JP2022551511A - 質量分析タンパク質分析のための材料及び方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、タンパク質若しくはポリペプチドを特性決定する、及び／又はタンパク質若しくはポリペプチド上のクリップ部位を同定するシステム、プロセス、及び方法を記載する。いくつかの実施形態では、当該システム、プロセス、及び方法は、レポーターイオンの生成、及びレポーターイオンによってトリガされるその後のタンデム質量分析を含む。
Description
（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、ファイル名が「２０６３８９＿００２７＿００ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、２０２０年１０月５日に作成され、１０ＫＢのサイズを有する、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂにより電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、ファイル名が「２０６３８９＿００２７＿００ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、２０２０年１０月５日に作成され、１０ＫＢのサイズを有する、ＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂにより電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１９年１０月１０日出願の米国特許仮出願第６２／９１３，４０６号の優先権及び利益を主張し、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１９年１０月１０日出願の米国特許仮出願第６２／９１３，４０６号の優先権及び利益を主張し、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれる。
（発明の分野）
本発明は、ポリペプチド並びにタンパク質又はポリペプチド上のクリップ部位を同定及び特性決定する方法に関する。一態様では、本発明は、レポーターイオンの生成及びレポーターイオンによってトリガされるその後のタンデム質量分析を介して、タンパク質又はポリペプチドのクリップ部位を同定するための方法に関する。
本発明は、ポリペプチド並びにタンパク質又はポリペプチド上のクリップ部位を同定及び特性決定する方法に関する。一態様では、本発明は、レポーターイオンの生成及びレポーターイオンによってトリガされるその後のタンデム質量分析を介して、タンパク質又はポリペプチドのクリップ部位を同定するための方法に関する。
タンパク質工学技術の最近の進歩により、構造及び立体配座の多様性において独特である新規な治療様式が可能になった（ＡｌＤｅｇｈａｉｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１５，５５，Ｓｕｐｐｌ ３：Ｓ４－２０参照）。これらの新規の薬物はまた、有効性及び安全性プロファイルを損なう可能性がある急速なタンパク質分解を含む不利な傾向がある。タンパク質のクリップは遍在的であり、培養中又はプロセス開発中に起こり得るが、部位特異的である、又は広範囲の基質特異性を有する宿主細胞由来プロテアーゼに起因することが最も多い（Ｄｏｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００９，１０３：１６２－１７６；Ｄｏｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２０１１，２７：２２０－２３１）。クリップはまた、クリップする傾向があるかなりの数の部位が、側鎖のタイプ、二次、三次及び四次構造による局所的柔軟性の変化、並びにそれらの発達性の評価でしばしば使用される予備分析変数（例えば、ｐＨ、温度、金属、及びラジカル）などの要因によって影響される、非酵素的機構を介して行われ得る（Ｖｌａｓａｋ＆Ｉｏｎｅｓｃｕ，ｍＡｂｓ，２０１１，３：２５３－２６３；Ｊａｒａｓｃｈ，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，２０１５，１０４：１８８５－１８９８）。クリップされた種のレベル並びに純度及び完全性を監視するために使用される分析方法は、生成物又はプロセスの重要な品質属性の一部である（Ｔｏｒｋａｓｈｖａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｒａｎｉａｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１７，２１：１３１－１４１；Ｄｕｖａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２０１２，２８：６０８－６２２）。
無傷又は切断されたタンパク質のＮ末端配列の同定は、その生化学的及び構造的特性決定に重要である。従来のショットガンプロテオミクス分析では、タンパク質Ｎ末端ペプチドの頻繁な検出に起因して、タンパク質Ｎ末端を同定することは困難である。ショットガン質量分析によるタンパク質治療薬のクリップ部位の特性決定は、複雑なタンパク質消化物に存在する最も豊富なペプチドの配列決定に起因して困難である。クリップされた種の比較的低い化学量論は、潜在的に、ネオＮ末端を有するペプチドを検出しない可能性がある。更に、溶液中及びソース内断片化アーチファクトは、質量分析によって配列決定されたネオＮ末端ペプチドの偽陽性同定を潜在的に引き起こす可能性がある。
技術分野において、ポリペプチド及びポリペプチド上のクリップ部位を同定及び特性決定するための方法の開発の必要性が依然として存在する。本発明は、これらのニーズに対処するものである。
一態様では、本発明は、ポリペプチドの特性決定を行う方法に関し、方法は、
（ｉ）ポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉ）標識ポリペプチドを消化して、１つ又は複数の非標識ペプチド及び１つ又は複数の標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｉｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）質量分析などの電子誘導解離質量分析に供して、１つ又は複数の標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルを得ることと、
（ｖ）１つ又は複数の標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルのレポーターイオンを検出することによって、１つ又は複数の標識ペプチドの各々を同定することと、
（ｖｉ）同定された標識ペプチドの各々を第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々の第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉ）標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
（ｉ）ポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉ）標識ポリペプチドを消化して、１つ又は複数の非標識ペプチド及び１つ又は複数の標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｉｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）質量分析などの電子誘導解離質量分析に供して、１つ又は複数の標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルを得ることと、
（ｖ）１つ又は複数の標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルのレポーターイオンを検出することによって、１つ又は複数の標識ペプチドの各々を同定することと、
（ｖｉ）同定された標識ペプチドの各々を第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々の第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉ）標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端標識試薬は、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）である。更なる実施形態では、標識ポリペプチドは、ＴＭＰＰ標識ポリペプチドであり、標識ペプチドは、ＴＭＰＰ標識ペプチドである。
いくつかの実施形態では、レポーターイオンは、ＴＭＰＰレポーターイオンである。更なる実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する。
いくつかの実施形態では、第２の質量分析は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析である。更なる実施形態では、標識ペプチドの第２の質量スペクトルは、ＴＭＰＰ標識ペプチドのＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルである。
同定の実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、ＣＩＤ質量分析、ＨＣＤ質量分析、又はＵＶＰＤ質量分析をトリガする（trigger）。
別の一般的な一態様では、本発明は、タンパク質上のクリップ部位を同定する方法に関し、方法は、
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、１つ又は複数の標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及び標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）質量分析などの電子誘導解離タンデム質量分析に供して、標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルを得ることと、
（ｖｉ）標識ペプチドの各々について、ＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルのレポーターイオンを検出することによって、標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉｉ）同定された標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々について第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）標識ペプチドの各々についてＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、１つ又は複数の標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及び標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）質量分析などの電子誘導解離タンデム質量分析に供して、標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルを得ることと、
（ｖｉ）標識ペプチドの各々について、ＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルのレポーターイオンを検出することによって、標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉｉ）同定された標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々について第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）標識ペプチドの各々についてＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端標識試薬は、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）である。更なる実施形態では、標識ポリペプチドは、ＴＭＰＰ標識ポリペプチドであり、標識ペプチドは、ＴＭＰＰ標識ペプチドである。
いくつかの実施形態では、レポーターイオンは、ＴＭＰＰレポーターイオンである。更なる実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する。
いくつかの実施形態では、第２の質量分析は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析である。更なる実施形態では、標識ペプチドの第２の質量スペクトルは、ＴＭＰＰ標識ペプチドのＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルである。
同定の実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、ＣＩＤ質量分析、ＨＣＤ質量分析、又はＵＶＰＤ質量分析をトリガする。
別の一般的な一態様では、本発明は、タンパク質上のクリップ部位を同定する方法に関し、方法は、
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識し、それによって１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）質量分析などの電子誘導解離質量分析に供して、ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルを得ることと、
（ｖｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々について、ＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトル中のＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することと、
（ｖｉｉ）ＴＭＰＰレポーターイオンの検出又は分離時に、ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々を、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてそれぞれＣＩＤ又はＨＣＤ質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトル及びＣＩＤ又はＨＣＤ質量スペクトルを分析することによって、タンパク質上のクリップ部位を同定することと
を含む。
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識し、それによって１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）質量分析などの電子誘導解離質量分析に供して、ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々のＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトルを得ることと、
（ｖｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々について、ＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルなどの質量スペクトル中のＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することと、
（ｖｉｉ）ＴＭＰＰレポーターイオンの検出又は分離時に、ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々を、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてそれぞれＣＩＤ又はＨＣＤ質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトル及びＣＩＤ又はＨＣＤ質量スペクトルを分析することによって、タンパク質上のクリップ部位を同定することと
を含む。
他の態様では、本発明は、部分的には、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するためのシステム及び／又は試料中のポリペプチド特性決定するためのシステムに関する。様々な実施形態では、システムは、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）装置及びタンデム質量分析計を含む。
一実施形態では、タンデム質量分析計は、
（ｉ）第１のイオン化装置と、
（ｉｉ）第１の範囲内の質量電荷比を有するイオンを透過するために、第１の動作モードで配置及び適合された第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器と、
（ｉｉｉ）第１のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｉｖ）動作モードでイオンを減衰させるための減衰手段と、
（ｖ）第１の範囲内の質量電荷比を有するが、１つ又は複数の望ましくない第１の電荷状態を有するイオンが実質的に減衰されるように、減衰手段の動作を制御するように構成された制御装置と、
（ｖｉ）第２のイオン化装置と、
（ｖｉｉ）第２のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｖｉｉｉ）フラグメントイオンの非混合信号を取得し、トリガイオンを非冗長的に（non-redundantly）コード化するように構成されたデータシステムであって、非冗長的なコード化が、任意の個々のゲート時間の複数回の反復において異なる親種からの任意の２つのイオン信号の反復的な重複を回避又は最小化するように配置されている、データシステムと
を含む。
（ｉ）第１のイオン化装置と、
（ｉｉ）第１の範囲内の質量電荷比を有するイオンを透過するために、第１の動作モードで配置及び適合された第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器と、
（ｉｉｉ）第１のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｉｖ）動作モードでイオンを減衰させるための減衰手段と、
（ｖ）第１の範囲内の質量電荷比を有するが、１つ又は複数の望ましくない第１の電荷状態を有するイオンが実質的に減衰されるように、減衰手段の動作を制御するように構成された制御装置と、
（ｖｉ）第２のイオン化装置と、
（ｖｉｉ）第２のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｖｉｉｉ）フラグメントイオンの非混合信号を取得し、トリガイオンを非冗長的に（non-redundantly）コード化するように構成されたデータシステムであって、非冗長的なコード化が、任意の個々のゲート時間の複数回の反復において異なる親種からの任意の２つのイオン信号の反復的な重複を回避又は最小化するように配置されている、データシステムと
を含む。
様々な実施形態では、ポリペプチド上のクリップ部位又はポリペプチドは、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識される。一実施形態では、第１のイオン化装置は、ＴＭＰＰレポーターイオンを生成する。
一実施形態では、試料をＬＣ装置に供して、溶出液を生成させる。一実施形態では、溶出液をタンデム質量分析に供して、第１の質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを得る。
いくつかの実施形態では、第１の質量スペクトル及び第２の質量スペクトルは、データベース又はスペクトルライブラリ内の情報と比較することによって分析される。
一実施形態では、第１のイオン化装置は、電子誘導解離装置である。いくつかの実施形態では、電子誘導解離装置は、電子移動解離（ＥＴＤ）装置又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）装置である。
いくつかの実施形態では、第２のイオン化装置は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）装置、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）装置、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）装置である。
いくつかの実施形態では、質量分析計は、衝突装置、断片化装置、又は反応装置を更に含む。
いくつかの実施形態では、減衰手段は、イオンゲート又はイオンバリアを含む。一実施形態では、減衰手段は、イオン移動度分光計又は分離器の下流に配置される。
いくつかの実施形態では、第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器は、第１の動作モードで配置及び適合されて、第１の範囲外の質量電荷比を有するイオンを減衰させる。いくつかの実施形態では、第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器は、当該イオン移動度分光計又は分離器の上流又は下流に配置される。
いくつかの実施形態では、第１の望ましくない電荷状態は、以下の（ｉ）１価、（ｉｉ）２価、（ｉｉｉ）３価、（ｉｖ）４価、（ｖ）５価、及び（ｖｉ）多価のうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態では、システムは、当該イオン移動度分光計又は分離器の上流に配置されたイオンガイド、イオントラップ、又はイオントラップ領域を更に含み、当該イオンガイド、イオントラップ、又はイオントラップ領域は、イオンをトラップ、貯蔵、又は蓄積し、次いで当該イオン移動度分光計又は分離器内に、若しくは当該イオン移動度分光計又は分離器に向かってイオンを定期的にパルス化するように配置されている。
他の態様では、本発明は、部分的には、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するためのレポーターイオンに関する。一実施形態では、クリップ部位は、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識される。一実施形態では、ＴＭＰＰはイオン化されてレポーターイオンを生成する。
他の態様では、本発明は、部分的には、ポリペプチドを特性決定するためのレポーターイオンに関する。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識される。一実施形態では、ＴＭＰＰはイオン化されてレポーターイオンを生成する。
一実施形態では、ＴＭＰＰは、質量分析計によってイオン化されて、レポーターイオンを生成する。一実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計である。様々な実施形態では、タンデム質量分析計は、電子移動解離（ＥＴＤ）装置、電子捕捉解離（ＥＣＤ）装置、衝突誘発解離（ＣＩＤ）装置、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）装置、紫外線光解離（ＵＶＰＤ）装置、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、レポーターイオンは、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する。
いくつかの実施形態では、レポーターイオンは、
他の態様では、本発明は、部分的には、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するための組成物に関する。
他の態様では、本発明は、部分的には、ポリペプチドを特性決定するための組成物に関する。
様々な実施形態では、組成物は、本発明の少なくとも１つのレポーターイオン及びポリペプチドを含む。
他の態様では、本発明はまた、部分的には、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するか、又は試料中のポリペプチドを特性決定するためのキットに関し、キットは、ポリペプチド上のクリップ部位を標識するためのＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）又はポリペプチドを標識するためのＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）、及び説明資料を含む。
本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。
以下の本発明の様々な実施形態の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより深い理解が得られるであろう。本発明を説明する目的で、図面には例示的な実施形態が示されている。ただし、本発明は、図示された実施形態の精密な配置及び手段に限定されるものでないことは理解されるべきである。
ＮＩＳＴ抗体の軽鎖Ｎ末端配列に対応するＴＭＰＰ標識ペプチドＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬ（配列番号１）の代表的なＥＴＤプロダクトイオンスペクトルを示す。質量スペクトルは、主に診断用ＴＭＰＰレポーターイオン（ｍ／ｚ＝５３３Ｄａ）及びＮ末端ＴＭＰＰタグからなるｃ型骨格プロダクトイオン（ｍ／ｚ＝５９０Ｄａ）からなっていた。
５３３Ｄａ、５９０Ｄａ、及び５７３Ｄａのレポーターイオンの構造の概略図を、それらの正確な質量で示し、図２Ａは、５３３Ｄａの（ＴＭＰＰ）＋のレポーターイオンの構造の概略図を示し、図２Ｂは、５９０Ｄａの（ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２）＋のレポーターイオンの構造の概略図を示し、図２Ｃは、５７３Ｄａの（ＴＭＰＰ－Ａｃ）＋のレポーターイオンの構造の概略図を示す。
５３３Ｄａ、５９０Ｄａ、及び５７３Ｄａのレポーターイオンの構造の概略図を、それらの正確な質量で示し、図２Ａは、５３３Ｄａの（ＴＭＰＰ）＋のレポーターイオンの構造の概略図を示し、図２Ｂは、５９０Ｄａの（ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２）＋のレポーターイオンの構造の概略図を示し、図２Ｃは、５７３Ｄａの（ＴＭＰＰ－Ａｃ）＋のレポーターイオンの構造の概略図を示す。
５３３Ｄａ、５９０Ｄａ、及び５７３Ｄａのレポーターイオンの構造の概略図を、それらの正確な質量で示し、図２Ａは、５３３Ｄａの（ＴＭＰＰ）＋のレポーターイオンの構造の概略図を示し、図２Ｂは、５９０Ｄａの（ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２）＋のレポーターイオンの構造の概略図を示し、図２Ｃは、５７３Ｄａの（ＴＭＰＰ－Ａｃ）＋のレポーターイオンの構造の概略図を示す。
ＥＴＤ（図２Ｄ）及びＨＣＤ（図２Ｅ）におけるレポーターイオンの生成効率を計算するための式を示す。
ＥＴＤ（図２Ｄ）及びＨＣＤ（図２Ｅ）におけるレポーターイオンの生成効率を計算するための式を示す。
代表的な逆相クロマトグラフィ緩衝液勾配及びＴＭＰＰ標識後のＮＩＳＴ消化物の対応する総イオンクロマトグラムを示す。ほとんどの非標識ペプチドは、１０分間の長さの浅い勾配で２～３０％の有機物で溶出した。代理ペプチドは、１２分で溶出したＮＩＳＴ抗体軽鎖のＴＭＰＰ標識Ｎ末端に対応した。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＨＫ（図４Ａ及び図４Ｂ）、ＡＤＹＥＫ（配列番号１２）（図４Ｃ）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）（図４Ｄ）、ＳＦＮＲ（配列番号１４）（図４Ｅ）、ＥＡＫ（図４Ｆ）、ＶＱＷＫ（配列番号１５）（図４Ｇ）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号１６）（図４Ｈ）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）（図４Ｉ）、ＴＫＰＲ（配列番号１８）（図４Ｊ）、ＥＥＱＹＮＳＴＹＲ（配列番号１９）（図４Ｋ）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２０）（図４Ｌ）、ＥＹＫ（図４Ｍ）、ＣＫ（図４Ｎ）、ＧＱＰＲ（配列番号２１）（図４Ｏ）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）（図４Ｐ～図４Ｒ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤ（配列番号２３）（図４Ｓ～図４Ｕ）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮ（配列番号２４）（図４Ｖ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５）（図４Ｗ～図４Ｘ）、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）（図４Ｙ）、及びＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２７）（図４Ｚ）を含む、２０種のＴＭＰＰ標識合成ペプチドの代表的なＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。
ＡｃＣＮ勾配でオーバーレイされた観察された保持時間の関数としてペプチド強度を示す代表的な結果を示す。
ＡｃＣＮ勾配でオーバーレイされた観察された保持時間の関数としてペプチド強度を示す代表的な結果を示す。
質量の関数としてのＴＭＰＰ＋ＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。
配列長の関数としてのＴＭＰＰ＋ＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。
電荷の関数としてのＴＭＰＰ＋ＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。
それぞれＴＭＰＰ＋及びＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋である５３３及び５９０の診断用イオンの効率としての強度差を実証する代表的な結果を示す。同じペプチドについて、５３３の診断用イオン（２桁の効率値）と比較して５９０の診断用イオンについてより小さい効率値（１桁）が観察された。したがって、５３３の診断用イオンの強度は、５９０の診断用イオンよりも有意に高かった。
全てのプロダクトイオンを考慮して、全体的なＥＴＤ効率がわずかな電荷状態依存的減少を示すことを実証する代表的な結果を示す。ＥＴＤ効率は、図２Ｄに示す式によって定義することができる。Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ＨＰ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２７：１２６２７－１２６３９）によって定義された元の％ＥＴＤ効率は、式５であり、これは、ポリペプチドの全ての骨格断片についての全体的なＥＴＤ効率推定値であった（パーセンテージとして報告される）。式１～式３は、レポーターイオンに特異的なＥＴＤ効率の推定値として導出された。式４は、レポーターイオン並びにポリペプチドの骨格断片のＥＴＤ効率推定値であった。対照的に、図７Ｃ及び図７Ｄは、ＴＭＰＰ＋レポーターイオンが無視された式５によって推定された全体的な骨格効率について、電荷状態依存的増加を示したＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ａは、式４を使用した質量の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｂは、式４を使用した電荷の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｃは、式５を使用した質量の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｄは、式５を使用した電荷の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。
全てのプロダクトイオンを考慮して、全体的なＥＴＤ効率がわずかな電荷状態依存的減少を示すことを実証する代表的な結果を示す。ＥＴＤ効率は、図２Ｄに示す式によって定義することができる。Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ＨＰ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２７：１２６２７－１２６３９）によって定義された元の％ＥＴＤ効率は、式５であり、これは、ポリペプチドの全ての骨格断片についての全体的なＥＴＤ効率推定値であった（パーセンテージとして報告される）。式１～式３は、レポーターイオンに特異的なＥＴＤ効率の推定値として導出された。式４は、レポーターイオン並びにポリペプチドの骨格断片のＥＴＤ効率推定値であった。対照的に、図７Ｃ及び図７Ｄは、ＴＭＰＰ＋レポーターイオンが無視された式５によって推定された全体的な骨格効率について、電荷状態依存的増加を示したＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ａは、式４を使用した質量の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｂは、式４を使用した電荷の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｃは、式５を使用した質量の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｄは、式５を使用した電荷の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。
全てのプロダクトイオンを考慮して、全体的なＥＴＤ効率がわずかな電荷状態依存的減少を示すことを実証する代表的な結果を示す。ＥＴＤ効率は、図２Ｄに示す式によって定義することができる。Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ＨＰ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２７：１２６２７－１２６３９）によって定義された元の％ＥＴＤ効率は、式５であり、これは、ポリペプチドの全ての骨格断片についての全体的なＥＴＤ効率推定値であった（パーセンテージとして報告される）。式１～式３は、レポーターイオンに特異的なＥＴＤ効率の推定値として導出された。式４は、レポーターイオン並びにポリペプチドの骨格断片のＥＴＤ効率推定値であった。対照的に、図７Ｃ及び図７Ｄは、ＴＭＰＰ＋レポーターイオンが無視された式５によって推定された全体的な骨格効率について、電荷状態依存的増加を示したＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ａは、式４を使用した質量の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｂは、式４を使用した電荷の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｃは、式５を使用した質量の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｄは、式５を使用した電荷の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。
全てのプロダクトイオンを考慮して、全体的なＥＴＤ効率がわずかな電荷状態依存的減少を示すことを実証する代表的な結果を示す。ＥＴＤ効率は、図２Ｄに示す式によって定義することができる。Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ＨＰ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１２７：１２６２７－１２６３９）によって定義された元の％ＥＴＤ効率は、式５であり、これは、ポリペプチドの全ての骨格断片についての全体的なＥＴＤ効率推定値であった（パーセンテージとして報告される）。式１～式３は、レポーターイオンに特異的なＥＴＤ効率の推定値として導出された。式４は、レポーターイオン並びにポリペプチドの骨格断片のＥＴＤ効率推定値であった。対照的に、図７Ｃ及び図７Ｄは、ＴＭＰＰ＋レポーターイオンが無視された式５によって推定された全体的な骨格効率について、電荷状態依存的増加を示したＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ａは、式４を使用した質量の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｂは、式４を使用した電荷の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｃは、式５を使用した質量の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｄは、式５を使用した電荷の関数としての全体的なＥＴＤ効率を実証する代表的な結果を示す。
式６を使用した質量の関数としてのＴＭＰＰ＋ＨＣＤ効率を実証する代表的な結果を示す。図７Ｆは、式６を使用した電荷の関数としてのＴＭＰＰ＋ＨＣＤ効率を実証する代表的な結果を示す。
式６を使用した電荷の関数としてのＴＭＰＰ＋ＨＣＤ効率を実証する代表的な結果を示す。
ＥＴＤ効率と、ペプチドあたりのチロシン残基及びリジン残基の数によってグループ化された標識ペプチドとの間の関係を実証する代表的な結果を示す。
ペプチドの反応又はＴＭＰＰ標識効率の全体的な分布を実証する代表的な結果を示す。
式７によって推定されたペプチドの反応又はＴＭＰＰ標識効率の全体的な分布を実証する代表的な結果を示す。
標識ペプチド及び非標識ペプチドにおける真陽性（ＴＰ）、偽陽性（ＦＰ）、真陰性（ＴＮ）、及び偽陰性（ＦＮ）の生成を実証する代表的な結果を示す。図１０Ａに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、真陰性（ＴＮ）であったレポーターを生成しなかった。図１０Ｂに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。図１０Ｃに示すように、修飾ペプチドは、偽陰性（ＦＮ）であった診断用イオンを生成しなかったが、未修飾ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。
標識ペプチド及び非標識ペプチドにおける真陽性（ＴＰ）、偽陽性（ＦＰ）、真陰性（ＴＮ）、及び偽陰性（ＦＮ）の生成を実証する代表的な結果を示す。図１０Ａに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、真陰性（ＴＮ）であったレポーターを生成しなかった。図１０Ｂに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。図１０Ｃに示すように、修飾ペプチドは、偽陰性（ＦＮ）であった診断用イオンを生成しなかったが、未修飾ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。
標識ペプチド及び非標識ペプチドにおける真陽性（ＴＰ）、偽陽性（ＦＰ）、真陰性（ＴＮ）、及び偽陰性（ＦＮ）の生成を実証する代表的な結果を示す。図１０Ａに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、真陰性（ＴＮ）であったレポーターを生成しなかった。図１０Ｂに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。図１０Ｃに示すように、修飾ペプチドは、偽陰性（ＦＮ）であった診断用イオンを生成しなかったが、未修飾ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。
標識ペプチド及び非標識ペプチドにおける真陽性（ＴＰ）、偽陽性（ＦＰ）、真陰性（ＴＮ）、及び偽陰性（ＦＮ）の生成を実証する代表的な結果を示す。図１０Ａに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、真陰性（ＴＮ）であったレポーターを生成しなかった。図１０Ｂに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。図１０Ｃに示すように、修飾ペプチドは、偽陰性（ＦＮ）であった診断用イオンを生成しなかったが、未修飾ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。
標識ペプチド及び非標識ペプチドにおける真陽性（ＴＰ）、偽陽性（ＦＰ）、真陰性（ＴＮ）、及び偽陰性（ＦＮ）の生成を実証する代表的な結果を示す。図１０Ａに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、真陰性（ＴＮ）であったレポーターを生成しなかった。図１０Ｂに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。図１０Ｃに示すように、修飾ペプチドは、偽陰性（ＦＮ）であった診断用イオンを生成しなかったが、未修飾ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。
標識ペプチド及び非標識ペプチドにおける真陽性（ＴＰ）、偽陽性（ＦＰ）、真陰性（ＴＮ）、及び偽陰性（ＦＮ）の生成を実証する代表的な結果を示す。図１０Ａに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、真陰性（ＴＮ）であったレポーターを生成しなかった。図１０Ｂに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。図１０Ｃに示すように、修飾ペプチドは、偽陰性（ＦＮ）であった診断用イオンを生成しなかったが、未修飾ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。
各診断用イオン及び溶出時間についてのＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を実証する代表的な結果を示す。図１１Ａは、ＴＭＰＰ＋（５３３）診断用イオンの代表的な予測力を示す。図１１Ｂは、ＴＭＰＰペプチド保持時間の代表的な予測力を示す。図１１Ｃは、ＴＭＰＰ－Ａｃ＋（５７３）診断用イオンの代表的な予測力を示す。図１１Ｄは、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋（５９１）診断用イオンの代表的な予測力を示す。
各診断用イオン及び溶出時間についてのＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を実証する代表的な結果を示す。図１１Ａは、ＴＭＰＰ＋（５３３）診断用イオンの代表的な予測力を示す。図１１Ｂは、ＴＭＰＰペプチド保持時間の代表的な予測力を示す。図１１Ｃは、ＴＭＰＰ－Ａｃ＋（５７３）診断用イオンの代表的な予測力を示す。図１１Ｄは、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋（５９１）診断用イオンの代表的な予測力を示す。
各診断用イオン及び溶出時間についてのＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を実証する代表的な結果を示す。図１１Ａは、ＴＭＰＰ＋（５３３）診断用イオンの代表的な予測力を示す。図１１Ｂは、ＴＭＰＰペプチド保持時間の代表的な予測力を示す。図１１Ｃは、ＴＭＰＰ－Ａｃ＋（５７３）診断用イオンの代表的な予測力を示す。図１１Ｄは、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋（５９１）診断用イオンの代表的な予測力を示す。
各診断用イオン及び溶出時間についてのＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を実証する代表的な結果を示す。図１１Ａは、ＴＭＰＰ＋（５３３）診断用イオンの代表的な予測力を示す。図１１Ｂは、ＴＭＰＰペプチド保持時間の代表的な予測力を示す。図１１Ｃは、ＴＭＰＰ－Ａｃ＋（５７３）診断用イオンの代表的な予測力を示す。図１１Ｄは、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋（５９１）診断用イオンの代表的な予測力を示す。
プロテアーゼ活性に起因して生成されたＩＡＷＬＶＫの配列（配列番号５）のネオＮ末端についての証拠を示す代表的なＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。図１２Ａは、特徴的な診断用イオンＴＭＰＰ＋（ｍ／ｚ＝５３３Ｄａ）を生成した２価イオンのＥＴＤ－ＭＳ２から得られた代表的なプロダクトイオンスペクトルを示す。図１２Ｂは、２価イオンの代表的な診断用レポーターイオン（ｍ／ｚ＝５３３）によってトリガされたＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。図１２Ｃは、診断用イオンが存在しない非コンジュゲートペプチドの代表的なＥＴＤスペクトルを示す。
プロテアーゼ活性に起因して生成されたＩＡＷＬＶＫの配列（配列番号５）のネオＮ末端についての証拠を示す代表的なＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。図１２Ａは、特徴的な診断用イオンＴＭＰＰ＋（ｍ／ｚ＝５３３Ｄａ）を生成した２価イオンのＥＴＤ－ＭＳ２から得られた代表的なプロダクトイオンスペクトルを示す。図１２Ｂは、２価イオンの代表的な診断用レポーターイオン（ｍ／ｚ＝５３３）によってトリガされたＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。図１２Ｃは、診断用イオンが存在しない非コンジュゲートペプチドの代表的なＥＴＤスペクトルを示す。
プロテアーゼ活性に起因して生成されたＩＡＷＬＶＫの配列（配列番号５）のネオＮ末端についての証拠を示す代表的なＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。図１２Ａは、特徴的な診断用イオンＴＭＰＰ＋（ｍ／ｚ＝５３３Ｄａ）を生成した２価イオンのＥＴＤ－ＭＳ２から得られた代表的なプロダクトイオンスペクトルを示す。図１２Ｂは、２価イオンの代表的な診断用レポーターイオン（ｍ／ｚ＝５３３）によってトリガされたＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。図１２Ｃは、診断用イオンが存在しない非コンジュゲートペプチドの代表的なＥＴＤスペクトルを示す。
ＧＬＰ１配列の逐次クリッピングに対応する代理ペプチドのＥＴＤ－ＭＳ２及び診断用イオン誘発ＣＩＤ－ＭＳ２プロダクトイオンスペクトルの証拠を実証する代表的な結果を示す。図１３Ａは、Ｉ／Ａクリップから生じるＡＷＬＶＫ（配列番号６）の代理ペプチドを実証する代表的な結果を示す。図１３Ｂは、Ａ／Ｗクリップから生じるＷＬＶＫ（配列番号７）の代理ペプチドを実証する代表的な結果を示す。図１３Ｃは、Ｗ／Ｌクリップから生じるＬＶＫの代理ペプチドを実証する代表的な結果を示す。
ＧＬＰ１配列の逐次クリッピングに対応する代理ペプチドのＥＴＤ－ＭＳ２及び診断用イオン誘発ＣＩＤ－ＭＳ２プロダクトイオンスペクトルの証拠を実証する代表的な結果を示す。図１３Ａは、Ｉ／Ａクリップから生じるＡＷＬＶＫ（配列番号６）の代理ペプチドを実証する代表的な結果を示す。図１３Ｂは、Ａ／Ｗクリップから生じるＷＬＶＫ（配列番号７）の代理ペプチドを実証する代表的な結果を示す。図１３Ｃは、Ｗ／Ｌクリップから生じるＬＶＫの代理ペプチドを実証する代表的な結果を示す。
ＧＬＰ１配列の逐次クリッピングに対応する代理ペプチドのＥＴＤ－ＭＳ２及び診断用イオン誘発ＣＩＤ－ＭＳ２プロダクトイオンスペクトルの証拠を実証する代表的な結果を示す。図１３Ａは、Ｉ／Ａクリップから生じるＡＷＬＶＫ（配列番号６）の代理ペプチドを実証する代表的な結果を示す。図１３Ｂは、Ａ／Ｗクリップから生じるＷＬＶＫ（配列番号７）の代理ペプチドを実証する代表的な結果を示す。図１３Ｃは、Ｗ／Ｌクリップから生じるＬＶＫの代理ペプチドを実証する代表的な結果を示す。
ＥＦＩＡＷＬＶＫ（配列番号３）、ＦＩＡＷＬＶＫ（配列番号４）、ＩＡＷＬＶＫ（配列番号５）、ＡＷＬＶＫ（配列番号６）、ＷＬＶＫ（配列番号７）及びＬＶＫの代理ペプチドを生成するためのデュラグルチド（配列番号２）のクリップ部位の概略図を示す。
デュラグルチドの代理ペプチドの代表的な抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。図１５Ａは、配列番号４～７のペプチド及びＬＶＫのペプチドを含む、ＴＭＰＰ標識なしの代理ペプチドの代表的な抽出イオンクロマトグラムを示す。図１５Ｂは、ＴＭＰＰ－ＦＩＡＷＬＶＫ（配列番号８）、ＴＭＰＰ－ＩＡＷＬＶＫ（配列番号９）、ＴＭＰＰ－ＡＷＬＶＫ（配列番号１０）、ＴＭＰＰ－ＷＬＶＫ（配列番号１１）及びＴＭＰＰ－ＬＶＫを含む標識代理ペプチドの代表的な抽出イオンクロマトグラムを示す。ＸＩＣは、各ＴＭＰＰ標識ペプチドが１０～１３分の間の２つの急速な傾斜の間に溶出したことを実証した。
デュラグルチドの代理ペプチドの代表的な抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。図１５Ａは、配列番号４～７のペプチド及びＬＶＫのペプチドを含む、ＴＭＰＰ標識なしの代理ペプチドの代表的な抽出イオンクロマトグラムを示す。図１５Ｂは、ＴＭＰＰ－ＦＩＡＷＬＶＫ（配列番号８）、ＴＭＰＰ－ＩＡＷＬＶＫ（配列番号９）、ＴＭＰＰ－ＡＷＬＶＫ（配列番号１０）、ＴＭＰＰ－ＷＬＶＫ（配列番号１１）及びＴＭＰＰ－ＬＶＫを含む標識代理ペプチドの代表的な抽出イオンクロマトグラムを示す。ＸＩＣは、各ＴＭＰＰ標識ペプチドが１０～１３分の間の２つの急速な傾斜の間に溶出したことを実証した。
ＬＶＫペプチド配列上の異なる解離モードを介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。図１６Ａは、ＬＶＫペプチド配列上の高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。図１６Ｂは、ＬＶＫペプチド配列上の紫外線光解離（ＵＶＰＤ）を介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。図１６Ｃは、ＬＶＫペプチド配列上の電子移動解離（ＥＴＤ）を介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。
ＬＶＫペプチド配列上の異なる解離モードを介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。図１６Ａは、ＬＶＫペプチド配列上の高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。図１６Ｂは、ＬＶＫペプチド配列上の紫外線光解離（ＵＶＰＤ）を介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。図１６Ｃは、ＬＶＫペプチド配列上の電子移動解離（ＥＴＤ）を介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。
ＬＶＫペプチド配列上の異なる解離モードを介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。図１６Ａは、ＬＶＫペプチド配列上の高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。図１６Ｂは、ＬＶＫペプチド配列上の紫外線光解離（ＵＶＰＤ）を介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。図１６Ｃは、ＬＶＫペプチド配列上の電子移動解離（ＥＴＤ）を介した特徴的なレポーターイオンを実証する代表的な結果を示す。
カテプシンＤの存在下及び非存在下、並びにＴＭＰＰ誘導体化に使用した異なるｐＨ及び緩衝液組成の緩衝溶液における、Ｆ－ＩでのＧＬＰ１ペプチドクリッピングを実証する代表的な結果を示す。カテプシンＤ処理試料を＋カテプシンＤと表記し、ＴＭＰＰ誘導体化試料を＋ＴＭＰＰと表記した。ｘ軸は、試料及び反応条件である、１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８；ＤＭＦと予備混合したＴＭＰＰ試薬；ＰＢＳ ｐＨ７中の未反応対照を示し、ｙ軸は、ピーク面積を示す。図１７Ａは、前駆体ペプチドＦＩＡＷＬＶＫ（配列番号４）及び対応するクリップされた生成物ＩＡＷＬＶＫ（配列番号５）の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）の代表的なパネルを示し、Ｙ軸はピーク面積を示し、ｘ軸は保持時間を示す。図１７Ｂは、前駆体ペプチドＦＩＡＷＬＶＫ（配列番号４）及び対応するクリップされた生成物ＩＡＷＬＶＫ（配列番号５）についてのＸＩＣの代表的なピーク面積を示す。
カテプシンＤの存在下及び非存在下、並びにＴＭＰＰ誘導体化に使用した異なるｐＨ及び緩衝液組成の緩衝溶液における、Ｆ－ＩでのＧＬＰ１ペプチドクリッピングを実証する代表的な結果を示す。カテプシンＤ処理試料を＋カテプシンＤと表記し、ＴＭＰＰ誘導体化試料を＋ＴＭＰＰと表記した。ｘ軸は、試料及び反応条件である、１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７、１００ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ８；ＤＭＦと予備混合したＴＭＰＰ試薬；ＰＢＳ ｐＨ７中の未反応対照を示し、ｙ軸は、ピーク面積を示す。図１７Ａは、前駆体ペプチドＦＩＡＷＬＶＫ（配列番号４）及び対応するクリップされた生成物ＩＡＷＬＶＫ（配列番号５）の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）の代表的なパネルを示し、Ｙ軸はピーク面積を示し、ｘ軸は保持時間を示す。図１７Ｂは、前駆体ペプチドＦＩＡＷＬＶＫ（配列番号４）及び対応するクリップされた生成物ＩＡＷＬＶＫ（配列番号５）についてのＸＩＣの代表的なピーク面積を示す。
本発明は、部分的には、電子移動解離（ＥＴＤ）質量分析と組み合わせたＴＭＰＰ標識の使用が、小さなトリプシンペプチドに対して最も強力であった容易なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したという予想外の発見に基づく。更に、本発明は、部分的には、衝突誘起解離（ＣＩＤ）ＭＳ２スペクトルがＥＴＤ同定を補完し、ＭＳ２スキャンをトリガし、レポーターイオンが観察された場合にのみＣＩＤスキャンが実行されるリアルタイムｉｎ ｓｉｌｃｏフィルタリング機構を提供するという予想外の発見に基づく。
したがって、本発明は、部分的には、タンパク質若しくはポリペプチドを特性決定するため、及び／又はタンパク質若しくはポリペプチド上のクリップ部位を同定するための新規なシステム、プロセス、及び方法に関する。様々な実施形態では、システム、プロセス、及び方法は、ＥＴＤにおけるレポーターイオンの容易な生成のためのハイスループットＬＣ－ＭＳを含む。いくつかの実施形態では、レポーターの生成は、その後のＭＳ／ＭＳ分析を容易にする。いくつかの実施形態では、ＭＳ／ＭＳ分析は、タンパク質又はポリペプチドを更に配列決定するために、強度及びｍ／ｚ依存性トリガイベントを介した、ＣＩＤ、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、及び／又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）などの相補的イオン活性化モードを含む。例えば、一実施形態では、本発明は、ＥＴＤ－ＭＳ２を含む、クリップポリペプチドを同定する方法に焦点を当て、ＴＭＰＰ由来のレポーターイオンは、ＭＳ２分析をトリガして、クリップポリペプチドを自律的にフィルタリングする。
定義
本明細書で使用するところの下記の用語のそれぞれは、この項でその用語に関連付けられる意味を有するものである。他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、好ましい方法及び材料を記載する。
本明細書で使用するところの下記の用語のそれぞれは、この項でその用語に関連付けられる意味を有するものである。他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。本明細書に記載されているものと同様又は同等の任意の方法及び材料を本発明を実施又は試験するために使用することが可能であるが、好ましい方法及び材料を記載する。
本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているように組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、装置、物品などの考察は、本発明の背景を与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、１つ又は１つを超える（すなわち、少なくとも１つの）目的語たる物品を指すものとして使用される。例として「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」とは、１つの要素又は複数の要素を意味する。
特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」なる語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、記載される値の±１０％を含む。例えば、約５０ｐｐｍ以下の量は、４５ｐｐｍ以下～５５ｐｐｍ以下を含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。
用語「約」は、当業者には理解されるものであり、この用語が用いられる文脈によってある程度異なる。量、及び持続時間などの測定可能な値を指す場合、本明細書で使用するところの「約」なる用語は、具体的な値から、±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、いっそうより好ましくは±０．１％のばらつきを包含することを意味するが、かかるばらつきは、本開示の方法を実施するうえで適切なものである。
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上必要としない限り、用語「含む（comprise）」並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、指定の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。本明細書で使用するとき、用語「含む」は、用語「含有する」又は「含む（including）」に置き換えることができ、又はときに本明細書で使用するとき、用語「有する」に置き換えることもできる。
本明細書で使用するとき、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書で使用するとき、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップは除外しない。本発明の態様又は実施形態に関連して本明細書で使用するとき、本開示の範囲を変化させるために、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」、及び「有する」という上記用語のいずれかを、用語「からなる」又は「から本質的になる」に置き換えることができる。
本明細書で使用するとき、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書で使用するとき、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
本明細書で使用される場合、「ＭＳ／ＭＳ」又は「ＭＳ２」は、タンデム質量分析を指す。タンデム質量分析は、２つ以上の質量分析器が、追加の反応ステップを使用して一緒に連結されて、試料を分析する能力を高める、機器分析における技術である。質量分析のタンデム使用は、反応ステップが空間内で分離される（空間内のタンデム）、及び／又は反応ステップが時間的に分離される（時間的にタンデム）場合に行うことができる。タンデム質量分析の一般的な使用は、タンパク質、ペプチド、有機及び無機分子、脂質、代謝産物、及びオリゴヌクレオチドなどの生体分子の分析である。
本明細書で使用される場合、「レポーターイオン」又は「診断用イオン」は、ＥＴＤ質量スペクトルで観察される、Ｎ末端タグ又は標識を含む標識ペプチド又はポリペプチドの特徴的なプロダクトイオンを指す。通常、それは、質量スペクトルにおける最も優勢なプロダクトイオンであり、その後のＭＳ／ＭＳイベントをトリガして標識ペプチド又はポリペプチドを更に配列決定するために使用される。
本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、「標識」プローブを生成するためにプローブに直接的又は間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体（例えば、小分子又は電荷標識）によって検出可能であってもよい。
「増幅」という用語は、試料中に存在する標的レポーターイオンのコピー数を増加させる操作を指す。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に限定されない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖と、当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指し、これらには多くの型が存在する。「ポリペプチド」としては、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」、「アミノ酸モノマー」、又は「アミノ酸残基」という用語は、２０個の天然に存在するアミノ酸、非天然の側鎖を有する合成アミノ酸のいずれかを指し、Ｄ及びＬ光学異性体の両方を含む。
本明細書で使用される場合、「天然アミノ酸」、「天然にコードされたアミノ酸」、「天然に存在するアミノ酸」、及び「遺伝的にコードされたアミノ酸」という用語は、２０個の共通のアミノ酸又はピロリジン若しくはセレノシステインのうちの１つであるアミノ酸を指す。「天然アミノ酸」という用語には、タンパク質原性アミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。
「非天然アミノ酸」は、２０個の共通のアミノ酸又はピロリジン若しくはセレノシステインのいずれでもないアミノ酸を指す。「非天然アミノ酸」という用語と同義的に使用されてもよい他の用語は、「天然にコードされていないアミノ酸」、「非天然アミノ酸」、「天然に存在しないアミノ酸」、「遺伝的にコードされていないアミノ酸」、及びそれらの様々なハイフンで結ばれたバージョン及びハイフンで結ばれていないバージョンである。「非天然アミノ酸」という用語には、天然にコードされるアミノ酸（一般的なアミノ酸又はピロリシン及びセレノシステインが挙げられるが、これらに限定されない）の修飾によって天然に存在するが、それ自体は翻訳複合体によって成長するポリペプチド鎖に組み込まれないアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。天然にコードされていない天然に存在するアミノ酸の例としては、Ｎ－アセチルグルコサミノイル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチルグルコサミノイル－Ｌ－スレオニン、及びＯ－ホスホチロシンが挙げられるが、これらに限定されない。更に、「非天然アミノ酸」という用語は、天然には存在せず、合成的に得られてもよく（例えば、Ｑ－プロリン系アミノ酸）、又は非天然アミノ酸の修飾によって得られてもよい非タンパク質原性アミノ酸及びアミノ酸を含むが、これらに限定されない。
「単離された」は、自然状態から変更又は除去されることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在するタンパク質又はペプチドは、「単離され」ないが、その天然状態の共存材料から部分的又は完全に分離された同じタンパク質又はペプチドは「単離されている」。単離されたペプチド又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができるか、又は例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
本明細書で使用される場合、「同一」という用語は、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。
更に、本明細書で使用される場合、「実質的に同一」という用語は、比較アルゴリズムを使用して、又は手動アライメント及び目視検査によって測定される場合、比較ウィンドウ又は指定領域にわたって最大の対応のために比較及び整列した場合に同じである連続単位のパーセンテージを有する２つ以上の配列を指す。単なる例として、連続単位が、指定された領域にわたって、約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、又は約９５％同一である場合、２つ以上の配列は「実質的に同一」であってもよい。そのようなパーセンテージは、２つ以上の配列の「同一性パーセント」を説明する。配列の同一性は、長さが少なくとも約７５～１００連続単位である領域にわたって、長さが約５０連続単位である領域にわたって、又は指定されない場合、配列全体にわたって存在することができる。この定義はまた、試験配列の相補体を指す。
本明細書で使用される場合、「説明資料」という用語は、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するか、又はポリペプチドを特性決定するためのキットにおける本発明のレポーターイオン、システム及び／又は方法の有用性を伝えるために使用することができる刊行物、記録、図、又は任意の他の媒体を含む。任意選択的に、又は代替的に、説明資料は、ポリペプチド又はポリペプチドのクリップ部位をＴＭＰＰで標識する１つ又は複数の方法を記載してもよい。任意選択的に、又は代替的に、説明資料は、本発明のシステム又は方法を使用して、ポリペプチド又はＴＭＰＰ標識ポリペプチド上のＴＭＰＰ標識クリップ部位を分析する１つ又は複数の方法を記載してもよい。キットの説明資料は、例えば、本発明の１つ又は複数の構成要素を含有する容器に添付されてもよいか、又は本発明の１つ又は複数の構成要素を含有する容器と一緒に出荷されてもよい。或いは、説明資料は、受領者が説明資料及び構成要素を協働して使用することを意図して、容器とは別に出荷されてもよい。
本開示を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式の説明は単に便宜上及び簡潔さのためのものであり、本発明の範囲上の確固とした制限として解釈されるべきではない、と理解すべきである。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲、並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示される部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を有すると見なされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
説明
本発明は、部分的には、タンパク質若しくはポリペプチドを特性決定するため、及び／又はタンパク質若しくはポリペプチド上のクリップ部位を同定するための新規なシステム、プロセス、及び方法に関する。本発明の様々な態様では、システム、プロセス、及び方法は、ＥＴＤにおけるレポーターイオンの容易な生成のためのハイスループットＬＣ－ＭＳを含む。いくつかの実施形態では、レポーターの生成は、その後のＭＳ／ＭＳ分析（すなわち、タンデム質量分析）を容易にする。いくつかの実施形態では、ＭＳ／ＭＳ分析は、タンパク質又はポリペプチドを更に配列決定するために、強度及びｍ／ｚ依存性トリガイベントを介した、ＣＩＤ、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、及び／又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）などの相補的イオン活性化モードを含む。例えば、一実施形態では、本発明は、ＥＴＤ－ＭＳ２を含む、クリップポリペプチドを同定する方法に焦点を当て、ＴＭＰＰ由来のレポーターイオンは、ＭＳ２分析をトリガして、クリップポリペプチドを自律的にフィルタリングする。
本発明は、部分的には、タンパク質若しくはポリペプチドを特性決定するため、及び／又はタンパク質若しくはポリペプチド上のクリップ部位を同定するための新規なシステム、プロセス、及び方法に関する。本発明の様々な態様では、システム、プロセス、及び方法は、ＥＴＤにおけるレポーターイオンの容易な生成のためのハイスループットＬＣ－ＭＳを含む。いくつかの実施形態では、レポーターの生成は、その後のＭＳ／ＭＳ分析（すなわち、タンデム質量分析）を容易にする。いくつかの実施形態では、ＭＳ／ＭＳ分析は、タンパク質又はポリペプチドを更に配列決定するために、強度及びｍ／ｚ依存性トリガイベントを介した、ＣＩＤ、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、及び／又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）などの相補的イオン活性化モードを含む。例えば、一実施形態では、本発明は、ＥＴＤ－ＭＳ２を含む、クリップポリペプチドを同定する方法に焦点を当て、ＴＭＰＰ由来のレポーターイオンは、ＭＳ２分析をトリガして、クリップポリペプチドを自律的にフィルタリングする。
クリップ部位の同定
質量分析は、クリップ部位の同定及び特性決定のための重要な新たな方法である。利用可能な質量分析計の性能及び質量範囲に関連して、「トップダウン」戦略及び「ボトムアップ」戦略を含む２つのアプローチがタンパク質を特性決定するために使用される。
質量分析は、クリップ部位の同定及び特性決定のための重要な新たな方法である。利用可能な質量分析計の性能及び質量範囲に関連して、「トップダウン」戦略及び「ボトムアップ」戦略を含む２つのアプローチがタンパク質を特性決定するために使用される。
タンパク質分析の「トップダウン」戦略では、無傷のタンパク質は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又はマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）のいずれかによってイオン化され、次いで質量分析器に導入される。しかし、無傷のＭＳは、機器の検出限界（ＬＯＤ）内にある分解産物を検出するのにのみ有用であるが、低レベルのクリップは、ペプチドレベル分析を必要とする無傷のＭＳ分析では観察されないことが多い。
「ボトムアップ」プロテオミクスでは、タンパク質の存在の同定はペプチドレベルで行われる。「ボトムアップ」戦略の一般的な手順は、１つ又は複数のタンパク質分解酵素（トリプシン、ペプシン、キモトリプシンなど）を使用して、タンパク質に由来する個々のペプチドの塊を得ることを含む。続いて、これらのペプチドを質量分析計に導入し、ペプチド質量フィンガープリント又はタンデム質量分析によって同定する。次いで、質量を配列データベース又はスペクトルライブラリなどのデータベースと比較し、確率ベースのスコアリングシステムを使用して、最も近いタンパク質マッチを決定する。したがって、このアプローチは、ペプチドレベルでの同定を使用して、クリップされたペプチドの存在を推測する。より小さくより均一な断片は、無傷のタンパク質よりも分析が容易であり、高精度で決定することもでき、したがって、この「ボトムアップ」アプローチは、プロテオミクス及びタンパク質特性評価における研究の好ましい方法である。
しかし、ボトムアップアプローチによるタンパク質のクリップ部位の特性決定は、複雑なタンパク質消化物に存在する最も豊富なペプチドの配列決定に起因して困難である。クリップされたペプチドの比較的低い化学量論は、ネオＮ末端を有するペプチドを検出しない可能性がある。更に、溶液中及びソース内断片化アーチファクトは、質量分析によって配列決定されたネオＮ末端ペプチドの偽陽性同定を潜在的に引き起こす可能性がある。
タンパク質のＮ末端同定の信頼性を高めるために、（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニルメチル）トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド（ＴＭＰＰ）又はジメチル標識によるＮ末端アミン基の化学的誘導体化とそれに続く質量分析が一般的に行われる。このアプローチを使用して、目的のタンパク質Ｎ末端を、トリプシン消化及びＬＣ－ＭＳ分析の前にＴＭＰＰ又はジメチルによって標識する。したがって、タンパク質のＮ末端は、Ｎ末端トリプシンペプチドのみが標識を含有するため、容易に同定することができる。ＴＭＰＰなどのＮ末端誘導体化を有するペプチドは、クロマトグラフィ中のペプチドのイオン化及び保持を改善し、タンデム質量分析の間に独自のフラグメントイオンを生成し、これにより、これらのペプチドの配列決定が著しく容易になる。
化学標識に基づく１つの方法は、還元メチル化を介して、水溶性ホルムアルデヒドでリジンのＮ末端及びε－アミノ基を標識する脱メチル化である。ＭＳ／ＭＳ分析では、この標識戦略は、ほとんどの非誘導体化断片からは検出できないａ１及びｙｎ－１イオンのシグナル増強を提供する。その単純さ、並びに低コストのため、ジメチル標識は、タンパク質Ｎ末端同定のための有望な戦略である。
或いは、ＴＭＰＰ標識アプローチは簡単であり、異なるタンパク質に首尾よく適用されている。この標識試薬の２つの特徴は、方法の感度を促進する：（ｉ）ＴＭＰＰ標識は、永続的な正電荷を導入し、その結果、イオン化効率が増強され、したがって、低存在量ペプチドのより良好な検出がもたらされ、（ｉｉ）疎水性ＴＭＰＰ基は、逆相クロマトグラフィにおけるＴＭＰＰ誘導体化ペプチドの保持時間をクロマトグラムのより複雑でない部分にシフトさせ、特に、そうでなければカラム上に保持されない短いＮ末端ペプチドについて、検出感度を増大させる。更に、ＴＭＰＰは、プロテオミクスにおけるタンパク質抽出に使用される全ての標準的な界面活性剤、カオトロピック剤、及び還元条件と完全に適合性があり、そのためＴＭＰＰ標識はタンパク質Ｎ末端配列決定に一般的に使用される方法となっている。
ＴＭＰＰ標識アプローチは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから切り取られたタンパク質からのタンパク質クリッピング及びＮ末端不均一性のプロテオゲノムマッピングを検出するために実証されている。更に、この標識試薬は、Ｎ末端ペプチドの疎水性を増加させ、それらのイオン化能力を改善し、導入される正電荷のためにそれらの断片化パターンを修飾する。
レポーターイオントリガタンデム質量分析
ＴＭＰＰタグの部位特異的局在化は、成熟Ｎ末端又はネオＮ末端の明確な決定を可能にする。骨格プロダクトイオンに加えて、衝突誘発解離（ＣＩＤ）を介して形成された２７３ＤａのＴＭＰＰレポーターイオンは、プロセシングされたＮ末端の存在について診断することができる。しかし、ＣＩＤを介して生成されたレポーターイオンは、それらの存在量が少ないため、情報価値が低い可能性がある。
ＴＭＰＰタグの部位特異的局在化は、成熟Ｎ末端又はネオＮ末端の明確な決定を可能にする。骨格プロダクトイオンに加えて、衝突誘発解離（ＣＩＤ）を介して形成された２７３ＤａのＴＭＰＰレポーターイオンは、プロセシングされたＮ末端の存在について診断することができる。しかし、ＣＩＤを介して生成されたレポーターイオンは、それらの存在量が少ないため、情報価値が低い可能性がある。
本出願は、電子移動解離（ＥＴＤ）タンデム質量分析でのＴＭＰＰレポーターイオンの容易な生成のための新規ハイスループットＬＣ－ＭＳ法について記載する。これらのレポーターイオンの豊富な生成は、更なる配列ペプチドに対する強度及びｍ／ｚ依存性トリガイベントを介したＣＩＤ、ＨＣＤ又はＵＶＰＤなどの相補的イオン活性化モードを使用したその後のＭＳ／ＭＳイベントを可能にする。ＥＴＤを介して生成されたレポーターイオンは新規であり、このレポーターのトリガは、ＴＭＰＰ標識ペプチドを含むスペクトルのフィルタリングを容易にし、データベース検索、又はスペクトルの迅速な手動検証を支援する。
一般的な一態様では、本出願は、ポリペプチドの特性決定を行う方法に関し、方法は、
（ｉ）ポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉ）標識ポリペプチドを消化して、１つ又は複数の非標識ペプチド及び１つ又は複数の標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｉｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）質量分析に供することと、
（ｖ）１つ又は複数の標識ペプチドのＥＴＤ質量スペクトルにおけるレポーターイオンを検出することによって、１つ又は複数の標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉ）同定された１つ又は複数の標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々の第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉ）標識ペプチドの各々のＥＴＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
（ｉ）ポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉ）標識ポリペプチドを消化して、１つ又は複数の非標識ペプチド及び１つ又は複数の標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｉｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）質量分析に供することと、
（ｖ）１つ又は複数の標識ペプチドのＥＴＤ質量スペクトルにおけるレポーターイオンを検出することによって、１つ又は複数の標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉ）同定された１つ又は複数の標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々の第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉ）標識ペプチドの各々のＥＴＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
本出願の実施形態によれば、特性決定されるポリペプチドは、酵素、抗体（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、又はその抗原結合断片、生体分子抗原、融合タンパク質、融合ペプチド、足場タンパク質若しくはペプチド、タンパク質若しくはペプチド薬物コンジュゲート、又は治療若しくは診断様式として有用な任意の他のポリペプチド若しくはペプチドを含むが、これらに限定されない、タンパク質又はペプチドのクリッピングから生じる断片（クリップポリペプチド）であってもよい。ポリペプチド自体は、１つ又は複数のクリップ部位を有することができ、したがってクリップされて、クリップされたペプチドを生成することができる。
Ｎ末端標識試薬は、任意の第１級アミン反応性試薬を含む末端アミン基と反応することができる。試薬の例としては、サンガー試薬、ダンシル誘導体、フェニルイソチオシアナート（ＰＩＴＣ）、ジメトキシピリミジン－２－イソチオシアナート（ＤＭＰＩＴＣ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）試薬、（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニルメチル）トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド（ＴＭＰＰ）、ジメチル標識試薬、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）、並びに相対及び絶対定量のための同重体タグ（ｉＴＲＡＱ）が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明に適したＮ末端標識試薬は、固定電荷誘導体化試薬である。これらの試薬の例としては、ＴＭＰＰ、ＴＭＴ、又はｉＴＲＡＱが挙げられるが、これらに限定されない。これらの試薬は、固定された正電荷を有するタグをペプチドに付加することができる。固定された電荷タグは、より良好なイオン化をもたらし、タグの疎水性は逆相クロマトグラフィにおけるより大きな保持をもたらす。更に、質量分析における固定された電荷ペプチドのその後の断片化は、レポーターイオンを含む様々な骨格断片及び荷電タグ断片をもたらし、これは、本質的に診断的であり、ペプチド同定を容易にすることができる。特に、レポーターイオンは、断片化時の電荷損失から生成される。
これらの試薬のいくつかはまた、遊離Ｎ末端に対する反応特異性を改善し、リジンなどの任意の他の遊離アミンに対する反応特異性を改善しない立体的な嵩高さを特徴とする。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端標識試薬はＴＭＰＰである。更なる実施形態では、標識ポリペプチドは、ＴＭＰＰ標識ポリペプチドであり、標識ペプチドは、ＴＭＰＰ標識ペプチドである。
いくつかの実施形態では、ペプチドのＴＭＰＰ標識は主にＮ末端にあり、更なる非標識リジン又はチロシン残基は診断用ＴＭＰＰ＋イオンに影響を及ぼさない。
いくつかの実施形態では、ペプチドを消化するために使用される酵素は、当技術分野で公知の任意のタンパク質分解酵素を含む。
特定の実施形態では、ＴＭＰＰ標識ポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成する。この混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供してＬＣの溶出液を生成する場合、この方法は、ＴＭＰＰ標識が疎水性であり、逆相勾配で後に溶出するので、混合物中の非標識ペプチドからのＴＭＰＰ標識ペプチドの迅速な分離を可能にする。これにより、ＴＭＰＰ標識ペプチドの保持時間予測性が可能になり、特異性が更に改善され、ペプチドの偽陽性同定が減少する。
いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）分離ステップｉｉｉ）は、分離のための液体クロマトグラフィ（ＬＣ）が存在しないように省略することができる。したがって、その後のステップｉｖ）において、１つ又は複数の非標識ペプチド及び１つ又は複数の標識ペプチドを含む混合物は、直接注入又はフローインジェクションによってタンデム質量分析に直接供される。例えば、一実施形態では、タンデム質量分析は、電子移動解離（ＥＴＤ）を含む。一般に、ＥＴＤは、電子誘導解離法の一種であるため、電子捕捉解離（ＥＣＤ）などの他のタイプの電子ベースの解離方法も、本明細書ではＥＴＤの代替として使用することができる。いくつかの実施形態では、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）などの他の解離方法も、本明細書ではＥＴＤの代替として使用することができる。
本出願の実施形態によれば、ＥＴＤに供される誘導体化されたプリーカーサイオンは、ペプチドの誘導体化のレベルに関係しない。例えば、１００％で誘導体化されたペプチドは、１％で誘導体化された同じペプチドと同じＥＴＤ効率を有することができる。これは、タンパク質のクリップ部位同定との関連でこれらの反応を考慮する場合に重要であり、タンパク質での誘導体化効率は、代理ペプチドのＥＴＤ効率に影響を及ぼさない。
いくつかの実施形態では、レポーターイオンは、ＴＭＰＰレポーターイオンである。更なる実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する。元素の公称質量は、その最も豊富な天然に存在する安定同位体の質量数であり、イオン又は分子の場合、公称質量は、構成原子の公称質量の合計である。公称質量の精度は、１０ｐｐｍまで良好であることが多い。
好ましくは、本発明の方法は、電子移動解離（ＥＴＤ）の際にｍ／ｚ約５３３Ｄａ（ＴＭＰＰ＋）、場合によっては約５９０Ｄａ（ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋）のＴＭＰＰレポーターイオン、又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）の際にｍ／ｚ約５７３Ｄａ（ＴＭＰＰ－Ａｃ＋）のＴＭＰＰレポーターイオンの容易な生成を可能にする。通常、約５３３Ｄａのレポーターイオンが最も優勢なプロダクトイオンである。強いプロダクトイオンを使用して、その後のＭＳ／ＭＳイベントをトリガしてペプチドを更に配列決定することができる。閾値を使用して、質量ｍ／ｚ閾値及び強度閾値を含む、後続のＭＳ／ＭＳイベントをトリガすることができる。例えば、フィルタ（質量許容差）は、ｍ／ｚ閾値として特定の特異性をトリガするためにしばしば使用される。特定の実施形態では、フィルタは、トリガのために１～２０ｐｐｍの範囲の質量許容差で、５３３．１９３５又は５９０．２１５０Ｄａ／電荷又はＴｈｏｍｓｏｎでの正確な質量電荷のベースピークに設定される。質量許容差は、１ｐｐｍ、２ｐｐｍ、３ｐｐｍ、４ｐｐｍ、５ｐｐｍ、６ｐｐｍ、７ｐｐｍ、８ｐｐｍ、９ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１１ｐｐｍ、１２ｐｐｍ、１３ｐｐｍ、１４ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、１６ｐｐｍ、１７ｐｐｍ、１８ｐｐｍ、１９ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、又はそれらの間の任意の数、好ましくは５ｐｐｍであってもよい。
或いは、レポーターイオンの強度を閾値として使用することができ、これは計装ソフトウェアを使用して設定することができる。例えば、強度は、任意の特定の数、例えば、ベースピークの１０％に設定することができ、次いで、ベースピークの１０％又は１０％より大きい強度を有する任意のレポーターイオンは、後続のＭＳ／ＭＳイベントをトリガすることができる。
好ましい実施形態では、本方法は、標識ペプチドのＥＴＤ質量スペクトルにおいてＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを同定することを含む。
本出願の実施形態によれば、一般に、ＥＴＤによってＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成する傾向は、同様の質量又は同じ数のアミノ酸を有するペプチドの３価のプリーカーサイオンより２価のプリーカーサイオンを好む。したがって、ＥＴＤによって生成されたＴＭＰＰ＋イオンの診断的有用性は、ほとんどが２価であるトリプシンペプチドに完全に適している。
いくつかの実施形態では、第２の質量分析は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析である。したがって、いくつかの実施形態では、タンデム質量分析は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析（ＣＩＤ－ＭＳ２）、高エネルギー衝突解離タンデム質量分析（ＨＣＤ－ＭＳ２）、又は紫外線光解離タンデム質量分析（ＵＶＰＤ－ＭＳ２）である。
いくつかの実施形態では、第２の質量スペクトルは、ＴＭＰＰ標識ペプチドのＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルである。
いくつかの実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、ＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量分析をトリガする。トリガ型質量分析の手法は、ＭＳ２の第１のＥＴＤ質量分析部分から生成されたレポーターイオンの存在を確認するトリガＭＳ２の発生が少ないため、データのフィルタリングを手動検査に適したものにする。したがって、これは、レポーターイオンピークを有するＥＴＤ質量スペクトルのｉｎ－ｓｌｉｃｏアプローチ又は手動検査の必要性を排除する。
いくつかの実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、電荷損失から生成される。
いくつかの実施形態では、ＬＣは、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）又は超高速液体クロマトグラム（ＵＰＬＣ）である。
いくつかの実施形態では、方法はハイスループットである。
いくつかの実施形態では、ＥＴＤ質量スペクトル（すなわち、第１の質量スペクトル）及びＣＩＤ、ＨＣＤ、若しくはＵＶＰＤ質量スペクトルなどの第２の質量スペクトルは、配列データベース又はスペクトルライブラリ内の情報と比較することによって分析される。
好ましい実施形態では、同定されたＴＭＰＰ標識ペプチドをＣＩＤ質量分析に供する。
本出願の実施形態によれば、ＴＭＰＰ標識はまた、ペプチドのリジン残基及びチロシン残基上で起こることができ、ＥＴＤに供した場合、これらのＴＭＰＰ修飾を有するペプチドはまた、診断用レポーターイオンを生成することができ、したがってＣＩＤ－ＭＳ２イベントをトリガすることができる。これらのＣＩＤスペクトルは、レポーターの偽陽性同定である。それにもかかわらず、ＥＴＤ及び診断用イオントリガＣＩＤスペクトルにおける配列イオンの後続の検査は、配列上にＴＭＰＰを部位特異的に局在化させ、偽陽性の排除に役立つことができる。例えば、後続のトリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルは、ＴＭＰＰ部分がリジン又はチロシンのＮ末端又は側鎖に割り当てられているかどうかを決定するために使用することができる骨格イオンの情報を提供することができる。ＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガＣＩＤ－ＭＳ２の相補的性質は、ＴＭＰＰ部分を含有する代理タンパク質分解ペプチドのアミノ酸配列に関係なく、潜在的なクリップされた種を迅速にスクリーニングするのに役立つことができる。トリガＣＩＤ－ＭＳ２のためのＴＭＰＰ＋イオンを生成する能力は、ＴＭＰＰ部分の正確な局在化又は高い信頼性での配列の確認のための配列の完全な調査を提示する。
好ましい実施形態では、本出願は、試料中のＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）標識ペプチドを特性決定する方法に関し、方法は、
（ｉ）試料を電子移動解離（ＥＴＤ）を含むタンデム質量分析に供することと、
（ｉｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドのＥＴＤ質量スペクトルにおいてＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを同定することと、
（ｉｉｉ）同定されたＴＭＰＰ標識ペプチドを第２の質量分析に供することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドの第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｉｖ）ＥＴＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを特性決定することと
を含む。
（ｉ）試料を電子移動解離（ＥＴＤ）を含むタンデム質量分析に供することと、
（ｉｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドのＥＴＤ質量スペクトルにおいてＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを同定することと、
（ｉｉｉ）同定されたＴＭＰＰ標識ペプチドを第２の質量分析に供することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドの第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｉｖ）ＥＴＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを特性決定することと
を含む。
Ｎ末端標識試薬、好ましくはＴＭＰＰは、リジン及びチロシンなどの側鎖中のアミン基にも結合することができることに留意されたい。ＴＭＰＰ標識ペプチドがＥＴＤに供されると、レポーターイオンも生成し、したがってＣＩＤ－ＭＳ２などの第２の質量分析をトリガする場合、これらの第２の質量スペクトルはレポーターイオンの偽陽性同定である。しかし、ＥＴＤスペクトル及びレポーターイオントリガＣＩＤスペクトルにおける配列イオンの慎重な検査は、配列上にＴＭＰＰを部位特異的に局在化させ、偽陽性の排除を助けることができる。
別の一般的な態様では、本出願はまた、タンパク質上のクリップ部位を同定する方法に関し、方法は、
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、１つ又は複数の標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及び標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）溶出液を、電子移動解離（ＥＴＤ）を含むタンデム質量分析に供することと、
（ｖｉ）標識ペプチドの各々について、ＥＴＤ質量スペクトルのレポーターイオンを検出することによって、標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉｉ）同定された標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々について第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）標識ペプチドの各々についてＥＴＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、１つ又は複数の標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及び標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）溶出液を、電子移動解離（ＥＴＤ）を含むタンデム質量分析に供することと、
（ｖｉ）標識ペプチドの各々について、ＥＴＤ質量スペクトルのレポーターイオンを検出することによって、標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉｉ）同定された標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々について第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）標識ペプチドの各々についてＥＴＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、天然タンパク質、合成タンパク質、組換えタンパク質、又はそれらのペプチドを包含する。本発明の方法によって分析することができるタンパク質の例としては、酵素、抗体（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、又はその抗原結合断片、生体分子抗原、融合タンパク質、融合ペプチド、足場タンパク質若しくはペプチド、タンパク質若しくはペプチド薬物コンジュゲート、又は治療若しくは診断様式として有用な任意の他のポリペプチド若しくはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
本出願の実施形態によれば、特性決定されるクリップポリペプチドは、酵素、抗体、及び生体分子抗原などのタンパク質のクリッピングから生じる断片であってもよい。ポリペプチド自体は、１つ又は複数のクリップ部位を有することができ、したがってクリップされて、クリップされたペプチドを生成することができる。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端標識試薬は、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）である。更なる実施形態では、標識ポリペプチドは、ＴＭＰＰ標識ポリペプチドであり、標識ペプチドは、ＴＭＰＰ標識ペプチドである。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端標識試薬はＴＭＰＰである。更なる実施形態では、標識ポリペプチドは、ＴＭＰＰ標識ポリペプチドであり、標識ペプチドは、ＴＭＰＰ標識ペプチドである。
いくつかの実施形態では、分離のための液体クロマトグラフィ（ＬＣ）が存在しないように、ステップｉｖ）は存在しなくてもよい。したがって、後続のステップｖ）において、非標識ペプチド及び標識ペプチドを含む混合物は、直接注入又はフローインジェクションによる電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）又は他の電子誘導解離タンデム質量分析に直接供される。
いくつかの実施形態では、レポーターイオンは、ＴＭＰＰレポーターイオンである。更なる実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する。
好ましい実施形態では、本方法は、標識ペプチドのＥＴＤ質量スペクトルにおいてＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを同定することを含む。
いくつかの実施形態では、第２の質量分析は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析である。したがって、いくつかの実施形態では、タンデム質量分析は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析（ＣＩＤ－ＭＳ２）、高エネルギー衝突解離タンデム質量分析（ＨＣＤ－ＭＳ２）、又は紫外線光解離タンデム質量分析（ＵＶＰＤ－ＭＳ２）である。
いくつかの実施形態では、第２の質量スペクトルは、ＴＭＰＰ標識ペプチドのＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルである。
いくつかの実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、ＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量分析をトリガする。
いくつかの実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、電荷損失から生成される。
いくつかの実施形態では、ＬＣは、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）又は超高速液体クロマトグラム（ＵＰＬＣ）である。
一実施形態では、タンパク質は治療用タンパク質である。一実施形態では、タンパク質は非治療用タンパク質である。
いくつかの実施形態では、方法はハイスループットである。
いくつかの実施形態では、ＥＴＤ質量スペクトル及びＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルなどの第２の質量スペクトルは、Ｕｎｉｐｒｏｔ、ＮＩＳＴ、又はＳｐｅｃｔｒａＳＴなどのデータベース又はスペクトルライブラリ中の情報と比較することによって分析される。しかし、これらのデータベース又はパブリックライブラリは、同定するための基準として注釈された５３３又は５９０レポーターイオンを有していないため、非レポーターイオンの同定のために使用される。
好ましい実施形態では、同定されたＴＭＰＰ標識ペプチドをＣＩＤ質量分析に供する。
別の一般的な一態様では、本発明は、タンパク質上のクリップ部位を同定する方法に関し、方法は、
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識し、それによって１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）を含むタンデム質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてＥＴＤ質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉ）ＥＴＤ質量スペクトル中のＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することと、
（ｖｉｉ）ＴＭＰＰレポーターイオンの検出又は分離時に、ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々を、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてそれぞれＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＶＰＤ質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてＥＴＤ質量スペクトル及びＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＰＶＤ質量スペクトルを分析することによって、タンパク質上のクリップ部位を同定することと
を含む。
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識し、それによって１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）溶出液を電子移動解離（ＥＴＤ）を含むタンデム質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてＥＴＤ質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉ）ＥＴＤ質量スペクトル中のＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することと、
（ｖｉｉ）ＴＭＰＰレポーターイオンの検出又は分離時に、ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々を、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてそれぞれＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＶＰＤ質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてＥＴＤ質量スペクトル及びＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＰＶＤ質量スペクトルを分析することによって、タンパク質上のクリップ部位を同定することと
を含む。
いくつかの実施形態では、特性決定されるクリップポリペプチドは、酵素、抗体、及び生体分子抗原などのタンパク質のクリッピングから生じる断片であってもよい。ポリペプチド自体は、１つ又は複数のクリップ部位を有することができ、したがってクリップされて、クリップされたペプチドを生成することができる。
いくつかの実施形態では、分離のための液体クロマトグラフィ（ＬＣ）が存在しないように、ステップｉｖ）は存在しなくてもよい。したがって、後続のステップｖ）において、非標識ペプチド及び標識ペプチドを含む混合物は、直接注入又はフローインジェクションを介して電子移動解離（ＥＴＤ）を含むタンデム質量分析に直接供される。
いくつかの実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する。
いくつかの実施形態では、ＥＴＤ質量スペクトル及びＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＰＶＤ質量スペクトルは、データベース又はスペクトルライブラリ内の情報と比較することによって分析される。
本開示を考慮して、本明細書に記載の発明には任意の適切な質量スペクトル装置を使用することができる。例えば、ＥＴＤを含むタンデム質量分析は、ＥＴＤ反応を行うことができる任意の機器を使用して行うことができる。このタイプの解離を行うことができるいくつかのモデル及び機器ベンダがあり、これらは当技術分野で公知である。例えば、電子捕捉解離（ＥＣＤ）は、ＥＴＤとの類似性を有し、したがって、解離を行い、同じレポーターイオンを生成することができる。したがって、ＥＣＤ反応を行うことができる機器も、ＥＴＤタンデム質量分析の代替として使用することができる。同様に、ＣＩＤタンデム質量分析は、低エネルギーＣＩＤ及び高エネルギーＣＩＤを含むＣＩＤ反応を行うことができる任意の機器を使用して行うことができる。
ポリペプチド上のクリップ部位を同定するための、及び／又はポリペプチドを特性決定するためのシステム
本発明はまた、部分的には、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するための、又は試料中のポリペプチドを特性決定するためのシステムに関する。本発明の様々な態様では、システムは、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）装置及びタンデム質量分析計を含む。
本発明はまた、部分的には、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するための、又は試料中のポリペプチドを特性決定するためのシステムに関する。本発明の様々な態様では、システムは、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）装置及びタンデム質量分析計を含む。
一実施形態では、ＬＣ装置は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）装置である。
いくつかの実施形態では、タンデム質量分析計は、
（ｉ）第１のイオン化装置と、
（ｉｉ）第１の範囲内の質量電荷比を有するイオンを透過するために、第１の動作モードで配置及び適合された第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器と、
（ｉｉｉ）第１のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｉｖ）動作モードでイオンを減衰させるための減衰手段と、
（ｖ）第１の範囲内の質量電荷比を有するが、１つ又は複数の望ましくない第１の電荷状態を有するイオンが実質的に減衰されるように、減衰手段の動作を制御するように構成された制御装置と、
（ｖｉ）第２のイオン化装置と、
（ｖｉｉ）第２のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｖｉｉｉ）フラグメントイオンの非混合信号を取得し、トリガイオンを非冗長的にコード化するように構成されたデータシステムであって、非冗長的なコード化が、任意の個々のゲート時間の複数回の反復において異なる親種からの任意の２つのイオン信号の反復的な重複を回避又は最小化するように配置されている、データシステムと
を含む。
（ｉ）第１のイオン化装置と、
（ｉｉ）第１の範囲内の質量電荷比を有するイオンを透過するために、第１の動作モードで配置及び適合された第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器と、
（ｉｉｉ）第１のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｉｖ）動作モードでイオンを減衰させるための減衰手段と、
（ｖ）第１の範囲内の質量電荷比を有するが、１つ又は複数の望ましくない第１の電荷状態を有するイオンが実質的に減衰されるように、減衰手段の動作を制御するように構成された制御装置と、
（ｖｉ）第２のイオン化装置と、
（ｖｉｉ）第２のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｖｉｉｉ）フラグメントイオンの非混合信号を取得し、トリガイオンを非冗長的にコード化するように構成されたデータシステムであって、非冗長的なコード化が、任意の個々のゲート時間の複数回の反復において異なる親種からの任意の２つのイオン信号の反復的な重複を回避又は最小化するように配置されている、データシステムと
を含む。
一実施形態では、試料をＬＣ装置に供して、溶出液を生成させる。
一実施形態では、溶出液をタンデム質量分析に供して、第１の質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを得る。
いくつかの実施形態では、ポリペプチド上のクリップ部位又はポリペプチドは、Ｎ末端標識試薬で標識される。例えば、一実施形態では、Ｎ末端標識試薬は、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）である。
一実施形態では、第１のイオン化装置は、ＴＭＰＰレポーターイオンを生成する。様々な実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する。一実施形態では、ＴＭＰＰレポーターイオンは、第２の質量分析をトリガする。
一実施形態では、第１のイオン化装置は、電子誘導解離装置である。いくつかの実施形態では、電子誘導解離装置は、電子移動解離（ＥＴＤ）装置又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）装置である。したがって、様々な実施形態では、第１の質量スペクトルは、ＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルである。
いくつかの実施形態では、第２のイオン化装置は、衝突誘発解離（ＣＩＤ）装置、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）装置、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）装置である。したがって、様々な実施形態では、第２の質量スペクトルは、ＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルを含む。
いくつかの実施形態では、第１の質量スペクトル及び第２の質量スペクトルは、データベース又はスペクトルライブラリ内の情報と比較することによって分析される。
いくつかの実施形態では、質量分析計は、衝突装置、断片化装置、又は反応装置を更に含む。
いくつかの実施形態では、減衰手段は、イオンゲート又はイオンバリアを含む。いくつかの実施形態では、減衰手段は、イオン移動度分光計又は分離器の下流に配置される。
いくつかの実施形態では、第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器は、第１の動作モードで配置及び適合されて、第１の範囲外の質量電荷比を有するイオンを減衰させる。いくつかの実施形態では、第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器は、当該イオン移動度分光計又は分離器の上流又は下流に配置される。
いくつかの実施形態では、第１の望ましくない電荷状態は、以下の（ｉ）１価、（ｉｉ）２価、（ｉｉｉ）３価、（ｉｖ）４価、（ｖ）５価、及び（ｖｉ）多価のうちの１つ又は複数から選択される。
いくつかの実施形態では、質量分析計は、当該イオン移動度分光計又は分離器の上流に配置されたイオンガイド、イオントラップ、又はイオントラップ領域を更に含み、当該イオンガイド、イオントラップ、又はイオントラップ領域は、イオンをトラップ、貯蔵、又は蓄積し、次いで当該イオン移動度分光計又は分離器内に、若しくは当該イオン移動度分光計又は分離器に向かってイオンを定期的にパルス化するように配置されている。
ポリペプチド上のクリップ部位を同定するための、及び／又はポリペプチドを特性決定するためのレポーターイオン
他の態様では、本発明はまた、部分的には、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するためのレポーターイオン及び／又はポリペプチドを特性決定するためのレポーターイオンに関する。一実施形態では、クリップ部位は、Ｎ末端標識試薬で標識される。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端標識試薬で標識される。例えば、一実施形態では、Ｎ末端標識試薬は、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）である。
他の態様では、本発明はまた、部分的には、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するためのレポーターイオン及び／又はポリペプチドを特性決定するためのレポーターイオンに関する。一実施形態では、クリップ部位は、Ｎ末端標識試薬で標識される。一実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端標識試薬で標識される。例えば、一実施形態では、Ｎ末端標識試薬は、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）である。
一実施形態では、Ｎ末端標識試薬は、イオン化されてレポーターイオンを生成する。例えば、一実施形態では、ＴＭＰＰは、イオン化されてレポーターイオンを生成する。
一実施形態では、Ｎ末端標識試薬は、質量分析計によってイオン化されてレポーターイオンを生成する。例えば、一実施形態では、ＴＭＰＰは、質量分析計によってイオン化されて、レポーターイオンを生成する。
一実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計である。様々な実施形態では、タンデム質量分析計は、本明細書に記載の任意のタンデム質量分析計である。例えば、いくつかの実施形態では、タンデム質量分析計は、電子移動解離（ＥＴＤ）装置、電子捕捉解離（ＥＣＤ）装置、衝突誘発解離（ＣＩＤ）装置、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）装置、紫外線光解離（ＵＶＰＤ）装置、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
一実施形態では、Ｎ末端標識試薬は、質量分析技術によってイオン化されてレポーターイオンを生成する。例えば、一実施形態では、ＴＭＰＰは、質量分析技術によってイオン化されてレポーターイオンを生成する。
一実施形態では、質量分析技術は、タンデム質量分析技術である。様々な実施形態では、タンデム質量分析技術は、本明細書に記載の任意のタンデム質量分析技術である。例えば、いくつかの実施形態では、タンデム質量分析計技術は、電子移動解離（ＥＴＤ）、電子捕捉解離（ＥＣＤ）、衝突誘発解離（ＣＩＤ）、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、紫外線光解離（ＵＶＰＤ）、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、レポーターイオンは、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する。
いくつかの実施形態では、レポーターイオンは、
他の態様では、本発明はまた、部分的には、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するための組成物に関する。
他の態様では、本発明は、部分的には、ポリペプチドを特性決定するための組成物に関する。
様々な実施形態では、組成物は、本発明の少なくとも１つのレポーターイオン及びポリペプチドを含む。
キット
本発明はまた、本発明の方法において有用なキットに関する。そのようなキットは、例えばポリペプチド上のクリップ部位を同定するための材料及び／又はポリペプチドを特性決定するための材料、並びに説明資料を含む、本明細書の他の箇所に記載される方法のうちのいずれかにおいて有用な構成要素の様々な組み合わせを含む。例えば、一実施形態では、キットは、試料中のポリペプチド上のクリップ部位を同定するのに有用な構成要素を含む。一実施形態では、試料中のポリペプチド上のクリップ部位を同定するのに有用な構成要素は、ＴＭＰＰを含む。別の実施形態では、キットは、試料中のポリペプチドを特性決定するのに有用な構成要素を含む。一実施形態では、試料中のポリペプチドを特性決定するのに有用な構成要素は、ＴＭＰＰを含む。
本発明はまた、本発明の方法において有用なキットに関する。そのようなキットは、例えばポリペプチド上のクリップ部位を同定するための材料及び／又はポリペプチドを特性決定するための材料、並びに説明資料を含む、本明細書の他の箇所に記載される方法のうちのいずれかにおいて有用な構成要素の様々な組み合わせを含む。例えば、一実施形態では、キットは、試料中のポリペプチド上のクリップ部位を同定するのに有用な構成要素を含む。一実施形態では、試料中のポリペプチド上のクリップ部位を同定するのに有用な構成要素は、ＴＭＰＰを含む。別の実施形態では、キットは、試料中のポリペプチドを特性決定するのに有用な構成要素を含む。一実施形態では、試料中のポリペプチドを特性決定するのに有用な構成要素は、ＴＭＰＰを含む。
一実施形態では、説明資料は、ポリペプチドをＴＭＰＰで標識するためのステップを記載する。一実施形態では、説明資料は、ポリペプチドのクリップ部位をＴＭＰＰで標識するためのステップを記載する。いくつかの実施形態では、説明資料は、本発明のシステムを使用して、ポリペプチド又はＴＭＰＰ標識ポリペプチド上のＴＭＰＰ標識クリップ部位を分析する１つ又は複数の方法を記載する。いくつかの実施形態では、説明資料は、本発明のシステムを使用して、ポリペプチド又はＴＭＰＰ標識ポリペプチド上のＴＭＰＰ標識クリップ部位を分析する１つ又は複数の方法を記載する。
本発明の実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態も提供する。
本発明は、以下の非限定的な実施形態も提供する。
実施形態１は、試料中のＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）標識ペプチドを特性決定する方法であって、方法は、
（ｉ）試料を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）又は他の電子ベースの解離タンデム質量分析又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）タンデム質量分光測定に供することと、
（ｉｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドのＥＴＤ又はＥＣＤ、他の電子誘導解離質量スペクトル、又はＨＣＤ質量スペクトルのＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを同定することと、
（ｉｉｉ）同定されたＴＭＰＰ標識ペプチドを第２の質量分析に供することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドの第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｉｖ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル又はＨＣＤ質量スペクトル、並びに第２の質量スペクトルを分析することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを特性決定することと
を含む。
（ｉ）試料を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）又は他の電子ベースの解離タンデム質量分析又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）タンデム質量分光測定に供することと、
（ｉｉ）ＴＭＰＰ標識ペプチドのＥＴＤ又はＥＣＤ、他の電子誘導解離質量スペクトル、又はＨＣＤ質量スペクトルのＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを同定することと、
（ｉｉｉ）同定されたＴＭＰＰ標識ペプチドを第２の質量分析に供することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドの第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｉｖ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル又はＨＣＤ質量スペクトル、並びに第２の質量スペクトルを分析することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドを特性決定することと
を含む。
実施形態１ａは、ＥＴＤが方法で使用される、実施形態１に記載の方法である。
実施形態１ｂは、ＥＣＤが方法で使用される、実施形態１に記載の方法である。
実施形態１ｃは、第２の質量分析が、ＣＩＤタンデム質量分析（ＣＩＤ－ＭＳ２）をもたらす衝突誘起解離（ＣＩＤ）質量分析の結果であり、第２の質量スペクトルが、ＣＩＤ質量スペクトルである、実施形態１～１ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１ｄは、第２の質量分析が、ＨＣＤタンデム質量分析（ＨＣＤ－ＭＳ２）をもたらす高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析であり、第２の質量スペクトルが、ＨＣＤ質量スペクトルである、実施形態１～１ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１ｄは、第２の質量分析が、ＵＰＶＤタンデム質量分析（ＵＶＰＤ－ＭＳ２）をもたらす紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析であり、第２の質量スペクトルが、ＵＶＰＤ質量スペクトルである、実施形態１～１ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２は、ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａ又は約５７３Ｄａ又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態１～１ｄのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２ａは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２に記載の方法である。
実施形態２ｂは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、５３３．１９３５の正確な質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２ａに記載の方法である。
実施形態２ｃは、ＴＭＰＰ標識ペプチドが、ＴＭＰＰ標識ペプチドのＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル中の第２のＴＭＰＰレポーターイオンを検出することによって同定され、第２のＴＭＰＰレポーターイオンが、約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２ａ又は２ｂに記載の方法である。
実施形態２ｄは、第２のＴＭＰＰレポーターイオンが、５９０．２１５０の正確な質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２ｃに記載の方法である。
実施形態２ｅは、ＴＭＰＰ標識ペプチドが、ＴＭＰＰ標識ペプチドのＥＴＤ又はＥＣＤ又はＨＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル中の第２又は第３のＴＭＰＰレポーターイオンを検出することによって同定され、第２又は第３のＴＭＰＰレポーターイオンが、約５７３Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２ａ～２ｄのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２ｆは、第２又は第３のＴＭＰＰレポーターイオンが、５７３．１８８４の正確な質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２ｅに記載の方法である。
実施形態３は、ＴＭＰＰレポーターイオンが、電荷損失から生成される、実施形態１～２ｆのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態３ａは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおいて優勢なプロダクトイオンである、実施形態３に記載の方法である。
実施形態３ｂは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＥＴＤ質量スペクトルにおいて優勢なプロダクトイオンである、実施形態３ａに記載の方法である。
実施形態３ｃは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＥＣＤ質量スペクトルにおいて優勢なプロダクトイオンである、実施形態３ａに記載の方法である。
実施形態３ｄは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、２価ペプチドから生成される、実施形態１～３ｃのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態３ｅは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＴＭＰＰ＋である、実施形態１～３ｃのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態３ｆは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋である、実施形態１～３ｃのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態３ｆは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＴＭＰＰ－Ａｃ＋である、実施形態１～３ｃのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態４は、ＴＭＰＰレポーターイオンが、第２の質量分析をトリガする、実施形態１～３ｆのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態４ａは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、強度閾値又はｍ／ｚ閾値を介して第２の質量分析をトリガする、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法である。
実施形態４ｂは、フィルタ（質量許容差）を使用して、第２の質量分析をトリガする、実施形態４又は４ａに記載の方法である。
実施形態４ｃは、フィルタが、１ｐｐｍ、２ｐｐｍ、３ｐｐｍ、４ｐｐｍ、５ｐｐｍ、６ｐｐｍ、７ｐｐｍ、８ｐｐｍ、９ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１１ｐｐｍ、１２ｐｐｍ、１３ｐｐｍ、１４ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、１６ｐｐｍ、１７ｐｐｍ、１８ｐｐｍ、１９ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、又はそれらの間の任意の数、好ましくは５ｐｐｍの質量許容差などの、トリガのための１～２０ｐｐｍの範囲の質量許容差で、５３３．１９３５、５７３．１８８４、又は５９０．２１５０Ｄａの正確な質量のベースピークに設定される、実施形態４ｂに記載の方法である。
実施形態４ｄは、レポーターイオンの強度が、第２の質量分析をトリガするための閾値として使用される、実施形態４又は４ａに記載の方法である。
実施形態４ｅは、強度が、ベースピークの強度の１０％以上に設定される、実施形態４ｄに記載の方法である。
実施形態４ｆは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＣＩＤタンデム質量分析（ＣＩＤ－ＭＳ２）をもたらす衝突誘起解離（ＣＩＤ）質量分析をトリガする、実施形態１～４ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態４ｇは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＨＣＤタンデム質量分析（ＨＣＤ－ＭＳ２）をもたらす高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析をトリガする、実施形態１～４ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態４ｈは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＵＶＰＤタンデム質量分析（ＵＶＰＤ－ＭＳ２）をもたらす紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析をトリガする、実施形態１～４ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態５は、ポリペプチドを特性決定する方法であって、方法は、
（ｉ）ポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉ）標識ポリペプチドを消化して、１つ又は複数の非標識ペプチド及び１つ又は複数の標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）任意選択で、混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｉｖ）ステップｉｉｉ）からの溶出液、又はステップｉｉ）からの混合物を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）又は他の電子誘導解離タンデム質量分析に供することと、
（ｖ）標識ペプチドのＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおけるレポーターイオンを検出することによって、標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉ）同定された標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
（ｉ）ポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉ）標識ポリペプチドを消化して、１つ又は複数の非標識ペプチド及び１つ又は複数の標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）任意選択で、混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｉｖ）ステップｉｉｉ）からの溶出液、又はステップｉｉ）からの混合物を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）又は他の電子誘導解離タンデム質量分析に供することと、
（ｖ）標識ペプチドのＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおけるレポーターイオンを検出することによって、標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉ）同定された標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
実施形態６は、ポリペプチドが、断片ポリペプチド又はクリップポリペプチドである、実施形態５に記載の方法である。
実施形態６ａは、断片ポリペプチド又はクリップポリペプチドが、タンパク質のクリッピングから生じる、実施形態６に記載の方法である。
実施形態６ｂは、ポリペプチドが、１つ又は複数のクリップ部位を有する、実施形態６又は６ａに記載の方法である。
実施形態６ｃは、タンパク質が、酵素、抗体（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、又はその抗原結合断片、生体分子抗原、融合タンパク質、融合ペプチド、足場タンパク質若しくはペプチド、タンパク質若しくはペプチド薬物コンジュゲート、又は治療若しくは診断様式として有用な任意の他のポリペプチド若しくはペプチドである、実施形態６～６ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態６ｄは、タンパク質が、治療用タンパク質である、実施形態６ａに記載の方法である。
実施形態６ｅは、タンパク質が、非治療用タンパク質である、実施形態６ａに記載の方法である。
実施形態６ｆは、ＥＴＤが方法で使用される、実施形態５～６ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態６ｇは、ＥＣＤが方法で使用される、実施形態５～６ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態７は、タンパク質上のクリップ部位を同定する方法であって、方法は、
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、１つ又は複数の標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及び標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）任意選択で、混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）ステップｉｖ）からの溶出液、又はステップｉｉｉ）からの混合物を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）又は他の電子誘導解離タンデム質量分析に供することと、
（ｖｉ）標識ペプチドの各々について、ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおけるレポーターイオンを検出することによって、標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉｉ）同定された標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々について第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のポリペプチドをＮ末端標識試薬で標識して、１つ又は複数の標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及び標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）任意選択で、混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）ステップｉｖ）からの溶出液、又はステップｉｉｉ）からの混合物を電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）又は他の電子誘導解離タンデム質量分析に供することと、
（ｖｉ）標識ペプチドの各々について、ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおけるレポーターイオンを検出することによって、標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉｉ）同定された標識ペプチドを第２の質量分析に供し、それによって標識ペプチドの各々について第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを分析することによって、ポリペプチドを特性決定することと
を含む。
実施形態８は、タンパク質が、酵素、抗体（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、又はその抗原結合断片、生体分子抗原、融合タンパク質、融合ペプチド、足場タンパク質若しくはペプチド、タンパク質若しくはペプチド薬物コンジュゲート、又は治療若しくは診断様式として有用な任意の他のポリペプチド若しくはペプチドである、実施形態７に記載の方法である。
実施形態８ａは、タンパク質が、治療用タンパク質である、実施形態７に記載の方法である。
実施形態８ｂは、タンパク質が、非治療用タンパク質である、実施形態７に記載の方法である。
実施形態８ｃは、タンパク質のクリップポリペプチドが、１つ又は複数のクリップ部位を有する、実施形態７～８ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態８ｄは、ＥＴＤが方法で使用される、実施形態７～８ｃのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態８ｅは、ＥＣＤが方法で使用される、実施形態７～８ｄのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態９は、Ｎ末端標識試薬が、固定電荷誘導体化試薬である、実施形態５～８ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態９ａは、Ｎ末端標識試薬が、ポリペプチドに正電荷を付加する、実施形態９に記載の方法である。
実施形態９ｂは、Ｎ末端標識試薬が、電荷損失から生成されたレポーターイオンをもたらす、実施形態９又は９ａに記載の方法である。
実施形態９ｃは、Ｎ末端標識試薬が、ＴＭＰＰである、実施形態９に記載の方法である。
実施形態９ｄは、Ｎ末端標識の効率が、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はそれらの間の任意の数である、実施形態５～９ｃのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１０は、標識ポリペプチドが、ＴＭＰＰ標識ポリペプチドである、実施形態５～９ｄのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１０ａは、標識ペプチドが、ＴＭＰＰ標識ペプチドである、実施形態１０に記載の方法である。
実施形態１１は、ＬＣが、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）又は超高速液体クロマトグラム（ＵＰＬＣ）、好ましくはＨＰＬＣである、実施形態５～１０ａのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１１ａは、ＴＭＰＰ標識ペプチドが、対応する非標識ペプチドと比較して逆相勾配で後に溶出する、実施形態１１に記載の方法である。
実施形態１１ｂは、ステップｉｉｉ）からの混合物が、電子捕捉解離（ＥＣＤ）を含むタンデム質量分析に供される、実施形態５～１０ａのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１１ｃは、混合物が、直接注入又はフロー注入を介してＥＴＤを含むタンデム質量分析に供される、実施形態１１ｂに記載の方法である。
実施形態１１ｄは、ステップｉｉｉ）からの混合物が、電子移動解離（ＥＴＤ）を含むタンデム質量分析に供される、実施形態５～１０ａのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１１ｅは、混合物が、直接注入又はフロー注入を介してＥＣＤを含むタンデム質量分析に供される、実施形態１１ｄに記載の方法である。
実施形態１２は、レポーターイオンが、ＴＭＰＰレポーターイオンである、実施形態５～１１ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１２ａは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態１２に記載の方法である。
実施形態１２ｂは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態１２ａに記載の方法である。
実施形態１２ｃは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３．１９３５の正確な質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態１２ｂに記載の方法である。
実施形態１２ｄは、標識ペプチドが、ＴＭＰＰ標識ペプチドのＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル中の第２のＴＭＰＰレポーターイオンを検出することによって同定され、第２のＴＭＰＰレポーターイオンが、約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態１２ｂ又は１２ｃに記載の方法である。
実施形態１２ｅは、第２のＴＭＰＰレポーターイオンが、５９０．２１５０の正確な質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態１２ｄに記載の方法である。
実施形態１２ｆは、標識ペプチドが、ＴＭＰＰ標識ペプチドのＥＴＤ又はＥＣＤ又はＨＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル中の第２又は第３のＴＭＰＰレポーターイオンを検出することによって同定され、第２又は第３のＴＭＰＰレポーターイオンが、約５７３Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態１２ａ～１２ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１２ｇは、第２又は第３のＴＭＰＰレポーターイオンが、５７３．１８８４の正確な質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態１２ｆに記載の方法である。
実施形態１２ｈは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、電荷損失から生成される、実施形態１２～１２ｇのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１２ｉは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおいて優勢なプロダクトイオンである、実施形態１２～１２ｈのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１２ｊは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、２価ペプチドから生成される、実施形態５～１２ｉのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１２ｋは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＴＭＰＰ＋である、実施形態１２に記載の方法である。
実施形態１２ｌは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋である、実施形態１２に記載の方法である。
実施形態１２ｍは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＴＭＰＰ－Ａｃ＋である、実施形態１２に記載の方法である。
実施形態１３は、第２の質量分析が、ＣＩＤタンデム質量分析（ＣＩＤ－ＭＳ２）をもたらす衝突誘起解離（ＣＩＤ）質量分析の結果であり、第２の質量スペクトルが、ＣＩＤ質量スペクトルである、実施形態５～１２ｍのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１３ａは、第２の質量分析が、ＨＣＤタンデム質量分析（ＨＣＤ－ＭＳ２）をもたらす高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析であり、第２の質量スペクトルが、ＨＣＤ質量スペクトルである、実施形態５～１２ｍのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１３ｂは、第２の質量分析が、ＵＶＰＤタンデム質量分析（ＵＶＰＤ－ＭＳ２）をもたらす紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析であり、第２の質量スペクトルが、ＵＶＰＤ質量スペクトルである、実施形態５～１２ｍのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１４は、ＴＭＰＰレポーターイオンが、第２の質量分析をトリガする、実施形態５～１３ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１４ａは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、強度及びｍ／ｚを介して第２の質量分析をトリガする、実施形態５～１４のいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１４ｂは、フィルタ（質量許容差）を使用して、第２の質量分析をトリガする、実施形態１４又は１４ａに記載の方法である。
実施形態１４ｃは、フィルタが、１ｐｐｍ、２ｐｐｍ、３ｐｐｍ、４ｐｐｍ、５ｐｐｍ、６ｐｐｍ、７ｐｐｍ、８ｐｐｍ、９ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１１ｐｐｍ、１２ｐｐｍ、１３ｐｐｍ、１４ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、１６ｐｐｍ、１７ｐｐｍ、１８ｐｐｍ、１９ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、又はそれらの間の任意の数、好ましくは５ｐｐｍの質量許容差などの、トリガのための１～２０ｐｐｍの範囲の質量許容差で、５３３．１９３５又は５９０．２１５０Ｄａの正確な質量のベースピークに設定される、実施形態１４ｂに記載の方法である。
実施形態１４ｄは、レポーターイオンの強度が、第２の質量分析をトリガするための閾値として使用される、実施形態１４又は１４ａに記載の方法である。
実施形態１４ｅは、強度が、ベースピークの強度の１０％以上に設定される、実施形態１４ｄに記載の方法である。
実施形態１４ｆは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＣＩＤタンデム質量分析（ＣＩＤ－ＭＳ２）をもたらす衝突誘起解離（ＣＩＤ）質量分析をトリガする、実施形態５～１４ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１４ｇは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＨＣＤタンデム質量分析（ＨＣＤ－ＭＳ２）をもたらす高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析をトリガする、実施形態５～１４ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１４ｈは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＵＶＰＤタンデム質量分析（ＵＶＰＤ－ＭＳ２）をもたらす紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析をトリガする、実施形態５～１４ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１５は、方法がハイスループットである、実施形態５～１４ｈのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１６は、ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル及び第２の質量スペクトルが、データベース又はスペクトルライブラリの情報と比較することによって分析される、実施形態１～１５のいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１６ａは、ＥＴＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルが分析される、実施形態１６に記載の方法である。
実施形態１６ｂは、ＥＣＤ質量スペクトル及び第２の質量スペクトルが分析される、実施形態１６に記載の方法である。
実施形態１６ｃは、第２の質量スペクトルが、ＣＩＤ質量スペクトルである、実施形態１６～１６ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１６ｄは、第２の質量スペクトルが、ＨＣＤ質量スペクトルである、実施形態１６～１６ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１６ｅは、第２の質量スペクトルが、ＵＶＰＤ質量スペクトルである、実施形態１６～１６ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１７は、方法が、クリップ部位の偽陽性同定を排除する、実施形態５～１６ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１７ａは、偽陽性同定が、非標識ポリペプチド又はペプチドによって引き起こされる、実施形態１７に記載の方法である。
実施形態１７ｂは、偽陽性同定が、リジン残基での標識によって引き起こされる、実施形態１７に記載の方法である。
実施形態１７ｃは、偽陽性同定が、チロシン残基での標識によって引き起こされる、実施形態１７に記載の方法である。
実施形態１８は、タンパク質上のクリップ部位を同定する方法であって、方法は、
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識し、それによって１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）任意選択で、混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）ステップｉｖ）からの溶出液、又はステップｉｉｉ）からの混合物を電子移動解離（ＥＴＤ）タンデム質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおけるＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することと、
（ｖｉｉ）ＴＭＰＰレポーターイオンの検出又は分離時に、ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々を、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてそれぞれＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＰＶＤ質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル及びＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＰＶＤ質量スペクトルを分析することによって、タンパク質上のクリップ部位を同定することと
を含む。
（ｉ）タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識し、それによって１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）任意選択で、混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）ステップｉｖ）からの溶出液、又はステップｉｉｉ）からの混合物を電子移動解離（ＥＴＤ）タンデム質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおけるＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することと、
（ｖｉｉ）ＴＭＰＰレポーターイオンの検出又は分離時に、ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々を、衝突誘発解離（ＣＩＤ）質量分析又は高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析に供し、それによってＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてそれぞれＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＰＶＤ質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル及びＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＰＶＤ質量スペクトルを分析することによって、タンパク質上のクリップ部位を同定することと
を含む。
実施形態１９は、タンパク質が、酵素、抗体（例えば、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体）、又はその抗原結合断片、生体分子抗原、融合タンパク質、融合ペプチド、足場タンパク質若しくはペプチド、タンパク質若しくはペプチド薬物コンジュゲート、又は治療若しくは診断様式として有用な任意の他のポリペプチド若しくはペプチドである、実施形態１８に記載の方法である。
実施形態１９ａは、タンパク質が、治療用タンパク質である、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態１９ｂは、タンパク質が、非治療用タンパク質である、実施形態１９に記載の方法である。
実施形態１９ｃは、タンパク質のクリップポリペプチドが、１つ又は複数のクリップ部位を有する、実施形態１８～１９ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１９ｄは、ＥＴＤが方法で使用される、実施形態１８～１９ｃのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１９ｅは、ＥＣＤが方法で使用される、実施形態１８～１９ｄのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態１９ｆは、ＴＭＰＰ標識の効率が、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又はそれらの間の任意の数である、実施形態１８～１９ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２０は、ＬＣが、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）又は超高速液体クロマトグラム（ＵＰＬＣ）、好ましくはＨＰＬＣである、実施形態１８～１９ｆのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２０ａは、ＴＭＰＰ標識ペプチドが、対応する非標識ペプチドと比較して逆相勾配で後に溶出する、実施形態２０に記載の方法である。
実施形態２０ｂは、ステップｉｉｉ）からの混合物が、電子移動解離（ＥＴＤ）を含むタンデム質量分析に供される、実施形態１８～１９ｂのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２０ｃは、混合物が、直接注入又はフロー注入を介してＥＴＤを含むタンデム質量分析に供される、実施形態２０ｂに記載の方法である。
実施形態２０ｄは、ステップｉｉｉ）からの混合物が、電子捕捉解離（ＥＣＤ）を含むタンデム質量分析に供される、実施形態１８～１９ａのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２０ｅは、混合物が、直接注入又はフロー注入を介してＥＣＤを含むタンデム質量分析に供される、実施形態２０ｃに記載の方法である。
実施形態２１は、ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態１８～２０ｃのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２１ａは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２１に記載の方法である。
実施形態２１ｂは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、５３３．１９３５の正確な質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２１ａに記載の方法である。
実施形態２１ｃは、ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおいて第２のＴＭＰＰレポーターイオンを検出することを更に含み、第２のＴＭＰＰレポーターイオンが、約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２１ａ又は２１ｂに記載の方法である。
実施形態２１ｄは、第２のＴＭＰＰレポーターイオンが、５９０．２１５０の正確な質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２１ｃに記載の方法である。
実施形態２１ｅは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５７３Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２１ａ～２１ｄのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２１ｆは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、５７３．１８８４の正確な質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２１ｅに記載の方法である。
実施形態２１ｇは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、電荷損失から生成される、実施形態２１～２１ｆのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２１ｈは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトルにおいて優勢なプロダクトイオンである、実施形態２１～２１ｇのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２１ｉは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、２価ペプチドから生成される、実施形態２１～２１ｈのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２１ｊは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＴＭＰＰ＋である、実施形態２１に記載の方法である。
実施形態２１ｋは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋である、実施形態２１に記載の方法である。
実施形態２１ｌは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＴＭＰＰ－Ａｃ＋である、実施形態２１に記載の方法である。
実施形態２２は、ＴＭＰＰレポーターイオンが、ＣＩＤタンデム質量分析（ＣＩＤ－ＭＳ２）をもたらす衝突誘起解離（ＣＩＤ）質量分析、又はＨＣＤタンデム質量分析（ＨＣＤ－ＭＳ２）をもたらす高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）質量分析、又はＵＶＰＤタンデム質量分析（ＵＶＰＤ－ＭＳ２）をもたらす紫外線光解離（ＵＶＰＤ）質量分析をトリガする、実施形態１８～２１ｌのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２２ａは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、強度及びｍ／ｚを介して、ＣＩＤ－ＭＳ２をもたらすＣＩＤ質量分析、又はＨＣＤ－ＭＳ２をもたらすＨＣＤ質量分析、又はＵＶＰＤ－ＭＳ２をもたらすＵＶＰＤ質量分析をトリガする、実施形態２２に記載の方法である。
実施形態２２ｂは、フィルタ（質量許容差）を使用して、第２の質量分析をトリガする、実施形態２２又は２２ａに記載の方法である。
実施形態２２ｃは、フィルタが、１ｐｐｍ、２ｐｐｍ、３ｐｐｍ、４ｐｐｍ、５ｐｐｍ、６ｐｐｍ、７ｐｐｍ、８ｐｐｍ、９ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１１ｐｐｍ、１２ｐｐｍ、１３ｐｐｍ、１４ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、１６ｐｐｍ、１７ｐｐｍ、１８ｐｐｍ、１９ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、又はそれらの間の任意の数、好ましくは５ｐｐｍの質量許容差などの、トリガのための１～２０ｐｐｍの範囲の質量許容差で、５３３．１９３５又は５９０．２１５０Ｄａの正確な質量のベースピークに設定される、実施形態２２ｂに記載の方法である。
実施形態２２ｄは、レポーターイオンの強度が、第２の質量分析をトリガするための閾値として使用される、実施形態２２又は２２ａに記載の方法である。
実施形態２２ｅは、強度が、ベースピークの強度の１０％以上に設定されている、実施形態２２ｄに記載の方法である。
実施形態２３は、方法がハイスループットである、実施形態１８～２２ｅのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２４は、ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル及びＣＩＤ質量スペクトルが、データベース又はスペクトルライブラリの情報と比較することによって分析される、実施形態１８～２３のいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２４ａは、ＥＴＤ又はＥＣＤ又は他の電子誘導解離質量スペクトル及びＨＣＤ質量スペクトルが、データベース又はスペクトルライブラリの情報と比較することによって分析される、実施形態１８～２３のいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２５は、方法が、クリップ部位の偽陽性同定を排除する、実施形態１８～２４ａのいずれか一項に記載の方法である。
実施形態２５ａは、偽陽性同定が、非標識ポリペプチド又はペプチドによって引き起こされる、実施形態２５に記載の方法である。
実施形態２５ｂは、偽陽性同定が、リジン残基での標識によって引き起こされる、実施形態２５に記載の方法である。
実施形態２５ｃは、偽陽性同定が、チロシン残基での標識によって引き起こされる、実施形態２５に記載の方法である。
実施形態２６は、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するか、又は試料中のポリペプチドを特性決定するためのシステムである。
実施形態２６ａは、システムが、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）装置及びタンデム質量分析計を含む、実施形態２６に記載のシステムである。
実施形態２６ｂは、タンデム質量分析計が、
（ｉ）第１のイオン化装置と、
（ｉｉ）第１の範囲内の質量電荷比を有するイオンを透過するために、第１の動作モードで配置及び適合された第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器と、
（ｉｉｉ）第１のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｉｖ）動作モードでイオンを減衰させるための減衰手段と、
（ｖ）第１の範囲内の質量電荷比を有するが、１つ又は複数の望ましくない第１の電荷状態を有するイオンが実質的に減衰されるように、減衰手段の動作を制御するように構成された制御装置と、
（ｖｉ）第２のイオン化装置と、
（ｖｉｉ）第２のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｖｉｉｉ）フラグメントイオンの非混合信号を取得し、トリガイオンを非冗長的にコード化するように構成されたデータシステムであって、非冗長的なコード化が、任意の個々のゲート時間の複数回の反復において異なる親種からの任意の２つのイオン信号の反復的な重複を回避又は最小化するように配置されている、データシステムとを含む、実施形態２６又は２６ａに記載のシステムである。
（ｉ）第１のイオン化装置と、
（ｉｉ）第１の範囲内の質量電荷比を有するイオンを透過するために、第１の動作モードで配置及び適合された第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器と、
（ｉｉｉ）第１のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｉｖ）動作モードでイオンを減衰させるための減衰手段と、
（ｖ）第１の範囲内の質量電荷比を有するが、１つ又は複数の望ましくない第１の電荷状態を有するイオンが実質的に減衰されるように、減衰手段の動作を制御するように構成された制御装置と、
（ｖｉ）第２のイオン化装置と、
（ｖｉｉ）第２のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｖｉｉｉ）フラグメントイオンの非混合信号を取得し、トリガイオンを非冗長的にコード化するように構成されたデータシステムであって、非冗長的なコード化が、任意の個々のゲート時間の複数回の反復において異なる親種からの任意の２つのイオン信号の反復的な重複を回避又は最小化するように配置されている、データシステムとを含む、実施形態２６又は２６ａに記載のシステムである。
実施形態２７は、ＬＣ装置が高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）装置である、実施形態２６～２６ｂのいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態２８は、試料が、溶出液を生成するためにＬＣ装置に供される、実施形態２６～２７のいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態２８ａは、溶出液がタンデム質量分析に供されて、第１の質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを得る、実施形態２８に記載のシステムである。
実施形態２９は、ポリペプチド上のクリップ部位又はポリペプチドが、Ｎ末端標識試薬で標識されている、実施形態２６～２８のいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態２９ａは、Ｎ末端標識試薬が、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）である、実施形態２９に記載のシステムである。
実施形態２９ｂは、第１のイオン化装置が、ＴＭＰＰレポーターイオンを生成する、実施形態２９ａに記載のシステムである。
実施形態２９ｃは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態２９ｂに記載のシステムである。
実施形態２９ｄは、ＴＭＰＰレポーターイオンが、第２の質量分析をトリガする、実施形態２９ａ～２９ｃのいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３０は、第１のイオン化装置が、電子誘導解離装置である、実施形態２６～２９のいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３０ａは、電子誘導解離装置が、電子移動解離（ＥＴＤ）装置又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）装置である、実施形態３０に記載のシステムである。
実施形態３０ｂは、第１の質量スペクトルが、ＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルである、実施形態３０ａに記載のシステムである。
実施形態３１は、第２のイオン化装置が、衝突誘発解離（ＣＩＤ）装置、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）装置、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）装置である、実施形態２６～３０のいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３１ａは、第２の質量スペクトルが、ＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルを含む、実施形態３１に記載のシステムである。
実施形態３２は、第１の質量スペクトル及び第２の質量スペクトルが、データベース又はスペクトルライブラリ内の情報と比較することによって分析される、実施形態３０ｂ又は３１ａに記載のシステムである。
実施形態３３は、質量分析計が、衝突装置、断片化装置、又は反応装置を更に含む、実施形態２６～３２のいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３４は、減衰手段が、イオンゲート又はイオンバリアを含む、実施形態２６～３３のいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３４ａは、減衰手段が、イオン移動度分光計又は分離器の下流に配置されている、実施形態２６～３４のいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３５は、第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器が、第１の動作モードで配置及び適合されて、第１の範囲外の質量電荷比を有するイオンを減衰させる、実施形態２６～３４ａのいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３５ａは、第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器が、当該イオン移動度分光計又は分離器の上流又は下流に配置されている、実施形態２６～３５のいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３６は、第１の望ましくない電荷状態が、以下の（ｉ）１価、（ｉｉ）２価、（ｉｉｉ）３価、（ｉｖ）４価、（ｖ）５価、及び（ｖｉ）多価のうちの１つ又は複数から選択される、実施形態２６～３５ａのいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３７は、質量分析計が、当該イオン移動度分光計又は分離器の上流に配置されたイオンガイド、イオントラップ、又はイオントラップ領域を更に含み、当該イオンガイド、イオントラップ、又はイオントラップ領域が、イオンをトラップ、貯蔵、又は蓄積し、次いで当該イオン移動度分光計又は分離器内に、若しくは当該イオン移動度分光計又は分離器に向かってイオンを定期的にパルス化するように配置されている、実施形態２６～３６のいずれか一項に記載のシステムである。
実施形態３８は、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するためのレポーターイオン、及び／又はポリペプチドを特性決定するためのレポーターイオンである。
実施形態３８ａは、クリップ部位がＮ末端標識試薬で標識されている、実施形態３８に記載のレポーターイオンである。
実施形態３８ｂは、ポリペプチドがＮ末端標識試薬で標識されている、実施形態３８に記載のレポーターイオンである。
実施形態３８ｃは、Ｎ末端標識試薬がイオン化されて、レポーターイオンを生成する、実施形態３８ａ又は３８ｂに記載のレポーターイオンである。
実施形態３８ｄは、Ｎ末端標識試薬が、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）である、実施形態３８ａ又は３８ｂに記載のレポーターイオンである。
実施形態３８ｅは、ＴＭＰＰがイオン化されて、レポーターイオンを生成する、実施形態３８ｄに記載のレポーターイオンである。
実施形態３９は、Ｎ末端標識試薬が、質量分析計によってイオン化されて、レポーターイオンを生成する、実施形態３８ａ～３８ｃのいずれか一項に記載のレポーターイオンである。
実施形態３９ａは、Ｎ末端標識試薬が、質量分析技術によってイオン化されて、レポーターイオンを生成する、実施形態３８ａ～３８ｃのいずれか一項に記載のレポーターイオンである。
実施形態４０は、ＴＭＰＰが、質量分析計によってイオン化されて、レポーターイオンを生成する、実施形態３８ｄ又は３８ｅに記載のレポーターイオンである。
実施形態４０ａは、ＴＭＰＰが、質量分析技術によってイオン化されて、レポーターイオンを生成する、実施形態３８ｄ又は３８ｅに記載のレポーターイオンである。
実施形態４１は、質量分析計がタンデム質量分析計である、実施形態３９又は４０に記載のレポーターイオンである。
実施形態４１ａは、タンデム質量分析計が、電子移動解離（ＥＴＤ）装置、電子捕捉解離（ＥＣＤ）装置、衝突誘発解離（ＣＩＤ）装置、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）装置、紫外線光解離（ＵＶＰＤ）装置、又はそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態４１に記載のレポーターイオンである。
実施形態４２は、質量分析技術がタンデム質量分析技術である、実施形態３９ａ又は４０ａに記載のレポーターイオンである。
実施形態４２ａは、タンデム質量分析技術が、本明細書に記載の任意のタンデム質量分析技術である、実施形態４２に記載のレポーターイオンである。例えば、いくつかの実施形態では、タンデム質量分析技術は、電子移動解離（ＥＴＤ）、電子捕捉解離（ＥＣＤ）、衝突誘発解離（ＣＩＤ）、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、紫外線光解離（ＵＶＰＤ）、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
実施形態４２ｂは、レポーターイオンが、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、実施形態４２ａに記載のレポーターイオンである。
実施形態４２ｃは、レポーターイオンが、
実施形態４３は、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するための組成物であり、組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つのレポーターイオン及びポリペプチドを含む。
実施形態４４は、ポリペプチドを特性決定するための組成物であり、組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つのレポーターイオン及びポリペプチドを含む。
実施形態４５は、試料中のポリペプチド上のクリップ部位を同定するためのキットであり、キットは、ポリペプチド上のクリップ部位を同定するためのレポーターイオンを含む。
実施形態４５ａは、クリップ部位が、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識されている、実施形態４５に記載のキットである。
実施形態４５ｂは、ＴＭＰＰがイオン化されて、レポーターイオンを生成する、実施形態４５ａに記載のキットである。
実施形態４６は、試料中のポリペプチドを特性決定するためのキットであり、キットは、ポリペプチドを特性決定するためのレポーターイオンを含む。
実施形態４６ａは、ポリペプチドが、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識されている、実施形態４６に記載のキットである。
実施形態４６ｂは、ＴＭＰＰがイオン化されて、レポーターイオンを生成する、実施形態４６ａに記載のキットである。
以下の実施例は、本発明の本質を更に説明するためのものである。以下の実施例は本発明を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定められる点を理解されたい。
実験実施例
本発明を、以下の実験実施例を参照して更に詳細に説明する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、特に明記しない限り、限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含すると解釈されるべきである。
本発明を、以下の実験実施例を参照して更に詳細に説明する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、特に明記しない限り、限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含すると解釈されるべきである。
更なる説明を行わずとも、当業者であれば、上記の説明及び以下の例示的な実施例を使用することで、本発明の化合物を作製及び利用し、特許請求される方法を実施することが可能であるものと考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘するものであって、本開示の残りの記載をいかなる意味においても限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１：Ｎ末端のＴＭＰＰ標識及び電子移動解離（ＥＴＤ）による診断用イオンの検出
ＮＩＳＴ抗体標準をＴＭＰＰで標識することによるＴＭＰＰレポーターイオンの診断的有用性及びデータ依存的ＥＴＤ－ＭＳ／ＭＳによるトリプシンペプチドマッピングを調べた。ＮＩＳＴ抗体は、軽鎖及び重鎖からの成熟Ｎ末端を有していた。２つの代理ペプチドのうちの１つは、遊離第１級アミンを有するＮＩＳＴ抗体軽鎖のＮ末端に対応し、重鎖のＮ末端ＮＩＳＴ抗体は、グルタミンの環化により第２級アミンからなり、Ｎ末端のピログルタミン酸残基を形成した。ＮＩＳＴ抗体上の任意のネオＮ末端は、保存中の分子の潜在的な分解産物又はクリッピング産物であった。
ＮＩＳＴ抗体標準をＴＭＰＰで標識することによるＴＭＰＰレポーターイオンの診断的有用性及びデータ依存的ＥＴＤ－ＭＳ／ＭＳによるトリプシンペプチドマッピングを調べた。ＮＩＳＴ抗体は、軽鎖及び重鎖からの成熟Ｎ末端を有していた。２つの代理ペプチドのうちの１つは、遊離第１級アミンを有するＮＩＳＴ抗体軽鎖のＮ末端に対応し、重鎖のＮ末端ＮＩＳＴ抗体は、グルタミンの環化により第２級アミンからなり、Ｎ末端のピログルタミン酸残基を形成した。ＮＩＳＴ抗体上の任意のネオＮ末端は、保存中の分子の潜在的な分解産物又はクリッピング産物であった。
図１は、ＮＩＳＴ抗体の軽鎖Ｎ末端配列に対応するペプチドのＥＴＤプロダクトイオンスペクトルを示す。質量スペクトルは、主に診断用ＴＭＰＰレポーターイオン（ｍ／ｚ＝５３３Ｄａ）及びＮ末端ＴＭＰＰタグからなるｃ型骨格プロダクトイオンからなっていた。このペプチド配列が、おそらくＣ末端アルギニン残基上の電荷隔離に起因して、ＥＴＤ中にはるかに低い程度でレポーターイオンを生成したより大きなトリプシンペプチドのインソース断片化に起因して生成されたことに注目することは興味深い（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００７，１２９：１２２３２－１２２４３）。それにもかかわらず、採用されたアプローチには、優勢なレポーターイオンピークを生成するための電子移動解離、高配列カバレッジを使用したＮ末端上のＴＭＰＰタグの局在化、及びＮＩＳＴ軽鎖の成熟Ｎ末端の存在を確認するための相補的活性化イベントのレポーターイオントリガが含まれた。ＮＩＳＴ抗体の分解に起因する更なる低レベルのクリップされた種が存在しないことはまた、データセット全体に５３３及び５９０の診断用レポーターイオンを有するＥＴＤ－ＭＳ／ＭＳスペクトルを試験及びフィルタリングすることによって確認された。５３３及び５９０Ｄａでのレポーターイオンの構造については、図２Ａ～図２Ｂを参照されたい。
トリガされたＣＩＤアプローチは、データセット全体のＥＴＤ－ＭＳ／ＭＳイベントから生成されたレポーターイオンの存在を確認したトリガＭＳ２スキャンの発生が少ないため、データのフィルタリングを手動検査に適したものにした。これにより、レポーターイオンピークを有するＥＴＤ－ＭＳ／ＭＳスキャンのｉｎ－ｓｌｉｃｏアプローチ又は手動検査の必要性を排除した。
実施例２：ＴＭＰＰ標識ペプチドの迅速な分離及び保持時間の予測性
次に、ＴＭＰＰ標識ペプチドのハイスループット検出のための急速な分離条件を評価した。ペプチドの完全な逆相分離、クリーンアップ、及び再平衡化を、２０分の総実行時間で達成した。図３は、逆相クロマトグラフィ緩衝液勾配及びＴＭＰＰ標識後のＮＩＳＴ消化物の対応する総イオンクロマトグラムを示す。ほとんどの非標識ペプチドは、１０分間の長さの浅い勾配で２～３０％有機物で溶出したことに留意することが重要であった。代理ペプチドは、１２分で溶出したＮＩＳＴ抗体軽鎖のＮ末端に対応していた。ＴＭＰＰ標識は、Ｎ末端ペプチドの疎水性を増加させ、ＴＭＰＰ標識ペプチドは、急速な傾斜を有する２つの急な勾配：１分で有機溶媒２～８５％の間にほとんど観察されたと考えられた。ＴＭＰＰ標識ペプチドを分離し、保持時間予測可能性を改善する能力は、ペプチドの特異性を更に改善し、偽陽性同定を減少させた。
次に、ＴＭＰＰ標識ペプチドのハイスループット検出のための急速な分離条件を評価した。ペプチドの完全な逆相分離、クリーンアップ、及び再平衡化を、２０分の総実行時間で達成した。図３は、逆相クロマトグラフィ緩衝液勾配及びＴＭＰＰ標識後のＮＩＳＴ消化物の対応する総イオンクロマトグラムを示す。ほとんどの非標識ペプチドは、１０分間の長さの浅い勾配で２～３０％有機物で溶出したことに留意することが重要であった。代理ペプチドは、１２分で溶出したＮＩＳＴ抗体軽鎖のＮ末端に対応していた。ＴＭＰＰ標識は、Ｎ末端ペプチドの疎水性を増加させ、ＴＭＰＰ標識ペプチドは、急速な傾斜を有する２つの急な勾配：１分で有機溶媒２～８５％の間にほとんど観察されたと考えられた。ＴＭＰＰ標識ペプチドを分離し、保持時間予測可能性を改善する能力は、ペプチドの特異性を更に改善し、偽陽性同定を減少させた。
３．５分での対応する非標識ＮＩＳＴ ｍＡｂ Ｎ末端ペプチド対応物も観察されたことに留意することも重要であった。複数のクリップされた種を有する複雑な試料は、（標識効率が１００％未満であるため）ＴＭＰＰ標識及び非標識ペプチド対応物の両方からなり、これらの非標識ペプチドは、勾配中で早期に溶出し、通常は強度が低く、場合によっては標識ペプチドと比較してＬＯＤ未満であったと考えられた。
次いで、非標識ペプチドを観察する可能性を評価し、ＮＩＳＴ配列から１５種の合成ペプチド標準を誘導体化することによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドの保持時間予測可能性を評価した。これらのペプチド混合物の２０分間のＨＰＬＣ勾配注入を、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドの保持時間及び強度を記録することによって監視した。ＴＭＰＰ標識の反応効率を、そのペプチドについて観察された総強度に対して正規化されたＴＭＰＰ標識ペプチドのピーク面積比を得ることによって評価した。分析では、１５個のＴＭＰＰペプチドが１２～１４分の間に溶出し、これらのペプチドの標識効率は８～１００％の範囲であり、１５個のペプチドのうち８個が１００％の効率で反応した。様々な反応効率にもかかわらず、全てのＴＭＰＰ標識ペプチドがＭＳ／ＭＳによって同定されたことは注目に値するものであった。非標識ペプチド対応物は、４～１２分のはるかに広い保持時間ウィンドウで溶出した。反応効率が高いため、１５個の非標識ペプチドのうち７個のみがＭＳ／ＭＳによって同定されたが、残りの８個の非標識ペプチドは、ＭＳ１で検出されたが、ＬＯＤが低いため、ＭＳ２－ＥＴＤをトリガしなかった。ペプチドの標識化は、改善された同定及び保持時間の予測可能性を可能にした。全体的な勾配のＬＣ実行時間は、より複雑でない試料についてのクリップ部位の迅速な同定のために短縮することができるか、又はより複雑な混合物について延長することができる。
実施例３：ＴＭＰＰ標識合成ペプチド標準の診断用イオン
ＮＩＳＴ ｍＡｂに対応するいくつかの合成ペプチド標準をＴＭＰＰ標識で誘導体化し、ＥＴＤ－ＭＳ２及び診断用レポーターイオントリガされたＭＳ２ ＣＩＤイベントを使用してＬＣ－ＭＳに供した。次いで、ＥＴＤスペクトルにおいて診断用ＴＭＰＰレポーターイオン（ｍ／ｚ＝５３３Ｄａ、５９０Ｄａ）を生成する傾向を、異なる長さ、アミノ酸組成、及びＴＭＰＰ標識化のための部位を有するこれらの合成ペプチド標準を使用して評価した。表１は、ほとんどのペプチドが、ＴＭＰＰレポーターイオンを検出すると、その後のＭＳ２－ＣＩＤスキャンをトリガしたことを示す。トリガされたスキャンは、レポーターイオン強度、すなわちＴＭＰＰ＋５３３ｍ／ｚに対する依存性を示した。ＮＩＳＴペプチドのＥＴＤスペクトルのいくつかの効率推定値が、ペプチド骨格結合の断片化について以前に報告された％効率計算に基づいて、ＴＭＰＰ誘導体化ペプチドについてのＴＭＰＰ＋及びＴＭＰＰ－Ａｃ＋レポーターイオンについて導出されている（Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００５，１２７：１２６２７－１２６３９）。これら２つのレポーターイオンのＥＴＤ効率推定値の計算については、図２Ｄを参照されたい。
ＮＩＳＴ ｍＡｂに対応するいくつかの合成ペプチド標準をＴＭＰＰ標識で誘導体化し、ＥＴＤ－ＭＳ２及び診断用レポーターイオントリガされたＭＳ２ ＣＩＤイベントを使用してＬＣ－ＭＳに供した。次いで、ＥＴＤスペクトルにおいて診断用ＴＭＰＰレポーターイオン（ｍ／ｚ＝５３３Ｄａ、５９０Ｄａ）を生成する傾向を、異なる長さ、アミノ酸組成、及びＴＭＰＰ標識化のための部位を有するこれらの合成ペプチド標準を使用して評価した。表１は、ほとんどのペプチドが、ＴＭＰＰレポーターイオンを検出すると、その後のＭＳ２－ＣＩＤスキャンをトリガしたことを示す。トリガされたスキャンは、レポーターイオン強度、すなわちＴＭＰＰ＋５３３ｍ／ｚに対する依存性を示した。ＮＩＳＴペプチドのＥＴＤスペクトルのいくつかの効率推定値が、ペプチド骨格結合の断片化について以前に報告された％効率計算に基づいて、ＴＭＰＰ誘導体化ペプチドについてのＴＭＰＰ＋及びＴＭＰＰ－Ａｃ＋レポーターイオンについて導出されている（Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００５，１２７：１２６２７－１２６３９）。これら２つのレポーターイオンのＥＴＤ効率推定値の計算については、図２Ｄを参照されたい。
合成ＮＩＳＴペプチドから、レポーターイオン存在量の差のために、ＴＭＰＰ＋効率がＴＭＰＰ－Ａｃ＋よりも有意に大きいことが観察された。レポーターイオン強度が、特にＴＭＰＰ＋レポーターイオンの寄与から、骨格結合の全体的なＥＴＤ効率に有意に寄与したことにも注目することは興味深いものであった。
関連するＥＴＤ－ＭＳ２及びＴＭＰＰ＋トリガされたＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルについては図４Ａ～図４Ｚを参照されたい。
また、後続の質量トリガされたＭＳ２スキャンを生成する忠実度は、後続のスキャンの決定がレポーターイオンの全体的な強度及びプリーカーサイオンのＡＧＣ設定に対して行われたデータ依存基準によって影響を受ける可能性が高いことにも留意されたい（Ｂｏｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，８：１０３９９）。例えば、Ｎ末端で標識された両ペプチドＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７）及びＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）は、より低い強度のＴＭＰＰ＋診断用イオンを生成した。しかし、質量トリガは、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１７、図４Ｉ）についてのみ観察され、一方、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）ペプチドはＭＳ２トリガを欠く（図４Ｌ）。その後のＭＳ１強度を調べたところ、ペプチドＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６）がＭＳ／ＭＳの閾値を下回った。誘導体化ペプチドの配列組成に基づくいくつかの興味深い解離挙動も観察された。単一残基伸長又はＴＭＰＰ標識の位置は、荷電種としてのＴＭＰＰ＋の気相解離に有意な効果を示した。例えば、ＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２６、図４Ｙ）ペプチドのＮ末端及びリジン側鎖の両方で誘導体化されたＴＭＰＰは、ＥＴＤ及びトリガされたＭＳ２－ＣＩＤスペクトルの際に優勢なレポーターイオンを生成した。Ｎ末端にＴＭＰＰを有するＣ末端にグルタミン酸残基が付加されたペプチドＶＶＳＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥ（配列番号２５、図４Ｗ）もまた、豊富な診断用レポーターイオン及びトリガされたＭＳ２－ＣＩＤスペクトルを生成することが観察された。いかなる特定の理論にも拘束されないが、ＥＴＤを介してレポーターイオンを生成する傾向は、ＴＭＰＰ標識の位置、アミノ酸組成、及びペプチドの電荷状態などの多数の異なる因子に依存する可能性が高いと仮定された。合成ペプチドデータは、ＴＭＰＰ標識が大部分Ｎ末端で起こり、チロシン残基及びリジン残基の誘導体化はより少ない程度で起こることを示唆した（すなわち、１５個のＮ末端のうち１４個、６個のうち１個はチロシン残基を有し、１０個のリジン残基のうち１個はＴＭＰＰ標識されていた）。
無傷のタンパク質の極性残基の溶媒アクセス可能性は、以前に報告されたように、リジン残基及びチロシン残基の望ましくない標識をもたらす可能性があることが予想された（Ａｂｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，６：４７７０－４７７６）。しかし、トリガされたＭＳ２アプローチは、ＴＭＰＰ修飾上での局在化を効果的に促進し、クリップ部位の明確な決定に役立った。ＴＭＰＰ標識リジン含有ペプチドは、ＥＴＤ－ＭＳ２によって排他的にＮ末端に明確に局在化したが、診断用イオントリガＣＩＤ－ＭＳ２データは、ＥＴＤスペクトルを補完し、信頼できる局在化を改善した。
ほとんどのＴＭＰＰ標識チロシン含有ペプチドは、信頼できる局在化を改善するイオントリガされたＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを有するＥＴＤ－ＭＳ２を使用して局在化された。しかし、配列イオンがＴＭＰＰ修飾部位の局在化に不十分であった場合、ＥＴＤ－ＭＳ２単独では情報価値がない可能性がある。図４Ｄは、検索エンジンが誤ってＮ末端にＴＭＰＰ修飾を割り当てた単一のＴＭＰＰ標識ペプチドＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号１３）の注釈付きＥＴＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。しかし、ｃ型及びｚ型のＥＴＤイオンに基づいて、ＴＭＰＰ部分は、チロシンのＮ末端又は側鎖誘導体のいずれかに明確に割り当てることができない。その後のトリガされたＭＳ２－ＣＩＤスキャンの有用性は、チロシン残基上にＴＭＰＰを明確に局在させる確信的なｙ１６イオンを生成した。図４Ｐは、骨格配列イオンを有さない診断用イオンのみを生成した単一のＴＭＰＰ標識ペプチドＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号２２）のＥＴＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。配列の同定は、ＭＳ１スペクトルのプリーカーサイオンのｍ／ｚに基づいており、レポーターイオンは、ペプチドがＴＭＰＰ部分を有する可能性が高いことを示した。トリガされたＭＳ２－ＣＩＤスペクトルは、Ｎ末端にＴＭＰＰを局在化させるＴＭＰＰ部分を有するｂ１～ｂ４イオンと共に、ＴＭＰＰ修飾を欠くいくつかの骨格イオン：ｙ７、ｙ８及びｙ１０を生成した。全てのＭＳ２－ＣＩＤスペクトルを調べた後、わずかなスペクトルのみが、限定された診断的有用性を有する５７３で診断用イオンを示したことに留意することが重要であった。
ＥＴＤ－ＭＳ２及びトリガされたＣＩＤ－ＭＳ２がこれらの実験においてどのように使用されたかの相補的性質は、ＴＭＰＰ部分を含有する代理タンパク質分解ペプチドのアミノ酸配列にかかわらず、潜在的なクリップされた種を迅速にスクリーニングするのに役立った。本明細書に記載のタンデムＭＳアプローチは、様々な長さ及び電荷状態を有するペプチドのＥＴＤ－ＭＳ２に適しており、ペプチドが二重に荷電したジペプチドと同じくらい小さい場合にも有効であった。ＴＭＰＰ部分の優勢な診断用インモニウムイオンを生成する能力は、その後のＣＩＤスキャンをトリガするためのＥＴＤ－ＭＳ２生成レポーターイオンにとって重要であった。ＥＴＤ－ＭＳ２は、ＴＭＰＰ診断用イオンを極めて一貫して生成することを示したが、ＥＴＤ及びＣＩＤ骨格の両方のフラグメントイオンは、ＴＭＰＰ修飾を単一の残基に局在化させた。
実施例４：細胞溶解物に由来するＴＭＰＰ標識合成物の診断用イオン
次に、Ｋ５６２細胞溶解物に由来するトリプシンペプチド及びそれらのＴＭＰＰ誘導体の大きなプールについてレポーターイオンを生成する効率を調べることによって、ＥＴＤ及びＨＣＤ型断片化を使用して生成されたＴＭＰＰ＋レポーターイオンの診断的有用性を調べた。ペプチドの複雑性は、全体的なＬＣ分離時間の変化を必要とし、したがって、ペプチドを２回のシングルショットの６倍長い実行時間（１２０分）に供し、ＥＴＤ－ＭＳ２及びＨＣＤ－ＭＳ２の解離を各実行について別々に行った。図５Ａは、ＡｃＣＮ勾配でオーバーレイされた、観察された保持時間の関数としてのペプチド強度を示す。非標識ペプチドは、予想通り約３０％ＡｃＣＮまで溶出したが、ＴＭＰＰ標識ペプチドは、より短い勾配の実行のように２つの急速な有機傾斜（０～８５％ＡｃＣＮ）に隣接して溶出した。より高い全体強度分布を有するＴＭＰＰ標識合成標準ペプチドの観察は、ペプチドの疎水性の増加及びＴＭＰＰ標識ペプチドのイオン化の改善を示した。図５Ｂは、対応する非標識ペプチドを有するＴＭＰＰ標識ペプチドのサブセットの観察された時間分布を示す。次に、標識ペプチド及び対応する非標識ペプチドとの間の観察された時間差（デルタ時間）を、ＡｃＣＮ勾配でオーバーレイされた観察された保持時間の関数として示した。ＴＭＰＰ標識配列は、大きな正の値によって示されるように、ほぼ全てのペプチドについて後に溶出した。ＴＭＰＰ標識ペプチドの密度は、勾配の２つの急速なＡｃＣＮ傾斜での高い保持時間及び高いデルタ時間で見られた。
次に、Ｋ５６２細胞溶解物に由来するトリプシンペプチド及びそれらのＴＭＰＰ誘導体の大きなプールについてレポーターイオンを生成する効率を調べることによって、ＥＴＤ及びＨＣＤ型断片化を使用して生成されたＴＭＰＰ＋レポーターイオンの診断的有用性を調べた。ペプチドの複雑性は、全体的なＬＣ分離時間の変化を必要とし、したがって、ペプチドを２回のシングルショットの６倍長い実行時間（１２０分）に供し、ＥＴＤ－ＭＳ２及びＨＣＤ－ＭＳ２の解離を各実行について別々に行った。図５Ａは、ＡｃＣＮ勾配でオーバーレイされた、観察された保持時間の関数としてのペプチド強度を示す。非標識ペプチドは、予想通り約３０％ＡｃＣＮまで溶出したが、ＴＭＰＰ標識ペプチドは、より短い勾配の実行のように２つの急速な有機傾斜（０～８５％ＡｃＣＮ）に隣接して溶出した。より高い全体強度分布を有するＴＭＰＰ標識合成標準ペプチドの観察は、ペプチドの疎水性の増加及びＴＭＰＰ標識ペプチドのイオン化の改善を示した。図５Ｂは、対応する非標識ペプチドを有するＴＭＰＰ標識ペプチドのサブセットの観察された時間分布を示す。次に、標識ペプチド及び対応する非標識ペプチドとの間の観察された時間差（デルタ時間）を、ＡｃＣＮ勾配でオーバーレイされた観察された保持時間の関数として示した。ＴＭＰＰ標識配列は、大きな正の値によって示されるように、ほぼ全てのペプチドについて後に溶出した。ＴＭＰＰ標識ペプチドの密度は、勾配の２つの急速なＡｃＣＮ傾斜での高い保持時間及び高いデルタ時間で見られた。
ＥＴＤスペクトルにおける診断用ＴＭＰＰレポーターイオン（ｍ／ｚ＝５３３Ｄａ、５９０Ｄａ）、及びＨＣＤスペクトルのＴＭＰＰレポーターｍ／ｚ５７３Ｄａを生成する傾向を、異なる長さ、アミノ酸組成、電荷状態、及びＴＭＰＰ標識部位を有するペプチドについて慎重に評価した。ＴＭＰＰ標識ペプチドごとに診断用イオンを生成する効率を、いくつかの異なる方法を用いて推定した。レポーターイオン強度を、両タイプのＥＴＤ由来レポーターイオンであるＴＭＰＰ＋及びＴＭＰＰ－ＡＣ－ＮＨ２
＋についての式１～式３（図２Ｄを参照されたい）の関係によって示されるように、様々なタイプのプロダクトイオン強度に対して正規化した。ほとんど全てのペプチドにおいて、ＴＭＰＰ＋レポーターイオン存在量は、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋より優勢であった（図６Ａ～図６Ｃ）。
更に、式４に示すような全ての骨格レポーター及びＣ、Ｚ型プロダクトイオン（Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００５，１２７：１２６２７－１２６３９）並びに式５に示すレポーターイオンを除く全ての骨格断片についての全体的なＥＴＤ効率の結果を調べた。式１のＥＴＤレポーターイオン推定と同様に、ＨＣＤ由来のレポーターイオンを式６に示すようにプロダクトイオンに対して正規化した（図２Ｅを参照されたい）。図５Ａ～図５Ｂに示すように、ＴＭＰＰ＋（５３３Ｄａ）効率を、前駆体の電荷状態によってグループ化されたペプチド前駆体質量又はペプチド長の関数として報告した。更に、ＴＭＰＰ＋レポーターイオンのＥＴＤ効率に対する電荷状態依存性に注目することが重要であった。ＴＭＰＰ＋効率は、２価プリーカーサイオンで最も高く、ペプチドの質量と共に直線的に減少することが観察された。また、ＴＭＰＰ＋効率は、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋（５９０Ｄａ）よりも有意に高かった。一般に、ＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成する傾向は、同様の質量又は同じ数のアミノ酸を有するペプチドの場合、３価プリーカーサイオンより２価プリーカーサイオンに有利であった。この観察は、これらの同じペプチドの骨格ｃ及びｚフラグメントイオンが、電荷状態の増加と共に効率の増加を示したので興味深いものであった（例えば、図７Ａ～図７Ｄ）。
次いで、全ての骨格フラグメントイオン及びレポーターイオンを除く全ての骨格フラグメントイオンを考慮して、ＴＭＰＰ標識ペプチドの全体的な骨格ＥＴＤ効率を評価した。図７Ａに示すように、全てのプロダクトイオンを考慮して、全体的なＥＴＤ効率は、わずかな電荷状態依存的減少を示した。対照的に、図７Ｂは、ＴＭＰＰ＋レポーターイオンを無視した式５によって推定される全体的な骨格効率について、ＥＴＤ効率が電荷状態依存的な増加を示したことを示し、これは、他の箇所で報告されているように非修飾ペプチドについて一般的に観察された。これら全ての観察結果を考慮すると、特に２価イオンについての全体的な効率推定値に対するＴＭＰＰ＋レポーターイオン強度の寄与は有意であった。ＥＴＤにより生成されたＴＭＰＰ＋イオンの診断的有用性は、ほとんどが２価であるトリプシンペプチドに完全に適していた。図７Ｃに示すように、ＨＣＤ由来ＴＭＰＰ－Ａｃ＋（５７３Ｄａ）効率は、前駆体の電荷状態によってグループ化されたペプチド前駆体質量の関数として報告された。全体として、ＨＣＤ生成ＴＭＰＰ－Ａｃ＋レポーターイオンの効率は、ＥＴＤ生成ＴＭＰＰ＋レポーターイオンと比較して有意に低かった。ほとんどのペプチドのＴＭＰＰ－Ａｃ＋レポーターイオンの効率は１％未満であり、有意な割合が診断用レポーターイオンを有さないか、又は効率がゼロであった。約３０％もの高さの極端な効率を示すいくつかのペプチドが存在した（６０％の効率に近い２つの異常値は、前駆体ｍ／ｚがレポーターイオンｍ／ｚと同じである偽陽性の割り当てであった）。ＴＭＰＰ－Ａｃ＋レポーターイオンのＨＣＤ効率に対する電荷状態依存性は観察されなかった。
次に、リジン残基及びチロシン残基へのＴＭＰＰのオフラベル化の可能性を調べた。チロシン残基で標識されたＴＭＰＰの１２個のＰＳＭを、配列マッチ（ＰＳＭ）に対する合計５２０個のチロシン含有ペプチドから同定した。これらの５２０個のチロシン含有ＰＳＭから、２６２個のＰＳＭはＴＭＰＰ誘導体化Ｎ末端を有し、残りの２４６個のＰＳＭは修飾されていなかった。リジン残基で標識されたＴＭＰＰのＰＳＭは、合計１４４１個のリジン含有ＰＳＭから同定されなかった。ＰＳＭを含有する１４４１個のリジンから、７７１個のＰＳＭはＴＭＰＰ誘導体化Ｎ末端を有し、１１個のＰＳＭはＴＭＰＰ誘導体化チロシンを有し、残りの６５９個のＰＳＭは修飾されていなかった。図８は、ＥＴＤ効率が、ペプチドあたりのチロシン残基及びリジン残基の数によってグループ化された標識ペプチドに影響を及ぼさないことを示す。これらのデータは、ペプチドのＴＭＰＰ標識が、記載された反応条件下で大部分がＮ末端にあり、更なる非標識リジン残基又はチロシン残基が診断用ＴＭＰＰ＋イオンに影響を及ぼさないことを示唆した。図９は、式７によって推定されたペプチドの反応又はＴＭＰＰ標識効率の全体的な分布を示す。ＥＴＤに供した誘導体化プリーカーサイオンは、誘導体化のレベルに影響を及ぼさなかった。言い換えれば、１００％で誘導体化されたペプチドは、１％で誘導体化された同じペプチドと同じＥＴＤ効率を有する。これは、タンパク質のクリップ部位同定との関連でこれらの反応を考慮する場合に重要であり、タンパク質での誘導体化効率は、代理ペプチドのＥＴＤ効率に影響を及ぼさなかった。
最後に、ＥＴＤ及びＨＣＤによって生成された各レポーターイオン並びにＬＣ保持時間の診断的有用性を調べた。ＴＭＰＰ誘導体化ペプチド及びそれらの未修飾対応物は、ヒトタンパク質配列に対する検索を介して確信を持って同定され、配列イオンは、ペプチドの大部分のＮ末端に高信頼性でＴＭＰＰ部分を局在化していた。検索結果を使用して、ＴＭＰＰ標識ペプチドのクラスを決定し、非標識ペプチドから分離した。次いで、各スペクトルについての診断用イオンの解離効率（ＥＴＤ又はＨＣＤ）をロジスティック回帰及びランダムフォレストモデルに供して、各診断用イオンの感度及び特異性を決定して、ＥＴＤ及びＨＣＤ診断用イオンの両方について受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を生成した。同様に、標識ペプチド及び非標識ペプチドの両方の保持時間を使用して、溶出時間の感度及び特異性を決定した。検索結果及び診断用イオン存在量をどのように使用してスペクトルを分類又は誤分類するかを説明した。図１０Ａに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、真陰性（ＴＮ）であったレポーターを生成しなかった。図１０Ｂに示すように、標識ペプチドは、真陽性（ＴＰ）であった特徴的なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成したが、非標識ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。図１０Ｃに示すように、修飾ペプチドは、偽陰性（ＦＮ）であった診断用イオンを生成しなかったが、未修飾ペプチド対応物は、偽陽性（ＦＰ）であったＴＭＰＰ＋レポーターイオンと質量が類似した干渉イオンを生成した。図１１Ａ～図１１Ｂは、各診断用イオン及び溶出時間についてのＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。レポーターイオンのうち、ＴＭＰＰ＋レポーターイオンが最も診断的であり、最も高いＡＵＣは９８％であり、ＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋ＡＵＣは８５％、ＴＭＰＰ－Ａｃ＋ＡＵＣは８４％であり、ＥＴＤ生成ＴＭＰＰ＋診断用イオンが他のレポーターイオンと比較して最も正確で最も特異的であることを示唆した。９９％の観察された保持時間ＡＵＣのＲＯＣ曲線は、全ての測定のうち最も診断的であった。
実施例５：治療用タンパク質分解を検出するためのＴＭＰＰ標識及びＥＴＤレポーターイオントリガＣＩＤの適用
最後に、ＴＭＰＰ標識を適用して、ＧＬＰ１ペプチドのプロテアーゼ誘導性クリップを受けることが知られている市販の治療用ＧＬＰ１アゴニストであるデュラグルチドのクリップ部位を調べた。カテプシンＤで処理したＧＬＰ１－Ｆｃ融合タンパク質であるデュラグルチドを使用して、ＥＴＤ－ＭＳ２及び診断用イオントリガＣＩＤ－ＭＳ２を使用してＧＬＰ１ペプチド上の推定クリップ部位を研究した。
最後に、ＴＭＰＰ標識を適用して、ＧＬＰ１ペプチドのプロテアーゼ誘導性クリップを受けることが知られている市販の治療用ＧＬＰ１アゴニストであるデュラグルチドのクリップ部位を調べた。カテプシンＤで処理したＧＬＰ１－Ｆｃ融合タンパク質であるデュラグルチドを使用して、ＥＴＤ－ＭＳ２及び診断用イオントリガＣＩＤ－ＭＳ２を使用してＧＬＰ１ペプチド上の推定クリップ部位を研究した。
以前の研究は、カテプシンＤがＷ２５／Ｌ２６でＧＬＰ１の切断を誘導することを報告している（Ｄｏｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，２０１１，２７：２２０－２３１；Ｄｅａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００４，５３：２１８１－２１８９；Ｍａｎａｎｄｈａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１５，５８：１０２０－１０３７）。図１２Ａ～図１２Ｃは、ＭＳ２スペクトルが、プロテアーゼ活性に起因して生成されるネオＮ末端の証拠を示したことを実証している。２価イオンのＥＴＤ－ＭＳ２から得られるプロダクトイオンスペクトル（図１２Ａ）は、特徴的な診断用イオンＴＭＰＰ＋（ｍ／ｚ＝５３３Ｄａ）を生成した。更に、ｃ型イオンは、ＴＭＰＰ部位局在で主に観察された。Ｎ末端上のＴＭＰＰの部位局在は、Ｆ－Ｉクリップに起因するネオＮ末端を示したが、Ｃ末端リジン残基上の第２のＴＭＰＰは、リジン残基にコンジュゲートしたＴＭＰＰがコンジュゲーション後の試料のトリプシン化に耐性であったので、Ｋ－Ｇクリップによって推測することができる。
ＴＭＰＰ標識はリジン残基及びチロシン残基にも起こり、ＴＭＰＰ修飾を有するペプチドをＥＴＤに供した場合、診断用レポーターイオンも生成し、したがってＣＩＤ－ＭＳ２イベントを引き起こすことに留意することが重要であった。これらのＣＩＤスペクトルは、レポーターの偽陽性同定であった。それにもかかわらず、ＥＴＤ及び診断用イオントリガＣＩＤスペクトルにおける配列イオンの慎重な検査は、ＴＭＰＰが配列上に部位特異的に局在し、偽陽性の排除に役立った。図１２Ｂは、２価イオンの診断用レポーターイオン（ｍ／ｚ＝５３３）トリガＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルを示す。ｂ型及びｙ型イオンは、Ｎ末端リジン及びＣ末端リジンの両方のＴＭＰＰ部位局在化を支援した。ペプチド配列は、特徴的なＣＩＤ誘導レポーターイオンを生成しなかった（ｍ／ｚ＝５７３）ことに留意することが重要であった。
診断用イオンが存在しない非コンジュゲートペプチド（図１２Ｃ）のＥＴＤスペクトルも生成された。非コンジュゲートペプチドのプロダクトイオン分布は、ｃ型イオン及びｚ型イオンの両方の混合物をもたらした。
デュラグルチドペプチドの完全な分析は、ＧＬＰ１の追加のクリッピングを同定した。図１３Ａ～図１３Ｃは、ＧＬＰ１配列の逐次クリッピングに対応する代理ペプチドのＥＴＤ－ＭＳ２及び診断用イオントリガＣＩＤ－ＭＳ２プロダクトイオンスペクトルの証拠を示す。Ｉ／Ａクリップから生じる代理ペプチドは、専ら５３３Ｄａの診断イオンを生成したが、Ａ／Ｗ及びＷ／Ｌクリップから生じるものは、ＥＴＤ中に５３３Ｄａ及び５９０Ｄａで診断用イオンを生成した。５３３Ｄａの優勢な診断用イオンは、各ペプチドについてＣＩＤ－ＭＳ２イベントをトリガし、ＣＩＤプロダクトイオンスペクトルを生成した。ＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルはＥＴＤ同定を補完し、トリガされたＭＳ２スキャンは、データセット全体のネオＮ末端を明確に同定するために、ＥＴＤ－ＭＳ／ＭＳからシームレスに生成されたレポーターイオンの存在を確認した。
図１４は、ネオＮ末端から代理ペプチドを生成するためのデュラグルチドのクリップ部位を示す。図１５Ａは、ＴＭＰＰ標識のない代理ペプチドの抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示し、図１５Ｂは、標識された代理ペプチドのクロマトグラムを示す。
クリッピングによって形成されたＴＭＰＰ標識ネオＮ末端ペプチドのためのレポーターイオンを生成するために、ＣＩＤに加えて、より多くの内部断片を作製することが知られているＨＣＤ（Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，１１：５４７９－５４９１）、及びＵＶＰＤなどの他の解離モードの有用性を更に調べた。表２は、ＧＬＰ１配列の代理ペプチドＩＡＷＬＶＫ（配列番号５）、ＡＷＬＶＫ（配列番号６）、ＷＬＶＫ（配列番号７）及びＬＶＫのクリップ部位について得られた結果をまとめたものである。これらのペプチドは全て、ＥＴＤを介して特徴的な５３３Ｄａ診断用イオンを生成したが、ＬＶＫペプチド配列のみが、ＨＣＤ及びＵＶＰＤ解離モードの診断用イオンを示した。図１６Ａ及び図１６Ｂに示すように、ＨＣＤは、アミド結合解離に起因して５７３Ｄａで特徴的な診断用イオンを生成し（Ｓａｄａｇｏｐａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０００，１１：１０７－１１９；Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，２０１２，２３：１１８２－１１９０）、ＵＶＰＤは、おそらく更なる解離及び再配列に起因して１８１Ｄａで診断用イオンを生成した（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，６９：１３７－１４４）。全てのペプチドにおいて診断用イオンを検出しなかったことに加えて、ＥＴＤ生成診断用イオン（図１６Ｃ）とは対照的に、有意に低い相対ピーク強度が観察され、これらのイオンのトリガはあまり有益ではなかった。
表２．レポーターイオンＴＭＰＰ特異的配列イオンに基づくＧＬＰ１の解離方法及び同定されたクリップ部位（５７３Ｄａ、１８１ＤａにおけるＨＣＤ、ＣＩＤ及びＵＶＰＤ診断用イオン；５３３ＤａにおけるＥＴＤ診断用イオン）。
ＸＩＣは、各ＴＭＰＰ標識ペプチドが１０～１３分の間の２つの急速な傾斜の間に溶出することを実証した。内因性試料で主に観察された短いＬＶＫペプチドは保持性が低く、ペプチドマッピング実験ではおそらく見つけにくい。しかし、ＴＭＰＰ標識後の同じペプチドは、ペプチドの全体的な疎水性増強により、逆相クロマトグラフィ中に有意なカラム保持をもたらした。非標識ペプチドも観察されたという事実は、ＴＭＰＰ標識が完全ではないことを示唆した。これらのＴＭＰＰ誘導体化反応を達成することができる程度を調査し、最適な条件をＴＭＰＰ標識に使用した（図１７Ａ～図１７Ｂ）。その前駆体からの保持時間が異なる非標識対応物の存在にもかかわらず、クリッピングに起因するネオＮ末端のＴＭＰＰ標識の同一性を更に検証した。
結論として、容易な診断用イオンＴＭＰＰ＋及びＴＭＰＰ－Ａｃ－ＮＨ２
＋を生成する手段として、電子移動解離質量分析と組み合わせたＴＭＰＰ標識の使用が報告された。レポーターイオンの中で、ＥＴＤは、小さなトリプシンペプチドに対して最も強い、容易なＴＭＰＰ＋レポーターイオンを生成した。この観察は、類似の長さを有するペプチドについてプリーカーサイオン電荷と共に通常増加した典型的な骨格解離効率とは異例であった。２価イオンのＥＴＤ効率は、単一の切断の結果として中性プロダクトイオン生成するために、３価又は４価イオンよりも低かった（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００７，１２９：１２２３２－１２２４３；Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００５，１２７：１２６２７－１２６３９）。したがって、データは、ＴＭＰＰ部分上の固定電荷基が効率的な電子再結合を促進して、電荷を保持する好ましい断片を生成することを示した（Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１６，１５：７４０－７５１）。ＮＩＳＴモノクローナル抗体の合成標準ペプチドを使用したＴＭＰＰ＋レポーターイオンの生成に影響を及ぼす様々な因子は、様々な長さ、荷電状態、及び配列組成を有するＫ５６２細胞溶解物からペプチドの大きなプールを生成することによっても同様に示された。ＴＭＰＰ＋レポーターイオン効率は、小さな２価ペプチドで最も高かった。対照的に、ＨＣＤは、電荷状態依存性を示さないＴＭＰＰ－Ａｃ＋レポーターイオンを生成した。ＥＴＤ生成ＴＭＰＰ＋イオンの診断的有用性は、ＲＯＣ分析のＨＣＤ生成ＴＭＰＰ－ＡＣ＋イオンについての８５％のＡＵＣと比較して、９８％のＡＵＣによって決定された。トリガスキャンのためにＴＭＰＰ＋イオンを生成する能力は、ＥＴＤが２価イオンの十分な骨格断片を生成できなかった場合に、ＴＭＰＰ部分の正確な位置決定のための配列の完全な調査又は高い信頼度での配列の確認を示した。トリガＭＳ２の高い忠実度は、ＴＭＰＰ誘導体化ＮＩＳＴ合成ペプチド及びＴＭＰＰで誘導体化されたＧＬＰ１－Ｆｃ融合タンパク質から生成されたトリプシンペプチドのパネルについて実証された。Ｎ末端の標識は、消化及び質量分析の前にクリップ部位を確立し、それらの両方は、クリップ部位と間違えられ得る偽断片を生成することが知られていた。
最後に、ＧＬＰ１のカテプシン誘導性クリップ部位を調べるためのＴＭＰＰ＋診断用レポーターイオントリガＭＳ２の有用性が実証された。ＧＬＰ１配列の逐次クリッピングに対応する代理ペプチドのＥＴＤ－ＭＳ２及び診断用イオントリガＭＳ２－ＣＩＤプロダクトイオンスペクトルの証拠が得られた。逐次クリップは各々、ＴＭＰＰ＋診断用イオン及びその後のレポーターイオントリガＣＩＤ－ＭＳ２を介して高い信頼性で確認された。ＣＩＤ－ＭＳ２スペクトルはＥＴＤ同定を補完し、トリガＭＳ２スキャンは、ＣＩＤスキャンがレポーターイオンが観察されたときにのみ実行されｉｎ ｓｉｌｃｏフィルタリング機構においてリアルタイムを提供した。レポーターイオントリガは、データセット全体に対するダウンネオＮ末端の高い信頼性の同定及びシームレスアセンブリのために行われた。この分析モードは、標識が実施されなかった場合のクリップ部位検出の曖昧さを低減し、試料消化及び質量分析条件によって生じる偽アーチファクトを評価する必要性を排除した。
要約すると、タンパク質治療薬は、分解されたタンパク質のネオＮ末端を与える酵素的及び非酵素的機構を介したクリッピングに感受性であった。治療薬のネオＮ末端の決定は、典型的には、ＴＭＰＰによるＮ末端アミン基の化学的誘導体化、その後のタンパク質分解及び質量分析によって行った。ＴＭＰＰ修飾を有するペプチド配列を衝突活性化に由来するプロダクトイオンスペクトルにマッピングすることによって、ＴＭＰＰ標識ペプチドの同定が可能であった。ＴＭＰＰタグの部位特異的局在化は、成熟Ｎ末端又はネオＮ末端の明確な決定を可能にした。骨格プロダクトイオンに加えて、ＣＩＤを介して形成された２７３ＤａのＴＭＰＰレポーターイオンは、プロセシングされたＮ末端の存在について診断することができた。しかし、ＣＩＤを介して生成されたレポーターイオンは、それらの存在量が少ないため、情報価値が低かった。本明細書では、ＥＴＤ時にｍ／ｚ５３３Ｄａ、場合によっては５９０ＤａでＴＭＰＰレポーターイオンを容易に生成するための新規ハイスループットＬＣ－ＭＳ法が実証された。これらのレポーターの豊富な生成は、更なる配列ペプチドに対する強度及びｍ／ｚ依存性トリガイベントを介したＣＩＤ、ＨＣＤ又はＵＶＰＤなどの相補的イオン活性化モードを使用したその後のＭＳ／ＭＳイベントを可能にした。
より具体的には、ＥＴＤ－ＭＳ２を介したクリップされたペプチドを同定するためのＴＭＰＰ由来レポーターイオンの有用性、及びクリップされたペプチドを自律的にフィルタリングするための診断用イオントリガＭＳ２イベントが実証された。ＴＭＰＰ標識標準ペプチドのレポーターイオンの効率的な生成のための本明細書に記載のアプローチは、Ｎ末端がクリップされた種並びにリジン残基及びチロシン残基での望ましくないＴＭＰＰ標識の両方を表すことが実証された。様々な配列組成、長さ及び電荷状態を有するＴＭＰＰ標識ペプチドの大きなプールを使用して、ＨＣＤ－ＭＳ２上でＥＴＤ－ＭＳ２を介して生成されたレポーターイオンの診断的有用性も実証された。最後に、本明細書に記載のアプローチを適用して、カテプシンＤで処理した市販のＧＬＰ１アゴニストであるデュラグルチドのＧＬＰ１ペプチドの逐次クリッピングを調べた。相補的解離モード：ＥＴＤ、ＨＣＤ、ＣＩＤ、及びＵＶＰＤについてのＴＭＰＰレポーターイオンの有用性を比較すると、ＥＴＤを介して生成されたＴＭＰＰ＋イオンのｍ／ｚ＝５３３Ｄａでの容易な電荷損失ピークが、ネオＮ末端を有するＴＭＰＰ標識ペプチドについて最も診断的であることが示唆された。迅速分離法により、ＴＭＰＰ標識ペプチドを複合試料中の非標識ペプチドから効率的に分離することが可能になり、ＴＭＰＰ標識ペプチドの保持時間予測性が向上して、クリップされたペプチドの特異性が更に改善され、偽陽性同定が減少した。
上記の実験実施例で使用した材料及び方法を次に説明する。
化学物質及び試薬
（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド（ＴＭＰＰ）、４－モルホリンエタンスルホン酸一水和物（ＭＥＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、重炭酸トリメチルアンモニウム（ＴＭＡＢ）、二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ウシ脾臓由来のカテプシンＤ、１，４ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）及びＮＩＳＴ－ＩｇＧ１－Ｋ１モノクローナル抗体は全て、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
（Ｎ－スクシンイミジルオキシカルボニル）トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムブロミド（ＴＭＰＰ）、４－モルホリンエタンスルホン酸一水和物（ＭＥＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、重炭酸トリメチルアンモニウム（ＴＭＡＢ）、二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ウシ脾臓由来のカテプシンＤ、１，４ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）及びＮＩＳＴ－ＩｇＧ１－Ｋ１モノクローナル抗体は全て、Ｓｉｇｍａ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。
ＮＩＳＴモノクローナル抗体からのペプチド標準は、Ｂｉｏｍａｔｉｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（オンタリオ州、カナダ）によって純度９９．９９％まで合成された。ヒトＫ５６２プレ消化細胞抽出物、並びに配列決定グレードのトリプシン及びエンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃは、Ｐｒｏｍｅｇａ（ウィスコンシン州マディソン）から購入した。ＧＬＰ１－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｍｙｏｄｅｒｍ（ペンシルベニア州ノリスタウン）から購入した。最適なＬＣ－ＭＳグレードのアセトニトリル、水、並びにギ酸、ヒドロキシルアミン、Ｇｙｂｃｏ ＰＢＳ緩衝液は全て、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（マサチューセッツ州ウォルサム）から購入した。
Ｎ末端標識及びタンパク質消化
合成ペプチド、Ｋ５６２プレ消化物由来のペプチド、ＮＩＳＴモノクローナル抗体及びＧＬＰ１－Ｆｃ融合タンパク質を全てＴＭＰＰで誘導体化した。誘導体化を以下の緩衝液中で行った：各々１００ｍＭのＭＥＳ ｐＨ６、ＨＥＰＥＳ ｐＨ７及びリン酸ナトリウムｐＨ８。ＴＭＰＰ １００ｍｇを１．３ｍＬのＤＭＦに溶解することにより、新鮮な１００ｍＭ ＴＭＰＰ溶液を調製した。ＴＭＰＰ標識は、他で公開されている誘導体化プロトコル（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１２９５：２４９－２５８）を適合させることによって実施した。
合成ペプチド、Ｋ５６２プレ消化物由来のペプチド、ＮＩＳＴモノクローナル抗体及びＧＬＰ１－Ｆｃ融合タンパク質を全てＴＭＰＰで誘導体化した。誘導体化を以下の緩衝液中で行った：各々１００ｍＭのＭＥＳ ｐＨ６、ＨＥＰＥＳ ｐＨ７及びリン酸ナトリウムｐＨ８。ＴＭＰＰ １００ｍｇを１．３ｍＬのＤＭＦに溶解することにより、新鮮な１００ｍＭ ＴＭＰＰ溶液を調製した。ＴＭＰＰ標識は、他で公開されている誘導体化プロトコル（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１２９５：２４９－２５８）を適合させることによって実施した。
簡潔には、１０μｌのＴＭＰＰ溶液を５０ｕｇのペプチド及びタンパク質に添加し、短時間混合し、続いて４０ｕＬの緩衝液を添加し、次いで得られた混合物を１時間インキュベートした。反応物を１ｕＬのヒドロキシルアミンでクエンチし、次いで凍結乾燥して乾燥させた。乾燥ペプチドをＭＳ用の０．１ ＦＡ水で再構成し、乾燥タンパク質をトリプシン処理用のＴＭＡＢで再構成した。
タンパク質を、他の場所に記載のプロトコル（Ｇｕｎａｗａｒｄｅｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１６，１５：７４０－７５１）を使用して消化した。簡単に言えば、タンパク質をＤＴＴで還元し、続いてヨードアセトアミドでアルキル化した。次いで、タンパク質を３７℃で１時間、エンドプロテイナーゼＬｙｓ－Ｃによるタンパク質分解に供し、続いて４倍希釈２５ｍＭ ＴＭＡＢ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＣａＣｌ２に供し、更に３７℃で４時間トリプシン消化した。ギ酸を０．１％に添加することによって消化を停止した。ペプチド溶液をＳｅｐ－Ｐａｋ Ｌｉｇｈｔ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、マサチューセッツ州ミルフォード）で脱塩し、質量分析用に収集した。
機器
全ての分析は、チューンアプリケーションソフトウェア２．１．１５６５．１８及びＸｃａｌｉｂｕｒ ４．０．２７．１３を使用して、エレクトロスプレーイオン源を備えたＯｒｂｉｔｒａｐＬｕｍｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州サンノゼ）Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）を使用して実施した。
全ての分析は、チューンアプリケーションソフトウェア２．１．１５６５．１８及びＸｃａｌｉｂｕｒ ４．０．２７．１３を使用して、エレクトロスプレーイオン源を備えたＯｒｂｉｔｒａｐＬｕｍｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州サンノゼ）Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計に連結されたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）を使用して実施した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した全ての試料を、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐ Ｍｉｃｒｏ Ｂｏｒｅ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ（１×１５０ｍｍ、２．７μｍ）カラムを用い、６５℃でＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２９０ ＵＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）で分離した。移動相Ａとして０．１％ギ酸を含む水及び移動相Ｂとしてアセトニトリルを利用する以下の２０分間の高速ＬＣ勾配プログラムを使用した：０分、２％Ｂ；１０分、３０％Ｂ；１０．５分、２％Ｂ；１１．５分、８５％Ｂ；１２分、２％Ｂ；１３分、８５％Ｂ；１３．５分、２％Ｂ；続いて８５％Ｂで１４～１８分間の洗浄ステップ、及びその後の２％Ｂで２分間の再平衡化を行った。移動相Ａとして０．１％ギ酸を含む水及び移動相Ｂとしてアセトニトリルを利用する１２０分ＬＣ勾配法を使用した：０分、２％Ｂ；６０分、３０％Ｂ；６０．５分、２％Ｂ；６１．５分、８５％Ｂ；６２分、２％Ｂ；６３分、８５％Ｂ；６３．５分、２％Ｂ；続いて６４．５～８０分の洗浄ステップ、８５％Ｂ、及びその後の２％Ｂでの２０分間の再平衡化を行った。全ての勾配の流量を０．２ｍＬ／分に設定し、選択された注入量は２μＬであった。質量分析計は、データ依存ＭＳ２ＥＴＤ、ＣＩＤ、ＨＣＤ、ＵＶＰＤ法を用いて正イオン化モードで操作した。界面条件は以下の通りであった：エミッタ電圧、－２６００Ｖ；気化器温度、３２５℃；イオン移動管、３２５℃；シースガス、５５（ａｒｂ）；ａｕｘガス、１０（ａｒｂ）、及びスイープガス、１（ａｒｂ）。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供した全ての試料を、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐ Ｍｉｃｒｏ Ｂｏｒｅ Ｒａｐｉｄ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ（１×１５０ｍｍ、２．７μｍ）カラムを用い、６５℃でＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２９０ ＵＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクララ）で分離した。移動相Ａとして０．１％ギ酸を含む水及び移動相Ｂとしてアセトニトリルを利用する以下の２０分間の高速ＬＣ勾配プログラムを使用した：０分、２％Ｂ；１０分、３０％Ｂ；１０．５分、２％Ｂ；１１．５分、８５％Ｂ；１２分、２％Ｂ；１３分、８５％Ｂ；１３．５分、２％Ｂ；続いて８５％Ｂで１４～１８分間の洗浄ステップ、及びその後の２％Ｂで２分間の再平衡化を行った。移動相Ａとして０．１％ギ酸を含む水及び移動相Ｂとしてアセトニトリルを利用する１２０分ＬＣ勾配法を使用した：０分、２％Ｂ；６０分、３０％Ｂ；６０．５分、２％Ｂ；６１．５分、８５％Ｂ；６２分、２％Ｂ；６３分、８５％Ｂ；６３．５分、２％Ｂ；続いて６４．５～８０分の洗浄ステップ、８５％Ｂ、及びその後の２％Ｂでの２０分間の再平衡化を行った。全ての勾配の流量を０．２ｍＬ／分に設定し、選択された注入量は２μＬであった。質量分析計は、データ依存ＭＳ２ＥＴＤ、ＣＩＤ、ＨＣＤ、ＵＶＰＤ法を用いて正イオン化モードで操作した。界面条件は以下の通りであった：エミッタ電圧、－２６００Ｖ；気化器温度、３２５℃；イオン移動管、３２５℃；シースガス、５５（ａｒｂ）；ａｕｘガス、１０（ａｒｂ）、及びスイープガス、１（ａｒｂ）。
方法の設定
特に明記しない限り、ＭＳスキャンに利用される内部質量分析計の設定は以下の通りであった：ＲＦレンズ、６０％；ＡＧＣ（自動利得制御）目標、４ｅ５；最大注入時間、５０ｍｓ；及びＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析装置で５０Ｋ解像度でのプロファイルモードでの１μスキャン。次いで、この方法は、任意のＨＣＤ ＭＳ２イベントの前に一連のフィルタを順次含んだ。モノアイソトピックピーク選択フィルタを含め、全ての方法についてペプチドとして設定した。特に明記しない限り、１ｅ５の強度フィルタを全ての方法に利用した。前駆電荷状態２～６を選択するためのいくつかの方法のために、任意の電荷状態フィルタが含まれた。１２秒又は３秒の排除ウィンドウのいずれかを有するいくつかの方法のための任意選択の動的排除（ＤＥ）フィルタを含み、共通パラメータ：除外ｎ＝１回；＋／－３ｐｐｍ；除外同位体；及び前駆体あたりの単一電荷状態を有した。ＡＰＥＸ検出は、１つの方法に含まれ、予想ピーク幅、６秒；所望の頂点ウィンドウ、３０％に設定した。特に明記しない限り、以下の設定で５回のｄｄＭＳ２ ＯＴ－ＥＴＤスキャンを行った：四重極単離、２ｍ／ｚ単離ウィンドウ；反応時間５０ｍｓ検出器タイプ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、自動ｍ／ｚ通常スキャン範囲、１５Ｋ分解能、１００ｍ／ｚ第１の質量；ＡＧＣターゲット、２ｅ５、全ての利用可能な並行化可能な時間についてイオン注入、最大注入時間５０ｍｓ；１μスキャン、プロファイル。標的質量トリガ（ＴＭＴ）は、ｄｄＭＳ２ＩＴ－ＣＩＤに従い、イオン５３３．１９３、６９０．２１４；＋／－５ｐｐｍ誤差許容範囲；明示されたリストからの２つ又は１つのイオンのいずれかの検出；全ての質量トリガについて最も強い上位１０内のイオンのみを含んだ。その後のｄｄＭＳ２ＯＴ－ＣＩＤ条件は、特に明記しない限り、以下の通りであった：ＭＳｎレベル、２；四重極単離、１．６ｍ／ｚ単離ウィンドウ；ＣＩＤ衝突エネルギー、３０；活性化Ｑ、０．２５；検出器タイプ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、自動ｍ／ｚ通常スキャン範囲、１５Ｋ解像度；ＡＧＣターゲット、５ｅ４、全ての利用可能な並行化可能な時間についてイオン注入、最大注入時間２２ｍｓ；１μスキャン、プロファイル。ｄｄＭＳ２ＯＴ－ＥＴＤとｄｄＭＳ２ＩＴ－ＣＩＤとの間の依存的スキャンの数を１に設定した。特に明記しない限り、以下の設定で５回のｄｄＭＳ２ ＯＴ－ＨＣＤスキャンを行った：四重極単離、１．６ｍ／ｚ単離ウィンドウ；ＨＣＤ衝突エネルギー、４０％、段階的５％；検出器タイプ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、自動ｍ／ｚ通常スキャン範囲、１５Ｋ解像度；１００ｍ／ｚ第１の質量；ＡＧＣターゲット、５ｅ４、全ての利用可能な並行化可能な時間についてイオン注入、最大注入時間３５ｍｓ；１μスキャン、プロファイル。
特に明記しない限り、ＭＳスキャンに利用される内部質量分析計の設定は以下の通りであった：ＲＦレンズ、６０％；ＡＧＣ（自動利得制御）目標、４ｅ５；最大注入時間、５０ｍｓ；及びＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析装置で５０Ｋ解像度でのプロファイルモードでの１μスキャン。次いで、この方法は、任意のＨＣＤ ＭＳ２イベントの前に一連のフィルタを順次含んだ。モノアイソトピックピーク選択フィルタを含め、全ての方法についてペプチドとして設定した。特に明記しない限り、１ｅ５の強度フィルタを全ての方法に利用した。前駆電荷状態２～６を選択するためのいくつかの方法のために、任意の電荷状態フィルタが含まれた。１２秒又は３秒の排除ウィンドウのいずれかを有するいくつかの方法のための任意選択の動的排除（ＤＥ）フィルタを含み、共通パラメータ：除外ｎ＝１回；＋／－３ｐｐｍ；除外同位体；及び前駆体あたりの単一電荷状態を有した。ＡＰＥＸ検出は、１つの方法に含まれ、予想ピーク幅、６秒；所望の頂点ウィンドウ、３０％に設定した。特に明記しない限り、以下の設定で５回のｄｄＭＳ２ ＯＴ－ＥＴＤスキャンを行った：四重極単離、２ｍ／ｚ単離ウィンドウ；反応時間５０ｍｓ検出器タイプ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、自動ｍ／ｚ通常スキャン範囲、１５Ｋ分解能、１００ｍ／ｚ第１の質量；ＡＧＣターゲット、２ｅ５、全ての利用可能な並行化可能な時間についてイオン注入、最大注入時間５０ｍｓ；１μスキャン、プロファイル。標的質量トリガ（ＴＭＴ）は、ｄｄＭＳ２ＩＴ－ＣＩＤに従い、イオン５３３．１９３、６９０．２１４；＋／－５ｐｐｍ誤差許容範囲；明示されたリストからの２つ又は１つのイオンのいずれかの検出；全ての質量トリガについて最も強い上位１０内のイオンのみを含んだ。その後のｄｄＭＳ２ＯＴ－ＣＩＤ条件は、特に明記しない限り、以下の通りであった：ＭＳｎレベル、２；四重極単離、１．６ｍ／ｚ単離ウィンドウ；ＣＩＤ衝突エネルギー、３０；活性化Ｑ、０．２５；検出器タイプ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、自動ｍ／ｚ通常スキャン範囲、１５Ｋ解像度；ＡＧＣターゲット、５ｅ４、全ての利用可能な並行化可能な時間についてイオン注入、最大注入時間２２ｍｓ；１μスキャン、プロファイル。ｄｄＭＳ２ＯＴ－ＥＴＤとｄｄＭＳ２ＩＴ－ＣＩＤとの間の依存的スキャンの数を１に設定した。特に明記しない限り、以下の設定で５回のｄｄＭＳ２ ＯＴ－ＨＣＤスキャンを行った：四重極単離、１．６ｍ／ｚ単離ウィンドウ；ＨＣＤ衝突エネルギー、４０％、段階的５％；検出器タイプ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ、自動ｍ／ｚ通常スキャン範囲、１５Ｋ解像度；１００ｍ／ｚ第１の質量；ＡＧＣターゲット、５ｅ４、全ての利用可能な並行化可能な時間についてイオン注入、最大注入時間３５ｍｓ；１μスキャン、プロファイル。
データ解析
データ分析は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＸｃａｌｉｂｕｒ視覚化ソフトウェア（カリフォルニア州サンノゼ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭｅｔｒｉｃｓからのＢｙｏｓ３．９クロマトグラフィ及び質量分析データ分析ソフトウェア（カリフォルニア州クパチーノ）、及びＲ３．６統計プログラミングソフトウェア（ウィーン、オーストリア）を用いて行った。
データ分析は、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＸｃａｌｉｂｕｒ視覚化ソフトウェア（カリフォルニア州サンノゼ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭｅｔｒｉｃｓからのＢｙｏｓ３．９クロマトグラフィ及び質量分析データ分析ソフトウェア（カリフォルニア州クパチーノ）、及びＲ３．６統計プログラミングソフトウェア（ウィーン、オーストリア）を用いて行った。
本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示のみを目的としたものであり、上述の実施形態に対する変更は、その広範な発明概念から逸脱することなくなされ得ることが理解される。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の趣旨及び範囲内の修正をも包含することを意図するものと理解される。
当業者は、本発明を実施する際に他の要素及び／又はステップが望ましい及び／又は必要とされることを認識してもよい。しかし、そのような要素及びステップは当技術分野において周知であり、それらは本発明のよりよい理解を促進しないため、本明細書ではそのような要素及びステップについての議論はしない。本明細書の開示は、当業者に知られているそのような要素及び方法に対する全てのそのような変形及び修正に関する。
本明細書で引用したそれぞれの及び全ての特許、特許出願、及び刊行物の開示内容が、それらの全体を参照することにより本明細書において援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されているが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者によって本発明の他の実施形態及び変更が考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、全てのそのような実施形態及び同等の変更を含むと解釈されることが意図される。
Claims (57)
- 試料中のＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）標識ペプチドを特性決定する方法であって、
（ｉ）前記試料を電子誘導解離タンデム質量分析に供して、前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの第１の質量スペクトルを得ることと、
（ｉｉ）前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの第１の質量スペクトルにおいてＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することによって、前記ＴＭＰＰ標識ペプチドを同定することと、
（ｉｉｉ）前記同定されたＴＭＰＰ標識ペプチドを第２の質量分析に供することによって、前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｉｖ）前記第１の質量スペクトル及び前記第２の質量スペクトルを分析することによって、前記ＴＭＰＰ標識ペプチドを特性決定することと
を含む、前記方法。 - ポリペプチドを特性決定する方法であって、
（ｉ）前記ポリペプチドをＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識して、ＴＭＰＰ標識ポリペプチドを得ることと、
（ｉｉ）前記ＴＭＰＰ標識ポリペプチドを消化して、１つ又は複数の非標識ペプチド及び１つ又は複数のＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｉｉ）前記混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、前記ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｉｖ）前記溶出液を電子誘導解離タンデム質量分析に供して、前記１つ又は複数のＴＭＰＰ標識ペプチドの各々の第１の質量スペクトルを得ることと、
（ｖ）前記１つ又は複数のＴＭＰＰ標識ペプチドの各々の前記第１の質量スペクトルにおいてＴＭＰＰレポーターイオンを検出及び分離することによって、前記１つ又は複数のＴＭＰＰ標識ペプチドを同定することと、
（ｖｉ）前記同定された１つ又は複数のＴＭＰＰ標識ペプチドを第２の質量分析に供することによって、前記１つ又は複数のＴＭＰＰ標識ペプチドの各々の第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉ）前記１つ又は複数のＴＭＰＰ標識ペプチドの各々について前記第１の質量スペクトル及び前記第２の質量スペクトルを分析することによって、前記ポリペプチドを特性決定することと
を含む、前記方法。 - タンパク質上のクリップ部位を同定する方法であって、
（ｉ）前記タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）前記１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識し、それによって１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）前記１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）前記混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、前記ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）前記溶出液を電子誘導解離タンデム質量分析に供して、前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々の第１の質量スペクトルを得ることと、
（ｖｉ）前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についての前記第１の質量スペクトルにおいてＴＭＰＰレポーターイオンを検出及び分離することによって、前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々を同定することと、
（ｖｉｉ）前記同定されたＴＭＰＰ標識ペプチドの各々を第２の質量分析に供することによって、前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々について第２の質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々について前記第１の質量スペクトル及び前記第２の質量スペクトルを分析することによって、前記タンパク質上の前記クリップ部位を同定することと
を含む、前記方法。 - 前記電子誘導解離が、電子移動解離（ＥＴＤ）又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の質量スペクトルが、ＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＭＰＰレポーターイオンが、前記第２の質量分析をトリガする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の質量分析が、衝突誘発解離（ＣＩＤ）、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の質量スペクトルが、ＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＭＰＰレポーターイオンが、前記ＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量分析をトリガする、請求項８又は９に記載の方法。
- 前記ＴＭＰＰレポーターイオンが、電荷損失から生成される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＬＣが、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）である、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項３～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、非治療用タンパク質である、請求項３～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、高スループットである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第１の質量スペクトル及び前記第２の質量スペクトルが、データベース又はスペクトルライブラリの情報と比較することによって分析される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第２の質量分析が、前記ＣＩＤ質量分析である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質上のクリップ部位を同定する方法であって、
（ｉ）前記タンパク質の１つ又は複数のクリップポリペプチドを含有する試料を得ることと、
（ｉｉ）前記１つ又は複数のクリップポリペプチドをＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識し、それによって１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）前記１つ又は複数のＴＭＰＰ標識クリップポリペプチドを消化して、非標識ペプチド及びＴＭＰＰ標識ペプチドを含む混合物を生成することと、
（ｉｖ）前記混合物を液体クロマトグラフィ（ＬＣ）に供して、前記ＬＣの溶出液を生成することと、
（ｖ）前記溶出液をタンデム質量分析に供し、それによって前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々について第１の電子移動解離（ＥＴＤ）質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉ）前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々について前記ＥＴＤ質量スペクトル中のＴＭＰＰレポーターイオンを検出又は分離することと、
（ｖｉｉ）前記ＴＭＰＰレポーターイオンの検出又は分離時に、前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々を、衝突誘発解離（ＣＩＤ）、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）を含む第２の質量分析に供し、それによって前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々についてそれぞれＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルを生成することと、
（ｖｉｉｉ）前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々について前記ＥＴＤ質量スペクトル及び前記ＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルを分析することによって、前記タンパク質上の前記クリップ部位を同定することと
を含む、前記方法。 - 前記ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＭＰＰレポーターイオンが、電荷損失から生成される、請求項１８又は１９に記載の方法。
- 前記ＬＣが、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）である、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、治療用タンパク質である、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が非治療用タンパク質である、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が高スループットである、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＥＴＤ質量スペクトル及び前記ＣＩＤ又はＨＣＤ又はＵＶＰＤ質量スペクトルが、データベース又はスペクトルライブラリの情報と比較することによって分析される、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＴＭＰＰ標識ペプチドの各々が、前記ＣＩＤ質量分析に供される、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
- ポリペプチド上のクリップ部位を同定するため、又は試料中のポリペプチドを特性決定するためのシステムであって、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）装置及びタンデム質量分析計を含み、前記タンデム質量分析計が、
（ｉ）第１のイオン化装置と、
（ｉｉ）第１の範囲内の質量電荷比を有するイオンを透過するために、第１の動作モードで配置及び適合された第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器と、
（ｉｉｉ）第１のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｉｖ）動作モードでイオンを減衰させるための減衰手段と、
（ｖ）前記第１の範囲内の質量電荷比を有するが、１つ又は複数の望ましくない第１の電荷状態を有するイオンが実質的に減衰されるように、前記減衰手段の動作を制御するように構成された制御装置と、
（ｖｉ）第２のイオン化装置と、
（ｖｉｉ）第２のイオン移動度分光計、検出器、又は分離器と、
（ｖｉｉｉ）フラグメントイオンの非混合信号を取得し、トリガイオンを非冗長的にコード化するように構成されたデータシステムであって、前記非冗長的なコード化が、任意の個々のゲート時間の複数回の反復において異なる親種からの任意の２つのイオン信号の反復的な重複を回避又は最小化するように配置されている、データシステムとを含む、
前記システム。 - 前記第１のイオン化装置が、電子誘導解離装置である、請求項２７に記載のシステム。
- 前記電子誘導解離装置が、電子移動解離（ＥＴＤ）装置又は電子捕捉解離（ＥＣＤ）装置である、請求項２８に記載のシステム。
- 前記第２のイオン化装置が、衝突誘発解離（ＣＩＤ）装置、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）装置、又は紫外線光解離（ＵＶＰＤ）装置である、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記質量分析計が、衝突装置、断片化装置、又は反応装置を更に含む、請求項２７～３０のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記減衰手段が、イオンゲート又はイオンバリアを含む、請求項２７～３１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記減衰手段が、前記イオン移動度分光計又は分離器の下流に配置されている、請求項２７～３２のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器が、前記第１の動作モードで配置及び適合されて、前記第１の範囲外の質量電荷比を有するイオンを減衰させる、請求項２７～３３のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第１の質量電荷比フィルタ又は質量電荷比質量分析器が、前記イオン移動度分光計又は分離器の上流又は下流に配置されている、請求項２７～３４のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第１の望ましくない電荷状態が、以下の（ｉ）１価、（ｉｉ）２価、（ｉｉｉ）３価、（ｉｖ）４価、（ｖ）５価、及び（ｖｉ）多価うちの１つ又は複数から選択される、請求項２７～３５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記イオン移動度分光計又は分離器の上流に配置されたイオンガイド、イオントラップ、又はイオントラップ領域を更に含み、前記イオンガイド、イオントラップ、又はイオントラップ領域が、イオンをトラップ、貯蔵、又は蓄積し、次いで前記イオン移動度分光計又は分離器内に、若しくは前記イオン移動度分光計又は分離器に向かってイオンを周期的にパルス化するように配置されている、請求項２７～３６のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記試料が、溶出液を生成するために前記ＬＣ装置に供される、請求項２７～３７のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記溶出液が、前記タンデム質量分析に供されて、第１の質量スペクトル及び第２の質量スペクトルを得る、請求項３８に記載のシステム。
- 前記第１の質量スペクトルが、ＥＴＤ又はＥＣＤ質量スペクトルである、請求項３９に記載のシステム。
- 前記第２の質量スペクトルが、ＣＩＤ、ＨＣＤ、又はＵＶＰＤ質量スペクトルを含む、請求項３９に記載のシステム。
- 前記ポリペプチド上の前記クリップ部位又は前記ポリペプチドが、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識されている、請求項２７～４１のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第１のイオン化装置が、ＴＭＰＰレポーターイオンを生成する、請求項４２に記載のシステム。
- 前記ＴＭＰＰレポーターイオンが、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、請求項４３に記載のシステム。
- 前記ＴＭＰＰレポーターイオンが、前記第２の質量分析をトリガする、請求項４３又は４４に記載のシステム。
- 前記ＬＣが、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）である、請求項２７～４５のいずれか一項に記載のシステム。
- 前記第１の質量スペクトル及び前記第２の質量スペクトルが、データベース又はスペクトルライブラリ内の情報と比較することによって分析される、請求項３８～４６のいずれか一項に記載のシステム。
- ポリペプチド上のクリップ部位を同定するためのレポーターイオンであって、
前記クリップ部位が、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識され、
前記ＴＭＰＰがイオン化されて、前記レポーターイオンを生成する、
前記レポーターイオン。 - ポリペプチドを特性決定するためのレポーターイオンであって、
前記ポリペプチドが、Ｎ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）で標識され、
前記ＴＭＰＰがイオン化されて、前記レポーターイオンを生成する、
前記レポーターイオン。 - 前記ＴＭＰＰが、質量分析計によってイオン化されて、前記レポーターイオンを生成する、請求項４８又は４９に記載のレポーターイオン。
- 前記質量分析計が、タンデム質量分析計である、請求項５０に記載のレポーターイオン。
- 前記タンデム質量分析計が、電子移動解離（ＥＴＤ）装置、電子捕捉解離（ＥＣＤ）装置、衝突誘発解離（ＣＩＤ）装置、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）装置、紫外線光解離（ＵＶＰＤ）装置、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５１に記載のレポーターイオン。
- 前記レポーターイオンが、約５３３Ｄａ、約５７３Ｄａ、又は約５９０Ｄａの公称質量電荷（ｍ／ｚ）を有する、請求項５２に記載のレポーターイオン。
- 前記レポーターイオンが、
- ポリペプチド上のクリップ部位を同定するための組成物であって、請求項４８及び５０～５４のいずれか一項に記載の少なくとも１つのレポーターイオン及びポリペプチドを含む、前記組成物。
- ポリペプチドを特性決定するための組成物であって、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の少なくとも１つのレポーターイオン及びポリペプチドを含む、前記組成物。
- ポリペプチド上のクリップ部位を同定するか、又は試料中のポリペプチドを特性決定するためのキットであって、
（ｉ）前記ポリペプチド上の前記クリップ部位を標識するためのＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）又は前記ポリペプチドを標識するためのＮ－トリス（２，４，６－トリメトキシフェニル）ホスホニウムアセチル（ＴＭＰＰ）と、
（ｉｉ）説明資料と
を含む、前記キット。
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