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Die
Erfindung betrifft einen Detektor zur Detektion schwacher fluoreszenter
Strahlung mit einem Mikroskopsystem.
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Desweiteren
betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Detektion schwacher fluoreszenter
Strahlung mit einem Mikroskopsystem.
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Die
deutsche Offenlegungsschrift
DE 101 109 25 A1 offenbart ein Verfahren
zur Photonenzählung
in einem Laser-Scanning-System. Die Zählung der Photonen erfolgt
dadurch, dass die einzelnen Impulse mit mehreren Schwellen verglichen
werden. Aufgrund der Lage der Schwelle werden den verschiedenen
Peaks unterschiedliche Photonenzahlen zugeordnet aus denen sie entstanden
sind. Erreicht zum Beispiel ein Peak, der aus zwei Photonen besteht
nicht die für
zwei Photonen vorgesehene Schwelle, so wird für diesen Peak nur ein Photon zählt.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde einen Detektor zu schaffen,
mit dem auch schwache fluoreszente Signale sicher erfasst werden
können und
ein genaue Zählung
der Photonen erfolgt.
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Die
objektive Aufgabe wird durch ein Mikroskopsystem gelöst, das
die Merkmale des Patentanspruchs 1 aufweist.
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Der
Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde Verfahren zu schaffen,
mit dem auch schwache fluoreszente Signale – wie sie bei Lebendzellanwendungen
auftauchen – sicher
erfasst werden können.
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Die
objektive Aufgabe wird durch ein Verfahen gelöst, das die Merkmale des Patentanspruchs
6 aufweist.
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Die
Erfindung hat den Vorteil, dass mit dem Detektor eine Detektion
schwacher fluoreszenter Strahlung mit einem Mikroskopsystem möglich ist. Das
Mikroskopsystem definiert einen Detektionslichtstrahl, in dem eine
Detektionseinheit vorgesehen ist, die einzelne Photonen des Detktionslichtstrahls
als jeweils einen Event erfasst und hieraus ein Ausgangssignal in
Form einer charakteristischen Funktion liefert. Ferner ist ein Filterkreis
vorgesehen, der aus der charakteristischen Funktion eine neue charakteristische
Funktion formt. Dem Filterkreis ist ein Diskriminator nachgeschaltet
ist, der anhand der neuen charakteristischen Funktion und eines Schwellwerts
einzelne Events unterscheidet.
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Der
Filterkreis kann analog oder digital ausgestaltet sein. Ebenso ist
eine entsprechende Software mit der Auswertung und Bestimmung der
einzelnen Events vorgesehen.
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In
der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt
und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben. Dabei zeigen:
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1 eine schematische Darstellung
eines Scanmikroskops, wobei den Detektoren ein SP Modul vorgeschaltet
ist;
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2a eine schematische Darstellung
von mehrere Photonen, die als Events über eine bestimmte Zeit dT
registriert werden;
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2b eine charakteristische
Funktion mit der z.B. ein Photon am Detektor registriert wird;
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3a ein Signal am Photomultiplier,
wobei ein Schwellwert zur Diskriminierung der charakteristischen
Funktion vorgesehen ist;
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3b eine Darstellung von
zwei charakteristischen Funtionen wie sie aufgrund von zwei Photonen
am Detektor registriert werden;
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3c eine Darstellung der
Signalverarbeitung, bei der eine Trennung in zwei diskrete Events möglich ist;
und
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4 eine graphische Darstellung
der Funktionsweise der Signalverarbeitung;
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In 1 ist das Ausführungsbeispiel
eines konfokalen Scanmikroskops schematisch gezeigt. Dies soll jedoch
nicht als Beschränkung
der Erfindung aufgefasst werden, da dies nur ein Anwendungsfall
für einen
sensitiven Detektor ist, wie er in 2 sikizziert
ist. Der von mindestens einem Beleuchtungssystem 1 kommende
Beleuchtungslichtstrahl 3 wird von einem Strahlteiler oder
einem geeigneten Umlenkmittel 5 zu einem Scanmodul 7 geleitet. Bevor
der Beleuchtungslichtstrahl 3 auf das Umlenkmittel 5 trifft,
passiert dieser ein Beleuchtungspinhole 6. Das Scanmodul 7 umfasst
einen kardanisch aufgehängten
Scanspiegel 9, der den Beleuchtungslichtstrahl 3 durch
eine Scanoptik 12 und eine Mikroskopoptik 13 hindurch über bzw.
durch ein Objekt 15 führt.
Das Beleuchtungssystem 1 kann derart ausgestaltet sein,
dass es aus dem Licht eines Lasers 10, Weisslicht erzeugt.
Hierzu ist ein mikrostrukturiertes Element 8 oder eine
tapered Glasfaser vorgesehen. Bei biologischen Objekten 15 (Präparaten)
oder transparenten Objekten kann der Beleuchtungslichtstrahl 3 auch
durch das Objekt 15 geführt
werden. Zu diesen Zwecken werden nichtleuchtende Präparate ggf.
mit einem geeigneten Farbstoff und oftmals auch mit mehreren Farbstoffen
präpariert
(nicht dargestellt, da etablierter Stand der Technik). Die in dem Objekt 15 vorhandenen
Farbstoffe werden durch den Beleuchtungslichtstrahl 3 angeregt
und senden Licht in einem ihnen eigenen charakteristischen Bereich des
Spektrums aus. Dieses vom Objekt 15 ausgehende Licht definiert
einen Detektionslichtstrahl 17. Der Detektionslichtstrahl 17 gelangt
zu einem Detektormodul 22. Der Detektionslichtstrahl 17 gelangt durch
die Mikroskopoptik 13, die Scanoptik 12 und über das
Scanmodul 7 zum Umlenkmittel 5, passiert dieses
und gelangt zum Detektormodul 22. Über ein Detektionspinhole 18 trifft
dieser auf mindestens einen Detektor 36, 37, der
jeweils als Photomultiplier ausgeführt ist. Der in 2 spezifizierte Detektor
ist in diese Charakteristik einzuordnen, da er sich wie ein besserer
Photomultiplier verhält.
Es ist dem Fachmann jedoch hinreichend klar, das auch andere Detektorformen
(CMOS, CCD, Dioden) eingesetzt werden können. Der vom Objekt 15 ausgehende
bzw. definierte Detektionslichtstrahl 17 ist in 1 als gestrichelte Linie
dargestellt. In den Detektoren 36, 37 werden elektrische,
zur Leistung des vom Objekt 15 ausgehenden Lichtes, proportionale
Detektionssignale erzeugt. Da, wie bereits oben erwähnt, vom
Objekt 15 Licht nicht nur einer Wellenlänge ausgesandt wird, ist es
sinnvoll vor dem mindestens einen Detektor 36, 37 ein
SP-Modul 20 vorzusehen. Die von dem mindestens einen Detektor 36, 37 erzeugten
Daten werden an ein Rechnersystem 23 weitergegeben. Dem
Rechnersystem 23 ist mindestens ein Peripheriegerät 27 zugeordnet.
Das Peripheriegerät 27 kann z.B.
ein Display sein, auf dem der Benutzer Hinweise zur Einstellung
des Scanmikroskops 100 erhält oder den aktuellen Setup
und auch die Bilddaten in graphischer Form entnehmen kann. Ferner
ist dem Rechnersystem 23 ein Eingabemittel 28 zugeordnet,
das z.B. aus einer Tastatur, einer Einstellvorrichtung für die Komponenten
des Mikroskopsystems und/oder einer Maus 30 besteht. Ebenso
ist dem Rechnersystem 23 ein Speicher 24 zugeordnet,
in dem die Datensätze
abgelegt werden. Ferner ist im Rechnersystem 23 eine Software 25 implementiert,
mit der geeignete Berechnungen durchgeführt werden. Hinzu kommt, dass
zusätzlich
auf dem Display 27 auch Einstellelemente 40, 41 für die Bildaufnahme
dargestellt werden. In der hier gezeigten Ausführungsform sind die Einstellelemente 40, 41 als Schieber
dargestellt. Ebenso können
die Einstellelemente 40, 41 als Checkboxen ausgebildet
sein, über
die ein Ja/Nein aktivierung für
bestimmte Parameter möglich
ist. Jede andere Ausgestaltung liegt im handwerklichen Können eines
Fachmanns. Der Detektionslichtstrahl 17 wird mit einem
Prisma 31 räumlich
spektral aufgespalten. Eine weitere Möglichkeit der spektralen Aufspaltung
ist die Verwendung eines Reflexions-, oder Transmissionsgitters.
Der spektral aufgespaltene Lichtfächer 32 wird mit der
Fokussieroptik 33 fokussiert und trifft anschließend auf
eine Spiegelblendenanordnung 34, 35. Die Spiegelblendenanordnung 34, 35,
die Mittel zur spektralen, räumlichen
Aufspaltung, die Fokussieroptik 33 und die Detektoren 36 und 37 werden
zusammen als SP-Modul 20 (oder Mutibanddetektor) bezeichnet.
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Zielt
man mit dem Focus eines Konfokalmikroskops, wie in 1 dargestellt, für eine bestimmte Zeit dT auf
einen Punkt im Objekt 15, so werden von diesem Punkt des
Objekts einzelne Photonen ausgesendet und vom Detektor 36, 37 detektiert.
In 2a sind die einzelnen
vom Objekt 15 ausgehenden Photonen als Pfeile dargestellt,
wobei die einzelnen Pfeile für
jeweils einen Event 50 (singuläres Ereignis) stehen, die über die
Zeit t dargestellt sind. (Diese Nomenklatur ist in der Signalverarbeitung
und der Physik zur idealisierten Modellbildung üblich und wird Dirac Impuls
genannt.) Die Zeit t ist auf der Abszisse 51 aufgetragen.
Die einzelnen Photonen des Fluoreszenzlichts oder des vom Objekt 15 ausgehenden Lichts
sind singuläre
Events 50 (singuläre
Ereignisse), die durch die Detektoren 36, 37 in
einer charakteristischen Funktion 52 dargestellt werden.
Der Photonenfluss über
die Zeit kann pro Photon am Detektor 36, 37, der
z.B. ein Photomultiplier sein kann, als charakteristische Funktion 52 dargestellt
werden. In einem Ausführungsbeispiel
ist die charakteristische Funktion 52 eine Dirac-Funktionen, siehe
hierzu 2b. Am Detektor 36, 37 laufen
zwei verschiedenen Prozesse ab. Das Photon bzw. der Event 50 trifft am
Detektor 36, 37 ein und wird durch die charakteristische
Funktion 52 zeitlich verschmiert (Faltung), wobei diese
charakteristische Funktion 52 relativ konstant ist (siehe 2b) und ggf. von der Einfallsrichtung
und der unterschiedlichen Energie eines Photons abhängt, welche
Signalstärken
am Ende des Detektors 36, 37 anliegen. Die konventionelle
Arbeitsweise eines Photonenzählers
arbeitet mit einem Schwellwert 53 (Diskriminator), wobei
ein Signalübergang
des PMT Ausgangs über
diese Schwelle als Event gezählt
wird (siehe 3a). Aus 3b ist ersichtlich, dass
diese Arbeitsweise des Photonenzählers
nur im Low-Light Fall (geringe Anzahl von Photonen) funktionieren
kann. Die in 3b dargestellte Situation
ist die, dass mehrere Photonen kurz nacheinander am Detektor 36, 37 eintreffen.
Die einzelnen, den Events oder Singularitäten zugeordneten charakteristischen
Funktionen 52 besitzen einen Überschneidungsbereich 54.
Ferner haben die charakteristischen Funktionen einen Schnittpunkt 56 gemeinsam.
Der Schnittpunkt 56 liegt in der in 3b dargestellten Situation über dem
Schwellwert 53, so die zwei nacheinander eintreffenden
Photonen nicht als zwei Events 50 erkannt werden. Eine
Trennung der einzelnen Events 50 ist in 3c dargestellt. Da die charakteristische
Funktion 52 bekannt ist, kann man eine Signalverarbeitung
vorschalten, die den Puls, der durch die Singularität erzeugt
wird, wieder formt bzw. schärft.
Möglich
sind zwei unterschiedliche Ausführungsformen
eines Verfahrens. Ein erste Ausführungsform
ist eine Dekonvolution des Zeitsignals. Eine zweite Ausführungsform
ist eine Korrelationsbestimmung und ein Übergang zu einem Korrelationsdetektor
(matched filter). Dekonvolution steht hier nur zur Vollständigkeit,
denn es ist zwar prinzipiell möglich
aber so aufwendig und teuer und schwierig, dass es in der Praxis
wohl keiner machen will. Korrelationsdetektion ist jedoch ein einfaches
und leicht anzuwendendes Konzept. Die charakteristische Funktion 52 ist
bekannt – sie
ist relativ konstant – und
so kann aus dem Eingangssignal die Kreuzkorrelation mit dem von
erwarteten Signal gebildet werden. Ferner kann man – bei leichten
Variationen in der charakteristischen Funktion – eine hinreichend genaue Approximation
derselben bilden. Die Filterung selber geschieht dann im wesentlichen über ein analoges
Faltungsintegral, wenn eine Implementierung in Form eines elektronischen
Filters in Betracht gezogen wird. Ebenso ist eine digitale Faltungssumme
möglich,
wenn das Signal am Detektor recht schnell gewandelt wird und dann
das ganze als Algorithmus im FPGA oder Ähnlichem durchführt wird. Die
charakteristische Funktion 52 ist nun jeweils eine neue
charakteristische Funktion 55 ersetzt, die anhand einer
oben erwähnten
Methoden ermittelt wurde. In der Praxis heisst dies, dass ein Filterkreis 61 zur
Signalverarbeitung zwischen dem Detektor 36, 37 und
den Diskriminator 60 gesetzt wird, der eine zur charakteristischen
Funktion 52 gespiegelte Impulsantwort hat (siehe hierzu 4.). Dieser Filterkreis 61 bewirkt,
dass ein Eingangssignal, die charakteristische Funktion 52,
aus einer Superposition mit einer gespiegelten charakteristischen
Funktion 63 besteht oder diese hinreichend genau aunnähert. Als
Ergebnis erhält
man eine neue charakteristische Funktion 55, die die einzelnen
Bestandteile besser trennt. In 3c ist
die Funktionsweise des Filterkreises 61 verdeutlicht. Der
Filterkreis 61 unterdrückt Störungen durch
rosa Rauschen (d.h. Events mit anderer Gestalt als die durch die
charakteristische Funktion erwartete), d.h das Signal zu Rauschverhältnis und
die Detektion werden in der Praxis besser. Der Filterkreis 61 formt
die neue charakteristische Funktion 55, die schärfer ansteigt,
da sie das Signal auf den Punkt bzw. die Singularität im wesentlichen
konzentriert, an dem die Ähnlichkeit
mit der ursprünglichen
charakteristischen Funktion 52 am Ähnlichsten ist. Die einzelnen
resultierenden neuen charakteristischen Funktionen 55 sind
besser getrennt. Die neue charakteristische Funktion 55 ist
derart, dass eine Überschneidung 56 der
neuen charakteristischen Funktion 55 im Verhältnis zum
Maximum bilden und somit bei geeigneter Schwellwertbildung (relativ
zum Maximum) unterhalb des Schwellwerts 53 liegt. Kaskaden
von dicht folgenden Events 50 können besser getrennt werden.
Ein dem Diskriminator 60 nachgeschalteter Zähler 62 erfasst
durch die neue charakteristische Funktion 55 die Events 50 als
einzelne und voneinander getrennte Events. Es ist direkt ersichtlich,
dass dieses Verfahren einen Betrieb eines Photonenzählers mit
höheren
Photonenzahlen erlaubt. Auch ein integrativer Ansatz profitiert
davon, da Störungen
rausgefiltert werden.
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Die
Erfindung wurde in bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es
ist jedoch selbstverständlich,
dass Änderungen
und Abwandlungen durchgeführt
werden können,
ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
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- 1
- Beleuchtungssystem
- 3
- Beleuchtungslichtstrahl
- 5
- Umlenkmittel
- 6
- Beleuchtungspinhole
- 7
- Scanmodul
- 8
- mikrostrukturiertes
Element
- 9
- Scanspiegel
- 10
- Laser
- 12
- Scanoptik
- 13
- Mikroskopoptik
- 15
- Objekt
- 17
- Detektionslichtstrahl
- 18
- Detektionspinhole
- 20
- SP-Modul
- 22
- Detektormodul
- 23
- Rechnersystem
- 24
- Speicher
- 25
- Software
- 27
- Peripheriegerät
- 30
- Maus
- 31
- Prisma
- 32
- aufgespaltener
Lichtfächer
- 33
- Fokussieroptik
- 34
- Spiegelblendenanordnung
- 35
- Spiegelblendenanordnung
- 36
- Detektor
- 37
- Detektor
- 50
- Event
- 51
- Abszisse
- 52
- charakteristische
Funktion
- 53
- Schwellwert
- 54
- Überschneidungsbereich
- 55
- neue
charakteristische Funktion
- 56
- Schnittpunkt
- 60
- Diskriminator
- 61
- Filterkreis
- 62
- Zähler
- 63
- gespiegelte
charakteristische Funktion
- 100
- Mikroskopsystem