JP2005261366A - 包括的スクリーニング方法及び原因dna配列同定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】正常細胞に由来するホールゲノムをカバーするプローブ群を有するゲノムDNAマイクロアレイに対し、検体細胞または検体細胞集団より抽出した検体ゲノムDNAと、正常の前記細胞または前記細胞集団より抽出した正常ゲノムDNAを異なる蛍光色素でラベルし、ゲノムDNAマイクロアレイに対し、競合的にハイブリダイズさせる。得られたシグナルにおける両者の蛍光強度の比を算出すれば、各プローブで、どちらのゲノムDNAがより多くハイブリダイズしたか明らかになるので、前記検体細胞または前記検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているDNA配列を有する少なくとも一つのプローブを同定することができる。
Description
メソッズ オブ モレキュラー バイオロジー(Methods Mol. Biol.) 2004年 256巻 39-56頁
本発明の包括的スクリーニング方法を行うために、まず正常細胞に由来する1組のゲノム全体(whole genome)をカバーするプローブ群を有するゲノムDNAアレイを作製する。
(1)まず、検体細胞または検体細胞集団より検体ゲノムDNAを、正常の細胞または細胞集団より正常ゲノムDNAを抽出する。
上記包括的スクリーニング法を利用して、検体細胞または検体細胞集団が、少なくとも一つのDNA配列の、細胞当たりのコピー数の増減が起因となる表現型を有する場合において、前記DNA配列を同定するための原因DNA配列を同定できる。ここでは、ある形質に対し特定の表現型を有する検体細胞または検体細胞集団に対し、上記CGH法を適用し、その表現型の原因DNA配列を同定することを目的とする。
(1)BACクローンのスクリーニング
まず、BAC-DNAライブラリーから、1,0176クローンのBACクローンを選択し、R.E.A.L Prep 96 Plasmid Kit( QIAGEN)を用いて、DNAを抽出した。インサートの両端から、クローニングサイト近傍のDNA配列を決定し、プローブとして使用可能なサイズであることと、重複していないこと、全体としてホールゲノムがカバーされていることを基準に7400個以上のクローンを最終的に選別した。
DOP-1:5’-CCGACTCGAGNNNNNNCTAGAA-3’ (配列番号:1)
DOP-2:5’-CCGACTCGAGNNNNNNTAGGAG-3’ (配列番号:2)
DOP-3:5’-CCGACTCGAGNNNNNNTTCTAG-3’ (配列番号:3)
プライマー2:5’-XGGAAACAGCCCGACTCGAG-3’ (配列番号:4)
Secondary PCRは反応液量20μlとし、反応組成は5mM Tris-HCl pH8.5, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2, 0.25mM dNTP, 1.6μM a分o-link primer, 3U AmpliTaq Gold, 0.5μl 各DOP-PCR 産物とした。PCR条件は95℃ 10分の熱変性後、95℃ 1分, 60℃ 1.5分, 72℃ 7分 を35サイクル行い、最後に72℃ 10分で伸張した。
マイクロアレイの作製にはSPBIO2000(HITACHI)を用いた。調整したDNAをガラススライド上にトリプルスポットし、飽和NaClチャンバーにて24時間インキュベートした。スライドガラス表面をBlocking Buffer(50mM ethanola分e, 0.1M Tris pH9.0, 0.1% SDS)で50℃、15分ブロッキングした後、滅菌蒸留水で2回洗浄し、さらに4x SSC, 0.1% SDS中で50℃、60分洗浄し、滅菌蒸留水で洗浄した。アレイ上のDNAを1本鎖化するためスライドガラスを沸騰した滅菌蒸留水中で2分インキュベートした後、室温の滅菌蒸留水にて2回洗浄し、乾燥させ、デシケータ中で保管した。
ゲノムDNAのラベリングにはBioprime Labeling kit(Invitrogen)を用いた。反応液量は50μlとし指定のプロトコールに従って1μgの健常人DNA(健常人の末梢血より抽出したDNA) と1μgの扁平上皮癌細胞株DNAのラベリング反応を行ったが、反応組成のうち各dNTP濃度を終濃度200μM( dATP, dGTP, dTTP)、50μM( dCTP)、160μM(Cy3またはCy5標識dCTP)となるよう変更した。ラベル後のDNAはSephadex G-50カラムを用いて精製し、67.5μgのHuman Cot-1 DNA (Invitrogen)とともにエタノール濃縮した。
プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションは、Lucidea Slide Pro(Amersham Biosciences) を用いて行った。
マイクロアレイのスキャニングにはGenePix4000B( Amersham Biosciences)を用いた。スキャニングには付属のソフトウェア設定のautomatic grid featureを使用し、必要な場合にはマニュアル補正を行った。測定したCy3およびCy5の蛍光量からバックグラウンドの蛍光量を引いたものを各スポットの蛍光強度とし、Cy3とCy5の蛍光強度比を算出した。データの標準化にはグローバル法を用いた。全スポットにおける蛍光強度比の平均値を算出し、その平均値で各スポットにおける蛍光強度比を割ったものを各スポットの平均蛍光強度比とした。
Claims (4)
- 検体細胞または検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減している少なくとも一つのDNA配列を同定するための包括的スクリーニング方法であって、
正常細胞に由来する1組のゲノム全体をカバーするプローブ群を有するゲノムDNAマイクロアレイを作製する工程と、
各プローブのDNA配列を明らかにする工程と、
前記検体細胞または前記検体細胞集団より抽出した検体ゲノムDNAと、正常の前記細胞または前記細胞集団より抽出した正常ゲノムDNAを、異なる標識物でラベルする工程と、
前記ゲノムDNAマイクロアレイに対し、前記検体ゲノムDNAと前記正常DNAを競合的にハイブリダイズさせる工程と、
得られたシグナルを解析し、前記検体細胞または前記検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているDNA配列を有する少なくとも一つのプローブを同定する工程と、
を備える包括的スクリーニング方法。 - 前記検体細胞または検体細胞集団が腫瘍細胞または腫瘍であることを特徴とする請求項1に記載の包括的スクリーニング方法。
- 少なくとも一つのDNA配列の、細胞当たりのコピー数が正常より増減していることが起因となる表現型を有する検体細胞または検体細胞集団において、前記DNA配列を同定するための前記表現型の原因遺伝子同定方法であって、
正常細胞に由来する1組のゲノム全体をカバーするプローブ群を有するゲノムDNAマイクロアレイを作製する工程と、
各プローブのDNA配列を明らかにする工程と、
前記検体細胞または前記検体細胞集団より抽出した検体ゲノムDNAと、正常の前記細胞または前記細胞集団より抽出した正常ゲノムDNAを、異なる標識物でラベルする工程と、
前記ゲノムDNAマイクロアレイに対し、前記検体ゲノムDNAと前記正常DNAを競合的にハイブリダイズさせる工程と、
得られたシグナルを解析し、前記検体細胞または前記検体細胞集団において、細胞当たりのコピー数が正常より増減しているDNA配列を有する少なくとも一つのプローブを同定する工程と、
を備える原因DNA配列同定方法。 - 前記表現型が細胞の腫瘍化であることを特徴とする請求項3に記載の原因DNA配列同定方法。
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Non-Patent Citations (3)
Title |
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JPN6009059635, 日本分子生物学会年会プログラム・講演要旨集, (2003), 26th, p.1042(4PC−154) * |
JPN6009059746, Breast Cancer Res., (2001), 3, [3], p.158−175 * |
JPN6009059748, Gene, (1997), 191, [1], p.69−79 * |
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