JP2004535783A - 乾癬の治療及び臨床的寛解のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】乾癬の治療と臨床的な寛解のための組成物及び方法を提供する。
【解決手段】リーシュマニア属の原生動物の粒子抗原から誘導される、個体の免疫応答を発生させて乾癬の臨床的症状を軽減するポリペプチドであって、SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 及びSEQ ID NO:14 から成る群から選択された単離されたアミノ酸配列又はそれらの免疫原性変異体を含む。
【解決手段】リーシュマニア属の原生動物の粒子抗原から誘導される、個体の免疫応答を発生させて乾癬の臨床的症状を軽減するポリペプチドであって、SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 及びSEQ ID NO:14 から成る群から選択された単離されたアミノ酸配列又はそれらの免疫原性変異体を含む。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、乾癬の治療と臨床的寛解のための免疫治療剤又は治療剤、それらの治療剤を含む組成物、及びそれらの治療剤及び組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、世界の人口の１乃至３パーセントがかかっている病因が不明の、慢性的で、遺伝的に影響される、寛解しては再発する鱗状化と炎症を伴う皮膚の病気である。乾癬には、斑状型、膿疱型、滴状型、関節症型、などいくつかのタイプがある。現在、乾癬には根治方法がなく、抑制治療しかできない（Greaves and Weinstein, 1995, Drug Therapy, 332: 581-588）。治療を必要とする徴候は、局所的な症状、例えば、痛みや痒み、手の機敏性の低下、歩行困難、及び顕著な手足や顔の病斑などの美容上の問題から生ずる。現在の有効な治療法には毒性があるので、軽症の患者は気になる症状（provoking factor）がなくなればそれ以上の治療を諦めてしまうことが多い。
【０００３】
現在の治療の目標は、乾癬が患者の職業、健康、又は個人生活や社会生活に実質的に支障とならないところまで、乾癬の深刻さと拡がりを減ずることである。どんなに深刻でも、安定状態の斑状乾癬の最初の治療は局所治療である。しかし、乾癬が皮膚の20パーセントを超えて拡がっている患者の場合、局所治療だけでは実際的でなく、全身治療も最初から必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
斑状乾癬の局所治療では、軟化剤、角質溶解剤、コールタール、アントラリン、効能が中〜強程度のコルチコステロイド、及びカルポトリエン（calpotrien）が使用される。これらの治療はすべて、効力にばらつきがあり、病気の頻繁な再発を防ぐことができず、副作用があり、それ自体美容上の問題がある。
【０００５】
身体的、社会的、又は経済的障害を引き起こし、局所治療ではその効果が現れない乾癬にかかっている患者には、全身的な治療が用いられる。現在、その選択は光線療法又は全身的薬物療法である。一般に、全身療法では、紫外線B照射による光線療法、光増感剤メトキサレンを紫外線A光線療法（PUVA）と組み合わせる光化学療法、メトトレキセート、エトレチネート、全身的コルチコステロイド、及びサイクロスポリンを用いている。これらの全身療法は、いずれも効力にばらつきがあり、望ましくない副作用があり、そのいくつかは非常に毒性が強く、病気を頻繁に再発させる。したがって、現在採用されている局所又は全身療法に関連した問題を回避できる有効な乾癬治療方法が現在必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は乾癬の治療と臨床的な寛解のための組成物及び方法を提供する。１つの様態では、リーシュマニア属の原生動物の粒子抗原から誘導される、個体の免疫応答を発生させて乾癬の臨床的症状を軽減するポリペプチドを提供する。この様態の一の実施の形態では、上記ポリペプチドは、SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, 及びSEQ ID NO:14に示された少なくとも１つのアミノ酸配列、又はその免疫原性変異体を含む。アミノ酸配列の免疫原性変異体とは、実質的な量の元の活性を保持した塩基配列の短縮（truncated）バージョン、又はその活性を保持するわずかなアミノ酸置換及び／又は変更を含む塩基配列の変更バージョンのどちらかである。
【０００７】
この様態の別の実施の形態では、上記ポリペプチドは、あるタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも免疫原性部分又はその免疫原性変異体を含み、該タンパク質はリーシュマニア属の原生動物から単離され、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって決定される見かけの分子量が21, 33, 44, 50, 55, 58, 65, 又は77 kDaである。
【０００８】
この様態のさらに別の実施の形態では、ポリペプチドはあるタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも免疫原性部分又はその免疫原性変異体を含み、該タンパク質はリーシュマニア属の原生動物から単離され、その完全還元（total reduction）と完全アルキル化の後のSDS-PAGEによって決定される見かけの分子量が73, 80, 又は82 kDaである。
【０００９】
関連した態様では、本発明はそのようなポリペプチドをコード化する核酸の配列、そのような核酸配列を組み込むベクター、微生物宿主細胞の形質転換、トランスフェクション又は形質導入によってそのようなポリペプチドを生産する方法、及びそのようなベクターによって形質転換される、そのような核酸配列でトランスフェクションされる、又はそのような核酸配列で形質導入される微生物宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明の別の様態では、１つ以上の本発明のポリペプチドを組み込んだ免疫治療剤が提供される。これらの免疫治療剤は、種々の抗体を混合した多価又は単価であり、接種された被験者から得られる免疫応答を強化するためのアルミナのような免疫助成剤（アジュバント）を含むことがある。ある好ましい実施例では、上記多価の免疫治療剤はリーシュマニアの４つの種、すなわち、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis,及びL.(L)chagasi, の混合物から単離されたポリペプチドを含む。また、ある好ましい一の実施の形態では、単価免疫治療剤は、これらの４つの種の１つから単離されたポリペプチドを含む。
【００１１】
本発明の別の様態では、乾癬の治療と臨床的寛解の方法が提供される。一の実施の形態では、そのような方法は、乾癬の臨床的症状を軽減する免疫応答を誘発させるために１つ以上の本発明のポリペプチドを含む治療的に効果的な量の製薬組成物を被験者に投与する処理を含む。関連した一の実施の形態では、そのような方法は、１つ以上の本発明の核酸配列を含む治療的に効果的な量の製薬組成物を被験者に投与する処理を含む。本明細書で用いる場合、“治療的に効果的な”という用語は、当業者にとって公知である乾癬面積及び重症度（severity）の約70 - 100%の減少を意味する。
【００１２】
本発明の別の様態は、本発明の核酸配列の遺伝分析用プローブとして及び分子量マーカーとしての使用、及び本発明のポリペプチドの分子量マーカーとしての使用を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、乾癬の治療と臨床的寛解のための新しい組成物及び方法に関する。この組成物は免疫原性のポリペプチド又はそれらをコード化する核酸を含む。本発明のポリペプチドは、温血動物において免疫応答を誘発して、乾癬の臨床的な寛解を引き出すことができる。本明細書で用いる場合、“温血動物”という用語はヒトを含む。本発明の一の実施の形態では、本発明のポリペプチドはリーシュマニア属の原生動物から、好ましくは殺生されたリーシュマニア属の無鞭毛原生動物から、単離できる。本発明のポリペプチドは、当業者に公知の標準的なタンパク質単離手順によってリーシュマニア属の原生動物から入手できる。本発明はまた、本発明の免疫原性ポリペプチドを組み込んだ免疫治療剤及び製薬組成物を対象としている。一の実施の形態では、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica, 及びL.(L)guyanensisなどの複数のリーシュマニア属の種の混合物から単離されたポリペプチドを含む第１世代多価免疫治療剤が提供される。好ましくは、この混合物はL.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, 及びL.(L)chagasiを含む。最も好ましくは、混合物はこれらの４つの種から成る。上記生物は、好ましくは、表１に定められる人工培養培地に5%ウシ胎児血清を補充したもので、一般的には約30 - 34 ℃で無鞭毛段階に培養される。その後、定常的な成長期に、無鞭毛原生動物は細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン（TLCK）、又は薬理的に許容されるその塩、を含む媒質で処理する。次に、死んだ細胞を分離して非イオン洗剤Nonidet p-40（NP40）で処理して表面抗原を可溶化してそれを除去する。本発明の免疫原性ポリペプチドを含む粒子抗原は、細胞を破壊した後に遠心分離によって集めることができる。これらのポリペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって洗浄した後、アルミナを含むPBSで4 ℃で５分間超音波処理して再懸濁させる。
【００１４】
他の実施の形態では、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica, 及びL.(L)guyanensisから成る群から選択された単一のリーシュマニア種から単離されるポリペプチドを含む第１世代単価免疫原性治療剤が記載される。好ましくは、この単一のリーシュマニア種は、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, 及びL.(L)chagasiから成る群から選択される。その他の点では、この免疫治療剤の調製の手順は、第１世代多価免疫原性治療剤について上で開示された手順と同一である。
【００１５】
他の実施の形態では、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica, 及びL.(L)guyanensisなどの複数のリーシュマニア属の種の混合物から単離されたポリペプチドを含む第２世代多価免疫治療剤が記載される。好ましくは、この混合物はL.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, 及びL.(L)chagasiを含む。最も好ましくは、混合物はこれらの４つの種から成る。上記生物は、好ましくは、表１に定められる人工培養培地に5%ウシ胎児血清を補充したもので、一般的には約30 - 34 ℃で無鞭毛段階で培養される。その後、定常的な成長期に、無鞭毛原生動物は細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン（TLCK）、又は薬理的に許容されるその塩、を含む媒質で処理する。次に、死んだ細胞を分離して非イオン洗剤Nonidet p-40（NP40）で処理して表面抗原を可溶化してそれを除去する。本発明の免疫原性ポリペプチドを含む粒子抗原は、細胞を破壊した後に遠心分離によって集めることができる。これらのポリペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって洗浄した後、4 ℃で５分間超音波処理して8 M 尿素、0.025 M Tris （Tris-ヒドロキシ-メチル-アミノ-メタン）で再懸濁させる。次に、ポリペプチドは8 M 尿素、0.025 M Trisを含むｐＨ8.3 の溶液中に0.05 - 0.3 M NaCl の段階的溶離によるDEAE-Sephadex カラムでのクロマトグラフィーにかけられる。７つのタンパク質分画が集められ、各分画のポリペプチドをアルミナを含むPBSで再懸濁させることによって各タンパク質分画を含む接種物（inoculum）が作られる。
【００１６】
他の実施の形態では、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica, 及びL.(L)guyanensisから成る群から選択された単一のリーシュマニア種から単離されるポリペプチドを含む第２世代単価免疫原性治療剤が記載される。好ましくは、この単一のリーシュマニア種は、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, 及びL.(L)chagasiから成る群から選択される。その他の点では、この免疫治療剤の調製の手順は、第２世代多価免疫原性治療剤について上で開示された手順と同一である。
【００１７】
上記に代えて、本発明のポリペプチドは公知の手順及び方法によって合成するか、又は、遺伝子組み換えで、所望のポリペプチドをコード化する１つ以上のヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換することによって生成できる。上記ポリペプチドは、これらを単離して所望の純度で精製できるように宿主細胞で形質発現させることができる。本発明のポリペプチドは、本発明に係る第３世代の免疫治療剤として用いて乾癬を治療することができる。
【００１８】
本発明はさらに、適当な宿主細胞を本発明のポリペプチドを生成させるように形質転換するために；温血動物に直接又は製薬的に許容される組成物の一部として投与して、免疫応答を生じさせそれによって動物の乾癬の臨床的寛解を引き出すために；遺伝的分析のための標識付けされたプローブとして；又は核酸分子量マーカーとして使用できる核酸配列に関する。
【００１９】
分子生物学の分野の当業者は、本明細書で提供される教示によって、本発明のポリペプチドをコード化する核酸を入手できる。例えば、本発明の第１世代免疫治療剤はリーシュマニア属の原生動物から単離，精製されたものであり、見かけの分子量が、それぞれ、21, 33, 44, 50, 55, 58, 65, 及び77 kDaである８つの異なるポリペプチドを表す、SDS-PAGEで同定される８つのバンドから成る。これらのバンドの各々は別々のポリペプチドを表し、それらは単離して標準的なアミノ酸配列決定手順によって配列を決定できる。各第２世代の免疫治療剤は、この８つのポリペプチドの混合物を含む第１世代の免疫治療剤をジエチルアミノエチル-（DEAE）-Sephadexでのクロマトグラフィーで処理することによって精製された。乾癬を治療する全ての活性を有する２つの画分が単離され、標準的な手順によって、完全に還元されアルキル化された。これらの画分を、アクリルアミド・ゲルでの電気泳動にかけて成分ポリペプチドを分離し、各ポリペプチドのアミノ酸配列が標準的なタンパク質配列決定手順によって得られた。これらのポリペプチドの各々をコード化するヌクレオチド配列は、これらのアミノ酸配列から遺伝コードを適用して導出できる。
【００２０】
さらに、本発明は本発明の免疫原性ポリペプチドを、それらをコード化する核酸を微生物宿主細胞に導入することによって大量生産することを対象としている。核酸は、宿主細胞のゲノムに直接導入するか、又は最初ベクターに組み込んで次にそれを宿主に導入してもよい。直接組み込む方法としては、例えば組み換えファージ又はコスミドによる形質導入、特別に処理された宿主バクテリア細胞に裸のファージ染色体を取り込ませるトランスフェクション、及びカルシウムの析出による形質転換などがある。これらの方法は当業者には周知である。
【００２１】
ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、及びファージがある。リーシュマニア属の種のゲノム・ライブラリーを通常の手段で作り出し、問題のDNAをそこから単離することができる。例えば、リーシュマニア原生動物のDNAを単離して公知の制限酵素によって制限することができる。次に、得られたDNA断片を適当なクローニング・ベクターに挿入して使用できる宿主に導入する。
【００２２】
対象となる宿主に応じて、ベクターにはいろいろな調節領域やその他の領域（通常は複製元、１つ以上のプロモータ領域、及び形質転換体の選択のためのマーカー等などを含ませてもよい。一般に、ベクターは問題のDNAの発現と増幅のための調節信号を提供する。
【００２３】
形質転換体の選択のためにいろいろなマーカーを用いることができる。例えば殺生物剤耐性、特に、アンピシリン、テトラサイクリン、トリメトプリン、クロールアンフェニコール、及びペニシリンなどの抗生物質に対する耐性；コリシンなどの毒素に対する耐性；及び水銀塩などの重金属に対する耐性をマーカーにすることができる。あるいはまた、栄養要求性の宿主に必須の栄養を提供する補完体（complementation）を用いることもできる。
【００２４】
本発明のポリペプチドの生産のために当業者に周知の方法に従って用いることができる宿主としては、原核生物、すなわち、バクテリア、などの単細胞微生物；及び例えば、酵母などの菌、藻類、原虫、カビなどの真核生物、ならびに培養されたもの・自然に存在する又は植えられた植物細胞があげられる。形質転換しやすいバクテリアの具体的な例としては、腸内細菌科のメンバー、例えばEscherichia coli; Salmonella; Bcillaceae,例えばBacillus sibtilis; Pneumococcus; Streptococcus; Haemophilus influenzae, 及び酵母、特にSaccharomycesがあげられる。本明細書で用いられる微生物宿主細胞という用語は、培養されたもの・自然に存在する又は植えられた植物細胞を含めたこれらの原核生物及び真核生物をすべて包含する。
【００２５】
あるDNAライブラリーのいくつかの断片と複合化（hybridized）して問題の遺伝子、すなわち、本発明の一部として記載されたポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を同定し選択すること（すなわち、“プロービング・アウト”）を可能にするユニバーサル・プローブを入手できる。これらの遺伝子の単離は分子生物学の分野の当業者に周知の方法を用いて行うことができる。単離された遺伝子は、適当なベクターに挿入して微生物宿主細胞の形質転換に用いることができる。さらに、これらの遺伝子を標準的な核酸配列決定手順で解析して本発明のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列についての具体的な情報を得ることができる。
【００２６】
現在では当業者には周知であるが、宿主細胞における発現向上されるために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用（codon usage）頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。本発明においては、“好ましいコドン使用の頻度”とは、あるアミノ酸を指定するためのヌクレオチド・コドンの使用においてある特定宿主細胞が示す偏好を指す。ある遺伝子におけるある特定コドンの使用頻度を決定するには、その遺伝子におけるそのコドンの出現回数をその遺伝子における同じアミノ酸を指定する全てのコドンの出現回数で割る。同様に、ある宿主細胞が示す好ましいコドン使用の頻度は、その宿主細胞が発現する多数の遺伝子における好ましいコドン使用の頻度を平均して計算することができる。この解析は、その宿主細胞が強く発現する遺伝子に限定することが好ましい。
【００２７】
したがって、本発明の一の実施の形態では、バクテリア、植物、その他の細胞が遺伝子工学的に処理されて、例えばリーシュマニア属の原生動物の遺伝子で形質転換されて、本発明のポリペプチド又はタンパク質の所望の発現レベルを達成する。発現が強化された遺伝子を得るために、遺伝子のDNA配列を変更して強く発現される遺伝子が好むコドンを含むようにして、ヌクレオチド塩基組成におけるA+T含有率が形質転換された宿主細胞に見られるものと実質的に同じになるようにする。また、前記宿主細胞に最適な開始配列を形成し、RNAの不安定化、不適当なポリアデニル化、劣化、終止を生ずる配列を除去し、二次的構造ヘアピン及びRNAスプライス・サイトを構成する配列を避けることが好ましい。例えば、合成遺伝子で、あるアミノ酸を指定するのに用いるコドンは、宿主細胞で強く発現される遺伝子でそのアミノ酸を指定するのに用いるコドン使用の分布頻度によって選択することができる。合成遺伝子で用いられるコドン使用の分布頻度は発現レベルの決定因子であるのは当業者に公知である。
【００２８】
本発明の遺伝子の組立は、当業者に公知の標準的な技術を用いて行うことができる。ある宿主細胞で強く発現されるように設計される構造遺伝子は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド二重鎖セグメントからDNAベクター内で酵素的に組み立てることができる。次にこの遺伝子を宿主細胞に導入して当業者に公知の手段によって発現させることができる。合成遺伝子の発現で生成されるタンパク質は原生のタンパク質と機能的に同等であることが好ましい。本発明によると、“機能的に同等”とは機能が同一または同一に近いことを指す。合成遺伝子産物で、その活性又は機能に関連した少なくとも１つの性質が天然のタンパク質と同様又は同一であるものは、それと機能的に同等と見なされる。
【００２９】
また、本発明のヌクレオチド配列を、元の全長の配列のその結果得られる断片の一部が該全長の配列の望ましい特性を保持するように短縮（truncate）できるということも当業者には周知である。様々な制限酵素がより大きい核酸分子から断片を生成するのに適していることは当業者には良く知られている。例えば、Ba131エキソヌクレアーゼがDNAの時間制御された限定された消化に好適に使用できることは周知である。（例えば、Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Pages 135-139参照。また、Wei et al., (1983) J. Biol. Chem. 258: 13006-13512参照。）すなわち、Ba131エキソヌクレアーゼは（一般に“塩基消去（erase-a-base）”手順と呼ばれる）、本発明の核酸の一方又は両方の端からヌクレオチドを除去することを可能にし、その結果広範なスペクトルの断片を生成し、その多くが本発明の天然のポリペプチド配列と機能的に同等である。ラベル標識手順も周知であり、当業者であればラベル標識された断片の複合化（hybridization）特性をごく普通にスクリーニングしてプローブとしての有用性を決定することができる。例えば、核酸をラベル標識して遺伝子同定又は診断手順で特定化又は選択プローブとして使用するのは日常的なことである。これらの配列の変型又は断片でリーシュマニア属の種のDNAに対し特定化及び選択的に複合化するものはプローブとしても機能するということは当業者には認識されるであろう。本発明の核酸のある断片が本発明によって特定化及び選択的に複合化する断片又は変型であるかどうかを決定することは当業者の通常の技術範囲内にあって過大な実験を必要としない。したがって、これらの核酸の断片又は変型はリーシュマニア属の種を同定したり、診断したり、識別したりするためのプローブとして有用である。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチド又はペプチドは、それぞれの核酸又はアミノ酸分子量決定又は測定における分子量マーカーとして有用であることも認められるであろう。
【００３１】
本発明による第１世代免疫治療剤を得るために、リーシュマニア属の生物を表１にリストされている成分を含む人工培地で培養することができる。ある好ましい実施の形態では、この培地には5%ウシ胎児血清が補充される。本発明による原生動物の培養は、代表的には、約30-34 ℃で行われる。特に好ましい実施の形態では、原生動物の培養はそのライフ・サイクルの無鞭毛段階で行われる。
【００３２】
【表１】
【００３３】
次に、原生動物細胞を含む培地を処理して、細胞を不活性化、好ましくは殺生することができる。これらの細胞を単離した後、抗原タンパク質をそれから精製して製薬的に許容されるキャリア、例えば緩衝液に含ませて第２世代の免疫治療剤を作り出すことができる。好ましくは、細胞は非溶解剤（non-lysing agent）、例えばTLCK、で不活性化又は殺生される。本発明の抗原タンパク質は通常の方法によって細胞から単離され得る粒状タンパク質である。より具体的な実施の形態では、本発明の第２世代免疫治療剤を作り出す方法は、（１）適当な培地で、好ましくは無鞭毛段階にある原生動物を培養するステップ；（２）前記原生動物細胞を処理して細胞を不活性化する又は殺生するステップ；（３）処理された細胞を単離するステップ；（４）単離された細胞から抗原タンパク質を抽出するステップ；及び（５）１つ以上の単離された抗原タンパク質を製薬的に許容されるキャリア、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と組み合わせて第２世代免疫治療剤組成物を調合するステップを含む。好ましい製薬的に許容されるキャリアはアルミナが溶液内に存在するPBS溶液である。
【００３４】
臨床的及び組織病理的に乾癬と診断された患者の乾癬を治療するために、第１世代多価免疫治療剤を、筋肉注射で三角筋部に、病気の重篤度に応じて、毎月１回、15日に１回、又は毎週１回、平均7.6 ± 6.0 月にわたって500 μg/服で投与した。
【００３５】
さらに乾癬を治療するために、第１世代多価免疫治療剤に含まれる各リーシュマニア種を含む単価免疫治療剤を本発明の組成物として用いて多価免疫治療剤と同様な結果を得た。
【００３６】
さらに乾癬を治療するために、生の第１世代免疫治療剤からクロマトグラフィー手段によって単離されたタンパク質画分を含む第２世代免疫治療剤を、0.1 mg アルミナ/mg タンパク質と合わせて、筋肉注射で三角筋部に15日に１回、一服当たり200 μg/0.5 ml で3-4服投与した。
【００３７】
以下は、本発明を実施する手順を例示する実施例である。これらの実施例は制限的なものと解してはならない。別に断らない限り、全てのパーセンテージは重量パーセントであり、全ての溶剤混合比率は体積比である。
【００３８】
実施例１
免疫原の調製
リーシュマニア属の原生生物を無鞭毛段階に表１に定められた人工培地に5%ウシ胎児血清を補ったもので代表的に約30-34 ℃で培養した（O'Daly et al., 1988, Acta Tropica (Basel), Vol. 45, pp. 109-126）。第２世代の免疫治療剤の調製のため、定常的な成長期の無鞭毛体を遠心分離（800 ｘ g,4 ℃で20分間）によって集め、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、150 μgのTLCKを含むEagle's MEM (Gibco)中で30-34 ℃で３日間インキュベートして記載されているような寄生体を不活性化した（O'Daly et al., 1986, Acta Tropica (Basel), Vol. 43, pp. 225-236）。PBSで２回洗浄した後（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）、1ml当たり1 ｘ 108 個の寄生体を0.12% Nonidet-P-40(NP40, Sigma)を含むMEM中で30 分間4 ℃でインキュベートして、表面抗原を可溶化し、それを除去した（O'Daly et al., 1990 AMJ Trop. Med. Hyg., Vol. 43, pp. 44-51）。粒子抗原を遠心分離（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）で集め、PBSで２回洗浄し、4 ℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath-Systems-Ultrasonic, Inc., Planview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理した。タンパク質含有量は、Lowryの方法で決定した（Lowry, O. et al., 1951, J. Biol. Chem., Vol. 193, pp. 265-275）。最終の単価第１世代免疫原試料は、アルミナ（水酸化アルミニウム低粘度ゲルREHYDRAGEL, Reheis Inc., New Jersey）を含むPBS 中に1 mg/mlの各リーシュマニア種抗原を、0.1 ml/mg (v/w)という寄生体タンパク質の濃度で含んでいた。免疫源の調製における各ステップで無菌性をチェックした。
【００３９】
本発明の別の実施の形態では、粒子抗原を遠心分離（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）で集め、PBSで２回洗浄し、8 モルの尿素、0.025 Tris (Tris-ヒドロキシ-メチル-アミノ-メタン)を含む溶液に溶解し、4 ℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath Systems Ultrasonic, Inc., Plainview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理した。タンパク質画分はDEAE クロマトグラフィーで分離した。
【００４０】
第２世代免疫治療剤は、本発明の組成物のDEAEクロマトグラフィーの後に単離された７つのタンパク質画分の各々であって、生の第１世代免疫治療剤のただ１つのリーシュマニア種、例えばL.(V)braisiliensis又はその他のリーシュマニア種のみを含むもので調製した。タンパク質含有量は、Lowryの方法で決定した（Lowry, O. et al., 1951, J. Biol. Chem., Vol. 193, pp. 265-275）。各タンパク質画分をPBSで溶解し、4 ℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath Systems Ultrasonic, Inc., Planview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理した。その後、各画分を0.20 μm Millipore（登録商標）フィルタによってフィルタ滅菌した。最終免疫原試料は、アルミナ（水酸化アルミニウム低粘度ゲルREHYDRAGEL, Reheis Inc., New Jersey）を含むPBS 中に400 μg/mlの各抗原画分を、0.1 ml/mg (v/w)のタンパク質分画の濃度で含んでいた。第２世代免疫源の調製における各ステップでも無菌性をチェックした。
【００４１】
部分標本（aliquots）を5%ウシ胎児血清を含むESM(FBS, Gibco)で、及び12.5%(w/v) Bacto-Peptone (Difco), 12.5% (w/v) 酵母エキス(Becton Dickinson), 3.75% (w/v) グルコース、及び3.75% (w/v) BBL 寒天(Becton Dickinson)を含む寒天平板でインキュベートした。サンプルは、速く生育するバクテリアを検出するために37℃で72時間インキュベートし、ゆっくりと生育するバクテリアと菌を検出するために26℃で3週間インキュベートした。免疫原の各バッチはSDS-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって監視してリーシュマニアタンパク質バンドのパターンが変わらないことを確認した。第１及び第２世代の免疫治療剤の各バッチはまた、E-TOXATE (Sigma)で発熱物質の存在をテストした。第１世代の免疫原は4℃で少なくとも4週間安定であった。
【００４２】
実施例２
免疫原のタンパク質成分
上記実施例１に記載した手順で得られた免疫原性組成物から、８つのたんぱく質バンドを、TLCKで処理されNP-40で抽出された、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasiからの無鞭毛体で、見かけの分子量が21, 33, 44, 50, 55, 58, 65, 及び77 kDaである無鞭毛体をSDS-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で処理することにより同定した。分子量が29〜96 kDaであるバンド２８と３０間の未処理の全ての無鞭毛体抽出物を、各リーシュマニア種で観測し、29,34,43,58,65 kDaの主要なバンドを観測した。
【００４３】
DEAE クロマトグラフィー後にたんぱく質画分３，４を含み、完全に還元されアルキル化された第２世代免疫治療剤の免疫原性組成物は、73,80,82 kDaの３つの分子量のバンドを有する。
【００４４】
実施例３
安全性および免疫性
上記実施例１と２に記載された第２世代免疫治療剤のタンパク質を含む免疫原性組成物を、5 mmを超えるIDRを生ずることができる投与量を求めるために、50 μgから始めて毎月50 μgずつ用量を増加して被検者に１ヶ月間隔で注射した。この投与量は、200 μgであることが見出された。免疫治療剤の最後の投与から１ヶ月及び６ヶ月後にこの被検者について以下の血液検査、即ち、全血球数、白血球分画、尿素、クレアチニン、糖アルカリ・ホスファターゼ、ビリルビン、トランスアミナーゼ、コレステロール、トリグリセリド、Ｃ反応性タンパク質、VDRL, HIV, 抗核抗体、LE細胞などの血清テスト、及び尿と便の検査を行った。全ての値が正常範囲にあり、何も副作用は認められなかった。
【００４５】
実施例４
免疫治療剤組成物の調製
第１世代単価免疫治療剤の調製のため、各リーシュマニア種の培養された無鞭毛体を遠心分離（800 ｘ g, 4 ℃で20分間）によって集め、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、150 μgのTLCKを含むEagle's MEM (Gibco)中で3 日間30-34 ℃でインキュベートし、上述の寄生体、即ち１ｍｌ当たり1 ｘ 108 個の寄生体を不活性化した。このステップは、無鞭毛体が定常的な成長期にあるとき、PBSで２回洗浄（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）した後で行うことが好ましい。
【００４６】
特に好ましい実施の形態では、本発明による保護的単価第１世代免疫原性組成物の調製は以下のステップを備える：
A) 無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、表１にリストされている成分を含む5%ウシ胎児血清を補充された人工培地で代表的に約30-34 ℃で培養するステップ；
B) 定常的な成長期にある無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、前記細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン又は製薬的に許容されるその塩を含む媒質にさらすステップ；
C) 前記殺生された細胞を単離するステップ；
D) 非イオン洗剤Nonidet p-40によって表面タンパク質を抽出するステップ；
E) 試料の遠心分離で粒子抗原を単離するステップ；
F) PBSで２回洗浄するステップ；及び
G) 前記殺生された細胞からの前記粒子抗原を、アルミナを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させることによって前記粒子抗原を含む免疫接種物を形成するステップ。
【００４７】
第２世代免疫治療剤の調製のため、培養された無鞭毛体を遠心分離（800 ｘ g, 4 ℃で20分間）によって集め、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、150 μgのTLCKを含むEagle's MEM (Gibco)中で3 日間30-34 ℃でインキュベートし、上述の寄生体、即ち１ｍｌ当たり1 ｘ 108 個の寄生体を不活性化した。このステップは、無鞭毛体が定常的な成長期にあるとき、PBSで２回洗浄（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）した後で行うことが好ましい。
【００４８】
特に好ましい実施の形態では、本発明による保護的第２世代免疫原性組成物の調製は以下のステップを備える：
A) 無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、表１にリストされている成分を含む5%ウシ胎児血清を補充された人工培地で代表的に約30-34 ℃で培養するステップ；
B) 定常的な成長期にある無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、前記細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン又は製薬的に許容されるその塩を含む媒質にさらすステップ；
C) 前記殺生された細胞を単離するステップ；
D) 非イオン洗剤Nonidet p-40によって表面タンパク質を抽出するステップ；
E) 試料の遠心分離で粒子抗原を単離するステップ；
F) PBSで２回洗浄するステップ；及び
G) 8モルの尿素、0.025モルのTris （Tris-ヒドロキシ-メチル-アミノ-メタン）を含む溶液に溶解し、4 ℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath Systems Ultrasonic, Inc., Planview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理するステップ；
H) 8モルの尿素、0.025 モルのTrisを含むｐＨ8.3 の溶液中で0.05 - 0.3 モルNaCl濃度のNaClを段階的に溶離してDEAE-Sephadex カラムでタンパク質画分を分離するステップ；及び
I) 前記殺生された細胞からの前記粒子抗原を、アルミナを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させることによって前記粒子抗原を含む免疫接種物を形成するステップ。
【００４９】
特に好ましい実施の形態では、本発明による乾癬の臨床的寛解のための第２世代免疫原性組成物の調製は以下のステップを備える：
A) 無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、表１にリストされている成分を含む5%ウシ胎児血清を補充された人工培地で代表的に約34 ℃で培養するステップ；
B) 定常的な成長期にある無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、前記細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン又は製薬的に許容されるその塩を含む媒質にさらすステップ；
C) 前記殺生された細胞を単離するステップ；
D) 非イオン洗剤Nonidet p-40によって表面タンパク質を抽出するステップ；
E) 第１世代免疫治療剤に存在するただ１つのリーシュマニア種、例えばL.(V)brasiliensis、又は他のリーシュマニア種からの粒子抗原に対してDEAE -Sephadexクロマトグラフィーをかけるステップ；
F) 0.05-0.3 モルNaClによる段階的溶離によって分離された７つのタンパク質画分を8モル尿素、0.025モルのTris を含むpH 8.3の溶液中で単離するステップ；
G) タンパク質画分を蒸留水により透析し凍結乾燥（lyophylization）するステップ；
H) タンパク質画分をリン酸緩衝生理食塩水に溶解するステップ；
I) Lowryの方法（Lowry, O. et al., 1951, J. Biol. Chem. Vol. 193, pp. 265-275）によって画分のタンパク質含有量を求めるステップ；
J) リン酸緩衝生理食塩水で各タンパク質画分を4℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath Systems Ultrasonic, Inc., Planview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理するステップ；
K) 各画分を0.20 μm Millipore（登録商標）フィルタに通すステップ；及び
L) １つ以上の前記タンパク質画分を含む第２世代免疫接種物を、アルミナを含むリン酸緩衝生理食塩水に該１つ以上の画分を再懸濁させることによって形成するステップ。
【００５０】
実施例５
L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi を含む第１世代多価免疫治療剤による乾癬の治療
【００５１】
【表２】
【００５２】
大多数の患者（79.17%）は年齢が26-65才であり平均年齢は42.56 ± 26.11才、その範囲は1才から88才までであった。
【００５３】
【表３】
【００５４】
35%は両親が乾癬であって、この病気の発病時期は11.6 ± 9.8 才で男性と女性で同様であり、その範囲は2才から46才までであった。
【００５５】
【表４】
【００５６】
92.6%が斑状乾癬の臨床形態を有し、それが純粋形態（79.1%）又は滴状と関連（10.1%）又は関節炎と関連（3.4%）に分布していた；10.1%が滴状乾癬の純粋な形態；0.3%が手掌と足底形態；1.8%が紅皮症であり、3.4％が乾癬性関節炎だった。
【００５７】
【表５】
【００５８】
1 PASI = 乾癬面積及び重篤度指数
2 8年間追跡
96%の患者が治療に対して10%を超えるPASI値の減少で応答し、わずかに4%だけが治療前の最初のPASI値の10%未満の減少で応答した。28%が病変の100%寛解を示し、病気は完全に消失した。これは男女で同様であった。全体で74%が病変の70-100%の寛解を示し、21%が最初のPASI値に比べて10-69%の寛解を示した。被検者の17.4%が、免疫治療剤の1-2回の投与の後に治療から離脱した（以下を参照のこと）。
【００５９】
【表６】
【００６０】
1 被験者の状態は８年間追跡された。
【００６１】
乾癬の100%の寛解には免疫治療剤の7.6 ± 6.0回の投与が必要だった。70-90%及び40-69%の寛解のグループでは投与量が少し高く、それぞれ、11.0 ± 10.0 及び9.0 ± 9.6 回に達していた。これは、臨床的寛解が主として被検者の免疫応答に依存すると言うことを示唆する。免疫治療剤に応答できる患者は治療の最初から応答することが確実である。応答しない患者は、免疫治療剤の投与回数が多くなっても依然として応答しない。
【００６２】
【表７】
【００６３】
1 月
病変が完全に寛解した648人の患者のうち188人（28.9%）の被検者で15.4 ± 20.6 月後に病気が再発した。再発時のPASI値は、治療前の最初のPASI値の1/3であった。新しい臨床的寛解でのPASIは再発時のPASI値よりもかなり低かった。新たな寛解は、5.8 ± 4.9 週後に免疫治療剤の7.1 ± 6.8回の投与で起こったが、これは最初の治療サイクルで病変の臨床的寛解に関して観測された期間よりも短かった。この再発グループでは、85.8%の患者で免疫治療剤を6-7回投与された後に再び病変が寛解した。
【００６４】
【表８】
【００６５】
小さな副作用が乾癬患者の半数未満に接種部位で観測され、性別や年齢による差は見られなかった。これらはすべて数日以内に消失した。第１世代免疫治療剤を21.4 ± 13.1 回投与された55人の乾癬患者のサンプルについての検査室分析の結果が表９に示されている。全ての値は正常の範囲内であることが見出された。
【００６６】
【表９】
【００６７】
実施例６
第１世代単価免疫治療剤の試験
【００６８】
【表１０】
【００６９】
免疫治療剤はまた、第１世代の免疫治療剤からのリーシュマニアの個々の種を用いて調製され、乾癬病変の臨床的寛解を生ずる能力がテストされた。表１５の結果は、乾癬患者の病変の臨床的寛解を得るためには第１世代の免疫治療剤における４つのリーシュマニア種の混合物を用意する必要はないということを明瞭に示している。１つのリーシュマニア種でも、多価免疫治療剤で用いられる４つの種の混合物と同様に、治療後に100%までのPASIの減少を生ずる効果がある。すなわち、どのリーシュマニア抽出物質にも乾癬に関連する炎症を抑える因子がある。
【００７０】
実施例７
調合と投与
本発明の化合物は、治療目的と非治療目的を含めいろいろな目的に有用である。この新しい化合物とそれを含む組成物の治療への応用は、現在又は将来の当業者に公知のどんな適当な治療方法及び手法によっても遂行できると考えられる。さらに、本発明の化合物は、他の有用な化合物及び組成物の調製のための出発物質又は中間物質としても有用である。
【００７１】
上述のようなホストに投与される用量は、感染の種類、ホストの年齢、体重、及び健康などの当該ホストのタイプ、並行した治療の存在と性質、治療の頻度、及び治療比に依存する。
【００７２】
本発明の化合物は製薬組成物の調製のための公知の方法によって調合できる。調合は、当業者に周知であり容易に利用できるいくつかの情報源に詳細に記載されている。例えば、E. W. Marin によるRemington's Pharmaceutical Scienceは、本発明に関連して利用できる調合を記載している。一般に、本発明の組成物は、有効な量の生物活性物質がその組成物の効果的な投与を容易にするために適当なキャリアと組合せられるように調合される。
【００７３】
実施例８
リーシュマニア種からのタンパク質画分のクロマトグラフィー分離とヒト末梢血液単核細胞による胚発生分析
前述のように、TLCKによるそれぞれの無鞭毛寄生体の処理とNP-40による抽出後、第１世代の免疫治療剤の第１の成分、粒子状のリーシュマニア chagasi抽出物から７つの画分を分離した。
【００７４】
これらの画分を、当業者には日常的な方法によって、ワクチン接種前及び後の乾癬患者からの末梢血液単核細胞による胚発生分析によりテストした。この実施例では、RPMI-1640に溶解された各画分の100 μlアリクオット（三重複）を平底マイクロタイタ・プレート（Falcon Plastics）に2 ｘ 105末梢血液単核細胞と共にプレインキュベートし、HISTOPAQUE （Sigma）で分離し、当業者にとっては日常的な方法で、20%の熱不活性化ウシ胎児血清を含む100 μlのRPMI-1640に再懸濁した。リンパ球刺激の陽性対照（positive control）としてコンカナバリンAを用いた。48 時間後、0.2 μCi/ウエルの3H-ティミジンを10μlアリクオットで加え、サンプルをさらに18時間インキュベートした。細胞は、自動細胞ハーベスター（MASHII）によって濾紙（ReeveAngel）に採取された。乾燥させたペーパー・ディスクを2.5 mlのAquasol(NEN)と共にミニバイアルに入れ、Packard Tri-Carb シンチレーション・カウンタModel 3385で１分間カウントした。刺激指数（S.I.）を各サンプルについて実験毎分カウント（c.p.m.）を対照c.p.m.で割って計算した（画分又はミトゲンの培養／培地だけの培養）。結果を以下の表１１-１４に示す。
【００７５】
【表１１】
【００７６】
ワクチン接種前の患者グループではS.I. ＞1.0であった。ワクチン接種後、この値は顕著に増加した。両グループの統計解析の結果は次の通りである：
対応のあるｔ検定：
差平均＝-.8739286（対の差の平均）
差の95%信頼区間：-1.150029から-0.5978283
両側ｐ値は＜0.0001---きわめて有意−
これらの結果は、L.(L)chagasi抽出物のいずれの画分の乾癬患者へのワクチン接種の後でも、リンパ球は著しく刺激されるということを示している。高い刺激指数は画分３と４、ならびに生きた無鞭毛体で観測された。
【００７７】
前述のように、TLCK によるそれぞれの無鞭毛寄生体の処理とNP-40による抽出後、第１世代の免疫治療剤の第２の成分である粒子状のL(V)brasiliensis 抽出物（PMH27）から７つの画分を分離した。
【００７８】
【表１２】
【００７９】
表１２では、ワクチン接種前に２つの患者グループが見られる、具体的には、１つのグループはS.I.＜1.0のグループであり、もう１つのグループはS.I.＞1.0のグループである。ワクチン接種後に治癒した患者のグループはワクチン接種前の２つの患者グループのどちらに比べても値が顕著に増加した。統計解析の結果は次の通りである：
S.I.＜1.0のグループ
対応のあるｔ検定：
差平均＝-1.107143（対の差の平均）
差の95%信頼区間：-1.534381から-0.6799043
両側ｐ値は＜0.0001---きわめて有意−
S.I.＞1.0のグループ
対応のないｔ検定：
差平均＝-.7285719（Bの平均マイナスAの平均）
差の95%信頼区間：-1.3904から-6.674413E-02
両側ｐ値は＜0.0316---有意−
これらの結果は、L.(V)brasiliensis抽出物のいずれの画分の乾癬患者へのワクチン接種によっても、ワクチン接種前の両グループのリンパ球は著しく刺激されるということを示している。高い刺激指数は画分３と４、ならびに生きた無鞭毛体で観測された。
【００８０】
前述のように、TLCK によるそれぞれの無鞭毛寄生体の処理とNP-40による抽出後、第１世代の免疫治療剤の第３の成分である粒子状のL.(L)venezuelensis 抽出物（PMH16）から６つの画分を分離した。
【００８１】
【表１３】
【００８２】
表１３では、ワクチン接種前に２つの患者グループが見られる、具体的には、１つのグループはS.I.＜1.0のグループであり、もう１つのグループはS.I.＞1.0のグループである。ワクチン接種後に治癒した患者のグループではワクチン接種前の２つの患者グループのどちらに比べても値が顕著に増加した。統計解析の結果は次の通りである：
S.I.＜1.0のグループ
対応のあるｔ検定：
差平均＝-2.115417（対の差の平均）
差の95%信頼区間：-3.008944から-1.22189
両側ｐ値は＜0.0001---きわめて有意−
S.I.＞1.0のグループ
対応のないｔ検定：
差平均＝-.7285719（Bの平均マイナスAの平均）
差の95%信頼区間：-1.3904から-6.674413E-02
両側ｐ値は＜0.0316---有意−
これらの結果は、L.(L)venezuelensis抽出物のいずれの画分による乾癬患者のワクチン接種によっても、ワクチン接種前の両グループのリンパ球は著しく刺激されるということを示している。高い刺激指数は画分３と４、ならびに生きた無鞭毛体で観測された。
【００８３】
前述のように、TLCK によるそれぞれの無鞭毛寄生体の処理とNP-40による抽出後、第１世代の免疫治療剤の第４の成分である粒子状のL.(L)amazonensis 抽出物（PMH8）から７つの画分を分離した。
【００８４】
【表１４】
【００８５】
表１４では、ワクチン接種前に２つの患者グループが見られる、具体的にいうと、１つのグループはS.I.＜1.0のグループであり、もう１つのグループはS.I.＞1.0のグループである。ワクチン接種後に治癒した患者のグループではワクチン接種前の２つの患者グループのどちらに比べても値が顕著に増加した。統計解析の結果は次の通りである：
S.I.＜1.0のグループ
対応のないｔ検定：
差平均＝-.5710449（対の差の平均）
差の95%信頼区間：.3475174から.7945725
両側ｐ値は＜0.0001---きわめて有意−
S.I.＞1.0のグループ
対応のないｔ検定：
差平均＝-.4549999（Bの平均マイナスAの平均）
差の95%信頼区間：-.8608927から-4.910712E-02
両側ｐ値は＜0.0287---有意−
これらの結果は、L.(L)amazonensis抽出物のいずれの画分による乾癬患者のワクチン接種によっても、ワクチン接種前の両グループのリンパ球は著しく刺激されるということを示している。高い刺激指数は画分３と４、ならびに生きた無鞭毛体で観測された。
【００８６】
要約すると、各胚発生実験は、第１世代免疫治療剤に含まれるリーシュマニア種の各々からのタンパク質画分のいずれによるワクチン接種も、特に画分３と４によるワクチン接種は、リンパ球の顕著な刺激を生ずるということを示している。刺激されたリンパ球はサイトカインを生成し、それが乾癬患者における炎症応答を抑止して乾癬病変の臨床的寛解を生ずる。
【００８７】
実施例１４
乾癬患者の体液性免疫
【００８８】
【表１５】
【００８９】
La: Leishmania amazonensis; Lv: L. venezuelensis
Lb: L. brasiliensis; Lch: L. changis
乾癬患者の血清をワクチン接種の前と後、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって分析した。その結果を表１５に示す。ワクチン接種前のサンプルと第１世代免疫治療剤の６回の投与後の病変の臨床的寛解までのワクチン接種後のサンプルとの間に光学密度の値に何も差異は見られなかった。ポジティブ反応のカットオフ点は0.5単位であった。唯一のポジティブ血清は活性リーシュマニア症の患者からのサンプルに属していた。このことは、第１世代免疫治療剤は体液性免疫又はTH2応答を誘発しないということをはっきりと示している。
【００９０】
実施例１５
乾癬患者における細胞性免疫
【００９１】
【表１６】
【００９２】
L.(L)chagasi
L.(V)brasiliensis
1 分画３vs.その他の分画
細胞性免疫の皮内反応分析の結果を表１６に示す。このデータは、第１世代免疫治療剤が治癒した患者にTHI応答を誘発することを示す。第１世代免疫治療剤のL.(L)chagasi及びL.(V)brasiliensisの抗原成分の画分３は、病変の臨床的寛解の後の皮内反応分析で最も高い生体内での免疫活性を示している。画分４もどちらの種でも高い活性度を示している。
【００９３】
実施例１６
単離されたタンパク質抗原画分を含む第２世代免疫治療剤による単一盲検試験
【００９４】
【表１７】
【００９５】
第二世代免疫物質の画分によるワクチン接種がPASI値に及ぼす効果を表１７に示す。画分３と４が乾癬の臨床的寛解に関して最高の活性を示す。これらの画分のどちらかを含む免疫治療剤の２回の投与はPASIをワクチン接種前の患者における最初の値の88%減少させる。これらの画分はまた、人工の 胚発生実験において最高の刺激指数を示し、乾癬が治癒した患者でワクチン接種後に最高の生体内での皮内反応（IDR）直径を示した。
【００９６】
実施例１７
乾癬病変の臨床的寛解を生ずるタンパク質画分の同定と特性
アクリルアミド・ゲルからのペプチドをニトロセルロース紙に移して、フロリダ州ゲインズビルにあるフロリダ大学のICBR タンパク質化学CORE施設で分析した。Hewlett Packard 1090 HPLC を用いてHPLC を行い、消化をEndo-Lys-Cによって行い、アミノ酸分析をABI 494 Protein Sequencerを用いて行った。アミノ酸配列の相同性をBLASTプログラムを用いて調べた。
【００９７】
【表１８】
【００９８】
画分３は、当業者に周知の完全還元とアルキル化の後、３つのバンドを含んでいた。２つを除く全てのペプチド配列はケラチンＩ又はII型のヒト・タンパク質との相同性を示した。画分４も、画分３と同様の結果を示した。この無鞭毛寄生体のケラチンは本発明の免疫治療剤が乾癬患者に及ぼす効果を明らかにする。多くの研究者たちは、乾癬が表皮ケラチノサイトから合成されるヒト・ケラチンにおける障害であると考えている。
【００９９】
実施例１８
フローサイトメータによる末梢血液リンパ球の分析
【０１００】
【表１９】
【０１０１】
第１世代免疫治療剤による治療の前、全ての乾癬患者は、末梢血液のリンパ球の数が正常の健康対照群に比べて著しく低かった。例外はHLA及びIgEマーカーで、これらは高いレベルで存在していた。
【０１０２】
【表２０】
【０１０３】
第１世代免疫治療剤による治療前の乾癬患者における末梢血液リンパ球個体数を調べた。患者たちを、病気の重篤度によって分け、PASI値によって表に表わした。その結果を表２０に示す。乾癬患者のPASI値が増加するにつれて、健康対照群に比べて末梢血液ノリンパ球のCD4+, CD8+, CD8-CD4+, CD3, CD8+CD3+, CD8+CD3-, CD8+HLA-の数は減少し、HLA+の数は増加した。PASI 1-9 のグループでは、４つのリンパ球個体数だけが対照群の値よりも低かったが、PASI 20-65のグループでは、７つのリンパ球個体数が対照の値よりも低かった。このことは、リンパ球が末梢血液から乾癬患者の皮膚の真皮と表皮へ移動してこの病気に特徴的な慢性炎症を生じていることを示唆する。
【０１０４】
【表２１】
【０１０５】
異なるPASI値の患者の間でリンパ球個体数には顕著な差がある。1-9 グループと10-20 グループの比較は、４つのリンパ球個体数の値が重篤な乾癬患者グループでは低くなっていることを示している。PASI 1-9のグループとPASIが20単位を超えるグループの比較は、７つのリンパ球個体数の値が重篤な乾癬患者グループでは低くなっていることを示している。IgA+リンパ球はより重病のグループで高くなっていた。
【０１０６】
【表２２】
【０１０７】
病変の臨床的寛解の後、末梢血液のすべてのリンパ球個体数は健康対照群と同様な正常値に戻った。HLA+とCD19のリンパ球個体数だけが健康対照群よりも値が高かった。これは多分、免疫治療剤による治療の後リンパ球が刺激されたためであると考えられる。
【０１０８】
具体的な実施の形態についての上の記述は単に例示的なものであり、本発明の精神と範囲から逸脱することなくいろいろな変更を加えることができ、それは添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
【０００１】
本発明は、一般に、乾癬の治療と臨床的寛解のための免疫治療剤又は治療剤、それらの治療剤を含む組成物、及びそれらの治療剤及び組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、世界の人口の１乃至３パーセントがかかっている病因が不明の、慢性的で、遺伝的に影響される、寛解しては再発する鱗状化と炎症を伴う皮膚の病気である。乾癬には、斑状型、膿疱型、滴状型、関節症型、などいくつかのタイプがある。現在、乾癬には根治方法がなく、抑制治療しかできない（Greaves and Weinstein, 1995, Drug Therapy, 332: 581-588）。治療を必要とする徴候は、局所的な症状、例えば、痛みや痒み、手の機敏性の低下、歩行困難、及び顕著な手足や顔の病斑などの美容上の問題から生ずる。現在の有効な治療法には毒性があるので、軽症の患者は気になる症状（provoking factor）がなくなればそれ以上の治療を諦めてしまうことが多い。
【０００３】
現在の治療の目標は、乾癬が患者の職業、健康、又は個人生活や社会生活に実質的に支障とならないところまで、乾癬の深刻さと拡がりを減ずることである。どんなに深刻でも、安定状態の斑状乾癬の最初の治療は局所治療である。しかし、乾癬が皮膚の20パーセントを超えて拡がっている患者の場合、局所治療だけでは実際的でなく、全身治療も最初から必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
斑状乾癬の局所治療では、軟化剤、角質溶解剤、コールタール、アントラリン、効能が中〜強程度のコルチコステロイド、及びカルポトリエン（calpotrien）が使用される。これらの治療はすべて、効力にばらつきがあり、病気の頻繁な再発を防ぐことができず、副作用があり、それ自体美容上の問題がある。
【０００５】
身体的、社会的、又は経済的障害を引き起こし、局所治療ではその効果が現れない乾癬にかかっている患者には、全身的な治療が用いられる。現在、その選択は光線療法又は全身的薬物療法である。一般に、全身療法では、紫外線B照射による光線療法、光増感剤メトキサレンを紫外線A光線療法（PUVA）と組み合わせる光化学療法、メトトレキセート、エトレチネート、全身的コルチコステロイド、及びサイクロスポリンを用いている。これらの全身療法は、いずれも効力にばらつきがあり、望ましくない副作用があり、そのいくつかは非常に毒性が強く、病気を頻繁に再発させる。したがって、現在採用されている局所又は全身療法に関連した問題を回避できる有効な乾癬治療方法が現在必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は乾癬の治療と臨床的な寛解のための組成物及び方法を提供する。１つの様態では、リーシュマニア属の原生動物の粒子抗原から誘導される、個体の免疫応答を発生させて乾癬の臨床的症状を軽減するポリペプチドを提供する。この様態の一の実施の形態では、上記ポリペプチドは、SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, 及びSEQ ID NO:14に示された少なくとも１つのアミノ酸配列、又はその免疫原性変異体を含む。アミノ酸配列の免疫原性変異体とは、実質的な量の元の活性を保持した塩基配列の短縮（truncated）バージョン、又はその活性を保持するわずかなアミノ酸置換及び／又は変更を含む塩基配列の変更バージョンのどちらかである。
【０００７】
この様態の別の実施の形態では、上記ポリペプチドは、あるタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも免疫原性部分又はその免疫原性変異体を含み、該タンパク質はリーシュマニア属の原生動物から単離され、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって決定される見かけの分子量が21, 33, 44, 50, 55, 58, 65, 又は77 kDaである。
【０００８】
この様態のさらに別の実施の形態では、ポリペプチドはあるタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも免疫原性部分又はその免疫原性変異体を含み、該タンパク質はリーシュマニア属の原生動物から単離され、その完全還元（total reduction）と完全アルキル化の後のSDS-PAGEによって決定される見かけの分子量が73, 80, 又は82 kDaである。
【０００９】
関連した態様では、本発明はそのようなポリペプチドをコード化する核酸の配列、そのような核酸配列を組み込むベクター、微生物宿主細胞の形質転換、トランスフェクション又は形質導入によってそのようなポリペプチドを生産する方法、及びそのようなベクターによって形質転換される、そのような核酸配列でトランスフェクションされる、又はそのような核酸配列で形質導入される微生物宿主細胞を提供する。
【００１０】
本発明の別の様態では、１つ以上の本発明のポリペプチドを組み込んだ免疫治療剤が提供される。これらの免疫治療剤は、種々の抗体を混合した多価又は単価であり、接種された被験者から得られる免疫応答を強化するためのアルミナのような免疫助成剤（アジュバント）を含むことがある。ある好ましい実施例では、上記多価の免疫治療剤はリーシュマニアの４つの種、すなわち、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis,及びL.(L)chagasi, の混合物から単離されたポリペプチドを含む。また、ある好ましい一の実施の形態では、単価免疫治療剤は、これらの４つの種の１つから単離されたポリペプチドを含む。
【００１１】
本発明の別の様態では、乾癬の治療と臨床的寛解の方法が提供される。一の実施の形態では、そのような方法は、乾癬の臨床的症状を軽減する免疫応答を誘発させるために１つ以上の本発明のポリペプチドを含む治療的に効果的な量の製薬組成物を被験者に投与する処理を含む。関連した一の実施の形態では、そのような方法は、１つ以上の本発明の核酸配列を含む治療的に効果的な量の製薬組成物を被験者に投与する処理を含む。本明細書で用いる場合、“治療的に効果的な”という用語は、当業者にとって公知である乾癬面積及び重症度（severity）の約70 - 100%の減少を意味する。
【００１２】
本発明の別の様態は、本発明の核酸配列の遺伝分析用プローブとして及び分子量マーカーとしての使用、及び本発明のポリペプチドの分子量マーカーとしての使用を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、乾癬の治療と臨床的寛解のための新しい組成物及び方法に関する。この組成物は免疫原性のポリペプチド又はそれらをコード化する核酸を含む。本発明のポリペプチドは、温血動物において免疫応答を誘発して、乾癬の臨床的な寛解を引き出すことができる。本明細書で用いる場合、“温血動物”という用語はヒトを含む。本発明の一の実施の形態では、本発明のポリペプチドはリーシュマニア属の原生動物から、好ましくは殺生されたリーシュマニア属の無鞭毛原生動物から、単離できる。本発明のポリペプチドは、当業者に公知の標準的なタンパク質単離手順によってリーシュマニア属の原生動物から入手できる。本発明はまた、本発明の免疫原性ポリペプチドを組み込んだ免疫治療剤及び製薬組成物を対象としている。一の実施の形態では、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica, 及びL.(L)guyanensisなどの複数のリーシュマニア属の種の混合物から単離されたポリペプチドを含む第１世代多価免疫治療剤が提供される。好ましくは、この混合物はL.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, 及びL.(L)chagasiを含む。最も好ましくは、混合物はこれらの４つの種から成る。上記生物は、好ましくは、表１に定められる人工培養培地に5%ウシ胎児血清を補充したもので、一般的には約30 - 34 ℃で無鞭毛段階に培養される。その後、定常的な成長期に、無鞭毛原生動物は細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン（TLCK）、又は薬理的に許容されるその塩、を含む媒質で処理する。次に、死んだ細胞を分離して非イオン洗剤Nonidet p-40（NP40）で処理して表面抗原を可溶化してそれを除去する。本発明の免疫原性ポリペプチドを含む粒子抗原は、細胞を破壊した後に遠心分離によって集めることができる。これらのポリペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって洗浄した後、アルミナを含むPBSで4 ℃で５分間超音波処理して再懸濁させる。
【００１４】
他の実施の形態では、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica, 及びL.(L)guyanensisから成る群から選択された単一のリーシュマニア種から単離されるポリペプチドを含む第１世代単価免疫原性治療剤が記載される。好ましくは、この単一のリーシュマニア種は、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, 及びL.(L)chagasiから成る群から選択される。その他の点では、この免疫治療剤の調製の手順は、第１世代多価免疫原性治療剤について上で開示された手順と同一である。
【００１５】
他の実施の形態では、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica, 及びL.(L)guyanensisなどの複数のリーシュマニア属の種の混合物から単離されたポリペプチドを含む第２世代多価免疫治療剤が記載される。好ましくは、この混合物はL.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, 及びL.(L)chagasiを含む。最も好ましくは、混合物はこれらの４つの種から成る。上記生物は、好ましくは、表１に定められる人工培養培地に5%ウシ胎児血清を補充したもので、一般的には約30 - 34 ℃で無鞭毛段階で培養される。その後、定常的な成長期に、無鞭毛原生動物は細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン（TLCK）、又は薬理的に許容されるその塩、を含む媒質で処理する。次に、死んだ細胞を分離して非イオン洗剤Nonidet p-40（NP40）で処理して表面抗原を可溶化してそれを除去する。本発明の免疫原性ポリペプチドを含む粒子抗原は、細胞を破壊した後に遠心分離によって集めることができる。これらのポリペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって洗浄した後、4 ℃で５分間超音波処理して8 M 尿素、0.025 M Tris （Tris-ヒドロキシ-メチル-アミノ-メタン）で再懸濁させる。次に、ポリペプチドは8 M 尿素、0.025 M Trisを含むｐＨ8.3 の溶液中に0.05 - 0.3 M NaCl の段階的溶離によるDEAE-Sephadex カラムでのクロマトグラフィーにかけられる。７つのタンパク質分画が集められ、各分画のポリペプチドをアルミナを含むPBSで再懸濁させることによって各タンパク質分画を含む接種物（inoculum）が作られる。
【００１６】
他の実施の形態では、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica, 及びL.(L)guyanensisから成る群から選択された単一のリーシュマニア種から単離されるポリペプチドを含む第２世代単価免疫原性治療剤が記載される。好ましくは、この単一のリーシュマニア種は、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, 及びL.(L)chagasiから成る群から選択される。その他の点では、この免疫治療剤の調製の手順は、第２世代多価免疫原性治療剤について上で開示された手順と同一である。
【００１７】
上記に代えて、本発明のポリペプチドは公知の手順及び方法によって合成するか、又は、遺伝子組み換えで、所望のポリペプチドをコード化する１つ以上のヌクレオチド配列で宿主細胞を形質転換することによって生成できる。上記ポリペプチドは、これらを単離して所望の純度で精製できるように宿主細胞で形質発現させることができる。本発明のポリペプチドは、本発明に係る第３世代の免疫治療剤として用いて乾癬を治療することができる。
【００１８】
本発明はさらに、適当な宿主細胞を本発明のポリペプチドを生成させるように形質転換するために；温血動物に直接又は製薬的に許容される組成物の一部として投与して、免疫応答を生じさせそれによって動物の乾癬の臨床的寛解を引き出すために；遺伝的分析のための標識付けされたプローブとして；又は核酸分子量マーカーとして使用できる核酸配列に関する。
【００１９】
分子生物学の分野の当業者は、本明細書で提供される教示によって、本発明のポリペプチドをコード化する核酸を入手できる。例えば、本発明の第１世代免疫治療剤はリーシュマニア属の原生動物から単離，精製されたものであり、見かけの分子量が、それぞれ、21, 33, 44, 50, 55, 58, 65, 及び77 kDaである８つの異なるポリペプチドを表す、SDS-PAGEで同定される８つのバンドから成る。これらのバンドの各々は別々のポリペプチドを表し、それらは単離して標準的なアミノ酸配列決定手順によって配列を決定できる。各第２世代の免疫治療剤は、この８つのポリペプチドの混合物を含む第１世代の免疫治療剤をジエチルアミノエチル-（DEAE）-Sephadexでのクロマトグラフィーで処理することによって精製された。乾癬を治療する全ての活性を有する２つの画分が単離され、標準的な手順によって、完全に還元されアルキル化された。これらの画分を、アクリルアミド・ゲルでの電気泳動にかけて成分ポリペプチドを分離し、各ポリペプチドのアミノ酸配列が標準的なタンパク質配列決定手順によって得られた。これらのポリペプチドの各々をコード化するヌクレオチド配列は、これらのアミノ酸配列から遺伝コードを適用して導出できる。
【００２０】
さらに、本発明は本発明の免疫原性ポリペプチドを、それらをコード化する核酸を微生物宿主細胞に導入することによって大量生産することを対象としている。核酸は、宿主細胞のゲノムに直接導入するか、又は最初ベクターに組み込んで次にそれを宿主に導入してもよい。直接組み込む方法としては、例えば組み換えファージ又はコスミドによる形質導入、特別に処理された宿主バクテリア細胞に裸のファージ染色体を取り込ませるトランスフェクション、及びカルシウムの析出による形質転換などがある。これらの方法は当業者には周知である。
【００２１】
ベクターの例としては、プラスミド、コスミド、及びファージがある。リーシュマニア属の種のゲノム・ライブラリーを通常の手段で作り出し、問題のDNAをそこから単離することができる。例えば、リーシュマニア原生動物のDNAを単離して公知の制限酵素によって制限することができる。次に、得られたDNA断片を適当なクローニング・ベクターに挿入して使用できる宿主に導入する。
【００２２】
対象となる宿主に応じて、ベクターにはいろいろな調節領域やその他の領域（通常は複製元、１つ以上のプロモータ領域、及び形質転換体の選択のためのマーカー等などを含ませてもよい。一般に、ベクターは問題のDNAの発現と増幅のための調節信号を提供する。
【００２３】
形質転換体の選択のためにいろいろなマーカーを用いることができる。例えば殺生物剤耐性、特に、アンピシリン、テトラサイクリン、トリメトプリン、クロールアンフェニコール、及びペニシリンなどの抗生物質に対する耐性；コリシンなどの毒素に対する耐性；及び水銀塩などの重金属に対する耐性をマーカーにすることができる。あるいはまた、栄養要求性の宿主に必須の栄養を提供する補完体（complementation）を用いることもできる。
【００２４】
本発明のポリペプチドの生産のために当業者に周知の方法に従って用いることができる宿主としては、原核生物、すなわち、バクテリア、などの単細胞微生物；及び例えば、酵母などの菌、藻類、原虫、カビなどの真核生物、ならびに培養されたもの・自然に存在する又は植えられた植物細胞があげられる。形質転換しやすいバクテリアの具体的な例としては、腸内細菌科のメンバー、例えばEscherichia coli; Salmonella; Bcillaceae,例えばBacillus sibtilis; Pneumococcus; Streptococcus; Haemophilus influenzae, 及び酵母、特にSaccharomycesがあげられる。本明細書で用いられる微生物宿主細胞という用語は、培養されたもの・自然に存在する又は植えられた植物細胞を含めたこれらの原核生物及び真核生物をすべて包含する。
【００２５】
あるDNAライブラリーのいくつかの断片と複合化（hybridized）して問題の遺伝子、すなわち、本発明の一部として記載されたポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を同定し選択すること（すなわち、“プロービング・アウト”）を可能にするユニバーサル・プローブを入手できる。これらの遺伝子の単離は分子生物学の分野の当業者に周知の方法を用いて行うことができる。単離された遺伝子は、適当なベクターに挿入して微生物宿主細胞の形質転換に用いることができる。さらに、これらの遺伝子を標準的な核酸配列決定手順で解析して本発明のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列についての具体的な情報を得ることができる。
【００２６】
現在では当業者には周知であるが、宿主細胞における発現向上されるために遺伝子を合成する場合、遺伝子のコドン使用（codon usage）頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近くなるように遺伝子を設計することが望ましい。本発明においては、“好ましいコドン使用の頻度”とは、あるアミノ酸を指定するためのヌクレオチド・コドンの使用においてある特定宿主細胞が示す偏好を指す。ある遺伝子におけるある特定コドンの使用頻度を決定するには、その遺伝子におけるそのコドンの出現回数をその遺伝子における同じアミノ酸を指定する全てのコドンの出現回数で割る。同様に、ある宿主細胞が示す好ましいコドン使用の頻度は、その宿主細胞が発現する多数の遺伝子における好ましいコドン使用の頻度を平均して計算することができる。この解析は、その宿主細胞が強く発現する遺伝子に限定することが好ましい。
【００２７】
したがって、本発明の一の実施の形態では、バクテリア、植物、その他の細胞が遺伝子工学的に処理されて、例えばリーシュマニア属の原生動物の遺伝子で形質転換されて、本発明のポリペプチド又はタンパク質の所望の発現レベルを達成する。発現が強化された遺伝子を得るために、遺伝子のDNA配列を変更して強く発現される遺伝子が好むコドンを含むようにして、ヌクレオチド塩基組成におけるA+T含有率が形質転換された宿主細胞に見られるものと実質的に同じになるようにする。また、前記宿主細胞に最適な開始配列を形成し、RNAの不安定化、不適当なポリアデニル化、劣化、終止を生ずる配列を除去し、二次的構造ヘアピン及びRNAスプライス・サイトを構成する配列を避けることが好ましい。例えば、合成遺伝子で、あるアミノ酸を指定するのに用いるコドンは、宿主細胞で強く発現される遺伝子でそのアミノ酸を指定するのに用いるコドン使用の分布頻度によって選択することができる。合成遺伝子で用いられるコドン使用の分布頻度は発現レベルの決定因子であるのは当業者に公知である。
【００２８】
本発明の遺伝子の組立は、当業者に公知の標準的な技術を用いて行うことができる。ある宿主細胞で強く発現されるように設計される構造遺伝子は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド二重鎖セグメントからDNAベクター内で酵素的に組み立てることができる。次にこの遺伝子を宿主細胞に導入して当業者に公知の手段によって発現させることができる。合成遺伝子の発現で生成されるタンパク質は原生のタンパク質と機能的に同等であることが好ましい。本発明によると、“機能的に同等”とは機能が同一または同一に近いことを指す。合成遺伝子産物で、その活性又は機能に関連した少なくとも１つの性質が天然のタンパク質と同様又は同一であるものは、それと機能的に同等と見なされる。
【００２９】
また、本発明のヌクレオチド配列を、元の全長の配列のその結果得られる断片の一部が該全長の配列の望ましい特性を保持するように短縮（truncate）できるということも当業者には周知である。様々な制限酵素がより大きい核酸分子から断片を生成するのに適していることは当業者には良く知られている。例えば、Ba131エキソヌクレアーゼがDNAの時間制御された限定された消化に好適に使用できることは周知である。（例えば、Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, Pages 135-139参照。また、Wei et al., (1983) J. Biol. Chem. 258: 13006-13512参照。）すなわち、Ba131エキソヌクレアーゼは（一般に“塩基消去（erase-a-base）”手順と呼ばれる）、本発明の核酸の一方又は両方の端からヌクレオチドを除去することを可能にし、その結果広範なスペクトルの断片を生成し、その多くが本発明の天然のポリペプチド配列と機能的に同等である。ラベル標識手順も周知であり、当業者であればラベル標識された断片の複合化（hybridization）特性をごく普通にスクリーニングしてプローブとしての有用性を決定することができる。例えば、核酸をラベル標識して遺伝子同定又は診断手順で特定化又は選択プローブとして使用するのは日常的なことである。これらの配列の変型又は断片でリーシュマニア属の種のDNAに対し特定化及び選択的に複合化するものはプローブとしても機能するということは当業者には認識されるであろう。本発明の核酸のある断片が本発明によって特定化及び選択的に複合化する断片又は変型であるかどうかを決定することは当業者の通常の技術範囲内にあって過大な実験を必要としない。したがって、これらの核酸の断片又は変型はリーシュマニア属の種を同定したり、診断したり、識別したりするためのプローブとして有用である。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチド又はペプチドは、それぞれの核酸又はアミノ酸分子量決定又は測定における分子量マーカーとして有用であることも認められるであろう。
【００３１】
本発明による第１世代免疫治療剤を得るために、リーシュマニア属の生物を表１にリストされている成分を含む人工培地で培養することができる。ある好ましい実施の形態では、この培地には5%ウシ胎児血清が補充される。本発明による原生動物の培養は、代表的には、約30-34 ℃で行われる。特に好ましい実施の形態では、原生動物の培養はそのライフ・サイクルの無鞭毛段階で行われる。
【００３２】
【表１】
次に、原生動物細胞を含む培地を処理して、細胞を不活性化、好ましくは殺生することができる。これらの細胞を単離した後、抗原タンパク質をそれから精製して製薬的に許容されるキャリア、例えば緩衝液に含ませて第２世代の免疫治療剤を作り出すことができる。好ましくは、細胞は非溶解剤（non-lysing agent）、例えばTLCK、で不活性化又は殺生される。本発明の抗原タンパク質は通常の方法によって細胞から単離され得る粒状タンパク質である。より具体的な実施の形態では、本発明の第２世代免疫治療剤を作り出す方法は、（１）適当な培地で、好ましくは無鞭毛段階にある原生動物を培養するステップ；（２）前記原生動物細胞を処理して細胞を不活性化する又は殺生するステップ；（３）処理された細胞を単離するステップ；（４）単離された細胞から抗原タンパク質を抽出するステップ；及び（５）１つ以上の単離された抗原タンパク質を製薬的に許容されるキャリア、例えばリン酸緩衝生理食塩水（PBS）と組み合わせて第２世代免疫治療剤組成物を調合するステップを含む。好ましい製薬的に許容されるキャリアはアルミナが溶液内に存在するPBS溶液である。
【００３４】
臨床的及び組織病理的に乾癬と診断された患者の乾癬を治療するために、第１世代多価免疫治療剤を、筋肉注射で三角筋部に、病気の重篤度に応じて、毎月１回、15日に１回、又は毎週１回、平均7.6 ± 6.0 月にわたって500 μg/服で投与した。
【００３５】
さらに乾癬を治療するために、第１世代多価免疫治療剤に含まれる各リーシュマニア種を含む単価免疫治療剤を本発明の組成物として用いて多価免疫治療剤と同様な結果を得た。
【００３６】
さらに乾癬を治療するために、生の第１世代免疫治療剤からクロマトグラフィー手段によって単離されたタンパク質画分を含む第２世代免疫治療剤を、0.1 mg アルミナ/mg タンパク質と合わせて、筋肉注射で三角筋部に15日に１回、一服当たり200 μg/0.5 ml で3-4服投与した。
【００３７】
以下は、本発明を実施する手順を例示する実施例である。これらの実施例は制限的なものと解してはならない。別に断らない限り、全てのパーセンテージは重量パーセントであり、全ての溶剤混合比率は体積比である。
【００３８】
実施例１
免疫原の調製
リーシュマニア属の原生生物を無鞭毛段階に表１に定められた人工培地に5%ウシ胎児血清を補ったもので代表的に約30-34 ℃で培養した（O'Daly et al., 1988, Acta Tropica (Basel), Vol. 45, pp. 109-126）。第２世代の免疫治療剤の調製のため、定常的な成長期の無鞭毛体を遠心分離（800 ｘ g,4 ℃で20分間）によって集め、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、150 μgのTLCKを含むEagle's MEM (Gibco)中で30-34 ℃で３日間インキュベートして記載されているような寄生体を不活性化した（O'Daly et al., 1986, Acta Tropica (Basel), Vol. 43, pp. 225-236）。PBSで２回洗浄した後（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）、1ml当たり1 ｘ 108 個の寄生体を0.12% Nonidet-P-40(NP40, Sigma)を含むMEM中で30 分間4 ℃でインキュベートして、表面抗原を可溶化し、それを除去した（O'Daly et al., 1990 AMJ Trop. Med. Hyg., Vol. 43, pp. 44-51）。粒子抗原を遠心分離（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）で集め、PBSで２回洗浄し、4 ℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath-Systems-Ultrasonic, Inc., Planview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理した。タンパク質含有量は、Lowryの方法で決定した（Lowry, O. et al., 1951, J. Biol. Chem., Vol. 193, pp. 265-275）。最終の単価第１世代免疫原試料は、アルミナ（水酸化アルミニウム低粘度ゲルREHYDRAGEL, Reheis Inc., New Jersey）を含むPBS 中に1 mg/mlの各リーシュマニア種抗原を、0.1 ml/mg (v/w)という寄生体タンパク質の濃度で含んでいた。免疫源の調製における各ステップで無菌性をチェックした。
【００３９】
本発明の別の実施の形態では、粒子抗原を遠心分離（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）で集め、PBSで２回洗浄し、8 モルの尿素、0.025 Tris (Tris-ヒドロキシ-メチル-アミノ-メタン)を含む溶液に溶解し、4 ℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath Systems Ultrasonic, Inc., Plainview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理した。タンパク質画分はDEAE クロマトグラフィーで分離した。
【００４０】
第２世代免疫治療剤は、本発明の組成物のDEAEクロマトグラフィーの後に単離された７つのタンパク質画分の各々であって、生の第１世代免疫治療剤のただ１つのリーシュマニア種、例えばL.(V)braisiliensis又はその他のリーシュマニア種のみを含むもので調製した。タンパク質含有量は、Lowryの方法で決定した（Lowry, O. et al., 1951, J. Biol. Chem., Vol. 193, pp. 265-275）。各タンパク質画分をPBSで溶解し、4 ℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath Systems Ultrasonic, Inc., Planview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理した。その後、各画分を0.20 μm Millipore（登録商標）フィルタによってフィルタ滅菌した。最終免疫原試料は、アルミナ（水酸化アルミニウム低粘度ゲルREHYDRAGEL, Reheis Inc., New Jersey）を含むPBS 中に400 μg/mlの各抗原画分を、0.1 ml/mg (v/w)のタンパク質分画の濃度で含んでいた。第２世代免疫源の調製における各ステップでも無菌性をチェックした。
【００４１】
部分標本（aliquots）を5%ウシ胎児血清を含むESM(FBS, Gibco)で、及び12.5%(w/v) Bacto-Peptone (Difco), 12.5% (w/v) 酵母エキス(Becton Dickinson), 3.75% (w/v) グルコース、及び3.75% (w/v) BBL 寒天(Becton Dickinson)を含む寒天平板でインキュベートした。サンプルは、速く生育するバクテリアを検出するために37℃で72時間インキュベートし、ゆっくりと生育するバクテリアと菌を検出するために26℃で3週間インキュベートした。免疫原の各バッチはSDS-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって監視してリーシュマニアタンパク質バンドのパターンが変わらないことを確認した。第１及び第２世代の免疫治療剤の各バッチはまた、E-TOXATE (Sigma)で発熱物質の存在をテストした。第１世代の免疫原は4℃で少なくとも4週間安定であった。
【００４２】
実施例２
免疫原のタンパク質成分
上記実施例１に記載した手順で得られた免疫原性組成物から、８つのたんぱく質バンドを、TLCKで処理されNP-40で抽出された、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasiからの無鞭毛体で、見かけの分子量が21, 33, 44, 50, 55, 58, 65, 及び77 kDaである無鞭毛体をSDS-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動で処理することにより同定した。分子量が29〜96 kDaであるバンド２８と３０間の未処理の全ての無鞭毛体抽出物を、各リーシュマニア種で観測し、29,34,43,58,65 kDaの主要なバンドを観測した。
【００４３】
DEAE クロマトグラフィー後にたんぱく質画分３，４を含み、完全に還元されアルキル化された第２世代免疫治療剤の免疫原性組成物は、73,80,82 kDaの３つの分子量のバンドを有する。
【００４４】
実施例３
安全性および免疫性
上記実施例１と２に記載された第２世代免疫治療剤のタンパク質を含む免疫原性組成物を、5 mmを超えるIDRを生ずることができる投与量を求めるために、50 μgから始めて毎月50 μgずつ用量を増加して被検者に１ヶ月間隔で注射した。この投与量は、200 μgであることが見出された。免疫治療剤の最後の投与から１ヶ月及び６ヶ月後にこの被検者について以下の血液検査、即ち、全血球数、白血球分画、尿素、クレアチニン、糖アルカリ・ホスファターゼ、ビリルビン、トランスアミナーゼ、コレステロール、トリグリセリド、Ｃ反応性タンパク質、VDRL, HIV, 抗核抗体、LE細胞などの血清テスト、及び尿と便の検査を行った。全ての値が正常範囲にあり、何も副作用は認められなかった。
【００４５】
実施例４
免疫治療剤組成物の調製
第１世代単価免疫治療剤の調製のため、各リーシュマニア種の培養された無鞭毛体を遠心分離（800 ｘ g, 4 ℃で20分間）によって集め、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、150 μgのTLCKを含むEagle's MEM (Gibco)中で3 日間30-34 ℃でインキュベートし、上述の寄生体、即ち１ｍｌ当たり1 ｘ 108 個の寄生体を不活性化した。このステップは、無鞭毛体が定常的な成長期にあるとき、PBSで２回洗浄（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）した後で行うことが好ましい。
【００４６】
特に好ましい実施の形態では、本発明による保護的単価第１世代免疫原性組成物の調製は以下のステップを備える：
A) 無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、表１にリストされている成分を含む5%ウシ胎児血清を補充された人工培地で代表的に約30-34 ℃で培養するステップ；
B) 定常的な成長期にある無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、前記細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン又は製薬的に許容されるその塩を含む媒質にさらすステップ；
C) 前記殺生された細胞を単離するステップ；
D) 非イオン洗剤Nonidet p-40によって表面タンパク質を抽出するステップ；
E) 試料の遠心分離で粒子抗原を単離するステップ；
F) PBSで２回洗浄するステップ；及び
G) 前記殺生された細胞からの前記粒子抗原を、アルミナを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させることによって前記粒子抗原を含む免疫接種物を形成するステップ。
【００４７】
第２世代免疫治療剤の調製のため、培養された無鞭毛体を遠心分離（800 ｘ g, 4 ℃で20分間）によって集め、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄し、150 μgのTLCKを含むEagle's MEM (Gibco)中で3 日間30-34 ℃でインキュベートし、上述の寄生体、即ち１ｍｌ当たり1 ｘ 108 個の寄生体を不活性化した。このステップは、無鞭毛体が定常的な成長期にあるとき、PBSで２回洗浄（12.100 ｘ g, 4 ℃で10分間）した後で行うことが好ましい。
【００４８】
特に好ましい実施の形態では、本発明による保護的第２世代免疫原性組成物の調製は以下のステップを備える：
A) 無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、表１にリストされている成分を含む5%ウシ胎児血清を補充された人工培地で代表的に約30-34 ℃で培養するステップ；
B) 定常的な成長期にある無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、前記細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン又は製薬的に許容されるその塩を含む媒質にさらすステップ；
C) 前記殺生された細胞を単離するステップ；
D) 非イオン洗剤Nonidet p-40によって表面タンパク質を抽出するステップ；
E) 試料の遠心分離で粒子抗原を単離するステップ；
F) PBSで２回洗浄するステップ；及び
G) 8モルの尿素、0.025モルのTris （Tris-ヒドロキシ-メチル-アミノ-メタン）を含む溶液に溶解し、4 ℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath Systems Ultrasonic, Inc., Planview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理するステップ；
H) 8モルの尿素、0.025 モルのTrisを含むｐＨ8.3 の溶液中で0.05 - 0.3 モルNaCl濃度のNaClを段階的に溶離してDEAE-Sephadex カラムでタンパク質画分を分離するステップ；及び
I) 前記殺生された細胞からの前記粒子抗原を、アルミナを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁させることによって前記粒子抗原を含む免疫接種物を形成するステップ。
【００４９】
特に好ましい実施の形態では、本発明による乾癬の臨床的寛解のための第２世代免疫原性組成物の調製は以下のステップを備える：
A) 無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、表１にリストされている成分を含む5%ウシ胎児血清を補充された人工培地で代表的に約34 ℃で培養するステップ；
B) 定常的な成長期にある無鞭毛段階のリーシュマニア属の原生動物を、前記細胞を殺生するのに有効な量のN-p-トシル-L-リジン・クロロメチル・ケトン又は製薬的に許容されるその塩を含む媒質にさらすステップ；
C) 前記殺生された細胞を単離するステップ；
D) 非イオン洗剤Nonidet p-40によって表面タンパク質を抽出するステップ；
E) 第１世代免疫治療剤に存在するただ１つのリーシュマニア種、例えばL.(V)brasiliensis、又は他のリーシュマニア種からの粒子抗原に対してDEAE -Sephadexクロマトグラフィーをかけるステップ；
F) 0.05-0.3 モルNaClによる段階的溶離によって分離された７つのタンパク質画分を8モル尿素、0.025モルのTris を含むpH 8.3の溶液中で単離するステップ；
G) タンパク質画分を蒸留水により透析し凍結乾燥（lyophylization）するステップ；
H) タンパク質画分をリン酸緩衝生理食塩水に溶解するステップ；
I) Lowryの方法（Lowry, O. et al., 1951, J. Biol. Chem. Vol. 193, pp. 265-275）によって画分のタンパク質含有量を求めるステップ；
J) リン酸緩衝生理食塩水で各タンパク質画分を4℃で5分間、Sonifier Cell Disrupter （Model WI85, Heath Systems Ultrasonic, Inc., Planview, New York）で、マイクロチップの出力制御の限界を50 Wにして超音波処理するステップ；
K) 各画分を0.20 μm Millipore（登録商標）フィルタに通すステップ；及び
L) １つ以上の前記タンパク質画分を含む第２世代免疫接種物を、アルミナを含むリン酸緩衝生理食塩水に該１つ以上の画分を再懸濁させることによって形成するステップ。
【００５０】
実施例５
L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi を含む第１世代多価免疫治療剤による乾癬の治療
【００５１】
【表２】
大多数の患者（79.17%）は年齢が26-65才であり平均年齢は42.56 ± 26.11才、その範囲は1才から88才までであった。
【００５３】
【表３】
35%は両親が乾癬であって、この病気の発病時期は11.6 ± 9.8 才で男性と女性で同様であり、その範囲は2才から46才までであった。
【００５５】
【表４】
92.6%が斑状乾癬の臨床形態を有し、それが純粋形態（79.1%）又は滴状と関連（10.1%）又は関節炎と関連（3.4%）に分布していた；10.1%が滴状乾癬の純粋な形態；0.3%が手掌と足底形態；1.8%が紅皮症であり、3.4％が乾癬性関節炎だった。
【００５７】
【表５】
1 PASI = 乾癬面積及び重篤度指数
2 8年間追跡
96%の患者が治療に対して10%を超えるPASI値の減少で応答し、わずかに4%だけが治療前の最初のPASI値の10%未満の減少で応答した。28%が病変の100%寛解を示し、病気は完全に消失した。これは男女で同様であった。全体で74%が病変の70-100%の寛解を示し、21%が最初のPASI値に比べて10-69%の寛解を示した。被検者の17.4%が、免疫治療剤の1-2回の投与の後に治療から離脱した（以下を参照のこと）。
【００５９】
【表６】
1 被験者の状態は８年間追跡された。
【００６１】
乾癬の100%の寛解には免疫治療剤の7.6 ± 6.0回の投与が必要だった。70-90%及び40-69%の寛解のグループでは投与量が少し高く、それぞれ、11.0 ± 10.0 及び9.0 ± 9.6 回に達していた。これは、臨床的寛解が主として被検者の免疫応答に依存すると言うことを示唆する。免疫治療剤に応答できる患者は治療の最初から応答することが確実である。応答しない患者は、免疫治療剤の投与回数が多くなっても依然として応答しない。
【００６２】
【表７】
1 月
病変が完全に寛解した648人の患者のうち188人（28.9%）の被検者で15.4 ± 20.6 月後に病気が再発した。再発時のPASI値は、治療前の最初のPASI値の1/3であった。新しい臨床的寛解でのPASIは再発時のPASI値よりもかなり低かった。新たな寛解は、5.8 ± 4.9 週後に免疫治療剤の7.1 ± 6.8回の投与で起こったが、これは最初の治療サイクルで病変の臨床的寛解に関して観測された期間よりも短かった。この再発グループでは、85.8%の患者で免疫治療剤を6-7回投与された後に再び病変が寛解した。
【００６４】
【表８】
小さな副作用が乾癬患者の半数未満に接種部位で観測され、性別や年齢による差は見られなかった。これらはすべて数日以内に消失した。第１世代免疫治療剤を21.4 ± 13.1 回投与された55人の乾癬患者のサンプルについての検査室分析の結果が表９に示されている。全ての値は正常の範囲内であることが見出された。
【００６６】
【表９】
実施例６
第１世代単価免疫治療剤の試験
【００６８】
【表１０】
免疫治療剤はまた、第１世代の免疫治療剤からのリーシュマニアの個々の種を用いて調製され、乾癬病変の臨床的寛解を生ずる能力がテストされた。表１５の結果は、乾癬患者の病変の臨床的寛解を得るためには第１世代の免疫治療剤における４つのリーシュマニア種の混合物を用意する必要はないということを明瞭に示している。１つのリーシュマニア種でも、多価免疫治療剤で用いられる４つの種の混合物と同様に、治療後に100%までのPASIの減少を生ずる効果がある。すなわち、どのリーシュマニア抽出物質にも乾癬に関連する炎症を抑える因子がある。
【００７０】
実施例７
調合と投与
本発明の化合物は、治療目的と非治療目的を含めいろいろな目的に有用である。この新しい化合物とそれを含む組成物の治療への応用は、現在又は将来の当業者に公知のどんな適当な治療方法及び手法によっても遂行できると考えられる。さらに、本発明の化合物は、他の有用な化合物及び組成物の調製のための出発物質又は中間物質としても有用である。
【００７１】
上述のようなホストに投与される用量は、感染の種類、ホストの年齢、体重、及び健康などの当該ホストのタイプ、並行した治療の存在と性質、治療の頻度、及び治療比に依存する。
【００７２】
本発明の化合物は製薬組成物の調製のための公知の方法によって調合できる。調合は、当業者に周知であり容易に利用できるいくつかの情報源に詳細に記載されている。例えば、E. W. Marin によるRemington's Pharmaceutical Scienceは、本発明に関連して利用できる調合を記載している。一般に、本発明の組成物は、有効な量の生物活性物質がその組成物の効果的な投与を容易にするために適当なキャリアと組合せられるように調合される。
【００７３】
実施例８
リーシュマニア種からのタンパク質画分のクロマトグラフィー分離とヒト末梢血液単核細胞による胚発生分析
前述のように、TLCKによるそれぞれの無鞭毛寄生体の処理とNP-40による抽出後、第１世代の免疫治療剤の第１の成分、粒子状のリーシュマニア chagasi抽出物から７つの画分を分離した。
【００７４】
これらの画分を、当業者には日常的な方法によって、ワクチン接種前及び後の乾癬患者からの末梢血液単核細胞による胚発生分析によりテストした。この実施例では、RPMI-1640に溶解された各画分の100 μlアリクオット（三重複）を平底マイクロタイタ・プレート（Falcon Plastics）に2 ｘ 105末梢血液単核細胞と共にプレインキュベートし、HISTOPAQUE （Sigma）で分離し、当業者にとっては日常的な方法で、20%の熱不活性化ウシ胎児血清を含む100 μlのRPMI-1640に再懸濁した。リンパ球刺激の陽性対照（positive control）としてコンカナバリンAを用いた。48 時間後、0.2 μCi/ウエルの3H-ティミジンを10μlアリクオットで加え、サンプルをさらに18時間インキュベートした。細胞は、自動細胞ハーベスター（MASHII）によって濾紙（ReeveAngel）に採取された。乾燥させたペーパー・ディスクを2.5 mlのAquasol(NEN)と共にミニバイアルに入れ、Packard Tri-Carb シンチレーション・カウンタModel 3385で１分間カウントした。刺激指数（S.I.）を各サンプルについて実験毎分カウント（c.p.m.）を対照c.p.m.で割って計算した（画分又はミトゲンの培養／培地だけの培養）。結果を以下の表１１-１４に示す。
【００７５】
【表１１】
ワクチン接種前の患者グループではS.I. ＞1.0であった。ワクチン接種後、この値は顕著に増加した。両グループの統計解析の結果は次の通りである：
差平均＝-.8739286（対の差の平均）
差の95%信頼区間：-1.150029から-0.5978283
両側ｐ値は＜0.0001---きわめて有意−
これらの結果は、L.(L)chagasi抽出物のいずれの画分の乾癬患者へのワクチン接種の後でも、リンパ球は著しく刺激されるということを示している。高い刺激指数は画分３と４、ならびに生きた無鞭毛体で観測された。
【００７７】
前述のように、TLCK によるそれぞれの無鞭毛寄生体の処理とNP-40による抽出後、第１世代の免疫治療剤の第２の成分である粒子状のL(V)brasiliensis 抽出物（PMH27）から７つの画分を分離した。
【００７８】
【表１２】
表１２では、ワクチン接種前に２つの患者グループが見られる、具体的には、１つのグループはS.I.＜1.0のグループであり、もう１つのグループはS.I.＞1.0のグループである。ワクチン接種後に治癒した患者のグループはワクチン接種前の２つの患者グループのどちらに比べても値が顕著に増加した。統計解析の結果は次の通りである：
S.I.＜1.0のグループ
差平均＝-1.107143（対の差の平均）
差の95%信頼区間：-1.534381から-0.6799043
両側ｐ値は＜0.0001---きわめて有意−
S.I.＞1.0のグループ
差平均＝-.7285719（Bの平均マイナスAの平均）
差の95%信頼区間：-1.3904から-6.674413E-02
両側ｐ値は＜0.0316---有意−
これらの結果は、L.(V)brasiliensis抽出物のいずれの画分の乾癬患者へのワクチン接種によっても、ワクチン接種前の両グループのリンパ球は著しく刺激されるということを示している。高い刺激指数は画分３と４、ならびに生きた無鞭毛体で観測された。
【００８０】
前述のように、TLCK によるそれぞれの無鞭毛寄生体の処理とNP-40による抽出後、第１世代の免疫治療剤の第３の成分である粒子状のL.(L)venezuelensis 抽出物（PMH16）から６つの画分を分離した。
【００８１】
【表１３】
表１３では、ワクチン接種前に２つの患者グループが見られる、具体的には、１つのグループはS.I.＜1.0のグループであり、もう１つのグループはS.I.＞1.0のグループである。ワクチン接種後に治癒した患者のグループではワクチン接種前の２つの患者グループのどちらに比べても値が顕著に増加した。統計解析の結果は次の通りである：
S.I.＜1.0のグループ
差平均＝-2.115417（対の差の平均）
差の95%信頼区間：-3.008944から-1.22189
両側ｐ値は＜0.0001---きわめて有意−
S.I.＞1.0のグループ
差平均＝-.7285719（Bの平均マイナスAの平均）
差の95%信頼区間：-1.3904から-6.674413E-02
両側ｐ値は＜0.0316---有意−
これらの結果は、L.(L)venezuelensis抽出物のいずれの画分による乾癬患者のワクチン接種によっても、ワクチン接種前の両グループのリンパ球は著しく刺激されるということを示している。高い刺激指数は画分３と４、ならびに生きた無鞭毛体で観測された。
【００８３】
前述のように、TLCK によるそれぞれの無鞭毛寄生体の処理とNP-40による抽出後、第１世代の免疫治療剤の第４の成分である粒子状のL.(L)amazonensis 抽出物（PMH8）から７つの画分を分離した。
【００８４】
【表１４】
表１４では、ワクチン接種前に２つの患者グループが見られる、具体的にいうと、１つのグループはS.I.＜1.0のグループであり、もう１つのグループはS.I.＞1.0のグループである。ワクチン接種後に治癒した患者のグループではワクチン接種前の２つの患者グループのどちらに比べても値が顕著に増加した。統計解析の結果は次の通りである：
S.I.＜1.0のグループ
差平均＝-.5710449（対の差の平均）
差の95%信頼区間：.3475174から.7945725
両側ｐ値は＜0.0001---きわめて有意−
S.I.＞1.0のグループ
差平均＝-.4549999（Bの平均マイナスAの平均）
差の95%信頼区間：-.8608927から-4.910712E-02
両側ｐ値は＜0.0287---有意−
これらの結果は、L.(L)amazonensis抽出物のいずれの画分による乾癬患者のワクチン接種によっても、ワクチン接種前の両グループのリンパ球は著しく刺激されるということを示している。高い刺激指数は画分３と４、ならびに生きた無鞭毛体で観測された。
【００８６】
要約すると、各胚発生実験は、第１世代免疫治療剤に含まれるリーシュマニア種の各々からのタンパク質画分のいずれによるワクチン接種も、特に画分３と４によるワクチン接種は、リンパ球の顕著な刺激を生ずるということを示している。刺激されたリンパ球はサイトカインを生成し、それが乾癬患者における炎症応答を抑止して乾癬病変の臨床的寛解を生ずる。
【００８７】
実施例１４
乾癬患者の体液性免疫
【００８８】
【表１５】
La: Leishmania amazonensis; Lv: L. venezuelensis
Lb: L. brasiliensis; Lch: L. changis
乾癬患者の血清をワクチン接種の前と後、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって分析した。その結果を表１５に示す。ワクチン接種前のサンプルと第１世代免疫治療剤の６回の投与後の病変の臨床的寛解までのワクチン接種後のサンプルとの間に光学密度の値に何も差異は見られなかった。ポジティブ反応のカットオフ点は0.5単位であった。唯一のポジティブ血清は活性リーシュマニア症の患者からのサンプルに属していた。このことは、第１世代免疫治療剤は体液性免疫又はTH2応答を誘発しないということをはっきりと示している。
【００９０】
実施例１５
乾癬患者における細胞性免疫
【００９１】
【表１６】
L.(L)chagasi
L.(V)brasiliensis
1 分画３vs.その他の分画
細胞性免疫の皮内反応分析の結果を表１６に示す。このデータは、第１世代免疫治療剤が治癒した患者にTHI応答を誘発することを示す。第１世代免疫治療剤のL.(L)chagasi及びL.(V)brasiliensisの抗原成分の画分３は、病変の臨床的寛解の後の皮内反応分析で最も高い生体内での免疫活性を示している。画分４もどちらの種でも高い活性度を示している。
【００９３】
実施例１６
単離されたタンパク質抗原画分を含む第２世代免疫治療剤による単一盲検試験
【００９４】
【表１７】
第二世代免疫物質の画分によるワクチン接種がPASI値に及ぼす効果を表１７に示す。画分３と４が乾癬の臨床的寛解に関して最高の活性を示す。これらの画分のどちらかを含む免疫治療剤の２回の投与はPASIをワクチン接種前の患者における最初の値の88%減少させる。これらの画分はまた、人工の 胚発生実験において最高の刺激指数を示し、乾癬が治癒した患者でワクチン接種後に最高の生体内での皮内反応（IDR）直径を示した。
【００９６】
実施例１７
乾癬病変の臨床的寛解を生ずるタンパク質画分の同定と特性
アクリルアミド・ゲルからのペプチドをニトロセルロース紙に移して、フロリダ州ゲインズビルにあるフロリダ大学のICBR タンパク質化学CORE施設で分析した。Hewlett Packard 1090 HPLC を用いてHPLC を行い、消化をEndo-Lys-Cによって行い、アミノ酸分析をABI 494 Protein Sequencerを用いて行った。アミノ酸配列の相同性をBLASTプログラムを用いて調べた。
【００９７】
【表１８】
画分３は、当業者に周知の完全還元とアルキル化の後、３つのバンドを含んでいた。２つを除く全てのペプチド配列はケラチンＩ又はII型のヒト・タンパク質との相同性を示した。画分４も、画分３と同様の結果を示した。この無鞭毛寄生体のケラチンは本発明の免疫治療剤が乾癬患者に及ぼす効果を明らかにする。多くの研究者たちは、乾癬が表皮ケラチノサイトから合成されるヒト・ケラチンにおける障害であると考えている。
【００９９】
実施例１８
フローサイトメータによる末梢血液リンパ球の分析
【０１００】
【表１９】
第１世代免疫治療剤による治療の前、全ての乾癬患者は、末梢血液のリンパ球の数が正常の健康対照群に比べて著しく低かった。例外はHLA及びIgEマーカーで、これらは高いレベルで存在していた。
【０１０２】
【表２０】
第１世代免疫治療剤による治療前の乾癬患者における末梢血液リンパ球個体数を調べた。患者たちを、病気の重篤度によって分け、PASI値によって表に表わした。その結果を表２０に示す。乾癬患者のPASI値が増加するにつれて、健康対照群に比べて末梢血液ノリンパ球のCD4+, CD8+, CD8-CD4+, CD3, CD8+CD3+, CD8+CD3-, CD8+HLA-の数は減少し、HLA+の数は増加した。PASI 1-9 のグループでは、４つのリンパ球個体数だけが対照群の値よりも低かったが、PASI 20-65のグループでは、７つのリンパ球個体数が対照の値よりも低かった。このことは、リンパ球が末梢血液から乾癬患者の皮膚の真皮と表皮へ移動してこの病気に特徴的な慢性炎症を生じていることを示唆する。
【０１０４】
【表２１】
異なるPASI値の患者の間でリンパ球個体数には顕著な差がある。1-9 グループと10-20 グループの比較は、４つのリンパ球個体数の値が重篤な乾癬患者グループでは低くなっていることを示している。PASI 1-9のグループとPASIが20単位を超えるグループの比較は、７つのリンパ球個体数の値が重篤な乾癬患者グループでは低くなっていることを示している。IgA+リンパ球はより重病のグループで高くなっていた。
【０１０６】
【表２２】
病変の臨床的寛解の後、末梢血液のすべてのリンパ球個体数は健康対照群と同様な正常値に戻った。HLA+とCD19のリンパ球個体数だけが健康対照群よりも値が高かった。これは多分、免疫治療剤による治療の後リンパ球が刺激されたためであると考えられる。
【０１０８】
具体的な実施の形態についての上の記述は単に例示的なものであり、本発明の精神と範囲から逸脱することなくいろいろな変更を加えることができ、それは添付された特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (38)
- SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 及びSEQ ID NO:14 から成る群から選択された単離されたアミノ酸配列又はその免疫原性変異体を含むポリペプチド。
- 少なくとも１つの請求項１記載のポリペプチドを含む乾癬の治療のための免疫治療剤。
- さらにアルミナを含む請求項２記載の免疫治療剤。
- SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 及びSEQ ID NO:14 から成る群から選択された単離されたアミノ酸配列から成るポリペプチド。
- 少なくとも１つの請求項４記載のポリペプチドを含む乾癬の治療のための免疫治療剤。
- さらにアルミナを含む請求項５記載の免疫治療剤。
- リーシュマニア属の原生動物から単離されたタンパク質のアミノ酸配列又はその免疫原性変異体、の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドであって、該免疫原生部分は乾癬の臨床的症状の軽減をもたらす免疫応答を誘発することができ、該タンパク質は見かけの分子量が21, 33, 44, 50, 55, 58, 65, 及び77 kDaである粒子抗原ポリペプチドから成る群から選択されたことを特徴とするポリペプチド。
- リーシュマニア原生動物から単離された少なくとも１つのポリペプチドを含む乾癬の治療のための免疫治療剤であって、該少なくとも１つのポリペプチドが完全還元及びアルキル化後の見かけの分子量が73, 80, 及び82 kDaである粒子抗原ポリペプチドから成る群から選択されたことを特徴とする免疫治療剤。
- さらにアルミナを含む請求項８記載の免疫治療剤。
- 該リーシュマニア原生動物がさらに、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica 及びL.(L)guyanensis から成る群から選択された少なくとも１つの種を含むことを特徴とする請求項８記載の免疫治療剤。
- さらにアルミナを含む請求項１０記載の免疫治療剤。
- 該リーシュマニア原生動物がL.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasiの混合物から成ることを特徴とする請求項８記載の免疫治療剤。
- さらにアルミナを含む請求項１２記載の免疫治療剤。
- リーシュマニア原生動物から単離された複数のポリペプチドを含む乾癬の治療のための免疫治療剤であって、該複数のポリペプチドが見かけの分子量が21, 33, 44, 50, 55, 58, 65, 及び77 kDaである粒子抗原ポリペプチドから成る群から選択されたことを特徴とする免疫治療剤。
- さらにアルミナを含む請求項１４記載の免疫治療剤。
- 該リーシュマニア原生動物がさらに、L.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasi, L.(L)donovani, L.(L)infantum, L.(L)major, L.(L)panamensis, L.(L)tropica 及びL.(L)guyanensis から成る群から選択された少なくとも１つの種を含むことを特徴とする請求項１４記載の免疫治療剤。
- さらにアルミナを含む請求項１６記載の免疫治療剤。
- 該リーシュマニア原生動物がL.(L)amazonensis, L.(L)venezuelensis, L.(V)braisiliensis, L.(L)chagasiの混合物から成ることを特徴とする請求項１４記載の免疫治療剤。
- さらにアルミナを含む請求項１８記載の免疫治療剤。
- SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 及びSEQ ID NO:14 から成る群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列又はその免疫原性変異体をコード化する単離された核酸配列又はその補体。
- 請求項２０記載の単離された核酸配列を含む一本鎖ベクター。
- 請求項２０記載の単離された核酸配列をその補体と複合化（hybridized）された形で含む二本鎖ベクター。
- 見かけの分子量が21, 33, 44, 50, 55, 58, 65, 及び77 kDaである粒子抗原ポリペプチドから成る群から選択されたリーシュマニア属の原生動物から単離されたポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも免疫原性部分をコード化する単離された核酸配列又はその免疫原性変異体又はその補体であって、該免疫原性部分は乾癬の臨床的症状の軽減をもたらす免疫応答を誘発することができることを特徴とする単離された核酸配列又はその免疫原性変異体又はその補体。
- 請求項２３記載の単離された核酸配列を含む一本鎖ベクター。
- 請求項２３記載の単離された核酸配列をその補体と複合化された形で含む二本鎖ベクター。
- 乾癬の治療と臨床的寛解のためのポリペプチドを生産する方法であって、請求項２１，２２，２４，又は２５記載のベクターで少なくとも１つの微生物宿主細胞を形質転換するステップ、形質転換された微生物宿主細胞を選択するステップ、形質転換された微生物宿主細胞を培養するステップ、及び該ポリペプチドを精製するステップを含む方法。
- 請求項２１，２２，２４，又は２５記載のベクターで形質転換された微生物宿主細胞。
- 乾癬の治療と臨床的寛解のためのポリペプチドを生産する方法であって、請求項２０又は２３記載の単離された核酸配列を含む、又は請求項２０又は２３記載の単離された核酸配列をその補体と複合化された形で含む、核酸によって少なくとも１つの微生物宿主細胞にトランスフェクションするステップ、トランスフェクションされた微生物宿主細胞を選択するステップ、トランスフェクションされた微生物宿主細胞を培養するステップ、及び該ポリペプチドを精製するステップを含む方法。
- 請求項２１又は２４記載の単離された核酸配列を含む一本鎖核酸によってトランスフェクションされた微生物宿主細胞。
- 請求項２２又は２５記載の単離された核酸配列をその補体と複合化された形で含む二本鎖核酸によってトランスフェクションされた微生物宿主細胞。
- 乾癬の治療と臨床的寛解のためのポリペプチドを生産する方法であって、請求項２０又は２３記載の単離された核酸配列を含む、又は請求項２０又は２３記載の単離された核酸配列をその補体と複合化された形で含む核酸によって少なくとも１つの微生物宿主細胞に形質導入するステップ、形質導入された微生物宿主細胞を選択するステップ、形質導入された微生物宿主細胞を培養するステップ、及び該ポリペプチドを精製するステップを含む方法。
- 請求項２０又は２３記載の単離された核酸配列を含む一本鎖核酸によって形質導入された微生物宿主細胞。
- 請求項２０又は２３記載の単離された核酸配列をその補体と複合化された形で含む二本鎖核酸によって形質導入された微生物宿主細胞。
- 乾癬の治療と臨床的寛解のための方法であって、治療的に有効な量の請求項１，３，又は７記載のポリペプチドを含む製薬組成物を温血動物に投与するステップを含む方法。
- 乾癬の治療と臨床的寛解のための方法であって、治療的に有効な量の請求項１，３，又は７記載のポリペプチドを含む製薬組成物を人間に投与するステップを含む方法。
- 乾癬の治療と臨床的寛解のための方法であって、治療的に有効な量の請求項２０，又は２３記載の単離された核酸配列を含む製薬組成物を温血動物に投与するステップを含む方法。
- 乾癬の治療と臨床的寛解のための方法であって、治療的に有効な量の請求項２０，又は２３記載の単離された核酸配列を含む製薬組成物を人間に投与するステップを含む方法。
- プローブとして使用するための請求項２０，又は２３記載の単離された核酸配列。
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