CN114829927A - 用于质谱蛋白质分析的材料和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了表征蛋白质或多肽和/或鉴定蛋白质或多肽上的剪切位点的系统、工艺和方法。在一些实施方案中，所述系统、工艺和方法包括报告离子的生成和随后由该报告离子触发的串联质谱法。
Description
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相关申请的交叉引用
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技术领域
本发明涉及鉴定和表征多肽以及蛋白质或多肽上的剪切位点的方法。在一个方面，本发明涉及经由报告离子的生成和随后由报告离子触发的串联质谱法来鉴定蛋白质或多肽的剪切位点的方法。
发明内容
蛋白质工程技术的最新进展已经使在结构和构象多样性方面独特的新型治疗方式成为可能(AlDeghaither等人，J.Clin.Pharmacol.，2015，55，增刊3：S4-20)。这些新药也容易受不利因素影响，包括可损害疗效和安全特性的快速蛋白水解降解。蛋白质的剪切是普遍存在的，并且可以在培养中或在工艺开发期间发生，并且最常归因于宿主细胞来源的蛋白酶，这些蛋白酶为位点特异性的或具有广泛范围的底物特异性(Dorai等人，Biotechnology and Bioengineering，2009，103：162-176；Dorai等人，BiotechnologyProgress，2011，27：220-231)。剪切也可经由非酶促机制发生，其中大量易于剪切的位点受到诸如以下的因素影响：侧链的类型、由于二级、三级和四级结构引起的局部柔性改变以及常用于评估位点可开发性的分析前变量(例如，pH、温度、金属和自由基)(Vlasak和Ionescu，mAbs，2011，3：253-263；Jarasch，J.Pharm.Sci.，2015，104：1885-1898)。剪切的物类的水平以及用于监测纯度和完整性的分析方法是产品或工艺的关键质量属性的一部分(Torkashvand等人，Iranian Biomedical Journal，2017，21：131-141；Duval等人，Biotechnology Progress，2012，28：608-622)。
完整的或裂解的蛋白质的N端序列的鉴定对于蛋白质生物化学和结构表征至关重要。在常规的鸟枪蛋白质组学分析中，由于不常检测到蛋白质N端肽，因此难以鉴定蛋白质N端。由于要对复杂蛋白质消化物中存在的最丰富的肽进行测序，通过鸟枪质谱法来表征蛋白质治疗性的剪切位点具有挑战性。剪切的物类的相对低化学计量可潜在地导致不能检测到具有新N端的肽。此外，溶液内和源内碎裂伪影可潜在地导致经质谱法测序的新N端肽的假阳性鉴定。
发明内容
本领域仍然需要用于开发鉴定和表征多肽和多肽上的剪切位点的方法。本发明解决了这些需求。
在一个总体方面，本发明涉及一种表征多肽的方法，该方法包括：
(i)用N端标记试剂标记多肽以获得标记的多肽；
(ii)消化标记的多肽以生成包含一种或多种未标记的肽和一种或多种标记的肽的混合物；
(iii)使混合物经受液相色谱法(LC)以生成LC的洗脱液；
(iv)使洗脱液经受电子诱导解离质谱法，诸如电子转移解离(ETD)或电子捕获解离(ECD)质谱法，以获得一种或多种标记的肽中的每种标记的肽的质谱，诸如ETD质谱或ECD质谱；
(v)通过在一种或多种标记的肽中的每种标记的肽的所述质谱(诸如ETD质谱或ECD质谱)中检测报告离子来鉴定一种或多种标记的肽中的每种标记的肽；
(vi)使鉴定的标记的肽中的每种鉴定的标记的肽经受第二质谱法，从而生成标记的肽中的每种标记的肽的第二质谱；以及
(vii)通过分析标记的肽中的每种标记的肽的ETD质谱或ECD质谱和第二质谱来表征多肽。
在一些实施方案中，N端标记试剂是N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)。在进一步的实施方案中，标记的多肽是TMPP标记的多肽，并且标记的肽是TMPP标记的肽。
在一些实施方案中，报告离子是TMPP报告离子。在进一步的实施方案中，TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
在一些实施方案中，第二质谱法是碰撞诱导解离(CID)质谱法、高能碰撞解离(HCD)质谱法或紫外光解离(UVPD)质谱法。在进一步的实施方案中，标记的肽的第二质谱是TMPP标记的肽的CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。
在某些实施方案中，TMPP报告离子触发CID质谱法、HCD质谱法或UVPD质谱法。
在另一个总体方面，本发明涉及一种鉴定蛋白质上的剪切位点的方法，该方法包括：
(i)获得含有蛋白质的一种或多种剪切的多肽的样品；
(ii)用N端标记试剂标记一种或多种剪切的多肽以获得一种或多种标记的剪切的多肽；
(iii)消化标记的剪切的多肽以生成包含未标记的肽和标记的肽的混合物；
(iv)使混合物经受液相色谱法(LC)以生成所述LC的洗脱液；
(v)使洗脱液经受电子诱导解离串联质谱法，诸如电子转移解离(ETD)或电子捕获解离(ECD)质谱法，以获得标记的肽中的每种标记的肽的质谱，诸如ETD质谱或ECD质谱；
(vi)通过在标记的肽中的每种标记的肽的质谱(诸如ETD质谱或ECD质谱)中检测报告离子来鉴定标记的肽；
(vii)使鉴定的标记的肽经受第二质谱法，从而生成标记的肽中的每种标记的肽的第二质谱；以及
(viii)通过分析标记的肽中的每种标记的肽的ETD质谱或ECD质谱和第二质谱来表征所述多肽。
在一些实施方案中，N端标记试剂是N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)。在进一步的实施方案中，标记的多肽是TMPP标记的多肽，并且标记的肽是TMPP标记的肽。
在一些实施方案中，报告离子是TMPP报告离子。在进一步的实施方案中，TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
在一些实施方案中，第二质谱法是碰撞诱导解离(CID)质谱法、高能碰撞解离(HCD)质谱法或紫外光解离(UVPD)质谱法。在进一步的实施方案中，标记的肽的第二质谱是TMPP标记的肽的CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。
在某些实施方案中，TMPP报告离子触发CID质谱法、HCD质谱法或UVPD质谱法。
在另一个总体方面，本发明涉及一种鉴定蛋白质上的剪切位点的方法，该方法包括：
(i)获得含有蛋白质的一种或多种剪切的多肽的样品；
(ii)用N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记一种或多种剪切的多肽，从而获得一种或多种TMPP标记的剪切的多肽；
(iii)消化一种或多种TMPP标记的剪切的多肽以生成包含未标记的肽和TMPP标记的肽的混合物；
(iv)使混合物经受液相色谱法(LC)以生成LC的洗脱液；
(v)使洗脱液经受电子诱导解离质谱法，诸如电子转移解离(ETD)或电子捕获解离(ECD)质谱法，以获得TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的质谱，诸如ETD质谱或ECD质谱；
(vi)在TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的质谱(诸如ETD质谱或ECD质谱)中检测或分离TMPP报告离子；
(vii)在检测或分离TMPP报告离子后，使TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽经受碰撞诱导解离(CID)质谱法或高能碰撞解离(HCD)质谱法，从而分别为TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽生成CID质谱或HCD质谱；以及
(viii)通过分析TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的ETD质谱或ECD质谱和CID质谱或HCD质谱来鉴定所述蛋白质上的剪切位点。
在其他方面，本发明部分地涉及用于鉴定多肽上的剪切位点和/或表征样品中的多肽的系统。在各种实施方案中，该系统包括液相色谱(LC)装置和串联质谱仪。
在一个实施方案中，串联质谱仪包括：
(i)第一电离装置；
(ii)第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪，第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪在第一操作模式下被布置为并适于传输具有在第一范围内的质荷比的离子；
(iii)第一离子迁移谱仪、检测器或分离器；
(iv)衰减部件，该衰减部件用于在操作模式下使离子衰减；
(v)控制装置，该控制装置被配置为控制衰减部件的操作，使得具有在第一范围内的质荷比但具有一个或多个非期望的第一电荷状态的离子基本上被衰减；
(vi)第二电离装置；
(vii)第二离子迁移谱仪、检测器或分离器；以及
(viii)数据系统，该数据系统被配置为获取片段离子的非混合信号并对触发离子进行非冗余编码，非冗余编码被布置为避免或最小化在任何单独选通时间的多次重复时来自不同母体物类的任何两个离子信号的重复重叠。
在各种实施方案中，用N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记多肽上的剪切位点或多肽。在一个实施方案中，第一电离装置生成TMPP报告离子。
在一个实施方案中，样品经受LC装置以生成洗脱液。在一个实施方案中，洗脱液经受串联质谱法以获得第一质谱和第二质谱。
在一些实施方案中，通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析第一质谱和第二质谱。
在一个实施方案中，第一电离装置是电子诱导解离装置。在一些实施方案中，电子诱导解离装置是电子转移解离(ETD)装置或电子捕获解离(ECD)装置。
在一些实施方案中，第二电离装置是碰撞诱导解离(CID)装置、高能碰撞解离(HCD)装置或紫外光解离(UVPD)装置。
在一些实施方案中，质谱仪还包括碰撞装置、碎裂装置或反应装置。
在一些实施方案中，衰减部件包括离子门或离子障壁。在一个实施方案中，衰减部件被布置在离子迁移谱仪或分离器的下游。
在一些实施方案中，第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪被布置为并适于在第一操作模式下使具有在第一范围之外的质荷比的离子衰减。在一些实施方案中，第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪被布置在所述离子迁移谱仪或分离器的上游或下游。
在一些实施方案中，第一非期望的电荷状态选自以下各项中的一项或多项：(i)单电荷；(ii)双电荷；(iii)三电荷；(iv)四电荷；(v)五电荷；以及(vi)多电荷。
在一些实施方案中，该系统还包括被布置在所述离子迁移谱仪或分离器上游的离子引导器、离子阱或离子俘获区，其中所述离子引导器、离子阱或离子俘获区被布置为俘获、储存或累积离子，然后周期性地将离子以脉冲方式发射到所述离子迁移谱仪或分离器中或以脉冲方式向所述离子迁移谱仪或分离器发射离子。
在其他方面，本发明部分地涉及用于鉴定多肽上的剪切位点的报告离子。在一个实施方案中，用N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记该剪切位点。在一个实施方案中，使TMPP电离以生成报告离子。
在其他方面，本发明部分地涉及用于表征多肽的报告离子。在一个实施方案中，用N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记该多肽。在一个实施方案中，使TMPP电离以生成报告离子。
在一个实施方案中，通过质谱仪使TMPP电离以生成报告离子。在一个实施方案中，质谱仪是串联质谱仪。在各种实施方案中，串联质谱仪包括电子转移解离(ETD)装置、电子捕获解离(ECD)装置、碰撞诱导解离(CID)装置、高能碰撞解离(HCD)装置、紫外光解离(UVPD)装置或它们的任何组合。
在一些实施方案中，报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
在一些实施方案中，报告离子是具有以下结构的化合物：
在其他方面，本发明部分地涉及用于鉴定多肽上的剪切位点的组合物。
在其他方面，本发明部分地涉及用于表征多肽的组合物。
在各种实施方案中，该组合物包含至少一种本发明的报告离子和多肽。
在其他方面，本发明还部分地涉及用于鉴定多肽上的剪切位点或表征样品中的多肽的试剂盒，该试剂盒包含：用于标记该多肽上的剪切位点的N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)或用于标记该多肽的N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)；以及说明性材料。
根据以下公开内容，包括本发明的详细描述和其优选的实施方案以及所附权利要求书，本发明的其他方面、特征和优点将显而易见。
附图说明
当结合附图阅读本发明的各种实施方案的以下具体实施方式时，能更好地理解具体实施方式。出于例示本发明的目的，附图中示出了例示性实施方案。但是，应当理解，本发明不限于附图中示出的实施方案的精确布置和手段。
图1示出了与NIST抗体的轻链N端序列相对应的TMPP标记的肽DIQMTQSPSTL(序列标识号：1)的代表性ETD产物离子谱。质谱主要由诊断性TMPP报告离子(m/z＝533Da)和包含N端TMPP标签的c型主链产物离子(m/z＝590Da)组成。
图2A至图2C示出了533Da、590Da和573Da的报告离子的结构与其精确质量的示意图：图2A示出了533Da的(TMPP)+的报告离子的结构的示意图，图2B示出了590Da的(TMPP-Ac-NH2)+的报告离子的结构的示意图，并且图2C示出了573Da的(TMPP-Ac)+的报告离子的结构的示意图。图2D至图2E示出了用于在ETD(图2D)和HCD(图2E)中计算生成报告离子的效率的公式。
图3示出了TMPP标记后NIST消化物的代表性反相色谱缓冲液梯度和对应的总离子色谱图。大多数未标记的肽都以2％至30％有机溶剂在10分钟长的浅梯度中洗脱。替代肽对应于在12分钟洗脱的NIST抗体轻链的TMPP标记的N端。
图4A至图4Z示出了二十种TMPP标记的合成肽的代表性ETD-MS2和触发的CID-MS2光谱，这些TMPP标记的合成肽包括HK(图4A和图4B)、ADYEK(序列标识号：12)(图4C)、VYACEVTHQGLSSPVTK(序列标识号：13)(图4D)、SFNR(序列标识号：14)(图4E)、EAK(图4F)、VQWK(序列标识号：15)(图4G)、DTLMISR(序列标识号：16)(图4H)、FNWYVDGVEVHNAK(序列标识号：17)(图4I)、TKPR(序列标识号：18)(图4J)、EEQYNSTYR(序列标识号：19)(图4K)、VVSVLTVLHQDWLNGK(序列标识号：20)(图4L)、EYK(图4M)、CK(图4N)、GQPR(序列标识号：21)(图4O)、EPQVYTLPPSR(序列标识号：22)(图4P至图4R)、STSGGTAALGCLVKD(序列标识号：23)(图4S至图4U)、STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN(序列标识号：24)(图4V)、VVSLTVLHQDWLNGKE(序列标识号：25)(图4W至图4X)、VVSLTVLHQDWLNGK(序列标识号：26)(图4Y)和VSLTVLHQDWLNGK(序列标识号：27)(图4Z)。
图5A示出了展示作为所观察的保留时间的函数的肽强度并叠加有AcCN梯度的代表性结果，并且图5B示出了展示作为所观察的保留时间的函数的肽强度并叠加有AcCN梯度的代表性结果。
图6A示出了展示作为质量的函数的TMPP+ETD效率的代表性结果。图6B示出了展示作为序列长度的函数的TMPP+ETD效率的代表性结果。图6C示出了展示作为电荷的函数的TMPP+ETD效率的代表性结果。图6D示出了将强度差异展示为533和590诊断离子的效率的代表性结果，这两种诊断离子分别是TMPP+和TMPP-Ac-NH2 +。对于相同的肽，与533诊断离子(两位数效率值)相比，观察到590诊断离子的更小效率值(一位数)。因此，533诊断离子的强度显著高于590诊断离子。
图7A至图7D示出了代表性结果，其表明在考虑所有产物离子的情况下，总体ETD效率显示出细微的电荷状态依赖性降低。ETD效率可由图2D所示的公式定义。由Gunawardena等人(Gunawardena HP等人，2005，Journal of the American Chemical Society，127∶12627-12639)定义的初始％ETD效率为公式5，该公式是多肽的所有主链片段的总体ETD效率估计值(报告为百分比)。导出公式1至3，作为特定于报告离子的ETD效率的估计值。公式4是报告离子以及多肽的主链片段的ETD效率估计值。相比之下，图7C和图7D示出了代表性结果，其表明对于在忽略TMPP+报告离子的情况下由公式5估计的总体主链效率，ETD效率显示出电荷状态依赖性增加。图7A示出了使用公式4展示作为质量的函数的总体ETD效率的代表性结果。图7B示出了使用公式4展示作为电荷的函数的总体ETD效率的代表性结果。图7C示出了使用公式5展示作为质量的函数的总体ETD效率的代表性结果。图7D示出了使用公式5展示作为电荷的函数的总体ETD效率的代表性结果。图7E示出了使用公式6展示作为质量的函数的TMPP+HCD效率的代表性结果。图7F示出了使用公式6展示作为电荷的函数的TMPP+HCD效率的代表性结果。
图8示出了展示ETD效率和标记的肽之间的关系的代表性结果，该标记的肽按每种肽的酪氨酸和赖氨酸残基数目分组。
图9A示出了展示肽的反应或TMPP标记效率的总体分布的代表性结果。图9B示出了展示由公式7估计的肽的反应或TMPP标记效率的总体分布的代表性结果。
图10A至图10C示出了展示在标记的肽和未标记的肽中生成真阳性(TP)、假阳性(FP)、真阴性(TN)和假阴性(FN)的代表性结果。如图10A所指示，标记的肽产生特征性TMPP+报告离子，其为真阳性(TP)，而未标记的肽对应物不产生报告离子，其为真阴性(TN)。如图10B所指示，标记的肽产生特征性TMPP+报告离子，其为真阳性(TP)，而未标记的肽对应物产生质量类似于TMPP+报告离子的干扰离子，其为假阳性(FP)。如图10C所指示，经修饰的肽不产生诊断离子，其为假阴性(FN)，而未经修饰的肽对应物产生质量类似于TMPP+报告离子的干扰离子，其为假阳性(FP)。
图11A至图11D示出了展示每种诊断离子和洗脱时间的ROC曲线的曲线下面积(AUC)的代表性结果。图11A示出了TMPP+(533)诊断离子的代表性预测能力；图11B示出了TMPP肽保留时间的代表性预测能力；图11C示出了TMPP-Ac+(573)诊断离子的代表性预测能力；并且图1 1D示出了TMPP-Ac-NH2 +(591)诊断离子的代表性预测能力。
图12A至图12C示出了代表性MS/MS光谱，其显示了因蛋白酶活性生成的IAWLVK(序列标识号：5)序列的新N端的证据。图12A示出了由双电荷离子的ETD-MS2得到的代表性产物离子谱产生特征性诊断离子TMPP+(m/z＝533Da)。图12B示出了双电荷离子的代表性诊断报告离子(m/z＝533)触发的CID-MS2光谱。图12C示出了不存在诊断离子的非缀合肽的代表性ETD光谱。
图13A至图13C示出了代表性结果，其展示了与GLP1序列的顺序剪切相对应的替代肽的ETD-MS2和诊断离子触发的CID-MS2产物离子谱的证据。图13A示出了展示由I/A剪切得到的AWLVK(序列标识号：6)的替代肽的代表性结果。图13B示出了展示由A/W剪切得到的WLVK(序列标识号：7)的替代肽的代表性结果。图13C示出了展示由W/L剪切得到的LVK的替代肽的代表性结果。
图14示出了用于生成EFIAWLVK(序列标识号：3)、FIAWLVK(序列标识号：4)、IAWLVK(序列标识号：5)、AWLVK(序列标识号：6)、WLVK(序列标识号：7)和LVK的替代肽的度拉糖肽(序列标识号：2)的剪切位点的示意图。
图15A至图15B示出了度拉糖肽的替代肽的代表性提取离子色谱图(XIC)。图15A示出了没有TMPP标记的替代肽的代表性提取离子色谱图，这些替代肽包括序列标识号：4至7的肽和LVK的肽。图15B示出了标记的替代肽的代表性提取离子色谱图，这些标记的替代肽包括TMPP-FIAWLVK(序列标识号：8)、TMPP-IAWLVK(序列标识号：9)、TMPP-AWLVK(序列标识号：10)、TMPP-WLVK(序列标识号：11)和TMPP-LVK。XIC展示了每种TMPP标记的肽在10至13分钟之间的两个快速斜变期间洗脱。
图16A至图16C示出了经由不同解离模式展示LVK肽序列上的特征性报告离子的代表性结果。图16A示出了经由高能碰撞解离(HCD)展示LVK肽序列上的特征性报告离子的代表性结果。图16B示出了经由紫外光解离(UVPD)展示LVK肽序列上的特征性报告离子的代表性结果。图16C示出了经由电子转移解离(ETD)展示LVK肽序列上的特征性报告离子的代表性结果。
图17A至图17B示出了代表性结果，其展示了在组织蛋白酶D和不同pH的缓冲溶液及用于TMPP衍生化的缓冲组合物存在和不存在下，GLP1肽在F-I处的剪切。经组织蛋白酶D处理的样品被表示为+组织蛋白酶D，并且TMPP衍生化的样品被表示为+TMPP；x轴显示样品和反应条件：100mM MES pH6，100mM HEPES pH7，100mM磷酸钠pH8；与DMF预混合的TMPP试剂；PBS pH7中未反应的对照；y轴显示峰面积。图17A示出了前体肽FIAWLVK(序列标识号：4)和对应剪切产物IAWLVK(序列标识号：5)的提取离子色谱图(XIC)的代表性组，其中Y轴显示峰面积并且x轴显示保留时间。图17B示出了前体肽FIAWLVK(序列标识号：4)和对应剪切产物IAWLVK(序列标识号：5)的XIC的代表性峰面积。
具体实施方式
本发明部分地基于如下意外发现：TMPP标记与电子转移解离(ETD)质谱法联用生成了对于小胰蛋白酶肽最强的简单TMPP+报告离子。另外，本发明部分地基于如下意外发现：碰撞诱导解离(CID)-MS2光谱补充了ETD鉴定和触发的MS2扫描，从而提供了仅在观察到报告离子时才执行CID扫描的实时计算机(in silco)过滤机制。
因此，本发明部分地涉及用于表征蛋白质或多肽和/或鉴定蛋白质或多肽上的剪切位点的新型系统、工艺和方法。在各种实施方案中，该系统、工艺和方法包括用于在ETD时简单生成报告离子的高通量LC-MS。在一些实施方案中，报告离子的生成有利于后续的MS/MS分析。在一些实施方案中，MS/MS分析包括互补离子活化模式，诸如CID、高能碰撞解离(HCD)和/或紫外光解离(UVPD)，其经由强度和m/z依赖性触发事件来进一步对蛋白质或多肽进行测序。例如，在一个实施方案中，本发明聚焦于鉴定剪切的多肽的方法，包括ETD-MS2，其中TMPP衍生的报告离子触发MS2分析以自主过滤剪切的多肽。
定义
如本文所用，以下术语中的每个术语具有本节中与其相关联的含义。除非在别处定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于本发明的实践或检验中，但是描述了优选的方法和材料。
本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文，如同在本文中进行了充分阐述。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
冠词″一个″和″一种″在本文中用于指一个或多于一个(即至少一个)冠词的语法对象。以举例的方式，″元件″是指一个元件或多于一个元件。
除非另行指出，否则任何数值，诸如本文所述的浓度或浓度范围被理解为在所有情况下用术语″约″修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，约50ppm或更少的量包括45ppm或更少到55ppm或更少。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
术语″约″应被本领域普通技术人员理解并根据使用其的上下文中有某种程度的变化。如本文所用，在涉及可测量值诸如量、时距等等时，术语″约″意指涵盖与指定值±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±1％以及还更优选地±0.1％的变化，因为此类变化适合执行本发明所公开的方法。
贯穿本说明书和随后的权利要求书，除非上下文另有要求，否则词语″包括″以及诸如″包含″和″含有″的变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时，术语″包含″可用术语″含有″或″包括″替代，或者有时在本文使用时用术语″具有″替代。
当在本文使用时，″由......组成″排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时，″基本上由......组成″不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当在本文中用于本发明的一个方面或实施方案的情境时，任何前述术语″包含″、″含有″、″包括″和″具有″均可用术语″由......组成″或″基本上由......组成″替代以改变本公开的范围。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语″和/或″被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由″和/或″连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语″和/或″的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语″和/或″的要求。
如本文所用，″MS/MS″或″MS2″是指串联质谱法。串联质谱法是仪器分析中的一种技术，其中两个或更多个质量分析仪使用另外的反应步骤联接在一起以增加其分析样品的能力。可以在将反应步骤在空间中分开(空间上串联)和/或将反应步骤在时间上分开(时间上串联)是情况下进行质量分析的串联使用。串联质谱法的常用用途是分析生物分子，如蛋白质、肽、有机和无机分子、脂质、代谢物和寡核苷酸。
如本文所用，″报告离子″或″诊断离子″是指在ETD质谱中观察到的含有N端标签或标记的标记的肽或多肽的特征性产物离子。通常，它是质谱中最占优势的产物离子，并且用于触发后续的MS/MS事件以进一步对标记的肽或多肽进行测序。
当在本文中使用时，术语″标记″是指与探针直接或间接缀合以生成″标记的″探针的可检测化合物或组合物。该标记本身可以是可检测的(例如，小分子或电荷标记)。
术语″扩增″是指样品中存在的靶报告离子的拷贝数倍增的操作。
如本文所用，术语″肽″、″多肽″和″蛋白质″可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质序列或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括包含彼此通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语既指短链又指长链，短链在本领域中通常也被称为例如肽、寡肽和寡聚体，而长链在本领域中通常被称为蛋白质，其类型有很多。″多肽″包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或它们的任何组合。
如本文所用，术语″氨基酸″、″氨基酸单体″或″氨基酸残基″是指二十种天然存在的氨基酸、具有非天然侧链的合成氨基酸中的任一种，并包括D和L光学异构体。
如本文所用，术语″天然氨基酸″、″天然编码的氨基酸″、″天然存在的氨基酸″和″遗传编码的氨基酸″是指为二十种常见氨基酸之一或焦赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸。术语″天然氨基酸″包括但不限于蛋白原氨基酸。
″非天然氨基酸″是指不为二十种常见氨基酸之一或焦赖氨酸或硒代半胱氨酸的氨基酸。可与术语″非天然氨基酸″同义使用的其他术语是″非天然编码的氨基酸″、″非天然氨基酸″、″非天然存在的氨基酸″、″非遗传编码的氨基酸″以及它们的各种带连字符和未带连字符的形式。术语″非天然氨基酸″包括但不限于通过修饰天然编码的氨基酸(包括但不限于常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而天然存在的氨基酸，但其本身不通过翻译复合物掺入到生长的多肽链中。非天然编码的天然存在的氨基酸的示例包括但不限于N-乙酰葡糖氨基-L-丝氨酸、N-乙酰葡糖氨基-L-苏氨酸和O-磷酸酪氨酸。另外，术语″非天然氨基酸″包括但不限于非蛋白原氨基酸以及非天然存在并且可通过合成获得(例如，基于Q-脯氨酸的氨基酸)或可通过修饰非天然氨基酸获得的氨基酸。
″分离的″是指从自然状态改变或去除。例如，天然存在于活体动物中的蛋白质或肽不是″分离的″，但与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同蛋白质或肽是″分离的″。分离的肽或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞中。
如本文所用，术语″相同″是指相同的两个或更多个序列或子序列。
此外，如本文所用，术语″基本上相同″是指当在比较窗口或指定区域内进行比较和比对以获得最大对应性时，两个或更多个序列具有一定百分比的相同的连续单元，如使用比较算法或通过手动比对和目视检查所测量。仅以举例的方式，如果连续单元在指定区域内约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同或约95％相同，则两个或更多个序列可为″基本上相同的″。此类百分比描述两个或多个序列的″百分比同一性″。在长度为至少约75至100个连续单元的区域内、在长度为约50个连续单元的区域内或在未指定的情况下在整个序列中可存在序列的同一性。该定义也指测试序列的互补序列。
正如该术语在本文中使用的，″说明性材料″包括出版物、记录、图表或任何其他表达介质，其可用于传达试剂盒中本发明的报告离子、系统和/或方法用于鉴定多肽上的剪切位点或表征多肽的有用性。任选地或另选地，说明性材料可描述用TMPP标记多肽或多肽的剪切位点的一种或多种方法。任选地或另选地，说明性材料可描述使用本发明的系统或方法分析多肽上的TMPP标记的剪切位点或TMPP标记的多肽的一种或多种方法。试剂盒的说明性材料可例如附连到含有本发明的一种或多种组分的容器或与含有本发明的一种或多种组分的容器一起运输。另选地，说明性材料可与容器分开运输，目的是接收人协同地使用说明性材料和组分。
在整个本公开中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被理解为是对本发明范围的固定限制。因此，范围的描述应被视为具有明确公开的所有可能子范围以及该范围内的各个数值。例如，范围诸如1至6的描述应被视为具有明确公开的子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的各个数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度如何，这均适用。
说明
本发明部分地涉及用于表征蛋白质或多肽和/或鉴定蛋白质或多肽上的剪切位点的新型系统、工艺和方法。在本发明的各个方面，该系统、工艺和方法包括用于在ETD时简单生成报告离子的高通量LC-MS。在一些实施方案中，报告离子的生成有利于后续的MS/MS分析(即，串联质谱法)。在一些实施方案中，MS/MS分析包括互补离子活化模式，诸如CID、高能碰撞解离(HCD)和/或紫外光解离(UVPD)，其经由强度和m/z依赖性触发事件来进一步对蛋白质或多肽进行测序。例如，在一个实施方案中，本发明聚焦于鉴定剪切的多肽的方法，包括ETD-MS2，其中TMPP衍生的报告离子触发MS2分析以自主过滤剪切的多肽。
剪切位点的鉴定
质谱法是用于剪切位点鉴定和表征的重要新兴方法。为了保持可用质谱仪的性能和质量范围，使用两种方法来表征蛋白质，包括″自上而下″策略和″自下而上″策略。
在蛋白质分析的″自上而下″策略中，通过电喷雾电离(ESI)或基质辅助激光解吸/电离(MALDI)将完整的蛋白质电离，然后引入质量分析仪。然而，完整的MS仅可用于检测在仪器的检测极限(LOD)内的降解产物，而低水平的剪切片段通常在完整的MS分析中观察不到，这需要肽水平分析。
在″自下而上″蛋白质组学中，蛋白质的存在的鉴定是在肽水平。″自下而上″策略的常见程序涉及使用一种或多种蛋白水解酶(诸如胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等)以获得源自蛋白质的单独肽的质量。随后将这些肽引入到质谱仪中并通过肽质量指纹图谱分析或串联质谱法鉴定。然后将质量与数据库诸如序列数据库或光谱库进行比较，并使用基于概率的评分系统来确定最接近的蛋白质匹配。因此，该方法使用肽水平的鉴定来推断剪切的肽的存在。更小和更一致的片段比完整的蛋白质更容易分析，并且也可以以高精度确定，因此这种″自下而上″方法是蛋白质组学和蛋白质表征中的优选研究方法。
然而，通过自下而上方法表征蛋白质的剪切位点具有挑战性，这是由于要对复杂蛋白质消化物中存在的最丰富的肽进行测序。剪切的肽的相对低化学计量可潜在地导致不能检测到具有新N端的肽。此外，溶液内和源内碎裂伪影可潜在地导致经质谱法测序的新N端肽的假阳性鉴定。
为了增加蛋白质N端鉴定的置信度，通常执行先由(N-琥珀酰亚胺基氧基羰基甲基)三(2，4，6-三甲氧基苯基)溴化鏻(TMPP)或二甲基标记对N端胺基化学衍生化，再质谱分析。使用该方法，在胰蛋白酶消化和LC-MS分析之前用TMPP或二甲基标记感兴趣的蛋白质N端。因此可以容易地鉴定蛋白质的N端，因为只有N端胰蛋白酶肽含有标记。具有N端衍生化诸如TMPP的肽改善了色谱法期间肽的电离和保留，并在串联质谱分析期间产生独特的片段离子，这显著地促进了这些肽的测序。
一种基于化学标记的方法是脱甲基化，其用水溶性甲醛经由还原性甲基化来标记肽N端和赖氨酸的ε-氨基。在MS/MS分析中，该标记策略提供了a1和yn-1离子的信号增强，这些离子不能从大多数非衍生化片段中检测到。由于其简单性以及低成本，二甲基标记是用于蛋白质N端鉴定的有前景的策略。
另选地，TMPP标记方法是直接的并且已经成功地应用于不同的蛋白质。该标记试剂的两种特性促进了该方法的灵敏度：(i)TMPP标记引入永久正电荷，使得电离效率提高，从而更好地检测低丰度肽；(ii)疏水性TMPP基团使TMPP衍生化的肽在反相色谱法中的保留时间向色谱图的较不复杂的部分移动，从而提高了检测的灵敏度，特别是对于原本不能保留在柱上的短N端肽。此外，TMPP与用于蛋白质组学中的蛋白质提取的所有标准洗涤剂、离液剂和还原条件完全相容，这使得TMPP标记成为蛋白质N端测序的常用方法。
已经证实TMPP标记方法可用于从SDS-PAGE凝胶切下的蛋白质检测蛋白质剪切以及N端异质性的蛋白质基因组作图。此外，该标记试剂增加了N端肽的疏水性，改善了它们的电离能力，并由于引入正电荷而改变了它们的碎裂模式。
报告离子触发的串联质谱法
TMPP标签的位点特异性定位允许明确确定成熟N端或新N端。除了主链产物离子之外，经由碰撞诱导解离(CID)形成的273Da的TMPP报告离子也可对经处理的N端的存在具有诊断性。然而，通过CID生成的报告离子提供的信息可能较少，这是由于它们的丰度较低。
本申请描述了用于在电子转移解离(ETD)串联质谱法时简单生成TMPP报告离子的新型高通量LC-MS方法。这些报告离子的大量生成允许后续的MS/MS事件，其使用互补离子激活模式(诸如CID、HCD或UVPD)经由强度和m/z依赖性触发事件来进一步对肽进行测序。经由ETD生成的报告离子是新的，并且该报告离子的触发有利于含有TMPP标记的肽的光谱的过滤，有助于数据库搜索或光谱的快速人工验证。
在一个总体方面，本申请涉及一种表征多肽的方法，该方法包括：
(i)用N端标记试剂标记多肽以获得标记的多肽；
(ii)消化标记的多肽以生成包含一种或多种未标记的肽和一种或多种标记的肽的混合物；
(iii)使混合物经受液相色谱法(LC)以生成LC的洗脱液；
(iv)使洗脱液经受电子转移解离(ETD)质谱法；
(v)通过在一种或多种标记的肽的ETD质谱中检测报告离子来鉴定所述一种或多种标记的肽；
(vi)使鉴定的一种或多种标记的肽经受第二质谱法，从而生成标记的肽中的每种标记的肽的第二质谱；以及
(vii)通过分析标记的肽中的每种标记的肽的ETD质谱和第二质谱来表征所述多肽。
根据本申请的实施方案，待表征的多肽可以是由蛋白质或肽的剪切产生的片段(剪切的多肽)，蛋白质或肽包括但不限于酶、抗体(例如，单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体)或其抗原结合片段、生物分子抗原、融合蛋白、融合肽、支架蛋白或肽、蛋白质或肽药物缀合物、或可用作治疗或诊断方式的任何其他多肽或肽。多肽本身可以具有一个或多个剪切的位点，因此可以被剪切以生成剪切的肽。
N端标记试剂可与末端胺基反应，包括任何伯胺反应性试剂。试剂的示例包括但不限于桑格试剂、丹磺酰衍生物、异硫氰酸苯酯(PITC)、二甲氧基嘧啶-2-异硫氰酸酯(DMPITC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)试剂、(N-琥珀酰亚胺基氧基羰基甲基)三(2，4，6-三甲氧基苯基)溴化鏻(TMPP)、二甲基标记试剂、串联质谱标签(TMT)以及相对和绝对定量同位素标签(iTRAQ)。
适用于本发明的N端标记试剂是固定电荷衍生化试剂。这些试剂的示例包括但不限于TMPP、TMT或iTRAQ。这些试剂可以将具有固定正电荷的标签添加到肽。固定电荷标签使得电离更好，并且标签的疏水性使得反相色谱法中保留更大。此外，随后固定电荷肽在质谱法中的碎裂产生多种主链片段和带电标签片段，包括报告离子，其在性质上可以是诊断性的并且有利于肽鉴定。具体地，报告离子由碎裂时的电荷损失生成。
这些试剂中的一些试剂还具有提高对游离N端而不是任何其他游离胺诸如赖氨酸的反应特异性的空间位阻特性。
在一些实施方案中，N端标记试剂是TMPP。在进一步的实施方案中，标记的多肽是TMPP标记的多肽，并且标记的肽是TMPP标记的肽。
在一些实施方案中，肽的TMPP标记主要在N端，并且另外的未标记的赖氨酸或酪氨酸残基对诊断性TMPP+离子没有影响。
在一些实施方案中，用于消化肽的酶包含本领域已知的任何蛋白水解酶。
在某些实施方案中，TMPP标记的多肽被消化而生成包含未标记的肽和TMPP标记的肽的混合物。当该混合物经受液相色谱法(LC)以生成LC的洗脱液时，该方法允许使混合物中TMPP标记的肽与未标记的肽快速分离，因为TMPP标记是疏水性的并且在反相梯度中稍后洗脱。这继而允许TMPP标记的肽的保留时间可预测性，并且进一步提高特异性并减少肽的假阳性鉴定。
在一些实施方案中，可以省略液相色谱法(LC)分离步骤iii)，使得不存在用于分离的液相色谱法(LC)。因此，在后续的步骤iv)中，使包含一种或多种未标记的肽和一种或多种标记的肽的混合物经由直接输注或流动注射直接经受串联质谱法。例如，在一个实施方案中，串联质谱法包括电子转移解离(ETD)。一般来讲，ETD是一种类型的电子诱导解离方法，因此，其他类型的基于电子的解离方法诸如电子捕获解离(ECD)也可以在本文中用作ETD的替代方案。在一些实施方案中，其他解离方法诸如高能碰撞解离(HCD)也可以在本文中用作ETD的替代方案。
根据本申请的实施方案，经受ETD的衍生化前体离子对肽的衍生化水平没有影响。例如，100％衍生化的肽可具有与1％衍生化的相同肽相同的ETD效率。当在蛋白质的剪切位点鉴定的上下文中考虑这些反应时这点很重要，蛋白质的衍生化效率对替代肽的ETD效率没有影响。
在一些实施方案中，报告离子是TMPP报告离子。在进一步的实施方案中，TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。元素的标称质量是其最丰富的天然存在的稳定同位素的质量数，并且对于离子或分子，标称质量是组成原子的标称质量之和。标称质量的精确度通常好至10ppm。
优选地，本发明的方法允许在电子转移解离(ETD)时简单生成m/z为约533Da(TMPP+)和在一些情况下约590Da(TMPP-Ac-NH2 +)的TMPP报告离子，或在高能碰撞解离(HCD)时简单生成m/z为约573Da(TMPP-Ac+)的TMPP报告离子。通常约533Da的报告离子是最占优势的产物离子。强产物离子可用于触发后续的MS/MS事件以进一步对肽进行测序。阈值可用于触发后续的MS/MS事件，包括质量m/z阈值和强度阈值。例如，过滤器(质量公差)通常用于以一定特异性作为m/z阈值来触发。在某些实施方案中，过滤器设置在单位电荷或汤姆森的精确质荷比为533.1935Da或590.2150Da的基峰上并且用于触发的质量公差范围在1ppm至20ppm之间。质量公差可以是1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、6ppm、7ppm、8ppm、9ppm、10ppm、11ppm、12ppm、13ppm、14ppm、15ppm、16ppm、17ppm、18ppm、19ppm、20ppm或它们之间的任何数值，优选地5ppm。
另选地，报告离子的强度可用作阈值，其可通过使用仪器软件来设置。例如，可以将强度设定在任何特定数值，例如基峰的10％，然后强度为基峰的10％或大于10％的任何报告离子可以触发后续的MS/MS事件。
在一个优选的实施方案中，该方法包括通过在标记的肽的ETD质谱中检测或分离TMPP报告离子来鉴定TMPP标记的肽。
根据本申请的实施方案，一般来讲，对于具有相似质量或相同数量的氨基酸的肽，通过ETD产生TMPP+报告离子的倾向更偏向双电荷前体，而不是三电荷前体离子。因此，ETD生成的TMPP+离子的诊断效用完全适合大多数为双电荷的胰蛋白酶肽。
在一些实施方案中，第二质谱法是碰撞诱导解离(CID)质谱法、高能碰撞解离(HCD)质谱法或紫外光解离(UVPD)质谱法。因此，在一些实施方案中，串联质谱法是碰撞诱导解离(CID)质谱法(CID-MS2)、高能碰撞解离串联质谱法(HCD-MS2)或紫外光解离串联质谱法(UVPD-MS2)。
在一些实施方案中，第二质谱是TMPP标记的肽的CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。
在一些实施方案中，TMPP报告离子触发CID质谱法、HCD质谱法或UVPD质谱法。由于触发MS2(其确认从MS2的第一ETD质谱部分生成的报告离子的存在)的低发生率，触发的质谱法的方法使得数据的过滤适于手动检查。因此，这消除了对具有报告离子峰的ETD质谱的计算机方法或手动检查的需要。
在一些实施方案中，TMPP报告离子由电荷损失生成。
在一些实施方案中，LC是高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UPLC)。
在一些实施方案中，该方法是高通量的。
在一些实施方案中，通过与序列数据库或光谱库中的信息进行比较来分析ETD质谱(即，第一质谱)和第二质谱诸如CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。
在一个优选的实施方案中，鉴定的TMPP标记的肽经受CID质谱法。
根据本申请的实施方案，TMPP标记也可以发生在肽的赖氨酸和酪氨酸残基上，并且当经受ETD时，携带这些TMPP修饰的肽也可以生成诊断报告离子并因此触发CID-MS2事件。这些CID光谱是报告离子的假阳性鉴定。然而，在ETD和诊断离子触发的CID光谱中对序列离子的后续检查可以将TMPP以位点特异性的方式定位在该序列上并有助于消除假阳性。例如，后续触发的CID-MS2光谱可提供主链离子的信息，该信息可用于确定TMPP部分是归属于N端还是赖氨酸或酪氨酸的侧链。ETD-MS2和触发的CID-MS2的互补性质可有助于快速筛选潜在的剪切的物类，而与含有TMPP部分的替代蛋白水解肽的氨基酸序列无关。触发的CID-MS2生成TMPP+离子的能力提供了对该序列的完全探询，以精确定位TMPP部分或以高置信度确认该序列。
在一个优选的实施方案中，本申请涉及一种表征样品中的N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记的肽的方法，该方法包括：
(i)使样品经受包括电子转移解离(ETD)的串联质谱法；
(ii)通过在TMPP标记的肽的ETD质谱中检测或分离TMPP报告离子来鉴定TMPP标记的肽；
(iii)使鉴定的TMPP标记的肽经受第二质谱法，从而生成TMPP标记的肽的第二质谱；以及
(iv)通过分析ETD质谱和第二质谱来表征所述TMPP标记的肽。
需注意，N端标记试剂(优选地TMPP)也可以结合于侧链中的胺基诸如赖氨酸和酪氨酸。当TMPP标记的肽经受ETD，也生成报告离子并因此触发第二质谱法诸如CID-MS2时，这些第二质谱是报告离子的假阳性鉴定。然而，在ETD光谱和报告离子触发的CID光谱中对序列离子的仔细检查可以将TMPP以位点特异性的方式定位在该序列上并有助于消除假阳性。
在另一个总体方面，本申请还涉及一种鉴定蛋白质上的剪切位点的方法，该方法包括：
(i)获得含有蛋白质的一种或多种剪切的多肽的样品；
(ii)用N端标记试剂标记一种或多种多肽以获得一种或多种标记的多肽；
(iii)消化标记的剪切的多肽以生成包含未标记的肽和标记的肽的混合物；
(iv)使混合物经受液相色谱法(LC)以生成LC的洗脱液；
(v)使洗脱液经受包括电子转移解离(ETD)的串联质谱法；
(vi)通过在标记的肽中的每种标记的肽的ETD质谱中检测报告离子来鉴定标记的肽；
(vii)使鉴定的标记的肽经受第二质谱法，从而生成标记的肽中的每种标记的肽的第二质谱；以及
(viii)通过分析标记的肽中的每种标记的肽的所述ETD质谱和第二质谱来表征多肽。
如本文所用，术语″蛋白质″涵盖天然蛋白质、合成蛋白质、重组蛋白质或它们的肽。可通过本发明的方法分析的蛋白质的示例包括但不限于酶、抗体(例如单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体)或其抗原结合片段、生物分子抗原、融合蛋白、融合肽、支架蛋白或肽、蛋白质或肽药物缀合物、或可用作治疗或诊断方式的任何其他多肽或肽。
根据本申请的实施方案，待表征的剪切的多肽可以是由蛋白质诸如酶、抗体和生物分子抗原的剪切产生的片段。多肽本身可以具有一个或多个剪切的位点，因此可以被剪切以生成剪切的肽。
在一些实施方案中，N端标记试剂是N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)。在进一步的实施方案中，标记的多肽是TMPP标记的多肽，并且标记的肽是TMPP标记的肽。
在一些实施方案中，N端标记试剂是TMPP。在进一步的实施方案中，标记的多肽是TMPP标记的多肽，并且标记的肽是TMPP标记的肽。
在一些实施方案中，可以缺少步骤iv)，使得不存在用于分离的液相色谱法(LC)。因此，在后续的步骤v)中，使包含未标记的肽和标记的肽的混合物经由直接输注或流动注射直接经受电子转移解离(ETD)或电子捕获解离(ECD)或其他电子诱导解离串联质谱法。
在一些实施方案中，报告离子是TMPP报告离子。在进一步的实施方案中，TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
在一个优选的实施方案中，该方法包括通过在标记的肽的ETD质谱中检测或分离TMPP报告离子来鉴定TMPP标记的肽。
在一些实施方案中，第二质谱法是碰撞诱导解离(CID)质谱法、高能碰撞解离(HCD)质谱法或紫外光解离(UVPD)质谱法。因此，在一些实施方案中，串联质谱法是碰撞诱导解离(CID)质谱法(CID-MS2)、高能碰撞解离串联质谱法(HCD-MS2)或紫外光解离串联质谱法(UVPD-MS2)。
在一些实施方案中，第二质谱是TMPP标记的肽的CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。
在一些实施方案中，TMPP报告离子触发CID质谱法、HCD质谱法或UVPD质谱法。
在一些实施方案中，TMPP报告离子由电荷损失生成。
在一些实施方案中，LC是高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UPLC)。
在一个实施方案中，蛋白质是治疗性蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质是非治疗性蛋白质。
在一些实施方案中，该方法是高通量的。
在一些实施方案中，通过与数据库或光谱库诸如Uniprot、NIST或Spectra ST中的信息进行比较来分析ETD质谱和第二质谱诸如CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。然而，这些数据库或公共图书馆没有注释的533或590报告离子作为鉴定标准，因此用于非报告离子的鉴定。
在一个优选的实施方案中，鉴定的TMPP标记的肽经受CID质谱法。
在另一个总体方面，本发明涉及一种鉴定蛋白质上的剪切位点的方法，该方法包括：
(i)获得含有蛋白质的一种或多种剪切的多肽的样品；
(ii)用N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记一种或多种剪切的多肽，从而获得一种或多种TMPP标记的剪切的多肽；
(iii)消化一种或多种TMPP标记的剪切的多肽以生成包含未标记的肽和TMPP标记的肽的混合物；
(iv)使混合物经受液相色谱法(LC)以生成LC的洗脱液；
(v)使洗脱液经受包括电子转移解离(ETD)的串联质谱法，从而为TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽生成ETD质谱；
(vi)在ETD质谱中检测或分离TMPP报告离子；
(vii)在检测或分离TMPP报告离子后，使TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽经受碰撞诱导解离(CID)质谱法或高能碰撞解离(HCD)质谱法或紫外光解离(UVPD)质谱法，从而分别为TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽生成CID质谱或HCD质谱或UVPD质谱；以及
(viii)通过分析TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的ETD质谱和CID质谱或HCD质谱或UPVD质谱来鉴定所述蛋白质上的所述剪切位点。
在一些实施方案中，待表征的剪切的多肽可以是由蛋白质诸如酶、抗体和生物分子抗原的剪切产生的片段。多肽本身可以具有一个或多个剪切的位点，因此可以被剪切以生成剪切的肽。
在一些实施方案中，可以缺少步骤iv)，使得不存在用于分离的液相色谱法(LC)。因此，在后续的步骤v)中，使包含未标记的肽和标记的肽的混合物经由直接输注或流动注射直接经受包括电子转移解离(ETD)的串联质谱法。
在一些实施方案中，TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
在一些实施方案中，通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析ETD质谱和CID质谱或HCD质谱或UPVD质谱。
鉴于本公开，任何合适的质谱装置可用于当前描述的发明。例如，可以使用能够执行ETD反应的任何仪器进行包括ETD的串联质谱法。有许多型号和仪器供应商可以进行这种类型的解离，这在本领域是已知的。例如，电子捕获解离(ECD)与ETD具有相似性，因此可以执行解离并产生相同的报告离子。因此，能够执行ECD反应的仪器也可用作ETD串联质谱法的替代方案。类似地，可以使用能够执行CID反应(包括低能CID和高能CID)的任何仪器进行CID串联质谱法。
用于鉴定多肽上的剪切位点和/或用于表征多肽的系统
本发明还部分地涉及用于鉴定多肽上的剪切位点或表征样品中的多肽的系统。在本发明的各个方面，该系统包括液相色谱(LC)装置和串联质谱仪。
在一个实施方案中，LC装置是高效液相色谱(HPLC)装置。
在一些实施方案中，串联质谱仪包括：
(i)第一电离装置；
(ii)第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪，第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪在第一操作模式下被布置为并适于传输具有在第一范围内的质荷比的离子；
(iii)第一离子迁移谱仪、检测器或分离器；
(iv)衰减部件，该衰减部件用于在操作模式下使离子衰减；
(v)控制装置，控制装置被配置为控制所述衰减部件的操作，使得具有在第一范围内的质荷比但具有一个或多个非期望的第一电荷状态的离子基本上被衰减；
(vi)第二电离装置；
(vii)第二离子迁移谱仪、检测器或分离器；以及
(viii)数据系统，该数据系统被配置为获取片段离子的非混合信号并对触发离子进行非冗余编码，非冗余编码被布置为避免或最小化在任何单独选通时间的多次重复时来自不同母体物类的任何两个离子信号的重复重叠。
在一个实施方案中，样品经受LC装置以生成洗脱液。
在一个实施方案中，洗脱液经受串联质谱法以获得第一质谱和第二质谱。
在一些实施方案中，用N端标记试剂标记多肽上的剪切位点或多肽。例如，在一个实施方案中，N端标记试剂是N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)。
在一个实施方案中，第一电离装置生成TMPP报告离子。在各种实施方案中，TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。在一个实施方案中，TMPP报告离子触发第二质谱法。
在一个实施方案中，第一电离装置是电子诱导解离装置。在一些实施方案中，电子诱导解离装置是电子转移解离(ETD)装置或电子捕获解离(ECD)装置。因此，在各种实施方案中，第一质谱是ETD质谱或ECD质谱。
在一些实施方案中，第二电离装置是碰撞诱导解离(CID)装置、高能碰撞解离(HCD)装置或紫外光解离(UVPD)装置。因此，在各种实施方案中，第二质谱包括CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。
在一些实施方案中，通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析第一质谱和第二质谱。
在一些实施方案中，质谱仪还包括碰撞装置、碎裂装置或反应装置。
在一些实施方案中，衰减部件包括离子门或离子障壁。在一些实施方案中，衰减部件被布置在离子迁移谱仪或分离器的下游。
在一些实施方案中，第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪被布置为并适于在第一操作模式下使具有在第一范围之外的质荷比的离子衰减。在一些实施方案中，第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪被布置在所述离子迁移谱仪或分离器的上游或下游。
在一些实施方案中，第一非期望的电荷状态选自以下各项中的一项或多项：(i)单电荷；(ii)双电荷；(iii)三电荷；(iv)四电荷；(v)五电荷；以及(vi)多电荷。
在一些实施方案中，质谱仪还包括被布置在离子迁移谱仪或分离器上游的离子引导器、离子阱或离子俘获区，其中离子引导器、离子阱或离子俘获区被布置为俘获、储存或累积离子，然后周期性地将离子以脉冲方式发射到所述离子迁移谱仪或分离器中或以脉冲方式向所述离子迁移谱仪或分离器发射离子。
用于鉴定多肽上的剪切位点和/或用于表征多肽的报告离子
在其他方面，本发明还部分地涉及用于鉴定多肽上的剪切位点的报告离子和/或用于表征多肽的报告离子。在一个实施方案中，用N端标记试剂标记剪切位点。在一个实施方案中，用N端标记试剂标记多肽。例如，在一个实施方案中，N端标记试剂是N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)。
在一个实施方案中，使N端标记试剂电离以生成报告离子。例如，在一个实施方案中，使TMPP电离以生成报告离子。
在一个实施方案中，通过质谱仪使N端标记试剂电离以生成报告离子。例如，在一个实施方案中，通过质谱仪使TMPP电离以生成报告离子。
在一个实施方案中，质谱仪是串联质谱仪。在各种实施方案中，串联质谱仪是本文所述的任何串联质谱仪。例如，在一些实施方案中，串联质谱仪包括电子转移解离(ETD)装置、电子捕获解离(ECD)装置、碰撞诱导解离(CID)装置、高能碰撞解离(HCD)装置、紫外光解离(UVPD)装置或它们的任何组合。
在一个实施方案中，通过质谱技术使N端标记试剂电离以生成报告离子。例如，在一个实施方案中，通过质谱技术使TMPP电离以生成报告离子。
在一个实施方案中，质谱法技术是串联质谱法技术。在各种实施方案中，串联质谱法技术是本文所述的任何串联质谱法技术。例如，在一些实施方案中，所述串联质谱法技术包括电子转移解离(ETD)、电子捕获解离(ECD)、碰撞诱导解离(CID)、高能碰撞解离(HCD)、紫外光解离(UVPD)或它们的任何组合。
在一些实施方案中，报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
在一些实施方案中，报告离子是具有以下结构的化合物：
在其他方面，本发明还部分地涉及用于鉴定多肽上的剪切位点的组合物。
在其他方面，本发明部分地涉及用于表征多肽的组合物
在各种实施方案中，该组合物包含至少一种本发明的报告离子和多肽。
试剂盒
本发明还涉及可用于本发明的方法的试剂盒。此类试剂盒包含可用于本文别处描述的任何方法的组分的各种组合，包括例如用于鉴定多肽上的剪切位点的材料和/或用于表征多肽的材料以及说明性材料。例如，在一个实施方案中，试剂盒包含可用于鉴定样品中的多肽上的剪切位点的组分。在一个实施方案中，可用于鉴定样品中的多肽上的剪切位点的组分包括TMPP。在另一个实施方案中，试剂盒包含可用于表征样品中的多肽的组分。在一个实施方案中，可用于表征样品中的多肽的组分包括TMPP。
在一个实施方案中，说明材料描述了用TMPP标记多肽的步骤。在一个实施方案中，说明材料描述了用TMPP标记多肽的剪切位点的步骤。在一些实施方案中，说明性材料描述了使用本发明的系统分析多肽上的TMPP标记的剪切位点或TMPP标记的多肽的一种或多种方法。在一些实施方案中，说明性材料描述了使用本发明的系统分析多肽上的TMPP标记的剪切位点或TMPP标记的多肽的一种或多种方法。
本发明的实施方案
本发明还提供以下非限制性实施方案。
实施方案1是一种表征样品中的N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记的肽的方法，所述方法包括：
(i)使所述样品经受电子转移解离(ETD)或电子捕获解离(ECD)或其他基于电子的解离串联质谱法或高能碰撞解离(HCD)串联质谱法；
(ii)通过在所述TMPP标记的肽的ETD或ECD、其他电子诱导解离质谱或HCD质谱中检测或分离TMPP报告离子来鉴定所述TMPP标记的肽；
(iii)使所述鉴定的TMPP标记的肽经受第二质谱法，从而生成所述TMPP标记的肽的第二质谱；以及
(iv)通过分析所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱或所述HCD质谱和所述第二质谱来表征所述TMPP标记的肽。
实施方案1a是根据实施方案1所述的方法，其中所述ETD用于所述方法。
实施方案1b是根据实施方案1所述的方法，其中所述ECD用于所述方法。
实施方案1c是根据实施方案1至1b中任一项所述的方法，其中所述第二质谱法是碰撞诱导解离(CID)质谱法而产生CID串联质谱法(CID-MS2)并且所述第二质谱是CID质谱。
实施方案1d是根据实施方案1至1b中任一项所述的方法，其中所述第二质谱法是高能碰撞解离(HCD)质谱法而产生HCD串联质谱法(HCD-MS2)并且所述第二质谱是HCD质谱。
实施方案1d是根据实施方案1至1b中任一项所述的方法，其中第二质谱法是紫外光解离(UVPD)质谱法而产生UPVD串联质谱法(UVPD-MS2)并且所述第二质谱是UVPD质谱。
实施方案2是根据实施方案1至1d中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约533Da或约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案2a是根据实施方案2所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约533Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案2b是根据实施方案2a所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有533.1935的精确质荷比(m/z)。
实施方案2c是根据实施方案2a或2b所述的方法，其中通过在所述TMPP标记的肽的所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱中检测第二TMPP报告离子来鉴定所述TMPP标记的肽，并且所述第二TMPP报告离子具有约590Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案2d是根据实施方案2c所述的方法，其中所述第二TMPP报告离子具有590.2150的精确质荷比(m/z)。
实施方案2e是根据实施方案2a至2d中任一项所述的方法，其中通过在所述TMPP标记的肽的所述ETD或ECD或HCD或其他电子诱导解离质谱中检测第二TMPP报告离子或第三TMPP报告离子来鉴定所述TMPP标记的肽，并且所述第二TMPP报告离子或所述第三TMPP报告离子具有约573Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案2f是根据实施方案2e所述的方法，其中所述第二TMPP报告离子或所述第三TMPP报告离子具有573.1884的精确质荷比(m/z)。
实施方案3是根据实施方案1至2f中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子由电荷损失生成。
实施方案3a是根据实施方案3所述的方法，其中所述TMPP报告离子是所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱中的主要产物离子。
实施方案3b是根据实施方案3a所述的方法，其中所述TMPP报告离子是所述ETD质谱中的主要产物离子。
实施方案3c是根据实施方案3a所述的方法，其中所述TMPP报告离子是ECD质谱中的主要产物离子。
实施方案3d是根据实施方案1至3c中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子由双电荷肽生成。
实施方案3e是根据实施方案1至3c中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子是TMPP+。
实施方案3f是根据实施方案1至3c中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子是TMPP-Ac-NH2 +。
实施方案3f是根据实施方案1至3c中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子是TMPP-Ac+。
实施方案4是根据实施方案1至3f中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述第二质谱法。
实施方案4a是根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子经由强度阈值或m/z阈值来触发所述第二质谱法。
实施方案4b是根据实施方案4或4a所述的方法，其中过滤器(质量公差)用于触发所述第二质谱法。
实施方案4c是根据实施方案4b所述的方法，其中所述过滤器设置在精确质量为533.1935Da、573.1884Da或590.2150Da的基峰上并且用于触发的质量公差范围在1ppm至20ppm之间，诸如质量公差为1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、6ppm、7ppm、8ppm、9ppm、10ppm、11ppm、12ppm、13ppm、14ppm、15ppm、16ppm、17ppm、18ppm、19ppm、20ppm或它们之间的任何数值，优选地5ppm。
实施方案4d是根据实施方案4或4a所述的方法，其中所述报告离子的强度用作触发所述第二质谱法的阈值。
实施方案4e是根据实施方案4d所述的方法，其中所述强度被设定为基峰的强度的10％或更多。
实施方案4f是根据实施方案1至4e中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述碰撞诱导解离(CID)质谱法而产生CID串联质谱法(CID-MS2)。
实施方案4g是根据实施方案1至4e中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述高能碰撞解离(HCD)质谱法而产生HCD串联质谱法(HCD-MS2)。
实施方案4h是根据实施方案1至4e中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述紫外光解离UVPD质谱法而产生UVPD串联质谱法(UVPD-MS2)。
实施方案5是一种表征多肽的方法，所述方法包括：
(i)用N端标记试剂标记所述多肽以获得标记的多肽；
(ii)消化所述标记的多肽以生成包含一种或多种未标记的肽和一种或多种标记的肽的混合物；
(iii)任选地使所述混合物经受液相色谱法(LC)以生成所述LC的洗脱液；
(iv)使来自步骤iii)的所述洗脱液或来自步骤ii)的所述混合物经受电子转移解离(ETD)或电子捕获解离(ECD)或其他电子诱导解离串联质谱法；
(v)通过在所述标记的肽的ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱中检测报告离子来鉴定所述标记的肽；
(vi)使所述鉴定的标记的肽经受第二质谱法，从而生成所述标记的肽的第二质谱；以及
(vii)通过分析所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱和所述第二质谱来表征所述多肽。
实施方案6是根据实施方案5所述的方法，其中所述多肽是片段多肽或剪切的多肽。
实施方案6a是根据实施方案6所述的方法，其中所述片段多肽或剪切的多肽由蛋白质的剪切产生。
实施方案6b是根据实施方案6或6a所述的方法，其中所述多肽具有一个或多个剪切的位点。
实施方案6c是根据实施方案6至6b中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是酶、抗体(例如，单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体)或其抗原结合片段、生物分子抗原、融合蛋白、融合肽、支架蛋白或肽、蛋白质或肽药物缀合物、或可用作治疗或诊断方式的任何其他多肽或肽。
实施方案6d是根据实施方案6a所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
实施方案6e是根据实施方案6a所述的方法，其中所述蛋白质是非治疗性蛋白质。
实施方案6f是根据实施方案5至6e中任一项所述的方法，其中所述ETD用于所述方法。
实施方案6g是根据实施方案5至6e中任一项所述的方法，其中所述ECD用于所述方法。
实施方案7是一种鉴定蛋白质上的剪切位点的方法，所述方法包括：
(i)获得含有所述蛋白质的一种或多种剪切的多肽的样品；
(ii)用N端标记试剂标记所述一种或多种多肽以获得一种或多种标记的多肽；
(iii)消化所述标记的剪切的多肽以生成包含未标记的肽和标记的肽的混合物；
(iv)任选地使所述混合物经受液相色谱法(LC)以生成所述LC的洗脱液；
(v)使来自步骤iv)的所述洗脱液或来自步骤iii)的所述混合物经受电子转移解离(ETD)或电子捕获解离(ECD)或其他电子诱导解离串联质谱法；
(vi)通过在所述标记的肽中的每种标记的肽的ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱中检测报告离子来鉴定所述标记的肽；
(vii)使所述鉴定的标记的肽经受第二质谱法，从而生成所述标记的肽中的每种标记的肽的第二质谱；以及
(viii)通过分析所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱和所述第二质谱来表征所述多肽。
实施方案8是根据实施方案7所述的方法，其中所述蛋白质是酶、抗体(例如，单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体)或其抗原结合片段、生物分子抗原、融合蛋白、融合肽、支架蛋白或肽、蛋白质或肽药物缀合物、或可用作治疗或诊断方式的任何其他多肽或肽。
实施方案8a是根据实施方案7所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
实施方案8b是根据实施方案7所述的方法，其中所述蛋白质是非治疗性蛋白质。
实施方案8c是根据实施方案7至8b中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的所述剪切的多肽具有一个或多个剪切的位点。
实施方案8d是根据实施方案7至8c中任一项所述的方法，其中所述ETD用于所述方法。
实施方案8e是根据实施方案7至8d中任一项所述的方法，其中所述ECD用于所述方法。
实施方案9是根据实施方案5至8e中任一项所述的方法，其中所述N端标记试剂是固定电荷衍生化试剂。
实施方案9a是根据实施方案9所述的方法，其中所述N端标记试剂将正电荷添加到所述多肽。
实施方案9b是根据实施方案9或9a所述的方法，其中所述N端标记试剂产生由电荷损失生成的报告离子。
实施方案9c是根据实施方案9所述的方法，其中所述N端标记试剂是TMPP。
实施方案9d是根据实施方案5至9c中任一项所述的方法，其中所述N端标记的效率为1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或它们之间的任何数值。
实施方案10是根据实施方案5至9d中任一项所述的方法，其中所述标记的多肽是TMPP标记的多肽。
实施方案10a是根据实施方案10所述的方法，其中所述标记的肽是TMPP标记的肽。
实施方案11是根据实施方案5至10a中任一项所述的方法，其中所述LC是高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UPLC)，优选地HPLC。
实施方案11a是根据实施方案11所述的方法，其中与对应的未标记的肽相比，所述TMPP标记的肽稍后在反相梯度中洗脱。
实施方案11b是根据实施方案5至10a中任一项所述的方法，其中来自步骤iii)的所述混合物经受包括电子捕获解离(ECD)的串联质谱法。
实施方案1 1c是根据实施方案11b所述的方法，其中所述混合物经由直接输注或流动输注来经受包括ETD的所述串联质谱法。
实施方案11d是根据实施方案5至10a中任一项所述的方法，其中来自步骤iii)的所述混合物经受包括电子转移解离(ETD)的串联质谱法。
实施方案11e是根据实施方案11d所述的方法，其中所述混合物经由直接输注或流动输注来经受包括ECD的所述串联质谱法。
实施方案12是根据实施方案5至11e中任一项所述的方法，其中所述报告离子是TMPP报告离子。
实施方案12a是根据实施方案12所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案12b是根据实施方案12a所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约533Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案12c是根据实施方案12b所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约533.1935的精确质荷比(m/z)。
实施方案12d是根据实施方案12b或12c所述的方法，其中通过在所述TMPP标记的肽的所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱中检测第二TMPP报告离子来鉴定所述标记的肽，并且所述第二TMPP报告离子具有约590Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案12e是根据实施方案12d所述的方法，其中所述第二TMPP报告离子具有590.2150的精确质荷比(m/z)。
实施方案12f是根据实施方案12a至12e中任一项所述的方法，其中通过在所述TMPP标记的肽的所述ETD或ECD或HCD或其他电子诱导解离质谱中检测第二TMPP报告离子或第三TMPP报告离子来鉴定所述标记的肽，并且所述第二TMPP报告离子或所述第三TMPP报告离子具有约573Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案12g是根据实施方案12f所述的方法，其中所述第二TMPP报告离子或所述第三TMPP报告离子具有573.1884的精确质荷比(m/z)。
实施方案12h是根据实施方案12至12g中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子由电荷损失生成。
实施方案12i是根据实施方案12至12h中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子是所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱中的主要产物离子。
实施方案12j是根据实施方案5至12i中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子由双电荷肽生成。
实施方案12k是根据实施方案12所述的方法，其中所述TMPP报告离子是TMPP+。
实施方案12l是根据实施方案12所述的方法，其中所述TMPP报告离子是TMPP-Ac-NH2 +。
实施方案12m是根据实施方案12所述的方法，其中所述TMPP报告离子是TMPP-Ac+。
实施方案13是根据实施方案5至12m中任一项所述的方法，其中所述第二质谱法是碰撞诱导解离(CID)质谱法而产生CID串联质谱法(CID-MS2)并且所述第二质谱是CID质谱。
实施方案13a是根据实施方案5至12m中任一项所述的方法，其中所述第二质谱法是高能碰撞解离(HCD)质谱法而产生HCD串联质谱法(HCD-MS2)并且所述第二质谱是HCD质谱。
实施方案13b是根据实施方案5至12m中任一项所述的方法，其中第二质谱法是紫外光解离(UVPD)质谱法而产生UVPD串联质谱法(UVPD-MS2)并且所述第二质谱是UVPD质谱。
实施方案14是根据实施方案5至13b中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述第二质谱法。
实施方案14a是根据实施方案5至14中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子经由强度和m/z来触发所述第二质谱法。
实施方案14b是根据实施方案14或14a所述的方法，其中过滤器(质量公差)用于触发所述第二质谱法。
实施方案14c是根据实施方案14b所述的方法，其中所述过滤器设置在精确质量为533.1935Da或590.2150Da的基峰上并且用于触发的质量公差范围在1ppm至20ppm之间，诸如质量公差为1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、6ppm、7ppm、8ppm、9ppm、10ppm、11ppm、12ppm、13ppm、14ppm、15ppm、16ppm、17ppm、18ppm、19ppm、20ppm或它们之间的任何数值，优选地5ppm。
实施方案14d是根据实施方案14或14a所述的方法，其中所述报告离子的强度用作触发所述第二质谱法的阈值。
实施方案14e是根据实施方案14d所述的方法，其中所述强度被设定为基峰的强度的10％或更多。
实施方案14f是根据实施方案5至14e中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述碰撞诱导解离(CID)质谱法而产生CID串联质谱法(CID-MS2)。
实施方案14g是根据实施方案5至14e中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述高能碰撞解离(HCD)质谱法而产生HCD串联质谱法(HCD-MS2)。
实施方案14h是根据实施方案5至14e中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述紫外光解离UVPD质谱法而产生UVPD串联质谱法(UVPD-MS2)。
实施方案15是根据实施方案5至14h中任一项所述的方法，其中所述方法是高通量的。
实施方案16是根据实施方案1至15中任一项所述的方法，通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱和所述第二质谱。
实施方案16a是根据实施方案16所述的方法，其中分析所述ETD质谱和所述第二质谱。
实施方案16b是根据实施方案16所述的方法，其中分析所述ECD质谱和所述第二质谱。
实施方案16c是根据实施方案16至16b中任一项所述的方法，其中所述第二质谱是CID质谱。
实施方案16d是根据实施方案16至16b中任一项所述的方法，其中所述第二质谱是HCD质谱。
实施方案16e是根据实施方案16至16b中任一项所述的方法，其中所述第二质谱是UVPD质谱。
实施方案17是根据实施方案5至16e中任一项所述的方法，其中所述方法消除所述剪切位点的假阳性鉴定。
实施方案17a是根据实施方案17所述的方法，其中所述假阳性鉴定由未标记的多肽或肽引起。
实施方案17b是根据实施方案17所述的方法，其中所述假阳性鉴定由赖氨酸残基处的标记引起。
实施方案17c是根据实施方案17所述的方法，其中所述假阳性鉴定由酪氨酸残基处的标记引起。
实施方案18是一种鉴定蛋白质上的剪切位点的方法，所述方法包括：
(i)获得含有所述蛋白质的一种或多种剪切的多肽的样品；
(ii)用N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记所述一种或多种剪切的多肽，从而获得一种或多种TMPP标记的剪切的多肽；
(iii)消化所述一种或多种TMPP标记的剪切的多肽以生成包含未标记的肽和TMPP标记的肽的混合物；
(iv)任选地使所述混合物经受液相色谱法(LC)以生成所述LC的洗脱液；
(v)使来自步骤iv)的所述洗脱液或来自步骤iii)的所述混合物经受电子转移解离(ETD)串联质谱法，从而为所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽生成ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱；
(vi)在所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱中检测或分离TMPP报告离子；
(vii)在检测或分离所述TMPP报告离子后，使所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽经受碰撞诱导解离(CID)质谱法或高能碰撞解离(HCD)质谱法或紫外光解离(UVPD)质谱法，从而分别为所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽生成CID质谱或HCD质谱或UPVD质谱；以及
(viii)通过分析所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱和所述CID质谱或HCD质谱或UPVD质谱来鉴定所述蛋白质上的所述剪切位点。
实施方案19是根据实施方案18所述的方法，其中所述蛋白质是酶、抗体(例如，单克隆抗体、双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体)或其抗原结合片段、生物分子抗原、融合蛋白、融合肽、支架蛋白或肽、蛋白质或肽药物缀合物、或可用作治疗或诊断方式的任何其他多肽或肽。
实施方案19a是根据实施方案19所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
实施方案19b是根据实施方案19所述的方法，其中所述蛋白质是非治疗性蛋白质。
实施方案19c是根据实施方案18至19b中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的所述剪切的多肽具有一个或多个剪切的位点。
实施方案19d是根据实施方案18至19c中任一项所述的方法，其中所述ETD用于所述方法。
实施方案19e是根据实施方案18至19d中任一项所述的方法，其中所述ECD用于所述方法。
实施方案19f是根据实施方案18至19e中任一项所述的方法，其中所述TMPP标记的效率为1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或它们之间的任何数值。
实施方案20是根据实施方案18至19f中任一项所述的方法，其中所述LC是高效液相色谱(HPLC)或超高效液相色谱(UPLC)，优选地HPLC。
实施方案20a是根据实施方案20所述的方法，其中与对应的未标记的肽相比，所述TMPP标记的肽稍后在反相梯度中洗脱。
实施方案20b是根据实施方案18至19b中任一项所述的方法，其中来自步骤iii)的所述混合物经受包括电子转移解离(ETD)的串联质谱法。
实施方案20c是根据实施方案20b所述的方法，其中所述混合物经由直接输注或流动输注来经受包括ETD的所述串联质谱法。
实施方案20d是根据实施方案18至19a中任一项所述的方法，其中来自步骤iii)的所述混合物经受包括电子捕获解离(ECD)的串联质谱法。
实施方案20e是根据实施方案20c所述的方法，其中所述混合物经由直接输注或流动输注来经受包括ECD的所述串联质谱法。
实施方案21是根据实施方案18至20c中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案21a是根据实施方案21所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约533Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案21b是根据实施方案21a所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有533.1935的精确质荷比(m/z)。
实施方案21c是根据实施方案21a或21b所述的方法，所述方法还包括在所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱中检测第二TMPP报告离子，并且所述第二TMPP报告离子具有约590Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案21d是根据实施方案21c所述的方法，其中所述第二TMPP报告离子具有590.2150的精确质荷比(m/z)。
实施方案21e是根据实施方案21a至21d中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约573Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案21f是根据实施方案21e所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有573.1884的精确质荷比(m/z)。
实施方案21g是根据实施方案21至21f中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子由电荷损失生成。
实施方案21h是根据实施方案21至21g中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子是所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱中的主要产物离子。
实施方案21i是根据实施方案21至21h中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子由双电荷肽生成。
实施方案21j是根据实施方案21所述的方法，其中所述TMPP报告离子是TMPP+。
实施方案21k是根据实施方案21所述的方法，其中所述TMPP报告离子是TMPP-Ac-NH2 +。
实施方案211是根据实施方案21所述的方法，其中所述TMPP报告离子是TMPP-Ac+。
实施方案22是根据实施方案18至211中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述碰撞诱导解离(CID)质谱法而产生CID串联质谱法(CID-MS2)，或触发所述高能碰撞解离(HCD)质谱法而产生HCD串联质谱法(HCD-MS2)，或触发紫外光解离(UVPD)质谱法而产生UVPD串联质谱法(UVPD-MS2)。
实施方案22a是根据实施方案22所述的方法，其中所述TMPP报告离子经由强度和m/z触发所述CID质谱法而产生CID-MS2，或触发HCD质谱法而产生HCD-MS2，或触发UVPD质谱法而产生UVPD-MS2。
实施方案22b是根据实施方案22或22a所述的方法，其中过滤器(质量公差)用于触发所述第二质谱法。
实施方案22c是根据实施方案22b所述的方法，其中所述过滤器设置在精确质量为533.1935Da或590.2150Da的基峰上并且用于触发的质量公差范围在1ppm至20ppm之间，诸如质量公差为1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、6ppm、7ppm、8ppm、9ppm、10ppm、11ppm、12ppm、13ppm、14ppm、15ppm、16ppm、17ppm、18ppm、19ppm、20ppm或它们之间的任何数值，优选地5ppm。
实施方案22d是根据实施方案22或22a所述的方法，其中所述报告离子的强度用作触发所述第二质谱法的阈值。
实施方案22e是根据实施方案22d所述的方法，其中所述强度被设定为基峰的强度的10％或更多。
实施方案23是根据实施方案18至22e中任一项所述的方法，其中所述方法是高通量的。
实施方案24是根据实施方案18至23中任一项所述的方法，通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱和所述CID质谱。
实施方案24a是根据实施方案18至23中任一项所述的方法，通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析所述ETD或ECD或其他电子诱导解离质谱和所述HCD质谱。
实施方案25是根据实施方案18至24a中任一项所述的方法，其中所述方法消除所述剪切位点的假阳性鉴定。
实施方案25a是根据实施方案25所述的方法，其中所述假阳性鉴定由未标记的多肽或肽引起。
实施方案25b是根据实施方案25所述的方法，其中所述假阳性鉴定由赖氨酸残基处的标记引起。
实施方案25c是根据实施方案25所述的方法，其中所述假阳性鉴定由酪氨酸残基处的标记引起。
实施方案26是一种用于鉴定多肽上的剪切位点或表征样品中的多肽的系统。
实施方案26a是根据实施方案26所述的系统，其中所述系统包括液相色谱(LC)装置和串联质谱仪。
实施方案26b是根据实施方案26或26a所述的系统，其中所述串联质谱仪包括：
(i)第一电离装置；
(ii)第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪，所述第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪在第一操作模式下被布置为并适于传输具有在第一范围内的质荷比的离子；
(iii)第一离子迁移谱仪、检测器或分离器；
(iv)衰减部件，所述衰减部件用于在操作模式下使离子衰减；
(v)控制装置，所述控制装置被配置为控制所述衰减部件的操作，使得具有在所述第一范围内的质荷比但具有一个或多个非期望的第一电荷状态的离子基本上被衰减；
(vi)第二电离装置；
(vii)第二离子迁移谱仪、检测器或分离器；以及
(viii)数据系统，所述数据系统被配置为获取片段离子的非混合信号并对触发离子进行非冗余编码，所述非冗余编码被布置为避免或最小化在任何单独选通时间的多次重复时来自不同母体物类的任何两个离子信号的重复重叠。
实施方案27是根据实施方案26至26b中任一项所述的系统，其中所述LC装置是高效液相色谱(HPLC)装置。
实施方案28是根据实施方案26至27中任一项所述的系统，其中所述样品经受所述LC装置以生成洗脱液。
实施方案28a是根据实施方案28所述的系统，其中所述洗脱液经受所述串联质谱法以获得第一质谱和第二质谱。
实施方案29是根据实施方案26至28中任一项所述的系统，其中用N端标记试剂标记所述多肽上的所述剪切位点或所述多肽。
实施方案29a是根据实施方案29所述的系统，其中所述N端标记试剂是N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)。
实施方案29b是根据实施方案29a所述的系统，其中所述第一电离装置生成TMPP报告离子。
实施方案29c是根据实施方案29b所述的系统，其中所述TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案29d是根据实施方案29a至29c中任一项所述的系统，其中所述TMPP报告离子触发所述第二质谱法。
实施方案30是根据实施方案26至29中任一项所述的系统，其中所述第一电离装置是电子诱导解离装置。
实施方案30a是根据实施方案30所述的系统，其中所述电子诱导解离装置是电子转移解离(ETD)装置或电子捕获解离(ECD)装置。
实施方案30b是根据实施方案30a所述的系统，其中所述第一质谱是ETD质谱或ECD质谱。
实施方案31是根据实施方案26至30中任一项所述的系统，其中所述第二电离装置是碰撞诱导解离(CID)装置、高能碰撞解离(HCD)装置或紫外光解离(UVPD)装置。
实施方案31a是根据实施方案31所述的系统，其中所述第二质谱包括CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。
实施方案32是根据实施方案30b或31a所述的系统，其中通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析所述第一质谱和所述第二质谱。
实施方案33是根据实施方案26至32中任一项所述的系统，其中所述质谱仪还包括碰撞装置、碎裂装置或反应装置。
实施方案34是根据实施方案26至33中任一项所述的系统，其中所述衰减部件包括离子门或离子障壁。
实施方案34a是根据实施方案26至34中任一项所述的系统，其中所述衰减部件被布置在所述离子迁移谱仪或分离器的下游。
实施方案35是根据实施方案26至34a中任一项所述的系统，其中所述第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪被布置为并适于在所述第一操作模式下使具有在所述第一范围之外的质荷比的离子衰减。
实施方案35a是根据实施方案26至35中任一项所述的系统，其中所述第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪被布置在所述离子迁移谱仪或分离器的上游或下游。
实施方案36是根据实施方案26至35a中任一项所述的系统，其中所述第一非期望的电荷状态选自以下各项中的一项或多项：(i)单电荷；(ii)双电荷；(iii)三电荷；(iv)四电荷；(v)五电荷；以及(vi)多电荷。
实施方案37是根据实施方案26至36中任一项所述的系统，其中所述质谱仪还包括被布置在所述离子迁移谱仪或分离器上游的离子引导器、离子阱或离子俘获区，其中所述离子引导器、离子阱或离子俘获区被布置为俘获、储存或累积离子，然后周期性地将离子以脉冲方式发射到所述离子迁移谱仪或分离器中或以脉冲方式向所述离子迁移谱仪或分离器发射离子。
实施方案38是一种用于鉴定多肽上的剪切位点的报告离子和/或用于表征多肽的报告离子。
实施方案38a是根据实施方案38所述的报告离子，其中用N端标记试剂标记所述剪切位点。
实施方案38b是根据实施方案38所述的报告离子，其中用N端标记试剂标记所述多肽。
实施方案38c是根据实施方案38a或38b所述的报告离子，其中使所述N端标记试剂电离以生成所述报告离子。
实施方案38d是根据实施方案38a或38b所述的报告离子，其中所述N端标记试剂是N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)。
实施方案38e是根据实施方案38d所述的报告离子，其中使所述TMPP电离以生成所述报告离子。
实施方案39是根据实施方案38a至38c中任一项所述的报告离子，其中通过质谱仪使所述N端标记试剂电离以生成所述报告离子。
实施方案39a是根据实施方案38a至38c中任一项所述的报告离子，其中通过质谱法技术使所述N端标记试剂电离以生成所述报告离子。
实施方案40是根据实施方案38d或38e所述的报告离子，其中通过质谱仪使所述TMPP电离以生成所述报告离子。
实施方案40a是根据实施方案38d或38e所述的报告离子，其中通过质谱法技术使所述TMPP电离以生成所述报告离子。
实施方案41是根据实施方案39或40所述的报告离子，其中所述质谱仪是串联质谱仪。
实施方案41a是根据实施方案41所述的报告离子，其中所述串联质谱仪包括电子转移解离(ETD)装置、电子捕获解离(ECD)装置、碰撞诱导解离(CID)装置、高能碰撞解离(HCD)装置、紫外光解离(UVPD)装置或它们的任何组合。
实施方案42是根据实施方案39a或40a所述的报告离子，其中所述质谱法技术是串联质谱技术。
实施方案42a是根据实施方案42所述的报告离子，其中所述串联质谱法技术是本文所述的任何串联质谱法技术。例如，在一些实施方案中，所述串联质谱法技术包括电子转移解离(ETD)、电子捕获解离(ECD)、碰撞诱导解离(CID)、高能碰撞解离(HCD)、紫外光解离(UVPD)或它们的任何组合。
实施方案42b是根据实施方案42a所述的报告离子，其中所述报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比(m/z)。
实施方案42c是根据实施方案42a所述的报告离子，其中所述报告离子是具有以下结构的化合物：
实施方案43是一种用于鉴定多肽上的剪切位点的组合物，其中所述组合物包含至少一中本文所述的报告离子和多肽。
实施方案44是一种用于表征多肽的组合物，其中所述组合物包含至少一种本文所述的报告离子和多肽。
实施方案45是一种用于鉴定样品中的多肽上的剪切位点的试剂盒，其中所述试剂盒包含：用于鉴定多肽上的剪切位点的报告离子。
实施方案45a是根据实施方案45所述的试剂盒，其中用N-三(2，4，6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记所述剪切位点。
实施方案45b是根据实施方案45a所述的试剂盒，其中使所述TMPP电离以生成所述报告离子。
实施方案46是一种用于表征样品中的多肽的试剂盒，其中所述试剂盒包含：用于表征多肽的报告离子。
实施方案46a是根据实施方案46所述的试剂盒，其中用N-三(2，4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基(TMPP)标记所述多肽。
实施方案46b是根据实施方案46a所述的试剂盒，其中使所述TMPP电离以生成所述报告离子。
以下实施例用于进一步说明本发明的实质。应当理解，以下实施例不限制本发明，并且本发明的范围由所附权利要求书确定。
实验实施例
参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。除非另外指明，否则这些实施例仅出于说明的目的而提供，并非旨在进行限制。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
在没有进一步描述的情况下，据信本领域的普通技术人员可使用前面的描述和下面的示例性实施例来制备和利用本发明的化合物并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
实施例1：通过N端的TMPP标记和电子转移解离(ETD)来检测诊断离子
通过用TMPP标记NIST抗体标准品并通过由数据依赖性ETD-MS/MS进行胰蛋白酶肽作图来研究TMPP报告离子的诊断效用。NIST抗体具有来自轻链和重链的成熟N端。这两种替代肽之一对应于具有游离伯胺的NIST抗体轻链的N端，而NIST抗体重链的N端由仲胺组成，这是由于谷氨酰胺环化形成N端的焦谷氨酸残基。NIST抗体上的任何新N端是储存期间分子的潜在降解或剪切产物。
图1示出了与NIST抗体的轻链N端序列相对应的肽的ETD产物离子谱。质谱主要由诊断性TMPP报告离子(m/z＝533Da)和包含N端TMPP标签的c型主链产物离子组成。有趣的是注意到该肽序列是因较大胰蛋白酶肽的源内碎裂而生成的，其在ETD期间以小得多的程度产生报告离子，原因可能是C端精氨酸残基上的电荷螯合(Xia等人，Journal of theAmerican Chemical Society，2007，129：12232-12243)。然而，所采用的方法包括电子转移解离以产生优势报告离子峰，使用高序列覆盖度将TMPP标签定位在N端上，以及报告离子触发互补活化事件以确认NIST轻链的成熟N端的存在。通过检查并过滤整个数据集中具有533和590诊断报告离子的ETD-MS/MS光谱，也确认了由于NIST抗体的降解而不存在另外的低水平的剪切的物类。533Da和590Da的报告离子的结构参见图2A至图2B。
由于触发的MS2扫描(其针对整个数据集确认由ETD-MS/MS事件生成的报告离子的存在)的低发生率，触发的CID方法使得数据的过滤适于手动检查。这消除了对具有报告离子峰的ETD-MS/MS扫描的计算机方法或手动检查的需要。
实施例2：TMPP标记的肽的快速分离和保留时间可预测性
接下来评估用于高通量检测TMPP标记的肽的快速分离条件。用20分钟的总运行时间实现了肽的完全反相分离、净化和再平衡。图3示出了TMPP标记后NIST消化物的反相色谱缓冲液梯度和对应的总离子色谱图。重要的是注意到大多数未标记的肽都以2％至30％有机溶剂在10分钟长的浅梯度中洗脱。替代肽对应于在12分钟洗脱的NIST抗体轻链的N端。TMPP标记增加了N端肽的疏水性，并且可以想到，TMPP标记的肽大部分在两个具有快速斜变的陡峭梯度期间观察到：1分钟内2％至85％的有机溶剂。分离TMPP标记的肽和改善TMPP标记的肽的保留时间可预测性的能力进一步提高了肽的特异性并减少了肽的假阳性鉴定。
还重要的是注意到在3.5分钟时也观察到对应的未标记的NIST mAb N端肽对应物。可以想到，具有多种剪切的物类的复杂样品由TMPP标记的肽对应物和未标记的肽对应物组成(由于标记效率小于100％)，与标记的肽相比，这些未标记的肽在梯度中较早洗脱，并且通常在强度上较小，并且在一些情况下低于LOD。
然后评估观察到未标记的肽的可能性，并且通过使来自NIST序列的15种合成肽标准品衍生化来评价TMPP标记的肽的保留时间可预测性。通过记录未标记的肽和TMPP标记的肽的保留时间和强度来监测这些肽混合物的20分钟长HPLC梯度注射。通过获得归一化到针对该肽观察到的总强度的TMPP标记的肽的峰面积比来评估TMPP标记的反应效率。在该分析中，15种TMPP肽在12至14分钟之间洗脱，这些肽的标记效率在8％至100％的范围内，并且这15种肽中的8种肽以100％效率反应。值得注意的是，通过MS/MS鉴定了所有TMPP标记的肽，尽管反应效率不同。未标记的肽对应物在4至12分钟的宽得多的保留时间窗口处洗脱。由于高反应效率，15种未标记的肽中仅7种未标记的肽通过MS/MS鉴定，而剩余的8种未标记的肽在MS1处检测到，但由于低LOD而未触发MS2-ETD。肽的标记实现了改善的鉴定和保留时间可预测性。总梯度的LC运行时间可以缩短以快速鉴定较不复杂的样品的剪切位点，或可以延长以用于更复杂的混合物。
实施例3：TMPP标记的合成肽标准品的诊断离子
用TMPP标记使对应于NIST mAb的几种合成肽标准品衍生化，并使用ETD-MS2和诊断报告离子触发的MS2 CID事件使这些合成肽标准品经受LC-MS。然后使用这些具有不同长度、氨基酸组成和TMPP标记位点的合成肽标准品评价在ETD光谱中生成诊断性TMPP报告离子(m/z＝533Da和590Da)的倾向。表1示出了在检测到TMPP报告离子时大多数肽触发后续的MS2-CID扫描。触发的扫描显示对报告离子强度的依赖性，即，TMPP+533m/z。基于先前针对肽主链键的断裂所报道的％效率计算(Gunawardena等人，Journal of the AmericanChemical Society，2005，127：12627-12639)，已经为TMPP衍生化的肽的TMPP+和TMPP-Ac+报告离子推导出NIST肽的ETD光谱的若干效率估计值。这两种报告离子的ETD效率估计值的计算参见图2D。
从合成NIST肽观察到TMPP+效率显著大于TMPP-Ac+，这是由于报告离子丰度不同。有趣的是还注意到报告离子强度对主链键的总体ETD效率有显著贡献，特别是来自TMPP+报告离子的贡献。
表1.TMPP标记的NIST合成肽的ETD效率。
相关的ETD-MS2和TMPP+触发的CID-MS2光谱参见图4A至图4Z。
还需注意，产生后续质量触发的MS2扫描的保真性可能受数据依赖性标准影响，在该数据依赖性标准中对报告离子的总强度和前体离子的AGC设置作出后续扫描的决定(Bowers等人，Scientific Reports，2018，8：10399)。例如，在N端进行了标记的两种肽FNWYVDGVEVHNAK(序列标识号：17)和VVSLTVLHQDWLNGK(序列标识号：26)都产生了较低强度的TMPP+诊断离子。然而，仅观察到FNWYVDGVEVHNAK(序列标识号：17；图4I)的质量触发，而VVSLTVLHQDWLNGK(序列标识号：26)肽没有MS2触发(图4L)。当检查后续的MS1强度时，肽VVSLTVLHQDWLNGK(序列标识号：26)降至低于MS/MS的阈值。还观察到基于衍生化的肽的序列组成的一些有趣的解离行为。单残基延伸或TMPP标记的位置显示出对作为带电物类的TMPP+的气相解离的显著影响。例如，在VVSLTVLHQDWLNGK(序列标识号：26；图4Y)肽的N端和赖氨酸侧链处衍生化的TMPP在ETD和触发的MS2-CID光谱上生成优势报告离子。还观察到在C端添加谷氨酸残基并在N端具有TMPP的肽VVSLTVLHQDWLNGKE(序列标识号：25；图4W)也产生了丰富的诊断报告离子和触发的MS2-CID光谱。尽管不受任何特定理论的束缚，但据推测经由ETD生成报告离子的倾向可能取决于许多不同因素，诸如TMPP标记的位置、氨基酸组成和肽的电荷状态。合成肽数据表明TMPP标记主要发生在N端并且酪氨酸和赖氨酸残基衍生化发生的程度较小(即，15个N端中的14个N端、6个酪氨酸残基中的1个酪氨酸残基、10个赖氨酸残基中的1个赖氨酸残基被TMPP标记)。
预计完整的蛋白质的极性残基的溶剂可及性可导致如先前报道的赖氨酸和酪氨酸残基的非期望标记(Abello等人，Journal of Proteome Research，2007，6∶4770-4776)。然而，触发的MS2方法有效地促进了TMPP修饰上的定位，并有助于剪切位点的明确确定。仅通过ETD-MS2将TMPP标记的含有赖氨酸的肽明确地定位在N端，同时诊断离子触发的CID-MS2数据补充了ETD光谱并改善了可信的定位。
使用ETD-MS2定位了大多数TMPP标记的含有酪氨酸的肽，并且离子触发的CID-MS2光谱改善了可信的定位。然而，当序列离子不足以定位TMPP修饰的位点时，单独的ETD-MS2可能信息不足。图4D示出了单一TMPP标记的肽VYACEVTHQGLSSPVTK(序列标识号：13)的注释ETD-MS2光谱，其中搜索引擎已将TMPP修饰不正确地归属于N端。然而，基于c型和z型ETD离子，TMPP部分不能明确地归属于N端或酪氨酸的侧链衍生物。后续触发的MS2-CID扫描的效用产生了可信的y16离子，其明确地将TMPP定位于酪氨酸残基上。图4P示出了单一TMPP标记的肽EPQVYTLPPSR(序列标识号：22)的ETD-MS2光谱，该肽仅产生诊断离子而没有主链序列离子。序列的鉴定基于MS1光谱的前体离子的m/z，而报告离子指示肽可能携带TMPP部分。触发的MS2-CID光谱生成几种主链离子：缺少TMPP修饰的y7、y8和y10与具有TMPP部分的b1至b4离子一起将TMPP定位于N端。重要的是注意到在检查所有MS2-CID光谱之后，只有一些光谱在573处显示出具有有限诊断效用的诊断离子。
如何在这些实验中使用ETD-MS2和触发的CID-MS2的互补性质有助于快速筛选潜在的剪切的物类，而与含有TMPP部分的替代蛋白水解肽的氨基酸序列无关。本文所述的串联MS方法适于具有各种长度和电荷状态的肽的ETD-MS2，并且当肽与双电荷二肽一样小时也有效。产生TMPP部分的优势诊断亚胺离子的能力对于ETD-MS2生成的报告离子触发后续的CID扫描至关重要。ETD-MS2已经显示出相当一致地生成TMPP诊断离子，同时ETD和CID主链片段离子将TMPP修饰定位于单个残基。
实施例4：来源于细胞裂解物的TMPP标记的合成物的诊断离子
接下来，通过检查一大批来源于K562细胞裂解物的胰蛋白酶肽和它们的TMPP衍生物生成报告离子的效率来检查使用ETD型和HCD型碎裂生成的TMPP+报告离子的诊断效用。肽的复杂性需要改变总体LC分离时间，因此肽经受两个单激发长6倍的运行时间(120分钟)，每次运行单独地执行ETD-MS2和HCD-MS2解离。图5A示出了作为所观察的保留时间的函数的肽强度并叠加有AcCN梯度。正如预期的，未标记的肽在最多约30％AcCN处洗脱，而TMPP标记的肽在邻近两个快速有机斜变(0％至85％AcCN)如较短的梯度运行处洗脱。具有较高总体强度分布的TMPP标记的合成标准肽的观察结果指示肽的疏水性增加和TMPP标记的肽的电离改善。图5B示出了具有对应未标记的肽的TMPP标记的肽的子集的观察时间分布。接下来，标记的肽和对应未标记的肽之间观察到的时间差(Δ时间)被示出为所观察的保留时间的函数并叠加有AcCN梯度。对于几乎每种肽，TMPP标记的序列都稍后洗脱，如由大正值给出的。TMPP标记的肽的密度在梯度的两个快速AcCN斜变处的高保留时间和高Δ时间处可见。
仔细评价了具有不同长度、氨基酸组成、电荷状态和TMPP标记位点的肽生成ETD光谱中的诊断性TMPP报告离子(m/z＝533Da和590Da)和HCD光谱的TMPP报告离子m/z 573Da的倾向。使用几种不同的方法估计每种TMPP标记的肽生成诊断离子的效率。如公式1至公式3(参见图2D)中对于两种类型的ETD衍生的报告离子(TMPP+和TMPP-AC-NH2 +)的关系所示，将报告离子强度归一化到各种类型的产物离子强度。在几乎所有肽中，TMPP+报告离子丰度都比TMPP-Ac-NH2 +占优势(图6A至图6C)。
此外，检查了如公式4(Gunawardena等人，Journal of the American ChemicalSociety，2005，127：12627-12639)中所示的所有主链报告离子和C型、Z型产物离子以及除如公式5中所示的报告离子之外的所有主链片段的总体ETD效率的结果。与公式1中的ETD报告离子估计类似，将衍生自HCD的报告离子归一化到产物离子，如公式6中所示(参见图2E)。如图5A至图5B所指示，TMPP+(533Da)效率被报告为按前体的电荷状态分组的肽前体质量或肽长度的函数。此外，注意到TMPP+报告离子的电荷状态对ETD效率的依赖性是重要的。据观察，TMPP+效率在双电荷前体离子中最高，并随肽的质量线性地降低。另外，TMPP+效率显著高于TMPP-Ac-NH2 +(590Da)。一般来讲，对于具有相似质量或相同数量的氨基酸的肽，产生TMPP+报告离子的倾向更偏向双电荷前体，而不是三电荷前体离子。该观察结果是有趣的，因为这些相同肽的主链c和z片段离子显示出随着电荷状态的增加而提高的效率(例如，图7A至图7D)。
然后在考虑所有主链片段离子和除报告离子之外的所有主链片段离子的情况下评价TMPP标记的肽的总体主链ETD效率。如图7A中所指示，在考虑所有产物离子的情况下，总体ETD效率显示出细微的电荷状态依赖性降低。相比之下，图7B示出了对于在忽略TMPP+报告离子的情况下由公式5估计的总体主链效率，ETD效率显示出电荷状态依赖性增加，如别处报道的未修饰的肽通常观察到的。在考虑所有这些观察结果的情况下，TMPP+报告离子强度对总效率估计值的贡献(特别是双电荷离子)是显著的。ETD生成的TMPP+离子的诊断效用完全适合大多数为双电荷的胰蛋白酶肽。如图7C所示，HCD衍生的TMPP-Ac+(573Da)效率被报告为按前体的电荷状态分组的肽前体质量的函数。总之，与ETD生成的TMPP+报告离子相比，HCD生成的TMPP-Ac+报告离子的效率显著更低。大多数肽的TMPP-Ac+报告离子的效率＜1％，其中很大一部分没有诊断报告离子或效率为零。有一些肽显示出高达约30％的极端效率(接近60％效率的两个异常值是假阳性归属，其中前体m/z与报告离子m/z相同)。没有观察到TMPP-Ac+报告离子的电荷状态对HCD效率的依赖性。
接下来，检查TMPP对赖氨酸和酪氨酸残基的去标记的可能性。从总共520个含有酪氨酸的肽与序列的匹配(PSM)中鉴定出在酪氨酸残基处标记TMPP的12个PSM。在这520个含有酪氨酸的PSM中，262个PSM具有TMPP衍生化的N端并且其余246个PSM是未修饰的。从总共1441个含有赖氨酸的PSM中没有鉴定出在赖氨酸残基处标记TMPP的PSM。在这1441个含有赖氨酸的PSM中，771个PSM具有TMPP衍生化的N端，11个PSM具有TMPP衍生化的酪氨酸，并且其余659个PSM是未修饰的。图8示出了ETD效率对标记的肽没有影响，所述标记的肽按每种肽的酪氨酸和赖氨酸残基数目分组。这些数据表明，肽的TMPP标记在所述反应条件下主要在N端，并且另外的未标记的赖氨酸或酪氨酸残基对诊断性TMPP+离子没有影响。图9示出了由公式7估计的肽的反应或TMPP标记效率的总体分布。经受ETD的衍生化前体离子对衍生化水平没有影响。换句话讲，100％衍生化的肽将具有与1％衍生化的相同肽相同的ETD效率。当在蛋白质的剪切位点鉴定的上下文中考虑这些反应时这点很重要，蛋白质的衍生化效率对替代肽的ETD效率没有影响。
最后，检查由ETD和HCD生成的每种报告离子的诊断效用和LC保留时间。通过针对人蛋白质序列的搜索来可信地鉴定TMPP衍生化的肽及其未修饰的对应物，其中序列离子以高置信度将TMPP部分定位于肽的大部分N端。使用搜索结果确定和分离TMPP标记的肽和未标记的肽的类别。然后每个光谱的诊断离子的解离效率(ETD或HCD)经受逻辑回归和随机森林模型以确定每个诊断离子的灵敏度和特异性，从而生成ETD和HCD诊断离子的接收者操作特性(ROC)曲线。以类似的方式，使用标记的肽和未标记的肽的保留时间确定洗脱时间的灵敏度和特异性。说明了如何使用搜索结果和诊断离子丰度对光谱进行分类或错误分类。如图10A所指示，标记的肽产生特征性TMPP+报告离子，其为真阳性(TP)，而未标记的肽对应物不产生报告离子，其为真阴性(TN)。如图10B所指示，标记的肽产生特征性TMPP+报告离子，其为真阳性(TP)，而未标记的肽对应物产生质量类似于TMPP+报告离子的干扰离子，其为假阳性(FP)。如图10C所指示，经修饰的肽不产生诊断离子，其为假阴性(FN)，而未经修饰的肽对应物产生质量类似于TMPP+报告离子的干扰离子，其为假阳性(FP)。图11A至图11B示出了每种诊断离子和洗脱时间的ROC曲线的曲线下面积(AUC)。在这些报告离子中，TMPP+报告离子最具诊断性，其具有98％的最高AUC，之后是85％的TMPP-Ac-NH2 +AUC和84％的TMPP-Ac+AUC，这表明与其他报告离子相比，ETD生成的TMPP+诊断离子最准确并最具特异性。99％的所观察的保留时间AUC的ROC曲线在所有量度中最具诊断性。
实施例5：TMPP标记和ETD报告离子触发的CID在检测治疗性蛋白质降解中的应用
最后，应用TMPP标记来研究可商购获得的治疗性GLP1激动剂度拉糖肽的剪切位点，度拉糖肽已知会经历GLP1肽的蛋白酶诱导的剪切。使用度拉糖肽(一种用组织蛋白酶D处理的GLP1-Fc融合蛋白)通过ETD-MS2和诊断离子触发的CID-MS2研究GLP1肽上的推定剪切位点。
先前的研究已经报道了组织蛋白酶D诱导的GLP1在W25/L26处的裂解(Dorai等人，Biotechnology Progress，2011，27：220-231；Deacon等人，Diabetes，2004，53：2181-2189；Manandhar等人，Journal of Medicinal Chemistry，2015，58：1020-1037)。图12A至图12C展示了MS2光谱示出因蛋白酶活性而生成的新N端的证据。由双电荷离子的ETD-MS2得到的产物离子谱(图12A)产生特征性诊断离子TMPP+(m/z＝533Da)。此外，在TMPP位点定位中主要观察到c型离子。TMPP在N端上的位点定位指示因F-I剪切产生的新N端，而C端赖氨酸残基上的第二TMPP可以通过K-G剪切推断，因为与赖氨酸残基缀合的TMPP对缀合后样品的胰蛋白酶消化具有抗性。
重要的是注意到TMPP标记也发生在赖氨酸和酪氨酸残基上，并且当携带TMPP修饰的肽经受ETD时，也生成诊断报告离子并因此触发CID-MS2事件。这些CID光谱是报告离子的假阳性鉴定。然而，在ETD和诊断离子触发的CID光谱中对序列离子的仔细检查将TMPP以位点特异性的方式定位在该序列上并有助于消除假阳性。图12B示出了双电荷离子的诊断报告离子(m/z＝533)触发的CID-MS2光谱。b型和y型离子有助于N端和C端赖氨酸的TMPP位点定位。重要的是注意到肽序列未生成特征性CID诱导的报告离子(m/z＝573)。
还生成了非缀合肽的ETD光谱(图12C)，其中不存在诊断离子。非缀合肽的产物离子分布给出了c型和z型离子的混合物。
度拉糖肽的完整分析使得鉴定了GLP1的额外剪切。图13A至图13C示出了与GLP1序列的顺序剪切相对应的替代肽的ETD-MS2和诊断离子触发的CID-MS2产物离子谱的证据。由I/A剪切产生的替代肽仅生成533Da诊断离子，而由A/W和W/L剪切产生的替代肽在ETD期间产生533Da和590Da的诊断离子。533Da的主要诊断离子触发每种肽的CID-MS2事件，从而生成CID产物离子谱。CID-MS2光谱补充了ETD鉴定，并且触发的MS2扫描以无缝方式确认了由ETD-MS/MS生成的报告离子的存在，从而针对整个数据集明确地鉴定新N端。
图14示出了度拉糖肽的剪切位点以从新N端生成替代肽。图15A示出了没有TMPP标记的替代肽的提取离子色谱图(XIC)，并且图15B示出了标记的替代肽的色谱图。
还检查了其他解离模式的效用，这些解离模式诸如为已知会产生更多内部片段的HCD(Michalski等人，Journal of Proteome Research，2012，11：5479-5491)，以及作为CID的补充的用于为通过剪切形成的TMPP标记的新N端肽生成报告离子的UVPD。表2总结了针对GLP1序列的替代肽IAWLVK(序列标识号：5)、AWLVK(序列标识号：6)、WLVK(序列标识号：7)和LVK的一系列剪切的位点获得的结果。虽然所有这些肽都经由ETD生成了特征性533Da诊断离子，但只有LVK肽序列显示出HCD和UVPD解离模式的诊断离子。如图16A和图16B所示，由于酰胺键解离，HCD产生了573Da的特征性诊断离子(Sadagopan等人，Journal of theAmerican Society for Mass Spectrometry，2000，11：107-119；He等人，Journal of theAmerican Society for Mass Spectrometry，2012，23∶1182-1190)，并且UVPD产生了181Da的诊断离子，原因可能是进一步解离和重排(Huang等人，Analytical Chemistry，1997，69：137-144)。除了在每种肽中没有检测到诊断离子之外，还观察到与ETD生成的诊断离子相比明显更低的相对峰强度(图16C)，这使得这些离子的触发提供的信息更少。
表2.解离方法以及基于报告离子TMPP特异性序列离子(573Da、181Da的HCD、CID和
UVPD诊断离子；533Da的ETD诊断离子)鉴定的GLP1的剪切位点。
XIC展示了每种TMPP标记的肽在10至13分钟之间的两个快速斜变期间洗脱。主要在内源性样品中观察到的短LVK肽具有较低保留率并且可能在肽作图实验中不明确。然而，由于肽的总体疏水性增强，TMPP标记后的相同肽在反相色谱法期间引起显著的柱保留。还观察到未标记的肽的事实表明TMPP标记不完全。研究了这些TMPP衍生化反应可完成的程度，并将最佳条件用于TMPP标记(图17A至图17B)。尽管存在具有与其前体不同的保留时间的未标记的对应物，但其进一步验证了由剪切产生的新N端的TMPP标记的种类。
总之，报道了TMPP标记与电子转移解离质谱法共同用作生成简单诊断离子TMPP+和TMPP-Ac-NH2 +的方法。在这些报告离子中，ETD生成了对于小胰蛋白酶肽最强的简单TMPP+报告离子。该观察结果对于典型的主链解离效率是不寻常的，对于具有相似长度的肽，典型的主链解离效率通常随着前体离子电荷而增加。双电荷离子的ETD效率低于三电荷离子或四电荷离子，这是由于因单次裂解而产生了中性产物离子(Xia等人，Journal of theAmerican Chemical Society，2007，129：12232-12243；Gunawardena等人，Journal of theAmerican Chemical Society，2005，127：12627-12639)。因此，数据表明TMPP部分上的固定电荷基团有利于有效的电子重组以产生保留电荷的有利片段(Gunawardena等人，Molecular&CellularProteomics，2016，15：740-751)。使用NIST单克隆抗体的合成标准肽以及通过从K562细胞裂解物生成具有各种长度、电荷状态和序列组成的一大批肽，证实了影响TMPP+报告离子产生的各种因素。TMPP+报告离子效率对于小双电荷肽最高。相比之下，HCD生成了未显示出电荷状态依赖性的TMPP-Ac+报告离子。ETD生成的TMPP+离子的诊断效用由98％的AUC确定，相比之下，HCD生成的TMPP-AC+离子的ROC分析的AUC为85％。触发的扫描生成TMPP+离子的能力提供了对该序列的完全探询，以在ETD未能生成双电荷离子的足够主链片段时精确定位TMPP部分或以高置信度确认该序列。针对一组TMPP衍生化的NIST合成肽和由TMPP衍生化的GLP1-Fc融合蛋白生成的胰蛋白酶肽证实了触发的MS2的高保真性。N端的标记在消化和质谱分析之前确立剪切的位点，已知消化和质谱法分析都会产生可能被误认为剪切的位点的假片段。
最后，证实了TMPP+诊断报告离子触发的MS2用于检查GLP1的组织蛋白酶诱导的剪切位点的效用。获得了与GLP1序列的顺序剪切相对应的替代肽的ETD-MS2和诊断离子触发的MS2-CID产物离子谱的证据。这些顺序剪切各自经由TMPP+诊断离子和后续报告离子触发的CID-MS2以高置信度确认。CID-MS2光谱补充了ETD鉴定和触发的MS2扫描，提供了仅在观察到报告离子时才执行CID扫描的实时计算机过滤机制。报告离子触发适合针对整个数据集的高置信度鉴定和顺着新N端向下的无缝组装。这种分析模式降低了未执行标记的地方的剪切位点检测的模糊性，并避免了评价由样品消化和质谱法条件产生的假伪影的需要。
总之，蛋白质治疗剂易于经由酶促机制和非酶促机制进行剪切以提供降解蛋白质的新N端。通常经由TMPP对N端胺基的化学衍生化，随后进行蛋白水解和质谱分析来执行治疗剂的新N端的确定。可以通过将具有TMPP修饰的肽序列作图至来源于碰撞活化的产物离子谱来鉴定TMPP标记的肽。TMPP标签的位点特异性定位允许明确确定成熟N端或新N端。除了主链产物离子之外，经由CID形成的273Da的TMPP报告离子也对经处理的N端的存在具有诊断性。然而，通过CID生成的报告离子提供的信息较少，这是由于它们的丰度较低。本文证实了用于在ETD时简单生成m/z为533Da和在一些情况下590Da的TMPP报告离子的新型高通量LC-MS方法。这些报告离子的大量生成允许后续的MS/MS事件，其使用互补离子激活模式(诸如CID、HCD或UVPD)经由强度和m/z依赖性触发事件来进一步对肽进行测序。
更具体地，证实了TMPP衍生的报告离子经由ETD-MS2和诊断离子触发的MS2事件鉴定剪切的肽以自主过滤剪切的肽的效用。已证实，本文描述的方法用于有效生成TMPP标记的标准肽的报告离子，所述TMPP标记的标准肽代表N端剪切的物类及在赖氨酸和酪氨酸残基处非期望的TMPP标记。还证实了使用具有不同序列组成、长度和电荷状态的一大批TMPP标记的肽经由ETD-MS2而不是HCD-MS2生成的报告离子的诊断效用。最后，应用本文所述的方法检查用组织蛋白酶D处理的可商购获得的GLP1激动剂度拉糖肽的GLP1肽的顺序剪切。比较TMPP报告离子用于互补解离模式ETD、HCD、CID和UVPD的效用表明，经由ETD生成的TMPP+离子的m/z＝533Da的简单电荷损失峰对于具有新N端的TMPP标记的肽最具诊断性。快速分离方法允许复杂样品中TMPP标记的肽与未标记的肽有效分离，并增强TMPP标记的肽的保留时间可预测性，以进一步改善剪切的肽的特异性和减少的假阳性鉴定。
现在描述上述实验实施例中使用的材料和方法。
化学品和试剂
(N-琥珀酰亚胺基氧基羰基)三(2，4，6-三甲氧基苯基)溴化鏻(TMPP)、4-吗啉乙磺酸一水合物(MES)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)、三甲基碳酸氢铵(TMAB)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、二甲基甲酰胺(DMF)、取自牛脾的组织蛋白酶D、1，4二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)和NIST-IgG1-K1单克隆抗体均购自Sigma(StLouis，MO)。
来自NIST单克隆抗体的肽标准品由Biomatik Corporation(Ontario，Canada)合成达到99.99％纯度。人K562预消化细胞提取物及测序级胰蛋白酶和内切蛋白酶Lys-C购自Promega(Madison，WI)。GLP1-Fc融合蛋白购自Myoderm(Norristown，PA)。Optima LC-MS级乙腈、水以及甲酸、羟胺、Gybco PBS缓冲溶液都购自Thermofisher Scientific(Waltham，MA)。
N端标记和蛋白质消化
合成肽、来自K562预消化的肽、NIST单克隆抗体和GLP1-Fc融合蛋白都用TMPP衍生化。在以下缓冲液中执行衍生化：各100mM的MES pH6、HEPES pH7和磷酸钠pH8。通过将100mg溶解于1.3mL的DMF中来制备新鲜的100mM TMPP溶液。通过采用在别处公布的衍生化方案来执行TMPP标记(Deng等人，Methods in Molecular Biology，2015，1295：249-258)。
简言之，将10μl TMPP溶液加入到50μg肽和蛋白质中并短暂混合，随后加入40μL缓冲液，然后将所得混合物温育1小时。用1μL羟胺淬灭反应，然后冻干至干燥。用0.1FA水重构干燥的肽以用于MS，并且用TMAB重构干燥的蛋白质以用于胰蛋白酶消化。
使用别处描述的方案消化蛋白质(Gunawardena等人，Molecular&CellularProteomics，2016，15：740-751)。简言之，将蛋白质用DTT还原，随后用碘乙酰胺进行烷基化。然后用内切蛋白酶Lys-C使蛋白质在37℃经受1小时的蛋白水解，随后用25mM TMAB、pH8.0、1mM CaCl2对蛋白质进行4倍稀释，并进一步用胰蛋白酶在37℃消化4小时。通过加入甲酸至0.1％来停止消化。将肽溶液在Sep-Pak Light C18小柱(Waters，Milford，MA)上脱盐并收集用于质谱法。
仪器
使用与配备有电喷雾离子源的Orbitrap Lumos(Thermo Scientific，San Jose，CA)三合一质谱仪偶联的Agilent 1200HPLC(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)并使用调谐应用软件2.1.1565.18和Xcalibur 4.0.27.13来执行所有分析。
LC-MS/MS分析
在65℃使用AdvanceBio Peptide Map Micro Bore Rapid Resolution Column(1×150mm，2.7μm)柱，在Agilent Infinity 1290 UHPLC(Agilent Technologies，SantaClara，CA)上分离经受LC-MS/MS分析的所有样品。采用以下20分钟快速LC梯度程序，该程序利用含0.1％甲酸的水作为流动相A，并利用乙腈作为流动相B：0分钟，2％B；10分钟，30％B；10.5分钟，2％B；11.5分钟，85％B；12分钟，2％B；13分钟，85％B；13.5分钟，2％B；然后是14至18分钟的洗涤步骤，85％B；并且随后在2％B下再平衡2分钟。采用120分钟LC梯度方法，该方法利用含0.1％甲酸的水作为流动相A，并利用乙腈作为流动相B：0分钟，2％B；60分钟，30％B；60.5分钟，2％B；61.5分钟，85％B；62分钟，2％B；63分钟，85％B；63.5分钟，2％B；然后是64.5至80分钟的洗涤步骤，85％B；并且随后在2％B下再平衡20分钟。所有梯度中的流速设置为0.2mL/min，并且所选择的进样体积为2μL。利用数据依赖性MS2ETD、CID、HCD、UVPD方法在正电离模式下操作质谱仪。界面条件如下：发射器电压，-2600V；气化器温度，325℃；离子传输管，325℃；鞘气，55(arb)；辅助气体，10(arb)；和吹扫气体，1(arb)。
方法设置
除非另行指出，否则用于MS扫描的内部质谱仪设置如下：RF透镜，60％；AGC(自动增益控制)目标，4e5；最大注射时间，50ms；和在Orbitrap质量分析仪上以轮廓模式在50K分辨率下的1μ扫描。然后该方法在任何HCD MS2事件之前依次包括一系列过滤器。对于所有方法包括单同位素峰选择过滤器并将其设置为肽。除非另行指出，否则le5的强度过滤器用于所有方法。包括对于选择前体电荷状态2至6的一些方法的任选的电荷状态过滤器。对于具有12s或3s排除窗口的一些方法包括可选的动态排除(DE)过滤器，并且该过滤器具有以下通用参数：排除n＝1次；+/-3ppm；排除同位素；和每个前体的单个电荷状态。对于一种方法包括顶点检测并将其设置为：预期峰宽，6s；期望顶点窗口，30％。有五次ddMS2OT-ETD扫描，除非另行指出，否则设置如下：四极分离，2m/z分离窗口；50ms的反应时间，检测器类型，Orbitrap，自动m/z正常扫描范围，15K分辨率，100m/z第一质量；AGC目标，2e5，经所有可用的可平行时间注射离子，最大注射时间50ms；1μscan，轮廓。目标质量触发器(TMT)遵循ddMS2IT-CID并且包括离子533.193、690.214；+/-5ppm误差容限；从明确说明的列表中检测2个或1个离子；所有质量触发器仅使用前10个最强离子内的离子。除非另行指出，否则后续的ddMS2OT-CID条件如下：MSn水平，2；四极分离，1.6m/z分离窗口；CID碰撞能量，30；活化Q，0.25；检测器类型，Orbitrap，自动m/z正常扫描范围，15K分辨率；AGC目标，5e4，经所有可用的可平行时间注射离子，最大注射时间22ms；1μscan，轮廓。在ddMS2OT-ETD和ddMS2IT-CID之间的依赖性扫描数设置为1。有五次ddMS2OT-HCD扫描，除非另行指出，否则设置如下：四极分离，1.6m/z分离窗口；HCD碰撞能量，40％，分步5％；检测器类型，Orbitrap，自动m/z正常扫描范围，15K分辨率，100m/z第一质量；AGC目标，5e4，经所有可用的可平行时间注射离子，最大注射时间35ms；1μscan，轮廓。
数据分析
用购自Thermo Scientific(San Jose，CA)的Xcalibur可视化软件、购自ProteinMetrics(Cupertino，CA)的Byos 3.9色谱和质谱法数据分析软件以及R 3.6统计编程软件(Vienna，Austria)执行数据分析。
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅是为了进行示意性的说明，并且可在不脱离本发明的广泛发明构思的情况下对上述实施方案进行修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖符合本发明实质和范围的修改，如所附权利要求书中定义的。
本领域的普通技术人员可以认识到，在实现本发明时期望和/或需要其他元件和/或步骤。然而，由于此类元件和步骤为本领域所熟知的，并且由于它们不利于较好地理解本发明，因此本文未提供对此类元件和步骤的讨论。本文的公开内容涉及对本领域技术人员已知的此类元件和方法的所有此类变型和修改。
本文所引用的每项专利、专利申请和专利公开中的公开内容均全文以引用方式并入本文中。尽管已结合具体实施方案公开了本发明，但是显而易见，本领域其他技术人员可以在不脱离本发明的真正实质和范围的情况下设计本发明的其他实施方案和变型形式。所附权利要求旨在被理解为包括所有此类实施方案及等同变型形式。
Claims (57)
1.一种表征样品中的N-三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基（TMPP）标记的肽的方法，包括：
(i) 使所述样品经受电子诱导解离串联质谱法以获得所述TMPP标记的肽的第一质谱；
(ii) 通过在所述TMPP标记的肽的所述第一质谱中检测或分离TMPP报告离子来鉴定所述TMPP标记的肽；
(iii) 使所述鉴定的TMPP标记的肽经受第二质谱法，从而生成所述TMPP标记的肽的第二质谱；以及
(iv) 通过分析所述第一质谱和所述第二质谱来表征所述TMPP标记的肽。
2.一种表征多肽的方法，包括：
(i) 用N-三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基（TMPP）标记所述多肽以获得TMPP标记的多肽；
(ii) 消化所述TMPP标记的多肽以生成包含一种或多种未标记的肽和一种或多种TMPP标记的肽的混合物；
(iii) 使所述混合物经受液相色谱法（LC）以生成所述LC的洗脱液；
(iv) 使所述洗脱液经受电子诱导解离串联质谱法以获得所述一种或多种TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的第一质谱；
(v) 通过在所述一种或多种TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的所述第一质谱中检测或分离TMPP报告离子来鉴定所述一种或多种TMPP标记的肽；
(vi) 使所述鉴定的一种或多种TMPP标记的肽经受第二质谱法，从而生成所述一种或多种TMPP标记的肽中的所述每种TMPP标记的肽的第二质谱；以及
(vii) 通过分析所述一种或多种TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的所述第一质谱和所述第二质谱来表征所述多肽。
3.一种鉴定蛋白质上的剪切位点的方法，包括：
(i) 获得含有所述蛋白质的一种或多种剪切的多肽的样品；
(ii) 用N-三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基（TMPP）标记所述一种或多种剪切的多肽，从而获得一种或多种TMPP标记的剪切的多肽；
(iii) 消化所述一种或多种TMPP标记的剪切的多肽以生成包含未标记的肽和TMPP标记的肽的混合物；
(iv) 使所述混合物经受液相色谱法（LC）以生成所述LC的洗脱液；
(v) 使所述洗脱液经受电子诱导解离串联质谱法以获得所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的第一质谱；
(vi) 通过在所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的所述第一质谱中检测或分离TMPP报告离子来鉴定所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽；
(vii) 使所述鉴定的TMPP标记的肽中的每种鉴定的TMPP标记的肽经受第二质谱法，从而生成所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的第二质谱；以及
(viii) 通过分析所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的所述第一质谱和所述第二质谱来鉴定所述蛋白质上的所述剪切位点。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述电子诱导解离是电子转移解离（ETD）或电子捕获解离（ECD）。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一质谱是ETD质谱或ECD质谱。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比（m/z）。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述第二质谱法。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第二质谱法包括碰撞诱导解离（CID）、高能碰撞解离（HCD）或紫外光解离（UVPD）。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第二质谱包括CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述TMPP报告离子触发所述CID质谱法、HCD质谱法或UVPD质谱法。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子由电荷损失生成。
12.根据权利要求2至11中任一项所述的方法，其中所述LC是高效液相色谱（HPLC）。
13.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
14.根据权利要求3至12中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是非治疗性蛋白质。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述方法是高通量的。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析所述第一质谱和所述第二质谱。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述第二质谱法是所述CID质谱法。
18.一种鉴定蛋白质上的剪切位点的方法，包括：
(i) 获得含有所述蛋白质的一种或多种剪切的多肽的样品；
(ii) 用N-三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基（TMPP）标记所述一种或多种剪切的多肽，从而获得一种或多种TMPP标记的剪切的多肽；
(iii) 消化所述一种或多种TMPP标记的剪切的多肽以生成包含未标记的肽和TMPP标记的肽的混合物；
(iv) 使所述混合物经受液相色谱法（LC）以生成所述LC的洗脱液；
(v) 使所述洗脱液经受串联质谱法，从而为所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽生成第一电子转移解离（ETD）质谱；
(vi) 在所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的所述ETD质谱中检测或分离TMPP报告离子；
(vii) 在检测或分离所述TMPP报告离子后，使所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽经受包括碰撞诱导解离（CID）、高能碰撞解离（HCD）或紫外光解离（UVPD）的第二质谱法，从而分别为所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽生成CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱；以及
(viii) 通过分析所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽的所述ETD质谱和所述CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱来鉴定所述蛋白质上的所述剪切位点。
19.根据权利要求18中任一项所述的方法，其中所述TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比（m/z）。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述TMPP报告离子由电荷损失生成。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述LC是高效液相色谱（HPLC）。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
23.根据权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是非治疗性蛋白质。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述方法是高通量的。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析所述ETD质谱和所述CID质谱或HCD质谱或UVPD质谱。
26.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述TMPP标记的肽中的每种TMPP标记的肽经受所述CID质谱法。
27.一种用于鉴定多肽上的剪切位点或表征样品中的多肽的系统，所述系统包括液相色谱（LC）装置和串联质谱仪，其中所述串联质谱仪包括：
(i) 第一电离装置；
(ii) 第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪，所述第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪在第一操作模式下被布置为并适于传输具有在第一范围内的质荷比的离子；
(iii) 第一离子迁移谱仪、检测器或分离器；
(iv) 衰减部件，所述衰减部件用于在操作模式下使离子衰减；
(v) 控制装置，所述控制装置被配置为控制所述衰减部件的操作，使得具有在所述第一范围内的质荷比但具有一个或多个非期望的第一电荷状态的离子基本上被衰减；
(vi) 第二电离装置；
(vii) 第二离子迁移谱仪、检测器或分离器；以及
(viii) 数据系统，所述数据系统被配置为获取片段离子的非混合信号并对触发离子进行非冗余编码，所述非冗余编码被布置为避免或最小化在任何单独选通时间的多次重复时来自不同母体物类的任何两个离子信号的重复重叠。
28.根据权利要求27所述的系统，其中所述第一电离装置是电子诱导解离装置。
29.根据权利要求28所述的系统，其中所述电子诱导解离装置是电子转移解离（ETD）装置或电子捕获解离（ECD）装置。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的系统，其中所述第二电离装置是碰撞诱导解离（CID）装置、高能碰撞解离（HCD）装置或紫外光解离（UVPD）装置。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的系统，其中所述质谱仪还包括碰撞装置、碎裂装置或反应装置。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的系统，其中所述衰减部件包括离子门或离子障壁。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的系统，其中所述衰减部件被布置在所述离子迁移谱仪或分离器的下游。
34.根据权利要求27至33中任一项所述的系统，其中所述第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪被布置为并适于在所述第一操作模式下使具有在所述第一范围之外的质荷比的离子衰减。
35.根据权利要求27至34中任一项所述的系统，其中所述第一质荷比过滤器或质荷比质量分析仪被布置在所述离子迁移谱仪或分离器的上游或下游。
36.根据权利要求27至35中任一项所述的系统，其中第一非期望的电荷状态选自以下各项中的一项或多项：(i)单电荷；(ii)双电荷；(iii)三电荷；(iv)四电荷；(v)五电荷；以及(vi)多电荷。
37.根据权利要求27至36中任一项所述的系统，还包括被布置在所述离子迁移谱仪或分离器上游的离子引导器、离子阱或离子俘获区，其中所述离子引导器、离子阱或离子俘获区被布置为俘获、储存或累积离子，然后周期性地将离子以脉冲方式发射到所述离子迁移谱仪或分离器中或以脉冲方式向所述离子迁移谱仪或分离器发射离子。
38.根据权利要求27至37中任一项所述的系统，其中所述样品经受所述LC装置以生成洗脱液。
39.根据权利要求38所述的系统，其中所述洗脱液经受所述串联质谱法以获得第一质谱和第二质谱。
40.根据权利要求39所述的系统，其中所述第一质谱是ETD质谱或ECD质谱。
41.根据权利要求39所述的系统，其中所述第二质谱包括CID质谱、HCD质谱或UVPD质谱。
42.根据权利要求27至41中任一项所述的系统，其中用N-三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基（TMPP）标记所述多肽上的所述剪切位点或所述多肽。
43.根据权利要求42所述的系统，其中所述第一电离装置生成TMPP报告离子。
44.根据权利要求43所述的系统，其中所述TMPP报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比（m/z）。
45.根据权利要求43或44所述的系统，其中所述TMPP报告离子触发所述第二质谱法。
46.根据权利要求27至45中任一项所述的系统，其中所述LC是高效液相色谱（HPLC）。
47.根据权利要求38至46中任一项所述的系统，其中通过与数据库或光谱库中的信息进行比较来分析所述第一质谱和所述第二质谱。
48.一种用于鉴定多肽上的剪切位点的报告离子，
其中用N-三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基（TMPP）标记所述剪切位点，并且
其中使所述TMPP电离以生成所述报告离子。
49.一种用于表征多肽的报告离子，
其中用N-三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基（TMPP）标记所述多肽，并且
其中使所述TMPP电离以生成所述报告离子。
50.根据权利要求48或49所述的报告离子，其中通过质谱仪使所述TMPP电离以生成所述报告离子。
51.根据权利要求50所述的报告离子，其中所述质谱仪是串联质谱仪。
52.根据权利要求51所述的报告离子，其中所述串联质谱仪包括电子转移解离（ETD）装置、电子捕获解离（ECD）装置、碰撞诱导解离（CID）装置、高能碰撞解离（HCD）装置、紫外光解离（UVPD）装置或它们的任何组合。
53.根据权利要求52所述的报告离子，其中所述报告离子具有约533Da、约573Da或约590Da的标称质荷比（m/z）。
54.根据权利要求53所述的报告离子，其中所述报告离子是具有选自以下的结构的化合物：
式(I)，
式(II)，和
式(III)。
55.一种用于鉴定多肽上的剪切位点的组合物，其中所述组合物包含至少一种根据权利要求48和50至54中任一项所述的报告离子和多肽。
56.一种用于表征多肽的组合物，其中所述组合物包含至少一种根据权利要求49至54中任一项所述的报告离子和多肽。
57.一种用于鉴定多肽上的剪切位点或表征样品中的多肽的试剂盒，所述试剂盒包含：
(i) 用于标记所述多肽上的所述剪切位点的N-三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基（TMPP）或用于标记所述多肽的N-三(2,4,6-三甲氧基苯基)鏻乙酰基（TMPP）；以及
(ii) 说明性材料。
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| CN114137124B (zh) * | 2021-12-01 | 2024-04-12 | 北京中医药大学 | 一种对蛋白进行快速肽图分析的方法 |
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Non-Patent Citations (1)
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| NALINI SADAGOPAN ET AL.,: "Investigation of the Tris(trimethoxyphenyl)phosphonium Acetyl Charged Derivatives of Peptides by Electrospray Ionization Mass Spectrometry and Tandem Mass Spectrometry", AMERICAN SOCIETY FOR MASS SPECTROMETRY, pages 109 - 119 * |
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