DE10110925A1 - Verfahren zur Photonenzählung in Laser-Scanning-Systemen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Photonenzählung im Detektionskanal einer laserscannenden Anordnung, vorzugsweise eines Laser-Scanning-Mikroskops, wobei eine Amplitudenbestimmung der einlaufenden Photonen mittels mehrerer Schwellwerte erfolgt und die Schwellwertbestimmung mit einer zeitaufgelösten Messung gekoppelt ist, indem für einzelne Schwellwerte jeweils eine Pulszählung erfolgt und die Summe der Zählungen für die Schwellwerte ermittelt wird, wobei vorteilhaft bei Erreichen eines höheren Schwellwertes der Zählwert des niedrigen Schwellwertes für die Zählung abgespeichert wird.

Description

Es ist bereits bei Laser-Scanning-Mikroskopen bekannt, von einem PMT detektierte Photonen einzeln aufzulösen, indem über einem PMT nachgeordnete Impulsverstärker und Schwellwertschalter wie Komparatoren eine Zählung der Photonen erfolgt - Fig. 1.

In Fig. 2 sind typische Beispiele dargestellt wie Fehlmessungen auftreten können.

Übereinanderliegende Photonen haben die gleiche Breite aber eine größere Amplitude.

Mit einer Komparator/Diskriminatorlösung können nur Einzelphotonen einer festgelegten Amplitude gezählt werden. Wird die eingestellte Schwelle überschritten, dann wird ein Photon erkannt. Wenn zum gleichen Zeitpunkt zwei Photonen auftreffen, dann erhöht sich die Amplitude aber die Schaltschwelle wird auch nur einmal überschritten und damit einmal gezählt.

Nebeneinanderliegende (im Abstand nicht auflösbare Photonen) sind breiter als ein Photon haben aber gleiche Amplitude.

Der Komparator benötigt eine gewisse (Schaltzeit) um von einem Zustand in den anderen zu gelangen. Liegen die einzelnen Photonen so eng aneinander, das der Komparator mit seiner Schaltzeit nicht die Pegeländerungen der nebeneinanderliegenden Photonen erfassen kann wird er nur einen Zustand erkennen und damit auch nur ein Photon zählen.

Dies ist in Fig. 2 schematisch am Beispiel von zwei gleichzeitig auftretenden Photonen, die als eins gezählt werden sowie 5 Photonen dargestellt, wobei in diesem Fall 2 Photonen hintereinanderliegen, die ganz eng mit 3 Photonen hintereinander zusammenliegen und damit für den Komparator nur wie ein Photon wirken.

Eine denkbare Variante, die Photonenzeit als Torzeit für eine Frequenzmessung zu nutzen, erfaßt genau die ineinanderfließenden Photonen aber nicht die übereinanderliegenden Photonen sodaß auch hier immer eine Ungenauigkeit bleiben wird.

Erfindungsgemäße Lösung

Ankommende Photonen werden zweidimensional ausgewertet, indem die Amplitude in mehreren Schwellwerten gemessen wird und die Messung in einem Zeitraster erfolgt, mit einer Zählfrequenz mindestens zweifach der Photonzeit (empirische Dauer der erforderlichen Messung für ein Photon) werden Impulse einer höheren Frequenz gezählt als der durch die Photonenzeit vorgegebene.

Die Summenbildung aus Amplituden- und Zeitmessung bilden dann die wirkliche Photonenzahl ZP.

Für die Schwellwertbestimmung können beispielsweise Komparatoren, Diskriminatoren, Trigger, aber auch in digitaler Form AD-Wandler und dazugehörige Register genutzt werden.

Für die zeitaufgelöste Bestimmung kann die Photonenzeit als Torzeit genutzt werden währenddessen eine noch höhere Frequenz in den Zähler läuft.

Das Ergebnis kann sowohl in einem Zähler oder in einem Adder zusammen­ gefaßt werden und über ein Register ausgelesen werden. Nach jeder Messung wird das Register wieder durch einen Clear-Impuls gelöscht.

Das erfindungsgemäße Prinzip der zweidimensionalen Erfassung von Photonen wird nachstehend anhand Fig. 3a) und b) beschrieben.

Das zu messende Signal liegt gleichzeitig an den Eingängen der 4 Komparatoren an. Überschreitet das Eingangssignal die Schaltschwelle S1, kippt der Komparator und gibt über den ersten Negator N1 die Torschaltung (Negator und UND-Verknüpfung) frei.

Ist das Eingangssignal nur eine Photonzeit lang, laufen 2 Impulse (die Zählfrequenz ist so gewählt, daß während der Zeitdauer für ein Photon 2 Impulse gezählt werden) durch die UND-Verknüpfung in den Zähler 1 (x1). Wird während der Messzeit (Pixelzeit eines LSM, Verweildauer zur Erfassung eines Pixels) die Schaltschwelle S2 erreicht und die Impulsbreite des Komparators ist nur eine Photonzeit breit, laufen ebenfalls zwei Impulse über Leitung F, N2 und die UND- Verknüpfung in Zähler 2 ein.

Diese Formulierung F = 2 Impulse heißt, das wegen des Abtasttheorems mindest zwei Impulse pro einer Photonzeit gezählt werden müssen. Die Ermittlung der Gesamtphotonenzahl hat in der Summenformel dann den Faktor 1/2 stehen. Dieser resultiert aus der Festlegung mindestens 2 Impulse pro Photon. Würde man eine 10 fache Zählfrequenz festlegen, so müßte in der Summenformel der Faktor 1/10 stehen um auf die wirkliche Photonenzahl zu kommen. Hat Komparator S2 die Schwelle erreicht, wird sofort mit dem Ausgang des Komparators die UND-Verknüpfung des 1. Komparators gesperrt und die des zweiten Komparators geöffnet. Das spätere Schalten des zweiten Komparators wird durch die Laufzeit des Signales des ersten Komparators durch den ersten Negator N1 kompensiert so daß der zweite Komparator noch sicher die erste Torschaltung sperren kann. Die Impulse im Zähler 2 werden mit 2 (2xF), die imZähler 3 mit 3(3xF) usw. multipliziert und erhalten somit einen höheren Wert als Impulse die über Komparator eins in den Zähler 1 einlaufen. Damit wird die zweite Dimension gemessen, denn Photonen die hintereinander liegen erzeugen nur eine höhere Amplitude, können aber die gleiche Zeit dauern.

Die Schaltschwelle S3 und S4 verhalten sich in gleicher Weise. Jedesmal, wenn eine höhere Schaltschwelle anspricht werden die darunterliegenden Zählkanäle gesperrt, wobei die weiteren Negatoren N2, N3 . . wie beim ersten Negator für eine entsprechende Laufzeitkompensation sorgen, so daß die zweite oder weitere Torschaltungen noch gesperrt werden können.

Die jeweils höchste Schwelle hat Priorität. Nach Ablauf der Meßzeit werden die Zählwerte Z der Zähler i mit einem Adder zusammengefaßt (Summenbildung) und als Meßwert ZP z. B. in ein Register gestellt und nachfolgend von einem Computer gelesen und weiterverarbeitet. Bei Impulsen, die nur Komparator eins ansprechen, aber länger als eine Photonezeit dauern sind werden entsprechend mehr Impulse über Leitung F, die UND-Verknüpfung in den Zähler X1 einlaufen. Damit werden verschmolzene bzw. eng aneinanderliegende Photonen erkannt und richtig gezählt und interpretiert.

Die Verbindung der Amplitudenüberwachung und der Zeitmessung der ankommenden Photonen geben ein genaues Abbild der wirklichen Anzahl von Photonen wieder, die innerhalb einer Meßzeit auftreten.

Durch Verbesserung der Genauigkeit wird erreicht

• - daß durch mehrstufige Komparatoren unterschiedliche Amplituden des Photonenstromes ausgewertet werden
• - daß durch Zeitmessung zusammenhängende Photonen separiert werden können
• - daß das Ergebnis aus der Amplitudenmessung und der Zeitmessung die genaue Photonenzahl ergibt

Claims (2)

1. Verfahren zur Photonenzählung im Detektionskanal einer laserscannenden Anordnung, vorzugsweise eines Laser-Scanning-Mikroskopes, wobei eine Amplitudenbestimmung der einlaufenden Photonen mittels mehrerer Schwellwerte erfolgt und die Schwellwertbestimmung mit einer zeitaufgelösten Messung gekoppelt ist, indem für einzelne Schwellwerte jeweils eine Pulszählung erfolgt und die Summe der Zählungen für die Schwellwerte ermittelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei bei Erreichen eines höheren Schwellwertes der Zählwert des niedrigen Schwellwertes für die Zählung abgespeichert wird.