JP2005321531A

JP2005321531A - 走査型レーザ顕微鏡装置

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Publication number: JP2005321531A
Application number: JP2004138623A
Authority: JP
Inventors: Hironori Kishida; 浩徳岸田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-05-07
Filing date: 2004-05-07
Publication date: 2005-11-17

Abstract

【課題】簡易な構成で試料からの光を正確に反映した良質の画像が取得できる走査型レーザ顕微鏡装置を提供すること。
【解決手段】電荷を蓄積するコンデンサ１０１と、電荷を放電させるスイッチ１０２と、電荷を抵抗１０４を介して放電させるスイッチ１０３と、電荷をデジタル値に変換するＡ／Ｄ変換器１０７と、デジタル値を加算する加算部１０８と、Ａ／Ｄ変換器１０７からと加算部１０８からと入力とを選択する選択部１０９と、電荷をデジタル値に変換するとともにスイッチ１０２によって放電する制御と、電荷をデジタル値に変換するとともにスイッチ１０３によって放電し、デジタル値を加算部１０８によって加算する制御とを行う制御部２７と、を備える。
【選択図】図２

Description

本発明は、試料にレーザ光を照射しつつ走査し、試料から発する光を観察する走査型レーザ顕微鏡装置に関するものである。

従来、レーザ光を試料に照射しつつ走査し、試料から発する光、あるいは試料を反射する光を光検出器によって電気信号に変換し、この電気信号を画像信号に変換して試料からの光を画像化する走査型レーザ顕微鏡装置が多用されている。この電気信号の処理技術として、光検出器からのノイズを減少させるため、コンデンサを用いて、コンデンサに充電された電荷を所定の周期で放電させる積分回路が知られている（特許文献１参照）。

特開平６−３３１８９２号公報

ところで、近年、生物試料の時間的変動を短い時間周期で観察することが求められている。このような場合、画像信号の分解能を確保しつつレーザ光を高速走査するために、上述したコンデンサの充放電サイクルを短くして対応している。しかしながら、コンデンサの放電には、所定時間を要するため、走査速度を速くすると、充電時間に対する放電時間の割合が高くなる。コンデンサを用いる積分回路では、原理的に放電中は、光検出器からの電気信号は取り込めないため、レーザ光を高速に走査させると放電時の電気信号の損出の影響が無視できなくなり、結果的に試料からの光を正確に反映した画像が取得できないという問題点があった。

また、試料からの光が非常に暗い場合、コンデンサに充電される電荷の信号成分に対するノイズ成分の比率が高くなり、Ｓ／Ｎ比が小さい画像しか取得できないという問題点があった。

本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、簡易な構成で試料からの光を正確に反映した良質な画像が取得できる走査型レーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、請求項１にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、レーザ光を試料に照射しつつ所定の走査速度で走査し、前記試料から発する光を光検出手段によって検出して電気信号に変換し、該変換された電気信号を画像表示する走査型レーザ顕微鏡装置において、前記電気信号の電荷を蓄積する電荷蓄積手段と、接地された第１のスイッチを有し、該第１のスイッチの閉によって前記電荷を接地して放電させる第１の放電手段と、抵抗を介して接地された第２のスイッチを有し、該第２のスイッチの閉によって前記電荷を前記抵抗を介して接地して放電させる第２の放電手段と、前記電荷をデジタル値に変換するデジタル変換手段と、前記デジタル値を加算する加算手段と、前記デジタル変換手段からの第１の入力と前記加算手段からの第２の入力とを選択して出力する選択手段と、前記レーザ光が１画素に対応する領域を走査する第１の周期に同期して前記電荷を前記デジタル変換手段によって前記デジタル値に変換するとともに前記第１の放電手段によって前記電荷を放電する第１の制御と、前記第１の周期に比して短い第２の周期に同期して前記電荷を前記デジタル変換手段によって前記デジタル値に変換するとともに前記電荷を前記第２の放電手段によって放電し、該デジタル値を前記加算手段によって加算し、該加算結果を前記第１の周期に同期して前記選択手段に出力する第２の制御とを行い、前記第１の制御時に前記第１の入力を選択指示し、前記第２の制御時に前記第２の入力を選択指示する制御手段と、を備えたことを特徴とする。

また、請求項２にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、他の抵抗を介して接地された第３のスイッチを有し、該第３のスイッチの閉によって前記電荷を前記他の抵抗を介して接地して放電させる第３の放電手段と、前記デジタル変換手段から出力された前記デジタル値を所定の閾値と比較し、該所定の閾値以上の前記デジタル値を計数する計数手段と、をさらに備え、前記選択手段は、前記計数手段からの第３の入力を含めて選択出力し、前記制御手段は、前記第１の周期に比して短い第３の周期に同期して前記電荷を前記デジタル変換手段によって前記デジタル値に変換するとともに前記電荷を前記第３の放電手段によって放電し、該デジタル値を前記計数手段によって計数させ、該計数結果を前記第１の周期に同期して前記選択手段に出力する第３の制御をさらに行い、前記第１の制御時に前記第１の入力を選択指示し、前記第２の制御時に前記第２の入力を選択指示し、前記第３の制御時に前記第３の入力を選択指示することを特徴とする。

また、請求項３にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記他の抵抗の抵抗値は、前記デジタル変換手段が前記第３の周期によるサンプリングを満足する範囲内の微小な抵抗値であることを特徴とする。

また、請求項４にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記選択手段は、前記所定の走査速度が遅い場合、前記第１の入力を選択し、前記所定の走査速度が速い場合、前記第２の入力を選択することを特徴とする。

また、請求項５にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記選択手段は、前記試料から発する前記光が暗い場合、前記第３の入力を選択することを特徴とする。

また、請求項６にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記画像表示によって表示された前記電気信号に応じて、前記第１の入力、前記第２の入力、あるいは前記第３の入力のいずれか一つを選択する指示を前記選択手段に対して行う指示手段をさらに備えたことを特徴とする。

また、請求項７にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、上記の発明において、前記抵抗は、可変抵抗であり、前記加算手段は、前記可変抵抗の抵抗値に応じてデジタル変換したデジタル値を加算演算し、この加算演算した加算値のうちの所定の下位ビットを削除して出力することを特徴とする。

本発明にかかる走査型レーザ顕微鏡装置は、レーザ光の走査速度に対応して光検出器から出力された電気信号の処理方法を切り替えることによって、試料からの光を正確に反映した良質な画像が取得できるという効果を奏する。

以下に添付図面を参照して、この発明にかかる走査型レーザ顕微鏡装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。

（実施の形態１）
図１は、この発明の実施の形態１である走査型レーザ顕微鏡装置１００の概要構成を示すブロック図である。図１において、この走査型レーザ顕微鏡装置１００は、レーザ光源１と、ビームエキスパンダ２と、波長フィルタ３と、ダイクロイックミラー４と、ガルバノ５と、瞳投影レンズ６と、プリズム７と、対物レンズ８と、レンズ１０と、ミラー１１と、レンズ１２と、光検出器１３と、フレームメモリ１４と、集光レンズ１５と、ダイクロイックミラー１６と、ミラー２１と、ダイクロイックフィルタ２２と、吸収フィルタ１７，２３と、ピンホール１８，２４と、光検出器１９，２５と、測定部２０，２６と、制御部２７と、表示部２８と、入力部２９とを有している。

まず、レーザ光源１から出射されたレーザ光は、ビームエキスパンダ２、波長フィルタ３ダイクロイックミラー４、ガルバノ５、瞳投影レンズ６、プリズム７、対物レンズ８を順次介して試料９に入射する。試料９に入射したレーザ光の一部は、試料を透過して透過光となり、レンズ１０、ミラー１１、レンズ１２を順次介して光検出器１３に入射する。光検出器１３は、入射した透過光を電気信号に変換し、電気信号は、Ａ／Ｄ変換されてフレームメモリ１４に格納される。

一方、試料９に入射したレーザ光は、一部は、試料９で反射された反射光となり、一部は、試料９で吸収され、試料９から蛍光が発さられる。反射光と蛍光とは、試料９に入射したレーザ光と同じ光路をダイクロイックミラー４まで逆行し、ダイクロイックミラー４を透過する。ダイクロイックミラー４を透過した反射光と蛍光とは、集光レンズ１５を介してダイクロイックミラー１６に入射する。ダイクロイックミラー１６に入射した反射光は、ダイクロイックミラー１６で反射され、吸収フィルタ１７、ピンホール１８を順次介して光検出器１９に入射する。光検出器１９に入射した反射光は、電気信号に変換されて測定部２０に出力される。測定部２０に出力された電気信号は、画像信号に変換されて制御部２７に出力され、制御部２７は、出力された画像信号を入力部２９からの指示にしたがって表示部２８に反射光画像として出力表示させる。また、ダイクロイックミラー１６に入射した蛍光は、ダイクロイックミラー１６を透過し、ミラー２１、ダイクロイックフィルタ２２、吸収フィルタ２３、ピンホール２４を順次介して光検出器２５に入射する。光検出器２５に入射した蛍光は、電気信号に変換され、測定部２６、制御部２７を順次介して表示部２８に蛍光画像として出力表示される。

つぎに、測定部２０，２６の動作について詳細に説明する。光検出器１９，２５と測定部２０，２６とは、同一機能を有し、同一動作を行う。図２は、測定部２０，２６の概要構成を示すブロック図である。測定部２０，２６は、光検出器１９，２５から入力した電気信号Ｉの電荷を蓄積するコンデンサ１０１と、コンデンサ１０１に蓄積された電荷を接地させて放電させるスイッチ１０２と、コンデンサ１０１に蓄積された電荷を抵抗値Ｒ１の抵抗１０４を介して接地して放電させるスイッチ１０３と、スイッチ１０２，１０３を駆動するスイッチ駆動部１０５と、コンデンサ１０１に蓄積された電荷の電圧値Ｖ_INを所定の比率で増幅するアンプ１０と、アンプ１０で増幅された電圧値であるアナログ値をデジタル値に変換するＡ／Ｄ変換器１０７と、Ａ／Ｄ変換器１０７で変換されたデジタル値を加算して加算値を出力する加算部１０８と、Ａ／Ｄ変換器１０７で変換されたデジタル値と加算部１０８で加算された加算値とのいずれかを選択して制御部２７に出力する選択部１０９とを有している。制御部２７は、スイッチ駆動部１０５と、Ａ／Ｄ変換器１０７と、加算部１０８と、選択部１０９とを制御している。

スイッチ駆動部１０５は、制御部２７の制御のもと、制御信号Ｓ１，Ｓ２によってスイッチ１０２，１０３を駆動制御している。また、Ａ／Ｄ変換器１０７は、制御部２７の制御のもと、制御信号Ｓ３Ａ，Ｓ３Ｂによってサンプリングするタイミングが制御されている。また、加算部１０８と選択部１０９とは、制御部２７の制御のもと、入出力が制御されている。

図３は、加算部１０８の概要構成を示すブロック図である。加算部１０８は、加算器１０８１を有し、Ａ／Ｄ変換器１０７から出力されたデジタル値を加算し、制御部２７からの制御のもと、加算結果である加算値を選択部１０９に出力している。

つぎに、レーザ光の走査速度に対応して測定部２０，２６が行う２種類の異なる信号処理について説明する。この発明の実施の形態１では、レーザ光の走査速度が遅い場合、光検出器１９，２５から出力された電気信号Ｉの電荷を所定時間コデンサ１０１に蓄積し、蓄積された電荷の電圧値から画像信号を取得するようにしている。また、レーザ光の走査速度が速い場合、光検出器１９，２５から出力された電気信号Ｉを抵抗１０４を介して放電して電圧値に変換し、この電圧値を所定時間加算し、加算結果である加算値から画像信号を取得するようにしている。

レーザ光の走査速度が遅い場合、図２において、光検出器１９，２５から電気信号Ｉが出力され、制御信号Ｓ１によってスイッチ１０２が「開」になり、制御信号Ｓ２によってスイッチ１０３が「開」になり、コンデンサ１０１に電気信号Ｉの電荷が蓄積される。この蓄積された電荷は時間の経過とともに増加し、電荷の増加とともにアンプ１０６に印加される電圧値Ｖ_INも増加する。電圧値Ｖ_INは、アンプ１０６によって増幅されてＡ／Ｄ変換器１０７に入力される。Ａ／Ｄ変換器１０７は、制御信号Ｓ３Ａによってサンプリングのタイミングが制御され、制御信号Ｓ３Ａによってサンプリングしたアナログ値をデジタル値に変換し、選択部１０９に出力する。選択部１０９は、制御部２７の制御のもと、デジタル値を制御部２７に出力する。制御部２７は、入力部２９からの指示のもと、入力したデジタル値を画像信号に変換して表示部２８に出力し、出力表示させる。

一方、レーザ光の走査速度が速い場合、図２において、光検出器１９,２５から電気信号Ｉが出力され、制御信号Ｓ１によってスイッチ１０２が「開」になり、制御信号Ｓ２によってスイッチ１０３が「閉」になり、電気信号Ｉは、抵抗値Ｒ１の抵抗１０４を介して放電される。電気信号Ｉの電荷は、抵抗１０４を介することによって電圧値Ｖ_INに変換され、電圧値Ｖ_INがアンプ１０６に印加される。電圧値Ｖ_INは、アンプ１０６によって増幅されてＡ／Ｄ変換器１０７に入力される。Ａ／Ｄ変換器１０７は、制御信号Ｓ３Ｂによってサンプリングのタイミングが制御され、制御信号Ｓ３Ｂによってサンプリングしたアナログ値をデジタル値に変換し、加算部１０８に出力する。加算部１０８は、制御部２７の制御のもと、入力したデジタル値を加算し、加算結果である加算値を選択部１０９に出力する。選択部１０９は、制御部２７の制御のもと、加算値を制御部２７に出力する。制御部２７は、入力部２９の指示のもと、入力した加算値を画像信号に変換して表示部２８に出力し、出力表示させる。

図４に、レーザ光の走査速度が遅い場合におけるＡ／Ｄ変換器１０７に入力する電圧値の時間変化と制御信号Ｓ１，Ｓ３Ａの「ＯＮ」「ＯＦＦ」のタイミングチャートとを示す。図４に示すように、Ａ／Ｄ変換器１０７に入力する電圧値は、時刻ｔ０〜ｔ１，時刻ｔ２〜ｔ３において、コンデンサ１０１に電荷が蓄積されるとともに増加し、時刻ｔ１〜ｔ２，時刻ｔ３〜ｔ４において、電荷が放電されるとともに減少する。制御信号Ｓ１は、時刻ｔ０〜ｔ１，時刻ｔ２〜ｔ３において「ＯＮ」となり、これにともなって、スイッチ１０２は、「開」となる。時刻ｔ１〜ｔ２，時刻ｔ３〜ｔ４において「ＯＦＦ」となり、これにともなって、スイッチ１０２は、「閉」となる。制御信号Ｓ３Ａは、時刻ｔ１，ｔ３の直前に「ＯＮ」になる。これによって、コンデンサ１０１に蓄積された電荷が放電される直前の電圧値がＡ／Ｄ変換器１０７によってサンプリングされてデジタル値に変換される。この場合、時刻ｔ０〜ｔ２までに取得された画像信号が１画素に対応し、時刻ｔ２〜ｔ４までが次の１画素に対応している。

つまり、スイッチ１０２が「開」となっている間、コンデンサ１０１に電荷が蓄積され、スイッチ１０２が「閉」となると、蓄積された電荷は、放電される。これに対応して、Ａ／Ｄ変換器１０７は、コンデンサ１０１に蓄積された電荷が放電される直前の電圧値をデジタル値に変換し、このデジタル値を１画素分の画像信号としている。１画素分の時間は、時刻ｔ０〜ｔ２，時刻ｔ２〜ｔ４に対応しているが、放電時（時刻ｔ１〜ｔ２，時刻ｔ３〜ｔ４）の電圧値は、デジタル値に変換されず、画像信号は、取得されない。

つぎに、図５に、レーザ光の走査速度が速い場合におけるＡ／Ｄ変換器１０７でサンプリングされたデジタル値と加算部１０８から出力される加算値との時間変化と制御信号Ｓ２，Ｓ３Ｂの「ＯＮ」「ＯＦＦ」のタイミングチャートとを示す。図５に示すように、Ａ／Ｄ変換器１０７から出力されるデジタル値の時間間隔Δｔは、サンプリング間隔に対応し、加算部１０８で積算される加算値は、時刻ｔ０〜ｔ２，時刻ｔ２〜ｔ４において、時間間隔Δｔのデジタル値を加算したものである。制御信号Ｓ２は、Ａ／Ｄ変換器１０７がサンプリングを開始する前に「ＯＮ」となり、スイッチ１０３は、「閉」となる。制御信号Ｓ３Ｂは、時刻ｔ０から時間間隔Δｔで「ＯＮ」となる。この場合、時刻ｔ０〜ｔ２においてサンプリングされたデジタル値を加算した加算値を画像信号に変換したものが１画素に対応し、時刻ｔ２〜ｔ４までが次の１画素に対応している。

つまり、スイッチ１０３が「閉」となっている間、光検出器１９，２５から出力された電気信号Ｉは、抵抗値Ｒ１の抵抗１０４を介して放電されるため、電圧値Ｖ_INに変換される。したがって、電気信号Ｉの変動は、電圧値Ｖ_INの変動に変換される。そこで、この電圧値Ｖ_INを１画素に対応した時間である時刻ｔ０〜ｔ２，時刻ｔ２〜ｔ４まで加算すると、１画素分の画像信号が取得できる。

つぎに、選択部１０９がＡ／Ｄ変換器１０７から出力されたデジタル値を選択する場合と、加算部１０８から出力された加算値を選択する場合とを模式図６を参照して説明する。図６において、ケース１は、レーザ光の走査速度が遅い場合を示し、ケース２は、レーザ光の走査速度が速い場合を示している。ケース１の場合、測定時間（電荷蓄積時間）である時刻ｔ０〜ｔ１，時刻ｔ２〜ｔ３に比して未測定時間（放電時間）である時刻ｔ１〜ｔ２，時刻ｔ３〜ｔ４は短い。したがって、選択部１０９は、測定時間に比して未測定時間が無視できるため、Ａ／Ｄ変換器１０７から出力されたデジタル値を選択し、制御部２７は、電気ノイズが小さい画像が取得できる。

一方、ケース２の場合、測定時間である時刻ｔ０〜ｔ２，時刻ｔ２〜ｔ４に比して未測定時間である時刻ｔ１〜ｔ２，時刻ｔ３〜ｔ４は長い。このような場合、未測定時間において、損失した信号の影響は、無視できなくなるため、選択部１０９は、加算部１０８から出力された加算値を選択し、制御部２７は、信号損失のない画像が取得できる。

したがって、レーザ光の走査速度に対応して信号処理を切り替えることによって、レーザ光の走査速度が遅い場合であっても速い場合であっても、試料を正確に反映した良質な画像が取得できる。

この実施の形態１では、レーザ光の走査速度に応じて信号処理の方法を切り替えるようにしている。このようにすると、レーザ光の走査速度が遅い場合は、電気ノイズの小さい画像が取得でき、レーザ光の走査速度が速い場合は、信号損失のない画像が取得できる。

なお、この実施の形態１では、電気信号Ｉを充放電するためのスイッチ１０２と抵抗１０４を介して放電させるスイッチ１０３とを個別に設けていたが、図７に示すように、双方に対応するスイッチ１１０を用いてもよい。

また、信号の処理方法は、レーザ光の走査速度に応じて入力部２９を介して手動によって切り換えるようにしていたが、レーザ光の走査速度から測定時間と未測定時間との比率を演算し、この比率をもとに自動的に切り換えるようにしてもよい。

（実施の形態２）
つぎに、この実施の形態２について説明する。実施の形態１では、レーザ光の走査速度に応じて光検出器からの電気信号の信号処理方法を切り替えるようにしていたが、この実施の形態２では、光検出器からの微弱な電気信号を増大させた抵抗を介して放電することによって電圧値を増幅させ、画像信号の分解能を擬似的に高くするようにしている。

図８は、この発明の実施の形態２である走査型レーザ顕微鏡装置２００の概要構成を示すブロック図である。図８において、この走査型レーザ顕微鏡装置２００は、制御部２７に代えて制御部２２７を配置し、測定部２０，２６に代えて測定部２２０，２２６を配置している。なお、図１と同一の構成部分には、同一の符号を付している。

つぎに、測定部２２０，２２６の動作について説明する。図９は、測定部２２０，２２６の概要構成を示すブロック図である。図９において、抵抗１０４に代えて抵抗２０４を配置し、加算部１０８に代えて加算部２０８を配置している。また、抵抗２０４の抵抗値Ｒ２は、抵抗１０４の抵抗値Ｒ１の２倍（Ｒ２＝２×Ｒ１）になっている。制御部２２７は、スイッチ駆動部１０５と、Ａ／Ｄ変換器１０７と、加算部２０８と、選択部１０９とを制御している。なお、図２と同一の構成部分には、同一の符号を付している。

さらに、図１０に示すように、加算部２０８は、加算器２０８１と、クリップ回路２０８２とを有している。この加算器２０８１は、加算器１０８１に比して処理ビット数が１ビット増加されているため、加算器１０８１に比して信号の処理容量が２倍になっている。図９において、スイッチ１０３が「閉」になると、電気信号Ｉは、抵抗２０４の抵抗値Ｒ２を介して接地されるが抵抗１０４の抵抗値Ｒ１の２倍になっているため、アンプ１０６に印加される電圧値Ｖ_INは、図２における電圧値Ｖ_INに比して２倍になる。

結果的に、図１０に示すように、加算部２０８の加算器２０８１は、２倍に増幅された電圧値の加算を行い、容量（０〜Ｎ＋１）ｂｉｔの加算値をクリップ回路２０８２に出力する。ここで、画像信号が容量（Ｎ）ｂｉｔである場合、クリップ回路２０８２は、加算値が画像信号の容量（Ｎ）ｂｉｔをオーバーフローしないように、加算値の上位の桁をクリップして、容量（１〜Ｎ＋１）ｂｉｔの加算値に変換して選択部１０９に出力する。

この結果、図１１に示すように、従来の画像信号のレンジが０〜３であったものが、２倍の抵抗値を介して放電させることによって、画像信号のレンジが２倍（０〜６）に増幅される。しかし、画像信号のレンジ容量が０〜３である場合、レンジが増幅された画像信号は、オーバーフローする。そこで、増幅された画像信号の上位桁部分をクリップすることによって、画像信号のレンジ容量に収まるようにできる。したがって、制御部２２７は、分解能が２倍になり、かつオーバーフローすることのない画像信号が取得できる。

レーザ光の走査速度が速く、あるいは試料９から発する光の光強度が小さく、結果的に光検出器１９，２５からの電気信号Ｉが微弱な場合でも、抵抗値を増大させて放電し、アンプ１０６に印加する電圧値を増幅させ、加算器２０８１とクリップ回路２０８２とを組み合わせることによって、擬似的に分解能を高めた画像信号が取得できる。

この実施の形態２では、抵抗２０４の抵抗値Ｒ２を抵抗１０４の抵抗値Ｒ１の２倍にするとともに、加算器２０８１の容量を２倍にし、さらに加算値の上位ビットをクリップすることによって、生物蛍光試料等から発する微弱な蛍光からも高精度の画像が取得できるようにしている。

なお、この実施の形態２では、抵抗２０４の抵抗地Ｒ２を抵抗値Ｒ１の２倍にし、加算器２０８１の処理ビット容量を２倍にしていたが、所望の分解能に応じられるように図１２のブロック図に示すように可変抵抗２０５を配置し、制御部２２７Ａが可変抵抗２０５の抵抗値を可変制御するようにしてもよい。また、クリップ回路２０８２は、加算値の上位ビットをクリップして、容量（Ｎ）ｂｉｔにしていたが画像信号のレンジ容量に応じて可変するようにしてもよい。

（実施の形態３）
つぎに、この実施の形態３について説明する。実施の形態１では、レーザ光の走査速度に応じて光検出器から出力される電気信号の処理方法を切り替えるようにしていた。また、実施の形態２では、微弱な蛍光等に対応させて擬似的に分解能を高くするようにしていた。この実施の形態３では、非常に暗い試料からの光を光子計数法によって測定し、Ｓ／Ｎ比の高い画像信号を取得するようにしている。

図１３は、この発明の実施の形態３である走査型レーザ顕微鏡装置３００の概要構成を示すブロック図である。図１３において、この走査型レーザ顕微鏡装置３００は、制御部２７に代えて制御部３２７を配置し、測定部２０，２６に代えて測定部３２０，３２６を配置している。なお、図１と同一の構成部分には、同一の符号を付している。

つぎに、測定部３２０，３２６の動作について説明する。図１４は、測定部３２０，３２６の概要構成を示すブロック図である。図１４において、測定部３２０，３２６は、スイッチ３１１と、抵抗３１２とを配置し、スイッチ駆動部１０５に代えてスイッチ駆動部３０５を配置し、光子計数部３１０を配置し、選択部１０９に代えて選択部３０９を配置している。また、抵抗３１２の抵抗値Ｒ３は、アンプ１０６、およびＡ／Ｄ変換器１０７によってパルス状の電気信号Ｉの周波数が小さくならない値に設定されている。また、制御部３２７は、スイッチ駆動部３０５と、Ａ／Ｄ変換器１０７と、加算部１０８と、選択部１０９と、光子計数部３１０とを制御している。なお、図２と同一の構成部分には、同一の符号を付している。

さらに、図１５に示すように、光子計数部３１０は、基準値生成部３１０１と、比較部３１０２と、カウント部３１０３とを有している。基準値生成部３１０１は、光検出系のノイズに相当する所定の閾値Ｔｔｈを比較部３１０２に出力し、比較部３１０２は、Ａ／Ｄ変換器１０７から入力したデジタル値と閾値Ｔｔｈとを比較し、デジタル値が閾値Ｔｔｈ以上であるデジタル値をカウント部３１０３に出力する。カウント部３１０３は、入力したデジタル値の個数を計数し、制御部３２７の制御のもと、計数を選択部３０９に出力する。選択部３０９は、制御部３２７の制御のもと、入力した計数を制御部３２７に出力する。制御部３２７は、入力部２９の指示のもと、入力した計数をもとに画像信号に変換して、表示部２８に出力表示させる。

試料９から発する光が非常に暗い場合、光検出器１９，２５から出力される電気信号Ｉは、パルス状になる。このような場合、スイッチ１０２，１０３を「開」にして、スイッチ３１１を「閉」にすると、このパルス状の電気信号Ｉは、極めて小さい抵抗値Ｒ３の抵抗３１２を介して放電するため、アンプ１０６にパルス状の電圧が印加される。アンプ１０６に印加されたパルス状の電圧は、Ａ／Ｄ変換器１０７を介して光子計数部３１０にパルス状のデジタル値が出力される。光子計数部３１０は、このパルス状のデジタル値からノイズである所定の閾値Ｔｔｈ以上のデジタル値を計数する。結果的にこの計数は、光子計数法における光子数となる。そこで、制御部３２７は、光子計数部３１０から出力された光子数を選択部３０９を介して入力し、光子計数法をもとに画像信号を取得することができる。

この実施の形態３では、非常に暗い試料９から発した光のパルス状の電気信号を計数し光子計数法によって画像信号を取得するようにしている。基準値生成部３１０１と比較部３１０２とによってノイズが除去できるためＳ／Ｎ比が高く、明るい画像信号が取得できる。

なお、この実施の形態３では、抵抗３１０の抵抗値Ｒ３を極めて小さく設定していた（Ｒ３≒０）が、これは、図１６に示すように、抵抗３１０の抵抗値Ｒ３を大きくする（Ｒ３＝Ｃ）と、抵抗３１０の時定数が増大して、光検出器１９，２６から出力されたパルス状の電気信号Ｉが崩れ、パルスの高さが減少するとともにパルスの幅が拡幅し、正確な光子数がカウントされなくなるからである。

また、この実施の形態３では、所定の閾値Ｔｔｈをノイズとして固定していたが、ノイズレベルの変化に対応させて変化させるようにしてもよい。

実施の形態１〜３では、電気信号Ｉの異なる信号処理を１つのアナログ入力回路で実現することによって、測定部の回路全体を簡易な構成にすることができ、装置全体を小さな容量に収めることができる。

なお、実施の形態１〜３では、試料９からの反射光、および蛍光から出力される電気信号Ｉの信号処理について説明したが、光検出器１３で検出される透過光についても実施の形態１〜３で説明した信号処理を行うようにしてもよい。

この発明の実施の形態１にかかる走査型レーザ顕微鏡装置を示す機能ブロック図である。この発明の実施の形態１にかかる測定部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態１にかかる加算部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態１にかかるＡ／Ｄ変換器に入力する電圧値の時間変化と制御信号Ｓ１，Ｓ３Ａのタイミングチャートである。この発明の実施の形態１にかかるＡ／Ｄ変換器から出力されるデジタル値の時間変化と加算値の時間変化と制御信号Ｓ２，Ｓ３Ｂのタイミングチャートである。この発明の実施の形態１にかかるレーザ光の走査速度の違いによって測定期間と未測定期間との比率が異なることを示す模式図である。この発明の実施の形態１にかかるスイッチの変形例を示すブロック図である。この発明の実施の形態２にかかる走査型レーザ顕微鏡装置を示す機能ブロック図である。この発明の実施の形態２にかかる測定部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態２にかかる加算部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態２にかかる画像信号のレンジの変化を示す模式図である。この発明の実施の形態２にかかる測定部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態３にかかる走査型レーザ顕微鏡装置を示す機能ブロック図である。この発明の実施の形態３にかかる測定部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態３にかかる光子計数部の機能ブロック図である。この発明の実施の形態３にかかる抵抗が大きくなることで、パルス波形が変形する様子を示す模式図である。

符号の説明

１レーザ光源
２ビームエキスパンダ
３波長フィルタ
４，１６ダイクロイックミラー
５ガルバノ
６瞳投影レンズ
７プリズム
８対物レンズ
９試料
１０，１２レンズ
１１，２１ミラー
１３，１９，２５光検出器
１４フレームメモリ
１５集光レンズ
１７，２３吸収フィルタ
１８，２４ピンホール
２０，２６，２２０，２２０Ａ，２２６，２２６Ａ，３２０，３２６測定部
２２ダイクロイックフィルタ
２７，２２７，２２７Ａ，３２７制御部
２８表示部
２９入力部
１００，２００，３００走査型レーザ顕微鏡装置
１０１コンデンサ
１０２，１０３，１１０，３１１スイッチ
１０４，２０４，３１２抵抗
１０５，３０５スイッチ駆動部
１０６アンプ
１０７Ａ／Ｄ変換器
１０８，２０８加算部
１０９，３０９選択部
２０５可変抵抗
３１０光子計数部
１０８１，２０８１加算器
２０８２クリップ回路
３１０１基準値生成部
３１０２比較部
３１０３カウント部

Claims

レーザ光を試料に照射しつつ所定の走査速度で走査し、前記試料から発する光を光検出手段によって検出して電気信号に変換し、該変換された電気信号を画像表示する走査型レーザ顕微鏡装置において、
前記電気信号の電荷を蓄積する電荷蓄積手段と、
接地された第１のスイッチを有し、該第１のスイッチの閉によって前記電荷を接地して放電させる第１の放電手段と、
抵抗を介して接地された第２のスイッチを有し、該第２のスイッチの閉によって前記電荷を前記抵抗を介して接地して放電させる第２の放電手段と、
前記電荷をデジタル値に変換するデジタル変換手段と、
前記デジタル値を加算する加算手段と、
前記デジタル変換手段からの第１の入力と前記加算手段からの第２の入力とを選択して出力する選択手段と、
前記レーザ光が１画素に対応する領域を走査する第１の周期に同期して前記電荷を前記デジタル変換手段によって前記デジタル値に変換するとともに前記電荷を前記第１の放電手段によって放電する第１の制御と、前記第１の周期に比して短い第２の周期に同期して前記電荷を前記デジタル変換手段によって前記デジタル値に変換するとともに前記電荷を前記第２の放電手段によって放電し、該デジタル値を前記加算手段によって加算し、該加算結果を前記第１の周期に同期して前記選択手段に出力する第２の制御とを行い、前記第１の制御時に前記第１の入力を選択指示し、前記第２の制御時に前記第２の入力を選択指示する制御手段と、
を備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡装置。
他の抵抗を介して接地された第３のスイッチを有し、該第３のスイッチの閉によって前記電荷を前記他の抵抗を介して接地して放電させる第３の放電手段と、
前記デジタル変換手段から出力された前記デジタル値を所定の閾値と比較し、該所定の閾値以上の前記デジタル値を計数する計数手段と、
をさらに備え、
前記選択手段は、前記計数手段からの第３の入力を含めて選択出力し、
前記制御手段は、前記第１の周期に比して短い第３の周期に同期して前記電荷を前記デジタル変換手段によって前記デジタル値に変換するとともに前記電荷を前記第３の放電手段によって放電し、該デジタル値を前記計数手段によって計数させ、該計数結果を前記第１の周期に同期して前記選択手段に出力する第３の制御をさらに行い、前記第１の制御時に前記第１の入力を選択指示し、前記第２の制御時に前記第２の入力を選択指示し、前記第３の制御時に前記第３の入力を選択指示することを特徴とする請求項１に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
前記他の抵抗の抵抗値は、前記デジタル変換手段が前記第３の周期によるサンプリングを満足する範囲内の微小な抵抗値であることを特徴とする請求項２に記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
前記選択手段は、前記所定の走査速度が遅い場合、前記第１の入力を選択し、前記所定の走査速度が速い場合、前記第２の入力を選択することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一つに記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
前記選択手段は、前記試料から発する前記光が暗い場合、前記第３の入力を選択することを特徴とする請求項２〜４のいずれか一つに記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
前記画像表示によって表示された前記電気信号に応じて、前記第１の入力、前記第２の入力、あるいは前記第３の入力のいずれか一つを選択する指示を前記選択手段に対して行う指示手段をさらに備えたことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一つに記載の走査型レーザ顕微鏡装置。
前記抵抗は、可変抵抗であり、
前記加算手段は、前記可変抵抗の抵抗値に応じてデジタル変換したデジタル値を加算演算し、この加算演算した加算値のうちの所定の下位ビットを削除して出力することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一つに記載の走査型レーザ顕微鏡装置。