JP2005055429A - 顕微鏡システムで弱い蛍光放射を検出するための検知器と方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 弱い蛍光信号でも信頼性高く感知でき、フォトンの正確な計数を成し遂げる検知器を創出する。
【解決手段】 顕微鏡システム（１００）は、検出された光ビーム（１７）の個々のフォトンを各々一つの事象（５０）として知覚し、それから特性関数（５２）の形式に出力信号を提供するように、構成される。フィルター回路（６１）が特性関数（５２）から、判別器（６０）に伝えられる新たな特性関数（５５）を形成する。
【選択図】 図４

Description

本発明は、顕微鏡システムで弱い蛍光放射を検出するための検知器に関する。
本発明は更に顕微鏡システムで弱い蛍光放射を検出するための方法に関する。

ドイツ連邦共和国特許公開公報ＤＥ１０１１０９２５Ａ１

特許文献１は、レーザー走査システムにおけるフォトン計数のための方法を開示する。フォトン計数は、個々のパルスを幾つかのしきい値と比較することによってなされる。しきい値の位置に基づいて様々なピークに異なるフォトン数が割り当てられる。これらフォトン数から上記ピークが発生するものである。例えば二つのフォトンから成るピークが二つのフォトンのために備えられたしきい値に達しないならば、ただ一つのフォトンがそのピークのために計数される。

本発明の課題は、弱い蛍光信号でも信頼性高く感知でき、フォトンの正確な計数を成し遂げる検知器を創出することである。
本発明の更なる課題は、生きている細胞の適用において生じるような弱い蛍光信号でも信頼性高く感知できる方法を創出することである。

上記第１の課題は請求項１の特徴構成を有する顕微鏡システムを介して解決される。
第２の課題は請求項６の特徴構成を有する方法を介して解決される。

本発明は、上記検知器を用いて、顕微鏡システムでの弱い蛍光放射を検出することが可能であるという利点を有する。検出された光ビームの個々のフォトンの各々を一つの事象として検出して、そこから特性関数（機能）の形式で出力信号を提供する検知ユニットをもたらす顕微鏡システムは、検出された光ビームを規定する。また上記特性関数から新たな特性関数を形成するフィルター回路がもたらされる。当該フィルター回路から下流に、新たな特性関数としきい値に基づいて個々の事象を識別する判別器がある。

フィルター回路はアナログ形式又はデジタル形式で構成可能である。また個々の事象の評価と決定・定量を伴う相応したソフトウエアプログラムがもたらされる。

本発明の主題（サブジェクトマター）乃至発明対象は図面に概略的に表され、図面に関連して以下に述べられる。

図１は共焦点の走査顕微鏡の例示的な実施形態を概略的に示す。ただし、この実施形態は、図２に描写されたような検波器への適用にすぎず、発明を限定するものではない。少なくとも一つの照明システム１からの照明光ビーム３が、ビームスプリッタ又は適当な偏向手段５によって走査モジュール７へ送られる。照明光ビーム３は、偏向手段５に当たる前に、照明ピンホール６を通過する。走査モジュール７はジンバル取り付けの走査ミラー９を含むが、これは照明光ビーム３を、走査光学システム１２と顕微鏡光学システム１３を介して被検物１５に案内する。照明システム１は、レーザー１０の光から白色光を生じるように構成され得る。このために微細構造要素８又はテーパー状のガラス繊維が備えられている。生物被検物１５（試料）又は透明被検物を用いる場合、照明光ビーム３はまた被検物１５を通って案内可能である。これらのために、もし適用可能ならば適当な染料を用いて、またしばしば幾つかの染料を用いて非発光試料が調製される（描写せず）。被検物１５に在る染料は照明光ビーム３によって刺激され、これらに特有な被検物の特徴区域において光を発する。被検物１５から進む光は検出された光ビーム１７を規定する。検出された光ビーム１７は検知器モジュール２２へ伝わる。検出された光ビーム１７は顕微鏡光学システム１３と走査光学システム１２を通り、走査モジュール７を介して偏向手段５に伝わり、これを通過して検知器モジュール２２に達する。検出ピンホール１８を通って少なくとも一つの検知器３６，３７（各々光電子増倍管として例示される）に当たる。図２に詳述された検知器は、より良好な光電子増倍管のように機能するので、この特徴を有するものとして分類される。しかしながら、当業者にとっては他の検知器形式（ＣＭＯＳ，ＣＣＤ，ダイオード）を用い得ることも十分に明白である。被検物１５から進む或いは被検物によって規定された検出光ビーム１７は図１に鎖線で描かれている。被検物１５から進む光のパワーレベルに比例する検出電気信号が検知器３６，３７に生じる。既に上に述べたように、一つ以上の波長の光が被検物１５から発するので、少なくとも一つの検知器３６，３７の前にＳＰモジュール２０を備えることが有効である。少なくとも一つの検知器３６，３７によって生じるデータはコンピュータシステム２３に伝えられる。少なくとも一つの周辺装置２７がコンピュータシステム２３と協働する。周辺装置２７は例えばディスプレイであり、これでユーザーは走査顕微鏡１００を調整するために指示を受けたり、図式的形態で現在の設定や画像データを見ることができる。付加的に入力手段２８が協働する。当該手段は例えばキーボード、顕微鏡システムの構成要素のための調整装置、及び／又はマウス３０を有する。同様にコンピュータシステム２３と、データ群を記憶するメモリ２４が協働する。付加的にコンピュータシステム２３で、適切な計算をなし得るソフトウェアプログラム２５が実行される。更に画像取得のための調整要素４０，４１がディスプレイ２７上に表示される。ここに示した実施形態では、調整要素４０，４１はスライダとして表される。調整要素４０，４１はまた、或るパラメータに対するイエス／ノー作動が可能なチェックボックスとして具現化可能である。他のいかなる形態も当業者の専門能力の範囲内である。検出された光ビーム１７はプリズム３１で空間的にスペクトル分離される。スペクトル分離のための他の可能性は、反射乃至伝播格子（grating）の使用である。スペクトル分離された光扇３２は集束光学システム３３で焦点合わせされ、ミラー止め装置３４，３５に当たる。ミラー止め装置３４，３５、空間的スペクトル分離のための手段、集束光学システム３３及び検知器３６，３７は一緒になってＳＰモジュール２０（又は多帯域検知器）として解釈される。

図１に描かれたように、共焦点顕微鏡の焦点が固有時間ｄＴの間に被検物１５の一点に向けられると、個々のフォトンが被検物におけるその点から発せられ、検知器３６，３７によって検出される。図２ａにおいて、被検物１５から進む個々のフォトンは矢印で描かれ、個々の矢印は各々、時間ｔに関して描かれている一つの（特異な）事象５０を表す。（この用語は信号処理や理想化されたモデリングのための物理学において一般的に知れ渡ったものであり、ディラックパルスDirac pulseと呼ばれる。）時間ｔが横座標５１にプロットされる。蛍光の、又は被検物１５から進む光の個々のフォトンは、特性関数５２において検知器３６，３７によって表された特異な事象５０である。時間に関するフォトン束は、特性関数５２として検知器３６，３７（例えば光電子増倍管）で各フォトンのために表され得る。一つの例示的な実施形態において特性関数５２はディラック関数（デルタ関数）である（図２ｂ）。二つの異なるプロセスが検知器３６，３７で生じる。フォトン又は事象５０が検知器３６，３７に達し、特性関数５２によって時間に関し塗り込められる（折り畳み）。その際、この特性関数５２は比較的一定で（図２ｂ参照）、場合によっては入射方向とフォトンの異なるエネルギーに依存する。その信号強度は検知器３６，３７の端部に存する。フォトンカウンターの機能・作動の従来の挙動はしきい値５３を伴い（判別器）、そのしきいを超えるＰＭＴ出力の信号推移が事象として計数される（図３ａ参照）。フォトンカウンターのこのような作用・働きは、低光量状態（少数のフォトン）においてのみ機能し得ることは図３ｂから明らかである。図３ｂに示された状態は、幾つかのフォトンが検知器３６，３７に立て続けに達するものである。事象又は特異点に関連した個々の特性関数５２が重複領域５４を有する。図３ｂに示された状態において、交差点５６はしきい値５３より上にあり、交互に達する二個のフォトンは二つの事象５０として認識されない。個々の事象５０の分離は図３ｃに示される。特性関数５２が知られているので、特異点によって生じるパルスを新しい形にするか鋭利にする信号プロセッサーを上流に備え得る。方法の異なる二つの実施形態が可能である。第１の実施形態は時間信号の線・形解析である。第２の実施形態は相関確定と相関検知器（整合フィルター）への移行である。原理上は可能であるが現実に誰も用いたいとは思わないほど複雑で高価で困難であるので、ここでは線・形解析が完備のためにのみ含まれる。しかしながら相関検出は簡単で容易に適用される概念である。特性関数５２は知られ（比較的一定である）、したがって予想信号を備えた相互相関が入力信号から計算可能である。更に、特性関数において僅かな変動の場合、その十分正確な概算（近似）が決められ得る。そしてその後、電子フィルターの形式での手段が考慮されるならば、ろ過自体が、アナログ重畳積分を介して実質的に起こる。また、検知器での信号が非常に素早く変えられ、ＦＰＧＡ等でのアルゴリズムとして全てが行われるならば、デジタル重畳合計も可能である。そして特性関数５２が夫々の場合に、上記方法の一つを用いて確かめられた新たな特性関数５５によって置き替えられる。実際問題として、これは信号処理のためのフィルター回路６１が、特性関数５２に対し鏡映するパルス応答を有する判別器６０と検知器３６，３７の間におかれることを意味する（図４参照）。このフィルター回路６１の影響は、入力信号（特性関数５２）が鏡映特性関数６３を備えた重ね合わせから成り立つか、十分な精度を伴ってそれに近づくことである。得られた結果は、個々の成分を良好に分離する新たな特性関数５５である。図３ｃはフィルター回路６１の作用・働きを説明する。フィルター回路６１はピンクノイズに起因する干渉を阻止する（即ち、特性関数の結果として期待される以外の形状を有した事象）：言い換えれば、ノイズに対する信号の比率（signal-to-noise ratio）と検出が実際の使用において良好になる。フィルター回路６１は新たな特性関数５５を形成するが、それは、オリジナルの特性関数５２に対する類似性が最大であるところの地点又は特異点に信号を相当に集中するので、より鋭く立ち上がっている。結果としての個々の新たな特性関数５５はより良好に分けられる。新たな特性関数５５は、新たな特性関数５５のオーバーラップ５６が最大・極大に関して形成されるようにあり、それゆえ（最大・極大に対して）適切にしきい値を形成する場合、しきい値５３の下に位置する。立て続けの事象５０のカスケードがより良好に分けられる。個々の事象が互いに分かれるので、新たな特性関数５５の結果として、判別器６０より下流のカウンター６２が事象５０を探知する。この方法によって、より多いフォトン計数を有するフォトンカウンターの作動が可能となることは直接的に明白である。干渉がろ過して取り除かれるので、インテグラティブアプローチもそれから得られる。

ＳＰモジュールが検知器に先行する走査顕微鏡を概略的に示す図である。 事象として記録された様々なフォトンの固有時間ｄＴに対する関係を概略的に示すグラフである。 例えば一つのフォトンが検知器で記録された特性関数を示す図である。 特性関数の判別のためのしきい値が備えられた光電子増倍管での信号を示す図である。 検知器で二つのフォトンの結果として記録された際の二つの特性関数を表す図である。 二つの別個の事象に分離することが可能な信号加工操作を表す図である。 信号加工操作の関数化を図式化した図である。

符号の説明

１７ 光ビーム
２０ 検出ユニット、ＳＰモジュール
５０ 事象
５２ 特性関数
５３ しきい値
５５ 新たな特性関数
６０ 判別器
６１ フィルター回路
６２ カウンター
１００ 顕微鏡システム

Claims (9)

1. 顕微鏡システム（１００）で弱い蛍光放射を検出するための検知器であって、上記顕微鏡システム（１００）は検出された光ビーム（１７）を規定し、そこでは、検出された光ビーム（１７）の個々のフォトンを各々一つの事象（５０）として知覚しそれから出力信号を特性関数（５２）の形式で提供する検知ユニット（２０）が備えられ；上記特性関数（５２）から新たな特性関数（５５）を形成するフィルター回路（６１）が設けられ；当該フィルター回路（６１）に続いて、新たな特性関数（５５）としきい値（５３）に基づいて個々の事象（５０）を識別する判別器（６０）が置かれるような、検知器。
2. 上記フィルター回路（６１）がアナログ式電子システムの形式で具現化される、請求項１に記載の検知器。
3. 上記フィルター回路（６１）がデジタル式電子システムによって構成される、請求項１に記載の検知器。
4. 上記フィルター回路（６１）がソフトウエアプログラムと共に働く、請求項３に記載の検知器。
5. 上記判別器（６０）に続いて、判別器（６０）によって識別された事象（５０）を計数するカウンター（６２）が置かれる、請求項１又は２に記載の検知器。
6. 少なくとも一つの検知器（３６，３７）を包含する顕微鏡システム（１００）で弱い蛍光放射を検出する方法であって、
   −フィルター回路（６１）に、上記検知器によって出力された事象（５０）の特性関数（５２）を伝えること；
   −上記特性関数（５２）をフィルター回路（６０）でほぼ鏡映された相関特性関数（６３）に適用することによって新たな特性関数（５５）を生じること；
   −上記新たな特性関数（５５）を判別器（６０）に伝えること；及び
   −上記判別器（６０）から下流のカウンター（６２）で上記事象（５０）を計数すること
   の各ステップを特徴とする方法。
7. 検知器（３６，３７）によって出力された特性関数（５２）がフィルター回路（６１）で形作られ；フィルター回路（６１）がアナログ式である、請求項６に記載の方法。
8. 検知器（３６，３７）によって出力された特性関数（５２）がフィルター回路（６１）で形作られ；フィルター回路（６１）がデジタル式である、請求項６に記載の方法。
9. フィルター回路（６１）がソフトウエアプログラムと共に働く、請求項８に記載の方法。

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