JP2005345263A - 生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価法、生鮮魚類の生可食残存日数の推定方法およびキット - Google Patents

Abstract

【課題】 生鮮魚介類等の鮮度を非破壊で評価する方法を提供する。
【解決手段】 ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入して発色媒体とし、該発色媒体を生鮮魚介類、獣肉または家禽肉と一緒に保蔵し、任意の時点で発色媒体の発色強度を測定し、測定した発色強度の強弱をもとに生鮮魚介類、獣肉または家禽肉のＫ値を推定することを特徴とする生鮮魚介類、家畜肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
【選択図】 図１

Description

本発明は、生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価法、生鮮魚類の生可食残存日数の推定方法およびそのためのキットに関するものである。

食品の安全性確保や品質の保証に消費者の関心が高まっている。生産者等には原料の生産・流通に関して安全性を確保し、併せてその情報を開示していくトレーサビリティシステムの構築が求められている。食肉や農産物に関しては牛肉トレーサビリティ法の制定、SEICAの普及、ICタグ等の試みが実施されているが、生鮮魚介類に関してはトレーサビリティシステムは端を発したばかりと言える。

これまで提案されたトレーサビリティシステムは消費者の安全・安心というよりは、むしろ生産者側や流通業者の生産物に対する管理に重点が置かれている。魚介類を生で食する我が国では、トレーサビリティに関する消費者のニーズとして、生産履歴（どこで漁獲・養殖されたか、生簀の情報、薬剤使用の有無など）や流通履歴（加工場所、流通及び配送過程など）よりは、あと何日生で食べられるか？一番おいしい時期はいつか？に大きな関心があるように考えられる。

生鮮魚介類、獣肉または家禽肉（以下、「生鮮魚介類等」と略称することがある）の品質保持技術は現在のところ、冷蔵・冷凍技術をおいて他にない。従って、温度管理をいかに厳格にするかによって最高の品質管理が可能になるものと考えられる。

しかし、生鮮魚介類等が流通過程の途中で品質が劣化するような温度にさらされた場合であっても、生鮮魚介類等の保蔵中の任意の時点での品質状態を目視で即座に判断することは難しい。

生鮮魚介類の鮮度が今どのような状態にあるのかを見極める計測法や装置は、種々開発実用化されている（特許文献１〜５）。しかしながら従来技術では、検体として、魚肉等を採取し試料溶液等を調製する必要があった。これらの従来技術は、破壊検査法であり、生鮮魚介類の商品価値は当然損なわれる。

一方、生鮮魚介類の品質管理や安全管理にHACCPを導入することは世界の趨勢である。HACCPの基準に基づけば生鮮魚介類の品質は生成ヒスタミン量によって判断される。ヒスタミンはバクテリアの生産する脱炭酸酵素によって遊離ヒスチジンから生成される。従って、魚介類を生で食べるレベルの品質評価法としてヒスタミン法はふさわしくないことは明らかである。

また、我が国では生鮮魚介類は生食されることが多く、生で食べられる期間はあと何日かという生可食残存日数も併せて推定できればよいが、このような生可食残存日数を非破壊的に推定する方法は知られていなかった。
特開昭５９−１０７２５６号公報 特開平３−２１９９００号公報 特開平８−２２８７６１号公報 特開平９−２６２０９６号公報 特開２００２−２６２７６４号公報

本発明が解決しようとする手段は、生鮮魚介類等の鮮度を非破壊で評価する方法、生鮮魚類の生可食残存日数の推定方法およびそのためのキットを提供することである。

（１） ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入して発色媒体とし、該発色媒体を生鮮魚介類、獣肉または家禽肉と一緒に保蔵し、任意の時点で発色媒体の発色強度を測定し、測定した発色強度の強弱をもとに生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度を推定することを特徴とする生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（２） 前記発色剤がテトラゾリウム塩であることを特徴とする（１）に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（３） 前記溶媒が、不凍性の極性溶媒であることを特徴とする（１）または（２）に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（４） 前記鮮度の推定を、予め発酵強度とＫ値の検量線を作成し、測定した発色強度からＫ値を求めることを特徴とする（１）ないし（３）のいずれか１項に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（５） 前記発酵強の測定および鮮度の推定を、色見本を用いて目視法で行うことを特徴とする（１）ないし（４）のいずれか１項に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
（６） ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入して発色媒体とし、該発色媒体を生鮮魚類が保蔵された保蔵容器内に配置し、任意の時点で発色媒体の発色強度を測定し、測定した発色強度の強弱をもとに生鮮魚類のＫ値を推定し、式（１）
ＲＤＶ_ｔ＝［Ｔ_ｔ（Ｋ_２−Ｋ’）／（Ｋ_２−Ｋ_０）］ （１）
（ただし式（１）中、ＲＤＶ_ｔ：ｔ℃貯蔵における生可食残存日数
Ｔ_ｔ：ｔ℃保存における生食としての許容限界日数
Ｋ_２：生食として食せる許容限界のＫ値
Ｋ_０：非常に新鮮な生鮮魚類のＫ値
Ｋ’：測定した時点のＫ値の推定値を示す。）
で表される式により生可食残存日数を算定することを特徴とする生鮮魚介類の生可食残存日数の推定方法。
（７） 前記発色剤がテトラゾリウム塩であることを特徴とする（６）に記載の生鮮魚類生可食残存日数の推定方法。
（８） 前記溶媒が、不凍性の極性溶媒であることを特徴とする（６）または（７）に記載の生鮮魚類生可食残存日数の推定方法。
（９） 前記発酵強の測定および鮮度の推定を、色見本を用いて目視法で行うことを特徴とする（６）ないし（８）のいずれか１項に記載の生鮮魚介類の生可食残存日数の推定方法。
（１０） ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入したことを特徴とする生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度推定用のキット。
（１１） ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入したことを特徴とする生鮮魚類生可食残存日数推定用のキット。
（１２） 前記発色剤がテトラゾリウム塩であることを特徴とする（１０）または（１１）に記載のキット。
（１３） 前記溶媒が、不凍性の極性溶媒であることを特徴とする（１０）または（１１）に記載のキット。

請求項１ないし５に記載された本発明方法により、生鮮魚介類等の鮮度を非破壊的に評価できるので、生鮮魚介類等の商品価値を損ねることがなく、従来の目視法に比べて生鮮魚介類等の鮮度をより客観的に評価をすることができる。特に請求項５に記載された発明は、目視法により生鮮魚介類等の鮮度を簡便に推定することができる。

請求項６ないし９に記載された本発明方法により、簡便な方法で、生鮮魚類の生可食残存日数を推定することができる。特に請求項９に記載された発明は、目視法により生鮮魚類の生可食残存日数を簡便に推定することができる。

請求項１０ないし１３に記載された本発明のキットにより、生鮮魚介類等の鮮度を非破壊的に評価し、また生鮮魚類生可食残存日数を推定することができる。

生鮮魚介類等の鮮度指標Ｋ値は生鮮魚介類等の筋肉中に含まれるアデノシン三リン酸（以下、「ＡＴＰ」と略称する）の分解過程から関数として導き出される。ＡＴＰはアデノシン二リン酸（以下、「ＡＤＰ」と略称する）を経てアデノシン一リン酸（アデニル酸、以下、「ＡＭＰ」と略称する）へと脱リン酸される。続いて、塩基部分の構造の一部が変化してイノシン酸（以下、「ＩＭＰ」と略称する）となる。ＩＭＰはカツオ節の旨み成分としてよく知られている。ＡＴＰの分解に際して個々までの過程は比較的早い。ＩＭＰの蓄積は旨み成分の蓄積であり、ここまでの分解は生鮮魚介類等の美味しさにとって重要な過程である。ＩＭＰは脱リン酸されてイノシン（以下、「ＨｘＲ」と略称する）となり、さらに酵素反応を受けてヒポキサンチン（以下、「Ｈｘ」と略称する）となる。Ｈｘはさらに酵素分解を受けてキサンチン・尿酸へと分解していく。この一連の過程の中で、ＩＭＰの分解速度が比較的小さいため、
[(HxR+Hx)/(ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx)×100(%)] （２）
を便宜的にＫ値と定義すると、Ｋ値は死後の時間経過と温度の関数となり、Ｋ値の増加速度が死後の生鮮魚介類等に起きる諸変化と概略平行する。

生鮮魚介類等の鮮度指標Ｋ値に関する上記式（２）は、以下の式（３）のように簡略化することも可能である。

[(HxR+Hx)/(IMP+ HxR+Hx)×100(%)] （３）
式（３）はＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰを省略したもので、これはＡＴＰからＩＭＰまでの分解が極めて短時間に進むことから提唱されたもので、Ｋ値とほぼ同じ値を示す。

一般に、生鮮魚介類ではＫ値２０％以下なら生食可能であるが、それ以上だと加熱調理する必要がある。そして、６０％を超えると腐敗が始まって食用に不可になるといわれる。一方、鶏肉では、Ｋ値が２０％以下なら極めて鮮度が高く、３０％以下なら良好、５０％以上では問題があるといわれている。

本発明者らは生鮮魚介類等の代謝過程であるＡＴＰの分解過程でＨｘからキサンチンおよび尿酸が生成する酵素反応に着目し、この酸化反応と共役して発色する発色剤（ホルマザン色素）の発色強度を計測することにより、任意の時点の生鮮魚介類等の鮮度を非破壊的に評価する方法を見出したものである。

すなわち、生鮮魚介類等の鮮度を非破壊的に評価する本発明は、ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入して発色媒体とし、該発色媒体を生鮮魚介類、獣肉または家禽肉と一緒に保蔵し、任意の時点で発色媒体の発色強度を測定し、測定した発色強度の強弱をもとに生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度を推定することを特徴とするとするものである。

本発明における、生鮮魚介類等とは、種々の魚や貝などの魚介類、牛、豚、羊等の獣肉、鶏肉等の家禽肉を意味する。

本発明における発色剤とは、ＡＴＰの分解過程でＨｘからキサンチン・尿酸を生成させるキサンチンオキシダーゼ（EC1.1.3.22、以下、「ＸＯＤ」と略称する）反応に共役して発色しホルマザン色素を生成する発色剤であれば特に限定されないが、表１に示したテトラゾリウム塩を挙げることができる。なお、表１に示したテトラゾリウム塩が反応して生成するホルマザン色素の発色の吸収極大の波長を合わせて示す。

表１に示した波長は吸収極大の例であり、測定条件によっては若干シフトする場合があるが、この波長を中心として短波長側あるいは長波長側20〜30ｎｍ付近の波長を採用することができる。発色強度の測定は、色見本による目視法、光電比色計または分光光度計の計器測定のいずれでもよい。

テトラゾリウム塩は窒素原子を４個有する五員環化合物の第４級アンモニウム塩で、酸化還元酵素の反応に共役して、それぞれ色調の異なるホルマザン色素を生成する。これらテトラゾリウム塩酸化還元酵素・コルチコイド・糖類・アスコルビン酸のような還元性物質の検出や、種子の発芽能力の試験、生細胞の計数・生体染色・尿路感染や慢性肉芽種の臨床検査などに使用される他、動物実験法代替試薬として実験動物に代わりin vitroでの培養細胞の毒性を調べることによって客観的に毒性を測定する試薬としても用いられる。

すなわち、生鮮魚介類等の代謝過程であるＡＴＰの分解過程でＨｘからキサンチンおよび尿酸が生成するＸＯＤ反応に共役して発色するホルマザン色の発色強度は対象生鮮魚介類等のＨｘの濃度を示す一方で、過去の温度履歴Ｘ時間を表す。Ｋ値および温度履歴が分かることで今の鮮度がどの状態にあるかの詳細が分かる。

ＸＯＤの反応過程を水が溶媒の例で下記に示した。

ヒポキサンチン＋Ｏ_２＋Ｈ_２Ｏ→キサンチン＋２Ｈ^＋＋Ｏ_２ ⁻
キサンチン＋Ｏ_２＋Ｈ_２Ｏ→尿酸＋２Ｈ＋＋Ｏ_２ ⁻
Ｏ_２ ⁻はスーパーオキシドアニオンである。このスーパーオキシドアニオンがテトラゾリウム塩と反応して発色する（図１参照）。

テトラゾリウム塩のピークの波長の吸光度、すなわち発色強度は、ＸＯＤの反応で生成したキサンチンおよび尿酸量を反映するとともに、酵素ＸＯＤにより分解されたＨｘの量に相当することから、予めランバート−ベールの法則に基づき、濃度既知のＨｘを用いて作成しておいた検量線（吸光度と濃度との関係式）から、発色媒体中で分解されたＨｘの量の推定が可能である。発色強度が強いほど、基質のＨｘが分解されていることを示し、すなわち生鮮魚介類等の鮮度が悪いことを示すので、発色強度を測定することにより鮮度を容易に推定することができる。

本発明の方法で検出された酵素ＸＯＤにより分解されたＨｘの量は、生鮮魚介類等の生体内で起きている任意の時点の酵素ＸＯＤの反応にほかならないから、その生鮮魚介類等の生体内で生成されたＨｘの量にほぼ等しい。従って、生鮮魚介類等の生体内で起きている酵素ＸＯＤのＨｘの分解程度から、すなわち発色強度から鮮度指標Ｋ値を推定する関数をつくり検量線を作成しておけば、本発明の方法による発色強度から、任意の時点の生鮮魚介類等のＫ値を推定することができる。

本発明の発色媒体には、Ｈｘ、ＸＯＤ、発色剤を溶解させるために溶媒が必要である。溶媒は、Ｈｘ、ＸＯＤ、発色剤を溶解するものであれば特に限定されないが、極性溶媒を用いることができる。本発明の発色媒体は、冷蔵あるいは冷凍環境下で使用するため、氷結しない冷蔵条件下では水を溶媒としてもよいが、氷結するような冷蔵あるいは冷凍環境下では、水は凍るため溶媒としては不適当である。氷点下でも凍らない不凍性の極性溶媒としては、例えばメタノール、エタノールなどの一価アルコール、エチレングリコール（ＥＧ）、1,4-ブタンジオールなどの二価アルコール、グリセロールなどの三価アルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、グルシトールなどの多価アルコールを例示することができる。

しかし、上述の採用可能な溶媒を用いても、本発明の方法では最良の結果が導き出されるとは限らない。これらの溶媒を採用するに当たっては、それぞれ最適濃度があることを考慮しなければならない。

本発明の発色媒体において、Ｈｘ、ＸＯＤ、発色剤および溶媒を含む発色剤組成物を封入する透明容器は、Ｈｘからキサンチン・尿酸を生成させるＸＯＤ反応に共役して発色するホルマザン色素の強度を計測できるものであれば、材質および形状は特に限定されない。

透明容器の材質としては、ポリアクリレート、ＡＢＳ樹脂、ポリ塩化ビニール等の高分子化合物あるいはガラス等を挙げることができる。形状は、試験管状、アンプル状、袋状いずれでもよいが、発色剤の発色強度を分光光度計で計測する場合は、内径１０ｍｍ、容量７〜８ｍｌの試験管状のものが使いやすい。

しかし、生鮮魚介類等のＫ値を計測する従来の方法では、生鮮魚介類の筋肉から測定用試料を調製しなければならず、破壊法であり、生鮮魚介類の商品価値を損なう欠点があった。また従来法は化学分析法であり、実験室的で熟練を要し、簡便な現場向き計測法ではなかった。

ＸＯＤの基質はプリン化合物分解経路で生じるＨｘであり、生鮮魚介類等の筋肉中ではＡＴＰの分解途中で生じるＨｘであるが、本発明では生鮮魚介類等の筋肉中のＨｘである必要はない。すなわち、Ｈｘそのものを基質として用いることによっても、温度履歴から鮮度を推定することが可能であることを見出した。本発明の方法では、生鮮魚介類等の筋肉を採取する必要がないため、非破壊法であり、生鮮魚介類等の商品価値を損ねることがない。従って、発色媒体は、鮮度を測定しようとする生鮮魚介類等と一緒に保蔵すればよい。魚や貝等の生鮮魚介類の場合は、トロ箱等の保蔵容器に発色媒体を装入すればよい。

ＸＯＤ反応は一般酵素反応と同じように温度依存性である。予め、Ｈｘ、ＸＯＤ、発色剤および溶媒を適当な透明容器に封入した発色媒体を用意し、この発色媒体を水揚げ後の生鮮魚介類の入ったトロ箱等貯蔵容器に装入しておけば、その発色媒体が置かれた温度環境に応じた発色強度を示す。すなわち、ある任意の時点の発色強度は鮮度指標Ｋ値を示すと共に、生鮮魚介類等の置かれた環境の温度履歴にも相当する。

生鮮魚介類が適正に冷蔵・冷凍保存されていれば、すなわち、温度が氷点下程度に保たれていれば、ＸＯＤの反応は進まないから発色しないが、氷点下よりも高い温度に置かれた場合は、ＸＯＤ反応が進むから発色する。この発色媒体の発色強度を計測することによって、今置かれた生鮮魚介類等の鮮度の状態（Ｋ値）を把握することが可能になる。

従って、予め発色媒体の発色強度とＫ値の関係を求めて検量線を作成しておけば、発色媒体の発色強度からＫ値を求めることができる。

生鮮魚介類の鮮度低下の様式を予め計測し、一定時間毎の発色強度をデータベース化しておけば、その時の発色強度から、その時の鮮度の状態を把握することが可能となるだけでなく、以下の生可食残存日数の式により生可食残存日数を推定することも可能となる。

貯蔵中のＫ値変化が一次反応であると仮定して、貯蔵中におけるＫ値変化を図２に示した。ここで、Ｋ_２は生可食限界のＫ値、Ｋ_０は限りなく新鮮な状態のＫ値、すなわち漁獲あるいは水揚げ直後の生鮮魚介類のＫ値を示す。図２より１日当たりのＫ値上昇率を求めると、例えば、５℃貯蔵では１／８＝０．１２５となり、１日当たりのＫ値は生可食限界値に達するまで１２．５％ずつ増大していくことになる。図３はこの状態を示したもので、−１０℃以下の貯蔵であればＫ値の増加は穏やかであるが、−１０℃を超えるとＫ値は急激に増大している。

貯蔵管理の徹底を図ることにより、任意の時点におけるＫ値は積算温度の影響を表していると考えることができる。それ故に、任意の時点のＫ値（Ｋ）は、
Ｋ＝ΣＥ_ｔ×Ｘ_ｔ＝（Ｋ_２−Ｋ_０）Σ（Ｘ_ｔ／Ｔ_ｔ） （４）
と表すことができる。ここでＥ_ｔはｔ℃におけるＫ値上昇率で、（Ｋ_２−Ｋ_０）／Ｔ_ｔで表すことができる。Ｔｔはｔ℃で保存された生鮮魚介類の生可食（刺身）としての許容日数を、Ｘｔはｔ℃に保存された日数を表す。

上記式（４）のＫが求まれば、任意の時点以降のｔ℃貯蔵における生可食残存日数（ＲＤＶ_ｔ）は式（１）で表すことができる。

ＲＤＶ_ｔ＝［Ｔ_ｔ（Ｋ_２−Ｋ’）／（Ｋ_２−Ｋ_０）］ （１）
なお、式（１）は、
ＲＤＶ_ｔ＝Ｔ_ｔ［Ｋ_２／（Ｋ_２−Ｋ_０）−Σ（Ｘ_ｔ／Ｔ_ｔ）］ （５）
と書き直すこともできる。

図４にＲＤＶ_ｔの関係式を示した。例えば、−２０℃に貯蔵した場合に、刺身として食べることが可能な残存日数（ＲＤＶ_−２０）を式（１）あるいは式（５）により求めることできる。

ＲＤＶ_−２０＝８５（２０−Ｋ’）／（２０−３）＝１００−５Ｋ’
となり、請求項１ないし６に記載した本発明により生鮮魚類任意の時点のＫ値を求めれば、−２０℃に貯蔵した時の生鮮魚類の刺身として食べられることが可能な残存日数を式（１）により求めることができる。

さらに、保存温度毎に検量線を作成し、生鮮魚介類の種別や鮮度変化の特徴や様式をデータベース化することで、個々の種類だけでなく、多種の生鮮魚類にも対応が可能となる。鮮度の推定を簡便に行うには例えば、図５に示したように発色強度と生可食残存日数や鮮度値Ｋ値を印刷した色見本を発色媒体に貼付しておけば、発色媒体の発色強度を目視で測定し、生可食残存日数や鮮度を簡便に推定することができる。

最近、トレーサビリティの一手段として電子荷札（ＩＣタグ）や温度記録子（データロガ）の利用が始まりつつある。電子荷札は信号を記録する部分と発信する部分からなり、生産者や生産状況の記録、流通の記録等の情報が得られる。温度記録子は一定時間毎の温度を一定回数分記録する機能をもつ。

前者は任意の時点の情報をインプットすることは可能であっても、任意の時点の対象物の状態を測定するものではない。後者は任意の時点における対象物の置かれた環境を計測するものであるが、任意の時点の対象物の状態は計測できない。両者とも、その情報を読み取ったり、解析するためには、コンピュータ（以下、「ＰＣ」と略称する）などに取り込む必要があり、ＰＣやスキャナーなどの解析装置、読み取り装置が必要である。両者とも電子媒体であるが、非対象物の状態を計測するものではない。

一方、本発明の方法はある意味で温度記録子と類似する点を持つ。温度記録子は一定時間毎の温度を一定回数記録するが、ＰＣに取り込んで処理することによって、積算温度や平均温度、温度の変化等の解析が可能である。これらの内、積算温度は時間の関数であり、被対象物の温度履歴の総和に等しい。一定に温度環境に被対象物が置かれた場合、特に本発明の被対象物のように温度依存性のある酵素反応を指標とするものでは、冷蔵・冷凍環境下と、常温環境下とでは同じ積算温度であっても後者の反応時間は早いものとなる。すなわち、被対象物の置かれた温度環境に依存する。このことは、被対象物がどのような温度環境に置かれていたかの温度履歴を示す。

本発明の方法は、被対象物（生鮮魚介類等）の任意の時点の状態（鮮度）を計測するものであり、その状態からどのような温度環境下に置かれていたかの追跡が可能であり、その時点での鮮度の状態の把握が可能であり、さらに任意の時点での被対象物の状態から将来の被対象物の状態変化を推定することができる。そして、本発明の方法は非電子的（非電磁波情報媒体）である。

なお、Ｈｘ、ＸＯＤ、発色剤および溶媒を含む発色剤組成物を封入した透明容器は、生鮮魚介類等の鮮度推定用または生鮮魚介類生可食残存日数推定用のキットとして最適である。

以下に、本発明の実施形態を更に詳細に説明する。

本発明の生鮮魚介類の生可食残存日数推定方法は、Ｋ値を指標にした生可食残存日数をＸＯＤによるＨｘの酸化反応に共役して発色するテトラゾリウム塩発色強度から推定する原理に基づくものである。

本発明を実施する一形態としては、極性溶媒に基質Ｈｘとテトラゾリウム塩を加え、例えば、テトラゾリウム塩としてＭＴＴを用いた場合はTris−塩酸緩衝液でｐＨ７．８に調製した溶液をガラス管等の透明容器に注入し、所定単位のＸＯＤを加えて密栓し発色媒体を調製し、この発色媒体を貯蔵される生鮮魚介類等と一緒にセットする。保蔵容器の置かれた環境が常温で温度履歴が増加する場合は発色し、氷蔵された場合は発色しない（図６）。

使用するＸＯＤの最適ｐＨは弱塩基性領域にあるため、使用するテトラゾリウム塩や極性溶媒の種類によっては緩衝液を用いてｐＨを一定に保つ必要がある。

ｐＨ調整はTris-塩酸の他に、HEPES（2-[4-(2-ヒドロキシル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸）などの使用が可能であるが、使用するテトラゾリウム塩の種類によって使い分ける必要がある。また、テトラゾリウム塩の種類によっても条件が異なる。

具体低的には、極性溶媒の一定量に基質（Hx）とテトラゾリウム塩の一定量を作成し、このｐHを調整した後、内径１０ｍｍのガラス管等の透明容器に収めた発色液を準備する。次に、一定の酵素単位（unit）になるように溶解したＸＯＤの酵素液を用意する。酵素液は一定量をバイアル瓶に溶解しておき、必要に応じて、その一部を注射筒などで取り出し、発色液と混合して透明容器を密封して発色媒体とする。あるいは、酵素の必要単位をガラス管等の透明容器に取り、必要時に溶媒に溶解して酵素液とし、これを発色液と混合して透明容器を密封し、発色媒体としてもよい。

発色媒体を生鮮魚介類等を収蔵あるいは貯蔵する容器に入れて、経時的に発色する強度を光電比色計で測定し、その吸光度から、その時点の鮮度の度合い、すなわちＫ値を推定する。予め作成しておいた色見本と目視で比べることで発色強度を測り、鮮度を推定しても構わない。また、実験室的に分光光度計を用いてもよい（図７）。

発色媒体の透明容器としては、内径１０ｍｍ、容量７〜８ｍｌのガラス管が使いやすい。発色強度は予め作成した色見本と比較する目視法、あるいはランバート−ベールの法則（Lambert-Beer Low）に基づいた光電比色系や分光光度計で定量されるが、後者の場合、光路長はガラス管の内径そのものであり、１０mmであることが望ましい。

図５に本発明の発色媒体を用いて生可食残存日数を推定する一実施形態を示す。図５に示した発色媒体は、試験管状の内径１０ｍｍ、容量７〜８ｍｌのガラス管に上述の発色剤組成物を注入し、密栓したものである。発色媒体は、温度履歴の増加によって、発色剤が発色するので、例えば図示したように発色媒体に刺身としての残存賞味期限を色見本で印刷したものを添付しておけば、発色媒体の発色強度を目視で観察することにより、発色媒体と一緒に保蔵した生鮮魚介類の生可食残存日数を簡便に推定することができる。

上述したランバート−ベールの法則とは、光が均質な物質層を透過するときの光の吸収に関する法則で、吸収層の厚さ依存性と溶液の濃度依存性を合わせて吸収の強さを示し、下記の式で表される。

Ｉ＝Ｉ_０×ｅ^−κｃｌ （６） Ｉ_０：入射光の強度
Ｉ＝Ｉ_０×１０^−εｃｌ （７） Ｉ：透過光の強度
ｌ：吸収層の厚さ（光路長）
ｃ：吸収物質の濃度
κ：モル吸収係数（定数）
ε：モル吸光係数（定数）、cm^-1・mol^-1・ｌ
Ａ＝ｌｏｇ_１０（Ｉ_０／Ｉ） （８） Ａ：吸光度
従って、吸光度が解れば物質の濃度が解る。

酵素濃度・基質濃度・発色剤濃度の検討
基質Ｈｘにテトラゾリウム塩ＭＴＴの存在下でそれぞれの濃度の酵素ＸＯＤを作用させ、生成したホルマザン色素の発色強度を吸光度５６５ナノメートルで測定した。Ｈｘの濃度を０．５グラム毎リットルとし、ＸＯＤの濃度を０．１・０．３・０．５・１．０酵素単位とし、エタノール（以下、「EtOH」と略称する）８０パーセント不凍液中で室温（２５．５℃）で反応させた（図８）。

テトラゾリウム塩ＭＴＴ、酵素ＸＯＤの存在下でそれぞれの濃度の基質Ｈｘを添加し、生成したホルマザン色素の発色強度を吸光度５６５ナノメートルで測定した。ＭＴＴの濃度は０．５グラム毎リットル、ＸＯＤの濃度は０．３酵素単位とし、ＨｘＲの濃度を０．１、０．２５、０．４、０．５５グラム毎リットルとし、EtOH８０パーセント不凍液中で室温（２５．５℃）で反応させた（図９）。

基質Ｈｘ、酵素ＸＯＤの存在下でそれぞれの濃度のテトラゾリウム塩ＭＴＴを添加し、生成したホルマザン色素の発色強度を吸光度５６５ナノメートルで測定した。Ｈｘの濃度は０．４グラム毎リットル、ＸＯＤの濃度は０．３酵素単位とし、ＭＴＴの濃度を０．１、０．２５、０．４、０．５５グラム毎リットルとし、EtOH８０パーセント不凍液中で室温（２５．５℃）で反応させた（１０図）。

その結果、ＸＯＤ：０．３酵素単位毎４ミリリットル、Ｈｘ：１．６ミリグラム毎４ミリリットル、ＭＴＴ：１．６ミリグラム毎４ミリリットルが最適濃度であった。

そこでＸＯＤ：０．３酵素単位毎４ミリリットル、Ｈｘ：１．６ミリグラム毎４ミリリットル、ＭＴＴ：１．６ミリグラム毎４ミリリットルの濃度のEtOH８０パーセント溶液からなる発色剤組成物を調整し、内径１０ｍｍのガラス管に７ｍｌ注入したのち密栓し発色媒体を調製し、鮮度測定用キットを作成した。

Ｋ値と発色強度との関係
実施例１で作成したキットをサンマ・マサバ・イワシの小型魚種とともに５℃および０℃環境下に置いた。発色媒体の発色強度の経時変化を測定するとともに、サンマ・マサバ・イワシの５℃および０℃環境下、HPLCでＫ値を測定し、検量線を作成した（図１１，図１２）。

サンマ・マサバ・イワシのＫ値変化のパターンはほぼ同じで、これらと発色媒体のとの間には良好な相関関係（0℃:R=0.95、5℃:R=0.95）があった。

水揚げ時に実施例１で作成した鮮度測定用キットを用意し、このキットをトロ箱等収蔵容器中の魚介と一緒に置き、漁港から東京まで輸送した。その際、温度計測用のセンサーも同時にトロ箱等収蔵容器内の数カ所に設置した。試験開始時は１０℃あったが、まもなく０℃にまで下降した。１０時間後東京へ到着したが、その時の温度上昇はほとんどなかった。キットの発色媒体の発色は無色のままであった。トロ箱等収蔵容器をそのまま常温に置き、なおも観察を続けた。１８時間後にわずかに着色したので吸光度を測定し、０．４０の吸光度を得た。この時の温度は１℃であった。この吸光度から鮮度値Ｋ値は１５．２％と推測され、生食可と判定された（Ｙ＝７．９５Ｘ＋１２）。２４時間後にはトロ箱等収蔵容器内の氷も溶け、発色媒体の吸光度は１．１９、Ｋ値は１９．９％で食限界と判定された（Ｙ＝１４．５Ｘ＋２．６）。この時の温度は５℃であった。３０時間を超える頃には常温となり、腐敗が始まり悪臭が漂っていた。

請求項１〜５に記載された本発明方法は、生鮮魚介類等の鮮度を非破壊的に推測することができるので、生鮮魚介類等の流通、販売において有用である。

請求項６〜９に記載された本発明方法は、生鮮魚介類の生可食残存日数を非破壊的に推測することができるので、生鮮魚介類の流通、販売において有用である。

請求項１０〜１３に記載されたキットは、生鮮魚介類等の鮮度推定用もしくは生鮮魚介類生可食残存日数推定用のキットとして有用である。

キサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）の反応様式を示す説明図 各温度における貯蔵時間とＫ値の関係を示すグラフ 貯蔵温度とＫ値上昇率との関係を示すグラフ 貯蔵日数とＫ値から導き出した生可食残存日数の関係を示すグラフ 発色媒体により生可食残存日数を推定する一実施形態を示す説明図 発色媒体の一実施形態を示すフロー図 発色強度の計測の一実施形態を示すフロー図 実施例１、酵素濃度の検討を示すグラフ 実施例１、基質濃度の検討を示すグラフ 実施例１、発色剤濃度の検討を示すグラフ 実施例２、Ｋ値と吸光度との関係（５℃）を示すグラフ 実施例２、Ｋ値と吸光度との関係（０℃）を示すグラフ

Claims (13)

1. ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入して発色媒体とし、該発色媒体を生鮮魚介類、獣肉または家禽肉と一緒に保蔵し、任意の時点で発色媒体の発色強度を測定し、測定した発色強度の強弱をもとに生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度を推定することを特徴とする生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
2. 前記発色剤がテトラゾリウム塩であることを特徴とする請求項１に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
3. 前記溶媒が、不凍性の極性溶媒であることを特徴とする請求項１または２に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
4. 前記鮮度の推定を、予め発酵強度とＫ値の検量線を作成し、測定した発色強度からＫ値を求めることを特徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
5. 前記発酵強の測定および鮮度の推定を、色見本を用いて目視法で行うことを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度の非破壊的評価方法。
6. ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入して発色媒体とし、該発色媒体を生鮮魚類が保蔵された保蔵容器内に配置し、任意の時点で発色媒体の発色強度を測定し、測定した発色強度の強弱をもとに生鮮魚類のＫ値を推定し、式（１）
   ＲＤＶ_ｔ＝［Ｔ_ｔ（Ｋ_２−Ｋ’）／（Ｋ_２−Ｋ_０）］ （１）
   （ただし式（１）中、ＲＤＶ_ｔ：ｔ℃貯蔵における生可食残存日数
   Ｔ_ｔ：ｔ℃保存における生食としての許容限界日数
   Ｋ_２：生食として食せる許容限界のＫ値
   Ｋ_０：非常に新鮮な生鮮魚類のＫ値
   Ｋ’：測定した時点のＫ値の推定値を示す。）
   で表される式により生可食残存日数を算定することを特徴とする生鮮魚類の生可食残存日数の推定方法。
7. 前記発色剤がテトラゾリウム塩であることを特徴とする請求項６に記載の生鮮魚類生可食残存日数の推定方法。
8. 前記溶媒が、不凍性の極性溶媒であることを特徴とする請求項６または７に記載の生鮮魚類生可食残存日数の推定方法。
9. 前記発酵強の測定および鮮度の推定を、色見本を用いて目視法で行うことを特徴とする請求項６ないし８のいずれか１項に記載の生鮮魚類の生可食残存日数の推定方法。
10. ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入したことを特徴とする生鮮魚介類、獣肉または家禽肉の鮮度推定用のキット。
11. ヒポキサンチンがキサンチンオキシダーゼによってキサンチンと尿酸に分解する反応に共役して発色する発色剤、ヒポキサンチン、キサンチンオキシダーゼおよび溶媒を含む発色剤組成物を透明容器に封入したことを特徴とする生鮮魚類生可食残存日数推定用のキット。
12. 前記発色剤がテトラゾリウム塩であることを特徴とする請求項１０または１１に記載のキット。
13. 前記溶媒が、不凍性の極性溶媒であることを特徴とする請求項１０または１１に記載のキット。

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