタンパク質分析物と同じであるという増加した可能性を示す。
【００７５】
タンパク質正体候補のさらなる確証は、推定される切断産物質量を、フラグメント化および質量スペクトル法の第２相により特徴付けられる切断産物以外の、プローブから脱着した切断産物について測定された質量と比較して得られ得る；この実施形態では、推定される質量と測定される質量との間のさらなる一致は、正体候補がタンパク質分析物と同じであるという増加した可能性を示す。
【００７６】
逆に、推定された質量と測定された質量が一致しないとき、この方法の工程が、特徴付けられた切断産物以外の脱着切断産物に対して繰り返され得る。
【００７７】
本発明のこの局面の方法の種々の実施形態は、ＱｑＴＯＦ質量分析計、イオントラップ質量分析計、イオントラップタイムオブフライト（ＴＯＦ）質量分析計、タイムオブフライトタイムオブフライト（ＴＯＦ−ＴＯＦ）質量分析計、またはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計のような、種々のタンデム質量分析計を含む分析機器を用いて実施され得る。上記のように、ＱｑＴＯＦタンデム質量分析計を備える分析機器が、利点を提示する。
【００７８】
本発明のこの局面の方法の種々の実施形態では、親和性捕捉プローブは、逆相表面、アニオン交換表面、カチオン交換表面、固定化金属親和性捕獲表面および混合様式表面のようなクロマトグラフィー吸着表面を有し得るか、または生体分子親和性表面を有し得る。
【００７９】
代表的には、本発明のこの局面の方法では、タンパク質混合物は、血液、血液フラクション、リンパ、尿、脳脊髄液、滑液、乳、唾液、硝子体液、房水、粘液または精液のような、生物学的サンプルであるか、またはそれから由来する。この生物学的サンプルはまた、有効な、細胞溶解液であり得る。
【００８０】
第４の局面では、本発明は、少なくとも１つの試験タンパク質を分析する方法を提供する。
【００８１】
この方法は、（ａ）試験タンパク質（単数または複数）を親和性捕獲プローブ（「タンパク質バイオチップ」）上に捕獲する工程、（ｂ）タンパク質分解因子を用いて、このタンパク質バイオチップ上の試験タンパク質（単数または複数）の切断産物を生成する工程；および（ｃ）タンデム質量分析計で少なくとも１つのタンパク質分解産物を分析する工程を包含する。本発明の第３の局面の方法とは対照的に、分析前のプローブの洗浄は必要ではなく、そして省略され得る。
【００８２】
本発明のこの局面の方法では、分析する工程は、（ｉ）タンパク質バイオチップからタンパク質切断産物をガス相中に脱着し、対応する親ペプチドイオンを生成する工程、（ｉｉ）第１の質量分析計を用いて次のフラグメント化のために親ペプチドイオンを選択する工程、（ｉｉｉ）ガス相中、選択されたフラグメント化条件下でこの選択された親ペプチドイオンをフラグメント化する工程、および（ｉｖ）産物イオンフラグメントの質量スペクトルを生成する工程を包含する。この様式では、この質量スペクトルは、試験タンパク質の分析を提供する。
【００８３】
本発明のこの局面の特定の実施形態では、この方法は、さらなる工程（ｄ）試験タンパク質について、少なくとも１つのタンパク質正体候補を決定する工程をさらに包含する。
【００８４】
１つのアプローチでは、このタンパク質正体候補は、質量スペクトルを、タンパク質データベースマイニングプロトコールに提示することにより同定され、これは、この質量スペクトルとこのデータベース中のタンパク質の理論的質量スペクトルとの間の一致の密接さの尺度を基に、データベースにおいて試験タンパク質に対する少なくとも１つのタンパク質正体候補を同定する。これらの特定の実施形態では、工程（ｄ）は、プロトコールに、試験タンパク質の質量およびこの試験タンパク質の起源の種を提示する工程をさらに包含する。
【００８５】
別のアプローチでは、タンパク質正体候補は、ＭＳ分析の第１の相で選択されたペプチドの少なくとも部分的なデノボＭＳ／ＭＳ配列決定の後に同定される。次いで、部分配列を用いて、配列データベースを質問（ｑｕｅｒｙ）し、データベースに受託される前に関連する配列を同定する。必要に応じて、タンパク質起源の種または属を用いて、選択されたペプチドの質量、そして非切断および非フラグメント化タンパク質分析物が知られていれば可能であるように、このクエリーを容易にし得るか、またはフィルターをかけ得る。
【００８６】
この２つのアプローチは互いに排他的ではなく、そして逐次的または並行して実施され得る。
【００８７】
タンパク質正体候補を同定することへのいずれかのアプローチとともに実施され得る種々の実施形態で、この方法は、（ｅ）以下によって、正体候補を、試験タンパク質と比較する工程をさらに包含する：（ｉ）（ｂ）のタンパク質切断産物の質量スペクトルを生成する工程；（ｉｉ）タンパク質切断産物の質量スペクトルをコンピュータープロトコールに提示する工程であって、このプロトコールは、タンパク質分解因子を用いることにより生成されると推定される正体候補の切断産物の理論的質量スペクトルと、タンパク質切断産物の質量スペクトルとの間の一致の密接さの尺度を決定し、それによってこの尺度が、試験タンパク質に対応するタンパク質バイオチップ上のタンパク質切断産物を示す工程。
【００８８】
この方法のなお他の実施形態は、工程（ｆ）、これは、工程（ｃ）を繰り返す工程であって、ここで、上記選択された親ペプチドイオンは、上記正体候補から推定されるタンパク質切断産物に対応せず；および、次いで（ｇ）、これは、（ｆ）の選択された親ペプチドイオンについて工程（ｄ）を繰り返す工程である。
【００８９】
本発明のこの第４の局面において、ならびに第２および第３の局面において、タンパク質分析物（試験タンパク質）は、第１の生物学的サンプルおよび第２の生物学的サンプル間として差次的に発現されるタンパク質であり得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、この第１および第２の生物学的サンプルは、正常および病的供給源に由来する。
【００９０】
第５の局面において、本発明は、第１の分子結合性パートナーと第２の分子結合性パートナーとの間の結合相互作用を特徴つける方法を提供する。
【００９１】
この局面では、この方法は、第２の結合性パートナーを第１の結合性パートナーに結合する工程であって、ここで、第１の結合性パートナーが、レーザー脱離イオン化プローブの表面に固定される工程；第２の結合性パートナーをフラグメント化する工程；および、次いでタンデム質量分析計測定により少なくとも１つのフラグメントを検出し、それによって検出されたフラグメントの質量スペクトルが、結合相互作用を特徴付ける工程を包含する。
【００９２】
本発明のこの局面の特定の実施形態において、第１の結合性パートナーは、第２の結合性パートナーがこの第１の結合性パートナーに結合する前に、親和性捕捉プローブの表面に最初に固定化される。
【００９３】
このような固定化は、共有結合のような、親和性捕捉プローブへの第１の結合パートナーの直接結合によってであり得る。代表的な共有結合実施形態は、第１の結合性パートナーのアミンと、プローブ表面のカルボニルジイミダゾール部分との間、ならびに第１の結合性パートナーのアミノまたはチオール基と、プローブ表面のエポキシ基との間の共有結合を含む。
【００９４】
この固定化はまた、第１の結合性パートナーと、プローブ表面の金または白金のような金属との間の配位結合または供与結合のような、直接非共有結合によってであり得る。この固定化はまた、逆相、アニオン交換、カチオン交換、固定化金属親和性捕捉および混合様式表面からなる群から選択されるクロマトグラフィー吸着表面への第１の結合性パートナーの相互作用によってであり得る。
【００９５】
あるいは、この固定化は、間接的であり得る。いくつかの実施形態では、この間接的結合は、間接的ではあるが共有結合であり得る。これらの後者の実施形態では、第１の結合性パートナーは、切断可能なリンカーのようなリンカーを介して共有結合によって固定化され得る。間接的固定化はまた、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン相互作用によるプローブへの固定化のような、非共有結合であり得る。
【００９６】
本発明のこの局面では、第１の分子結合性パートナーは、タンパク質、核酸、炭水化物、および脂質からなる群から選択され得る。代表的には、第１の結合性パートナーはタンパク質であり、これは、多細胞真核生物、単細胞真核生物、原核生物、およびウイルスからなる群から選択される生物からの天然に存在するタンパク質であり得るか、または組換え融合タンパク質のような、天然に存在しないタンパク質であり得る。
【００９７】
第１の結合性パートナーがタンパク質である実施形態では、このタンパク質は、特に、抗体、レセプター、転写因子、細胞骨格タンパク質、細胞周期タンパク質、およびリボソームタンパク質からなる群から選択され得る。
【００９８】
第２の結合性パートナーの、固定化された第１の結合性パートナーへの結合は、代表的な実施形態では、第１の結合性パートナーを、生物学的サンプルと接触することにより実施される；このサンプルは、血液、リンパ、尿、脳脊髄液、滑液、乳、唾液、硝子体液、房水、粘液または精液からなる群から選択される流体、または細胞溶解液、または別の形態の特定のサンプルであり得る。
【００９９】
第１の結合性パートナーがタンパク質である実施形態を含む種々の実施形態において、第２の結合性パートナーはタンパク質であり得る。あるいは、第２の結合性パートナーは、コンビナトリアルライブラリー中に存在する化合物であり得、ここで、第２の結合性パートナーの第１の結合性パートナーへの結合は、第１の結合性パートナーを、化学的に合成されたコンビナトリアルライブラリーのアリコートと接触することにより行われる。なお他の代替では、第２の結合性パートナーは、ファージディスプレイライブラリーのような、生物学的にディスプレイされたコンビナトリアルライブラリーの成分であり得る。
【０１００】
特定の代表的な実施形態では、フラグメント化は、第２の結合性パートナーを酵素と接触することにより行われ；ここで、この第２の結合性パートナーはタンパク質であり、この酵素は、代表的には、トリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｖ８）プロテアーゼ、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（セリンプロテアーゼ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ（システインプロテアーゼ）、Ａｓｎ−Ｎプロテアーゼ、およびＬｙｓ−Ｃプロテアーゼのような、特異的エンドプロテアーゼである。プロテアーゼはまた、ペプシン、サーモリシン、パパイン、サブチリシン、およびプロナーゼ（ｐｒｏｎａｚｓｅ）のような、準特異性の酵素であり得る。あるいは、フラグメント化は、第２の結合パートナーを、ＣＮＢｒまたはポリペプチド鎖の酸触媒加水分解を実施し得るいくつかの有機または無機酸のような、液体相化学薬品と接触することにより行われ得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、この方法は、第１の結合性パートナーへの第２の結合性パートナーの結合の後であって、かつ第２の結合性パートナーのフラグメント化の前に、第２の結合性パートナーを変性する工程をさらに包含する。
【０１０２】
種々の実施形態において、この方法は、第２の結合性パートナーのフラグメント化の後、第１の溶出液で、そして、時々、第２の溶液で、プローブを洗浄する工程をさらに包含する。第２の溶出液は、第１の溶出液とは、ｐＨ、イオン強度、洗浄強さ、および疎水性のような溶出特性の少なくとも１つが異なる。
【０１０３】
代表的な実施形態では、この方法は、フラグメント化工程の後で、かつ第２の結合性パートナーのフラグメントを検出する工程の前に、エネルギー吸収分子をプローブに付与する工程をさらに包含する。好適な実施形態では、次いで、プローブを、本発明の分析機器の親和性捕捉プローブインターフェースに係合し、そしてこの器具のレーザー源を用いて、第２の結合性パートナーのフラグメントがプローブからイオン化および脱着する。
【０１０４】
この器具を用い、この方法において、いくつかの型の有用な測定を行い得、これには、すべてのイオン質量の測定、フラグメントのサブセットの質量の測定、および単一イオンモニタリング測定が含まれる。
【０１０５】
有用なことに、この方法の実施形態は、第２の結合性パートナーのフラグメントの質量分析測定の後に、フラグメント測定を、第２の結合性パートナーの一次アミノ酸配列に対するフラグメント化酵素の切断規則を適用することにより推定されるフラグメント測定と比較し、それによって、このような比較が分子間相互作用を特徴付ける工程、を包含する。
【０１０６】
第２の結合性パートナーの正体が未知であれば、この方法は、このような比較の前に、ｍｓ／ｍｓ分析により、第２の結合性パートナーを同定する工程をさらに包含し得る。このようなＭＳ／ＭＳ分析は、第２の結合性パートナーの第１のフラグメントを質量分析により選択する工程；ガス相中で、この第２の結合性パートナーの第１のフラグメントを解離する工程；この第２の結合性パートナーの第１のフラグメントのフラグメントスペクトルを測定する工程、および、次いで、このフラグメントスペクトルを、データベース中に先に受託されたアミノ酸配列データから推定されたフラグメントスペクトルと比較する工程、を包含し得る。上記アミノ酸配列データは、実験的データおよび推定データからなる群から選択され得、そして代表的な実施形態における上記解離する工程は、衝突誘起解離である。
【０１０７】
この方法のいくつかの実施形態では、第１の結合性パートナーは、抗体、Ｔ細胞レセプター、およびＭＨＣ分子からなる群から選択される。他の実施形態では、第１の結合性パートナーは、レセプターであり、そして第２の結合性パートナーは、レセプターのアゴニスト、レセプターの部分アゴニスト、レセプターのアンタゴニスト、およびレセプターの部分アンタゴニストからなる群から選択される。他の実施形態では、第１の結合性パートナーは、糖タンパク質レセプターであり、そして第２の結合性パートナーは、レクチンである。
【０１０８】
第６の局面において、本発明は、分析物を検出する方法を提供し、この方法は、親和性捕捉プローブを、本発明の分析機器の親和性捕捉プローブインターフェース中に係合する工程であって、この親和性捕捉プローブがそれに結合した分析物を有する工程；この器具のレーザー源を用いて、このプローブから分析物またはそのフラグメントを脱着およびイオン化する工程；および、次いで、脱着したイオンについて、タンデム質量分析計測定により分析物を検出する工程を包含する。
【０１０９】
この局面において、この方法は、脱着およびイオン化する工程の後であって、かつ検出する工程の前に、脱着したイオンの衝突誘起解離を行う工程をさらに包含し得る。このような解離の前に、いくつかの実施形態では、イオンのサブセットが、衝突解離のために選択され得る。
【０１１０】
他の実施形態では、先行する、プローブに分析物を吸着する工程を実施し得、そしてなお別の実施形態では、分析物を吸着する工程の後であって、かつプローブをプローブインターフェース中に係合する工程の前に、プローブおよび分析物を、エネルギー吸収分子と接着して接触する工程を実施し得る。
【０１１１】
なおさらなる局面において、本発明は、サンプルにおける標的タンパク質を検出するための方法を提供する。この方法は、（ａ）親和性捕捉プローブ上にこの標的タンパク質を捕捉する工程；（ｂ）タンパク質分解因子を使用して、この親和性捕捉プローブ上のこの標的タンパク質のタンパク質切断産物を生成する工程；（ｃ）質量分析法によって、このタンパク質切断産物を検出する工程；ならびに（ｄ）この標的タンパク質の予め決定された１つ以上のタンパク質フラグメントマーカーを、検出された１つ以上のタンパク質切断産物と相関つける工程を包含し、この相関性により、この標的タンパク質を検出する。代表的には、タンパク質切断産物の質量分析検出は、親和性捕捉プローブから気相中へとタンパク質切断産物を脱離して、対応するイオンタンパク質を生成する工程；およびこの脱離したイオンタンパク質の質量スペクトルを生成する工程を包含する。
【０１１２】
このタンパク質フラグメントマーカーは、以下のように決定され得る：（ｉ）親和性捕捉プローブ上に標的タンパク質を捕捉する；（ｉｉ）タンパク質分解因子を使用して、その親和性捕捉プローブ上にタンパク質切断産物を生成する；（ｉｉｉ）タンデム質量分析計を用いて、少なくとも１つのタンパク質切断産物を分析する；（ｉｖ）これらの候補タンパク質切断産物から試験タンパク質の少なくとも１つのタンパク質フラグメントマーカーを同定し、相関性により、そのタンパク質切断産物が、その試験タンパク質のタンパク質フラグメントマーカーであることが示される。
【０１１３】
代表的には、（ｉｉｉ）タンデム質量分析計を用いて、少なくとも１つのタンパク質切断産物を分析する工程は、（１）その親和性捕捉プローブから気相中へタンパク質切断産物を脱離させて、対応する親イオンペプチドを生成する工程；（２）第１質量分析計を用いて、親イオンペプチドを、その後のフラグメント化のために選択する工程；（３）産物イオンフラグメントを生成するように、気相中にて選択されたフラグメント化条件下でその選択した親イオンペプチドをフラグメント化する工程；ならびに（４）第２質量分析計を用いて、産物イオンフラグメントの質量スペクトルを生成する工程、を包含する。
【０１１４】
代表的には、（ｉｖ）これらの候補タンパク質切断産物から試験タンパク質の少なくとも１つのタンパク質フラグメントマーカーを同定する工程は、（１）少なくとも１つの質量スペクトルを、タンパク質データベースマイニング（ｍｉｎｉｎｇ）プロトコルに供し、このプロトコルにより、その質量スペクトルと、そのデータベース中のタンパク質の理論上の質量スペクトルとの間の一致の密接さ（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）の尺度に基づいて、その中の試験タンパク質についての少なくとも１つのタンパク質の正体候補が同定される工程；ならびに（２）同定された候補が試験タンパク質に対応するか否かを決定する工程；による。
【０１１５】
本発明のこの局面の方法の特定の実施形態において、質量分析法は、レーザー脱離質量分析法／イオン化質量分析法であり、特に、レーザー脱離飛行時間質量分析法／イオン化飛行時間質量分析法である。さらに、種々の実施形態において、これらの方法において使用されるタンパク質分解因子は、化学物質および酵素因子からなる群より選択される。
【０１１６】
なおさらなる局面において、本発明は、２つの複雑な生物学的サンプル間にて差次的に提示されるタンパク質を同定するための方法を提供する。この方法は、（ａ）質量分析計を用いて、２つのサンプル間で差次的に提示される少なくとも１つのタンパク質を検出する工程；（ｂ）その２つのサンプルにおけるタンパク質をフラグメント化し、そして質量分析計を用いて、その２つのサンプル間にて差次的に提示されるタンパク質フラグメントを検出する工程；（ｃ）タンデム質量分析計を用いて、差次的に提示される少なくとも１つのタンパク質フラグメントの正体を決定する工程；ならびに（ｄ）差次的に提示されるタンパク質と、そのタンパク質の正体とを相関付け、その相関性により、差次的に提示されるタンパク質が同定される、工程；を包含する。
【０１１７】
この方法の特定の実施形態において、工程（ａ）「検出する工程」は、（ｉ）親和性捕捉プローブ上にそのサンプルからタンパク質を捕捉する工程；（ｉｉ）各サンプルから捕捉されたタンパク質を、レーザー脱離質量分析計／イオン化質量分析計によって分析する工程；ならびに（ｉｉｉ）その２つのサンプルにおける捕捉されたタンパク質を比較して、差次的に発現されるタンパク質を同定する工程；を包含する。
【０１１８】
特定の実施形態において、工程（ｂ）「フラグメント化し、そして検出する工程」は、（ｉ）親和性捕捉プローブ上にそれらのサンプルからタンパク質を捕捉する工程；（ｉｉ）タンパク質分解因子を使用して、その親和性捕捉プローブ上にタンパク質切断産物を生成する工程；（ｉｉｉ）レーザー脱離質量分析計／イオン化質量分析計により、そのタンパク質切断産物を分析する工程；ならびに（ｉｖ）その２つのサンプル中のタンパク質切断産物を比較して、差次的に発現されるタンパク質切断産物を同定する工程；を包含する。
【０１１９】
本発明のこの局面の方法の特定の実施形態において、工程（ｃ）「差次的に提示される少なくとも１つのタンパク質フラグメントの正体を決定する工程」は、（ｉ）そのタンパク質バイオチップから気相中へとそのタンパク質切断産物を脱離させて、対応する親ペプチドイオンを生成する工程；（ｉｉ）第１質量分析計を用いて、その後のフラグメント化のために親ペプチドイオンを選択する工程；（ｉｉｉ）第２質量分析計を用いて、選択されるフラグメント化条件下でその選択された親ペプチドイオンを気相中でフラグメント化して、産物イオンフラグメントを生成する工程；（ｉｖ）その産物イオンフラグメントの質量スペクトルを生成する工程；ならびに（ｖ）少なくとも１つの質量スペクトルを、タンパク質データベースマイニング（ｍｉｎｉｎｇ）プロトコルに供し、このプロトコルにより、その質量スペクトルと、そのデータベース中のタンパク質の理論上の質量スペクトルとの間の一致の密接さの尺度に基づいて、そのデータベース中において差次的に提示されるタンパク質についての少なくとも１つのタンパク質の正体候補を同定することによって、少なくとも１つのタンパク質の正体候補フラグメントマーカー産物を同定する工程；を包含する。
【０１２０】
本発明のこの局面の種々の実施形態において、フラグメント化する工程は、溶液中で実施される。他の実施形態において、フラグメント化する工程は、親和性捕捉プローブ（「チップ」）上で実施される。
【０１２１】
フラグメント化は、酵素的フラグメント化（限定的酵素消化を含む）を包含し得る。あるいは、フラグメント化する工程は、化学的フラグメント化（酸加水分解を含む）を包含し得る。
【０１２２】
差次的に提示されるタンパク質は、独特のタンパク質であり得る。さらに、その２つのサンプルは、（１）健常供給源由来のサンプルおよび罹患供給源由来のサンプルからか、（２）毒性化合物に曝露された試験モデル由来のサンプルおよびその毒性化合物に曝露されていない試験モデル由来のサンプルからか、または（３）薬物に応答する被検体由来のサンプルおよびその薬物に応答しない被検体由来のサンプルから、選択され得る。
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書で用いられるとき、用語、特に以下に提示される用語は、以下の定義を有する。他に定義されなければ、本明細書で用いられるすべての用語は、本発明が属する分野の当業者により共通に理解される意味を有している。
【０１２３】
「分析物」は、検出されることが所望されるサンプルの任意の成分をいう。この用語は、サンプル中の単一成分または複数の成分に言及し得る。
【０１２４】
「プローブ」は、レーザー脱離イオン化源に対して測定可能な関係で、かつガス相イオンスペクトル分析器と大気圧または準大気圧で同時連絡する位置で係合するとき、分析物に由来するイオンを、スペクトル分析器中に導入するために用いられ得るデバイスをいう。本明細書で用いるとき、「プローブ」は、代表的には、プローブインターフェースにより可逆的に係合可能である。
【０１２５】
「親和性捕捉プローブ」は、プローブが、分析物を、不均一混合物から抽出および濃縮することを可能にするに十分である相互作用により、分析物を結合するプローブをいう。純度までの濃縮は必要ではない。代表的には、この結合相互作用は、プローブの吸着表面への分析物の吸着により媒介される。しばしば、親和性捕捉プローブは、通俗的に、「タンパク質バイオチップ」と呼ばれ、この語句は、従って、本明細書では、「親和性捕捉プローブ」と同じ意味で用いられる。用語「ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標） Ａｒｒａｙ」は、本発明における使用のために、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販されている親和性捕捉プローブをいう。親和性捕捉プローブは、本明細書で以下に定義されるように、クロマトグラフィー吸着表面または生体分子親和性表面を有し得る。
【０１２６】
「吸着」は、分析物の吸着剤への検出可能な非共有結合をいう。
【０１２７】
「吸着剤」は、分析物を吸着し得る任意の材料をいう。この用語「吸着剤」は、本明細書では、単一材料（「モノプレックス吸着剤」）（例えば、化合物または官能基）および複数の異なる材料（「複数吸着剤」）の両方をいうために用いられる。マルチプレックス吸着剤中の吸着剤材料は、「吸着剤種」と呼ばれる。例えば、プローブ基板上のレーザーでアドレス可能な吸着表面は、異なる結合特性を有する多くの異なる吸着種（例えば、アニオン交換材料、金属キレーター、または抗体）により特徴付けられるマルチプレックス吸着剤を含み得る。
【０１２８】
「吸着表面」は、吸着剤を有する表面をいう。
【０１２９】
「クロマトグラフィー吸着表面」は、分析物間のクロマトグラフィー的識別または分析物を分離し得る吸着剤を有する表面をいう。従って、この語句は、イオン抽出成分、アニオン交換成分、カチオン交換成分、順相成分、逆相成分、金属親和性捕捉成分、および／または混合様式吸着剤を有する表面を含み、これらの用語は、クロマトグラフィー技術分野で理解される。
【０１３０】
「生体分子親和性表面」は、タンパク質、オリゴ糖，抗体、レセプター、小分子リガンド、および種々のタンパク質リポ結合体および糖結合体のような、特異的に結合し得る生体分子を含む吸着剤を有する表面をいう。
【０１３１】
親和性捕捉プローブの吸着表面に吸着されたサンプルの「複合度」は、吸着されている異なるタンパク質種の数を意味する。
【０１３２】
「特異的結合」は、サンプル中の他の分子種への結合に比べ、互いに優先的に結合する、異質（不均一）サンプル中に同時に存在する２つの分子種の能力をいう。代表的には、特異的な結合相互作用は、反応における偶然的な結合相互作用を、少なくとも２倍、より代表的には１０倍〜１００倍より多く超えて識別する。分析物を検出するために用いられるとき、特異的結合は、異質（不均一）サンプル中の分析物の存在を決定するとき、十分に識別的である。代表的には、特異的結合反応の親和性または結合活性は、少なくとも約１０−７Ｍであり、より大きい特異性の特異的結合反応は、代表的に少なくとも１０−８Ｍ〜少なくとも約１０−９Ｍの親和性または結合活性を有する。
【０１３３】
「エネルギー吸収分子」および等価な頭字語「ＥＡＭ」は、レーザー脱離イオン化源からエネルギーを吸収し得、そしてその後、それとの接触において分析物の脱離およびイオン化に寄与し得る分子をいう。この語句は、それらの開示全体が参考として本明細書に援用される、米国特許番号第５，７１９，０６０号、第５，８９４，０６３号、第６，０２０，２０８号および６，０２７，９４２号でそのように呼ばれる全ての分子を含み、これは、しばしば「マトリクス」と称され、ＭＡＬＤＩで用いられるＥＡＭ分子を含み、そしてケイ皮酸誘導体、シナピン酸（「ＳＰＡ」）、シアノヒドロキシケイ皮酸（「ＣＨＣＡ」）およびジヒドロ安息香酸を明りょうに含む。
【０１３４】
「タンデム質量スペクトル分析器」は、イオン混合物中のイオンを含む、イオンのｍ／ｚを基礎にした識別または測定の２つの連続ステージを実施し得る、任意のガス相イオンスペクトル分析器をいう。この語句は、イオンのｍ／ｚを基礎にした識別または測定の２つの連続的なステージをタンデムな空間で実施し得る２つの質量分析計を有するスペクトル分析器を含む。この語句は、イオンのｍ／ｚを基礎にした識別または測定の２つの連続的なステージをタンデムな時間で実施し得る１つの質量分析計を有するスペクトル分析器をさらに含む。従って、この語句は、ＱｑＴＯＦ質量スペクトル分析器、イオン捕捉質量スペクトル分析器、イオン捕捉−ＴＯＦ質量スペクトル分析器、ＴＯＦ−ＴＯＦ質量スペクトル分析器、およびフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル分析器を明りょうに含む。
【０１３５】
「溶出剤」は、代表的には溶液である、吸着表面の吸着剤への分析物の吸着に影響するか、またはそれを改変するために使用される作用剤をいう。溶出剤はまた、本明細書では、「選択性閾値改変剤」ともいう。
【０１３６】
「溶出特性」は、吸着表面の吸着剤への分析物の吸着に影響するか、またはそれを改変する溶出剤の能力に寄与する、溶出剤の物理的または化学的特性をいう。２つの溶出剤は、もし、分析物および吸着剤との接触に置いたとき、この吸着剤に対する分析物の親和性の程度が異なれば、異なる溶出特性を有する。溶出特性は、例えば、ｐＨ、イオン強度、カオトロピズムの程度、洗浄の強さ、および温度を含む。
【０１３７】
「生物学サンプル」および「生物学的サンプル」は、複製し得る生物の少なくとも一部分に由来するサンプルを同じくいう。本明細書で用いるとき、生物サンプルは、ウイルス、原核生物、単一細胞真核生物および多細胞真核生物を含む、公知の分類学上の任意の界に由来し得る。この生物サンプルは、培養されたその部分からを含む、生物の実体またはその部分に由来し得る。生物サンプルは、ホモジネート、細胞下分画物、溶解物および流体を含む、文脈に適切な任意の物理的形態であり得る。「複合生物サンプル」は、少なくとも１００の異なるタンパク質種を含む生物サンプルをいう。「中程度複合生物サンプル」は、少なくとも２０の異なるタンパク質種を含む生物サンプルをいう。
【０１３８】
「生体分子」は、生物サンプル中に見出され得るか、しかし、必ずしもそれに由来する必要はない分子をいう。
【０１３９】
「有機生体分子」は、ステロイド、アミノ酸、ヌクレオチド、糖，ポリペプチド、ポリヌクレオチド、複合炭水化物および脂質、ならびにその組み合わせのような、生物サンプル中に見出され得るか、しかし、必ずしもそれに由来する必要はない有機分子をいう。
【０１４０】
「小有機分子」は、一般に、製薬で用いられるような有機分子に匹敵し得るサイズの有機分子をいう。この用語は、有機生体高分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除く。代表的には、本明細書で用いるとき、小有機分子は、約５０００Ｄａまで、約２５００Ｄａまで、約２０００Ｄａまで、または約１０００Ｄａまでのサイズの範囲にある。
【０１４１】
「生体高分子」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリサッカライドおよびポリグリセリド（例えば、ジ−またはトリグリセリド）のような、生物サンプル中に見出され得るか、しかし、必ずしもそれに由来する必要はないポリマーをいう。
【０１４２】
「フラグメント」は、分析物の化学的、酵素的、または物理的分解の産物をいう。フラグメントは、中性状態またはイオン状態であり得る。
【０１４３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書では交換可能に用いられ、アミノ酸モノマー（残基）を含む天然に存在するか、または合成のポリマーをいい、ここで、アミノ酸モノマーは、天然に存在するアミノ酸、天然に存在するアミノ酸の構造改変体、およびペプチド結合に参加し得る天然に存在しない合成のアナログを含む。ポリペプチドは、例えば、糖タンパク質を形成するための炭水化物残基の付加により改変され得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、糖タンパク質および非糖タンパク質を含む。
【０１４４】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、ヌクレオチドモノマー（塩基）を含む天然に存在するか、または合成のポリマーを等しくいう。ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）およびリボ核酸（「ＲＮＡ」）のような天然に存在する核酸、ならびに核酸アナログを含む。核酸アナログは、天然に存在しない塩基を含むもの、およびヌクレオチドモノマーが天然に存在するホスホジエステル結合以外で連結されているものを含む。ヌクレオチドアナログは、例えば、そして限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホルホルアミデート、ボラノホスフェート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）などを含む。
【０１４５】
本明細書で用いるとき、「分子結合パートナー」−および等価に「特異的結合パートナー」は、特異的結合を示す、代表的には、生体分子の対である、分子の対をいう。非制限的な例は、レセプターとリガンド、抗体と抗原、ビオチンとアビジン、およびビオチンとストレプトアビジンである。
【０１４６】
「レセプター」は、生物サンプル中に見出され得るか、しかし、必ずしもそれに由来する必要はない、しかもリガンドとの特異的結合に参加し得る、代表的には高分子である分子をいう。この用語は、特異的になおリガンド結合し得るフラグメントおよび誘導体をさらに含む。
【０１４７】
「リガンド」は、指定されたレセプターまたは抗体との特異的結合に参加し得る任意の化合物をいう。
【０１４８】
「抗体」は、少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子、または少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子のフラグメントにより実質的にコードされ、リガンドとの特異的結合に参加し得るポリペプチドをいう。この用語は、天然に存在する形態、およびフラグメントおよび誘導体を含む。本明細書で用いるとき、この用語の範囲内のフラグメントは、フラグメントがなお標的分子に特異的に結合し得る限り、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ）’２フラグメントのような、種々のペプチダーゼを用いた消化により生成されるもの、化学的解離により、化学的切断により、および組換えにより生成されるものを含む。そのように、例えば、ファージディスプレイにより生成される代表的な組換えフラグメントは、単鎖ＦａｂおよびｓｃＦｖ（「単鎖可変領域」）フラグメントを含む。この用語の範囲内の誘導体は、配列が改変されているが、なお標的分子に特異的に結合し得る、種間キメラおよびヒト化抗体を含む抗体（またはそのフラグメント）を含む。本明細書で用いるとき、抗体は、ネイティブＢリンパ球、ハイブリドーマ、組換え発現系の細胞培養からの回収、ファージディスプレイによるなどを含む、任意の公知の技法により生成され得る。
【０１４９】
「抗原」は、抗体により結合され得るリガンドをいう。抗原は、免疫原性である必要はない。抗体と接触する抗原の部分は、「エピトープ」と命名されている。
【０１５０】
「流束（ｆｌｕｅｎｃｅ）」は、照射イメージの単位面積あたりに送達されるエネルギーをいう。
【０１５１】
（ＩＩ．親和性捕捉プローブタンデム質量スペクトル分析器）
第１の局面において、本発明は、親和性捕捉レーザー脱離イオン化サンプル導入の利点を、高精度、高い質量解像度、タンデム質量スペクトル分析器の利点と組み合わせる分析機器を提供する。この組み合わせは、公知の技法を実施するための現存するデバイスに対して顕著な利点を提供する。さらに、この新規な機器は、タンパク質発見の新規な方法を可能にし、そして現存するアプローチに比べ同時に効率的かつ高感度である、特異的結合パートナー間の分子相互作用を同定および特徴付ける新規な方法を可能にする。この機器を、最初に全体として簡単に記載し；その後、親和性捕捉プローブインターフェースの特徴をより詳細に記載する。
【０１５２】
簡単に、図１を参照して、機器１００は、レーザー脱離／イオン化源１３；親和性捕捉プローブインターフェース１０、およびタンデム質量スペクトル分析器１４を備える。図１に示されるのは、好適な実施形態であり、ここで、レーザー源１２はパルス化窒素レーザーであり、そしてタンデム質量スペクトル分析器１４は、直交４極飛行時間型質量スペクトル分析器（ＱｑＴＯＦ）タンデムＭＳである。
【０１５３】
（レーザー脱離／イオン化源）
レーザー脱離／イオン化源１３は、親和性捕捉プローブ１６に接着したタンパク質およびその他の分析物を脱着およびイオン化する、適正に調整および指向されたエネルギーに富む光子を生成する。レーザー脱離／イオン化源１３は、レーザー源１２、レーザー光学列１１、および、必要に応じて、プローブ観察光学機器１８を備える。
【０１５４】
レーザー脱離／イオン化源１３は、パルス化レーザー１２の使用、または、それに代わり、連続レーザー１２からビームを機械的または電子工学的に切り刻むことのいずれかによりパルス化レーザーエネルギーを生成する。代表的には、パルス化レーザーが好適である。好適なパルス化レーザー源は、窒素レーザー、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー、エルビウム：ＹＡＧレーザー、およびＣＯ２レーザーを含む。現在好適なのは、単純なフットプリントおよび相対的低コストに起因する、パルス化窒素レーザーである。
【０１５５】
レーザー１２から発せられる光子は、レーザー光学列１１によりプローブ１６の表面をたたくように向けられる。光学列１１は、脱離エネルギーの焦点スポットの形態にある適切な脱離流束が、プローブ１６に送達されるように、各レーザーパルスの強度を収集し、向け、集め、分割し、そして制御するように機能する、レンズ、ミラー、プリズム、減衰器、および／またはビームスプリッターの配列から構成され得る。
【０１５６】
あるいは、光学列１１は、各レーザーパルスのエネルギーを、収集し、向け、および分割するように機能する光学的ファィバーアレイから構成され得る。
【０１５７】
この後者の実施形態では、レーザー１２の出力は、光学的カップラーを用いて光学的ファイバーの入力側にカップルされる；このカップラーは、代表的には、その焦点距離および直径がこのファイバーの入力数アパーチャーに適切であるレンズから構成される。
【０１５８】
ファイバーに入るエネルギーの量は、ファイバーに対するレンズの位置の分別ある調節により制御され得る；この例では、この光学的ファイバーカップラーは、光学的減衰器として二重であり得る。別の好適な配置では、レーザーの総出力エネルギーは、フィイバー中にカップルされ、そして減衰器が、光学的ファイバーの出力側と、光学列の脱離スポット焦点エレメントとの間に配置される。なお別の好適な配置では、光学的減衰器が、レーザーと光学的ファイバーカップラーとの間に配置される。すべての例において、光学的減衰が採用され、レーザー１２の出力エネルギーとは独立に、プローブ１６の表面に適切なレーザー流束の送達を確実にする。代表的なレーザー流束は、２０−１０００μジュール／ｍｍ２のオーダーである。
【０１５９】
レーザーから焦点に集められたエネルギーを受けるとき、光学的ファイバー部材がしばしば損傷を受け得ることは良く確立されているので、入射レーザーエネルギーの流束が、ファイバーの損傷閾値未満であるように、ファイバーの入力側の受容面積を最大にすることが有利である。後者はまた、レーザーおよび光学的ファイバーに対する光学的カップラーの相対的位置を調節するとき、レーザービームの光学的ファイバーとのアラインメントを単純にする。しかし、プローブ１６において合理的な脱離流束レベルを得るために、約２００μＪ／レーザーパルスの最大エネルギーを送達する代表的な窒素レーザーとともに用いられるとき、４００μｍ（ミクロン）の最大出口側ファイバー直径は超えるべきではない。この問題の解決は、その入力側が４００〜１２００ミクロンのオーダーにある直径を有し、そしてその出力側が２００〜４００ミクロンの直径を有するテーパー状の光学的ファイバーを取り込むことにある。
【０１６０】
代表的には、脱離スポットは、脱離およびイオン化を誘導するに十分な流束を維持しながら、プローブ１６の最大領域を照射することにより、各パルスに対するイオンの生成を最大にするサイズに集められるべきである。４極−４極飛行時間型タンデム質量スペクトル分析器にカップルしたレーザー脱離／イオン化源における約２００μＪ／パルスの最大エネルギーを送達する代表的な窒素レーザーを用いながら、最適レーザースポット面積は、０．４〜０．２ｍｍ２の間の範囲であることが決定された。
【０１６１】
レーザー脱離／イオン化源１３は、代表的には、光学的列１１の一体部分、プローブ観察光学機器１８を備え得る。光学的機器１８は、照射源、レンズ、ミラー、プリズム、二色性ミラー、バンド−パスフィルター、およびＣＣＤカメラを含み得、脱離位置、すなわち、レーザーにより照射されるプローブ１６の領域の照射および観察を可能にする。
【０１６２】
レーザー光学的列１１が、光学的ファイバーを備える場合、観察光学的機器１８は、光学的ファイバーそれ自身からの光を利用し得る。
【０１６３】
例えば、光学的ファイバーカップラーは分岐し得、付与されたレーザーエネルギーをモニターする手段として用いられるレーザー励起エネルギーの小フラクションを裂き取るか、またはそれは、脱離位置を照射するための可視光の導入を可能にするように分岐され得る。
【０１６４】
これら２つの実施形態のうち最初の実施形態において、励起エネルギーの一部は、光検出器上に衝突するように方向付けられ、この光検出器は、プローブ１６に送達されるレーザーエネルギーの実質量を反射するように較正されたレーザーエネルギー回路の一体化された構成要素である。第２の実施形態において、可視光は、ＣＣＤカメラに連結された光オプティクスの別個のセットを通してか、または光ファイバーとレーザー励起源との間のプリズムまたは二色ミラー（これは、反射された光を、光ファイバーの主ブランチ（ｍａｉｎ ｂｒａｎｃｈ）を通してＣＣＤカメラに向ける）の使用のいずれかにより、脱離位置を照射するように方向付けられて、この領域のビューイングを可能にする。
【０１６５】
あるいは、プリズムまたは二色性ミラーは、光ファイバーの照射ファイバーブランチと照射源との間の線に沿って配置されて、このブランチ中に結合する任意の後方反射したイメージが、ＣＣＤカメラに衝突するように方向付けられることを可能にし得る。なお別の実施形態において、このファイバーは、三又にされ得、その結果１つのブランチは、脱離／イオン化レーザーパルスを送達し、第２のブランチは、脱離位置を照射するための可視光を送達し、そして第３のブランチは、この脱離位置からＣＣＤカメラへと反射光を伝達する。これらのビューイングスキームのそれぞれについて、適切な帯域フィルターは、あるいは有害な高エネルギー光子の伝送を防ぐために、ＣＣＤカメラとビューイング光学縦列との間に配置されるべきである。この高エネルギー光子は、プローブ表面上の入射レーザーパルスの直接反射として生じるか、または入射レーザーパルスによる電子励起の直接の結果としての、プローブ表面から放射される二次光子である。
【０１６６】
（プローブインターフェース）
親和性捕捉プローブインターフェース１０は、親和性捕捉プローブ１６を可逆的に係合し得、そしてレーザー源１２に対して呼び掛け可能な関係で、かつタンデム質量分析計１４と同時に連絡するようにプローブ１６を位置付けし得る；この連絡は、大気圧〜準大気圧を支持する。
【０１６７】
プローブインターフェース１０は、プローブホルダー、プローブ導入ポート、プローブ位置アクチュエータアセンブリ、真空および空気アセンブリ、およびインターフェースイオン収集システムを備える。
【０１６８】
このプローブホルダーは、プローブ１６の形状因子に適合するように形成されるプローブインターフェース１０の構成要素である。プローブ１６がＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ ＵＳＡ）である場合、プローブホルダーは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイの形状因子に適合する。
【０１６９】
このプローブホルダーは、単一のプローブ１６または複数のプローブ１６を保持し得る。このホルダーは、各プローブ１６を、レーザー脱離／イオン化源１３により呼び掛けられるように、そしてインターフェースイオン収集システムに対して適切な配置で位置付ける。
【０１７０】
このプローブホルダーは、位置アクチュエータアセンブリと緊密に接触する。
【０１７１】
このアクチュエータアセンブリは、プローブの異なる領域が、呼び掛けられ得、そしてこのような照射から生じたイオンが、タンデム質量分析計１４中への導入のために収集され得るように、レーザー脱離／イオン化源１３およびインターフェースイオン収集システムに対してプローブ１６の相対位置を移動する。
【０１７２】
このアクチュエータは、電気機械式デバイスを備え、このデバイスは、レーザー脱離／イオン化源およびイオン収集システムに対するプローブの位置を一定に維持しながら、プローブ１６の並進移動および／または回転移動を支持する。このような電気機械式デバイスとしては、機械式位置センサもしくは光位置センサ、ソレノイド、ステッパー電動機、ＤＣもしくはＡＣ同期電動機（これは、線形運動アクチュエータと直接または間接的に連絡する）、直線運動もしくは円運動ガイドレール、ジンバル、ベアリング、またはアクスルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
プローブ導入ポートは、プローブホルダー（ロードされたプローブ１６を含む）を、過度なレベルの空気をプローブインターフェース１０およびタンデム質量分析計１４に導入することなく、プローブ位置アクチュエータアセンブリ上に配置することを可能にする。
【０１７４】
後者を達成するために、このプローブ導入ポートは、真空排気系（プローブ導入ポート排気系）を使用して、空気をポンプで出し、チップを作業位置に移動する前に標的ポート圧力を達成する。プローブ交換の間、プローブアクチュエータアセンブリは、プローブを、作業位置（レーザー脱離源１３およびイオン収集システムと一直線上の位置）から交換位置まで移動させる。このようにする際、アクチュエータは、交換ポート（これは、まもなく大気圧まで上昇される）と、質量分析計の入口との間にシールを提供し得る。質量分析計入口を密封した後、プローブ導入ポート加圧システムによりこのプローブ導入ポートに空気が導入される。これによりプローブホルダーの大気表面と導入ポートとの間の圧力差が無くなり、プローブホルダーがプローブ位置アクチュエータアセンブリから取り出されることを可能にする。
【０１７５】
先に分析したプローブ１６を取り出して新しいプローブ１６を設置した後、そのプローブホルダーは、その位置アクチュエータ中に戻されて、サンプルロードプロセスが始まる。以前に記載されたように、プローブ導入ポートは、排気系により準大気圧までポンプで排気され得る。標的サンプル導入圧を達成すると、このプローブアクチュエータシステムは、プローブ１６を交換位置から作業位置まで移動させ、そしてそれを行う際に、質量分析計入口に対するシールを開放する。
【０１７６】
あるいは、イオンが、大気圧に保持された脱離チャンバにおいて生成されて、そしてこのイオンを質量分析計入口へ導入するイオン光学アセンブリに最終的に向けられる場合、このプローブ導入ポートを排気および加圧する必要はない。なぜなら、このポートは、大気圧に維持されるからである。
【０１７７】
プローブ導入ポート排気系は、真空ポンプ、圧力センサ、真空適合性の管状部材および接続フィッテング、ならびに真空適合性弁を備え、協調して作動する場合、プローブ１６が作業位置へと移動され得るように、サンプル交換後に導入ポート内に含まれる空気の制御された排気が可能になる。真空ポンプは、一段式または多段式のオイル機械式ポンプ、スクロールポンプ、またはオイルを使用しないダイアフラムポンプであり得るが、これらに限定されない。
【０１７８】
好ましい実施形態において、真空適合性弁は、電気制御された電磁弁である。同じ実施形態において、圧力センサは、大気圧から１ミリトルまでの範囲に及ぶ圧力範囲で作動し得る電子センサである。このような圧力センサとしては、熱電対真空計およびピラニ真空計が挙げられるがこれらに限定されない。同じ実施形態において、このシステムの協調操作は、アナログ論理回路またはデジタルマイクロプロセッサにより提供される論理制御下で達成され、これは、圧力センサおよび位置センサからの入力を調和させて、全体の装置操作の一部としてサンプルポートの自動排気を可能にする。
【０１７９】
プローブ導入ポート加圧システムは、ガス源、圧力センサ、ガス伝導管状部材およびフィッティング、ならびにガス適合性弁を備え、これらは、協調して作動した場合に、交換ポートを加圧する気体の制御された導入を可能にし、それによりアクチュエータアセンブリからのプローブホルダの取り出しを可能にする。
【０１８０】
一実施形態において、ガス源は、未処理の空気である。別の実施形態において、ガス源は、大気であり、これは、最初に水分吸収トラップをとおり、そして次に、必要に応じて加圧系への導入の前に粒状フィルターを通る。別の実施形態において、加圧ガスは、空気を使用する代わりに、乾燥不活性ガス（例えば、窒素またはコスト効率の良い希ガス）の精製した供給源により供給される。
【０１８１】
好ましい実施形態において、加圧系の、ガス伝導管状部材、フィッティング、いくつかの弁、および圧力センサは、排気系において使用されるものである。同じ実施形態において、この系の協調した操作は、アナログ論理回路またはデジタルマイクロプロセッサにより提供される論理下で達成され、これは、圧力センサおよび位置センサからの入力を利用して、装置全体の操作の一部としてサンプルポートの自動加圧を可能にする。
【０１８２】
プローブインターフェース圧力調節系は、プローブ１６のサンプル提示（吸着）表面とイオン収集システムとの間に存在する脱離チャンバにおける選択的バックグラウンド気圧を提供するように機能する。許容可能な脱離チャンバ圧力範囲は、大気圧から０．１マイクロトルに及ぶ。好ましい圧力範囲は、１トル〜１ミリトルに及ぶ。プローブインターフェース圧力調節系は、ガス源、ガス伝導管状部材およびフィッティング、気流レギュレーター、ならびに圧力センサを備える。このガス源は、未処理の空気であり得る。別の実施形態において、このガス源は、最初に水分吸収トラップを通されて、そして次に必要に応じて調節系への導入の前に粒状フィルターを通される空気である。別の実施形態において、調節ガスは、乾燥不活性ガス（例えば、窒素またはコスト効率の良い希ガス）の精製された供給源により供給される。気流レギュレータは、手動で制御されるフローレストリクターであり得る。
【０１８３】
あるいは、気流調節は、電子制御されたフローレストリクターを使用することにより達成され得る。好ましい実施形態において、好ましい脱離チャンバ圧力の閉ループ制御は、アナログ論理回路またはデジタルマイクロプロセッサにより提供される論理制御下の自動様式で達成され、これは、自動気流レギュレータと能動的に相互作用して、圧力計からの予め確立された読み出しを達成する。
【０１８４】
インターフェースイオン収集系は、静電イオン収集アセンブリ、任意の空気イオン収集アセンブリ、および静電またはＲＦイオンガイドを備える。
【０１８５】
この静電イオン収集アセンブリは、脱離チャンバ内で脱離したイオンを収集して、それらを質量分析計入口に向けるように機能するＤＣ静電レンズ要素の配置を備える。
【０１８６】
一実施形態において、静電イオンアセンブリは、２つの静電要素を備える。第１の要素は、プローブホルダーおよびプローブ表面から構成され、そして第２の要素は、抽出レンズである。この抽出レンズは、プローブの表面から０．２〜４ｍｍ離れて配置される。この抽出レンズは、直径２ｍｍ〜２０ｍｍの範囲の開口を含み、これは、脱離位置の中心から質量分析計入口の中心まで延びる垂直軸の周りで同心上に位置する。独立したＤＣ電位が、このアセンブリの各要素に印加される。
【０１８７】
好ましい実施形態において、抽出レンズは、直径１０ｍｍの開口を含み、そしてプローブ表面から１ｍｍ離れて配置される。同じ好ましい実施形態において、１０ボルトの電位差が、抽出器とアレイとの間に確立される。
【０１８８】
任意の空気式イオン収集アセンブリは、ガス源、伝導管状部材、管状部材コネクタ、気流レギュレータ、気圧センサ、およびガス放出ポートを備え、その結果、ガスの所定のフローが生成されて、脱離チャンバ内の脱離したイオンの、質量分析計入口へのバルク移動を補助し得る。
【０１８９】
ガス源は、未処理の空気であり得る。別の実施形態において、ガス源は、最初に水分吸収トラップを通り、そして系への導入の前に、必要に応じて次に粒状フィルターを通るように方向付けられる空気である。別の実施形態において、イオン収集ガスは、乾燥不活性ガス（例えば、窒素または任意のコスト効率の良い希ガス）の精製された供給源から供給される。
【０１９０】
気流レギュレーターは、手動制御フローレストリクターであり得る。あるいは、気流調節は、電子制御フローレストリクターを使用することにより達成され得る。圧力センサは、熱電対真空計およびピラニ真空計であり得るが、これらに限定されない。ガス放出ポートは、バルク気流を、プローブの周囲でかつ脱離位置と質量分析計入口との間の中心に位置する垂直軸に沿って誘導するように、プローブ１６の後に位置する。
【０１９１】
好ましい実施形態において、ガスの流れは、アナログ制御回路またはデジタル制御回路の使用により自動式閉ループ制御下にあり、その結果、適切なイオン掃引フローが、脱離チャンバを過剰に加圧することなしに生成される。
【０１９２】
インターフェースイオン収集システムの最後の構成要素は、イオンガイドである。このイオンガイドは、収集されたイオンを質量分析計１４に移動させるように作用する。静電型またはＲＦ型の種類であり得る。好ましい実施形態は、多重極ＲＦイオンガイドである。後者の例は、四重極イオンガイドまたは六重極イオンガイドである。以下により詳細に記載される好ましいＱｑ−ＴＯＦ機において、イオンガイドは、四重極ＲＦイオンガイドである。イオンは、静電加速力および空気式加速力（それぞれ、静電イオン収集システムおよび空気式イオン収集システムにより生成される）によりイオンガイド中に向けられる。好ましい実施形態において、イオンガイドのＤＣ静電ポテンシャルは、抽出レンズの静電ポテンシャルより代表的に１０〜２０ボルトだけ低い。
【０１９３】
（タンデム質量分析計）
本発明の分析機器としては、さらにタンデム質量分析計１４が挙げられる。タンデム質量分析計１４は、直交四重極飛行時間型（Ｑｑ−ＴＯＦ）、イオントラップ（ＩＴ）、イオントラップ飛行時間型（ＩＴ−ＴＯＦ）、飛行時間−飛行時間型（ＴＯＦ−ＴＯＦ）、およびイオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）の種類を含む群から有効に選択され得る。
【０１９４】
直交Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳが、ここでは好ましく、そして以下に詳細にさらに記載される。
【０１９５】
ＱｑＴＯＦ ＭＳの主要な長所は、得られる質量の精度および分解能；ペプチドおよび低ＭＷ範囲における増大した感度；および低エネルギーの衝突誘起脱離（ＣＩＤ）を使用することによる優れたｍｓ／ｍｓ性能である。エレクトロスプレーイオン化源を用いる直交ＱｑＴＯＦは、ＡＢ／ＭＤＳ Ｓｃｉｅｘ （ＱＳＴＡＲＴＭ；ＡＢ／ＭＤＳ−Ｓｃｉｅｘ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から市販されている。
【０１９６】
図２を参照して、ＱｑＴＯＦの原理および特徴は、簡単に概要を示される。
【０１９７】
イオンは、第１の四重極レンズ「ｑ０」の前で脱離チャンバにおいて生成される。ｑ０内の圧力は、代表的には約０．０１〜１ｔｏｒｒに維持されるが、大気圧にも維持され得る。この様式において、脱離されたイオンは、その生成後すぐにバックグランドガスとの衝突により急速に冷却される。
【０１９８】
イオン集団のこの冷却または減衰は、３つの主要な利点を提供する。
【０１９９】
第１に、この冷却は、脱離したイオンの初期エネルギー分布を排除し、そしてそれらの総エネルギーをそれらの熱エネルギーに近付く点まで低減させる。これにより直交抽出要件が単純化され、イオン位置およびイオンエネルギーの変動が補正され、それにより最終的な分解能が改善される。この改善された分解能の直接的な結果は、低ｐｐｍレベルにまで低下した増強された質量の精度である。
【０２００】
衝突冷却の第２の主要な利点は、長期のイオン減衰速度を低減する能力である。ガスの衝突は、内部励起を緩和し、そしてペプチドイオンおよびタンパク質イオンの安定性を改善する。この安定化効果は、イオンが約１ｔｏｒｒの圧力のバックグランドガスの存在下で生成される場合に最小にされるようである。他者により公開された測定は、小さな基の損失およびバックグランドフラグメンテーションが、実質的に無くなり得、高分子量タンパク質および他の不安定な生体高分子（すなわち、糖結合体、ＤＮＡなど）の伝達を改善することを示した。より速い崩壊機構（即発型崩壊および起点（ｉｎ−ｓｏｕｒｃｅ）型崩壊がなお発生する。
【０２０１】
ｑ０衝突冷却の最後の利点は、質量分析機への偽連続的なイオンフローの生成にある。ｑ０におけるイオン衝突は、脱離雲をｑ０軸に沿って分散させる。この分散により、種々の脱離事象からのイオンが重なり始めるという状況が生じ、分析機へのイオンのエレクトロスプレー様の連続的な導入を生じる。
【０２０２】
ｑ０を通過した後、イオンは、第２の四重極２２（「Ｑ１」）に入る。この四重極は、イオンガイドまたは質量フィルターのいずれかとして作用する。ここで、ｍｓ／ｍｓ実験または単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）実験のために、イオンの選択が行われる。
【０２０３】
Ｑ１を出た後、イオンは、衝突セル２６に位置付けられた第３の四重極２４（「ｑ２」）に入る。単純な実験の間、ｑ２は、単純なｒｆイオンガイドとして操作される。ｍｓ／ｍｓ実験のために、ｑ２は、約１０−２ｔｏｒｒの圧力の衝突ガスで満たされ、低エネルギーＣＩＤを促進する。
【０２０４】
ｑ２を出た後、イオンは、ｑ２の出口と収束グリッド２８との間に印加されたＤＣ電位差によりわずかに加速される。この加速は、イオンの速度をＹ軸に「付勢」し、その結果それらの速度は、それらのイオンのｍ／ｚの平方根に対して逆の関係になる。このことは、異なるｍ／ｚの全てのイオンが、直交抽出および自由飛行の後に検出器に衝突するべきである場合に、達成されなければならない。このような付勢が達成されない場合、異なるｍ／ｚのイオンは、同じＹ軸速度で直交抽出領域に入る。
【０２０５】
常に飛行時間であるので、より低いｍ／ｚのイオンは、より大きなｍ／ｚのイオンより前に、検出器に衝突する。Ｙ軸における変位の絶対的な程度は、Ｚ軸におけるイオンの飛行時間と、イオンのＹ軸速度との積である。検出器が、中位のｍｗのイオンのために最適化されたいずれかの位置に配置される場合、より軽いイオンはこの検出器に「届かず」、図２において検出器の右側に達する。対照的に、より大きなｍ／ｚのイオンは、検出器を「越え」、そして図２において検出器の左側に達する。その結果、全てのイオンが共通の検出点に衝突する場合、全てのイオンが、Ｚ軸速度とＹ軸速度との一定の比を維持することが必要である。先に記載した格子バイアス法が、このことを達成する。
【０２０６】
集束グリッド２８を通過した後に、イオンは、直交抽出要素の変調器領域３０に達する。変調器３０は、１０，０００パルス／秒（１０ｋＨｚ）に近い速度でパルス化される。イオンは、イオン光学機器の加速器カラム３２に押し込まれ、そして直交飛行時間（Ｏ−ＴＯＦ）の自由飛行領域３４に出る。イオンがイオンミラー３６に入る際に、エネルギー補正が達成される。このミラーにおいて、イオンは向きを変えられ、そして高速応答シュブロンアレイマイクロチャネルプレート検出器３８に衝突するよう方向付けられる。
【０２０７】
この原型の配置に対する代替が使用され得る。
【０２０８】
例えば、上に提供した構造は、高い加速エネルギーでのＯ−ＴＯＦを実施することが困難である。ペプチドおよびタンパク質についてのイオン検出感度が、全体のイオンエネルギーの増加と共に改善されることは、十分に確立されている。ヒトインスリン（ＭＷ＝５８０７．６５Ｄａ）について、検出効率は、代表的なマイクロチャネルプレート検出器を使用する場合、３５ｋｅＶのイオンエネルギーにおいて、１００％に達する。これらのイオンが２０ｋｅＶまたは３０ｋｅＶのエネルギーに加速される場合、自由飛行チューブのライナー４０および他の対応する構成要素は、それぞれ−２０ｋＶまたは−３０ｋＶに浮上（ｆｌｏａｔ）されなければならない。このような電位で、単純なイオン光学要素に対する安定な絶縁を提供することの困難は、周知である。複数の要素をこのような電位で安全に確実に浮上させることは、困難である。１つの解決法は、加速後技術の使用である。
【０２０９】
上記のデバイスとは異なり、このような代替のデバイスは、加速器の後の検出器を使用する（図示せず）。イオンは、直交抽出要素を離れた後に約４ｋｅＶのエネルギーに加速され、そして自由飛行領域は、−４ｋＶで浮上される。イオンが加速器後検出器アセンブリに入ると、さらなる加速が達成される。このアセンブリにおいて、イオンは、直線電位で維持される、場を保持する格子を通過する。次いで、イオンは、場を保持する格子と、検出器の一次イオン変換表面との間に確立される場において、さらなる加速を受ける。このような加速場は、４〜１０ｍｍの距離にわたって、１０〜２０ｋＶのオーダーである。
【０２１０】
この直交の設計は、飛行時間の測定とイオン形成との結び付きを解くので、多数の利点が実現される。
【０２１１】
レーザーの流束量に関連する問題（例えば、イオン遮蔽に起因するピークのブロードニングおよびイオン加速場の崩壊）が、排除される。なぜなら、脱離プルームのイオンは、ＴＯＦ質量分析計への直行抽出および加速の前に、膨張して温度が下がるための延長した時間（代表的には数ミリ秒）を有するからである。さらに、直交抽出は、ＥＡＭの過剰の中性物質装填によって生じる化学的ノイズに起因して高レーザーエネルギーの従来の抽出スペクトルの初期に見られる、大きな隆起およびベースラインの異常の大部分を排除する。中性物質は変調器領域において抽出されないので、イオンのみが検出器へと下方に伝達され、そして化学的ノイズは、かなり低下する。
【０２１２】
これらの要因は、平行連続イオン抽出アプローチまたは遅延イオン抽出アプローチの間に通常使用されるものよりも２〜３倍大きい、レーザー流束量の使用を可能にする。正味の結果は、乏しいサンプル−ＥＡＭ均一性が存在する場合でさえも、「スイートスポット」を探し、そして検索する必要性を、ほぼ完全に排除すること、ならびに外部標準質量の正確さの改善された決定（代表的な誤差は、２０〜５０ｐｐｍの間である）、改善された定量的再現性、および改善された信号対ノイズである。さらなる利点は、広いｍ／ｚ範囲のイオンを分析するための、低レーザーエネルギー走査および高レーザーエネルギー走査を実施する必要性の排除である。単一のレーザー流束量が、ここで、低いｍｗのイオンと高いｍｗのイオンとの両方を見るために使用され得、未知の混合物の分析を大いに単純化する。
【０２１３】
おそらく、従来の平行抽出アプローチと比較した場合の、このデバイスの最も重要な利点は、サンプルの位置決めの厳密な要件に対する必要性を排除する能力にある。ＴＯＦ測定は、実質的にイオン形成プロセスから除かれるので、イオンの最初の位置はもはや重要ではない。さらに、イオン形成は、高圧の環境で、高電圧の抽出場の共存的な印加なしで達成されるので、固相サンプル入口システムの設計要件は、大いに低減される。二次元サンプルの操作を使用し、一方で優れた外部標準の質量の正確さの性能を維持する、単純なアプローチが採られ得る。さらに、サンプル提示表面はもはや、金属または他の伝導性媒体で作製される必要がない。
【０２１４】
要約すると、レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳは、既存のＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ技術より優れた、以下の利点を有する：（１）増加した外部標準質量の正確さ（代表的に２０〜５０ｐｐｍ）；（２）増強された分解能；（３）改善されたｍｓ／ｍｓ効率；（４）単一の高レーザーエネルギーレベルを使用する、信号発生の改善された容易さ（これは、高エネルギー走査および低エネルギー走査の必要性を排除する）；（５）ＴＤＣ技術および最小の脱離閾値より２〜４倍高いレーザー流束量の使用による改善された定量能力；（６）二次元サンプルアクチュエーターに対する減少した要件；（７）サンプル提示プローブ表面に対してプラスチック構成要素を使用する可能性（例えば、射出成形された二次元プローブアレイ）；（８）単一のイオンモニタリングを使用することによる化学的ノイズの低下、およびＥＡＭ化学的ノイズ領域におけるイオンの測定の能力の増大。
【０２１５】
レーザー脱離イオン化（ＬＤＩ）Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳは、タンパク質の特徴付けおよび同定において、既存のＭＡＬＤＩ−ＰＳＤアプローチより優れた以下の利点を有する。
【０２１６】
ＬＤＩ−ＱｑＴＯＦは、より高い質量分解能および質量の正確さを提供する；データベースマイニングアプローチにおいて、このことは、誤ったポジティブデータベースヒットの数を減少させる能力を増加させ、同定を容易にした。さらに、ＱｑＴＯＦはまた、ＰＳＤ ＭＳ／ＭＳを用いて得られ得る感度より１桁大きい感度を提供する。
【０２１７】
本発明の分析機器は、印象的なＭＳ／ＭＳ能力を示し、そして１回のＭＳ分析に対して２０ｐｐｍ未満の質量アサインメント誤差を示す。後者は、単一の親和性捕捉プローブの表面に同時に保持された複数のタンパク質の同定を可能にした。
【０２１８】
（他の構成要素）
親和性捕捉プローブタンデムＭＳ機器１００は、代表的に、タンデム質量分析計検出器とインターフェースした、デジタルコンピュータをさらに備える。このデジタルコンピュータは、代表的に、レーザー脱離源１２とさらにインターフェースして、このコンピュータが、イオン生成を制御すること、ならびにデータの獲得および分析に関与することを可能にする。
【０２１９】
分析ソフトウェアは、コンピュータに対してローカルであり得るか、または遠隔であり得るが、コンピュータに通信可能にアクセス可能である。例えば、このコンピュータは、インターネットへの接続を有し得、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ、ＰＲＯＷＬ、またはＭａｓｃｏｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｅｎｇｉｎｅ（これらは、ワールドワイドウェブで利用可能である）のような分析パッケージの使用を可能にする。この分析ソフトウェアはまた、ＬＡＮサーバまたはＷＡＮサーバ上に遠隔に常駐し得る。
【０２２０】
（親和性捕捉プローブ）
本明細書中以下の節に詳細に記載されるもののような分析を実施するために、吸着された分析物を有する少なくとも１つの親和性捕捉プローブ１６が、プローブインターフェース１０に適所で係合され、レーザー脱離／イオン化源１３によって問い合わせられ、そして脱離したイオンをタンデム質量分析計１４に送達する。
【０２２１】
プローブ１６は、代表的に、１つ以上の吸着表面１８を有し、この表面は、互いに異なり得る（１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄ）。代表的に、複数の吸着表面１８が存在する場合、全てがプローブ１６の共通の面に曝露される。複数の吸着表面１８が単一のプローブ表面に存在する場合、このプローブは、代表的に、プローブアレイと称される；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能な市販の実施形態は、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイと称される。
【０２２２】
吸着表面１８は、代表的に、クロマトグラフ吸着表面または生体分子親和性表面のいずれかである。
【０２２３】
クロマトグラフ親和性表面は、分析物間でのクロマトグラフ識別または分析物の分離が可能な吸着剤を有する。従って、このような表面は、陰イオン交換部分、陽イオン交換部分、逆相部分、金属親和性捕捉部分、および混合モード吸着剤（このような用語は、クロマトグラフの分野において理解されるとおりである）を備え得る。生体分子親和性表面は、特異的結合が可能な生体分子を含む吸着剤を有する。従って、このような表面は、抗体、レセプター、核酸、レクチン、酵素、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ＳｔａｐｈプロテインＡおよびＳｔａｐｈプロテインＧを含み得る。吸着剤表面は、以下の節にさらに記載される。
【０２２４】
インターフェース１０は、レーザー脱離／イオン化源１３に問い合わせ可能な関係で、プローブ１６を配置する。代表的に、レーザーは、プローブ吸着表面１８に問い合わせることが望ましい。従って、インターフェース１０は、プローブ１６および吸着表面１８を、レーザー脱離／イオン化源１３に問い合わせ可能な関係で配置する。吸着表面１８がプローブ１６の１つの面のみに位置する場合には、プローブ１６および／またはインターフェース１０のプローブホルダは、非対称な寸法にされ得、従って、吸着表面１８にレーザー脱離源１３を提示する配向でのプローブ１６の挿入を強制する。
【０２２５】
プローブ１６が複数の吸着表面１８を有する場合、レーザー源１２が各吸着表面１８を不連続にアドレスし得ることが望ましい。このことは、レーザー源１２とインターフェース１０との間に介在する光学機器によって、レーザー源１２および／またはインターフェース１０を可動にすることによって、あるいはこれらの組み合わせによって、達成され得る。
【０２２６】
プローブ１６は、単一のＭＳ分析において現在使用されるような、親和性捕捉プローブであり得る（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ ＵＳＡから入手可能な、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ）。
【０２２７】
（ＩＩＩ．親和性捕捉プローブタンデムＭＳ機器の適用）
本発明の上記分析機器は、以下において有意な利点を提供し、そして以下のための新規な方法を与える：（Ａ）タンパク質の発見および同定；（Ｂ）特異的結合対間の相互作用の特徴付け；（Ｃ）タンデム質量分析法による、タンパク質の配列決定および同定；（Ｄ）同定および検出のためのタンパク質分解増幅（「ＰＡＩＤ」）；ならびに（Ｅ）差示的タンパク質ディスプレイおよび迅速なタンパク質同定（「ＱＰＩＤ」）。
【０２２８】
これらの適用の５つ全てに共通の、本発明の分析機器によって与えられる利点としては、以下が挙げられる：親和性捕捉プローブ技術と組み合わせて、質量の正確さが高い測定を、単一の質量ＭＳおよびタンデムＭＳモードで実施する能力。特定の利点は、各適用に関して記載され、これらがここで順に記載される。
【０２２９】
（Ａ．タンパク質の発見および同定）
（１．本発明の方法の利点）
タンパク質の生物学者が解決しようと試みる問題の１つの関連するセットは、タンパク質の発見、同定、およびアッセイの開発である。
【０２３０】
タンパク質の発見とは、例えば、診断マーカーとして機能するかまたは重要な細胞機能を実施するので生物学的に興味深いタンパク質を、系において見出すプロセスである。タンパク質の同定とは、発見されたタンパク質の実体を決定するプロセスである。アッセイの開発とは、そのタンパク質を検出するための確実なアッセイを開発するプロセスである。本発明の方法は、以前の技術と比較して、これらのプロセスの３つ全てを実施する際に、実施者に利点を提供する。
【０２３１】
本発明の主要な利点は、タンパク質の発見からタンパク質の同定へ、そしてアッセイの開発へのプロセス工程を実施する、単一のプラットフォームを提供することである。表面増強レーザー脱離イオン化技術に基づく単一のプラットフォームの提供は、発見とアッセイ評価との間の時間を有意に減少させる：以前の技術を用いると数ヶ月間かかっていたものが、今や数週間または数日でなされ得る。
【０２３２】
本発明の方法はまた、実験を実施するために必要とされるサンプルの量を、有意に減少させる。以前の方法は、数マイクロモルの分析物を必要としたが、本発明の方法は、ピコモルの分析物を用いて、同じ実験を実施し得る。このことは、サンプルがほとんどない場合、またはスケールアップが困難である場合に、重要な困難を克服する。
【０２３３】
以前には、タンパク質の発見および単離は、代表的に、染色またはウェスタンブロットにより検出して、２Ｄ電気泳動分離を使用して達成された。しかし、差示的に発現したタンパク質を検出するためにゲルを互いに比較することは、困難な手順である。
【０２３４】
発見されたタンパク質は、今や、質量分析法を使用して同定され得る。重要なタンパク質が単離され得、そして最終的に、プロテアーゼでゲル中でフラグメント化され得、そしてペプチドフラグメントは、質量分析計および適切なバイオインフォマティクス方法によって分析され得る。しかし、ゲルは、現在の質量分析法に適合性ではなく、そしてペプチドフラグメントは、ゲルから取り出されなければならない。後者のプロセスは、サンプルの損失を必然的にもたらすので、このアプローチは、多量の出発タンパク質および材料を必要とする。重要なタンパク質がそうであり得るように、タンパク質が希少である場合、このことは、このプロセスの困難性を増加させる。
【０２３５】
一旦同定されると、実施者は、そのタンパク質を検出するために、確実なアッセイを開発する必要がある。代表的に、これは、ＥＬＩＳＡアッセイを開発することを包含する。次に、この技術は、抗体の産生を必要とした。このことは、特に、目的のタンパク質が免疫のために多量に産生することが困難である場合、時間を浪費する作業であり得る。
【０２３６】
従って、従来の技術は、タンパク質の発見、タンパク質の同定およびタンパク質のアッセイを達成するために、３つの異なる技術を必要とし得た。本発明の方法は、１つの技術で、これを達成し得る。
【０２３７】
（２．タンパク質の発見、同定およびアッセイの開発の方法）
タンパク質の発見、同定およびアッセイの開発のための、本発明の方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）目的のタンパク質を発見するための、差異マップを作成する工程、（ｉｉ）そのタンパク質を、親和性捕捉プローブタンデム質量分析法によって同定する工程；および（ｉｉｉ）親和性捕捉プローブレーザー脱離イオン化クロマトグラフ表面アッセイまたは親和性捕捉プローブレーザー脱離イオン化生体特異性表面アッセイを使用して、評価する工程。
【０２３８】
このプロセスは、以下のように進行し得る。
【０２３９】
例えば、濃縮水（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）研究の異なるマッピングを使用して、目的のタンパク質（単数または複数）が提供されるかまたは発見される。これらの方法は、例えば、ＷＯ９８／５９３６２（ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐ）（その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されている。簡単に言えば、何らかの重要な局面が異なる２つの生物学的サンプル（例えば、正常対疾患；機能的対非機能的）が、濃縮水クロマトグラフィー方法によって試験される。この方法は、サンプルを、複数の異なるクロマトグラフィー親和性および洗浄の条件に供する工程、続いて親和性捕捉プローブレーザー脱離イオン化によって、「保持されたタンパク質」を試験する工程を包含する。２つのサンプル間で差示的に発現されるタンパク質は、さらなる試験のための候補である。これらは質量分析計で試験されたので、これらの候補タンパク質の分子量は既知である。
【０２４０】
通常、目的のタンパク質に加えて、多数のタンパク質が、チップ上に保持される。従って、次の任意の工程は、さらなる分析のためのサンプルを単純にするように、目的のタンパク質（単数または複数）が保持される、親和性および洗浄の条件を改善することである。（これらの任意の工程はまた、ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＹｉｐの国際特許出願に記載されている。）目的の単一のタンパク質の捕捉が理想的であるが、約１０個以下の検出可能なタンパク質の捕捉が好ましい。この改善された方法は、目的のタンパク質に対する改善されたクロマトグラフィーアッセイを提供する。
【０２４１】
次いで、保持されたタンパク質は、選り抜きのタンパク質分解試薬を使用してプローブでフラグメント化されて、引き続く研究のためのペプチド（切断産物）のプールを生じる。いくつかの場合において、特定のエンドプロテアーゼ（例えば、トリプシン）を使用する消化が有利であり得る。なぜなら、切断パターンが既知であり、そしてバイオインフォマティクス方法（配列がデータベースに格納されており、そして実験実行の単一のｍｓスペクトルを使用して検索されたタンパク質の、インシリコ切断を包含する）と直接比較可能であるからである。多くの他の場合において、吸着されたタンパク質の消化は、高効率のプロテアーゼ（これは、複数の位置で切断し、そして変性条件下で作動する）または変性条件下で共存的に作動する化学的タンパク質分解アプローチのような、より積極的なタンパク質分解手段を使用して、最良に達成される。後者の場合、低下した程度の切断特異性は、しばしば、高い分解能、高い正確さのＭＳ−ＭＳ分析（例えば、質量アサインメントの誤差が２０ｐｐｍ未満であり、そして分解能が約１０，０００である）を使用することによって、タンパク質の同定を実施することの必要性を生じる。さらに、実施される消化は、制限された消化（すなわち、サンプル中の１つのタンパク質あたり平均５以下のタンパク質フラグメント、より好ましくは２以下のタンパク質フラグメントを生じる消化）であり得る。
【０２４２】
この時点で、特定のペプチドフラグメントが、目的のタンパク質分析物の切断産物であるのか、他の保持されたタンパク質の１つの切断産物であるのかは、明らかではないかもしれない。それにもかかわらず、ペプチドフラグメント（切断産物）の１つを、（可能ならば無作為に、可能ならば目的のタンパク質に対応する情報に基づいて）選択し、そしてこのペプチドを気相フラグメント化に供することによって、この分析が進行する。１つのこのような方法は、衝突誘起解離（ＣＩＤ）である。このペプチドは、チップから単離される必要がない。なぜなら、ＭＳ−ＭＳデバイスが、目的のペプチドを、他のペプチドから、質量分析計において単離するからである。このことは、選択されたペプチドフラグメントのさらなるフラグメント化パターンを生じる。
【０２４３】
データベースマイニングプロトコールのような、当該分野で既に確立された方法を使用して、フラグメンテーションパターンから情報を、タンパク質配列データーベースを問い合わせるために使用して、ペプチドフラグメントが誘導されるタンパク質に関する、１つ以上の推定正体候補を生成する。
【０２４４】
このような分野で確立されたプロトコールによって使用される１つのアプローチにおいて、クロスネスオブフィット（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ−ｏｆ−ｆｉｔ）分析を実施して、選択されたフラグメントの正確な質量スペクトルが、配列データーベースにアクセスする前に、タンパク質の配列から予想される質量スペクトルとどれほど良好に一致するかを測定する。このような予測されたスペクトルは、比較の間に生成されるか、または予測された質量スペクトルの誘導データーベースで予め計算されて格納されるかのいずれかである。次いで、このデーターベースのタンパク質は、経験的なフラグメント質量スペクトルとのクロスネスオブフィットに基づいてランク付けされ得る。親タンパク質およびオリジナルの種の質量の知識（これらの両方の質量は、既知である）は、生成される正体候補の数を限定するのを補助する。
【０２４５】
このような分野で確立されたプロトコールによって使用された代替のアプローチは、測定されたフラグメントイオンスペクトル内に存在するフラグメントイオンの質量の差を使用して、選択されたフラグメントのアミノ酸配列の少なくとも一部を決定し；次いで、この一部の配列を使用して、代表的に、さらなる識別基準（例えば、フラグメント化していない親タンパク質イオンの質量、オリジナルの種の質量、そして公知の場合、タンパク質分解断片化前のタンパク質質量分析）を用いて、タンパク質配列データーベースを問い合わせる。タンパク質正体候補は、予想配列と配列データーベースにアクセスする前の配列との間で計算されたクロスネスオブフィットに基づいて識別される。このような問い合わせアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアライメントサーチツール（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）））は、当該分野で公知であり、公に利用可能である。
【０２４６】
タンパク質正体候補を識別するための当該分野で確立された２つのアプローチは、相互に排他的ではなく、そして並行的または連続的に実施され得る。
【０２４７】
次いで、ペプチドフラグメントが生成されたタンパク質の推定識別子を確認する。推定正体候補の主要な配列のデーターベースおよび使用されたタンパク質分解剤の切断パターンからの知識を使用して、タンパク質分解剤によって正体候補の断片化から生成される、ペプチドフラグメント（特に、それらの分子量）を推定し得る。次いで、この予想された一連のフラグメントを、それらの質量に基づくチップに保持されるタンパク質のタンパク質分解切断後に生成される、正確な一連のフラグメントと比較する。次いで、推定されたフラグメントが計算される場合、この推定正体候補が、このチップに保持されるタンパク質の１つの識別子に実際に対応することを確認する。そしてそうでない場合、このフラグメントが生成されたタンパク質が識別されるまで、排除プロセスを介して、他の推定正体候補を試験しなければならない。この時点で、識別タンパク質に対応する生成されたフラグメントは、計算された場合に、生成された一連のフラグメントの合計から排除され得る。
【０２４８】
親和性条件および洗浄条件を精密にした後、１つのタンパク質のみが保持された場合、ペプチドフラグメントの全てが計算され、そしてこのプロセスが完了する。しかし、１つ以上のタンパク質が保持された場合、この状態は、より複雑となり得る。例えば、分析に使用されるフラグメントは、目的のタンパク質から生成されるか、またはこのフラグメントは、チップ上に保持されたタンパク質によって生成され得るが、目的のタンパク質ではない。
【０２４９】
１つ以上のタンパク質が、親和性捕捉プローブ上に保持された場合、目的のタンパク質が識別されるか、または全ての保持されたタンパク質が識別されるまで、記載されたＭＳ−ＭＳ方法によって計算されなかったペプチドフラグメントを分析する工程を繰り返すことが、有用である。
【０２５０】
あるいは、またはさらに、この親和性捕捉プローブに吸収されたタンパク質の断片化産物の混合物の複雑さは、タンデムＭＳ分析の前に低減され得る。これは、目的のタンパク質分析物の少なくとも１つの断片化産物のプローブに吸収されたタンパク質分解産物の中の相対濃度を増加させるに十分な時間および条件下で、第１の抽出物を用いて、少なくとも１回、このプローブを洗浄することによって有用に達成され得る。必要に応じて、さらなる洗浄、少なくとも１つの溶出物特性中において第１の溶出物と異なる、少なくとも第２の溶出物を使用するさらなる洗浄が、目的のタンパク質分析物の少なくとも１つの断片化産物のプローブに吸収されたタンパク質断片化産物の中で相対的な濃度をさらに増加させるのに十分な時間および条件下で実施され得る。
【０２５１】
この洗浄は、タンパク質分解断片化直後および分析直前に実施され得るか、あるいはまたは加えて、このプローブを本発明の分析用デバイスから除去し、次いで続く分析のためにこのプローブを再挿入する前に洗浄を実施することによって、第１のＭＳ／ＭＳ分析後に実施され得る。
【０２５２】
最後に、目的のタンパク質は、親和性捕捉プローブレーザー脱離イオン化アッセイ（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）で使用するために開発され得る、このタンパク質を保持するように既に決定されたクロマトグラフ表面または生物特異的表面のいずれかを使用して、親和性捕捉プローブレーザー脱離イオン化法によってアッセイされ得る。生物特異的表面の作製は、識別されたタンパク質に対する結合対（例えば、抗体、またはレセプターが公知である場合、レセプター）を提供する工程、およびこのチップ表面にこの結合対を取り付ける工程を包含する。次いで、目的のタンパク質は、既に記載した表面増強レーザー脱離イオン化質量スペクトロメトリーによってアッセイされ得る。
【０２５３】
（Ｂ．分子相互作用の特徴付け）
本発明の分析装置は、最初に、特異的な結合対間の相互作用の研究のための、感受性で効果的な単一プラットフォームアプローチを可能にする。
【０２５４】
特定の結合対の相互作用は、生物学的なプロセスの広範なスペクトルのコアにある。従って、このような相互作用を測定および特徴付けるための能力は、このようなプロセスを完全に理解するための必要な必須条件であり、臨床レベルにおいて、このような相互作用を測定および特徴付けるための能力は、これらのプロセスにおける病理学的異常性を理解するために、ならびにこのような相互作用を調節するため、またはさらに抑制するために使用され得る試薬の合理的な設計のために重要である。
【０２５５】
例えば、組織された真核生物組織のレベルにおいて、哺乳動物の神経系における細胞間のシグナル伝達は、それらの同族レセプターとの神経伝達物質の相互作用を介して媒介される。このような結合相互作用の分子的な性質の理解は、このようなシグナル伝達機構の完全な理解に必要である。臨床的なレベルにおいて、このような結合相互作用の分子的な性質の理解は、シグナル伝達の病理機構の十分な理解のために、およびこのようなシグナル伝達の病理を緩和する試薬、パーキンソン病から精神分裂病、強迫性障害から癲癇にいたる範囲の疾患の処置のために有用な試薬の合理的な設計のために必要とされる。
【０２５６】
別の例として、循環性レベルにおいて、Ｂ細胞レセプターと循環性抗原との相互作用は、Ｂ細胞クローンの展開、分化、および抗原特異的体液性免疫応答を引き起こすために必要とされる。抗原認識を担う抗原エピトープの理解は、免疫応答の完全な理解のために重要である。臨床的なレベルにおいて、このような理解は、より強固な体液性免疫を与えるワクチンの設計のために重要である。同様に、抗原提示細胞上のＭＨＣに関連して提示されるペプチドとＴ細胞レセプターとの相互作用は、細胞免疫の引き起こすことに関して重要である。抗原認識を担うＴ細胞エピトープの理解は、より強固な細胞免疫を与えるワクチンの設計のために重要である。
【０２５７】
個々の細胞のレベルにおいて、細胞外シグナルに対する表現型応答は、細胞表面レセプターとリガンドとの初期の相互作用から、シグナルを核に形質導入する細胞質内の相互作用、タンパク質転写因子とＤＮＡとの相互作用、次に、観測された表現型応答に導く別のパターンの遺伝子表現への細胞間相互作用の、少なくとも１つの、最も頻繁なカスケードによって媒介される。例えば、卵巣細胞による、エストロゲンおよびプロゲステロンの差動的結合は、排卵のために必要とされる。一方の、ステロイドホルモンレセプターとホルモンリガンドとの間の結合相互作用、および他方の、ゲノム中で配位したレセプターとステロイドホルモン応答エレメントとの結合相互作用の分子的な性質の理解は、ホルモン応答の理解のために重要である。次に、このような理解は、不妊症の理解のため、および排卵、着床、および／または胎児の生存度を抑制することが意図される薬剤（例えば、ＲＵ４８６）の合理的な設計のために重要である。
【０２５８】
このような相互作用は、真核生物系においてのみ見出されるだけではなく、原核生物系および原核生物と真核生物との相互作用においても見出されない。例えば、特定のグラム陰性細菌は、真核生物の尿道の浸襲のために必要とされる腺毛を合成し、このような相互作用の理解は、病理プロセスの完全な理解、およびこのような浸襲を防止し得る薬剤の合理的な設計のために重要である。
【０２５９】
多数の技術が、特定の結合対間のこのような分子間相互作用を研究およびマッピングするために、当該分野で使用される。それぞれは、有意な不都合を有する。
【０２６０】
このような方法の第１において、特定の結合対の１つのメンバーは、クロマトグラフィーカラムにパッケージングされる吸着剤に固定される。第１の（結合）結合対と接触する第２の（遊離）結合対の構造内の部位をマッピングするために、この第２の（遊離）結合対が、断片化される。代表的に、このような断片化は、特定のタンパク質分解酵素によるが、特定の化学的断片化（例えば、ＣＮＢｒによる）またはさらに非特異的な化学的な加水分解がなされ得る。その後、この消化物が、カラムを通過して、第１の（固定）対にさらに結合する、第２の（遊離）対の一部に結合する。
【０２６１】
次いで、第２の対のペプチドは、代表的に、塩またはｐＨ勾配を使用して溶出され、そして代表的にＭＡＬＤＩまたはエレクトロスプレーイオン化によって質量分析計にペプチドを導入することによって識別される。
【０２６２】
このアプローチのいくつかは、周知であり、そして有意に問題を有する。第１に、大量の精製された第１の結合対は、特定の吸着剤を作製するために必要とされる。第２に、代表的に精製された、大量の第２の結合対が、消化、吸着、および溶出に必要とされる。なぜならば、これらの段階のそれぞれは、希釈効果および分析物の損失が伴うからである。さらに、続く質量スペクトロメトリー分析は、高度に感受性であり得るが、流体相分析と質量分析計との干渉がまた、分析物の損失を生じさせ得る。
【０２６３】
おそらく、より基本的な不都合な点は、第１の対に結合する前に第２の結合対を切断することによって、このペプチドフラグメントに適切に保持されている第２の結合対におけるこれらの分子構造のみが、結合し、そしてその後に検出される。例えば、抗体が、線状ではなく不連続なエピトープにおいて抗原に結合する場合、このような不連続エピトープは、フラグメンテーションによって破壊され得、固定化された抗体への結合を支持し得ず、このような抗原エピトープは、検出され得ない。
【０２６４】
当該分野において第２の代表的なアプローチは、点変異を使用して、タンパク質結合対（分子間結合を担うこれらの残基）内でマッピングすることである。
【０２６５】
この後者のアプローチは、タンパク質結合対がクローニングされ、設計された点変異が導入され、改変されたタンパク質発現組換え体および改変された組換えタンパク質が精製されることが必要とされる。その後、改変されたタンパク質とその対とを結合する動力学を測定して、分子間相互作用における変異残基の効果を決定する。
【０２６６】
あまり頻繁に使用されないが、結合対間での接触の性質が、結合対のＸ線結晶解析によって解明され得る。この技術は高度に効果的であり、そして原子レベルの解像度を提供するが、各々の結合対が高度に精製されることが必要とされ、そして適切な共結晶（ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌ）が形成されることがさらに必要とされる。
【０２６７】
本発明の親和性捕捉タンデム質量分析（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）装置は、かなり少ない出発物質を必要とし、点変異分析を排除し、結晶化を排除し、そして純度要求を実質的に低減させる、改善されたアプローチを提供する。
【０２６８】
この第１の工程は、親和性捕捉プローブに結合対の１つを固定化することである。
【０２６９】
各々の対は固定化され得るが、これは、この結合接触に関する構造的な情報が得られる遊離対である。このアプローチの例として、レセプター／リガンド相互作用を使用して、このリガンドをプローブ上に固定化することにより、リガンドの結合に加わるレセプターの領域の同定が可能となるのに対して、このレセプターをこのプローブ上に固定することにより、レセプターへの結合に加わるリガンドの領域の同定が可能となる。このリガンドが、タンパク質（例えば、タンパク質ホルモン、サイトカイン、またはケモカイン）である場合、次に、各対をしようする別個の実験により、分子間接触の双方の理解が得られる。
【０２７０】
このプローブ結合パートナーが、共有結合または強力な非共有結合の相互作用を使用して固定化され得る。この選択は、固定化される対に対する適切な反応性基のアベイラビリティーおよびプローブの表面の化学的な性質に依存する。適切な化学は、この分析分野において周知である。
【０２７１】
例えば、固定化される結合対が、遊離アミノ基を有する場合、共有結合は、結合パートナーの遊離アミノ基とこのプローブ表面のカルボニルジイミダゾール部分との間に形成され得る。同様に、この結合対の遊離アミノ基またはチオール基を使用して、エポキシ基を有するプローブ表面にこの対を共有結合し得る。強力な配位または与格の結合が、結合対のスルフヒドリル基とプローブ表面の金または白金との間に形成され得る。
【０２７２】
必要に応じて、次いで、このプローブ表面上の残りの反応部位がブロックされ、活性化されたプローブ表面への非特異的な結合を低減し得る。
【０２７３】
次いで、第２の（遊離）結合対は、親和性捕捉チップに接触され、そして第１の（固定化）結合対への結合を可能にする。
【０２７４】
この第２の（遊離）結合対は、既知であり、利用可能である場合、溶液中で純粋に存在し得、またはより代表的に、不均一の混合物（例えば、この第２の結合対を含むと疑われている生物学的サンプル）から捕捉される。この生物学的サンプルは、上記のバイオマーカーディスカバリーアプローチとして、生物学的流体（例えば、血液、血清、血漿、リンパ、間質性流体、尿、または浸出液）が、細胞溶解物、細胞分泌物であり得るか、またはそれらの部分的にフラクション化された部分および精製された部分であり得る。
【０２７５】
次いで、このプローブは、明確な溶出特徴を有する１種以上の溶出物を用いて洗浄される。これらの洗浄は、このプローブに非特異的に結合する種の数を低減させるのに役立つ。
【０２７６】
次いで、エネルギー吸収分子が、代表的に液相中に適用され、そして乾燥され得る。エネルギー吸収分子の適用は、親和性捕捉プローブの使用を除いて同様の様式で実施され、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）Ａｒｒａｙｓ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した場合、エネルギー吸収分子は、製造者の説明書に従って適用される。
【０２７７】
親和性捕捉プローブに非共有結合する種（例えば、第１（固定化）結合パートナーに特異的に結合する第２の結合対、プローブ表面に非特異的に結合する分子、第１の結合対に非特異的に結合する分子）は、次いで、レーザー脱離イオン化質量分析の第１の相で検出される。
【０２７８】
この質量分析計は、単一段階の親和性捕捉ＬＤＩ−ＭＳデバイス（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．からのＰＢＳ ＩＩ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ ＵＳＡ））であり得る。しかし、本発明の親和性捕捉タンデムＭＳは、より高度な質量の正確性およびより高度な質量の分解能を提供し、そして好まれる。
【０２７９】
代表的に、第２の（遊離）結合対は、より初期の研究から既知であり、そしてこの存在または非存在は、質量分析によって容易に確認可能である。この第２の（遊離）結合対は知られておらず、プローブに結合する種の各々は、次に調査され得る。検出可能な種の数が非常に多すぎる場合、この親和性捕捉プローブは異なる溶出特性（代表的に、増加したストリンジェンシー）を有する溶出液で洗浄され、分析のために提供される種の数を減少させる。
【０２８０】
一旦、第１の（固定された）結合パートナーへの第２の（「遊離」）結合パートナーの結合が確認されると、この第２の結合パートナーは、断片化される。これは、代表的に、この第２の結合パートナー（これは、この時点では、第１の結合パートナーに、非共有結合的であるが、特異的に結合され、次いで、プローブ表面上に固定される）を、特異的エンドプロテアーゼ（例えば、トリプシン、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｖ８）プロテアーゼ、エンドプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ（セリンプロテアーゼＡｒｇ−Ｃ酵素もしくはシステインプロテアーゼのＡｒｇ−Ｃ酵素のいずれか）、Ａｓｎ−Ｎプロテアーゼ、またはＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ）と接触させることによって、達成される。
【０２８１】
消化後、ペプチドは、質量分光法によって検出される。
【０２８２】
第２の結合パートナーの全てのフラグメントが、同一である場合、例えば、ペプチド質量フィンガープリント分析により第２の結合パートナーの正体を確認するために、エネルギー吸収分子が用いられ、そしてプローブは、レーザー脱離イオン化による質量分光法にペプチドを導入するために、使用される。この目的のために、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＰＢＳ ＩＩ単一加速ステージ線形ＴＯＦ ＭＳが、使用され得る；本発明のタンデムＭＳ（これは、優れた質量精度および質量分解能を提供する）が、好ましい。なぜなら、増加した分解能および精度は、任意の所定のデータベースの問い合わせにおける任意の所定の信頼度レベルにおいて戻される推定「ヒット」の数を減少させるからである。
【０２８３】
しかし、より代表的には、固定された第１の結合パートナーに最も密接に結合する第２の結合パートナーのフラグメントを分析することが望ましい。このような場合において、プローブは、エネルギー吸収分子の添加の前に、１つ以上の溶離液で洗浄される。
【０２８４】
この時点において、プローブは、本発明のタンデムＭＳのインターフェースに挿入され、そして第２の結合パートナーのフラグメント（代表的には、ペプチド）が、検出される。
【０２８５】
第２（遊離）の結合パートナーの正体が、既知である場合、検出されたフラグメントの質量は、断片化酵素の既知の切断法則を第２の結合パートナーの一次アミノ酸配列に適用することによって予測される質量と比較され得る。この様式において、各フラグメントが同定され、従って、第２の結合パートナーの構造内に、第１の結合パートナーへの結合を担う部分が配置され得る。
【０２８６】
理論上は、単一ステージＭＳデバイスが使用され得るが、実際には、第２の結合パートナーから生じるフラグメント以外のフラグメントが存在し、このような分析を混乱させる。従って、通常の場合における最終的な同定は、本発明の機器の高い質量分解能および質量精度から恩恵を受け、さらに頻繁には、ｍｓ／ｍｓ分析から恩恵を受ける。
【０２８７】
第２（遊離）の結合パートナーが、既知ではない場合、このパートナーは、ｍｓ／ｍｓ分析により同定され得る。
【０２８８】
代表的には、このような分析は、ＭＳの第１段階における第１の親ペプチドの選択、この選択されたペプチドの断片化、次いでＭＳ分析の第２段階におけるフラグメントの質量スペクトルの生成の形態をとる。断片化は、好ましくは、衝突誘起解離によって、気相で行われる。本発明の親和性捕捉タンデム質量分光計の好ましい実施形態において、ＣＩＤは、約１０−２Ｔｏｒｒの窒素ガスの衝突によって、ｑ２において影響を受ける。
【０２８９】
次いで、フラグメントのスペクトルは、公知のアルゴリズム（例えば、Ｙａｔｅｓら、米国特許第５，５３８，８９７号および同第６，０１７，６９３号に開示されるアルゴリズム、およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ ＭＳ−ＴＡＧ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ／ｅｄｕ）モジュールにおいて用いられるアルゴリズム］を使用して、配列データベースを問い合わせするために、使用される。
【０２９０】
推定同定は、第２の親ペプチドを選択し、そしてこのアプローチを繰り返して、必要に応じて、全てのペプチドが同定可能な親由来であることを確認することによって、さらに確証され得る。
【０２９１】
その後、一旦、第２の結合パートナーが同定されると、分子間相互作用の性質が、上記のようにして研究され得る。断片化酵素（または化学的、例えば、ＣＮＢｒ）の既知の切断法則が、現在同定されている第２の結合パートナーの一次配列、および理論的消化に対してマッピングされた経験的に測定されたペプチドに適用され、従って、固定された第１の結合パートナーに結合するペプチドが同定され、従って、ネイティブの分子において、固定された第１の結合パートナーへの結合に寄与するペプチドが同定される。また上記のように、最も密接に結合するペプチドを同定するために、洗浄のストリンジェンシーを増加させながら、この実験が繰り返され得る。
【０２９２】
他の摂動が、細胞間結合の性質をさらに解明するために、行われ得る。
【０２９３】
第２の結合パートナーの断片化後のプローブを洗浄するための溶出液の溶出特性は、その相互作用に最も強く寄与するフラグメントを同定するため、または結合に寄与するｐＨ依存性または塩依存性接触を同定するために、変更され得る。
【０２９４】
洗浄の増加したストリンジェンシー（例えば、増加した塩濃度、より高い温度）を用いると、固定された第１の結合パートナーにそれほど密接に結合していないフラグメントは、この第１の結合パートナーから溶出されるという原理は、もちろん、クロマトグラフィーの分野および分子生物学の分野において周知である。本発明の構成において、このような不十分に結合しているフラグメントは、プローブから溶出され、そして続く質量分光分析から失われる。従って、プローブまたは同一の対応プローブが、増加するストリンジェンシーで洗浄される一連の実験が行われ、従って、第２の結合パートナーのフラグメントの段階的なシリーズのサブセットが作製され得、ここで、各連続的なサブセットは、より密接に結合しているフラグメントのより小さいサブセットを有する。
【０２９５】
上記のように、第１の（固定された）結合パートナーおよび第２（遊離）の結合パートナーは、相互交換され得、他のパートナーの結合定数が解明され得る。
【０２９６】
さらに有用な摂動は、これらの結合パートナーの１つまたは両方における翻訳後修飾の除去または変更である。例えば、第１の結合パートナーが、糖タンパク質である場合、第２の結合パートナーの結合の前および／または後の１つ以上の特異的または非特異的グリコシダーゼでの処理は、糖残基の結合への寄与を解明するのを助ける。
【０２９７】
同様に、これらの結合パートナーの一方が核酸である場合、他方の結合パートナーの結合の後のヌクレアーゼでの核酸結合パートナーの処理は、重要な結合残基を同定するのを助け得る。
【０２９８】
分子間相互作用の特徴付けに対する上記のアプローチは、従来技術のマルチプラットホームの、労働集約的な非感受性の技術を、単一プラットフォームの、ストリームライン化された高感度のアプローチに置き換える。このアプローチは、広範な異なる生物学的システムおよび問題に適用可能である。
【０２９９】
上で示唆されるように、本発明の方法は、エピトープマッピングのため、すなわち、抗体、Ｔ細胞レセプター、またはＭＨＣへの結合に寄与する抗原内の接触を同定するために、使用され得る。この方法は、生物学的リガンドのそれらのレセプターへの結合の性質、転写因子の核酸への結合の性質、および多タンパク質複合体における転写因子に対する他の転写因子への結合の性質を解明するために、使用され得る。
【０３００】
タンパク質／タンパク質相互作用に関して上記で特に考察されたが、本発明の方法は、レクチンと糖タンパク質との間、タンパク質と核酸との間、および低分子とレセプターとの間の結合相互作用を解明するために、実施され得る。
【０３０１】
特に、低分子リガンドに関して、この方法はまた、既知のレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストの設計に適用され得る。
【０３０２】
過去十年間にわたって、多数の低分子を組み替え生成するため、および種々の均質アッセイおよび生存細胞アッセイにおいて、このような分子を、１つ以上の生物学的プロセスに影響を与えるそれらの能力についてスクリーニングするための技術が、開発された。例えば、均質シンチレーション近接アッセイを使用して、既知のレセプターへの結合について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングし得；デジタル画像ベースの細胞アッセイを使用して、コンビナトリアルライブラリー由来の化合物を、下流効果（例えば、レセプターの細胞質／核輸送、細胞内カルシウム分布の変化、または細胞運動性の変化）についてスクリーニングし得る。
【０３０３】
しかし、一旦、このようなリード化合物が同定されると、低分子とそのレセプターとの相互作用の詳細な理解は、改良された薬物動態学および治療指数を有する分子のインテリジェント設計を容易にする。本発明の技術は、このような使用のために充分に適切である。
【０３０４】
この低分子が、エネルギー吸収分子により提供されるシグナル付近にシグナルを提供する場合、ＭＳは、コンビナトリアルライブラリー成分の既知の質量についてのみ調べる単一のイオンモニタリングで実施される。
【０３０５】
（Ｃ．タンパク質分解性フラグメント混合物由来の改善された配列の適用範囲）
しばしば、質量分光法によって同定または配列決定されることが望まれるタンパク質は、他のタンパク質との混合物中に存在する。ゲルベースまたは液体のクロマトグラフィーアプローチにより最初に濃縮されるタンパク質でさえ、ＭＳ分析の前に均一にまで精製されることは、ほとんどない。例えば、２次元ＰＡＧＥゲル上に単一のスポットであることが目で見えるものは、類似の荷電および質量特性に起因して、同じゲル配置に同時移動する１０個以上の異なるタンパク質種を含み得る。
【０３０６】
このような同定が、例えば、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析計により得られる質量を使用するペプチドマッピングによって行われるか、または例えば、液体クロマトグラフィー−質量分光法（ＬＣ−ＭＳ）タンデム質量分光計により得られるタンデムＭＳスペクトルを使用するタンデムＭＳ配列決定によって行われるかにかかわらず、タンパク質の混合物は、質量分光法によるタンパク質の同定を複雑にする。
【０３０７】
１つの問題は、質量分光法によるタンパク質の同定が、このタンパク質の複数の切断産物が、サンプリングされ得、そしていくつかの切断産物からのスペクトルデータが関連する場合に、実質的に改善されるということである。言い換えると、同定は、集団配列の網羅範囲が増加するにつれて、改善する。
【０３０８】
例えば、データベースマイニング実験においてウシフェチュインの実質的なトリプシン消化を使用した場合、１．０ｐｐｍの精度（ほとんどのＭＳ技術では現在達成不可能なレベル）を用いた場合であっても、この複雑な真核生物ゲノムを検索する場合、不十分な信頼度のタンパク質ＩＤの一致が、単一のペプチド質量のみを使用して、達成されることが示された。２つのペプチドについて、同様に、低い信頼度結果が、達成される。３つのペプチドが提示された後にのみ、３００ｐｐｍ未満の誤差の質量アサイメントについて、信頼性のある結果が戻される。５つ以上のペプチドを用いた場合、１０００ｐｐｍより良好な誤差の質量精度を有するさらなる信頼度はもたらされない。Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：１１６４−１１６７（２０００）。
【０３０９】
しかし、タンパク質が、混合物中に存在する場合、３個、または４個または５個の切断産物を、同じタンパク質由来であると信頼性高く同定することが困難なことが明らかにされ得、従って、タンパク質の同定の試みを複雑にする。
【０３１０】
タンパク質混合物により生じる問題に対する１つの解決法は、ＭＳ分析の前に、さらなるオフライン精製を実施することである。代表的に、このような精製は、カラムベースのアプローチを使用して達成される；しかし、このアプローチは、カラム上、分離媒体上ののサンプルの保持に起因して、および／またはサンプルの沈殿に起因して、サンプルの損失を生じ得る。
【０３１１】
本発明の１つの局面として上に記載される別の解決法は、プローブ自体の上でタンパク質混合物を切断する前に、親和性捕捉プローブ上でタンパク質混合物を単純化することである。
【０３１２】
しかし、時折、このタンパク質混合物は、質量分光分析が完了する時点で、すでに切断されている。例えば、溶出および続く分析の前に、２−Ｄゲル上を共移動する（すなわち、これは単一スポットとして検出可能である）タンパク質を消化することは、珍しいことではない。
【０３１３】
他の場合において、タンパク質切断は、先に行う精製工程（例えば、ゲルからの溶出）の必要な付随物ではあり得ないが、それにも関わらず、親和性捕捉プローブへの吸着の前であることが所望され得る。例えば、プローブ上切断が不十分であることが観測されるか、または不十分であることが予測される場合、吸着の前に、混合物中に存在するタンパク質を切断することが望まれ得る。
【０３１４】
タンパク質混合物について先に行われる切断は、分析の前に混合物の複雑性を増加することによって、さらなる問題を提示する。
【０３１５】
例えば、タンパク質の同定に対する標準的なマトリクス支援レーザー脱離／イオン化ベースのアプローチは、イオンの競合およびクエンチ（抑制）効果によって、悪影響を受ける；これらの影響は、吸着されたペプチド混合物の全複雑性に直接関連する。
【０３１６】
例えば、図８Ａは、逆相ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）に吸着されたＩｇＧのトリプリン消化により得られた質量スペクトルを示す。容易に見られ得るように、より低分子量のペプチドが優性である；数個のペプチドは、より低分子量の種からのイオン競合に起因して、より上のＭＷ範囲において見られる。以下の実施例２でさらに考察されるように、この検出可能なペプチドは、ＩｇＧ配列のわずか約６５％をふくむ；すなわち、このペプチドは集団として、わずか約６５％の配列の網羅範囲を提供する。
【０３１７】
さらに、ＭＡＬＤＩプローブに吸着される混合物の複雑性が、増大する場合、任意の１つのペプチドの相対量および絶対量の両方は、代表的に、減少する；これは、次いで、シグナル対ノイズ比を減少し、ＭＳ／ＭＳ分析から配列を取得する能力を低下させる。
【０３１８】
さらに、プローブ上のペプチドの量が、減少する場合、レーザー問い合わせにより生成される二重に荷電されたイオンの量もまた減少する；二重に荷電されたイオンは、ＭＳ／ＭＳ配列決定のために好ましいイオン種であるため、この量の減少は、ＭＳ／ＭＳ配列決定の試みを妨害する。
【０３１９】
従って、別の局面において、本発明は、タンパク質をその切断産物から同定するための方法を提供し、この切断産物は、他のタンパク質の切断産物との混合物中に存在する。この方法は、ＭＳによって検出され得る分析物のタンパク質分解性フラグメントの集団的配列網羅範囲を増加する。この増加された配列網羅範囲は、タンデムＭＳによるタンパク質の同定および配列決定を改善し得、この同定および配列決定は、本発明の分析デバイスを使用して有利に実施され得る。
【０３２０】
第１の実施形態において、タンパク質は、切断産物として、他のタンパク質の切断産物との混合物中にすでに存在する。この切断産物の混合物は、代表的に、タンパク質分解性因子を用いるのタンパク質混合物について先に行われる切断の結果である；このタンパク質混合物は、例えば、未精製の生物学的サンプル、２Ｄゲル中で共移動するタンパク質の混合物、または一般のクロマトグラフィー画分中で溶出するタンパク質の混合物であり得る。第２の実施形態において、この方法は、タンパク質分解性切断の前工程を包含する。両方の実施形態において、タンパク質分解性因子は、代表的に、既知の切断特異性を有するエンドプロテアーゼ（例えば、トリプシン）である。
【０３２１】
この混合物由来の複数の切断産物は、次いで、親和性捕捉プローブの少なくとも１つの吸着表面への吸着によって、捕捉される。この吸着表面は、クロマトグラフィーの吸着表面または生体分子親和性表面であり得る。プローブの吸着表面に吸着された複数の切断産物は、特徴付けされることが望まれるタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を含む。
【０３２２】
もとの混合物の複雑性、タンパク質分解性因子による切断の頻度、ならびに吸着の間の吸着表面の性質および物理的状態（例えば、温度およびイオン強度）の性質に依存して、プローブに吸着される切断産物の混合物は、種々の程度の複雑性を有し得る。
【０３２３】
次いで、このプローブは、第１の溶出液で、少なくとも１回洗浄される。このプローブは、複数の吸着されたタンパク質分解産物の複雑性を減少するのに充分な時間および充分な条件下で、洗浄され、この減少した複雑性を有する吸着された切断産物は、分析されることが望まれるタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を含む。従って、この洗浄は、吸着された混合物の複雑性の減少、およびプローブに吸着されたままのタンパク質切断産物中のタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物の相対濃度の増加を同時に行うように働き得る。
【０３２４】
必要に応じて、このプローブは、複数の吸着されたタンパク質切断産物の複雑性をさらに減少するのに充分な時間および条件下で、少なくとも１回、第２の溶出液で洗浄され得、この第２の溶出液は、上記第１の溶出液の溶出特性とは異なる少なくとも１つの溶出特性を有し、このさらに減少された複雑性の吸着された切断産物は、分析されることが望まれるタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を含む。
【０３２５】
その後、エネルギー吸収分子が適用され、このプローブが問い合わされ、そしてタンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物が、タンデム質量分光法により特徴付けられる。この問い合わせおよび特徴付けは、レーザー脱離イオン化供給源、プローブインターフェイスおよびタンデム質量分光計を有する分析デバイスで行われる。
【０３２６】
代表的には、タンデムＭＳ測定は、以下を包含する：（ｉ）プローブに吸着されるタンパク質切断産物を脱着およびイオン化して、対応する親ペプチドイオンを生成する工程；（ｉｉ）質量分析の第１の相において、所望の親ペプチドイオンを選択する工程；（ｉｉｉ）気体相中の選択した親ペプチドイオンを、フラグメントイオンへとフラグメント化する工程；および、次いで、（ｉｖ）質量分析の第２の相において、選択した親ペプチドイオンのフラグメントイオンの質量スペクトルを測定する工程。気体相フラグメント化は、通常、衝突解離（ＣＩＤ）によりもたらされる。図１および図２に示した本発明の分析装置の実施形態では、このようなＣＩＤは、ｑ２でもたらされる。
【０３２７】
次いで、フラグメントスペクトルは、タンパク質同定に用いられ得る。
【０３２８】
タンパク質同定の１つのアプローチでは、フラグメントスペクトルは、選択した親ペプチドイオンのアミノ酸配列の少なくとも一部を決定するために用いられる。配列決定は、例えば、十分に確立されたアルゴリズムに従って、フラグメントイオン質量スペクトルにおいて表示される特定のフラグメントシリーズのフラグメントイオン間の質量の差異を計算し、そしてこの質量の差異を、アミノ酸の既知の質量と相関させることにより実行され得る。
【０３２９】
次いで、部分配列は、頻繁に、親ペプチドイオンの質量と共に、そして、必要に応じて、タンパク質起源の属および種と共に、タンパク質配列データベースを問い合わせる（ｑｕｅｒｙ）ために用いられる。この問い合わせ（ｑｕｅｒｙ）は、代表的には、少なくとも１つのタンパク質の正体の候補の回帰を生じるパラメーターを用いて実行され、予想したタンパク質配列と、データベースに事前に登録された配列との間で計算される、一致の密接さ（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ ｏｆ ｆｉｔ）に基づいて同定される。このデータベースは、実験的なタンパク質配列、核酸配列から予想したタンパク質配列、または問い合わせの実行の間に翻訳される核酸配列を含み得る。
【０３３０】
次いで、タンパク質の正体の候補は、検証され得る；すなわち、配列データベースの問い合わせにより回帰される正体の候補が、混合物から同定されることが望ましいタンパク質分析物と同じである可能性が、次いで、評価され得る。
【０３３１】
正体の候補が、タンパク質分析物と同じであるという可能性を評価するために、選択した親ペプチドイオンについて測定した（非フラグメント化）質量は、切断産物について予想した質量に匹敵する。この切断産物は、タンパク質分解因子を用いて、タンパク質の正体の候補を切断することにより生成される。このタンパク質分解因子は、プローブへの吸着の前に、タンパク質混合物中のタンパク質を切断するために、最初に用いられる。予想した質量の１つと、測定した親ペプチドイオン質量との間の一致は、正体の候補が、タンパク質分析物と同じである可能性の増大を示す。
【０３３２】
測定した親ペプチド質量が、タンパク質の正体の候補のインシリコ切断により予想した質量と一致する場合、推定の同定のさらなる検証が、初めから選択およびフラグメント化されていた切断産物以外の、プローブから脱着した切断産物（すなわち、親ペプチドイオン）について測定した質量に対して、予想した質量を比較することにより、実行され得る。予想した質量と測定した質量との間のさらなる一致は、正体の候補が、タンパク質分析物と同じである可能性の増大を示す。
【０３３３】
反対に、測定した質量が、予想した質量と一致しない場合（このことは、データベース検索において同定した候補が、間違っていることを示唆する）、プローブは、さらに１回、問い合わせされ得、引き続いてのフラグメント化、フラグメント質量分析、およびデータベースマイニング（ｍｉｎｉｎｇ）についての質量分析の第１の相において、異なる親ペプチドイオンを選択する。
【０３３４】
タンパク質同定のための別のアプローチ（これは、第１のアプローチに追加してまたは代替として用いられ得る）において、フラグメントスペクトルが、初めに部分配列を確立することなく、直接用いられて、タンパク質の正体の候補の少なくとも１つを決定する。
【０３３５】
この後者のアプローチでは、正体の候補は、実験的に測定したフラグメントイオン質量スペクトルと、配列データベースに事前に登録された配列から予想される質量スペクトルとの間の一致の密接さに基づいて、配列データベースから選択される。このような予想したスペクトルは、比較の間に生成されるか、予想した質量スペクトルの派生データベースにおいて、事前に計算されそして保存されているかのいずれかである。次いで、データベース中のタンパク質は、実験的フラグメント質量スペクトルに対する一致の密接さに基づいて、順位付けされ得る。このようなプロトコルをもたらすアルゴリズムは、当該分野で公知である。例えば、Ｙａｔｅｓら、米国特許第５，５３８，８９７号、および同第６，０１７，６９３号（これらの開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０３３６】
第１のアプローチの場合、親ペプチドおよび／またはタンパク質分析物の質量（必要に応じて、タンパク質起源の種についての情報）は、タンパク質の正体の候補が選択される信頼性を助長しかつ改善するために、データベース問い合わせにおいて用いられ得る。例えば、タンパク質起源の分類学的種は、予想した質量スペクトルが計算されなければならない配列の数を減少させるためのフィルターとして用いられ得る。
【０３３７】
第１のアプローチの場合、正体の候補がタンパク質分析物と同じである可能性は、有効に評価される。このような評価において、選択した親ペプチドイオンについて測定された（非フラグメント化）質量は、切断産物について予想した質量と比較される。この切断産物は、タンパク質の正体の候補をタンパク質分解因子で切断することにより生成される。このタンパク質分解因子は、プローブへの吸着の前に、タンパク質混合物中のタンパク質を切断するために、最初に用いられる。予想した質量の１つと、測定した親ペプチドイオン質量との間の一致は、正体の候補が、タンパク質分析物と同じである可能性の増大を示す。
【０３３８】
測定した親ペプチド質量が、タンパク質の正体の候補のインシリコ切断により予想した質量と一致する場合、推定の同定のさらなる検証が、選択およびフラグメント化されていた切断産物以外の、プローブから脱着した切断産物について測定した質量に対して、予想した質量を比較することにより、実行され得る。予想した質量と測定した質量との間のさらなる一致は、正体の候補が、タンパク質分析物と同じである可能性の増大を示す。
【０３３９】
反対に、測定した質量が、予想した質量と一致しない場合（このことは、データベース検索において同定した候補が、間違っていることを示唆する）、プローブは、さらに１回、問い合わせされ得、引き続いてのフラグメント化、フラグメント質量分析、およびデータベースマイニング（ｍｉｎｉｎｇ）についての質量分析の第１の相において、異なる親ペプチドイオンを選択する。
【０３４０】
本発明の方法は、本発明の任意の分析装置（この装置は、レーザーデソープションイオン化源、親和性捕捉プローブインターフェース（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒｏｂｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、およびタンデム質量分析計を備える）において実行され得る。特に、タンデム質量分析計は、ＱｑＴＯＦ質量分析計、イオントラップ質量分析計、イオントラップ飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計、飛行時間型−飛行時間型（ＴＯＦ−ＴＯＦ）質量分析計、およびフーリエ変換型イオンサイクロトロン共鳴質量分析計からなる群から有効に選択され得る。現在、ＱｑＴＯＦ ＭＳが、特定の利点を提供している。
【０３４１】
タンパク質の同定が、困難または不確実であると判明する場合、手順の全体は、異なるタンパク質分解因子および／または異なる吸着表面を有する異なる親和性捕捉プローブを用いて、タンパク質混合物の別のアリコートに対して繰り返され得る。
【０３４２】
そして、一旦同定されると、タンパク質分析物は、タンデム質量分析の前に分析物切断産物の実質的な精製をもたらすように特に選択された、親和性捕捉プローブを用いて、さらなるタンパク質混合物中で優位に同定され得る。このような特に選択された親和性捕捉プローブは、特異的な結合を介してタンパク質分析物を捕捉するのに特に適合された、少なくとも１つの生体分子親和性表面を有効に含む。例えば、このような生体分子親和性表面は、タンパク質分析物の切断産物の１つ以上に特異的な、抗体または抗原結合抗体フラグメントもしくは誘導体を有し得、そして、望ましくは、１０−６Ｍのオーダー、より望ましくは、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、および１０−９以上のオーダーの親和性を有する、このような特異的な結合をもたらし得る。
【０３４３】
２Ｄゲルから溶出したタンパク質切断産物の混合物について特に記載したが、このタンパク質混合物は、血液、血液画分、リンパ、尿、脳脊髄液、滑液、乳汁、唾液、硝子体液、房水、粘液および精液のような体液を含む、任意の生物学的サンプルに由来し得る。生物学的サンプルは、細胞溶解物と同等であり得る。本発明の方法は、数マイクロリットルのサンプルのみを必要とし、そしてマイクロリットルレベル未満のサンプルを用いて成し遂げられ得る。なぜならば、液相クロマトグラフ精製により引き起こされるような、非特異的損失は、未然に防がれるからである。
【０３４４】
（Ｄ．同定および検出のためのタンパク質分解増幅（「ＰＡＩＤ」））
別の局面では、本発明は、タンパク質の同定および検出のための方法を提供し、ここで、吸着表面に保持されるタンパク質と相関するタンパク質フラグメントは、質量分析によって直接検出することが困難であるタンパク質についてのアッセイにおけるマーカーとして用いられる。
【０３４５】
タンパク質は、多くの理由のため、質量分析により検出することが困難であり得る。例えば、あるタンパク質は、複合体混合物内に存在する他のタンパク質と比較した場合、マトリクス結晶へのこれらのタンパク質の組込みにおいて問題を生じ得る、修飾または一次の性状を保有する。あるタンパク質は、複合体混合物内に見出される他のタンパク質と比較した場合、イオン化することがより困難である。さらに、大きなタンパク質は、一般的に、小さなタンパク質よりも検出することが困難である。なぜならば、大きなタンパク質は、イオン検出表面において、電子へとあまり有効に変換されないからである。
【０３４６】
頻繁に、存在する異なるタンパク質の数に関して、サンプルがより複雑になれば、サンプル内の任意の特定のタンパク質を検出することはより困難になる。サンプル内に存在する全てのタンパク質の１０％未満を構成するタンパク質は、頻繁に、検出することが困難である。従って、これらのタンパク質の検出を改善する方法は望ましい。
【０３４７】
従って、別の局面では、本発明は、タンパク質（特に、質量分析により検出することが困難であるタンパク質）を検出するための方法を提供する。この方法は、標的タンパク質のタンパク質フラグメントの使用を包含し、このフラグメントは、標的タンパク質についてのタンパク質フラグメントマーカーとして、タンデムＭＳにより同定される。この方法は、単一のＭＳにより標的タンパク質を検出するのに特に有用である。
【０３４８】
標的タンパク質は、一般的に、単一のＭＳによる検出が困難である公知のタンパク質である。この方法に有用であるタンパク質フラグメントマーカーを同定するために、標的タンパク質は、親和性捕捉プローブに捕捉される。
【０３４９】
好ましくは、親和性捕捉プローブは、サンプルの液体から標的タンパク質を特異的に捕捉する生体分子親和性表面（例えば、抗体）を備える。これは分析を非常に単純化する。なぜならば、標的タンパク質の純粋または実質的に純粋なサンプルが捕捉される場合、生成されるタンパク質フラグメントの全てまたは殆どは、標的タンパク質に対応するからである。しかし、クロマトグラフ吸着表面を有する親和性捕捉プローブもまた、これらが分析物を保持する限り、有用である。
【０３５０】
生体分子親和性表面に付着しようと、クロマトグラフ表面に吸着しようと、捕捉したタンパク質は、再現可能なフラグメント化方法により、フラグメント化される。再現可能なフラグメント化方法とは、標的タンパク質の引き続いてのサンプルに適用した場合に、同じフラグメントを生成する、任意の方法を意図する。このような方法は、酵素的または化学的であり得る。
【０３５１】
好ましい実施形態では、標的タンパク質は、特定のアミノ酸配列で再現可能に切断する、１つ以上のタンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、クロストリパン、キモトリプシンまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテアーゼ、パパイン、サーモリシン、ペプシン、サブチリシン、およびプロナーゼ）によりフラグメント化される。あるいは、フラグメント化は、特異的に切断する化学薬品を用いる処理によりもたらされ得る。特異的切断を生じる化学薬品の例としては、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、Ｏ−ロドソベンゾエート（Ｏ−ｌｏｄｏｓｏｂｅｎｘｏａｔｅ）、ヒドロキシルアミン、および２−ニトロ−５−チオシアノベンゾエート、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、または高濃度無機酸溶液が挙げられる。
【０３５２】
フラグメント化は、「チップ上」または溶液中で実施され得る。
【０３５３】
次いで、得られたタンパク質フラグメントは、タンデムＭＳにより分析されて、標的タンパク質に対応するフラグメントを同定する。
【０３５４】
代表的には、このような分析は、ＭＳの第１の相における、タンパク質フラグメントの１つのイオン（親ペプチドイオン）の選択、気体相における親ペプチドイオンの（例えば、衝突解離による）フラグメント化、および質量分析の第２の相におけるフラグメントイオンスペクトルの生成により、進行する。
【０３５５】
次いで、フラグメントイオンスペクトルは、親ペプチドイオンの配列を決定するために用いられ得る。本明細書中の他の箇所で議論されるように（この議論は本明細書中で参考として援用される）、このような配列決定は、新規の配列決定、部分配列を用いるデータベースマイニング、部分配列および親ペプチドイオン質量を用いるデータベースマイニング、ならびに配列データベースからアルゴリズムにより生成される理論的スペクトルに対するフラグメントイオンスペクトルの一致の密接さを用いるデータベースマイニングを含む、当該分野で公知の方法のいずれかまたは全てにより実施され得る。標的タンパク質の正体は代表的には公知であるので、このような技術は、選択したフラグメントが標的タンパク質に由来するか否か、従って、標的タンパク質について適切なフラグメントマーカーであるか否かを容易に同定する。
【０３５６】
タンデムＭＳ手順は、親和性捕捉プローブから脱着およびイオン化され得る各フラグメントについて、有効に繰り返され得る。この方法は、頻繁に、標的タンパク質と相関し得る、複数のフラグメントマーカーを生じ、そしてこれらのマーカーは、引き続いての標的タンパク質検出アッセイにおいて、複合体混合物内の標的タンパク質を検出するための代理マーカーとして、この方法において用いられ得る。引き続いてのアッセイに用いられるフラグメントの数は、標的タンパク質を同定するために、明らかに十分であるべきである。殆どの場合、１つの単一のペプチドマーカーで十分である。
【０３５７】
一旦、タンパク質フラグメントマーカーが同定されると、試験サンプル内の標的タンパク質についてのアッセイは、以下のように実施される。
【０３５８】
試験サンプルは、標的タンパク質を捕捉することが公知である、親和性捕捉チップの表面に曝露される。好ましくは、これは、タンパク質を捕捉するために用いられた吸着表面（ここからタンパク質フラグメントマーカーが、上記の方法において生成された）と同じ型である。サンプル内のタンパク質はチップ上で平衡化され、そして、一般的に、洗浄が適用され、その結果、少なくともこの標的タンパク質は保持され、そして他のタンパク質は洗い流される。これは、サンプルの複雑性を単純化する。次いで、捕捉したタンパク質は、標的タンパク質由来のタンパク質フラグメントマーカーを生成する方法によるフラグメント化に供される。
【０３５９】
チップ表面上のフラグメント化タンパク質は、ここで、質量分析により分析される。この場合、質量分析は、タンデムＭＳである必要はない。なぜならば、この工程の目的は、タンパク質フラグメントマーカーを検出することであるからである。サンプル内のタンパク質フラグメントマーカーの検出は、サンプルにおける標的タンパク質の検出を示す。好ましくは、１つの単一のタンパク質フラグメントマーカーが、標的タンパク質を同定するための代理物として用いられる。しかし、１つより多い標的フラグメントマーカーが共に用いられ得る。タンパク質フラグメントマーカーの検出は定量化され得、その結果、サンプル中の標的タンパク質の量が決定される。
【０３６０】
（Ｅ．迅速なタンパク質同定のための、差示的ペプチドディスプレイ（「ＱＰＩＤ」））
本発明の方法はまた、２つのサンプル間で差示的にディスプレイされた標的タンパク質の同定のために有用である。特に、本方法は、サンプルの質量スペクトルが共通にディスプレイされたタンパク質、および差示的にディスプレイされたタンパク質の両方をディスプレイする、複数のタンパク質を有するサンプルの試験において有用である。好ましくは、同定のために標的化されたタンパク質は、独特のものとして検出される（すなわち、１つのサンプル中に存在するが、他方のサンプル中には存在しない）。それほどは好ましくはないが、標的タンパク質のディスプレイは、２つのサンプルの間で定量的に異なり得る。後者の場合は、上記ほどは好ましくはない。なぜなら、（上記のように）サンプル中のタンパク質の消化の後、生成されたフラグメントを標的タンパク質と一致させることは、より困難だからである。
【０３６１】
本方法は、異なるタンパク質集団を含む２つのサンプルを用いて開始する。代表的には、サンプルは、実験的なサンプル、およびコントロールサンプルを含む。これらの方法において有用なサンプルの対の例は：健常な供給源由来のサンプル対、発病した供給源由来のサンプル（診断的バイオマーカーの発見に有用）、毒性の状態に供された動物またはモデル系由来のサンプル対、毒性でない状態に供された動物またはモデル系由来のサンプル（毒物学のバイオマーカーの発見に有用）、および、薬物の応答者由来のサンプル対、薬物の非応答者由来のサンプル（臨床の成層バイオマーカーの発見に有用）、である。
【０３６２】
好ましくは、サンプルは、表面増強レーザー脱離イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を介する、差異のマッピングによって（すなわち、タンパク質をバイオチップの吸着性表面に吸着し、そして吸着されたタンパク質を検出することによって）、プロファイル化される。好ましくは、このプロセスは、未結合タンパク質を、溶出剤を用いて洗い流す工程を、包含する。
なぜなら、この洗い流す工程は、サンプル中のタンパク質のクロマトグラフ分離、および複雑さの減少をもたらすからである。あるいは、サンプルが予め分画されている場合、サンプルを、吸着性表面にアプライして、吸着性表面において濃縮（例えば、乾燥まで）させ得る。上記ほどは好ましくはないが、サンプルがアプライされ、平衡に達した後、過剰な液体が除去され得る。サンプルのアプライの後、エネルギー吸収材料が、一般的にプローブ表面にアプライされ、そして、結合したタンパク質が、レーザー脱離／イオン化質量分析計によって検出される。２つのサンプルのスペクトルを比較（目視によるか、またはコンピュータによるかのいずれか）することによって、差示的にディスプレイされた標的タンパク質が、分子量に基づいて検出される。
【０３６３】
次に、各サンプルのアリコートを、タンパク質フラグメント化に供する。フラグメント化の方法は、酵素的であっても、化学的であってもよい。
【０３６４】
好ましくは、フラグメント化は、「チップ上」で行なわれる。フラグメント化は、溶液中で行われ得るが、これは、標的タンパク質の同定を複雑にし得る。なぜなら、多くのタンパク質フラグメントが生成されるからである。
【０３６５】
タンパク質フラグメント化のための多くの技術が、当該分野で公知である：タンパク質は、必要に応じて酵素的に、化学的に、または物理的にフラグメント化される。
【０３６６】
フラグメント化は、非特異的（すなわち、ランダム）、特異的（すなわち、所定のタンパク質の特定の部位のみにおいて）、または選択的（すなわち、優先的）であり得る。物理的フラグメント化方法、例えば、物理的せん断、熱切断などは、非特異的タンパク質フラグメント化を代表的に生じる。対照的に、酵素的フラグメント化法および化学的フラグメント化法は、サンプル中のタンパク質から、非特異的または特異的に切断されたペプチドフラグメントを生じ得る。化学的フラグメント化の１つの方法は、酸加水分解である。特異的切断を生じる化学剤の例としては、ブロモシアン（ＣＮＢｒ）、Ｏ−ロドソベンゾエート（ｌｏｄｏｓｏｂｅｎｘｏａｔｅ）、ヒドロキシルアミン、および２−ニトロ−５−チオシアノベンゾエート、トリフルオロ酢酸、ペンタフルオロプロピオン酸、または高濃度の鉱酸溶液が挙げられる。
【０３６７】
好ましい実施形態において、サンプル中のタンパク質は、１つ以上のタンパク質分解性酵素によってフラグメント化される。本発明の方法における使用のために適切な例示的なプロテアーゼは、必要に応じて、例えば、アミノペプチダーゼ、（ＥＣ ３．４．１１）、ジペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１３）、ジペプチジル−ペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１４）、ペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１５）、セリン型カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１８）、オメガペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１９）、セリンプロテイナーゼ（ＥＣ ３．４．２１）、システインプロテイナーゼ（ＥＣ ３．４．２２）、アスパラギン酸プロテイナーゼ（ＥＣ ３．４．２３）、メタロプロテイナーゼ （３．４．２４）、未知のメカニズムのプロテイナーゼ（ＥＣ ３．４．９９）などから選択される。より具体的には、酵素は、トリプシン、クロストリパイン（ｃｌｏｓｔｒｉｐａｉｎ）、キモトリプシン、またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテアーゼ、パパイン、サーモリシン、ペプシン、サブチリシン、およびプロナーゼであり得る。
【０３６８】
サンプル中のタンパク質が、複数のポリペプチド鎖を含む場合、および／またはジスルフィド結合を含む場合、さらなるプロセシングが、必要に応じて利用される。例えば、タンパク質が、非共有結合（例えば、静電的相互作用など）によって共に保持される複数のポリペプチド鎖を含む場合、変性剤（例えば、尿素またはグアニジン塩酸）を使用して、フラグメント化の前に、ポリペプチド鎖をお互いに解離させ得る。タンパク質がジスルフィド結合を含む場合（例えば、単一のポリペプチド鎖内、および／または別個のポリペプチド鎖間）、ジスルフィド結合は、必要に応じて、チオール（例えば、ジチオスレイトール、 −メルカプトエタノールなど）を用いる還元によって切断される。還元後、ジスルフィド結合由来のシステイン残基は、必要に応じて、例えば、ヨード酢酸を用いて、アルキル化され、Ｓ−カルボキシメチル誘導体を形成して、ジスルフィド結合が再形成されるのを防ぐ。
【０３６９】
好ましい実施形態において、フラグメント化は、限定的な、酵素的消化または化学的消化によって進む。本発明の文脈において、限定的な、酵素的消化または化学的消化とは、５以下の、好ましくは、２以下のフラグメントを意味する。限定的タンパク質分解性アプローチは、３つの主な利点を有する：タンパク質の同定（ＩＤ）時間の減少、タンパク質のＩＤ感度の増加、および、最終的に、混合物から複数のタンパク質を同定することを可能にすること。
【０３７０】
ほとんどの捕捉実験において、１つより多いタンパク質が、親和性プローブ表面に捕捉される。従来の酵素的消化が、表面上において行われた場合、各タンパク質は、複数のペプチドを生じる。複数のタンパク質由来であるペプチドマップは、複数のタンパク質同定のためのデータマイニングを複雑にする。次に、各ペプチドのＭＳ／ＭＳ分析は、データマイニングおよびタンパク質同定を可能にするイオンを生成する。
【０３７１】
このストラテジーを用いると、混合物から、各々の個々のタンパク質を単離・精製するために、さらなる精製工程は、必要ない。従って、このストラテジーは、タンパク質ＩＤ時間を減少し、そして感度を増加させる。また、必要な開始物質は、より少量である。なぜなら、たった１つの独特のペプチドが、タンパク質ＩＤに十分であり得るからである。さらに、攻撃的なタンパク質分解性アプローチが、用いられるので、本来、従来の酵素的消化に耐性であるタンパク質が、ここで分解される。最後に、このアプローチは、タンパク質の混合物からの複数のタンパク質ＩＤを可能にする。
【０３７２】
各サンプルから生成されたタンパク質フラグメントは、次に、質量分析計によって試験される。検出されたフラグメントを比較することによって、サンプル間の差異マップが生成され、標的タンパク質を含むサンプル中で差示的に検出されたタンパク質を同定する。少なくとも、いくつかの差示的にディスプレイされたタンパク質フラグメントは、差示的にディスプレイされた標的タンパク質のフラグメントを表さなければならない。
【０３７３】
次に、差示的にディスプレイされたタンパク質フラグメントの少なくとも１つの正体候補が、本明細書に記載されるタンデムＭＳ法を用いて決定される。次に、標的タンパク質が、正体候補と相関させられる。相関関係は、研究者に利用可能な任意の情報に基づき得る。しかし、情報の初期の項目は、タンパク質の分子量である。研究者は、任意の正体候補の予測された質量が、任意の翻訳後修飾前のタンパク質の質量を表すことを認識する。標的タンパク質が、正体候補の質量に対応する質量を有する場合、研究者は、研究者が標的タンパク質の正体を決定したことを、高度に確信し得る。標的タンパク質の質量が、正体候補の質量に対応しない場合、研究者は、他の情報にも依存しなければならない。標的タンパク質の質量は、正体候補の質量よりも、大きくても、小さくてもよい。
【０３７４】
標的タンパク質の質量が、正体候補の質量よりも大きい場合、正体候補の構造が調べれられ、候補タンパク質における翻訳後修飾（例えば、グリコシル化部位またはリン酸化部位）の可能性について決定し得る。いくつかのタンパク質データベースに注釈が付けられ、公知の修飾部位および修飾の代表的な形態についての情報を提供する。標的タンパク質を、疑われる翻訳後修飾について試験することによって、さらなる確信を得ることができる。例えば、標的タンパク質がグリコシル化されていることが疑われる場合、そのタンパク質を、グリコシダーゼに供して、消化されたタンパク質を調べて、その際の質量が、正体候補と一致するか否かについて決定し得る。
【０３７５】
さらに、正体候補の物理化学的特性を使用して、対として、確信を高め得る。例えば、標的タンパク質が、親水性バイオチップ表面に結合する場合、研究者は、正体候補もまた、標的タンパク質を捕捉するために使用した保持条件下で親水性特性を有すると予測されるか否かについて、質問をすることができる。
【０３７６】
正体候補の質量が、標的タンパク質の質量よりも大きい場合、このことは、より小さな標的タンパク質が、正体候補のフラグメント化産物であることを示唆する。この理論は、インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）において試験され得る。正体候補の一部であることが決定されたタンパク質フラグメント（単数または複数）のアミノ酸配列を知ることによって、正体候補のアミノ酸配列についての質問をして、これらのフラグメントを含む正体候補の任意の連続配列フラグメントが標的タンパク質の質量に対応するか否かについて、決定し得る。
【０３７７】
いずれの正体候補も、受容可能なレベルの確信（一般に、少なくとも９０％）をもって、標的タンパク質と相関付けられ得ないならば、標的タンパク質および産物のさらなる試験が是認される。上記のように、正体候補より生成された全てのフラグメントが、実質的にスペクトルから「除去」され得る。次に、別の残りのタンパク質フラグメントの正体が、決定され得、それによって、標的タンパク質についての別の正体候補が生成される。このプロセスは、必要なレベルの確信を持って正体候補が同定されるまで、反復され得る。
【０３７８】
以下の実施例は、説明の目的のみのために提供され、決して限定のためではない。
【実施例】
【０３７９】
（実施例１：前立腺癌バイオマーカーのタンデムＭＳ同定）
伝統的に、前立腺ガン腫は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の上昇した血中レベルの発見後、生検によって診断される。通常の男性において、ＰＳＡは、１ｎｇ／ｍｌ未満のレベルで存在する。ＢＰＨおよび前立腺ガン腫の両方について、ＰＳＡレベルは、４〜１０ｎｇ／ｍｌまで上昇し得る（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌｏｇｙ １５７：２１６６−２１７０（１９９７）；Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：３５２−３５９（１９９７））。ＰＳＡは、キモトリプシン活性（チロシンおよびロイシンのＣ末端で切断する）を有することが公知である（Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：３５２−３５９（１９９７））。
【０３８０】
ＢＰＨであると診断された患者由来の精漿、ならびに前立腺ガン腫であると診断された患者由来の精漿を、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）差示的ディスプレイの技術を用いて分析した。図３は、１人のＢＰＨおよび前立腺ガン腫患者の精液タンパク質のプロファイルを示す。仮想的なゲルディスプレイを使用して、サンプル間の視覚的な比較を増強する。前立腺ガン腫からＢＰＨを引いたタンパク質プロファイルについての差異プロットが、ゲルの光景のプロットの下に表示される。差異プロットの正に置換されたシグナルは、前立腺ガン腫において上方制御されるタンパク質を示し、その一方、負のピークは、前立腺ガン腫での下方のタンパク質制御を示す。いくつかの独特に上方制御されたシグナル（可能性のある前立腺ガンバイオマーカーを示す）が検出された。
【０３８１】
これら上方制御されたタンパク質の１つのチップ上での単離が、混合された態様の表面および中性ｐＨ緩衝液洗浄を使用することによって、達成された（図４を参照のこと）。この場合、タンパク質は、ほぼ均質にまで富化された。富化されたバイオマーカー候補を、次に、トリプシンを用いるインサイチュ消化に曝露した。インキュベーションの後、飽和ＣＨＣＡ溶液（マトリクス）を添加し、そしてその後の消化産物を、表面増強レーザー脱離イオン化（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）飛行時間質量分析計によって分析した。
【０３８２】
いくつかのペプチドが、検出された（図５を参照のこと）。結果として生じるペプチドシグナルを、タンパク質データベース分析に供し、そしてヒトセメノゲリン（ｓｅｍｅｎｏｇｅｌｌｉｎ）Ｉの予備的な同定を行った。この同定は、幾分複雑である。なぜなら、候補バイオマーカーは、質量分析計によって約５７５１Ｄａの分子量を有し、セメノゲリンＩの分子量（分子量５２，１３１Ｄａ）よりもかなり小さいからである。
【０３８３】
同一の精製タンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ ＬＤＩ Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳ検出に供した（図６を参照のこと）。５７５１Ｄａでの親イオンは、ＬＤＩ Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳ分析の現在の質量限界（３０００Ｍ／ｚ）を超えたので、二重に荷電したイオンを、ＣＩＤ ＭＳ／ＭＳ配列決定に使用した（図７を参照のこと）。ＣＩＤ ＭＳ／ＭＳの結果を用いて、タンパク質データベースマイニングを行った。２６のｍｓ／ｍｓイオンのうち１５が、ヒト精液塩基性タンパク質（ＳＢＰ）であるセメノゲリンＩのタンパク質分解性誘導フラグメントに戻しマップされ、この候補バイオマーカーの決定的な同定を提供する。
【０３８４】
これらのような初期の研究は、迅速に可能性のあるバイオマーカーを明らかにするが、任意のバイオマーカーの完全な確認のためには、数十または数百もの関連するサンプルを分析して、発現および有病率に関する統計学的に顕著な情報を得ることが必要である。
【０３８５】
（実施例２：ＭＳ／ＭＳ配列決定のための、増加したタンパク質分解性フラグメント配列の網羅範囲）
親和性捕捉プローブでの保持クロマトグラフィーが、ＭＳ／ＭＳ分析について意図されたタンパク質分解性混合物よりも増加した配列網羅範囲をもたらし得ることを実証するために、２つの実験を行った。
【０３８６】
第１の実験において、完全なトリプシン分解をＩｇＧのサンプルについて行った。次に、消化物を、単一のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）上に存在する、４つの同一の、別個の、逆相クロマトグラフィー吸着表面（「スポット」）にアプライし、これに吸着させた。
【０３８７】
分析の前に、４つのスポットのうちの３つを洗浄した。次に、エネルギー吸着分子を、４つのスポットの各々にアプライし、そしてスポットを、単一の加速ステージ、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイプローブインターフェース（ＰＢＳ Ｉ、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を有する線形飛行時間質量分析計において、個別に問い合わせした。
【０３８８】
図８Ａは、分析前に洗浄されなかったスポットから脱着されたペプチド混合物のスペクトルを示す。容易に見られ得るように、より低い分子量のペプチドが優勢であり、より高分子量の分子種の脱着およびイオン化を抑制する。このことは、ペプチドマッピングおよび／またはタンデムＭＳ配列決定技術において問題であり得る（特に、全体としてのタンパク質の配列が所望されるか、または必要とされる場合）。なぜなら、検出可能なペプチドは、ＩｇＧの一次配列の約６５％におよぶのみだからである。
【０３８９】
図８Ｂは、レーザでの問い合わせの前に水で洗浄した、４つのスポットのうちの別のスポットからのペプチドの脱着より生じたスペクトルを示す。ＭＳでの分析の前に、より小さい、疎水性の度合いが低いペプチドの溶出を用いて、より高分子量のペプチドが検出可能となる。同様にして、図８Ｃは、非イオン性界面活性剤である０．１％のｎ−オクチルグルコピラノシド（「ｎ−ＯＧＰ」）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（「ＰＢＳ」）を用いて、問い合わせの前に洗浄したスポットからの脱着より生じたスペクトルを示し、そして図８Ｄは、５０％アセトニトリルで洗浄したスポットの問い合わせより得られたスペクトルを示す。
【０３９０】
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄを比較すると、異なる洗浄条件は、同一の最初のペプチド混合物からのペプチドの異なる集団の質量分析計スペクトロメトリー検出をもたらす。集合体全体として、差示的に洗浄されたスポットは、ＩｇＧ配列の９５％を超える部分に対応するペプチドを提供し、ＭＳ／ＭＳ配列決定およびタンパク質同定のために使用されるペプチド中の、集合的な配列の網羅範囲を増加するこの技術の能力を実証する。
【０３９１】
第２の実験において、ＢＳＡの完全なトリプシン消化、２Ｍ尿素によるスパイクを、種々の条件下で分析した。
【０３９２】
図９は、消化したＢＳＡサンプルの２μＬのアリコートのＭＳスペクトルを示す。このスペクトルは、ＱｑＴＯＦ ＭＳにおいてＭＡＬＤＩプローブを用いて、得られた。このスペクトルは、ほんの８つのペプチド（１１％の配列を網羅する）が検出され得たことを実証する。この８つのペプチドのｍ／ｚを別に、図の右側に作表する。
【０３９３】
図１０は、弱いカチオン交換表面を有する親和性捕捉プローブの吸着した後、ｐＨ６で緩衝液を用いて洗浄した、並行のアリコートから得られたスペクトルを示す。理解できるように、２倍のペプチドが検出され、集合的に２０％の配列の網羅範囲を提供する。図９におけるように、検出されたペプチドのｍ／ｚは、図面の右側に作表される。
【０３９４】
図１１は、一連の実験（同一のサンプルのアリコートが、弱いカチオン交換表面にアプライされ、そしてＭＳ分析の前に、種々の条件下において洗浄される、図１０に示される実験を含む）からのデータを編集する。集合体全体として、異なる洗浄は、検出されるペプチドの数を３４にまで増加し、集合体全体として、４５％の配列を網羅する。
【０３９５】
図１２は、同一のサンプルのアリコートを強アニオン交換表面を有する親和性捕捉プローブにアプライして、その後、ＭＳ分析の前に示された条件下で洗浄した一連の実験からのデータを編集する。集合体全体として、異なる洗浄は、２６ペプチドの検出を可能にし、集合体全体として、３７％の配列を網羅する。
【０３９６】
図１１および１２に示されるデータを組み合わせて、３６個のＢＳＡペプチドを分析し得、集合体全体として、４６％の配列を網羅する。配列の網羅範囲におけるそのような改善を用いて、その後のＭＳ／ＭＳ配列決定および／または配列に基づくタンパク質同定が、実質的に改善される。
【０３９７】
（実施例３：同定および検出のためのタンパク質分解性増幅）
（Ａ．導入）
この実施例において、本発明者らは、以下のことを示すためにＣＥＡモデル系を使用した：
１）プロテアーゼ消化が、１３０倍まで抗原の検出を増幅すること；
２）タンパク質の同定が、チップ上消化（ｏｎ−ｃｈｉｐ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）からの１つのペプチドのＭＳ／ＭＳ分析を用いて達成され得ること；
３）抗体の捕捉およびタンパク質分解性増幅が、チップの収容能の範囲内で定量的であること；および
４）複雑なタンパク質混合物（胎仔ウシ血清に対してスパイクされた抗原）における抗原分析物の検出限界が、純粋な抗原についての検出限界と同様のレベルであること。
【０３９８】
（Ｂ．物質および材料）
抗原：
癌胎児抗原（ＣＥＡ）を、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｓａｃｏ、Ｍａｉｎｅ、カタログ番号Ａ３２１３７）から購入した。製造元によって、このタンパク質は、ヒト流体またはヒト転移性肝臓から精製された。ＣＥＡは、０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ緩衝液中で、２．５ｍｇ／ｍｌにて入手した。これを、ＰＢＳにより０．２５ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして−２０℃にてアリコートとして保存した。ＣＥＡは、７０２アミノ酸およびＭＷ７６．８ｋＤａを有する。ＣＥＡは糖タンパク質であり、本発明者らは、ＭＡＬＤＩにおいて１５０ｋＤａ付近に広いピークを観察した。
【０３９９】
抗体：
モノクローナル抗ＣＥＡ抗体もまた、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎから購入した（カタログ番号Ｍ３７４０１Ｍ）。これは、０．９％ ＮａＣｌ中で、２．３ｍｇ／ｍｌにて入手した。これを、−２０℃にてアリコートとして保存した。
【０４００】
抗体捕捉およびチップ上消化のプロトコル：
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＳ２ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（ＰＳ２ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）は、アミン基およびチオール基と共有結合的に反応するエポキシ表面を有し、このチップ表面にプロテインＧを共有結合させる）の全てのスポットに対して１ｍＭ プロテインＧを２μＬ適用し、そしてこのチップを、室温にて２時間、加湿チャンバ中でインキュベートする。８ｍｌのブロッキング緩衝液（０．５Ｍ エタノールアミンを含有するＰＢＳ、ｐＨ８．０）を含む１５ｍｌコニカルチューブ中にこのチップを入れることにより、残存する活性部位をブロックする。このチューブを、室温にて１５分間、回転プラットフォーム上で混合する。
【０４０１】
ブロッキング後、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳを用いてこのチップを１５分間洗浄し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した。このチップを風乾し、２μｌの抗ＣＥＡ抗体を、所望のスポットに２．３ｍｇ／ｍｌ適用した。このチップを、室温で２時間、加湿チャンバ中でインキュベートする。０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳを用いてこのチップを１５分間大量洗浄し、そしてＰＢＳで３回洗浄する。
【０４０２】
２μｌの抗原を所望の濃度でスポットに適用する。室温にて２時間、加湿チャンバ中でインキュベートする。０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳを用いてこのチップを１５分間、３回大量洗浄し、その後、ＰＢＳで３回洗浄する。チップを風乾し、そして０．５％ ＴＦＡ中の０．０１ｍｇ／ｍｌのペプシン２μｌを適用する。３７℃にて２時間、加湿チャンバ中でこのチップをインキュベートする。消化されたスポットに１μｌのＣＨＣＡマトリクスおよび消化されていないスポットに１μｌのＳＰＡを適用する。
【０４０３】
このチップを、最初に、シングルＭＳ（例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＢＳ ＩＩ）で読み取り、次いで、タンデムＭＳ（例えば、ＳＥＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ）で読み取って、ＭＳ／ＭＳスペクトルを得た。次いで、例えば、ＭＳ−Ｔａｇを使用することによりタンパク質の同定を行う。
【０４０４】
（Ｃ．結果および議論）
（１．ＣＥＡおよび抗ＣＥＡモデル系）
癌胎児抗原（ＣＥＡ）は、種々の分泌組織において発現される糖タンパク質である。ＣＥＡは、種々の転移の発達および増殖に関連する細胞内認識および結合に関連する。上昇したＣＥＡの血清レベルは、いくつかの悪性状態と関連し、そして、ＣＥＡに対するイムノアッセイは、数年間、悪性腫瘍をモニタリングするのに有用であった。
【０４０５】
以下の理由で、ＣＥＡをモデル系として選択した：１）ＣＥＡは、その糖タンパク質の不均一性に起因してＭＡＬＤＩにおいて検出しにくい；および２）ＣＥＡの分子量は約１５０ｋＤａであり、捕捉抗体の分子量と重なる。図１３に示すように、抗ＣＥＡは、０．０７５の強度で１５０ｋＤａに存在する。抗ＣＥＡにより捕捉されたＣＥＡもまた、０．１〜０．２の間の強度で約１５０ｋＤａのシグナルを有する。従って、さらに同定することなく、ＣＥＡが首尾よく捕捉されることを証明することは、非常に困難である
（１．１． 抗体により捕捉されたＣＥＡの検出、増幅、および同定）
上記のように、ＣＥＡを、抗ＣＥＡによりＰＳ２チップ上で捕捉した。図１３は、ＣＥＡチップの調製における３つの段階にて、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＢＳ ＩＩ ＴＯＦ−ＭＳを用いて生成した質量スペクトルを示す：上段列は、プロテインＧが共有結合したチップからのスペクトルを示す（「プロテインＧ」）；中段列は、抗ＣＥＡｍＡｂがさらに結合したチップからのスペクトルを提供する（「プロテインＧ＋抗ＣＥＡ」）；そして下段列は、４ｐｍｏｌのＣＥＡがさらに結合したチップからのスペクトルを示す（「プロテインＧ＋抗ＣＥＡ＋ＣＥＡ（２×２ｐｍｏｌ）」）。
【０４０６】
プロテインＧ＋抗ＣＥＡスポット（中段のスペクトル）において、本発明者らは、１５０ｋＤａ付近でピークを検出した。これは抗体である。プロテインＧ＋抗ＣＥＡ＋ＣＥＡスポット（下段のスペクトル）から明らかなように、抗ＣＥＡにより捕捉されたＣＥＡもまた、１５０ｋＤａにてシグナルを有し、その強度がわずかに増大していた。１５０ｋＤａでのＣＥＡのシグナルの平均強度は、０．１〜０．２の間である。抗体もまた１５０ｋＤａに存在するので、本発明者らは、ＣＥＡが捕捉されたという結論を出すことができない。
【０４０７】
次いで、チップ上のタンパク質分解を、ＣＥＡが実際に捕捉されたことを立証するため、およびＣＥＡを示すピークのシグナルを増幅するために実施した。図１４は、チップのチップ上ペプシン消化後（そのスペクトルは図１３に示される）に、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＢＳ ＩＩ ＴＯＦ−ＭＳを用いて生成した質量スペクトルを示す。上段列は、プロテインＧ＋ペプシンからのスペクトルである；中段列は、プロテインＧ＋抗ＣＥＡ ｍＡｂ＋ペプシンからのスペクトルである；下段列は、プロテインＧ＋ＣＥＡに対するＭａｂ＋４ｐｍｏｌ ＣＥＡ＋ペプシンからのスペクトルである。見られるように、Ｍ＝１８９６（図において標識されている）は、ＣＥＡ捕捉スポットに固有である。
【０４０８】
消化後、本発明者らは、抗ＣＥＡ抗体もまた、ペプシンにより消化されることを見出した（図１４、列２）。本発明者らは、このスペクトルをコントロールとして使用した。抗ＣＥＡ抗体のみの消化パターン（図１４、列２）と抗ＣＥＡにより捕捉されたＣＥＡの検出の消化パターン（列３）とを比較して、本発明者らは、質量１８９６における１つの大きな差を観察した（図１４）。ＳＥＬＤＩ−ＱｑＴＯＦにおけるＴＯＦ ＭＳスキャンは、正確な ＭＨ＋ ＝ｍ／ｚ １８９４．９３６５を示した。
【０４０９】
図１５は、表面増強レーザー脱離イオン化ＱｑＴＯＦを用いて獲得したＣＥＡペプチドＭＨ＋ｍ／ｚ＝１８９４．９２９９のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。アミド結合の切断から生じたペプチドフラグメントを、Ｎ末端（ｂイオン）、Ｃ末端（ｙイオン）および内部フラグメント（それらの配列に基づき標識されている）における電荷の保持と対応して観察した。
【０４１０】
このフラグメントを、最小のストリンジェントの検索パラメータ（分子量範囲：全て；種：全て；酵素：なし；親イオン：２０ｐｐｍ；フラグメントイオン：５０ｐｐｍ、６４０４２８実態）を用いてタンパク質同定について、ＭＳ−Ｔａｇに供した。このペプチドを、癌胎児抗原由来のペプチドＹＶＩＧＴＱＱＡＴＰＧＰＡＹＳＧＲＥとして同定した。
【０４１１】
１５０ｋＤａでのＣＥＡの強度は０．２であり、そして１８９６におけるレポーターペプチドの強度が、２６である。この場合、本発明者らは、ＣＥＡを示すピークの１３０倍の増幅を観察した。
【０４１２】
（１．２ 抗体により捕捉されたＣＥＡの定量）
このアッセイの定量的な局面を評価するために、本発明者らは、４００ｆｍｏｌ／μｌ〜４ｆｍｏｌ／μｌまでのＣＥＡの連続希釈を実施した。２μｌのＣＥＡを、各々のスポットに充填した。ペプシン消化後、６ｆｍｏｌのソマトスタチンの内部標準を、このマトリクス中にスパイクした。ソマトスタチンを用いて、スペクトルを正規化した。図１６は、連続希釈のスペクトルを示す。
【０４１３】
ＣＥＡレポーティングペプチド（質量＝１８９６）の強度を、チップに充填したＣＥＡの量に対してプロットした（図１７）。直線的な応答を、２０ｆｍｏｌ〜８０ｆｍｏｌまで観察した；飽和は、８０ｆｍｏｌ以上で生じた。太線は、第１の３つのデータ点の最も直線的な一致である（Ｒ２＝０．９９４３）。レポーターペプチドは、８ｆｍｏｌレベルで検出されなかった。
【０４１４】
この定量結果は、第１に、分析物（ＣＥＡ）の抗体捕捉が、特定の範囲にわたり定量的であることを示す。この直線的な範囲は、チップの収容能、抗体の親和性、および抗原分析物またはレポーティングペプチドに対する検出限界に依存する。この結果は、第２に、タンパク質分解消化が、同一範囲内で定量的であることを示す。
【０４１５】
（１．３ 胎仔ウシ血清の存在下で抗体により捕捉されたＣＥＡの検出）
複雑なタンパク質混合物の存在下でのＣＥＡの検出限界を示すために、所望の濃度のＣＥＡを、３０％ウシ胎仔血清（ｆｃｓ）中にスパイクした。
【０４１６】
４００ｆｍｏｌ／μｌ〜１０ｆｍｏｌ／μｌまでのＣＥＡの連続希釈物を調製し；２μｌのＣＥＡサンプルを各々のスポットに充填した。スペクトルを図１８に示す。他のタンパク質の非特異的結合が観察された（図１８、８ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、および３８ｋＤａ）。ＣＥＡの結合を、４０ｆｍｏｌレベルで検出した。この結果を図１８に示す。タンパク質分解後のＣＥＡレポーティングペプチドの検出限界もまた、４０ｆｍｏｌである（図１９）。ｍ＝１８９６のペプチド（図１９にて標識されている）は、ＣＥＡレポーティングペプチドである。
【０４１７】
（実施例４）
（高速タンパク質同定（「ＱＰＩＤ」）のための示差的なペプチド提示）
示差的に発現されるタンパク質と相関するペプチドの示差的提示が、高速タンパク質同定のために使用され得ることを実証するために、２つの実験を実施した。
【０４１８】
（Ａ．実験１：高速タンパク質同定のための、制限された酵素消化からのペプチドの示差的提示）
（１．背景）
腫瘍性低酸素症は、組織レベルで腫瘍細胞と正常細胞とを区別する病態生理学的状態である。低酸素症性腫瘍細胞と正常細胞との差は、癌治療における治療的選択性を達成するために利用され得る。さらに、低酸素症性腫瘍細胞と正常細胞との間の差の理解は、腫瘍低酸素症が時々存在するという首尾良い癌治療に対する障害を克服または回避する治療を設計する上で重要である。
【０４１９】
種々のヒト癌の検出および予後のための新規の生物マーカーを開発するために、本発明者らは、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）を用いて、低酸素症により誘導されたタンパク質分泌における変化を分析した。
【０４２０】
（２．物質および材料）
ＦａＤｕ細胞（扁平上皮癌由来）を、低酸素条件下または正常な条件下で２４時間、無血清培地で増殖させた。この培地を、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）分析のために単離および濃縮した。
【０４２１】
ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ分析の前に、この培地を結合緩衝液（１００ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ３）で希釈し、タンパク質終濃度を０．５ｍｇ／ｍｌにした。強アニオン交換ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイを、サンプルの分析に使用した（ＳＡＸ）。簡単に言うと、アレイ表面を、結合緩衝液（５μｌ）を用いて１５分間予め平衡化し、その後、希釈した培地（５μｌ）を適用した。室温、３０分間での結合（常に攪拌しながら）後、サンプルを取り除き、そしてアレイ表面を、５μｌの洗浄緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ ＯＧＰを有する結合緩衝液）を用いて、室温にて３回洗浄した。最後の洗浄後、アレイ表面を、さらなる処理を行うかまたは分析のための準備をした。分析のための準備をしたサンプルについては、アレイをＨＰＬＣ等級の水でリンスし、その後、０．５μｌの飽和ＣＨＣＡ（５０％ ＡＣＮおよび０．５％ ＴＦＡで希釈した）を添加した。
【０４２２】
タンパク質のプロファイリングの後、アレイ表面を、消化緩衝液（５０ｍＭ 重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．８）２μｌを用いて１５分間平衡化した。トリプシン（０．２μｇ／ｍｌ）をこの表面に添加し、そして加湿チャンバにて一晩インキュベートした。消化後、トリプシンを表面上で乾燥させ、そして１μｌの飽和ＣＨＣＡを、ＳＥＬＤＩ分析の前にアレイ表面に添加した。
【０４２３】
サンプルのトリプシンペプチドマップを、内部標準としてトリプシン自己分解フラグメントを用いて較正した。正常条件下および低酸素条件下でのサンプルからのトリプシンペプチドマップを比較した後、特有のトリプシンペプチドピークを、ＭＳ／ＭＳ分析またはＰｒｏＦｏｕｎｄデータベース検索のために選択した。
【０４２４】
（３．結果）
低酸素条件下または正常条件下で増殖したサンプルのタンパク質プロフィールを比較した後、１８７８６．７Ｄａのタンパク質が、低酸素条件下で処理したサンプルにおいて強くアップレギュレートされていることが示された（図２０）。実験条件下で、１８７８６．７Ｄａタンパク質は、ＳＡＸ２ ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）表面により捕捉されたタンパク質プロフィールの間の主要な差を表す。３つの主要なタンパク質ピーク（１１９８４．４Ｄａ、３３９００．７Ｄａ、および６７５４３．３Ｄａ）を、両方のサンプルにおいて同様の強度で観察した（図２０）。
【０４２５】
トリプシン消化後、５つの特有のトリプシンペプチド（１４７１．６０、１６３６．１３、１８８２．８９、２５０５．４２、２９１０．８９）を、低酸素条件下で処理したサンプルにおいて見出した（図２１）。両方のサンプルにおいて共通して見られた２つのトリプシン自己分解フラグメント（２１６４．３、２２７４．６）を、内部較正のための標準として使用した。５つのトリプシンペプチドを、タンパク質の同定のためにデータベースの問い合わせに供した。同一のペプチドは、ＭＳ／ＭＳ配列決定分析にも同様に供され得る。
【０４２６】
ＰｒｏＦｏｕｎｄデータベース検索は、特有のトリプシンペプチドフラグメントを用いていくつかのタンパク質候補を返した。１８．７２ｋＤａのヒトタンパク質（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２４：１４−９（１９９４））である、ジンクフィンガータンパク質９（ＺＦＰ９）を、最も可能性の高い候補として上位にランクした。ＺＦＰ９は、ヒト細胞核酸結合タンパク質（ＣＮＢＰ）と呼ばれる、高度に保存されたサイトゾルタンパク質のファミリーのメンバーである。ＣＮＢＰの機能は未知である。ＣＮＢＰは、細胞下画分におけるサイトゾルおよび小胞体にて見出されたが、核画分において検出されなかった。本発明者らが、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイを使用して、細胞培養培地中の分泌タンパク質を捕捉したという事実を考慮すれば、ＺＥＰ９の細胞下分布および分子量は、それが、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイにより捕捉された１８．７６ｋＤａタンパク質の強力な候補であることを示唆する。
【０４２７】
（Ｂ．実験２：高速タンパク質同定のためのペプチド示差提示）
第２の実験において、１０μｌのチトクロムＣ（８０μｇ／ｍｌ＝６．５ｎｍｏｌ／ｍｌ）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（６ｍｇ／ｍｌ）中で１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中に４０μｌ添加（スパイク）した。このサンプルから、５μｌを、酸化ケイ素表面を有する親和性捕捉プローブ（ＮＰ２０、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）上にスポットした。平行して、５μｌの８％ ＦＣＳを、ＮＰ２０アレイにスポットした。ＮＰ２０アレイを、加湿チャンバ中で１５分間インキュベートし、次いで、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を用いて５分間大量洗浄した。この洗浄を、さらに２回繰り返した。
【０４２８】
１μｌのシナピン酸（ＳＰＡ）マトリクス（５０％アセトニトリル／０．５％ ＴＦＡ中）を、ＮＰ２０アレイのうちの１つのアレイスポットに添加し、次いで、このアレイを、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＢＳＩＩ線形ＴＯＦ質量分析計にて読み取り、タンパク質プロフィールを獲得した。
【０４２９】
他のＮＰ２０アレイに、１００ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８中で０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度のトリプシン２μｌを充填した。次いで、これらを、３７℃にて２時間、加湿チャンバ中でインキュベートした。１μｌのＣＨＣＡマトリクス（５０％アセトニトリル／０．５％ ＴＦＡ中）を、このアレイに添加した。これらのアレイを、ＰＢＳＩＩ線形ＴＯＦ質量分析計およびＱｑＴＯＦタンデム質量分析計の両方で読み取り、示差的ペプチド提示およびタンパク質同定を得た（ＱｑＴＯＦの概略図については図１および２を参照のこと）。タンパク質の同定を、ＭＳ−Ｔａｇ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ）を用いて実施した。
【０４３０】
図２３は、サンプル（ＦＣＳ中のチトクロムＣ、パネルＡおよびパネルＢ、Ｂは拡大表示）およびコントロール（ＦＣＳ、パネルＣおよびパネルＤ，Ｄは拡大表示）のＰＢＳＩＩ質量スペクトル（タンパク質プロフィール）を示す。サンプル中で特有に表れるピークに印を付けている（１２４６５．７ダルトン）。
【０４３１】
図２４は、トリプシンによるチップ上消化後にＰＢＳＩＩにおいて獲得されたサンプルおよびコントロールのＭＳスペクトルを示す。上側のスペクトルはコントロールを示し；下側のスペクトルはサンプルを示す。サンプル中に特有に存在するペプチドを標識してある。
【０４３２】
図２５は、図２４に示されるようなサンプルおよびコントロールのスペクトルを示すが、これは、ＱｑＴＯＦにおいて獲得されたものである。次いで、１１６８のペプチドを、ＣＩＤおよびＭＳ／ＭＳ分析のために選択し、得られたフラグメントのスペクトルを図２６に示した。ペプチドフラグメントの質量を、ＭＳ−Ｔａｇに供し、その結果を図２７に示す。
【０４３３】
これらの結果は、チトクロムＣが、示差的に提示されたタンパク質として直接的に同定され得（図２３）、かつタンパク質分解性消化後の構成ペプチドの示差的提示に基づき迅速に同定され得る（図２６および２７）ことを実証する。
【０４３４】
（実施例５）
（制限された酸加水分解）
（Ａ．制限された酸加水分解）
（１．背景）
過去において、タンパク質の完全な酸加水分解は、アミノ酸分析のために通常使用され、そして部分的な酸加水分解は、ジペプチドおよびトリペプチドを生成するその能力に基づいて、タンパク質配列決定のために使用された。無機酸（例えば、ＨＣｌ）が、通常選択される酸であり、そしてタンパク質は、１１０℃において、２〜６Ｍの酸濃度で、通常、数時間〜１日処理された。
【０４３５】
このような加水分解条件は、広範な非特異的切断を生じる；その結果、このような条件は、質量分析法を使用するタンパク質同定の努力において制限された価値を有し、ある程度の切断については、大部分のデータベースマイニングアルゴリズムによって、選択性が必要とされる。従って、広範な酸加水分解のアプローチは、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ表面における直接的な加水分解に適さないとみなされる。
【０４３６】
最近、質量分析法のペプチドマッピングおよびタンパク質同定のための、蒸気相の酸加水分解法が、報告された。凍結乾燥されたタンパク質が、密封された酸蒸気チャンバ中で、７０℃で６０分間インキュベートされた。このチャンバの底部は、９０％ペンタフルオロプロピオン酸（ＰＦＰＡ）で満たされた。これらの条件下で、異なる型の切断反応が観察された：特定の内部アミノ酸残基（セリンのＮ末端側、アスパラギン酸のＣ末端側、ならびにより低い程度まで、スレオニンのＮ末端側およびグリシン残基の両側）における切断、およびそのタンパク質のインタクトなＮ末端またはＣ末端を含む、配列ラダーの形成を生じる切断。このような特異性に起因して、蒸気相の酸加水分解は、チップ上のタンパク質分解がデータベースマイニング活動を支持する、実行可能な技術であるという見込みを示した。
【０４３７】
本発明者らは、制限された酸加水分解を、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を使用して実施した。本発明者らは、蒸気相と溶液相との両方の酸加水分解を調査した。本発明者らの研究は、６％ＴＦＡを使用する溶液加水分解が、気相反応について以前に報告されたものと類似のタンパク質加水分解パターンを提供することを示した。６％ＴＦＡ溶液相の加水分解について、好ましい切断部位は、グリシンの両側、およびアスパラギン酸のＣ末端側を含んだ。さらに、末端ペプチドが生成した後に、配列ラダーがしばしば形成された。０．６％ＴＦＡ溶液相の加水分解を使用する間に、観察される切断パターンはより特異的になり、アスパラギン酸のＣ末端側における結合の分裂が、好ましかった。溶液相ＴＦＡ加水分解を、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ表面に直接適用することによって、自由な溶液の様式と同じ様式で、効果的な制限された加水分解が生じた。
【０４３８】
（２．方法）
チップ上加水分解の場合に、１〜１０ｐｍｏｌのタンパク質を、８スポット混合モードのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）に沈着させ、そして風乾した。混合モードのチップは、いくらかの親水性特徴を有する、ほぼ疎水性の結合性質を示す。次いで、２μｌの６％ＴＦＡまたは０．６％ＴＦＡ（１％のＤＴＴを含む）を、各スポットに直接添加した。その後、チップをすぐに、密封した加湿チャンバ（液体レザバを利用するプラスチック容器）に入れた。この加湿チャンバの底部に水を満たし、そして全てのチップをラックに載せ、水面より上に吊下した。次いで、この加湿チャンバを６５℃のオーブンに入れた。チップ上加水分解のための反応時間は、一般に、２〜４時間であった。インキュベーション後、チップを取り出し、そしてスポットを風乾し、その後、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）マトリクス溶液を添加した。
【０４３９】
ＣＨＣＡマトリクスの飽和溶液を、酸加水分解産物の分析のために使用した。マトリクス溶媒は、５０％／５０％ Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（ｖ／ｖ）および０．５％ＴＦＡであった。スペクトルを、陽イオンモードで、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＰＢＳ ＩＩシステム（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）（時間遅れ焦点化法の、線レーザー脱着／電離飛行時間型質量分析計）で得た。時間遅れ焦点化法の遅延時間を、４００ｎｓに設定した。イオンを、３ｋＶのイオン抽出パルスを使用して抽出し、そして２０ｋＶの加速電位を使用して、最終速度に加速した。このシステムは、１秒間あたり２パルスから５パルスに変化する繰返し数でパルス化される窒素レーザーを使用した。代表的なレーザー流束量は、３０〜１５０ｍＪ／ｍｍ２で変化した。自動分析プロトコルを使用して、大部分のサンプル分析におけるデータ獲得プロセスを制御した。各スペクトルは、少なくとも５０のレーザーショットの平均であり、そして既知のペプチドの混合物に対して外部較正した。ペプチドラダーを生成する場合、ペプチド配列を、質量スペクトルから直接誘導し得る。本発明者らのモデル系のタンパク質配列を、ＮＣＢＩデータベースおよびＰｒｏｗｌソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｗｌ１．ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ．ｅｄｕ／ｐｒｏｗｌ／ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｆｏ．ｈｔｍｌ）を使用して検索した。
【０４４０】
（３．結果）
ａｐｏ−Ｍｂおよびβ−ラクトグロブリンＡについてのチップ上酸加水分解実験の結果を、図２２に示す。この図は、以下のような条件で、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＢＳ ＩＩ ＭＳによって分析した場合の、４時間のチップ上酸加水分解から得られたペプチド産物の、陽イオン質量スペクトルを示す：（ａ）６％ＴＦＡ、ａｐｏ−Ｍｂ；（ｂ）０．６％ＴＦＡ、ａｐｏ−Ｍｂ；（ｃ）６％ＴＦＡ、リゾチーム；および（ｄ）０．６％ＴＦＡ、リゾチーム。
【０４４１】
驚くべきことに、類似の加水分解パターンが、高い酸濃度と低い酸濃度との両方の実験について観察され、そして全ての場合において、加水分解フラグメントは、インキュベーションの６０分以内に見られた。類似の結果が、ＢＳＡ、リゾチーム、およびリボヌクレアーゼＡについて見られた。本発明者らは、低い酸濃度と高い酸濃度との両方の加水分解産物の類似性が、チップ上酸溶液の時間依存性の希釈（全ての実験を、低い酸濃度で効果的に進行させる）に起因すると考える。全てのチップを６５℃の加湿チャンバ内でインキュベートした場合、時がたつにつれて、８位置チップの各位置に最初に沈着された２μＬの酸溶液が蒸発しはじめ、従って、これらの相対蒸気圧に同調して、成分を失った。本質的に、大部分のＴＦＡが蒸発し、そして新たな平衡が、チップ表面と周囲の気体媒体との間に確立された。全ての実験に対して、加湿チャンバの流体レザバは、代表的に、約１８０ｍＬの蒸留水を装填された。従って、チップ上の液滴についての有効ＴＦＡ濃度が連続的に低下し、そして完全な交換サイクルの後に、４桁も希釈される。
【０４４２】
チップ上β−ラクトグロブリンＡ加水分解が進行した全体的な速度もまた、驚くべきものであった。低い酸濃度の微小遠心管の結果と比較して、β−ラクトグロブリンＡのチップ上加水分解は、より迅速に進行し、微小遠心管実験のために必要とされた一晩のインキュベーションを必要とせず、１時間以内に観察可能なラダーを生じた。この場合、高濃度と低濃度との両方の実験の観察された切断パターンが、低濃度微小遠心分離実験のものと類似するのみでなく、反応速度もまた有意に増加した。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイ表面は、結合したβ−ラクトグロブリンＡを、酸不安定な残基へのアクセスを改善する様式で変性または提示することによって、特に与えられた役割を果たすと仮定される。
【０４４３】
表１は、高い酸濃度および低い酸濃度の条件下での、５つ全てのタンパク質について同定されたチップ上切断部位を列挙する。ここでまた、これらの産物は、低濃度の微小遠心管での試行によって生成されるものに好ましく匹敵し、酸性残基のＣ末端での好ましい切断を実証する（例えば、ａｐｏ−Ｍｂ由来のフラグメント１２７〜１５３（Ｄ／Ａ．．．Ｇ／＿）およびウシβ−ラクトグロブリン由来のフラグメント１３５〜１６２（Ｅ／Ｋ．．．Ｉ／＿））。微小遠心分離の試行についての場合にそうであったように、チップ上酸加水分解反応はまた、アスパラギンおよびグルタミンにおける切断を示した（例えば、リボヌクレアーゼＡ由来のフラグメント１１４〜１２２（Ｎ／Ｐ．．．Ｖ／＿）およびリゾチーム由来のフラグメント１０４〜１２９（Ｎ／Ｇ．．．Ｌ／＿））。
【０４４４】
図２２は、ＰＢＳ ＩＩによって分析した場合の、４時間のチップ上酸加水分解から生じたペプチド産物の陽イオン質量スペクトルを示す。（ａ）６％ＴＦＡ、ａｐｏ−Ｍｂ。（ｂ）０．６％ＴＦＡ、ａｐｏ−Ｍｂ。（ｃ）６％ＴＦＡ、リゾチーム。（ｄ）０．６％ＴＦＡ、リゾチーム。数字は、得られたフラグメントの親タンパク質におけるアミノ酸範囲を示す。
【０４４５】
（表１ チップ上酸加水分解のペプチド産物（６％ＴＦＡと０．６％ＴＦＡとの両方））
【０４４６】
【表１】
＊＊全ての質量は、ＰＢＳ ＩＩによって分析した場合の平均質量である。
【０４４７】
（４．結論）
チップ上酸加水分解研究（６％ＴＦＡまたは０．６％ＴＦＡ）について、優先的な好ましい切断部位は、アスパラギン酸または脱アミド化アスパラギンのＣ末端側であり、そしてより低い程度まで、グルタミン酸または脱アミド化グルタミンのＣ末端側であり、それに続いて、ロイシンのＣ末端切断である。これらの制限された条件下で、良好な程度の特異性が得られ、そして０．６％の制限された酸加水分解に基づいて、特定の検索アルゴリズムを作成してデータベースマイニング活動を支持するために、合理的な規則セットが構成され得る。
【０４４８】
本明細書中で言及された全ての特許、特許公報、および他の刊行された参考文献は、各々が個々に具体的に本明細書中に援用されたかのように、その全体が本明細書中に参考として援用される。本文書における種々の参考文献の引用によって、本出願人らは、いずれの特定の参考文献も、本発明の「先行技術」であることを認めない。
【０４４９】
特定の実施例が提供されたが、上記記載は説明であり、限定ではない。先に記載された実施形態の特徴の任意の１つ以上が、任意の様式で、本発明の任意の他の実施形態の１つ以上の特徴と組み合わせられ得る。さらに、本発明の多数のバリエーションが、本明細書を再検討する際に、当業者に明らかとなる。従って、本発明の範囲は、上記記載を参照して決定されるのではなく、添付の特許請求の範囲を、その全ての範囲の均等物と共に参照して、決定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０４５０】
本発明の上記の目的および他の目的ならびに上記の利点および他の利点は、上記の詳細な説明を、添付の図面と組み合わせて考慮すると明らかになる。添付の図面において、同様の文字は、全体にわたり同様の部分を指す。
【図１】図１は、本発明の分析装置の実施形態を図式化する。
【図２】図２は、本発明の分析装置における使用に好ましい直交ＱｑＴＯＦタンデム質量分析計の要素をより詳細に示す。
【図３】図３は、単一のＢＰＨおよび前立腺癌患者の精液タンパク質プロフィールを示す。
【図４】図４は、図３にて検出可能なアップレギュレートされたタンパク質のうちの１つのプローブ上単離の結果を示す。
【図５】図５は、図４の濃縮されたバイオマーカー候補がトリプシンを使用してインサイチュ消化に曝された後に、ＭＳ分析の１つのフェーズにより検出されたペプチドを示す。
【図６】図６は、図５において示されるのと同じ精製タンパク質ペプチドのＬＤＩ Ｑｑ−ＴＯＦ ＭＳ分析を示す。
【図７】図７は、濃縮されたバイオマーカー候補の選択された二重荷電イオンの、本発明の分析デバイスからのＭＳ／ＭＳの結果を示す。
【図８】図８は、タンパク質分析物のタンパク質分解切断産物の質量スペクトルを示し、これは、親和性捕捉プローブ上にタンパク質分解フラグメントを捕捉し、その後、分析前に選択的に溶出することにより、配列網羅範囲の増加が可能なことを示す。
【図９】図９は、２Ｍ尿素でスパイクしたＢＳＡのトリプシン消化物のＭＡＬＤＩ質量スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、弱カチオン交換表面を有する親和性捕捉プローブに吸着させｐＨ６の緩衝液で洗浄した後の、２Ｍ尿素でスパイクしたＢＳＡのトリプシン消化物の質量スペクトルを示す。
【図１１】図１１は、弱カチオン交換表面を有する親和性捕捉プローブに吸着させ種々の条件下で洗浄した後の、２Ｍ尿素でスパイクしたＢＳＡのトリプシン消化物から得られる質量スペクトルにて観察される、ペプチドのｍ／ｚを表に示す。
【図１２】図１２は、強アニオン交換表面を有する親和性捕捉プローブに吸着させ種々の条件下で洗浄した後の、２Ｍ尿素でスパイクしたＢＳＡのトリプシン消化物から得られる質量スペクトルにて観察される、ペプチドのｍ／ｚを表に示す。
【図１３】図１３は、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ上でのＣＥＡ捕捉の３つの段階での質量スペクトルを示す。
【図１４】図１４は、図１３のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイのチップ上ペプシン消化後の、質量スペクトルを示す。
【図１５】図１５は、本発明に従ってＳＥＬＤＩ−ＱｑＴＯＦを使用して得られた、ＣＥＡペプチドＭＨ＋＝ｍ／ｚ １８９４．９２９９のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図１６】図１６は、ソマトスタチンを使用して正規化した、４００ｆｍｏｌ／μｌ〜４ｆｍｏｌ／μｌのＣＥＡ連続希釈物のペプシン消化物の質量スペクトルを示す。
【図１７】図１７は、図１６のスペクトルからの、チップ上に搭載されたＣＥＡの量に対するＣＥＡ−レポーティングペプチド（ｍ／ｚ＝１８９６）の強度のプロットであり、２０ｆｍｏｌ〜８０ｆｍｏｌにて線形応答が観察される。
【図１８】図１８は、ウシ胎仔血清の存在下でのＣＥＡ連続希釈物からの質量スペクトルを示す。
【図１９】図１９は、ペプシンタンパク質分解後の、ウシ胎仔血清の存在下でのＣＥＡ連続希釈物からの質量スペクトルを示す。
【図２０】図２０は、正常条件下または低酸素条件下で増殖した細胞から得た培地サンプルの質量スペクトルを示す。
【図２１】図２１は、正常条件下または低酸素条件下で増殖した細胞から得た、トリプシン消化後のサンプルの質量スペクトルを示す。
【図２２】図２２は、４時間のチップ上酸加水分解から生じたペプチド産物の陽イオン質量スペクトルを示し、この結果は、（ａ）６％ ＴＦＡ，ａｐｏ−Ｍｂ；（ｂ）０．６％ ＴＦＡ，ａｐｏ−Ｍｂ；（ｃ）６％ ＴＦＡ，リゾチーム；および（ｄ）０．６％ ＴＦＡ，リゾチームのような条件を用いて、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＢＳ ＩＩ ＭＳにより分析した。
【図２３】図２３は、ウシ胎仔血清中のチトクロムＣサンプル（パネルＡおよびパネルＢ、Ｂは表示倍率が増加している）およびコントロール（ＦＣＳ、パネルＣおよびパネルＤ、Ｄは、表示倍率が増加している）についての、ＰＢＳＩＩ質量スペクトル（タンパク質プロフィール）を示す。
【図２４】図２４は、トリプシンによりチップ上での消化後に得た、図２３に示されるコントロールおよびサンプルについてのＭＳスペクトルを示す。
【図２５】図２５は、図２４と同様であるがＱｑＴＯＦタンデム質量分析計にて得た、サンプルおよびコントロールについてのスペクトルを示す。
【図２６】図２６は、１１６８のペプチドについてのＱｑＴＯＦ ＣＩＤ ＭＳ／ＭＳフラグメントスペクトルを示す。
【図２７】図２７は、図２６に示されるスペクトルから得たペプチドフラグメント質量の提出からのＭＳ−Ｔａｇの結果を示す。

Claims (26)

  1. サンプル中の標的タンパク質を検出するための方法であって、以下の工程：
    （ａ）親和性捕捉プローブ上に該標的タンパク質を捕捉する工程；
    （ｂ）タンパク質分解因子を使用して、該親和性捕捉プローブ上に該標的タンパク質のタンパク質切断産物を生成する工程；
    （ｃ）レーザー脱離イオン化質量分析法によって、該タンパク質切断産物を検出する工程；および
    （ｄ）１つ以上の検出されたタンパク質切断産物を、該標的タンパク質の予め決定された１つ以上のタンパク質フラグメントマーカーと関連づける、工程、
    を包含し、
    これによって、該関連が、該標的タンパク質を検出する、
    方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質フラグメントマーカーが、以下の工程：
    （ｉ）親和性捕捉プローブ上に前記標的タンパク質を捕捉する工程；
    （ｉｉ）タンパク質分解因子を使用して、該親和性捕捉プローブ上に該標的タンパク質のタンパク質切断産物を生成する工程；
    （ｉｉｉ）少なくとも１つのタンパク質切断産物を、タンデム質量分析法を用いて分析する工程であって、ここで、分析する工程が、以下の工程：
    （１）該タンパク質切断産物を、該親和性捕捉プローブから気相中に脱着して、対応する親ペプチドイオンを生成する工程、
    （２）第１質量分析計を用いて、後のフラグメント化のための親ペプチドを選択する工程、
    （３）該気相中において、選択されたフラグメント化条件下で、選択された親ペプチドイオンをフラグメント化して、フラグメントイオンを生成する工程、および
    （４）第２質量分析計を用いて該フラグメントイオンの質量スペクトルを生成する工程、
    を包含する、工程、ならびに
    （ｉｖ）候補タンパク質切断産物の中から該試験タンパク質の少なくとも１つのタンパク質フラグメントマーカーを同定する工程であって、以下：
    （１）少なくとも１つの質量スペクトルをタンパク質データベースマイニングプロトコルに供する工程であって、該プロトコルが、質量スペクトルと該データベース中のタンパク質の理論的質量スペクトルとの間の一致の密接さの尺度に基づいて、該データベースにおいて、試験タンパク質に対する少なくとも１つのタンパク質正体候補を同定する、工程、および
    （２）該正体候補が該試験タンパク質に対応するか否かを決定する工程、
    によって、同定する工程、
    を包含し、
    これによって、該タンパク質切断産物が該試験タンパク質のタンパク質フラグメントマーカーであることを対応が示す、
    方法。
  3. 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、質量分析法が、レーザー脱離／イオン化質量分析法である、方法。
  4. 請求項３に記載の方法であって、ここで、質量分析法が、レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析法である、方法。
  5. 請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記タンパク質分解因子が、化学因子および酵素因子からなる群より選択される、方法。
  6. ２つの複雑な生物学的サンプル間で差示的に提示されるタンパク質を同定するための方法であって、以下：
    （ａ）質量分析計を用いて、２つのサンプル間で差示的に提示される少なくとも１つのタンパク質を検出する工程；
    （ｂ）２つのサンプル中でタンパク質をフラグメント化し、そして質量分析計を用いて、２つのサンプル間で差示的に提示されるタンパク質フラグメントを検出する工程；
    （ｃ）タンデム質量分析計を用いて、少なくとも１つの差示的に提示されたタンパク質フラグメントの正体を決定する工程；および
    （ｄ）該タンパク質フラグメントの正体を、差示的に提示されたタンパク質と関連づける工程、
    を包含し、
    これによって、該関連が、差示的に提示されたタンパク質を同定する、
    方法。
  7. 請求項６に記載の方法であって、ここで：
    （ａ）検出する工程が、以下：
    （ｉ）親和性捕捉プローブ上に前記サンプルからのタンパク質を捕捉する工程；
    （ｉｉ）レーザー脱離／イオン化質量分析法によって、各サンプルから該捕捉されたタンパク質を分析する工程；
    （ｉｉｉ）前記２つのサンプル中の捕捉されたタンパク質を比較して、差示的に発現されたタンパク質を同定する工程、
    を包含し、
    （ｂ）フラグメント化し、そして検出する工程が、以下：
    （ｉ）親和性捕捉プローブ上に該サンプルからのタンパク質を捕捉する工程；
    （ｉｉ）タンパク質分解因子を用いて、該親和性捕捉プローブ上にタンパク質切断産物を生成する工程；
    （ｉｉｉ）レーザー脱離／イオン化質量分析法によって、該タンパク質切断産物を分析する工程；
    （ｉｖ）該２つのサンプル中のタンパク質切断産物を比較して、差示的に発現されるタンパク質切断産物を同定する工程、
    を包含し、
    （ｃ）少なくとも１つの差示的に提示されるタンパク質フラグメントの正体を決定する工程が、以下：
    （ｉ）該タンパク質バイオチップから該タンパク質切断産物を気相中に脱着して、対応する親ペプチドイオンを生成する工程、
    （ｉｉ）第１の質量分析計を用いて、後のフラグメント化のための親ペプチドイオンを選択する工程、
    （ｉｉｉ）該気相中において、選択されたフラグメント化条件下で、選択された親ペプチドイオンをフラグメント化して、第２質量分析計を用いて、産物イオンフラグメントを生成する工程、
    （ｉｖ）該産物イオンフラグメントの質量スペクトルを生成する工程、
    （ｖ）少なくとも１つの質量スペクトルをタンパク質データベースマイニングプロトコルに供することによって、少なくとも１つのタンパク質正体候補フラグメントマーカー産物を同定する工程であって、該プロトコルが、質量スペクトルと該データベース中のタンパク質の理論的質量スペクトルとの間の一致の密接さの尺度に基づいて、該データベースにおいて、試験タンパク質に対する少なくとも１つのタンパク質正体候補を同定する、工程、
    を包含する、方法。
  8. 請求項６に記載の方法であって、ここで、フラグメント化が、溶液中で行われる、方法。
  9. 請求項６または７に記載の方法であって、ここで、前記差示的に提示されるタンパク質が、前記２つのサンプルのうちの１つにおいて独特に検出可能である、方法。
  10. 請求項６または７に記載の方法であって、ここで（ｂ）フラグメント化する工程が、酵素的なフラグメント化を包含する、方法。
  11. 請求項１０に記載の方法であって、制限酵素消化を含む、方法。
  12. 請求項６または７に記載の方法であって、ここで、（ｂ）フラグメント化する工程が、化学フラグメント化を含む、方法。
  13. 請求項１２に記載の方法であって、ここで、化学フラグメント化が、酸加水分解を含む、方法。
  14. 請求項６または７に記載の方法であって、ここで、前記２つのサンプルが、（１）健康な供給源由来のサンプルおよび疾患のある供給源由来のサンプル、（２）毒性化合物に曝露される試験モデル由来のサンプルおよび毒性化合物に曝露されない試験モデル由来のサンプル、または（３）薬物に応答する被験体由来のサンプルおよび薬物に応答しない被験体由来のサンプルから選択される、方法。
  15. 他のタンパク質の切断産物と混合して、複数の切断産物として存在するタンパク質分析物を分析するための方法であって、以下の工程：
    （ａ）親和性捕捉プローブへの吸着によって、該混合物から複数の切断産物を捕捉する工程であって、該複数の吸着された切断産物が、該タンパク質分析物少なくとも１つの切断産物を含む、工程；
    （ｂ）該複数の吸着されたタンパク質切断産物の複雑性を減少させるのに十分な時間および条件下で、第１溶出液を用いて少なくとも１回洗浄する工程であって、複雑性の減少された該吸着された切断産物が、該タンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を含む、工程；および、次いで
    （ｃ）タンデム質量分析計測定を用いて該タンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を特徴付ける工程、
    を包含し、
    該少なくとも１つの切断産物のタンデム質量分析による特徴付けが該タンパク質分析物の分析を提供する、
    方法。
  16. 請求項１５に記載の方法であって、以下：
    タンパク質分解因子を用いて、前記混合物中のタンパク質を切断産物に切断する工程、
    の先立つ工程をさらに、包含する、方法。
  17. 請求項１５または１６に記載方法であって、
    前記第１溶出液を用いる洗浄の後、および前記少なくとも１つのタンパク質分析物切断産物を特徴付ける前に、以下の工程の少なくとも１回の反復をさらに包含し、該工程が、
    該プローブを第２溶出液を用いて、前記複数の吸着されたタンパク質切断産物の複雑性をさらに減少させるのに十分な時間および条件下で、洗浄する工程であって、該第２溶出液が、前記第１溶出液とは異なる少なくとも１つの溶出特性を有し、さらに複雑性が減少された該吸着された切断産物が、該タンパク質分析物の少なくとも１つの切断産物を含む、工程である、
    方法。
  18. 請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記タンデム質量分析計測定を用いて特徴付ける工程が、以下：
    ｉ）前記プローブから前記タンパク質切断産物を脱着しそしてイオン化し、対応する親ペプチドイオンを生成する、工程；
    ｉｉ）質量分析計の第１相において、所望の親ペプチドイオンを選択する工程；
    ｉｉｉ）前記選択された親ペプチドを気相中でフラグメントイオンにフラグメント化する工程；および
    ｉｖ）質量分析計の第２相において、前記選択された親ペプチドイオンのフラグメントイオンの質量スペクトルを測定する工程、
    を包含する、方法。
  19. 請求項１８に記載の方法であって、ここで、前記フラグメント化する工程が、衝突誘起解離（ＣＩＤ）によってもたらされる、方法。
  20. 請求項１９に記載の方法であって、以下：
    （ｄ）前記フラグメントイオン質量スペクトルで表されるフラグメントイオンの内、質量の差異を計算することによって、前記タンパク質分析物のアミノ酸配列の少なくとも一部を決定する工程、
    をさらに包含する、方法。
  21. 請求項２０に記載の方法であって、以下：
    （ｅ）前記予測配列と配列データベースに予め記入された配列との間で計算される一致の密接さに基づいて、該タンパク質分析物についての少なくとも１つのタンパク質正体候補を決定する工程、
    をさらに包含する、方法。
  22. 請求項２１に記載の方法であって、以下：
    （ｆ）前記正体候補が、前記タンパク質分析物と同じである可能性を評価する工程であって、（ｉ）前記選択された親ペプチドイオンについて測定された質量を、（ｉｉ）前記タンパク質分解因子を用いて該正体候補を切断することによって生成される切断産物について予測される質量を比較することによって評価する、工程、
    をさらに、包含し、
    予測された質量と該測定された質量との間の一致が、該正体候補が該タンパク質分析物と同じであるという増加した可能性を示す、
    方法。
  23. 請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記タンデム質量分析特徴付けが、ＱｑＴＯＦ質量分析計、イオントラップ質量分析計、イオントラップ飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計、飛行時間 飛行時間（ＴＯＦ−ＴＯＦ）質量分析計、およびフーリエ変換イオンサイクトロン共鳴質量分析計からなる群より選択される質量分析計を使用して実行される、方法。
  24. 請求項２３に記載の方法であって、前記タンデム質量分析計が、ＱｑＴＯＦ質量分析計である、方法。
  25. 請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記親和性捕捉プローブが、クロマトグラフィー吸着表面を有する、方法。
  26. 請求項２５に記載の方法であって、ここで、前記クロマトグラフィー吸着表面が、逆相表面、アニオン交換表面、カチオン交換表面、固定化金属親和性捕捉表面および混合モード表面からなる群より選択される、方法。
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