JP5903051B2 - ポリペプチドの配列バリアントの決定方法 - Google Patents
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Description
タンパク質は、今日の医薬品ポートフォリオにおいて重要な役割を果たしている。ヒトへの適用のために、すべての治療用タンパク質は、明確な基準を満たしていなければならない。生物薬剤の対人安全性を確保するため、治療用タンパク質の特性は一定の制限内に収まらなければならず、かつ製造プロセスにおいて蓄積される副産物は、特に、除去されなければならない。
(a)ポリペプチドの試料を少なくとも2つ提供する工程、
(b)該試料を各々、プロテアーゼと共にインキュベートする工程、
(c)逆相クロマトグラフィー分離と質量分析および/またはMS/MS分析との組み合わせを含む二次元データ分析により、該インキュベートした試料を分析する工程、
(d)工程(c)で一つの試料から得られたデータセットを参照試料と定義して、工程(c)で他の試料から得られたデータセットと参照試料のデータセットを比較する工程であって、判定される差異の全てが、該ポリペプチドのアミノ酸配列バリエーション(変異)であり、それによってポリペプチドのアミノ酸配列バリアントを決定する、工程。
(a)ポリペプチドの試料を少なくとも2つ提供する工程、
(b)該試料を各々、プロテアーゼと共にインキュベートする工程、
(c)逆相クロマトグラフィー分離と質量分析および/またはMS/MS分析との組み合わせを含む二次元データ分析により、該インキュベートした試料を分析する工程、
(d)工程(c)で一つの試料から得られたデータセットを参照試料と定義して、工程(c)で他の試料から得られたデータセットと参照試料のデータセットを比較する工程であって、判定される差異の全てが、該ポリペプチドにおけるアミノ酸配列変異であり、それによってポリペプチドにおけるアミノ酸配列変異を判定する、工程
あるいは、
(a)ポリペプチドの試料を少なくとも1つ提供する工程、
(b)試料をプロテアーゼと共にインキュベートする工程、
(c)逆相クロマトグラフィー分離と質量分析および/またはMS/MS分析との組み合わせを含む二次元データ分析により、該インキュベートした試料を分析する工程、
(d)工程(c)で試料から得られたデータセットと、工程(b)および(c)で報告される方法により決定された参照試料のデータセットを比較する工程であって、判定される差異の全てが、該ポリペプチドにおけるアミノ酸配列変異であり、それによってポリペプチドにおけるアミノ酸配列変異を判定する、工程。
を含むことを特徴とする、ポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸配列変異を判定する方法である。
(e)MS/MSフラグメンテーションおよびデータ分析によりアミノ酸配列バリエーション(変異)の種類および位置を決定する工程
をさらに含む。
(a)ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を少なくとも2つ提供する工程、
(b)細胞を個別播種(single depositing)および培養する工程、
(c)個別播種した細胞を用いて本明細書で報告する方法を実施する工程、
(d)アミノ酸バリエーション(アミノ酸配列変異)を最小数および/または最小比で含むポリペプチドを産生する細胞を選択する工程、
(e)選択された細胞を培養する工程、
(f)細胞または培養培地からポリペプチドを回収することによってポリペプチドを産生する工程。
[本発明1001]
以下の工程を含むことを特徴とする、変異アミノ酸配列を有するポリペプチドを決定する方法:
(a)ポリペプチドの試料を少なくとも2つ提供する工程、
(b)該試料を各々、同一のプロテアーゼと共にインキュベートする工程、
(c)逆相液体クロマトグラフィー分離と質量分析および/またはMS/MS分析との組み合わせを使用する二次元データ分析により、該インキュベートした試料を分析する工程、
(d)工程(c)で一つの試料から得られたデータセットを参照試料と定義して、工程(c)で他の試料から得られたデータセットと参照試料のデータセットを比較する工程であって、判定されるアミノ酸配列の差異の全てが、該ポリペプチドにおけるアミノ酸配列変異であり、それによって変異アミノ酸配列を有するポリペプチドを決定する、工程。
[本発明1002]
参照質量スペクトルシグナルの強度に対する試料質量スペクトルシグナルの強度の比が3より大きいアミノ酸配列の差異の全てが、アミノ酸配列変異であることを特徴とする、本発明1001の方法。
[本発明1003]
パターン比較用のm/zフレーム幅が、1.6またはそれを上回ることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
(e)MS/MS分析によりアミノ酸配列中のアミノ酸変異の種類および位置を決定する工程
をさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
既知のアミノ酸配列変異を有するポリペプチドでスパイクされたポリペプチドを含むさらなる試料が提供され、かつ提供された試料に加えて、該さらなる試料がインキュベート、分析、および比較されることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
分析する工程が、pH8.0未満のpH値および40℃未満の温度で実施されることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
試料が、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液中に提供されることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
試料とプロテアーゼをインキュベートする工程が、ポリペプチドをプロテアーゼにより3〜60アミノ酸残基長のアミノ酸配列断片に切断することであることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
工程(d)の比較する工程が、1つまたは複数またはすべてのMS電荷状態のデータを用いて実施されることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリン結合体であることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
試料をプロテアーゼと共に16時間〜18時間インキュベートした後、蟻酸またはトリフルオロ酢酸を添加することを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
試料をプロテアーゼと共に4時間インキュベートした後、蟻酸またはトリフルオロ酢酸を添加することを特徴とする、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1013]
比較する工程が、参照試料および他の分析対象試料各々の質量分析トータルイオンクロマトグラム(MS-TIC)をオーバーレイすることを含み、
ここで、オーバーラップおよびアラインしたすべての質量の強度比が計算され、比が10より大きいピークがアミノ酸配列変異と評価されることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
比較する工程が、理論的アミノ酸配列のDNA翻訳タンパク質分解断片ペプチドパターンと分析対象試料の質量分析トータルイオンクロマトグラム(MS-TIC)を比較する工程を追加で含み、かつ、該理論的アミノ酸配列の算出された理論的質量の各々にまたは該理論的質量から、アミノ酸を変化させる三塩基組(コドン)における核酸変異、欠失または挿入により生じる質量差をそれぞれ加えるまたは減ずることにより、アミノ酸配列変異が同定されることを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
以下の工程を含む、ポリペプチドを産生する方法:
- ポリペプチドを産生する細胞を選択する工程であって、該ポリペプチドが、全処理試料の中で、または、本発明1001〜1014のいずれかの方法により決定された参照試料もしくは既定のアミノ酸配列に対して、最小数のアミノ酸配列変異を含む、工程。
[本発明1016]
以下の工程を含む、免疫グロブリンを産生する方法:
(a)免疫グロブリンをコードする核酸を含む細胞を少なくとも2つ提供する工程、
(b)該細胞を個別播種および培養する工程、
(c)本発明1001〜1014のいずれかの方法を実施する工程、
(d)参照試料に対して最小数のアミノ酸配列変異を含む免疫グロブリンを産生する細胞を選択する工程、
(e)該細胞を培養する工程、
(f)該細胞または培養培地からポリペプチドを回収することによって該ポリペプチドを産生する工程。
例えば組み換え法により産生される、治療用タンパク質は、アミノ酸配列がわずかに異なる分子の混合物であり得、その違いはアミノ酸配列のC末端またはN末端のみならず、アミノ酸配列内にも見られる(例えば、アミノ酸変異、交換、酸化またはチオエーテル形成)。アミノ酸配列変異(バリエーション)は、本明細書で報告する方法を用いてペプチドマッピング手法により検出することができる。これらのアミノ酸配列変異(バリエーション)は、例えば、i)核酸複製の際の核酸ポリメラーゼのエラーにより、またはii)核酸転写の際のRNAポリメラーゼもしくはスプライシング装置のエラーにより、またはiii)タンパク質翻訳の際の誤ったt-RNAの取得によりもしくは誤ったアミノ酸を保持するt-RNAにより、またはiv)意図せぬ翻訳後修飾もしくはシグナルペプチドの不完全除去として、発生し得る。したがって、アミノ酸配列変異(バリエーション)は、各ポリペプチドをコードするDNAの組み込み/増幅プロセス、またはコード核酸の複製、または転写後修飾(例えば、mRNAスプライシングの際もしくはRNA編成の際)を含む転写に起因し得るか、あるいは翻訳の間に起こりうる。リボソームから分子が放出された後の個々のアミノ酸残基の修飾に起因するアミノ酸バリエーションは、必ずしも意図されていないとは言えない翻訳後修飾と定義され、本明細書が指す変異(バリアント)ではない。
複製:-通常のポリメラーゼで、複製核酸塩基108〜1012個あたり1個、
-エラープローンポリメラーゼで、複製核酸塩基101〜103個あたり1個;
転写:転写核酸塩基対104〜105個あたり1個;
翻訳:導入アミノ酸残基103〜104個あたり1個。
ケースA:予め特徴決定された試料を利用できる場合、これを参照試料として選択することができ、判定対象の試料をこれと比較することができる:既知のペプチドパターンおよびピーク割当(peak assignment)が参照として使用され、試料において検出された差異はいずれもアミノ酸配列変異(バリエーション)であり得る。そのような参照物質は、十分に特徴決定された細胞株由来、例えば明確な発酵プロセス由来の物質であり得る。
ケースB:予め特徴決定された試料が利用できない場合、
a)一つの試料のピーク割当に関する完全な特徴決定を実施し、ケースAを適用/続行することができる(ケースB-1);または
b)一つの試料を参照試料として任意選択し(ケースB-2)、残りの試料をそれと比較する;これは、参照試料および非参照試料の両方における差異すなわち変異の判定を含む。
分析対象のポリペプチドを含む試料をプロテアーゼ、例えばトリプシンで消化し、特有のアミノ酸配列断片(ペプチド)を得る。一つの態様において、アミノ酸配列断片のサイズは3または4アミノ酸残基長から始まり最大60アミノ酸残基長である。第二の工程では、アミノ酸配列断片のクロマトグラフィー分離(逆相高速液体クロマトグラフィー、RP-HPLC)と、それに接続された、フーリエ変換イオンサイクロトロン(FT-ICR/FT-orbitrap)技術を用いる高分解能質量分析(MS)および質量分析装置内での衝突誘起解離(CID)により得られたアミノ酸配列断片の質量分析(MS/MS)を行う。これは、二次元データ分析である。分析が二次元、すなわち時間対質量であるため、分解が向上し得る。また、二次元分析であるがゆえに、MS分析の前に低分解性の液体クロマトグラフィー分離を受け入れることができ、その際にオーバーラップしたピークはMS分析時に分解することができる。
以下では、本明細書で報告するすべての方法の具体的態様について解説する。
評価対象の試料を、利用可能な参照試料と共に分析する。各試料および参照試料に対して少なくとも2回、決定を行うべきである。陽性対照として、参照試料と類似する、すなわち1または2のアミノ酸配列変異(バリエーション)を含む試料を参照試料にスパイクし、人工変異アミノ酸配列(バリアント)として使用する。人工変異アミノ酸配列(バリアント)は、一つの態様において、この方法の全体感度の確認のために、0.5%(w/w)で参照試料にスパイクする。分析方法のパラメータを設定するために、参照試料、すなわち、変異(修飾)を有さないまたは既知の変異(修飾)パターンを有する組み換え産生ポリペプチドを用いて得られた結果、および人工アミノ酸配列変異(バリアント)を含む変異アミノ酸配列でスパイクした参照試料を用いて得られた結果を比較することができる。これらのパラメータを用いて、以下の分析を実施することができる。
a)参照試料と試料で同じ質量、同じ強度のピークは約1の値を示し、分析対象試料においてより高頻度で存在する質量は1より大きい値を示し、
b)1より大きい値を有する、一つの態様では、3より大きい、または10より大きい、または100より大きい値を有する、一つの態様では、10〜5*109の値を有する、別の態様では、100〜5*109の値を有する、すべての質量を同定し、ここで、その同定のために、親の質量に対応するすべてのMS/MSスペクトルを使用し、それらの異なる電荷状態も考慮し、
c)変異アミノ酸配列(バリエーション)の定量化は、質量スペクトルにおける1つまたは複数またはすべての電荷状態を使用することによって、互いに対して相対的に実施することができ、ここで、天然アミノ酸配列および変異アミノ酸配列(バリアント)で同じ電荷状態を選択し、抽出イオンクロマトグラム(EIC)を生成し、EICにおける相互に対応するピークの曲線下面積を、次式にしたがい、互いに対して相対的に定量化する。
このケースでは、予め特徴決定された試料が利用可能でない。提供された分析対象試料の一つについて(このケースでは1つ以上の分析対象試料が利用可能である必要がある)、TICにおけるすべての決定された質量と理論的に決定されたペプチドパターンのアラインメントを、(消化に既定のプロテアーゼを用いて)実施することができる、すなわち、ピーク割当を実施することができる。正確なアラインメントのために重要なのは、一方では厳密な質量であり、他方では提唱されたペプチドの配列確認のためのMS/MSフラグメントカバー域であり得る。一つの特定の態様において、アミノ酸配列変異(バリエーション)は、算出された天然アミノ酸配列の理論的質量の各々に、または当該理論的質量から、核酸変異すなわちアミノ酸配列を変化させる三塩基組(コドン)における単一ヌクレオチド置換、欠失または挿入により生じる質量差を、それぞれ足すまたは引くことによるエラー・トレラント・サーチにより同定することができる。その後、提唱されたアミノ酸配列変異(バリエーション)を、MS/MSフラグメンテーションパターンにより確認する必要がある。それと共に、アミノ酸配列変異の種類(差異)だけでなくアミノ酸変異の位置(変化)も、MS/MS分析におけるフラグメントの質量によりカバーされている必要がある。
- ペプチドマップからアミノ酸配列変異(バリエーション)を含むポリペプチドを単離し、エドマン配列決定を行う、
- アミノ酸変異(バリエーション)を有するペプチドを合成し、それをMSおよびMS/MS分析においてポリペプチドにスパイクし、保持およびMS/MSプロフィールを確認する、
- 各試料を産生する細胞クローンのDNA配列決定によりその存在を確認する、
- 異なるタンパク質分解酵素で消化し、それによって得られた断片を分析する、
のいずれかによりその検出を確認することによって排除することができる。
変異(バリエーション)を有するポリペプチドの検出感度の評価は、モデルポリペプチドであるモノクローナル抗体(mAb)を、アミノ酸配列変異(バリエーション)を有する第2のmAbにより様々な割合すなわち様々な濃度でスパイクすることによって実施した。一つの例において、本明細書で報告する方法により2つの異なるペプチドが同定されることを予想して、アミノ酸配列変異(バリエーション)を有するmAbを1%(w/w)スパイクした。
(a)ポリペプチドの試料を少なくとも2つ提供する工程、
(b)該試料を各々、同一のプロテアーゼと共にインキュベートする工程、
(c)逆相液体クロマトグラフィー分離と質量分析および/またはMS/MS分析との組み合わせを使用する二次元データ分析により、該インキュベートした試料を分析する工程、
(d)工程(c)で一つの試料から得られたデータセットを参照試料と定義して、工程(c)で他の試料から得られたデータセットと参照試料のデータセットを比較する工程であって、判定されるアミノ酸配列の差異の全てが、該ポリペプチドにおけるアミノ酸配列変異であり、それによって変異アミノ酸配列を有するポリペプチドを決定する、工程。
- ポリペプチドを産生する細胞を選択する工程であって、該ポリペプチドが、全処理試料の中で、または、本明細書で報告する方法により決定された参照試料もしくは既定のアミノ酸配列に対して、それぞれ最小数もしくは最小比のアミノ酸配列変異を含む、工程。
(a)免疫グロブリンをコードする核酸を含む細胞を少なくとも2つ提供する工程、
(b)該細胞を個別播種および培養する工程、
(c)本明細書で報告する方法を実施する工程、
(d)参照試料に対してそれぞれ最小数または最小比のアミノ酸配列変異を含む免疫グロブリンを産生する細胞を選択する工程、
(e)該細胞を培養する工程、
(f)該細胞または培養培地からポリペプチドを回収することによって該ポリペプチドを産生する工程。
配列番号:1 抗CCR5抗体重鎖可変ドメイン1
配列番号:2 抗CCR5抗体軽鎖可変ドメイン1
配列番号:3 抗CCR5抗体重鎖可変ドメイン2
配列番号:4 抗CCR5抗体軽鎖可変ドメイン2
配列番号:5 抗CCR5抗体重鎖可変ドメイン3
配列番号:6 抗CCR5抗体軽鎖可変ドメイン3
配列番号:7 ヒトIgG1定常領域
配列番号:8 ヒトIgG4定常領域
配列番号:9 ヒトκ軽鎖定常ドメイン
配列番号:10 ヒトλ軽鎖定常ドメイン
材料および方法
参照および試料の試料調製法:
a)還元およびアルキル化:
250μgの免疫グロブリン、最大100μl量を、変性緩衝液(0.4 M Tris-HCl、8.0 M グアニジン塩酸塩、pH 8)で希釈し終量240μlとした。この溶液に20μlのジチオトレイトール(変性緩衝液中240 mM)を添加し、混合物を37℃±2℃で60分間インキュベートした。その後、20μlのヨード酢酸溶液(純水中0.6 M)を添加し、激しく混合し、室温、暗所で15分間インキュベートした。アルキル化反応は、30μlのジチオトレイトール溶液(変性緩衝液中240 mM)の添加によって停止させた。
変性、還元、カルボキシメチル化免疫グロブリンを含む溶液の300μl(およそ250μgまたは3.2 nmol)の緩衝液を、NAP(商標)5 Sephadex(商標)G-25脱塩カラムを用いて交換した。簡潔に説明すると、このカラムを、50 mM Tris-HClを含むpH 7.5の緩衝液溶液10 mlで平衡化し、試料をカラムに適用し、カラムを350μlの上記緩衝液溶液で洗浄し、そして試料をおよそ480μl分回収した。各工程(カラムの平衡化、試料の適用、洗浄および溶出)の間に、溶液を充填カラム床全体に行き渡らせた。
緩衝液交換した免疫グロブリン溶液に48μlのトリプシン溶液(Tris-HCl中0.2 g/l、pH 7.5)を添加し、37℃で約16時間室温でインキュベートした。消化は、20μlの10%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)溶液の添加により停止させた。
LC-MS/MS分析は、トリプシン消化工程で得られた加水分解ペプチドのクロマトグラフィー分離(LC)と、それに続く、HPLCと質量分析装置の間のインターフェースとしてAdvion BioSciences製のナノESIイオン源を用いるMSおよびMS/MS検出のそれぞれにより実施した。
HPLC: Dionex Ultimate 3000
流速: 40μl/分
UV検出波長: 220 nmおよび280 nm
カラムオーブンの温度: 35℃
試料ループ: 10μl
カラム: Dionex pep Map C18、3μm、100Å、1 x 150 mm
注入量: 10μl
溶出液A=0.1%蟻酸を含むHPLCグラジエントグレード水
溶出液B=0.1%蟻酸を含むHPLCグラジエントグレードアセトニトリル
ナノESI源: Triversa NanoMate(Advion)
質量分析装置イオン源への流量: およそ200 nl/分、フロースプリッター制御
ガス圧: 0.1〜0.5 psi
印加電圧: 1.1〜1.7 kV
陽イオン: 選択
機器: ESI LTQ-FT ICR(Thermo Scientific)
キャピラリー温度: 175℃
MS/MSのイオントラップ衝突エネルギー: 40%
チューブレンズ電圧: 100 V
動的除外(Dynamic exclusion)特性: 入(反復計数(Repeat Count):1、
除外時間(Exclusion Duration):8
秒、除外質量幅(Exclusion mass
width):3 ppm)
抗CD19抗体参照および試料の分析
データの生成:
参照および試料の抗CD19抗体を、材料および方法の節にしたがい処理した。MSデータを、材料および方法の節にしたがい取得した。
a)LC-MSデータセットを用いる参照・試料間の差異の検出
参照および試料について得た質量プロフィール(トータルイオンクロマトグラム(TIC)、図2参照)の比較には、SIEVE(商標)ソフトウェアパッケージ(バージョン1.1.0、Thermo Scientific製)を使用した。簡潔に説明すると、参照および試料のTICデータセットを保持時間でアラインし(図3)、プリセットの保持時間ウィンドウ内のプリセットの閾値に達するまでの質量ピーク強度について比較した(図4および5)。
フレームm/z幅: 1.6
フレーム時間幅: 0.3分
強度閾値: 10000
M/z開始: 350
M/z最終: 2000
検索ピーク幅: 30%
保持時間開始: 5分
保持時間終了: 60分
i)クロマトグラフィー分解能(フレーム時間幅)、および
ii)使用した機器の感度およびバックグラウンドノイズ(強度閾値)
前段落に記載される手順を用いて見出された差異の同定に関して、最初に、同位体ピーククラスターを、ペプチドに典型的なものであることについて検査した。次に、各m/zシグナルがMS/MSフラグメンテーションの生成のために選択されたかどうか、およびそれがMascotエラー・トレラント・サーチ(Mascot ETS)によって同定されるかどうかを検査した。Mascot ETSによって同定された各暫定配列バリアントを、得られたMS/MSフラグメントイオンスペクトルを用いて手作業で検査および確認した(図6および7参照)。
同定された変異アミノ酸配列(バリアント)を、変異(バリエーション)を含む(トリプシン消化)アミノ酸配列断片のレベルで、かつ同一試料中のオリジナルの非変異アミノ酸配列断片との関係で、定量化した(図8および9参照)。試料のLC-MSデータから2つの抽出イオンクロマトグラム(EIC)、一方は試料用、一方は参照試料用、を生成した。抽出イオンクロマトグラム(EIC)は、各ペプチドのすべての電荷状態およびすべての同位体ピークを含む。各EICにより生成されたピークを、機器ソフトウェア(XCalibur)を用いて積分し、それによって算出された面積を以下の式で使用する:
ここで、すべての電荷状態およびすべての同位体ピークを網羅する抽出イオンクロマトグラムのピーク面積を使用する。
抗CCR5抗体参照および試料の分析
可変ドメインすなわち軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインにおける単一アミノ酸変化(変異)の判定のために、抗CCR5抗体を用いた。第一のすなわち参照抗CCR5抗体は、配列番号:1および2、配列番号:3および4、ならびに配列番号:5および6の対から選択される可変重鎖および可変軽鎖ドメインアミノ酸配列を有する。第二のすなわち試料抗CCR5抗体は、以下のアミノ酸変異(変化)を有する:重鎖可変ドメイン(VH)において、109アミノ酸位のイソロイシン残基がスレオニンに変異(変化)しており(VH-I109T)、軽鎖可変ドメイン(VL)において、52アミノ酸位のバリン残基がイソロイシンに変異(変化)している(VL-V52I)。
参照および試料について得た質量プロフィール(トータルイオンクロマトグラム(TIC))の比較には、SIEVE(商標)ソフトウェアパッケージ(バージョン1.1.0、Thermo Scientific製)を使用した。簡潔に説明すると、参照および試料のデータセットを保持時間でクロマトグラフィー的にアラインし(図10)、プリセットの保持時間ウィンドウ内のプリセットの閾値に達するまでの質量ピーク強度について比較した(図11)。
前段落に記載される手順を用いて見出された差異の同定に関して、最初に、同位体ピーククラスターを、ペプチドに典型的なものであることについて検査した。次に、各m/zシグナルがMS/MSフラグメンテーションの生成のために選択されたかどうか、およびそれがMascotエラー・トレラント・サーチ(Mascot ETS)によって同定されるかどうかを検査した。Mascot ETSによって同定された各暫定配列変異(バリアント)を、得られたMS/MSフラグメントイオンスペクトルを用いて手作業で検査および確認した。
同定された変異アミノ酸配列(バリアント)を、変異(バリエーション)を含む(トリプシン消化)アミノ酸配列断片のレベルで、かつ同一試料中のオリジナルの非変異ペプチドとの関係で、定量化した(図12および13参照)。試料のLC-MSデータから2つの抽出イオンクロマトグラム(EIC)、一方は変異ペプチド(バリアント)用、一方はネイティブペプチド用、を生成した。抽出イオンクロマトグラム(EIC)は、各ペプチドのすべての電荷状態およびすべての同位体ピークを含む。各EICにより生成されたピークを、機器ソフトウェア(XCalibur)を用いて積分し、それによって算出された面積を実施例1に示される式にしたがい使用する。
Claims (10)
- 以下の工程を含むことを特徴とする、変異アミノ酸配列を有するポリペプチドを決定する方法:
(a)ポリペプチドの試料を少なくとも2つ提供する工程、
(b)該試料を各々、同一のプロテアーゼと共にインキュベートする工程、
(c)逆相液体クロマトグラフィー分離と質量分析との組み合わせを使用する二次元データ分析により、該インキュベートした試料を分析して、試料ごとに、前記逆相液体クロマトグラフィー分離の各保持時間と質量分析の各m/z値とに関連する質量シグナルの強度をデータセットとして得る工程、
(d)一つの試料を参照試料と定義して、工程(c)で得られた前記参照試料のデータセットの質量シグナルの強度と、工程(c)で得られた他の試料のデータセットの質量シグナルの強度とを、前記各保持時間において、m/zフレーム幅1.6のもとで前記各m/z値が対応するものについて比較することで、前記参照試料のデータセットの質量シグナルの強度に対する前記他の試料のデータセットの質量シグナルの強度の比を計算し、前記参照試料と前記他の試料との間のアミノ酸配列の差異ごとに前記比が3より大きくなることを使用して、該ポリペプチドにおける全てのアミノ酸配列変異を決定することによって、変異アミノ酸配列を有するポリペプチドを決定する、工程。 - (e)MS/MS分析により変異アミノ酸配列中のアミノ酸変異の種類および位置を決定する工程
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 既知のアミノ酸配列変異を有するポリペプチドでスパイクされたポリペプチドを含むさらなる試料が提供され、かつ提供された他の試料に加えて、該さらなる試料が同一のプロテアーゼと共にインキュベートされ、
逆相液体クロマトグラフィー分離と質量分析との組み合わせを使用する二次元データ分析により、該インキュベートしたさらなる試料を分析して、前記逆相液体クロマトグラフィー分離の各保持時間と質量分析の各m/z値とに関連する質量シグナルの強度がデータセットとして得られ、および
参照試料のデータセットの質量シグナルの強度と、さらなる試料のデータセットの質量シグナルの強度とを、前記各保持時間において、m/zフレーム幅1.6のもとで前記各m/z値が対応するものについて比較される
ことを特徴とする、請求項1または2記載の方法。 - 工程(c)の試料を分析する工程が、pH8.0未満のpH値および40℃未満の温度で実施されることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- 工程(c)の質量分析において、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液が使用されることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 試料とプロテアーゼをインキュベートする工程が、ポリペプチドをプロテアーゼにより3〜60アミノ酸残基長のアミノ酸配列断片に切断することであることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 工程(d)の比較する工程が、1つまたは複数またはすべてのMS電荷状態のデータを用いて実施されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリン結合体であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- 試料をプロテアーゼと共に16時間〜18時間インキュベートした後、蟻酸またはトリフルオロ酢酸を添加することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- 試料をプロテアーゼと共に4時間インキュベートした後、蟻酸またはトリフルオロ酢酸を添加することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
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