JP2005181124A - スペクトル検出装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 スペクトル検出分解能を可変可能にしたスペクトル検出装置を提供する。
【解決手段】 分散されたスペクトルを発生する回折格子２４とスペクトルの波長ごとの強度を検出するライン検出器２６との間の光路上にズームレンズ２５を配置し、このズームレンズ２５の操作により、ライン検出器２６へのスペクトル投影倍率を可変可能にする。
【選択図】 図１

Description

本発明は、標本から発せられる蛍光の分離されたスペクトルを複数の検出チャンネルを有するライン検出手段により検出するスペクトル検出装置に関するものである。

従来、レーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法、走査型近視野顕微鏡法では、標本から発せられる蛍光の分離されたスペクトルを複数の検出チャンネルを有するライン検出手段に取込み、波長ごとのスペクトル強度を検出するスペクトル検出装置が用いられている。

図２は、特許文献１に開示されるスペクトル検出装置の一例を示すもので、標本からの検出光を、不図示のダイクロイックミラーにより励起光と蛍光に分離し、このうちの蛍光を結像レンズ１１を通し、結像レンズ１１の焦点面と共役の位置におかれたピンホール１２を通して焦点面以外からの蛍光放射光をカットし、さらにコリメートミラー１３で平行光に変換した後、回折格子１４によりスペクトル分離して、結像ミラー１５を介してライン検出器１６上に投影することで、波長ごとのスペクトル強度を検出するようにしている。

この場合、ライン検出器１６でのスペクトル検出分解能は、ライン検出器１６の有するｎ個の検出チャンネルに対し、回折格子１４で分離されたスペクトルをライン検出器１６に投影する結像ミラー１５の投影倍率に基づいた波長帯域により決定される。つまり、ライン検出器１６でのスペクトル検出分解能をΔλ、ライン検出器１６に投影される波長帯域をλとすると、Δλ＝λ／ｎとなる。具体的には、回折格子１４によりスペクトル分離された４００〜７００ｎｍの可視領域全体を、３２個の検出チャンネルを有するライン検出器１６により検出した場合のスペクトル検出分解能は、９．３７５ｎｍである。

また、このような特許文献１のものは、スペクトル検出分解能を物理的に上げることも可能で、この場合、回折格子１４による分離スペクトルの範囲をライン検出器１６による検出範囲より広く設定し、回折格子１４と結像ミラー１５を同期させて図示ａ方向に回転移動させることで、固定されたライン検出器１６に対し、所望する検出波長帯域を投影させるか、ライン検出器１６自身を図示ｂ方向に所望する検出波長帯域まで移動させるようにしている。

ところで、標本より発生される蛍光の強さは、標本の種類などによって様々で、強度の大きい場合や、逆に、極めて微弱な場合もある。このような場合、標本からの蛍光強度が十分であれば、スペクトル検出分解能を高い状態に設定して波長ごとのスペクトル強度を検出することができるが、逆に、蛍光が極めて微弱だとライン検出器１６上で光量不足に陥るおそれがあり、このため、スペクトル検出分解能を多少下げてでも、ライン検出器１６でのスペクトル強度の検出を必要とすることもある。
特開２００３−１８５５８２号公報

ところが、特許文献１のものは、上述した方法によりスペクトル検出分解能を物理的に変更することはできるが、回折格子１４と結像ミラー１５の組み合わせによりライン検出器１６へ投影される分離スペクトルの投影倍率は一定になっているため、回折格子１４、結像ミラー１５およびライン検出器１６により一度全体の波長帯域を設定すると、この状態で、スペクトル検出分解能が固定されてしまい、必要に応じて任意のスペクトル検出分解能を設定することはできない。

この結果、上述したように、標本より発生される蛍光が微弱の場合は、光量不足により放射スペクトル強度がライン検出器１６の検出感度に達しないことや、ノイズ成分の影響などによりライン検出器１６でのスペクトル強度の検出ができなくなるという問題があった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、スペクトル検出分解能を可変可能にしたスペクトル検出装置を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、標本からの蛍光を検出する光検出光学系と、前記光検出光学系で検出される蛍光より分離されたスペクトルを発生するスペクトル分離手段と、前記スペクトル分離手段で分離されたスペクトルの波長ごとの強度を検出する複数の検出チャンネルを有するライン検出手段と、前記スペクトル分離手段により分離されたスペクトルを任意の投影倍率で前記ライン検出手段に投影する投影倍率可変手段とを具備したことを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、スペクトル分離手段は、回折格子からなることを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項１または２記載の発明において、前記投影倍率可変手段は、投影倍率を可変可能としたズームレンズからなることを特徴としている。

請求項４記載の発明は、請求項１乃至３のいずれかに記載の発明において、前記スペクトル分離手段は、回転可能で、前記ライン検出手段は、スペクトル領域の分光方向に沿って平行移動可能にしたことを特徴としている。

本発明によれば、ライン検出手段へのスペクトル投影倍率を可変可能にし、スペクトル検出分解能を可変可能にしたので、例え、微弱な蛍光に対しても、ライン検出手段での投影強度を上げることで、スペクトル強度を確実に検出することができる。

また、本発明によれば、スペクトル検出分解能を高めたことで、ライン検出手段の検出範囲を外れるスペクトル帯域が生じても、スペクトル分離手段を回転させるか、ライン検出手段をスペクトルの分光方向に沿って平行移動させることで、これら検出範囲を外れるスペクトル帯域についても確実に検出することができる。

以下、本発明の一実施の形態を図面に従い説明する。

図１は、本発明の一実施の形態にかかるスペクトル検出装置の概略構成を示すものである。図において、２０は顕微鏡としてのレーザ走査型顕微鏡で、ここでは、標本から発せられた蛍光を検出し、共焦点効果を得るための結像レンズ２１とピンホール２２を含む光検出光学系２０１が示されている。

結像レンズ２１は、標本からの蛍光をピンホール２２の中心に集光するものである。また、ピンホール２２は、結像レンズ１１の焦点面と共役の位置に配置され、焦点面以外からの蛍光放射光をカットするものである。

なお、レーザ走査型顕微鏡２０の別な主要部であるレーザ光源、レーザ光走査部、顕微鏡本体部、励起光と蛍光を分けるダイクロイックミラーなどは図面から省略されている。

光検出光学系２０１のピンホール２２を通過した蛍光の光路には、コリメートレンズ２３が配置されている。このコリメートレンズ２３は、ピンホール２２を通過して拡散する蛍光を平行光に変換するものである。

コリメートレンズ２３を通過した平行光の光路には、スペクトル分離手段としての回折格子２４が配置されている。この回折格子２４は、コリメートレンズ２３から入射する平行光より分離されたスペクトルを発生するものである。なお、スペクトル分離手段は、回折格子２４に代えてプリズムやグリズムなどを用いることもできる。

回折格子２４より発生する蛍光スペクトルの光路には、投影倍率が可変可能な投影倍率可変手段としてのズームレンズ２５とライン検出手段としてのライン検出器２６が配置されている。

この場合、ズームレンズ２５は、凹レンズ２５１と凸レンズ２５２を複数枚ずつ組み合わせたもので、これら凹レンズ２５１と凸レンズ２５２を光軸に沿って図示ｃ方向に移動させ相互の距離を変えて焦点距離を変化させることにより、ライン検出器２６に対するスペクトルの投影倍率を可変可能にしたものである。また、ライン検出器２６は、複数（例えば、３２個）の検出チャンネル２６１を有するマルチチャンネル検出器が用いられ、ズームレンズ２５を介して投影されるスペクトルの波長ごとのスペクトル強度を検出するようになっている。

なお、回折格子２４およびライン検出器２６は、蛍光スペクトルの相対位置を可変できるようになっており、回折格子２４については、図示矢印ｄ方向に回転させるための駆動手段（不図示）、ライン検出器２６については、蛍光スペクトルの分光方向にに沿って図示矢印ｅ方向に平行移動させるための駆動手段（不図示）が設けられている。

次に、このような実施の形態の作用を説明する。

いま、レーザ走査型顕微鏡２０において、不図示のダイクロイックミラーにより分離された標本から蛍光が結像レンズ２１とピンホール２２を含む光検出光学系２０１に入射すると、結像レンズ２１を通り、この結像レンズ２１の焦点面と共役の位置におかれたピンホール２２を通過して焦点面以外からの蛍光放射光がカットされ、さらにコリメートレンズ２３で平行光に変換され、回折格子２４に入射する。回折格子２４は、コリメートレンズ２３から入射する平行光を分離し、スペクトルを発生する。

この回折格子２４により発生されたスペクトルは、ズームレンズ２５を介してライン検出器２６に投影され、スペクトルの波長ごとのスペクトル強度が検出される。

この場合、ズームレンズ２５は、ライン検出器２６に対するスペクトルの投影倍率を可変してスペクトル検出分解能を任意に可変できるようになっている。

まず、ズームレンズ２５が基準位置にあるとき、ライン検出器２６に投影されるスペクトル帯域が可視域の４００〜７００ｎｍになるように回折格子２４とズームレンズ２５を設定する。このとき３２個の検出チャンネル２６１を有するライン検出器２６で検出可能なスペクトル検出分解能は、上述したように９．３７５ｎｍになる。

次に、ズームレンズ２５を基準位置から光軸方向に沿って図示ｃ方向に移動し、投影倍率を２倍にすると、ライン検出器２６に投影されるスペクトル帯域が半減し、例えば４７５〜６２５ｎｍとなり、このときのスペクトル検出分解能は、上述の２倍の４．６８７５ｎｍになる。

この場合、ズームレンズ２５により投影倍率を上げると、ライン検出器２６の検出範囲を外れるスペクトル帯域が発生する。この帯域を検出するには、回折格子２４を不図示の駆動手段により矢印ｄ方向に回転させるか、ズームレンズ２５のレンズ径が充分大きければ、ライン検出器２６を不図示の駆動手段により、スペクトルの分光方向にに沿って図示矢印ｅ方向に平行移動させることで可能となる。

一方、標本より発生される蛍光が微弱な場合、光量不足によりライン検出器２６の検出感度に達しないことや、ノイズ成分の影響などによりライン検出器２６でのスペクトル強度の検出ができないことがある。このような場合は、ズームレンズ２５を光軸方向に沿って図示ｃ方向に移動し、投影倍率を下げる。すると、ライン検出器２６上の小さな面積にスペクトルの光が集められ、単位面積当りに投影されるスペクトルの強度、つまり投影強度が引き上げられる。例えば、ズームレンズ２５の基準倍率でのライン検出器２６へのスペクトルの投影強度を１とした場合、ズームレンズ２５の倍率を、基準倍率のときの１／２にすると、投影強度は４となる。また、ズームレンズ２５にシリンドリカルレンズなどを用い、１方向の横倍率のみ１／２にした場合は、投影強度が２となる。

これにより、標本からの蛍光が微弱の場合でも、ズームレンズ２５により投影倍率を下げ、ライン検出器２６へのスペクトルの投影強度を上げることで、ライン検出器２６でのスペクトルの強度検出を確実に行なうことができる。

なお、ライン検出器２６でのスペクトル強度の検出を確実にするため、ズームレンズ２５により投影倍率を下げることで、スペクトル検出分解能が低下することになるが、ライン検出器２６でのスペクトル検出ができないよりは好ましい。

従って、このようにすれば、分散されたスペクトルを発生する回折格子２４とスペクトルの波長ごとの強度を検出するライン検出器２６との間の光路上にズームレンズ２５を配置し、このズームレンズ２５の操作により、ライン検出器２６へのスペクトル投影倍率を可変可能としたので、ライン検出器２６でのスペクトル検出分解能を任意に可変できる。

これにより、仮に、標本より発生される蛍光が微弱で、光量不足によりライン検出器２６の検出感度に達しないような場合は、ズームレンズ２５により投影倍率を下げてライン検出器２６上でのスペクトルの強度、つまり投影強度を上げることにより、ライン検出器２６でのスペクトルの強度検出を確実に行なうことができる。

また、ズームレンズ２５により投影倍率を上げて、スペクトル検出分解能を高めたことにより、ライン検出器２６の検出範囲を外れるスペクトル帯域が生じることがあっても、回折格子２４を回転させるか、ライン検出器２６を蛍光スペクトルの分光方向にに沿って平行移動させることで、これら検出範囲を外れるスペクトル帯域についても確実に検出することができる。

なお、上述した実施の形態では、回折格子２４で分離されたスペクトルをライン検出器２６へ倍率を変えて投影する手段として、ズームレンズ２５を用いたが、これに代わって複数の固定倍率レンズを切り替えるようにした手段などを用いることもできる。

また、上述した実施の形態では、焦点面に共役の位置にピンホール２２を配置したものについて述べたが、多光子吸収を使用する場合は、励起の確立が励起光強度の乗数（２光子の場合は２乗）に比例するため、光子強度の高い焦点位置付近でしか励起せず、レーザを走査することで断層像が得られることから、焦点面に共役の位置にピンホールを配置しなくともよい。

その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の一実施の形態の概略構成を示す図。 従来の顕微鏡スペクトル検出装置の一例の概略構成を示す図。

符号の説明

２０…レーザ走査型顕微鏡、２０１…光検出光学系
２１…結像レンズ、２２…ピンホール
２３…コリメートレンズ、２４…回折格子、２５…ズームレンズ
２５１…凹レンズ、２５２…凸レンズ、２６…ライン検出器
２６１…検出チャンネル

Claims (4)

1. 標本からの蛍光を検出する光検出光学系と、
   前記光検出光学系で検出される蛍光より分離されたスペクトルを発生するスペクトル分離手段と、
   前記スペクトル分離手段で分離されたスペクトルの波長ごとの強度を検出する複数の検出チャンネルを有するライン検出手段と、
   前記スペクトル分離手段により分離されたスペクトルを任意の投影倍率で前記ライン検出手段に投影する投影倍率可変手段と
   を具備したことを特徴とするスペクトル検出装置。
2. スペクトル分離手段は、回折格子からなることを特徴とする請求項１記載のスペクトル検出装置。
3. 前記投影倍率可変手段は、投影倍率を可変可能としたズームレンズからなることを特徴とする請求項１または２記載のスペクトル検出装置。
4. 前記スペクトル分離手段は、回転可能で、前記ライン検出手段は、スペクトルの分光方向に沿って平行移動可能にしたことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のスペクトル検出装置。

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