JP2005058161A - ヒドロキシクエン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ヒドロキシクエン酸の大量製造方法を提供する。
【解決手段】 本発明は、微生物を用いた発酵法によるヒドロキシクエン酸の製造方法に関する。この方法は、ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物を培養する工程、および得られた培養液からヒドロキシクエン酸を回収する工程、を包含する。代表的には、上記ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物は、ストレプトミセスＧ３株、ミクロバクテリウムＧＤ８８Ａ株、バチルスＧ４５Ｃ株である。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ヒドロキシクエン酸の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、微生物を用いた発酵法によるヒドロキシクエン酸の製造方法に関する。本発明により製造されるヒドロキシクエン酸は、健康食品、ダイエット食品、肥満抑制剤などの用途に利用可能である。

ヒドロキシクエン酸は、ガルシニア・カンボジア（Ｇａｒｃｉｎｉａ ｃａｍｂｏｇｉａ）に含まれる脂肪合成抑制作用をもつことが知られている物質である。ガルシニア・カンボジアは、東南アジア原産のオトギリソウ科の植物であって、オレンジに良く似た果実をもち、古くから、カレーのスパイスや魚の保存料として利用されている。ガルシニア・カンボジアのダイエット素材としての歴史もまた古い。現在、ガルシニア・カンボジアの果皮から抽出されたエキスが市販されている。

Ｌｅｗｉｓは、ガルシニア・カンボジアの乾燥果皮から単離されたヒドロキシクエン酸に脂肪の合成を抑制する作用のあることを報告した（非特許文献１）。ヒドロキシクエン酸は、水酸基（−ＯＨ）の数が１つ多い点を除けばクエン酸と同じ構造をもち、細胞内のＡＴＰ濃度が上昇したとき、ミトコンドリアから細胞質に輸送されたクエン酸を基質にして脂肪を合成するＡＴＰクエン酸リアーゼの反応をクエン酸と拮抗することにより阻害し、クエン酸のグリーコーゲンへの転換を促進する。

Ｌｅｗｉｓの報告以後、ガルシニア・カンボジアからのヒドロキシクエン酸を含むエキスの抽出方法およびその用途について、種々の知見が得られている。米国特許第５６５６３１４号（特許文献１）は、水抽出、およびアニオン交換樹脂とカチオン交換樹脂の組合せを用いた、ガルシニア属の果実の皮からのヒドロキシクエン酸濃縮物の調製法を記載する。特開平１１−１４３１（特許文献２）は、ヒドロキシクエン酸を主成分とし、消化吸収性を向上させた肥満抑制剤を記載する。特開２０００−２５６６６８（特許文献３）は、ヒドロキシクエン酸類を有効成分として含有する酸化防止剤を記載する。特開２０００−２７９１０１（特許文献４）は、ヒドロキシクエン酸を含有する飼料を記載する。

ガルシニア・カンボジアの他に、アフリカ原産の植物であるハイビスカス・サブダリファ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｕｂｄａｒｉｆｆａ）もまた、ヒドロキシクエン酸を含むことが知られている。ハイビスカス・サブダリファの乾燥した顎はハイビスカスティーとして広く飲用されている。

ヒドロキシクエン酸には４種の異性体が存在し、ガルシニア・カンボジアは、（２Ｓ，３Ｓ）型のヒドロキシクエン酸を、そしてハイビスカス・サブダリファは、（２Ｓ，３Ｒ）型ヒドロキシクエン酸をそれぞれ含む。（２Ｒ、３Ｓ）型および（２Ｒ，３Ｒ）型ヒドロキシクエン酸は、現在まで、自然界には見出されてはいない。ヒドロキシクエン酸の立体選択的化学的合成は困難である（非特許文献２）。

ラット肝臓におけるＡＴＰクエン酸リアーゼを用いた、クエン酸に対する阻害実験の結果によると、４種の異性体のうち、ガルシニア・カンボジア由来の（２Ｓ，３Ｓ）ヒドロキシクエン酸が最も阻害作用があるとの報告がなされている（非特許文献３）。

Ｚｅｍｌｙａｎｕｋｈｉｎらは、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物、およびハイビスカスにおけるヒドロキシクエン酸の代謝を調査し、ヒドロキシクエン酸を２ケトグルタル酸に可逆的に変換するヒドロキシクエン酸デヒドラターゼの存在を確認している（非特許文献４）。
Ｙ．Ｓ．Ｌｅｗｉｓ；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ．（Ｊ．Ｍ．Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ，ｅｄ．）Ｖｏｌ．１３，ｐ６１３−６１９ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６９） Ｇｌｕｓｋｅｒ、Ｊｅｎｎｙ Ｐ．ｅｔ ａｌ；Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｙｈｓ．１３２（２）、ｐ５７３−５７５（１９６９） Ａｎｎ Ｃ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ ｅｔ ａｌ；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７），ｖｏｌ．２５２，Ｎｏ．２１，７５８３−７５９０ Ｌ．Ａ．Ｚｅｍｌｙａｎｕｋｈｉｎ ａｎｄ Ａ．Ａ．Ｚｅｍｌｙａｎｕｋｈｉｎ；Ｒｕｓｓ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９６），ｖｏｌ．４３，Ｎｏ．１，１０８−１１０ 米国特許第５６５６３１４号 特開平１１−１４３１ 特開２０００−２５６６６８ 特開２０００−２７９１０１

現在、ヒドロキシクエン酸を含むガルシニアエキスは、ガルシニア・カンボジアの果皮から抽出して製造され販売されている。しかし、ヒドロキシクエン酸を含有する植物種は極めて少ないため、ヒドロキシクエン酸を含む健康食品、ダイエット食品、肥満抑制剤などに対する需要が高まるにつれ、ヒドロキシクエン酸の供給源を天然の植物に依存することは、将来、需要量に足る供給量を確保することが困難になると予想される。また、ガルシニア・カンボジアの産地は、タイ、インドなどの南アジア地域に限られており、ヒドロキシクエン酸の供給源を天然の植物に依存することはまた、その生産量が産地や気候に依存することをも意味している。このような状況下、ヒドロキシクエン酸を、大量かつ安定に製造することが望まれる。本発明は、ヒドロキシクエン酸を、大量かつ安価に提供する製造方法を提供することを目的とする。

本発明は、ヒドロキシクエン酸の製造方法に関し、この方法は、ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物を培養する工程、および得られた培養液からヒドロキシクエン酸を回収する工程を包含する。

好ましくは、上記微生物は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する放線菌である。

好ましくは、上記放線菌は、ストレプトミセスＧ３株である。

好ましくは、上記微生物は、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌である。

好ましくは、上記細菌は、ミクロバクテリウムＧＤ８８Ａ株である。

好ましくは、上記微生物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌である。

好ましくは、上記細菌は、バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｉｕｍ）である。

好ましくは、上記細菌は、バチルスＧ４５Ｃ株である。

本発明によれば、著量のヒドロキシクエン酸が、短期間の培養で培地中に生成蓄積されるために、分離精製が容易で効率よく安価にヒドロキシクエン酸を製造する方法が提供される。

ヒドロキシクエン酸は、クエン酸に比べ、ＡＴＰクエン酸リアーゼに対する親和性が約１００倍高いので（非特許文献３）、低濃度のヒドロキシクエン酸が肝細胞に存在すると、ヒドロキシクエン酸がクエン酸とＡＴＰクエン酸リアーゼの基質として競争阻害することにより肝細胞による脂肪合成を阻害する。ヒドロキシクエン酸がＡＴＰクエン酸リアーゼを阻害することにより、クエン酸が脂肪に変換されずに、エネルギー源として利用可能なグリコーゲンに変換される。従って、本発明は、優れたダイエット素材のみならず、摂取した個体において、例えば、持久力が増加するなどの効能が期待され得る素材を、大量に提供する方法が提供もされる。

以下本発明について詳細に説明する。

本明細書で用いる用語は、特に示されなければ、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。また、本明細書で用いる用語は、一般に、特に示されなければ、単数形の表現であってもその複数形の概念をも含む。また、本明細書で用いる「％」は、特に示されなければ重量％を意味する。

本明細書で用いる用語「炭素源」は、一般に、微生物によって吸収利用される炭素を含む化合物（炭素化合物）を意味し、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖などの炭水化物、多価アルコール、有機酸類、およびこれらを含む原材料を包含する。

本明細書で用いる用語「窒素源」は、一般に、微生物がその体を構成するタンパク質、核酸、その他の窒素化合物の原材料として、外界から取り入れられる窒素を含む化合物（窒素化合物）を意味し、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物、アミノ酸、アミド、アミン、尿素などの有機窒素化合物、およびこれらを含む、ペプトン類、酵母エキス（以下しばしばＹＥと略記する）、肉エキス、コーンスティープリカーなどの原材料を包含する。

本発明は、ヒドロキシクエン酸の製造方法に関し、この方法は、ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物を培養する工程、および得られた培養液からヒドロキシクエン酸を回収する工程を包含する。

本発明の方法に用いる「ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物」は、ヒドロキシクエン酸の前駆体となり得る炭素源を含む培地でヒドロキシクエン酸を生産する任意の微生物を含む。このような微生物は、自然界から単離され得る。このような微生物の代表的な単離源として、土壌、植物などが挙げられる。ヒドロキシクエン酸の前駆体となり得る炭素源として、クエン酸、２−オキソグルタル酸、トランスアコニット酸、ヒドロキシクエン酸アナログ体などが挙げられる。

上記「ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物」は、代表的には、ｉ）上記のヒドロキシクエン酸の前駆体；ｉｉ）ヒドロキシクエン酸を含むガルシニアエキス；およびｉｉｉ）マンニトールのいずれかを唯一の炭素源として含む培地を用いて単離され得る。

上記「ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物」は、代表的には、ｉ）植物の果実、葉などを直接寒天培地に接触させて培養し、そこから単離する；ｉｉ）植物の一部、または土壌を滅菌水に懸濁した後、適宜希釈して寒天培地に塗布して培養し、そこから単離する；およびｉｉｉ）植物の組織内部から単離することによって得られ得る。

上記「ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物」であることの確認は、小量の液体培地を用いて得られた単離菌を培養し、培養液中に生成されるヒドロキシクエン酸を、高速液体クロマトグラフィーなどの分析機器を用いて検出することによって行われ得る。

代表的には、上記「ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物」は、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する放線菌、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌である。特に、好適な「ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物」は、ストレプトミセスＧ３株、ミクロバクテリウムＧＤ８８Ａ株、バチルスＧ４５Ｃ株である。これらの株は、それぞれ、２００３年７月２９日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４５２、ＦＥＲＭ Ｐ−１９４５４およびＦＥＲＭ Ｐ−１９４５３として寄託されている。

なお、本明細書で用いる用語「ｒＤＮＡ」は、通常用いられているように、リボソームを構成するＲＮＡをコードするＤＮＡであって、特に、原核細胞のｒＲＮＡを構成する１６Ｓサブユニットに含まれる分子をコードするＤＮＡをいう。本明細書で用いる用語「ＤＮＡ」は、当該分野で通常用いられる意味で用いられる。

上記ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物を培養する工程は、一般に、微生物の培養に用いられる培地を用いて行われ得る。このような培地は、上記ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物が資化できる、炭素源、窒素源、無機塩、微量栄養素、発育促進物質などを含み得る。好ましくは、培地の液性は、中性ないしは微酸性である。

代表的な炭素源は、グルコース、シュークロース、フラクトース、マンノース、ラクトース、デンプン、糖蜜、ホエー、グリセリン、ソルビトールなどを包含する。代表的な窒素源は、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機塩、尿素を包含する。必要に応じて、ヒドロキシクエン酸の生成を促進するために、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、カゼイン分解物、アミノ酸などの有機窒素源を添加し得る。さらに必要に応じて、上記ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物をの生育およびヒドロキシクエン酸の生成を促進するために、リン酸、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、亜鉛などの化合物を添加し得る。さらに必要に応じて、上記ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物の生育によって産生される酸を中和し、ｐＨ低下によるヒドロキシクエン酸産生の障害を緩和するために、炭酸カルシウム、炭酸ソーダ、アルカリ液を添加し得る。さらに、必要に応じて、硫酸、硝酸、塩酸などの無機酸、またはリンゴ酸、ピルビン酸、クエン酸などの有機酸を添加し得る。

上記ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物を培養する工程は、通常、深部通気撹拌培養により実施され得る。代表的には、培養は、２３℃〜３５℃、好ましくは２５℃〜３０℃で行われる。通常、このような条件下、２日〜１０日間培養を行えば、著量のヒドロキシクエン酸が培養液中に産生かつ蓄積される。

上記得られた培養液からヒドロキシクエン酸を回収する工程は、微生物の培養液から有機酸を採取するために通常用いられる、当業者に公知の分離採取の手段を、適宜組み合わせて実施され得る。例えば、遠心分離または濾過などの方法によって培養液から菌体を除き、得られた上澄液を濃縮してヒドロキシクエン酸を結晶として回収し得る。

あるいは、同様にして得られた上澄液に、硫酸カルシウムに代表されるカルシウム塩を加えて、ヒドロキシクエン酸をカルシウム塩として回収し得る。

あるいは、同様にして得られた上澄液を、イオン交換樹脂処理してヒドロキシクエン酸を回収し得る。

あるいは、同様にして得られた上澄液を濃縮した後、アルコール酸性化においてエステル化し、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ジクロロメタンなどの溶媒でヒドロキシクエン酸エステル化物を抽出し、さらに、シリカゲルカラムなど当業者に公知の方法で不純物を除去した後、得られたヒドロキシクエン酸エステル化物を、加水分解、濃縮し、再結晶することによってヒドロキシクエン酸を回収し得る。

あるいは、同様にして得られた上澄液を濃縮した後、硫酸や塩酸を加えてｐＨを酸性にして、ジエチルエーテル、酢酸エチル、ブタノールなどの溶媒でヒドロキシクエン酸を抽出し、抽出液を濃縮し、再結晶してヒドロキシクエン酸を回収し得る。

以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例は、本発明の例示であって、本発明を制限するものではない。

（実施例１）ヒドロキシクエン酸産生菌のスクリーニング
（１）土壌、植物などを単離源としヒドロキシクエン酸産生菌を分離した。ヒドロキシクエン酸産生菌の分離は、クエン酸、２−オキソグルタル酸、トランスアコニット酸、ガルシニアエキス、またはマンニトールを唯一の炭素源として含む５種類の培地を用い、ｉ）植物の果実、葉などを直接寒天培地に接触させて培養し、そこから単離する；ｉｉ）植物の一部、または土壌を滅菌水に懸濁した後、適宜希釈して寒天培地に塗布して培養し、そこから単離する；またはｉｉｉ）植物の組織内部から単離することにより行った。表１に分離に用いた培地に含まれる炭素源を、そして表２にその他の培地成分を示す。その結果、約４５０種類の微生物が分離された。

（２）単離した微生物、本発明者らの所有する保存菌株、および菌株保存分譲機関から入手した菌株を、表３に示す炭素源および表４に示す成分を含む培地５ｍｌを含む３０ｍｌ容試験管に植菌し、３０℃で４８時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離して上澄液を得、これを、フィルター（Ｍｉｌｌｅｘ、０．２０μｍ、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で濾過し、得られた濾液を高速液体クロマトグララフィー（ＨＩＴＡＣＨＩ社製、カラム ＧＬ−Ｃ６１０、流速 １．０ｍｌ／分、検出 ＵＶ−２１０ｎｍ、溶離液 ０．１％Ｈ_３ＰＯ_４）でヒドロキシクエン酸を測定した。その結果、ヒドロキシクエン酸と同じ保持時間の大きなピークが測定された、Ｇ３株、ＧＤ８８Ａ株、およびＧ４５Ｃ株を、ヒドロキシクエン酸生産菌として選択した。

（４）Ｇ３株、ＧＤ８８Ａ株、およびＧ４５Ｃ株の菌学的性状
（４−１）Ｇ３株
（Ｉ）形態的性質
栄養菌糸は、各種寒天培地上でよく発達し分断は観察されない。気菌糸は、イースト・麦芽エキス寒天やオートミール寒天で豊富に着生し、白から褐色の色調を呈する。顕微鏡下の観察では、気菌糸上に２０ケ以上の胞子の直線状の連鎖が認められる。個々の胞子は円筒状の形態をもち、その大きさは約１．０〜１．２×０．５〜０．６μｍであった。胞子の表面は平滑である。菌核、胞子のう、および遊走子は見出されない。

（ＩＩ）各種培地上での性状
イー・ビー・シャーリング（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）と、デー・ゴットリーブ（Ｄ．Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）の方法（インターナショナル・ジャーナル・オブ・システィマテック・バクテリオロジー、１６巻、３１３頁、１９６６年）によって調べたＧ３株の培養性状を以下に示す。

以下の表５において、色調は、標準色として、カラー・ハーモニー・マニュアル第４版（コンテナー・コーポレーション・オブ・アメリカ・シカゴ、１９５８年）を用いて決定し、色標名とともに括弧内にそのコードを併せて記載した。以下は、特記しない限り、２７℃、２週間目の各培地における観察の結果である。

（ＩＩＩ）生理学的諸性質
１．メラニン色素の生成
（イ）チロシン寒天 陰性
（ロ）ペプトン・イースト・鉄寒天 陰性
（ハ）トリプトン・イースト液 陰性
（ニ）単純ゼラチン培地（２１〜２３℃） 陰性
２．硝酸塩の還元 陰性
３．ゼラチンの液化（単純ゼラチン培地２１〜２３℃） 陽性
４．スターチの加水分解 陽性
５．脱脂乳の凝固（２７℃） 陰性
６．脱脂乳のペプトン化（２７℃） 陰性
７．生育温度範囲 １０〜３６℃
８．炭素源の利用性（プリドハム・ゴトリーブ寒天培地）
利用する：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラクトース、ｍｙｏ−イノシトール。
利用しない：ラフィノース、メリビオース、シュクロース。
９．セルロースの分解 陰性
（ＩＶ）細胞壁組成
細胞壁のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ_６）およびＭＫ−９（Ｈ_８）であった。

（Ｖ）１６Ｓ ｒＤＮＡ
１６Ｓ ｒＤＮＡ（１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子）の部分塩基配列約５００ｂｐを用いてＧ３株の帰属分類群を推定した。

（方法） Ｇ３株をＹＭ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ、Ｆｒａｎｃｅ）に植菌し、３０℃で培養し、得られた菌体を供試試料とした。供試試料から定法に従い、ゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲ法により、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列約５００ｂｐを増幅し、得られた塩基配列を配列決定して解析に用いた。ＰＣＲ産物の精製、サイクルシークエンスには、ＭｉｃｏＳｅｑ^ＴＭ５００ １６ｓ ｒＤＮＡ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕ．Ｓ．）を用いた。ゲノムＤＮＡ抽出からサイクルシークエンスまでの操作は、製造業者のプロトコール（Ｐ／Ｎ４３０８１３２ Ｒｅｖ．Ａ）に従って行った。サーマルサイクラーは、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｅｔｅｍ ９６００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕ．Ｓ．）を、そしてＤＮＡシークエンサーは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕ．Ｓ．）をそれぞれ用いた。

得られた１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を用いて相同性検索、および系統樹の作成を行い、Ｇ３株の近縁種および帰属分類群の検討を行った。相同性検索、および系統樹の作成には、ＭｉｃｒｏＳｅｃ^ＴＭ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ．１．４．１およびＭｉｃｒｏＳｅｑ^ＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ５００ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕ．Ｓ．）をそれぞれ用いた。

（結果） Ｇ３株の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列は相同率１００％でストレプトミセス グリセオプラナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｐｌａｎｕｓ）と一致した。分子系統樹上においてもＧ３株は、ストレプトミセス グリセオプラナスと同じ場所に位置したことから、Ｇ３株は、ストレプトミセス グリセオプラナスまたはこれに近縁な菌株であると推定された。

（ＶＩ）結論
以上、Ｇ３株の菌学的性状を要約すると、次のとおりである。細胞壁中のジアミノピメリン酸はＬＬ型、主要メナキノンはＭＫ−９（Ｈ_６）およびＭＫ−９（Ｈ_８）である。胞子連鎖の形態は直線状で、長い胞子鎖を呈し、気菌糸は白色からイエロー系の色調を呈する。メラニン色素および可溶性色素は産生しない。これらの結果から、Ｇ３株は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー、４巻、１９８９年に基き、ストレプトミセス属に分類された。なお、本菌株は、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）Ｇ３として、産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９４５２として寄託されている。
（４−２）ＧＤ８８Ａ株
（Ｉ）菌学的性状
大きさ０．６〜０．７×１．５〜２．０μｍの桿菌である。グラム染色性は陽性であり、胞子および運動性はない。栄養寒天で３０℃２４時間培養すると、円形で全縁滑らかな低凸状の光沢のある黄色のコロニーを形成する。カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性、酸／ガス産生（グルコース）反応陰性、およびＯ／Ｆテスト（グルコース）陰性である。

（ＩＩ）１６Ｓ ｒＤＮＡ
Ｇ３株と同様に、１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列約５００ｂｐを用いてＧＤ８８Ａ株の帰属分類群を推定した。

ＭｉｃｒｏＳｅｃ^ＴＭ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ．１．４．１およびＭｉｃｒｏＳｅｑ^ＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ５００ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕ．Ｓ．）を用いた解析の結果、ＧＤ８８Ａ株の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列は、相同率９６．２３％でミクロバクテリウム リケファシエンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ）、ミクロバクテリウム マリティピカム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｔｙｐｉｃｕｍ）、およびミクロバクテリウム エアボレセンス（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｂｏｒｅｓｃｅｎｓ）の１６ＳｒＤＮＡに対し最も高い相同性を示した。分子系統樹上では、ＧＤ８８Ａ株の１６ＳｒＤＮＡは、単独で枝を形成したが、ミクロバクテリウムの１６ＳｒＤＮＡが形成するクラスター内に含まれていた。
（４−３）Ｇ４５Ｃ株
（Ｉ）菌学的性状
大きさ１．０〜１．２×２．０〜４．０μｍの桿菌である。グラム染色性は陽性であり、胞子および運動性を有する。栄養寒天で３０℃２４時間培養すると、円形で全縁滑らかな低凸状の光沢のない淡黄色のコロニーを形成する。カタラーゼ反応陽性、オキシダーゼ反応陰性、酸／ガス産生（グルコース）反応陰性、およびＯ／Ｆテスト（グルコース）陰性である。

（ＩＩ）１６Ｓ ｒＤＮＡ
Ｇ３株と同様に、１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列約５００ｂｐを用いてＧ４５Ｃ株の帰属分類群を推定した。

ＭｉｃｒｏＳｅｃ^ＴＭ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖ．１．４．１およびＭｉｃｒｏＳｅｑ^ＴＭ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ５００ Ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．００２３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｕ．Ｓ．）を用いた解析の結果、Ｇ４５Ｃ株の１６Ｓ ｒＤＮＡの部分塩基配列は、相同率９９．６３％でバチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の１６ＳｒＤＮＡに対して最も高い相同性を示した。分子系統樹上においても、Ｇ４５Ｃ株の１６ＳｒＤＮＡは、バチルス メガテリウムの１６ＳｒＤＮＡと同じ場所に位置した。

（実施例２）ストレプトミセスＧ３株を用いたヒドロキシクエン酸の製造
グルコース１８ｇ、リン酸二水素カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム０．２５ｇ、コーンスティープリカー（日本食品加工株式会社製）３ｇを水道水に溶かしてｐＨ６．０に調整した後１Ｌとした。そのうちの４０ｍｌを２００ｍｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間殺菌を行い、前培養培地とした。

次いで、予めＰＧＹ斜面培地で２５℃、３〜７日間培養したストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属として同定されたＧ３菌株の菌体１白金耳分を前培養培地に接種し、ロータリーシェーカー上、回転数毎分１４０回転、培養温度３０℃で２日間培養を行った。

前培養終了後、以下の組成の本培養培地４００ｍｌに、前培養液の全量を添加した。
本培養培地の組成および調製法：グルコース３６ｇ、リン酸二水素カリウム２ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、コーンスティープリカー（日本食品加工株式会社製）６ｇを水道水に溶かしてｐＨ６．０に調整した後２Ｌとし、４００ｍｌづつ２Ｌ容三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間殺菌を行った。

本培養培地を含み、前培養液が添加された三角フラスコを、ロータリーシェーカーに乗せ、回転数毎分１４０回転、培養温度３０℃に維持することにより、Ｇ３株を培養した。培養は２日間行った。

本培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を除き、得られた上澄液について下記の条件で高速液体クロマトグラフィーを行い、生成物の分析を行った。

［高速液体クロマトグラフィー条件］：カラム ＧＬ−Ｃ６１０、移動相 ０．１％リン酸水溶液、移動相の流量： １．０ｍｌ／分、検出 ＵＶ２１０ｎｍ。

その結果、上澄液中に、約１５ｍｇ／Ｌのヒドロキシクエン酸、およびその他の生成物としてクエン酸が測定され、Ｇ３株の培養液中に、ヒドロキシクエン酸が生成蓄積されていることが確認された（図１を参照のこと図１中、ＨＣＡはヒドロキシクエン酸を示す。以下同様）。

さらに、ヒドロキシクエン酸を、得られた上澄液中から以下の方法を用いて単離し、そしてそれをメチルエステル化して、その物性を測定した。

［ヒドロキシクエン酸の単離］
上澄液１.８Ｌに、炭酸カルシウム（和光純薬（株））を５ｇ加え、水溶液中に含まれるクエン酸をカルシウム塩として沈澱させた。次に、上澄液に、１０ｍｌの陽イオン交換樹脂（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ ＩＲ１２０Ｎａ オルガノ（株））を加え、水溶液中に残る炭酸カルシウムおよびカルシウムイオンを取り除いた。さらに、上澄液に、１００ｍｌのＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株））を加え、色素を取り除いた。

次に、得られた、陽イオン交換樹脂およびＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０に吸着しない画分を、陰イオン交換樹脂（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ ＩＲＡ４１０ＪＣＬ オルガノ（株））に吸着させた。陰イオン交換樹脂を１Ｌの水でよく洗い流した後、２５％ギ酸溶液（和光純薬（株））１００ｍｌで酸成分を溶出させた。得られた溶出液を乾固して得られた濃縮物を水に溶解し、リサイクルＨＰＬＣ（日本分析工業（株）、カラム ＧＳ３２０、流速 ５ｍｌ／分、カラム温度 室温、溶離液 ；蒸留水）を用いてヒドロキシクエン酸を分離した。

得られたヒドロキシクエン酸を再度濃縮した後、ジアゾメタンを用いてヒドロキシクエン酸をメチルエステル化した。得られた溶液に、ジクロロメタンおよび飽和食塩水を加え、ジクロロメタン層にヒドロキシクエン酸のメチルエステル化物を移動させた後、ジクロロメタン層を硫酸ナトリウムを用いて水分を除去し、その後濃縮した。得られた濃縮物をシリカゲルカラムグラフィーにより分離し、ヒドロキシクエン酸のメチルエステル化物を精製した。

６００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーター（Ｖａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ ６００ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｒ）を用い、精製したヒドロキシクエン酸のメチルエステル化物の^１Ｈスペクトルを測定した（ＣＤＣｌ_３溶液中）。図２に結果を示す。

図２に示されるように、ケミカルシフト３．０６ｐｐｍと２．９１ｐｐｍに（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸（ハイビスカス型）のメチルエステル体のラクトンを示すプロトンＨａ、Ｈｂが測定された。このダブレットの分裂幅は１５Ｈｚであった。また、ケミカルシフト３．１６と２．９８ｐｐｍに（２Ｓ、３Ｒ）ヒドロキシクエン酸の非ラクトン型のメチルエステル体を示すプロトンＨｄ、Ｈｅが測定された。このダブレットの分裂幅は１５Ｈｚであった。図２に示す化学式は、左の化学式が（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸（ハイビスカス型）のメチルエステル体のラクトン、そして右の化学式がヒドロキシクエン酸の非ラクトン型のメチルエステル体である。

（実施例３）ミクロバクテリウムＧＤ８８Ａ株を用いたヒドロキシクエン酸の製造
（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属と同定されたＧＤ８８Ａ株を用いたことを除いて、実施例２と同様に、培養液中のヒドロキクエン酸を測定した。

図３に、ＧＤ８８Ａ株の培養上澄液の高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す。ＧＤ８８Ａ株についても、Ｇ３株同様、その培養上澄液中に、約１２ｍｇ／Ｌのヒドロキシクエン酸、およびその他の生成物としてクエン酸が測定され、ＧＤ８８Ａ株の培養液中に、ヒドロキシクエン酸が生成蓄積されていることが確認された。

実施例２と同様に、ＧＤ８８Ａ株の培養上澄液からヒドロキシクエン酸を単離し、４００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用いてメチルエステル化したヒドロキシクエン酸の^１Ｈスペクトルを測定した（ＣＤＣｌ_３溶液中）。図４に結果を示す。

図４に示されるように、ケミカルシフト２．７１ｐｐｍと３．１８ｐｐｍに（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸（ガルシニア型）のメチルエステル体のラクトンを示すプロトンＨａ、Ｈｂが測定された。このダブレットの分裂幅は１５．３Ｈｚであった。図４に示される化学式は、（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸（ガルシニア型）のメチルエステル体のラクトンである。

（実施例４）バチルスＧ４５Ｃ株を用いたヒドロキシクエン酸の製造
バチルス属として同定されたＧ４５Ｃ株を用いたことを除いて、実施例２と同様に、培養液中のヒドロキクエン酸を測定した。

図５に、Ｇ４５Ｃ株の培養上澄液の高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す。Ｇ４５Ｃ株についても、Ｇ３株同様、その培養上澄液中に、約３１ｍｇ／Ｌ濃度のヒドロキシクエン酸、およびその他の生成物としてクエン酸が測定され、Ｇ４５Ｃ株の培養液中に、ヒドロキシクエン酸が生成蓄積されていることが確認された。

実施例２と同様に、ＧＤ４５Ｃ株の培養上澄液からヒドロキシクエン酸を単離し、３００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーター（日本電子製）を用いてメチルエステル化したヒドロキシクエン酸の^１Ｈスペクトルを測定した（ＣＤＣｌ_３溶液中）。その結果、図６に示されるように、ケミカルシフト３．０７ｐｐｍと２．８７ｐｐｍに（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸（ハイビスカス型）のメチルエステル体のラクトンを示すプロトンＨａ、Ｈｂが測定され、このダブレットの分裂幅は１７．４Ｈｚであった。さらに、ケミカルシフト３．１６と２．９８ｐｐｍに（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸の非ラクトン型のメチルエステル体を示すプロトンＨｄ、Ｈｅもまた測定された。このダブレットの分裂幅は１７Ｈｚであった。図６に示す化学式は、左の化学式が（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸（ハイビスカス型）のメチルエステル体のラクトン、そして右の化学式が（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸の非ラクトン型のメチルエステル体である。

（比較例１）
ガルシニア・カンボジアの果実の乾燥した果皮から、以下の方法により、（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸を精製し標品として用いた。

ガルシニア・カンボジアの果実の乾燥した果皮５ｇを、１００℃の熱水１００ｍｌ中に入れて１時間攪拌し、炭酸カルシウム（和光純薬(株)）を５ｇ加え、溶液に含まれるクエン酸をカルシウム塩として沈澱させた。次に、１０ｍｌの陽イオン交換樹脂（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ ＩＲ１２０Ｎａ オルガノ（株））を加え、溶液中に残る炭酸カルシウムおよびカルシウムイオンを取り除いた。さらに、１００ｍｌのＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０（三菱化学（株））を加え、色素を取り除いた。

次に、得られた、上記陽イオン交換樹脂およびＤＩＡＩＯＮ ＨＰ−２０に吸着しない画分を、陰イオン交換樹脂（ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ ＩＲＡ４１０ＪＣＬ オルガノ（株））に吸着させた。陰イオン交換樹脂を１Ｌの水でよく洗い流した後、２５％ギ酸溶液（和光純薬（株））１００ｍｌで酸成分を溶出させた。得られた溶出液を乾固して得られた濃縮物を水に溶解し、リサイクルＨＰＬＣ（日本分析工業（株）、カラム ＧＳ３２０、流速 ５ｍｌ／分、カラム温度 室温、溶離液 蒸留水）を用いてヒドロキシクエン酸を分離した。分離前の測定結果を図７に、そして分離後の測定結果を図８に示す。

精製されたヒドロキシクエン酸を乾燥した後、３００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーター（日本電子製）を用いて、^１Ｈスペクトル測定を行った（Ｄ_２Ｏ溶液中）。結果を図９に示す。図９に示されるように、ケミカルシフト２．７９ｐｐｍと３．１４ｐｐｍに、（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸のラクトンのプロトンＨａ、 Ｈｂが測定された。このダブレットの分裂幅は１８Ｈｚであった。プロトンＨｃのシグナルは４．９１ｐｐｍに測定された。（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸の非ラクトン型のプロトンＨｄ、Ｈｅのシグナルは、３．０１、２．９１ｐｐｍ付近にダブレットを形成し、その分裂幅は１６．５Ｈｚであった。プロトンＨｆのシグナルは４．３０ｐｐｍに測定された。

また、ガルシニア・カンボジアの果実の乾燥した果皮から、以下の方法により、（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸メチルエステル体を精製し標品として用いた。

ガルシニア・カンボジアの果実の乾燥した果皮１０ｇを、塩酸−メタノール（１．５ｗ／ｖ％）６０ｍｌに入れ、２４時間室温にて撹拌した。この溶液に、少量の飽和食塩水とジクロロメタン１００ｍｌを加えてヒドロキシクエン酸を分配抽出した。硫酸ナトリウムで乾燥させたジクロロメタン層を濃縮し、実施例１と同様の方法を用いてシリカゲルカラムグラフィーにより分離し、目的とするヒドロキシクエン酸のメチルエステル化物を精製した。

４００ＭＨｚ ＮＭＲスペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用い、精製した（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸のメチルエステル化物の^１Ｈスペクトルを測定した（ＣＤＣｌ_３溶液）。その結果、図１０に示されるように、ケミカルシフト２．７９ｐｐｍと３．１８ｐｐｍに（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸のメチルエステル体のラクトンを示すプロトンＨａ、Ｈｂが測定された。このダブレットの分裂幅は１８Ｈｚであった。またプロトンＨｃのシグナルは４．９３ｐｐｍに測定された。

さらに、ケミカルシフト３．０４ｐｐｍ付近に、（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸の非ラクトン型のメチルエステル体を示すプロトンＨｄ、Ｈｅが測定され、プロトンＨｆのシグナルは４．３２ｐｐｍに測定された。メチル基のプロトンのシグナルは４．０ｐｐｍ付近に測定された。

なお、図７、８、９、および１０に示される化学式は左がラクトン型、そして右が非ラクトン型の構造を示す。

（比較例２）
比較例１と同様の方法を用い、ハイビスカス・サブダリファの乾燥顎から、（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸を精製し、標品として用いた。

精製したヒドロキシクエン酸を乾燥させた後、３００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトロメーター（日本電子製）を用い、ヒドロキシクエン酸の^１Ｈスペクトルを測定した（Ｄ_２Ｏ溶液）。結果を図１１に示す。図１１に示されるように、ケミカルシフト３．２４ｐｐｍと２．７０ｐｐｍに（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸のラクトンのプロトンＨａ、 Ｈｂが測定された。このダブレットの分裂幅は１７．７Ｈｚであった。また、プロトンＨｃのシグナルは５．３０ｐｐｍに測定された。（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸の非ラクトン型のプロトンＨｄ、Ｈｅのシグナルは、２．９７、２．８４ｐｐｍ付近にダブレットを形成し、その分裂幅は１６．２Ｈｚであった。プロトンＨｆのシグナルは４．３７ｐｐｍに測定された。

また、比較例１と同様の方法を用い、ハイビスカス・サブダリファの乾燥顎から（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸のメチルエステル体を精製し、標品として用いた。

４００ＭＨｚ ＮＭＲスペクトロメーター（Ｂｒｕｋｅｒ社製）を用い、精製した（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸のメチルエステル化物の^１Ｈスペクトルを測定した（ＣＤＣｌ_３溶液）。結果を図１２に示す。図１２に示されるように、ケミカルシフト３．０８ｐｐｍと２．８８ｐｐｍに（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸のメチルエステル体のラクトンを示すプロトンＨａ 、Ｈｂが測定された。このダブレットの分裂幅は１７．４Ｈｚであった。またプロトンＨｃのシグナルは５．１３ｐｐｍに測定された。また、ケミカルシフト３．１６ｐｐｍと２．９７ｐｐｍに（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸の非ラクトン型のメチルエステル体を示すプロトンＨｄ、Ｈｅが測定された。このダブレットの分裂幅は１７Ｈｚであった。プロトンＨｆのシグナルは４．３６ｐｐｍに測定された。メチル基のプロトンのシグナルは４．０ｐｐｍ付近に測定された。

なお、図１１および１２に示される化学式は、左がラクトン型、そして右が非ラクトン型の構造を示している。

本発明により製造されるヒドロキシクエン酸は、健康食品、ダイエット食品、肥満抑制剤などの用途に利用可能である。

Ｇ３株の培養液の上澄液（精製前）の高速液体クロマトグラフィー測定結果を示す図。 Ｇ３株の培養液の上澄液から精製されたヒドロキシクエン酸メチルエステル体の６００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。 ＧＤ８８Ａ株の培養液の上澄液（精製前）の高速液体クロマトグラフィー測定結果を示す図。 ＧＤ８８Ａ株の培養液の上澄液から精製されたヒドロキシクエン酸メチルエステル体の４００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。 Ｇ４５Ｃ株の培養液の上澄液（精製前）の高速液体クロマトグラフィー測定結果を示す図。 Ｇ４５Ｃ株の培養液の上澄液から精製されたヒドロキシクエン酸メチルエステル体の３００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。 ガルシニア抽出物（分離前）の高速液体クロマトグラフィー測定結果を示す図。 ガルシニア抽出物（分離後）の高速液体クロマトグラフィー測定結果を示す図。 Ｄ_２Ｏ中で測定したガルシニア型ヒドロキシクエン酸（（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸）の３００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。 ＣＤＣｌ_３中で測定したガルシニア型ヒドロキシクエン酸（（２Ｓ、３Ｓ）−ヒドロキシクエン酸のメチルエステル体）の４００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。 Ｄ_２Ｏ中で測定したハイビスカス型ヒドロキシクエン酸（（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸）の３００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。 ＣＤＣｌ_３中で測定したハイビスカス型ヒドロキシクエン酸（（２Ｓ、３Ｒ）−ヒドロキシクエン酸のメチルエステル体）の４００ＭＨｚ ^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図。

Claims (8)

1. ヒドロキシクエン酸の製造方法であって、
   ヒドロキシクエン酸生産能を有する微生物を培養する工程、および
   得られた培養液からヒドロキシクエン酸を回収する工程、を包含する、方法。
2. 前記微生物が、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する放線菌である、請求項１に記載の方法。
3. 前記放線菌が、ストレプトミセスＧ３株である、請求項２に記載の方法。
4. 前記微生物が、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌である、請求項１の方法。
5. 前記細菌が、ミクロバクテリウムＧＤ８８Ａ株である、請求項４に記載の方法。
6. 前記微生物が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する細菌である、請求項１のヒドロキシクエン酸製造方法。
7. 前記細菌が、バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である、請求項６のヒドロキシクエン酸製造方法。
8. 前記細菌が、バチルスＧ４５Ｃ株である、請求項６のヒドロキシクエン酸製造方法。
   

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