DE102012214202B4

DE102012214202B4 - Verfahren zum Charakterisieren oberflächenadhäsiver Eigenschaften von Peptiden und Proteinen

Info

Publication number: DE102012214202B4
Application number: DE102012214202.9A
Authority: DE
Inventors: Ingo Grunwald; Lucio Colombi Ciacchi; Sascha Steckbeck
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Universitaet Bremen
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Universitaet Bremen
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2032-08-10
Also published as: DE102012214202A1

Abstract

Verfahren zum Charakterisieren oberflächenadhäsiver Eigenschaften eines Peptids oder Proteins, umfassend folgende Schritte:
(i) Bereitstellen einer Probenmischung enthaltend zwei oder mehr Peptidfragmente eines zu charakterisierenden Peptids oder Proteins;
(ii) Bestimmen der Peptidfragmentmassen der in der Probenmischung enthaltenen Peptidfragmente mittels Massensprektrometrie und Erstellen eines Referenz-Peptidmassenfingerprints;
(iii) Auftragen der Probenmischung auf eine anorganische oder organische Substratoberfläche hinsichtlich derer die oberflächen-adhäsiven Eigenschaften des Peptids bzw. Proteins charakterisiert werden sollen;
(v) Bestimmen der Peptidfragmentmassen der in der Probenmischung enthaltenen, nicht an die Substratoberfläche gebundenen Peptidfragmente mittels Massensprektrometrie und Erstellen eines Peptidmassenfingerprints;
(vi) Vergleich des in Schritt (ii) bestimmten Referenz-Peptidmassenfingerprints mit dem in Schritt (v) bestimmten Peptidmassenfingerprint und Identifizieren des bzw. eines, mehrerer oder sämtlicher an die Substratoberfläche gebundener Peptidfragmente und/oder eines, mehrerer oder sämtlicher nicht an die Substratoberfläche gebundener Peptidfragmente.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Charakterisieren der Adhäsionseigenschaften von Peptiden und Proteinen an Oberflächen und ermöglicht die gezielte Identifikation von Materialien, die auf Grund ihrer Oberflächenbeschaffenheit für bestimmte Anwendungen, insbesondere zur Verpackung bzw. Aufbewahrung bestimmter Peptide oder Proteine geeignet sind.
Weitere Aspekte der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung, den Beispielen sowie insbesondere den beigefügten Patentansprüchen.
Peptide und Proteine sind in der Lage, spezifische Wechselwirkungen mit zahlreichen biologischen, aber auch anorganischen, insbesondere technischen Materialien einzugehen. Dabei bestimmen sowohl die Oberflächenbeschaffenheit des Materials, als auch die inhärenten Eigenschaften des Peptids bzw. Proteins die Stärke und die Spezifität der Wechselwirkung. Die Interaktion von Peptiden oder Proteinen untereinander sowie die Interaktion mit anderen Materialien wird insbesondere durch ihren molekularen Aufbau bestimmt. Durch die Aminosäuresequenz ist grundsätzlich festgelegt, welche funktionellen Einheiten vorhanden sind. Insbesondere in größeren Proteinen bedingt jedoch ihre dreidimensionale Faltung, dass gegebenenfalls nur bestimmte Strukturen für eine Wechselwirkung oder andere Funktionalitäten zur Verfügung stehen. Weiterhin können Funktionalität und/oder mögliche Wechselwirkungen eines Peptids oder Proteins beispielsweise durch posttranslationale Modifikationen beeinflusst werden.
Aufgrund ihrer vorteilhaften Wechselwirkungen bzw. Funktionen werden viele Peptide und Proteine auf diversen Gebieten der Technik für unterschiedliche Anwendungen genutzt. Ein Beispiel hierfür ist die Biomineralisation, wobei man sich spezifische Interaktionen von Proteinen bzw. Peptiden mit anorganischen Materialien zu Nutze macht. In diesem Zusammenhang identifizierte (Erkennungs-)Sequenzen von Proteinen bzw. Peptiden können „Baugerüste” für anorganische Nanostrukturen bilden und eröffnen im Bereich der Nano(bio)technologie neue Möglichkeiten, wie sie beispielsweise in WO 03026590 A2 beschrieben werden.
Häufig ist auch eine Adhäsion von Proteinen, insbesondere an der Oberfläche von Implantaten erwünscht, wodurch beispielsweise die Besiedelung der Implantatoberfläche mit Körperzellen und damit ein schnelles Einwachsen ins Gewebe erleichtert und/oder eine negative Immunreaktion verhindert werden kann.
In anderen Fällen kann eine Adhäsion von Proteinen oder Peptiden an bestimmte Materialien jedoch von Nachteil sein. Zum Beispiel können (unerwünschte) Bakterien, Pilze und andere ein- oder mehrzellige Organsimen mit Hilfe von Proteinen (neben Zuckerstrukturen) an Oberflächen haften, was wiederum unerwünschte Folgeerscheinungen mit sich bringen kann. Die Bildung eines Films von Organismen auf einer technischen Oberfläche wird u.a. als „Biofouling” bezeichnet und kann beispielsweise die Effizienz von Solarzellen verringern oder, insbesondere im Fall von marinen/aquatischen Sensoren, zum Ausfall von Messgeräten führen.
Besonders unerwünscht ist auch eine Adhäsion sogenannter „Proteindrugs”, pharmakologisch wirksamer Medikamente bzw. Substanzen auf Basis von Proteinen (z.B. Antikörper oder Enzyme), die in der Medizin zunehmend an Bedeutung gewinnen, an Verpackungsoberflächen, da auf diese Weise erhebliche Anteile der oft in sehr kleinen Mengen dosierten Medikamente verloren gehen. Die Kosten einer Behandlung mit Proteinbasierten Medikamenten liegen nicht selten bei mehreren 10.000 Euro pro Jahr und Patient, wobei oft nur wenige hundert Milligramm Substanz verwendet werden. Aufgrund der (bekannten) oft in erheblichem Maße auftretenden Protein-Adhäsion an der Verpackungsmaterial-Oberfläche werden beim Abfüllen bzw. Verpacken der Medikamente häufig bis zu 30 % mehr Proteine bzw. Peptide eingesetzt. Es besteht daher das Bedürfnis, die Adsorption an gebräuchlichen Verpackungsmaterialien, z.B. an Glasflaschen/Glasvials, gezielt zu verhindern, um einen effizienten Einsatz der Medikamente bzw. einen ressourcen- und kostenschonend(er)en Umgang mit solchen Medikamenten zu ermöglichen. Weiterhin besteht Bedarf daran, ohne großen Aufwand Verpackungsmaterialien auswählen zu können, die zur Verpackung bestimmter Medikamente besonders geeignet sind, d.h. bei denen keine oder allenfalls eine geringe Adhäsion auftritt.
Im Hinblick auf weitere Anwendungen würde ein tiefergehendes Verständnis bzw. eine Charakterisierung der molekularen Wechselwirkungen zwischen einem Peptid oder Protein bzw. einem Peptid- oder Proteinfragment und bestimmten Oberflächen es beispielsweise auch ermöglichen, gezielt (gewünschte) adhäsive Peptid- oder Proteinmotive herzustellen, um bestimmte Oberflächen (z.B. durch Ankopplung von Biomolekülen) gezielt zu beschichten. Neben bereits bekannten Anwendungen solcher Wechselwirkungen in Enzym-basierten Sensoren oder diagnostischen Tests (z.B. Immunadsorption/ELISA) bietet es sich z.B. auch an, Oberflächen gezielt derart zu modifizieren, dass ihnen damit neue oder verbesserte Eigenschaften (z. B. Haftungs-, Reinigungs-, Reibungs- oder Glanzeigenschaften) verliehen werden.
Da die molekularen Zusammenhänge, die bei bestimmten Protein- bzw. Peptidadsorptionen eine Rolle spielen, bislang häufig nicht ausreichend verstanden sind, sind Vorhersagen über das Adsorptionsverhalten bestimmter Sequenzmotive an einer Materialoberfläche in der Regel kaum möglich. Die Auswahl von – für eine (bio)technologische Anwendung – geeigneten Materialien beansprucht daher einen erheblichen experimentellen, zeit- und kostenintensiven Aufwand und ist häufig weitgehend vom Zufall abhängig.
Daher besteht nach wie vor ein großes Interesse an schnellen und effizienten experimentellen Methoden, um die oberflächenadhäsiven Eigenschaften von Peptiden und Proteinen sowohl qualitativ als auch quantitativ beurteilen zu können und, gegebenenfalls auch durch Computersimulationen gestützte, Vorhersagen über das Adsorptionsverhalten von bestimmten Peptidmotiven an Substratoberflächen treffen zu können.
Die derzeit gängigen Methoden zum Auffinden von Peptiden bzw. Aminosäuresequenzen, die an bestimmte Materialien spezifisch binden bzw. adsorbieren, sind in der Regel kombinatorische biologische Verfahren wie das Phage-Display und das Cell-Surface-Display, bei denen kurze Peptide auf der Außenseite von (Bakterio-)Phagen, Bakterien oder höheren Zellen präsentiert werden. Die Peptide stammen hierbei meist aus einer Bibliothek von rekombinant erzeugten zufälligen Sequenzen. Nach dem Kontakt mit der Testoberfläche wird analysiert, welche der Organismen daran gebunden haben, und die für die Bindung maßgebliche Peptidsequenz ermittelt. Phage-Display und Cell-Surface-Display sind bereits bei der Selektion von Peptiden, die spezifisch an anorganische Materialien binden, angewandt worden (Sarikaya et al. Nature Materials, 2003, 2, 577–585; Sarikaya et al. Annual Review of Materials Research, 2004, 34, 373–408; Tamerler et al. Philosophical Transactions of the Royal Society A, 2009, 367, 1705–1726; Shiba et al. Current Opinion in Biotechnology, 2010, 21, 412–425).
Da jedoch bei den Display-Techniken eine in vivo Selektion stattfindet, sind diese Verfahren sehr aufwendig, insbesondere da sie mehrere Iterationsschritte erfordern und mit den Problemen biotechnologischer Methoden behaftet sind. So müssen die zu untersuchenden Aminosäuresequenzen beispielsweise codiert im Phagen bzw. Zellgenom integriert werden, wobei der Erfolg dieses Schrittes stark von der Transformationseffizienz des Organismus abhängt. In einer Sequenz auftretende Stop-Codons können zu einem eventuell unerwünschten vorzeitigen Abbruch der Translation führen, so dass bestimmte Aminosäuresequenzen bzw. Peptidfragmente nur unvollständig präsentiert werden können. Weiterhin wird die Oberfläche durch den Kontakt mit biologischem Medium unter Umständen chemisch oder physikalisch modifiziert, wodurch die Ergebnisse verfälscht werden können. Zudem sind die bei den Display-Techniken präsentierten Peptide an Oberflächenproteine der Phagen bzw. Zellen fusioniert, wodurch ihre Struktur und Funktionalität deutlich von dem frei in Lösung vorliegenden Peptid abweichen kann. Schließlich kann der Phage bzw. die Zelle, auf dessen bzw. deren Oberfläche das Peptid präsentiert wird, auch die Adsorption eines Peptids oder insbesondere mehrerer Peptide nebeneinander durch eine räumliche Behinderung beeinflussen bzw. beeinträchtigen.
Ein Ansatz, die Adsorption von kurzen synthetischen Peptiden an eine Metalloberfläche zu erklären, wurde beispielsweise von Imamura et al. (Journal of Bioscience and Bioengineering, 2007, 103, 7–12) unternommen. Dazu wurde das Adsorptionsverhalten von Octapeptiden mit 0 bis 4 Aspartat-(sauer) bzw. 0 bis 4 Lysin-(basisch) Einheiten an Ti-Partikel bei verschiedenen pH Werten experimentell untersucht. Ergänzend wurden in theoretischen Studien die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den (bei verschiedenen pH Werten unterschiedlich geladenen) Aminosäureresten und der Titanoxidoberfläche und die daraus resultierenden bevorzugten Orientierungen der Peptide auf der Partikeloberfläche simuliert.
Mittlerweile werden Methoden der Massenspektrometrie (MS) standardmäßig zur Identifikation von Proteinen bzw. Peptiden verwendet. Dabei ermöglicht die Analyse von spezifischen Spaltprodukten auch Aussagen über die Struktur oder Interaktionen von Proteinen miteinander oder mit anderen Materialien. MS-basierte Sequenzierungen oder Strukturaufklärungen umfassen meist zumindest einen Schritt, bei dem die Probe einem proteolytischen Verdau unterzogen wird. Anschließend müssen die Protein- bzw. Peptidfragmente ionisiert und in die Gasphase überführt werden. Dazu wird die Probe üblicherweise zunächst durch Co-Kristallisation in eine Matrix eingebaut und dann mit einem Laser ionisiert (matrix assisted laser desorption ionisation; MALDI) oder die in Lösung vorliegende Probe wird in ein elektrisches Feld gesprüht und dabei ionisiert (electron spray ionisation; ESI). MS-Analysen von komplexeren Protein/Peptid-Mischungen bedürfen jedoch meist einer aufwendigen Probenvorbereitung.
In WO 02074927 A2 wird eine Methode zur Identifizierung von Proteinen in komplexen Mischungen aus Biomolekülen beschrieben. Das zu untersuchende Protein (oder eine Mischung, die das Protein enthält) wird dabei fragmentiert (spezifischer oder unspezifischer Verdau), und anschließend wird von einem Aliquot der Probe, enthaltend alle Fragmente des Proteins, ein Peptidfragmentmassenprofil erstellt, während ein oder mehrere weitere Aliquot(s) zunächst durch z. B. chromatographische, elektrophoretische oder (beliebige andere) Trennverfahren weiter aufgetrennt wird bzw. werden. Die resultierende(n) Fraktion(en) wird bzw. werden dann getrennt entsprechend analysiert. Die Auswertung erfolgt elektronisch mittels Vergleich aller Fragmentmassenprofile der Fraktionen mit Datenbank-Einträgen.
WO 09080308 A1 gibt Methoden an, um Proteine, die durch sogenannte „cross-linking fixatives” in einer spezifischen Struktur, beispielsweise in einer bestimmten Faltung oder intermolekularen Wechselwirkung, fixiert sind, zu untersuchen. Diese Proben werden auf einer Oberfläche adsorbiert und dann durch Endoproteasen verdaut, um im Anschluss die erhaltenen Spaltungsprodukte mittels Massenspektrometrie zu analysieren.
WO 02061047 A2 betrifft eine Apparatur und Verfahren zur Identifikation und Sequenzierung von Proteinen mittels Tandem-Massenspektrometrie. Dabei werden die zu untersuchenden Analyten aus einer heterogenen Probe durch ein Affinitäts-Reagenz auf einer Adsorptionsoberfläche konzentriert und durch Laser-Desorption/Ionisierung untersucht.
Leize et al. beschreiben in Analytical Biochemistry 1999, 272, 19–25 eine quantitative Methode, um die Interaktion von Proteinen mit Metalloberflächen zu untersuchen. Dabei werden die adsorbierten Proteine durch Verwendung einer stark sauren Matrixlösung von der Metalloberfläche abgelöst und nach Co-Kristallisation in der Matrixlösung mittels MALDI analysiert. Aus den Studien konnten Erkenntnisse über die Adsorptionskinetik von Lysozym an Titanoberflächen von Zahnimplantaten gewonnen werden.
In Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2003, 14, 203–214 wird von Doucette et al. berichtet, welchen Effekt Oberflächenchemie und Oberflächenmorphologie auf den Verdau von oberfächengebundenen Proteinen hat. Die Peptidfragmente des auf der Oberfläche verdauten Proteins wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert und mit denen des in Lösung verdauten Proteins verglichen.
Durch proteolytischen Verdau und anschließende massenspektroskopische Analyse können auch an eine bakterielle Zelloberfäche gebundene Peptide identifiziert werden (Severin et al. Journal of Bacteriology, 2007, 189, 1514–1522).
Die vorstehend beschriebenen Methoden haben den Nachteil, dass die Messungen entweder direkt auf der Oberfläche stattfinden und diese dementsprechend MS kompatibel sein muss oder die adsorbierten Proteine/Peptide in einem zusätzlichen Schritt wieder von der Oberfläche abgelöst werden müssen, bevor sie analysiert werden können. Dabei werden die Proteine/Peptide meist mit weiteren Reagenzien (z. B. Fixierungsmittel, Affinitäts-Reagenz, stark saure Matrixlösung) behandelt, die sowohl die Adsorptionseigenschaften der Proteine/Peptide, als auch die Beschaffenheit der Oberfläche verändern können.
Es war daher eine primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine schnelle und effiziente Methode zur Verfügung zu stellen, die es erlaubt, sowohl oberflächenadhäsive Peptidmotive, als auch anti-adhäsive Peptidmotive zu identifizieren, und die für eine breite Auswahl an Materialien unabhängig von deren Oberflächenbeschaffenheit anwendbar ist. Eine weitere Aufgabe bestand darin, eine kostengünstige und einfache Identifikation solcher Materialien zu ermöglichen, die für bestimmte Anwendungen mit Peptiden oder Proteinen geeignet sind, insbesondere solche Materialien, die als Verpackungsmaterialien für Proteine bzw. Peptide oder Protein- bzw. Peptid-haltige Zusammensetzungen geeignet sind.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden diese Aufgaben insbesondere durch die Einführung eines Depletion-Assays gelöst, bei dem (anstelle der Untersuchung adsorbierter Peptide) eine Ausgangsmischung und im Vergleich hierzu ein Probenüberstand untersucht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher primär ein Verfahren zum Charakterisieren oberflächenadhäsiver Eigenschaften eines Peptids oder Proteins umfassend folgende Schritte:

(i) Bereitstellen einer Probenmischung enthaltend zwei oder mehr Peptidfragmente, vorzugsweise eine Vielzahl von Peptidfragmenten, eines (oder mehrerer; vgl. hierzu die Ausführungen weiter unten) zu charakterisierenden Peptids oder Proteins;
(ii) Bestimmen der Peptidfragmentmassen der in der Probenmischung enthaltenen Peptidfragmente mittels Massensprektrometrie und Erstellen eines Referenz-Peptidmassenfingerprints;
(iii) Auftragen der Probenmischung (oder einer Teilmenge davon) auf eine anorganische oder organische Substratoberfläche hinsichtlich derer die oberflächenadhäsiven Eigenschaften des Peptids bzw. Proteins charakterisiert werden sollen;
(v) Bestimmen der Peptidfragmentmassen der in der (aufgetragenen) Probenmischung enthaltenen, nicht an die Substratoberfläche gebundenen Peptidfragmente mittels Massensprektrometrie und Erstellen eines Peptidmassenfingerprints;
(vi) Vergleich des in Schritt (ii) bestimmten Referenz-Peptidmassenfingerprints mit dem in Schritt (v) bestimmten Peptidmassenfingerprint und Identifizieren des bzw. eines, mehrerer oder sämtlicher an die Substratoberfläche gebundener Peptidfragmente und/oder eines, mehrerer oder sämtlicher nicht an die Substratoberfläche gebundener Peptidfragmente.

Die hierin beschriebenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens sind nicht notwendigerweise in der vorstehend beschriebenen Reihenfolge durchzuführen. Insbesondere kann es sich beispielsweise anbieten, lediglich einen Teil einer in Schritt (i) bereitgestellten Probenmischung gemäß Schritt (iii) auf die anorganische oder organische Substratoberfläche aufzutragen und einen weiteren Teil der in Schritt (i) bereitgestellten Probenmischung (Referenz) zunächst zurückzuhalten, um die Schritte (ii) und (v) gleichzeitig, d.h. in einem Messvorgang, durchzuführen (vgl. hierzu 1).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „Protein” vorzugsweise alle natürlich vorkommenden oder synthetischen Polymere, die Aminosäuren als Monomere enthalten. Aminosäuren können dabei natürlich vorkommende Aminosäuren, deren strukturelle Derivate sowie nicht natürlich vorkommende, modifizierte oder synthetische Analoga sein, die in der Lage sind, Peptidbindungen auszubilden. Unter den Begriff „Peptid” fallen demnach auch Proteine, die aus einer beliebig kleinen Anzahl von Aminosäuren aufgebaut sind. „Peptidfragmente” (wie hierin beschrieben) besitzen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise eine Kettenlänge von 2 bis 100 Aminosäuren, vorzugsweise von 2 bis 50 Aminosäuren, insbesondere von 2 bis 20 Aminosäuren, und können sowohl durch enzymatische, chemische oder physikalische Fragmentierung eines größeren Peptids bzw. Proteins, als auch durch Synthese aus ihren Aminosäure-Bausteinen bereitgestellt werden.
Um einen „Peptidmassenfingerprint” zu erhalten, wird eine analytische Technik angewendet, um Proteine bzw. Peptide oder Fragmente davon, die in einer zu untersuchenden Mischung (z.B. einer Probenmischung wie hierin beschrieben) enthalten sind, anhand ihrer absoluten Molekularmasse zu identifizieren bzw. zu charakterisieren. Das zu untersuchende Protein oder Peptid wird hierbei üblicherweise zunächst fragmentiert, und anschließend werden die absoluten Massen der Fragmente mittels Massenspektrometrie bestimmt. Die Massen der Fragmente können dann mit denen bekannter Fragmente verglichen werden. Dazu werden vorzugsweise digitale Datenbanken herangezogen und durch entsprechende Computerprogramme Übereinstimmungen identifiziert.
Eine „Substratoberfläche” (auch als Oberfläche bezeichnet) bezeichnet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung insbesondere die Oberfläche eines anorganischen, organischen oder biologischen beschichteten oder unbeschichteten Materials beliebiger Morphologie.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Auftragen” jedes Inkontaktbringen einer Probenmischung mit einer Substratoberfläche.
Unter „Adhäsion” werden im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung alle Effekte von Oberflächen(an-)haftung bezeichnet, bei denen eine spezifische oder unspezifische attraktive Wechselwirkung zwischen einem Peptidfragment und einer Oberfläche auftritt. Sie umfasst vor allem Adsorptionsprozesse, wie Chemisorption und Physisorption. Unter „Chemisorption” ist eine Ausbildung einer oder mehrerer chemische(n/r) Bindung(en) zwischen einem Peptidfragment und der Substratoberfläche zu verstehen. Bei der „Physisorption” wird ein Peptidfragment durch physikalische Kräfte auf der Substratoberfläche angelagert. Dazu zählen insbesondere elektrostatische Wechselwirkungen und Van-der-Waals-Kräfte oder London‘sche Dispersionskräfte, d.h. elektrostatische Wechselwirkungen zwischen induzierten, fluktuierenden Dipolen, aber auch rein morphologische Effekte.
Im Gegensatz zu den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren wird im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens ein für die Zwecke von Schritt (v) entnommener Überstand oder einer Teilmenge davon nach gegebenenfalls erfolgter Adsorption auf gegenüber der Probenmischung (siehe Schritte (i) und (ii)) fehlende (d.h. adsorbierte) Komponenten untersucht. Aus dem Vergleich des erhaltenen Peptidmassenfingerprints mit dem Referenz-Peptidmassenfingerprint (siehe Schritt (ii)) werden dann Rückschlüsse auf das Adhäsionsverhalten aller ursprünglich in der Probenmischung enthaltenen Peptidfragmente gezogen. Demnach können vorteilhafterweise nicht nur Peptidfragmente mit adhäsiven Eigenschaften, sondern auch gezielt Peptidfragmente mit anti-adhäsiven Eigenschaften identifiziert werden. Zudem erlaubt eine Analyse der Peakflächen/-intensitäten auch eine relative Aussage darüber, welche Peptidfragmente einen vergleichsweise stärkeren oder schwächeren adhäsiven Charakter haben.
Die untersuchten Peptidfragmente und Oberflächen sind vorzugsweise unbehandelt, so dass die Ergebnisse vorteilhafterweise nicht wie bei den oben beschriebenen Verfahren des Standes der Technik durch chemische oder physikalische Modifikation der Peptide bzw. Oberflächen verfälscht werden. Das Verfahren ist daher vorteilhafterweise auch, unabhängig von der chemischen oder morphologischen Beschaffenheit der Oberfläche, für beliebige Materialien anwendbar. Weiterhin sind vorteilhafterweise keine Zwischenschritte wie Wasch- oder Desorptionsschritte notwendig, wodurch eine Kontamination mit weiteren Substanzen vermieden und rasch Ergebnisse erzielt werden können.
Zudem müssen bei der erfindungsgemäßen Depletion-Technique keine rekombinanten Peptidbibliotheken (vgl. oben) verwendet werden. Dadurch können die zu untersuchenden Proteine oder Peptide bzw. Protein- oder Peptidfragmente auf wesentliche Strukturmotive reduziert werden. Somit ist es möglich, gezielt zu untersuchen, welche Domäne bzw. welches Motiv innerhalb eines untersuchten bzw. zu charakterisierenden Proteins bzw. Peptids für die Adsorption entscheidend ist. Dem Fachmann stehen zahlreiche bioinformatische Methoden bzw. Software-Skripten und Datenbanken zu Verfügung, die eine weitgehende Automatisierung solcher Studien erlauben. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierte Peptidfragmente können anschließend auch mit weiteren experimentellen Methoden, z. B. XPS (X-ray photoelectron spectroscopy), IR(Infrarot)-Spektroskopie, ZPM (zeta potential measurements), QCM (quarz crystal microbalance), SPR (surface plasmon resonance), AFM (atomic force microscopy), weiter auf ihre Funktion bzw. die Affinität, Geometrie oder Spezifität ihrer Bindung an die Oberfläche hin untersucht werden. Dazu können die Peptide bzw. Peptidfragmente auch mit einem Label (z.B. ein Fluoreszenzfarbstoff) versehen und auf den jeweiligen Materialien getestet werden, beispielsweise mit Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzpolarisation oder FRET (fluorescence resonance energy transfer).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es gelungen, nachzuweisen, dass eine Korrelation zwischen der Abnahme (bis hin zu einem Verschwinden) bzw. dem Gleichbleiben der MS-Peakflächen im (Teil-)Überstand vor und nach Kontakt der Peptidfragmente mit der Oberfläche und dem Adsorptionsverhalten der zugehörigen Peptidfragmente besteht (siehe hierzu die Beispiele 1 und 2). Obwohl (quantitative) Einschätzungen der Menge an adsorbiertem Protein(-fragment) bzw. Peptid durch Analyse der Konzentrationsverringerung im Überstand (solution depletion) in der Literatur beschrieben sind (Imamura et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2007, 103, 7–12; Hlady et al. Methods in Enzymology, 1999, 309, 402–429), war die Tatsache, dass die Korrelation mit den MS-Peakflächen zu brauchbaren (insbesonderen qualitativen) Aussagen über das Adsorptionsverhalten führt und gleichzeitig eine Selektion und Identifikation adhäsiver bzw. antiadhäsiver Peptidfragmente erlaubt, für den Fachmann nicht naheliegend und wurde nun erstmals mittels umfangreicher Untersuchungen verifiziert. Im Rahmen eigener Untersuchungen konnte durch komplementäre experimentelle Methoden, z.B. high-performance liquid chromatography (HPLC), QCM und AFM, sowie parallele Vergleichsexperimente bestätigt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist, nicht bzw. schwach oder stark bindende Peptidfragmente in einer Probenmischung zu identifizieren (siehe hierzu die Beispiele 3, 4 und 5). Obwohl verschiedene Peptide unterschiedliche Ionisierungspotentiale besitzen und daher bei MALDI ToF-Experimenten unterschiedlich stark beschleunigen, wurde gezeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch eine relative Evaluation der Oberflächenaffinität verschiedener Peptide bzw. Peptidfragmente erlaubt (siehe hierzu ebenfalls die beigefügten Beispiele). Zusätzlich wurden die Ergebnisse durch Molecular Dynamics(MD)-Simulationen gestützt (siehe hierzu Beispiel 6).
Gemäß einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die auf der Substratoberfläche aufgetragene Probenmischung in einem zusätzlichen Schritt (iv) unter Bedingungen inkubiert, die eine Adhäsion, vorzugsweise eine Adsorption, Chemisorption und/oder Physisorption, etwaiger in der Probenmischung enthaltener oberflächenadhäsiver Peptidfragmente an der Substratoberfläche ermöglicht.
So wird beispielsweise durch Inkubation über einen gewissen Zeitraum und gegebenenfalls unter Schütteln – abhängig von in der Probenmischung enthaltenen Peptidfragmenten und der Beschaffenheit der Oberfläche – vorteilhafterweise eine vollständige Durchmischung gewährleistet und eine unspezifische Ablagerung von Peptidfragmenten an der Oberfläche oder eine Aggregation von Peptidfragmenten in der Lösung verhindert.
In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besitzen die bzw. ein, mehrere oder sämtliche der in der Probenmischung enthaltenen Peptidfragmente, bevorzugt sämtliche der in der Probenmischung enthaltenen Peptidfragmente, eine Kettenlänge im Bereich von 2 bis 100 Aminosäuren, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 50 Aminosäuren, besonders bevorzugt im Bereich von 2 bis 20 Aminosäuren.
Liegen in der Probenmischung nur Peptidfragmente der oben angegebenen bzw. als bevorzugt angegebenen Kettenlängen vor, dann ist eine eindeutige Identifikation der stark und schwach bindenden Peptide und eine Charakterisierung ihres Adsorptionsverhaltens besonders gut möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher insbesondere geeignet, um Peptidfragmente einer solchen Länge hinsichtlich ihres adhäsiven Verhaltens zu charakterisieren. Längere Peptidfragmente können vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter fragmentiert werden, um eine bevorzugte Fragmentlänge zu erhalten.
Die in einem erfindungsgemäßen Verfahren in Schritt (i) bereitzustellende Probenmischung wird vorzugsweise durch enzymatisches, chemisches und/oder physikalisches Fragmentieren eines Peptids oder Proteins und/oder durch Synthese der einzelnen Peptidfragmente bereitgestellt.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit sowohl relevante Proteine auf ihre für die Adsorption entscheidenden Domänen oder Strukturmotive bzw. Sequenzen zu testen bzw. zu untersuchen, als auch gezielt relevante Strukturmotive herzustellen, z.B. um die Resultate vorangegangener Untersuchungen zu verifizieren oder detailierter betrachten zu können oder auch um neue, synthetisch hergestellte und gegebenenfalls für bestimmte Anwendungen einsetzbare Strukturmotive zu identifizieren.
Die in Schritt (i) bereitzustellende Probenmischung wird vorzugsweise durch

a) proteolytischen Verdau eines Peptids oder Proteins, vorzugsweise unter Verwendung einer oder mehrerer Proteasen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, Chymotrypsin, Arg-C, Asp-N, Lys-C, Lys-N, Glu-C, Pepsin, Papain, Proteinase K und Proteinase V8, und/oder
b) chemische und/oder physikalische Fragmentierungsprozesse, vorzugsweise unter Verwendung von CNBr oder mittels Stoßionisation, bereitgestellt.

Für die Fragmentierung größerer Peptide bzw. Proteine zur Bereitstellung der Probenmischung in Schritt (i) steht, falls erforderlich, grundsätzlich eine ganze Reihe von Möglichkeiten zur Verfügung. Durch proteolytischen Verdau mit z.B. einer Protease können, je nach Spezifität des verwendeten Enzyms, gezielt bestimmte Peptidfragmente erhalten werden. Dies ermöglicht, bei bekannter Sequenz des untersuchten Proteins, eine Vorhersage darüber treffen zu können, welche Peptidfragmente in der Probenmischung vorliegen und möglicherweise an die Oberfläche adsorbieren können. Einzelne Domänen und Sequenzmotive können somit gezielt identifiziert und auf ihre Adsorptionseigenschaften hin untersucht werden. Chemische und physikalische Fragmentierungsprozesse können ebenfalls mehr oder weniger spezifisch sein; beispielsweise schneidet CNBr am C-Terminus von Methionin-Einheiten. Je nach Behandlung des Ausgangsproteins oder -peptids können jedoch auch zufällige Spaltprodukte generiert und untersucht werden.
Die in Schritt (i) bereitgestellte Probenmischung kann zudem zwei oder mehr Peptidfragmente, vorzugsweise eine Vielzahl von Peptidfragmenten, eines weiteren zu untersuchenden Peptids oder Proteins oder mehrerer weiterer zu untersuchender Peptide und/oder Proteine enthalten.
So können auch komplexe Mischungen von Proteinen oder Peptiden, wie sie beispielsweise in einer biologischen Probe vorliegen können, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auf adhäsive bzw. anti-adhäsive Peptidfragmente untersucht werden. Nachdem im ersten Schritt gegebenenfalls näher zu charakterisierende Peptidfragmente identifiziert worden sind, kann die Suche nach bestimmten adhäsiven oder anti-adhäsiven Peptidmotiven innerhalb dieser Fragmente verfeinert werden.
Alternativ enthält die Probenmischung neben den zwei oder mehr Peptidfragmenten des zu untersuchenden Peptids oder Proteins keine weiteren Peptidfragmente eines anderen Peptids oder Proteins. In diesem Fall kann ganz gezielt nach Bindungsmotiven eines relevanten Peptids oder Proteins gesucht werden.
Erfindungsgemäß werden die Peptidfragmentmassen in Schritt (ii) und/oder Schritt (v) mittels Massenspektrometrie bestimmt, insbesondere mittels MALDI ToF-MS, wobei die Peptidfragmentmassen in Schritt (ii) und Schritt (v) vorzugsweise mittels identischer Methoden bestimmt werden.
Besonders bevorzugt wird in einem erfindungsgemäßen Verfahren die Massenanalyse durch MALDI ToF-Massenspektrometrie durchgeführt. Dabei handelt es sich um eine Methode, bei der matrix assisted laser desorption ionisation (MALDI) mit einem Flugzeitanalysator (time of flight; ToF) kombiniert wird. Diese Methode hat sich als besonders geeignet für die Analyse von Biopolymeren erwiesen. Zu ihren Vorteilen zählen, dass nur geringe Probenmengen notwendig sind, eine präzise Massendetektion möglich ist und simultan verschiedene Analyten detektiert werden können ohne dass eine vorherige Separation nötig ist. Zudem können theoretisch unbegrenzt große Molekülmassen detektiert werden.
Da bei Verwendung der erfindungsgemäßen Depletion-Technique nur Proben des Überstandes bzw. eines Teils davon analysiert werden müssen, ist das Verfahren im Prinzip vorteilhafterweise unbegrenzt für beliebige Oberflächen anwendbar. Besonders interessant sind jedoch solche Oberflächen bzw. Materialien, die im Zusammenhang mit der diagnostischen oder therapeutischen Bedeutung von Proteinen und Peptiden Anwendung finden. Daneben sind auch technische Materialien, die mit biologischem Material in Kontakt kommen, sowie biotechnologische Systeme von besonderem Interesse.
Vorzugsweise umfasst oder besteht die Substratoberfläche oder das gesamte Substrat aus einem oder mehreren Materialien ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
Polymere, insbesondere Thermoplasten, beispielsweise Polystyrol, Polyethylen, PEEK, Duroplasten, Biopolymere, insbesondere PLA, Membranen oder Biomembranen, künstliche und natürliche Gläser, insbesondere Kalk-Natron-Glas, Quarzglas, Bleiglas und Borosilikatglas, Glaskeramiken oder Keramiken, Siliciumdioxide und Siliciumdioxid enthaltende Materialien.
Bevorzugt sind auch Substratoberflächen, die eine durch Plasma- oder Sputterprozesse beschichtete Oberfläche oder eine oxidierte metallische Oberfläche, insbesondere aus Titandioxid oder Aluminiumdioxid, aufweisen bzw. sind.
In einer bevorzugten Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht die Substratoberfläche oder das gesamte Substrat aus einem Material, das als Verpackungsmaterial geeignet ist, insbesondere als Verpackungsmaterial zur Aufbewahrung von Peptiden und/oder Proteinen bzw. von Peptide und/oder Proteine enthaltenden Mischungen oder Zubereitungen, vorzugsweise zur Aufbewahrung des bzw. eines im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zu charakterisierenden Peptids oder Proteins bzw. einer ein solches Peptid bzw. ein solches Protein enthaltenden Mischung oder Zubereitung.
Erfindungsgemäß wird daher auch ein Verfahren zur Identifikation eines Materials angegeben, das als Verpackungsmaterial zur Aufbewahrung von Peptiden und/oder Proteinen bzw. von Peptide und/oder Proteine enthaltenden Mischungen oder Zubereitungen geeignet ist, vorzugsweise zur Aufbewahrung des bzw. eines im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens zu charakterisierenden Peptids oder Proteins bzw. einer ein solches Peptid bzw. ein solches Protein enthaltenden Mischung oder Zubereitung, wobei, jeweils unter Anwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens, unterschiedliche gegebenenfalls als Verpackungsmaterialien geeignete, zu untersuchende Materialien in Schritt (iii) für die Substratoberfläche bzw. als Substrat verwendet werden.
Angesichts der eingangs erwähnten (zunehmenden) Bedeutung von Protein-basierten Medikamenten, aber auch anderer wissenschaftlicher oder gewerblicher Anwendungen von Proteinen (z.B. biotechnologische Verfahren) liefert das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifikation geeigneter Verpackungsmaterialien eine schnelle und effiziente Möglichkeit, Verluste der oft teuren und in kleinen Mengen verpackten Substanzen zu vermeiden, um diese effizienter nutzen zu können (vgl. hierzu Beispiel 2).
Außerdem können die aus einem erfindungsgemäßen Verfahren (wie oben beschrieben) gewonnenen Erkenntnisse genutzt werden, um empfindliche technische Anwendungen, z.B. Sensoren oder Solarzellen, gegen Schädigung oder Ausfall durch Biofouling zu schützen, z.B. indem Materialien oder entsprechende Beschichtungen verwendet werden, die eine Adhäsion der Organismen und dementsprechend eine Filmbildung verhindern. Auch bei Baumaterialien und Maschinen, die über lange Zeiträume dem Kontakt mit Mikroorganismen ausgesetzt sind, beispielweise unter Wasser oder unter der Erde, sind entsprechende Anwendungen denkbar. So könnte beispielsweise ein Bewachsen mit Algen oder die Bildung von Schimmel verhindert oder zumindest verlangsamt werden.
Andererseits können im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Materialien identifiziert werden, an die bestimmte Peptidmotive bevorzugt binden. Wie eingangs bereits erwähnt, ist dies z. B. im Bereich von Implantaten von Bedeutung, da geeignete Materialien beispielsweise ein schnelles Einwachsen ins Gewebe ermöglichen oder zumindest unterstützen. Durch im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnene Erkenntnisse können die Eigenschaften bestimmter Oberflächen (z.B. von Implantaten) auch gezielt modifiziert werden.
Weiterhin können unterschiedliche Materialien bzw. Substanzen über ein adhäsives Peptidmotiv aneinander gekoppelt werden. Mögliche Anwendungen sind die Herstellung von Oberflächen für Arrays oder Sensoren, beispielsweise für diagnostische Anwendungen. Zudem können (Bio-)Moleküle gezielt an Oberflächen angekoppelt werden, um deren physikalische Eigenschaften zu beeinflussen (z.B. Glanz- oder Reibungseigenschaften). Auf diese Weise kann z.B. auch die Biokompatibilität (beispielsweise bezüglich einer Immunreaktion) von diagnostischen oder therapeutischen Mitteln oder ihre gerichtete Anreicherung an Wirkorten (drug-targeting), je nach Art ihrer Verabreichung oder Anwendung, sei es z.B. als bewegliches magnetisches (Nano-)Partikel oder festes Implantat, positiv beeinflusst werden.
Im Bereich der biologischen Materialien können zudem die Oberflächen von Knochen, Zähnen, Haut oder Haaren von Bedeutung sein. In diesem Zusammenhang sind zahlreiche therapeutische und kosmetische Anwendungen adhäsiver bzw. antiadhäsiver Peptidmotive denkbar.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können auch kinetische Aspekte des Adsorptionsverhaltens der Peptidfragmente untersucht werden. Dazu wird Schritt (v) vorzugsweise ein oder mehrere Male mit nacheinander entnommenen Proben (Teilmengen des Überstands) wiederholt, um jeweils nach spezifischen Zeitabständen die Peptidfragmentmassen der in der Probenmischung enthaltenen, nicht an die Substratoberfläche gebundenen Peptidfragmente zu bestimmen.
In Beispiel 1 wurde die Entwicklung der MS-Peakfläche von Lysozym in einer Lösung, die mit einer Substratoberfläche in Kontakt stand, über einen Zeitraum von 48 Stunden beobachtet. Da sich hierbei ein klassisches Adsorptionsverhalten zeigte (siehe ), ist das erfindungsgemäße Verfahren nachweislich auch insbesondere für kinetische Untersuchungen der Adsorption geeignet.
Gemäß einem weiteren, bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung kann auch die Aminosäuresequenz der im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens identifizierten adhäsiven oder antiadhäsiven Peptidfragmente bestimmt werden, wobei ein erfindungsgemäßes Verfahren (wie oben beschriebene) dann zusätzlich folgenden Schritt umfasst:

(vii) Bestimmen oder Identifizieren, vorzugsweise mittels Datenbankrecherche, der Aminosäuresequenz(en) des bzw. der in Schritt (vi) identifizierten Peptidfragmente.

Durch den Abgleich der gemessenen Peakdaten (Massenliste, Peptidmassenfingerprint) mit den in Datenbanken hinterlegten Informationen unter Berücksichtigung einiger Parameter (z. B. Toleranzen durch technische Messungenauigkeiten) können im Idealfall alle Peaks direkt einer Aminosäuresequenz zugeordnet werden. Für den Abgleich mit einer Datenbank kann beispielsweise der Suchalgorithmus der MASCOT-Datenbank verwendet werden (Perkins et al. Electrophoresis, 1999, 20(18), 3551–3567).
Es ist jedoch auch möglich, die Sequenzen identifizierter Peptide (gegebenenfalls nach Aufreinigung) experimentell zu bestimmen. Dem Fachmann sind dazu Verfahren aus der Literatur bekannt (z.B. Edmann-Sequenzierung, HPLC).
Proteine oder Peptide, die für die Charakterisierung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren von besonderem Interesse sind, sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen zur diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung, vorzugsweise Antikörpern.
Daneben kann jedoch grundsätzlich auch das Oberflächenadhäsionsverhalten sämtlicher Proteine, Peptide und Peptidfragmente mit (bio)technologisch, kosmetisch, physikalisch oder chemisch relevanten Eigenschaften im Rahmen eines erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können auch Molecular Dynamics(MD)-Simulationen zum weiteren Verständnis von Adsorptionsprozessen beitragen. Computersimulationen werden immer häufiger dazu verwendet, Wechselwirkungen auf molekularer Ebene zu verstehen und Vorhersagen über Bindungsgeometrien oder Bindungsaffinitäten zu machen. Erkennungsmuster zwischen Peptid- oder Proteinmotiven, die zu spezifischen Wechselwirkungen führen, spielen dabei eine besondere Rolle. Um Vorhersagen auch im Bezug auf Peptid bzw. Protein/Oberflächen Wechselwirkungen machen zu können, können die experimentellen Ergebnisse aus dem erfindungsgemäßen Verfahren durch Computersimulationen gestützt bzw. auf molekularer Ebene erklärt werden (siehe dazu Beispiel 6). Umgekehrt können die aus dem erfindungsgemäßen Assay gewonnenen Erkenntnisse auch Input-Daten für eine Verbesserung oder Weiterentwicklung der Computersimulationen liefern.
Schließlich könnte das erfindungsgemäße Verfahren auf Grund seiner einfachen Durchführbarkeit auch, beispielsweise mit Hilfe eines Spotting-Roboters, automatisiert werden, wodurch große Mengen an Peptiden oder Peptidmischungen bezüglich ihrer Adhäsion an unterschiedlichen Oberflächen schnell und effizient gescreent werden können.
Der vorliegenden Beschreibung sind folgende Abbildungen bzw. Figuren beigefügt:
1: Schematische (beispielhafte) Darstellung der Depletion-Technique und Auswertung der MALDI ToF-Spektren.
2: Entwicklung der MALDI ToF-Peakfläche von Lysozym in einer Lösung, die mit Borsilikatglas in Kontakt steht, über einen Zeitraum von 48 Stunden.
3: MALDI ToF-Spektrum der Lösung mit Trypsin verdautem Lysozym.
4: Kinetiken von vier Beispielpeptiden (A–D) aus einem Lysozym-Verdau jeweils nach Kontakt mit SiO₂ und Borosilikatglas
5: Vergleich der Konzentrationsbestimmungen mittels MALDI in 10 Schritten über einen Zeitraum von 40 min und mittels HPLC nach 0 und 40 min.
6: QCM-Messungen der Peptide eines Lysozym-Verdaus.
7: AFM-Aufnahmen verschiedener Peptide, adsorbiert an ein oxidiertes Si-Plättchen
Im Folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand von Beispielen und unter Bezugnahme auf die Abbildungen bzw. Figuren näher erläutert.
Beispiele:
Die MALDI ToF-MS Messungen in den Beispielen wurden an einer Voyager-DE^TM PRO Biospectrometry Workstation von Applied Biosciences mit der Voyager Control Panel Software (Darmstadt, Deutschland) durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mit der Data Explorer 4.0 Software von Applied Biosciences. Alle Messungen wurden auf polierten Stahl-Targets beschichtet mit einer CHCA(α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, Sigma, Deutschland, C-2020-10G)-Dünnschicht-Matrix ausgeführt. Diese wurde mit einer gesättigten CHCA-Lösung in 100% Aceton frisch hergestellt, die unmittelbar vor Beginn der MALDI-Experimente getrocknet wurde.
In den Beispielen wurden als Substratoberflächen Si-Plättchen (Silchem Handelsgesellschaft mbH, Freiberg, Deutschland) und Glasvials (Schott AG, Mainz, Deutschland) verwendet. Die Glasvials waren zum einen aus Standard-Borosilikatglas und zum anderen sogenannte Typ I Plus Glasvials, deren Innenwand mit reinem amorphen SiO₂ mittels plasma impulse chemical vapor deposition (PICVD) beschichtet wurde. Beide Typen von Glasvials hatten dabei die gleichen Dimensionen von 40 mm Höhe und einem Durchmesser von 22 mm (Wanddicke: 1 mm).
Beispiel 1: Lysozym-Adsorption
Um zu verifizieren, dass bei einer Proteinadsorption die MALDI ToF-Peakfläche des Proteins im Überstand kleiner wird, wurde eine Lösung von unverdautem Lysozym mit Borosilikatglas in Kontakt gebracht und die Peakfläche über einen Zeitraum von 48 Stunden gemessen.
Für das Adsorptionsexperiment wurden 4 mL einer Lysozym-Lösung (0.5 mg in 1 mL 400mM NH₄HCO₃-Puffer, Sigma-Aldrich, Deutschland, Cat. No. L4919-5G) in ein Borosilikatglas-Vial gefüllt und bei 100 rpm auf einem Schüttler (IKA KS 260 basic, Staufen, Deutschland) inkubiert. Nach 0, 2, 4, 20, 24, 26, 28, 44, 46 und 48 Stunden wurden jeweils 0.5 L Proben aus dem Überstand entnommen. Jede Probe wurde direkt auf das MALDI-Target pipettiert, mit einer CHCA-Matrix bedeckt und bei Raumtemperatur getrocknet. Um statistisch relevante Messungen zu erhalten, wurden von jeder Probe 5 Spektren mit 200 Laserschüssen aus getrennten Spots gemessen. Die Beschleunigungsspannung wurde auf 25,000 Volt und die Verzögerungszeit auf 750 ns eingestellt. Es wurde ein Massenbereich von 5 bis 20 kDA beobachtet.
Die zeitabhängige Entwicklung der Peakflächen (siehe 2) zeigte ein klassisches Adsorptionsverhalten, mit einem starken Anstieg an adsorbiertem Protein zu Beginn und einer späteren Stabilisation um einen Plateau-Wert. Demnach ist die erfindungsgemäße Depletion-Technique geeignet, um direkt im Überstand einer Probe, die sich in Kontakt mit einer bestimmten Oberfläche befindet, eine Peptid(-fragment)-Adsorption zu messen.
Beispiel 2: Adsorption von verdautem Lysozym auf unterschiedlichen Oberflächen
Lysozym (Sigma-Aldrich, Deutschland, Cat. No. L4919-5G) wurde mit Trypsin (Sigma-Aldrich, T6567-5X20UG, Proteomics Grade) über Nacht bei 37 °C in 400 mM NH₄HCO₃-Puffer in einem Gewichtsverhältnis von Trypsin zu Lysozym von 1 zu 25 inkubiert. Vor dem Verdau wurde das Trypsin mit DTT (Dithiotreitol, 45 mM) bei 50°C für 15 min reduziert und dann mit 100 mM Iodacetamid (IAA) bei Raumtemperatur für 15 min alkyliert, um bessere Ergebnisse beim Verdau zu erhalten. Der Verdau wurde durch Gefrieren der Lösung gestoppt. Anschließend wurden die Peptidfragmente auf die für die MALDI Messungen benötigte Konzentration verdünnt und unverzüglich weiterverwendet.
Die Messungen der Adsorption der Peptidfragmente wurden analog zu denen des unverdauten Lysozyms über 48 Stunden mit einer Peptidkonzentration von 0.1 mg/mL, einer Beschleunigungsspannung von 20,000 Volt und einer Verzögerungszeit von 80 ns durchgeführt. Zwischen 5 und 10 Spots wurden jedesmal gemessen, wobei Spektren im Bereich von 0.4 bis 2.5 kDA mit 100 Laserschüssen pro Spektrum aufgenommen wurden. Ein MALDI ToF-Spektrum des verdauten Lysozym ist in 3 gezeigt.
Unter Verwendung des MASCOT-Datenbank Suchalgorithmus (Perkins et al. Electrophoresis, 1999, 20(18), 3551–3567) konnte eine Sequenz zu jedem Masse/Ladungs-Peak zugeordnet werden, womit 78% der Sequenz abgedeckt waren.
Die Probenmischung wurde mit Borosilikatglas- und SiO₂-beschichteten Glasoberflächen typischer Glasgefäße, wie sie für die Aufbewahrung pharmazeutischer Lösungen verwendet werden, in Kontakt gebracht.
Die Entwicklung der Peakflächen im Verlauf der Zeit zeigte eine drastische Verringerung der Menge an Peptid in der Lösung, die mit dem Borosilikatglas in Kontakt war. Im Gegensatz dazu wurde kaum eine bzw. gar keine Verringerung der Peakflächen in der Lösung, die mit der SiO₂-beschichteten Glasoberfläche in Kontakt stand, beobachtet. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass die Plasma-Behandlung der Oberfläche eine Proteinadhäsion erfolgreich verhindern kann (4).
Beispiel 3: Identifikation und Charakterisierung des Adsorptionsverhaltens eines schwach und eines stark bindenden Peptidfragments
Borosolikatglas wurde ausgewählt, um zwischen einem stark und einem schwach bindenden Peptidfragment des verdauten Lysozyms (siehe oben, Beispiel 2) zu unterscheiden. Es wurden exemplarisch zwei Peptidfragmente anhand der Entwicklung ihrer jeweiligen Peakflächen über den experimentellen Zeitraum als schwach bzw. stark bindend klassifiziert. Die Sequenzen wurden unter Zuhilfenahme der MASCOT-Datenbank bestimmt: die Sequenz GCRL (im Folgenden P1 genannt) mit einer Masse von 505 Da repräsentiert dabei ein schwach bindendes Peptid und die Sequenz WWCNDGR (im Folgenden P2 genannt) mit einer Masse von 994 Da ein stark bindendes Peptid. Die zugehörigen Massenpeaks sind in 3 markiert.
Um das beobachtete Adsorptionsverhalten mit den reinen Peptiden zu verifizieren, um z. B. Konkurrenzeffekte, die in einer Peptidmischung auftreten können, zu vermeiden, wurden die beiden Peptide P1 und P2 synthetisch hergestellt.
Beide Peptide wurden mittels Festphasensynthese nach Merrifield hergestellt. Dazu wurden ein Peptide Synthesizer von Applied Biosciences (433A) und das FastMoc Protocol (Applied Biosystems, 2002) verwendet. Die Aminosäuren und das TCP-Harz wurden von IRIS Biotech GmbH (Deutschland) bzw. PepChem (Reutlingen, Deutschland) erworben. Die Aktivierung der Carbonsäure wurde mit einer 0.5 M Mischung HBTU (2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat) und HBT (1-Hydroxybenzotriazol) in DMF (N,N-Dimethylformamid) durchgeführt. Nach der Synthese wurden die Peptide von der festen Phase durch Zugabe von 3.6 mL Trifluoressigsäure (TFA), 0.2 mL Triisopropylamin (Roth, Deutschland) und 0.2 mL Wasser abgespalten. Die Lösung wurde kurz geschüttelt und für 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Peptide wurden durch Filtration und direkte Präzipitation in eiskaltem Butylmethylether (Cat. No. T175.1, Sigma, Deutschland) aufgereinigt. Nach Zentrifugation bei 3,500 rpm für 10 min wurde der Überstand entfernt, das Pellet mit flüssigem N₂ gefroren und in 15 mL Röhrchen (VWR) gefriergetrocknet. Die synthetisierten Peptide wurden dann mit MALDI ToF-MS auf ihre korrekte Masse und mit HPLC (BioCad 700E Perfusion Chromatography Workstation, C18-Säule) auf ihre Reinheit getestet.
Die Adsorptionskinetiken der synthetisierten Peptide wurden wie für die Peptidfragmentmischung beschrieben auf Borosilikatglas mit MALDI ToF-MS gemessen. Zum Vergleich wurden die Messungen parallel mit zwei weiteren Peptiden durchgeführt, die von einer anderen Arbeitsgruppe als stark bzw. schwach an Quarz bindend klassifiziert worden waren (Oren et al. Langmuir, 2010, 26, 11003–11009). Dabei handelt es sich um die Sequenzen PPPWLPYMPPWS (P3, stark-bindend) und CINQEGAGSKDK (P4, schwach-bindend). Für alle vier Peptide wurde der erwartete schwach bzw. stark bindende Charakter durch die Messungen bestätigt.
Beispiel 4: Verifikation des Adsorptionsverhaltens mittels HPLC (siehe hierzu Fig. 5)
Zum Vergleich mit der detektierten Konzentrationsverringerung in den Lösungen der synthetisierten Peptide wurden die Konzentrationen dieser Lösungen sofort und 40 min nach Kontakt mit der Oberfläche mittels HPLC bestimmt.
Die HPLC Messungen wurden durchgeführt, indem 1 mL einer Lösung mit 0.1 mg/mL des jeweiligen synthetischen Peptides und 400 mM NH₄HCO₃ mit der Borosilikatglas-Oberfläche in Kontakt gebracht wurde. 100 L Proben wurden nach 0 und 40 min genommen, die Lösung in der Zwischenzeit mit 100 rpm geschüttelt und die Proben in das HPLC-System injiziert. Von 0 bis 7 min wurde das System mit 100 % Lösemittel B equilibriert, von 7 bis 27 min wurden die Peptide von der Säule eluiert, indem ein Anteil an Lösemittel A bis 70 % zugegeben wurde. Diese Zusammensetzung wurde für 5 min beibehalten. Im letzten Schritt wurde über einen Zeitraum von 7 min der Anteil an Lösemittel A auf 0 % reduziert und der Anteil an Lösemittel B auf 100 % erhöht. Lösemittel A bestand aus reinem Acetonitril (HPLC Grade, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit 0.1 % Trifluoressigsäure (TFA, Roth, Karlsruhe, Deutschland). Lösemittel B war reines Wasser (HPLC Grade, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit 0.1 % Trifluoressigsäure (TFA, Roth, Karlsruhe, Deutschland).
Der Vergleich der Ergebnisse mit denen der MALDI ToF-Messungen bestätigte den schwachen bzw. starken Bindungscharakter von P1 und P2.
Beispiel 5: Verifikation des Adsorptionsverhaltens mittels QCM und AFM
Um die schwache bzw. starke Bindung von den Peptiden P1 und P2 auf SiO₂-Oberflächen zu bestätigen wurden zusätzlich komplementäre AFM- und QCM-Messungen durchgeführt.
Eine QCM (quartz crystal microbalance; Quarzkristall-Mikrowaage) wird verwendet, um die Masse eines auf einer Oberfläche adsorbierten Materials zu bestimmen. Dabei wird die Abhängigkeit der Schwingungsfrequenz eines Schwingquarzes von der Masse des an seiner Oberfläche adsorbierten Materials ausgenutzt. Mit dieser Methode sind auch Vorhersagen über die quasi-real-time Adsorptionskinetik möglich.
Für die QCM-Messungen wurde ein Q-Sense E4-System der Firma Biolin Scientific verwendet. Alle zu testenden Peptide wurden in 400 mM NH₄HCO₃-Puffer in einer Konzentration von 0.1 mg/mL vorgelegt. Der Quarzkristall (Q-Sense, QSX 303, SiO₂) wurde zunächst für 30 Minuten an der Luft und dann für weitere 30 Minuten in Puffer equilibriert. Die Durchflussgeschwindigkeit wurde auf 80 L/min angepasst. Die gemessenen Frequenzänderungen wurden mit der PRISM Software (v. 5.01, GraphPad Software Inc., San Diego, Kalifornien) analysiert.
Die QCM-Messungen zeigten, dass bei Peptid P2 kurze Zeit nach dem Kontakt mit der Oberfläche eine Adhäsion stattfindet. Im Gegensatz dazu ist bei Peptid P1 keine Adsorption messbar (vgl. 6).
AFM (atomic force microscopy) erlaubt es, die Beschaffenheit einer Probenoberfläche mit einer Auflösung im Nanometer-Bereich zu untersuchen und abzubilden. Zudem kann die Adhäsionskraft direkt gemessen werden.
Ein JPK Nanowizard II AFM wurde verwendet, um die Oberflächen-Scans in Flüssigkeit (AC mode) mit Si nanosensor probes (ACTA) von AppNano Company (Santa Clara, USA) und mit einer nominalen Federkonstante von 40 N/m und einem Spitzenradius von 6 nm aufzunehmen. Die visuelle Analyse wurde mit der JPK Data Processing Software (v. spm-4.2.16) durchgeführt. Für die Abbildung an einem Si-Plättchen wurde das Plättchen in für AFM-Untersuchungen geeignete Stücke geschnitten. Jedes Stück wurde mit Piranha-Lösung (H₂O₂:H₂SO₄, 1:2) gewaschen und ausgiebig mit Wasser gespült. 500 L Peptid-Lösung (5 ng/ L in ddH₂O) wurden auf jedem Plättchen für 30 min inkubiert und anschließend mit ddH₂O abgespült. Die Proben wurden dann in eine AFM-Flüssigzelle transferiert. Die Bilder (1 × 1 m) wurden mit einer Scan Rate von 1 Hz (512 × 512 Zeilen) bei Raumtemperatur in ddH₂O aufgenommen.
Die AFM-Bilder von den Peptiden P1 und P2, adsorbiert an ein oxidiertes Si-Plättchen, sind in 7 wiedergegeben. P2 zeigt darauf eine größere Abdeckung der Oberfläche als P1.
Beispiel 6: Molecular Dynamics-Simulationen der Adsorptionsprozesse
Molecular Dynamics(MD)-Simulationen wurden durchgeführt, um die Bindungsmechanismen der Peptide on die Oxidoberflächen auf atomarer Ebene zu erklären.
Für die klassischen Gleichgewichts-MD-Simulationen wurden das AMBER Kraftfeld (Cornell et al., 1995) und das TIP3P Wassermodell in Kombination mit einem eigenen Kraftfeld für die Wechselwirkungen zwischen oxidierten Si-Oberflächen und Proteinhaltigen wässrigen Lösungen (Cole et al. Journal of Chemical Physics, 2007, 127, 204704/1–204704/12; Butenuth et al., Physica Status Solidi B, 2012, 249, 292–305.) verwendet. Die Oberfläche wurde mit einer realistischen Struktur des nativ oxidierten (100) Si, wie sie in vorangegangenen Arbeiten bestimmt und verwendet wurde (Colombi Ciacchi, Physical Review Letters, 2005, 95, 196101/1–196101/4; Colombi Ciacchi, J. Phys. Chem. C, 2008, 112, 12077–12080, Cole et al. Journal of Chemical Physics, 2007, 127, 204704/1–204704/12, Butenuth et al., Physica Status Solidi B, 2012, 249, 292–305, Schneider, J. Am. Chem. Soc., 2012, 134, 2407–2413), modelliert. Die Oberfläche hatte sowohl neutrale Silanol-Gruppen als auch negativ geladene, deprotonierte Silanol-Termini (Oberflächenladungsdichte –0.136C/m²). Das Oberflächenmodell bedeckte eine Fläche von 43.49 × 43.49 Å². Na⁺-Gegenionen wurden mit eingeschlossen, um die Ladungsneutralität des Systems zu gewährleisten. Die Simulationen wurden unter Verwendung des LAMMPS-Code (Plimpton, Journal of Computational Physics, 1995, 117, 1–19) ausgeführt. Der Zeitschritt wurde bei 1 fs angesetzt, die nicht-bindenden Wechselwirkungen wurden bei einer Entfernung von 12.0 Å unterbrochen und die elektrostatischen Wechselwirkungen wurden durch die particle-particle particle-mesh (PPPM) Methode beschrieben, wie sie in dem Code implementiert ist. Die Struktur des Peptids wurde in Lösung für 6 ns bei 450 und 300 K equilibriert, bevor es in nahen Kontakt mit dem Substrat gebracht wurde, wo es ein weiteres Mal für 1 ns bei 450 K und für 10 ns bei 300 K equilibriert wurde. Dieses Protokoll wurde mehrere male wiederholt, um verschiedene mögliche Konformationen des adsorbierten Peptids zu untersuchen.
In den MD-Simulationen adsorbierten beide Peptide P1 und P2 spontan an die Oberfläche. Es wurden zwei Hauptadsorptionsmodi identifiziert, von denen einer von beiden Peptiden eingenommen werden kann, der andere jedoch nur von P2. Im ersten Adsorptionsmodus ziehen negativ geladene Oberflächen-Termini polare Einheiten an, insbesondere die positiv geladenen R-Endgruppen und die N-terminalen Ammoniumgruppen. Diese Gruppen nehmen einen Platz in Regionen mit höherer Wasserdichte an der Oberfläche ein, wo sie Wasserstoffbrücken mit Oberflächengruppen und physisorbierten Wassermolekülen ausbilden. Gemäß dem zweiten Adsorptionsmodus bindet P2 zusätzlich über seine zwei Tryptophan-Einheiten, die sich oberhalb hydrophober Oberflächenbereiche mit niedriger Wasserdichte anlagern. Dieser zusätzliche Adsorptionsmodus kann dazu herangezogen werden die experimentell beobachtete höhere Bindungsaffinität von P2 zu erklären.

Claims

Verfahren zum Charakterisieren oberflächenadhäsiver Eigenschaften eines Peptids oder Proteins, umfassend folgende Schritte: (i) Bereitstellen einer Probenmischung enthaltend zwei oder mehr Peptidfragmente eines zu charakterisierenden Peptids oder Proteins; (ii) Bestimmen der Peptidfragmentmassen der in der Probenmischung enthaltenen Peptidfragmente mittels Massensprektrometrie und Erstellen eines Referenz-Peptidmassenfingerprints; (iii) Auftragen der Probenmischung auf eine anorganische oder organische Substratoberfläche hinsichtlich derer die oberflächen-adhäsiven Eigenschaften des Peptids bzw. Proteins charakterisiert werden sollen; (v) Bestimmen der Peptidfragmentmassen der in der Probenmischung enthaltenen, nicht an die Substratoberfläche gebundenen Peptidfragmente mittels Massensprektrometrie und Erstellen eines Peptidmassenfingerprints; (vi) Vergleich des in Schritt (ii) bestimmten Referenz-Peptidmassenfingerprints mit dem in Schritt (v) bestimmten Peptidmassenfingerprint und Identifizieren des bzw. eines, mehrerer oder sämtlicher an die Substratoberfläche gebundener Peptidfragmente und/oder eines, mehrerer oder sämtlicher nicht an die Substratoberfläche gebundener Peptidfragmente.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend zudem den Schritt (iv) Inkubieren der auf die Substratoberfläche aufgetragenen Probenmischung unter Bedingungen, die eine Adhäsion, vorzugsweise eine Adsorption, Chemisorption und/oder Physisorption, etwaiger in der Probenmischung enthaltener oberflächenadhäsiver Peptidfragmente an der Substratoberfläche ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die bzw. ein, mehrere oder sämtliche der in der Probenmischung enthaltenen Peptidfragmente, bevorzugt sämtliche der in der Probenmischung enthaltenen Peptidfragmente, eine Kettenlänge im Bereich von 2 bis 100 Aminosäuren besitzen, vorzugsweise im Bereich von 2 bis 50 Aminosäuren, besonders bevorzugt im Bereich von 2 bis 20 Aminosäuren.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die in Schritt (i) bereitzustellende Probenmischung durch enzymatisches, chemisches und/oder physikalisches Fragmentieren eines Peptids oder Proteins und/oder durch Synthese der einzelnen Peptidfragmente bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die in Schritt (i) bereitzustellende Probenmischung durch a) proteolytischen Verdau eines Peptids oder Proteins, vorzugsweise unter Verwendung einer oder mehrerer Proteasen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Trypsin, Chymotrypsin, Arg-C, Asp-N, Lys-C, Lys-N, Glu-C, Pepsin, Papain, Proteinase K und Proteinase V8, und/oder b) chemische und/oder physikalische Fragmentierungsprozesse, vorzugsweise unter Verwendung von CNBr oder mittels Stoßionisation, bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Probenmischung zudem zwei oder mehr Peptidfragmente, vorzugsweise eine Vielzahl von Peptidfragmenten, eines weiteren zu untersuchenden Peptids oder Proteins oder mehrerer weiterer zu untersuchender Peptide und/oder Proteine enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Probenmischung neben den zwei oder mehr Peptidfragmenten des zu untersuchenden Peptids oder Proteins keine weiteren Peptidfragmente eines anderen Peptids oder Proteins enthält.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Peptidfragmentmassen in Schritt (ii) und/oder Schritt (v) mittels Massenspektrometrie bestimmt werden, insbesondere mittels MALDI ToF-MS, wobei die Peptidfragmentmassen in Schritt (ii) und Schritt (v) vorzugsweise mittels identischer Methoden bestimmt werden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Substratoberfläche oder das gesamte Substrat ein oder mehrere Materialien ausgewählt aus der folgenden Gruppe umfasst oder daraus besteht: Polymere, insbesondere Thermoplasten, beispielsweise Polystyrol, Polyethylen, PEEK, Duroplasten, Biopolymere, insbesondere PLA, Membranen oder Biomembranen, künstliche und natürliche Gläser, insbesondere Kalk-Natron-Glas, Quarzglas, Bleiglas und Borosilikatglas, Glaskeramiken oder Keramiken, Siliciumdioxide und Siliciumdioxid enthaltende Materialien; oder wobei die Substratoberfläche eine durch Plasma- oder Sputterprozesse beschichtete Oberfläche oder eine oxidierte metallische Oberfläche, insbesondere aus Titandioxid oder Aluminiumdioxid, ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Substratoberfläche oder das gesamte Substrat aus einem Material besteht, das als Verpackungsmaterial geeignet ist, insbesondere als Verpackungsmaterial zur Aufbewahrung von Peptiden und/oder Proteinen bzw. von Peptide und/oder Proteine enthaltenden Mischungen oder Zubereitungen, vorzugsweise zur Aufbewahrung des bzw. eines im Rahmen des Verfahrens zu charakterisierenden Peptids oder Proteins bzw. einer ein solches Peptid bzw. ein solches Protein enthaltenden Mischung oder Zubereitung.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei Schritt (v) ein oder mehrere Male wiederholt wird, um jeweils nach spezifischen Zeitabständen die Peptidfragmentmassen der in der Probenmischung enthaltenen, nicht an die Substratoberfläche gebundenen Peptidfragmente zu bestimmen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, umfassend zudem den Schritt (vii) Bestimmen oder Identifizieren, vorzugsweise mittels Datenbankrecherche, der Aminosäuresequenz(en) des bzw. der in Schritt (vi) identifizierten Peptidfragmente.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das zu charakterisierende Peptid oder Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen zur diagnostischen und/oder therapeutischen Anwendung, vorzugsweise Antikörpern.
Verfahren zur Identifikation eines Materials, das als Verpackungsmaterial zur Aufbewahrung von Peptiden und/oder Proteinen bzw. von Peptide und/oder Proteine enthaltenden Mischungen oder Zubereitungen geeignet ist, vorzugsweise zur Aufbewahrung des bzw. eines im Rahmen eines Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche zu charakterisierenden Peptids oder Proteins bzw. einer ein solches Peptid bzw. ein solches Protein enthaltenden Mischung oder Zubereitung, wobei, jeweils unter Anwendung eines Verfahrens nach einem der vorangehenden Ansprüche, unterschiedliche gegebenenfalls als Verpackungsmaterialien geeignete, zu untersuchende Materialien in Schritt (iii) für die Substratoberfläche bzw. als Substrat verwendet werden.