MXPA06009076A

MXPA06009076A - Composiciones y metodos para el tratamiento y remision clinica de psoriasis.

Info

Publication number: MXPA06009076A
Application number: MXPA06009076A
Authority: MX
Inventors: Jose Antonio O'daly
Original assignee: Astralis Llc
Priority date: 2004-02-09
Filing date: 2005-02-08
Publication date: 2007-03-08
Also published as: US20040241168A1; CA2555612A1; AU2005220149A1; JP2007522221A; EP1720410A4; BRPI0507545A; EP1720410A1; WO2005084444A1

Abstract

Un tratamiento para psoriasis y enfermedades relacionadas tiene un mecanismo de accion que incluye una inhibicion o bloqueo de recubrimiento de celula T mediante interferencia con la interaccion de CLA-E e interferencia de union endotelial o diapadesis por induccion, por bloqueo de la interaccion LFA-1/ICAM y/o la interaccion VLA/VCAM con celulas endoteliales.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO Y REMISIÓN CLÍNICA DE PSORIASIS Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud de E. U. Serie Número 10/687,892, la cual se presentó el 17 de Octubre de 2003, la cual es una continuación en parte de la Solicitud de Patente de E.U.

Número 09/809,003, la cual se expidió como la Patente de E. U. Número 6,673,351 , la cual se emitió el 6 de Enero de 2004.

Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a agentes inmunoterapéuticos o agentes terapéuticos, composiciones que comprenden aquellos agentes, y métodos de uso de aquellos agentes y composiciones para el tratamiento y remisión clínica de psoriasis.

Antecedentes La psoriasis es un desorden dérmico inflamatorio y escamoso, remitente y recurrente, genéticamente influenciado, crónico, de etiología desconocida, que afecta de 1 a 3 por ciento de la población mundial. Existen varios tipos de psoriasis, incluyendo, variantes de placa, pustular, goteante y artrítica. Como se reporta por Stephanie Mehlis y Kenneth Gordon, la inmunología de la psoriasis se ha estudiado y parece que el mecanismo del sistema inmune humano que activa los síntomas de la psoriasis se relaciona muy de cerca con un infiltrado linfático que consiste en linfocitos de célula T. Journal of the American Academy of Dermatology, 2003; 49: S44-50. Las células T desempeñan una función en el inicio y mantenim iento de la psoriasis. La función de las células T en el inicio y mantenimiento de la psoriasis puede dividirse en tres áreas: (1 ) la activación inicial de las células T, (2) la migración de células T hacia la piel y (3) la función efectora de las células T en la piel mediante la secreción de citocinas y la amplificación de la cascada inmunológica. La activación inicial de una célula T requiere de tres etapas. La primer etapa es el enlace: la Célula T se vuelve momentáneamente y se anexa reversiblemente a una célula que presenta antígeno (APC). Este proceso se media a través de moléculas superficiales utilizadas para adhesión, incluyendo antígenos asociados a la función de leucocitos (LFA)-1 y CD2 en las células T y molécula de adhesión intercelular (ICAM)-1 y LFA-3 en el APC. La siguiente etapa es un proceso de activación específica de antígeno, llamada señal 1 . Aquí, el receptor de célula T específico de la célula T reconoce un antígeno presentado en el complejo de principal histocompatibilidad (MHC I o II) por el APC. La etapa final es una interacción de célula-célula específica de no-antígeno, referida como la señal 2 o co-estimulación. Si la co-estimulación no ocurre, la célula T no responderá y experimentará ya sea apoptosis o se volverá no responsiva en el futuro, un proceso llamado anergia. Tal como las células T deben activarse para inducir o mantener la psoriasis, igualmente deben presentarse en la piel. El proceso de células T que migran o "transitan" hacia la piel también es un proceso de múltiples etapas regulado por factores segregados e interacciones de célula-célula entre la célula T y el endotelio. Una célula T activada en la circulación debe hacerse lenta y después unirse al endotelio antes de migrar hacia el tejido afectado, en este caso, la piel. La primer etapa en este proceso, la renovación, se media por interacciones de célula-célula, tal como antígeno de linfocito cutáneo (CLA) en la célula T migrante y E.selectina en la célula endotelial. La renovación disminuye la velocidad de la célula a fin de que pueda unirse a las paredes de vasos sanguíneos y se inmovilicen. Existen múltiples requisitos para el enlace, incluyendo la activación de proteínas superficiales en las células T, mediadas por pequeñas proteínas quimiotácticas llamadas quimoquinas, y el enlace de proteína superficial endotelial de célula que incluye interacciones de LFA-1 /ICAM y VLA/VACM. Una vez que ha ocurrido esta etapa de enlace, la célula T puede migrar a través de la pared del vaso sang uíneo en un proceso llamado diapedesis, y participa en la respuesta inmune local en la psoriasis. La etapa final en el proceso ¡nmunológico de la psoriasis es la inducción de los cambios queratinocitos por células T y secreciones de otras células inflamatorias. Esta etapa puede involucrar muchos tipos de células, incluyendo células T, macrófagos locales, células dendríticas, endotelio vascular, e incluso queratinocitos. Aunque existen muchas interacciones potenciales entre estos tipos de células que podrían tener una profunda influencia en la psoriasis, es probable que una cascada de citocinas, segregadas por muchas células diferentes en el ambiente local de la placa ps?riática, desempeñen una función central en las respuestas fenotípicas en la psoriasis (Tabla 1). De manera importante, ambas células T CD4(+) y CD8(+) producen citocinas de tipo T1 , es decir, interferon-? (IFN-?) , e IL-2. Estas citocinas influyen en otras células de manera local para segregar una plétora de proteínas que incluyen quimioquinas, factor-a de necrosis de tumor (TNF-a) , factor estimulador de colonia de granulocito-macrófago (GM-CSF), factor de crecimiento epidérmico (EGF). E I L-8. Esto regula la migración de nuevas células inflamatorias en la piel e incrementa la actividad de estas células y queratinocitos, dando como resultado una placa psoriática. Existe una necesidad de proporcionar métodos y composiciones para tratar psoriasis y otras enfermedades que se relacionan con linfocitos de célula T que se infiltran en ciertas membranas.

Breve Descripción de la Invención Un tratamiento para la psoriasis y las enfermedades relacionadas tiene un mecanismo de acción que incluye una inhibición o bloqueo de renovación de células T mediante interferencia con la interacción de CLA-E selectina mediante una novedosa citosina e interferencia de enlace endotelial o diapédesis mediante una citosina novedosa inducida por estimulación de un clon de célula T desconocido que bloquea la interacción LFA/ICAM y/o la interacción VLA/VCAM con células endoteliales.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a composiciones novedosas y métodos para el tratamiento y remisión clínica de psoriasis. La modalidad preferida se representa por composiciones que comprenden polipéptidos inmunogénicos o los ácidos nucleicos que los codifican. En una modalidad de la invención, los polipéptidos sujeto pueden aislarse de protozoarios Leishmania y preferentemente a partir de protozoarios amastigoto Leishmania. Los polipéptidos de la invención sujeto pueden obtenerse de protozoarios del género Leishmania mediante el uso de procedimientos de aislamiento proteínico estándares, que se conocen en la materia. También se contemplan por la presente invención los agentes inmunoterapéuticos y composiciones farmacéuticas que incorporan los polipéptidos inmunogénicos de la presente invención. En una modalidad, se proporciona una primer generación de agente inmunoterapéutico polivalente, que comprende un aislado polipéptido de una mezcla de una pluralidad de especies Leishmania, tal como L. (L)amazonensis, L. (L)venezuelensis, L. (V)brasiliensis, L. (L)chagasi, L. (L)donovani, L. (L)infantum, L. (L)major, L. (L)panamensis, L. (L)tropic.a, y L. (L)guyanensis. Preferentemente, la mezcla comprende L. (L)amazonensis, L. (L)venezuelensis, L. (V)brasiliensis, y L. (L)chagasi. Más preferentemente, la mezcla consiste en estas cuatro especies. Los organismos se cultivan preferentemente en el estado amastigoto en el medio de cultivo sintético, especificado en la Tabla 1 , complementado con 5% de suero bovino fetal, típicamente en aproximadamente 30-34°C. Posteriormente, y durante la fase estática de crecimiento, los amastigotos se sujetan a un medio que contiene una cantidad de N-p-tosil-L-Lisina clorometil quetona (TLCK) o una sal farmacológicamente aceptable del mismo, eficaz para elim inar las células. Las células muertas se aislan y tratan entonces con el detergente no iónico Nonidet p-40 (N P40) para solubilizar los antígenos superficiales, que se descartan. Los antígenos particulados que comprenden los polipéptidos inmunogénicos de la presente invención pueden recolectarse mediante centrifugación después de la interrupción celular. Estos polipéptidos se enjuagan con solución salina regulada con fosfato (PBS) y posteriormente se re-suspenden mediante sonicación por 5 minutos a 4°C en PBS que contiene alúmina. En otra modalidad, se describe una primer generación de agente inmunoterapéutico monovalente, que comprende un aislado de polipéptido de una sola especie de Leishmania seleccionada a partir del grupo que consiste en L. (L)amazonensis, L. (L)venezuelensis, L. (V)brasiliensis, L. (L)chagasi, L. (L)donovani, L. (L)infahtum, L. (L)major, L. (L)panamensis, L. (L)tropica, y L. (L)guyanensis. Preferentemente, la especia individual de Leihsmania se selecciona a partir del grupo que consiste en L. (L)amazonensis, L. (L)venezuelensis, L. (V)brasiliensis, y L. (L)chagasi. Los procedimientos para la preparación de este agente inmunoterapéutico son de otro modo idénticos a aquellos arriba expuestos para el agente inmunoterapéutico polivalente de primer generación. En otra modalidad, se describe un agente inmunoterapéutico polivalente de seg unda generación, que comprende un aislado de polipéptido de una mezcla de una pluralidad de especies Leishmania, tal como L. (L)amazonensis, L. (L)venezuelensis, L.(V)brasiHensis, L. (L)chagasi, L. (L)donovani, L. (L)infantum, L. (L)major, L. (L)panamensis, L. (L)tropica, y L. (L)guyanensis. Preferentemente, la mezcla comprende L. (L)amazonensis,^ L. (L)venezuelensis, L. (V)brasiliensis, y L. (L)chagasi. Más preferentemente, la mezcla consiste en estas cuatro especies. Los organismos se cultivan preferentemente en la etapa de amastigoto en el medio de cultivo sintético especificado en la Tabla 1 , complementado con 5% de suero bovino fetal, típicamente a aproximadamente 30-34°C. Posteriormente y durante la fase estática de crecimiento, los amastigotos se sujetan a un medio que contiene una cantidad de N-p-tosil-L-L-lisina clorometil quetona (TLCK) o una sal farmacológicamente aceptable de la misma, eficaz para eliminar las células. Las células muertas se aislan entonces y se tratan con el detergente no iónico Nonidet p-40 (NP40) para solubilizar los antígenos superficiales, que se descartan. Los antígenos de particulado que comprenden los polipéptidos inmunogénicos de la presente invención pueden recolectarse mediante centrifugación después de la interrupción celular. Estos polipéptidos se enjuagan con solución salina regulada con fosfato (PBS) y posteriormente se re-suspenden mediante sonicación durante 5 minutos a 4°C en 8 M de Urea, 0.025 M Tris (Tris-hidroxi-metil-amino-metano). Los polipéptidos se sujetan entonces a cromatografía en una columna DEAE-Sephadex con una levigación por etapas a partir de 0.05-0.3 M NaCI en una solución que contiene 8M de Urea, .025 M Tris, pH 8.3. Se recolectan siete fracciones de proteína y un inoculo que comprende cada fracción de proteína se elabora mediante re-suspensión de los polipéptidos de cada fracción en PBS que contiene alúmina. En otra modalidad, se describe un agente inmunoterapéutico monovalente de segunda generación, que comprende un aislado polipéptido de una sola especie de Leishmania seleccionada a partir del grupo que consiste en L. (L)amazonensis, L. (L)venezuelensis, L. (V)brasiliensis, L. (L)chagasi, L. (L)donovani, L. (L)infantum, L. (L)major, L. (L)panamensis, L. (L)tropica, y L. (L)guyanensis. Preferentemente, la especie individual de Leishmania se selecciona a partir del grupo que consiste en L. (L)amazonensis, L. (L)venezuelensis, L. (V)brasiliensis, y L. (L)chagasi. Los procedimientos para la preparación de este agente inmunoterapéutico son de otro modo idénticos a aquellos arriba expuestos para el agente inmunoterapéutico polivalente de segunda generación. De manera alternativa, los polipéptidos sujeto pueden sintetizarse de acuerdo con procedimientos y técnicas conocidos, o producirse de manera recombinante mediante transformación de una célula huésped con una o más de las secuencias nucleótidas que codifican los polipéptidos deseados. Los polipéptidos pueden expresarse en la célula huésped de tal manera que pueden aislarse y purificarse hasta un grado de purificación deseado. Los polipéptidos sujeto pueden utilizarse de acuerdo con la invención sujeto como un agente inmunoterapéutico de tercera generación, para tratar la psoriasis. La presente invención se refiere además a secuencias de ácido nucleico que pueden ser útiles en la transformación de células huésped adecuadas para originar que produzcan los polipéptidos de la invención; en administración a un animal de sangre caliente, ya sea directamente o como parte de una composición farmacéuticamente aceptable, a fin de generar una respuesta inmune e inducir así la remisión clínica de psoriasis en el animal; como sondas etiquetadas para análisis genético; o como marcadores de peso molecular de ácido nucleico. Uno de experiencia ordinaria en la materia de biología molecular puede obtener ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la presente invención en vista de las enseñanzas aquí proporcionadas. Por ejemplo, los polipéptidos del agente inmunoterapéutico de primer generación de la presente invención se han aislado y purificado a partir de protozoarios del género Leishmania y comprenden ocho bandas, identificadas por SDS-PAGE, que representan ocho distintos polipéptidos que tienen pesos moleculares aparentes de 21 , 33, 44, 50, 55, 58, 65 y 77 kDa, respectivamente. Cada una de estas bandas representa un polipéptido separado que puede aislarse y ordenarse en secuencia de acuerdo con procedimientos estándares de ordenamiento en secuencia de amino ácidos. Los polipéptidos de cada agente inmunoterapéutico de segunda generación se purificaron mediante sujeción del agente inmunoterapéutico de primer generación que contiene la mezcla de ocho polipéptidos a cromatografía en dietilaminoetil(DEAE)-Sephadex. Dos fracciones que tienen toda la actividad para curar psoriasis se aislaron y redujeron totalmente y alquilaron mediante procedimientos estándares. Estas fracciones se sujetaron a electroforesis en geles de acrilamida para separar los polipéptidos constituyentes, y la secuencia amino acida de cada polipéptido se obtuvo mediante procedimientos estándares de ordenamiento en secuencia de proteínas. Las secuencias nucleótidas que codifican cada uno de estos polipéptidos pueden derivarse de estas secuencias amino acidas mediante aplicación del código genético. Adicionalmente, la presente invención contempla la producción de grandes cantidades de los polipéptidos inmunogénicos de la invención a través de la introducción de los ácidos nucleicos que los codifican en células huésped microbianas. Los ácidos nucleicos pueden introducirse directamente en el genoma de la célula huésped o pueden incorporarse en un vector que después se introduce en el huésped. Los métodos ejemplares de incorporación directa incluyen transducción mediante fago recombinante o cósmidos, transfección donde las células huésped especialmente tratadas puede originarse que capturen cromosomas fagos sin cubierta, y transformación mediante precipitación de calcio. Estos métodos son muy conocidos en la materia. Los vectores ejemplares incluyen plásmidas, cósmidas y fagos. Una biblioteca genómica para una especie Leishmania puede crearse por medios de rutina, y aislarse el ADN de interés a partir de la misma. Por ejemplo, el ADN de protozoarios Leishmania puede aislarse y restringirse con enzimas de restricción conocidas. Los fragmentos de ADN resultantes pueden insertarse entonces en vectores de clonación adecuados para introducción a un huésped compatible. Dependiendo del huésped contemplado, el vector puede incluir diversas regiones reguladoras y otras, que incluyen normalmente un origen de reproducción, una o más regiones promotoras, y marcadores para la selección de transformadores. En general, los vectores proporcionarán señales reguladoras para expresión y amplificación del ADN de interés. Pueden emplearse diversos marcadores para la selección de transformadores, incluyendo resistencia a biocidas, particularmente a antibióticos tales como ampicilina, tetraciclina, trimetoprima, cloranfenicol, y penicilina; toxinas, tales como colicina; y metales pesados, tales como sales de mercurio. Alternativamente, puede emplearse la complementación que proporciona un nutriente esencial para un huésped auxotrópico. Los huéspedes que pueden emplearse de acuerdo con técnicas muy conocidas en la materia de la producción de los polipéptidos de la presente invención incluyen microorganismos unicelulares, tales como procariotes, es decir, bacterias; y eucariotes, tales como hongos, incluyendo levaduras, algas, protozoarios, molds y los similar, así como también células de plantas, tanto en cultivo como en plantas. Bacterias específicas que son susceptibles a transformación incluyen miembros de las Enterobacterias, tales como cepas de Escherichia coli; Salmonella; Bacillaceae, tal como Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus; Haemophilus influenzae y levaduras tales como Saccharomyces, entre otros. Según se utiliza en la presente, el término célula huésped microbiano abarca todos los organismos procarióticos y eucarióticos, incluyendo células de plantas, tanto en cultivo como en plantas. Las sondas universales pueden obtenerse, las cuales hibridizan ciertos fragmentos de una biblioteca de ADN, permitiendo la identificación y selección (o "sondeo") de los genes de interés, es decir, aquellas secuencias nucleótidas que codifican los polipéptidos descritos como parte de la presente invención. El aislamiento de estos genes puede llevarse a cabo mediante el uso de técnicas que son muy conocidas en la materia de biología molecular. Los genes aislados pueden insertarse en vectores adecuados para utilizarse en la transformación de células huésped microbianas. Además, estos genes pueden sujetarse a procedimientos estándares de ordenamiento en secuencia de ácido nucleico a fin de proporcionar información específica acerca de la secuencia nucleótida de los genes que codifican los polipéptidos sujeto. Es bien sabido en la materia que, cuando se sintetiza un gen para expresión mejorada en una célula huésped, es deseable diseñar el gen de tal manera que su frecuencia de uso de codón se aproxime a la frecuencia de uso de codón preferido de la célula huésped. Para propósitos de la invención sujeto, "frecuencia de uso de codón preferido" se refiere a la preferencia exhibida por una célula huésped específica en uso de codones nucleótidos para especificar un amino ácido dado. A fin de determinar la frecuencia de uso de un codón en particular en un gen, el número de ocurrencias de ese codón en el gen se divide entre el número total de ocurrencias de todos los codones que especifican el mismo amino ácido en el gen. De manera similar, la frecuencia de uso de codón preferido exhibida por una célula huésped puede calcularse mediante promedio de la frecuencia de uso de codón preferido en un gran número de genes expresados por la célula huésped. Es preferible que este análisis se limite a genes que se expresan altamente por la célula huésped. De este modo, en una modalidad de la invención sujeto, las bacterias, plantas u otras células pueden diseñarse genéticamente, por ejemplo, transformarse con genes de protozoarios de la especie Leishmania, a fin de lograr los niveles de expresión deseados de los polipéptidos o proteínas sujeto. Para proporcionar genes que tienen expresión mejorada, la secuencia de ADN del gen puede modificarse para comprender codones preferidos por genes altamente expresados a fin de lograr un contenido A+T en la composición de base nucleótida que sea substancialmente el encontrado en la célula huésped transformada. También es preferible formar una secuencia de inicio óptima para dicha célula huésped y eliminar las secuencias que pueden originar desestabilización, poliadenilación inadecuada, degradación y terminación de ARN y evitar secuencias que constituyen ganchos de estructura secundaria y sitios de división de ARN. Por ejemplo, en genes sintéticos, los codones utilizados para especificar un amino ácido dado pueden seleccionarse con respecto a la frecuencia de distribución del uso de codón empleado en genes altamente expresados en la célula huésped para especificar ese amino ácido. Como se aprecia por aquellos expertos en la materia, la frecuencia de distribución del uso de codón utilizada en el gen sintético es una determinante del nivel de expresión. El. ensamble de los genes de esta invención puede llevarse a cabo mediante el uso de tecnología estándar conocida en la materia. Un gen estructural diseñado para expresión mejorada en una célula huésped puede ensamblarse de manera enzimática dentro de un vector de ADN a partir de segmentos en dúplex de oligonucleótidos químicamente sintetizados. El gen puede introducirse entonces en la célula huésped y expresarse mediante medios conocidos en la materia. Preferentemente, la proteína producida después de la expresión del gen sintético es funcionalmente equivalente a una proteína nativa. De acuerdo con la invención sujeto, "funcionalmente equivalente" se refiere a identidad o casi identidad de función. Un producto de gen sintético que tiene al menos una propiedad con relación a su actividad o función que es similar o idéntica a una proteína familiar se considera funcionalmente equivalente a la misma. También se sabe bien en la materia que las secuencias nucleótidas de la invención sujeto pueden truncarse de tal manera que ciertos fragmentos resultantes de la secuencia original de longitud completa pueden retener las características deseadas de la secuencia de longitud completa. Una amplia variedad de enzimas de restricción es muy conocida por aquellos expertos en la materia como adecuados para la generación de fragmentos a partir de moléculas de ácido nucleico mayores. Por ejemplo, es bien sabido que la exonucleasa Ba131 puede utilizarse convenientemente para digestión limitada de ADN de tiempo controlado. Ver, por ejemplo, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, páginas 135-139. Ver también Wei et al. (1983) J. Biol. Chem. 258: 13006-13512. De este modo, la exonucleasa Ba131 (comúnmente referida como procedimientos de "eliminación de una base") permite el retiro de nucleótidos de cualquiera o ambos extremos de los ácidos nucleicos sujeto, generando en consecuencia un amplio espectro de fragmentos, muchos de los cuales codifican productos que son funcionalmente equivalentes a las secuencias polipéptidas naturales de la presente invención. Los procedimientos de etiquetado también son muy conocidos, y el técnico ordinariamente experto podría seleccionar por rutina los fragmentos etiquetados para sus características de hibridización a de determinar su utilidad como sondas. Por ejemplo, es de rutina el etiquetar los ácidos nucleicos para utilizarse como sondas específicas y selectivas en la identificación genética o procedimientos de diagnóstico. Una persona de experiencia ordinaria en' la materia reconocería que diversas variaciones o fragmentos de aquellas secuencias, que hibridizan de manera específica y selectiva el ADN de la especie Leishmania, también podrían funcionar como una sonda. Esto se encuentra dentro de la experiencia ordinaria de las personas en la materia y no requiere de indebida experimentación, a fin de determinar si un segmento de los ácidos nucleicos sujeto es un fragmento o una variante que se hibridiza . de manera específica y selectiva de acuerdo con la invención sujeto. Por consiguiente, los fragmentos o variantes de estos ácidos nucleicos pueden ser útiles como sondas para identificar, diagnosticar o distinguir especies de Leishmania. También se reconoce que los polinucleótidos o péptidos de la invención sujeto pueden ser útiles como marcadores de peso molecular en determinaciones o ensayos de peso molecular de ácido nucleico o amino ácidos, respectivos. Con objeto de mantener un agente inmunoterapéutico de primera generación de acuerdo con la invención sujeto, los organismos del género Leishmania pueden cultivarse en medio de cultivo sintético que comprende los ingredientes listados en la Tabla 1 . En una modalidad preferida, el medio de cultivo se complementa con 5% de suero bovino fetal. El cultivo de los protozoarios de acuerdo con la invención sujeto se lleva a cabo típicamente a aproximadamente 30-34°C. En una modalidad particularmente preferida, el cultivo de los protozoarios se lleva a cabo en la etapa de amastigoto de su ciclo de vida. Tabla 1 : Medio de cultivo de Leishmania I ng red iente mg/lt Ing rediente mg/lt Metionina 140 Carnosina 25 Triptofano 50 Citrulina 50 Ácido a-Amino Adípico 3 Sarcosina 57 Asparagina 1 65 CaCI2 265 Cistipa Al Fe(N 03)9 H20 0.72 Histidina 6 KCI 400 Ácido Aspártico 120 MgS04 7H20 200 Alanina 512 NaCI 5, 850 Prolina 2 8 NaHCOa 2,000 Lisina 337 NaH2PO„H20 140 Taurina 6 Tricina 900 Isoleucina 1 91 Hemina 1 Ornitina 3 H EPES 2,000 Tirosina 210 Glucosa 1 ,000 ß-alanina 80 D-ribosa 1 0 Fosfoserina 23 2-Deoxi-ribosa 1 0 Ácido a-amino Butírico 8 Golecalciferol (D3) 0.1 Leucina 440 Biotina 1 Arginína 413 Piridoxamina 0.05 Serina 220 Piridoxal 1 Hidroxilisina 1 2 Cianocobalamina (B?2) 0.01 Gl utamina 164 Colina 1 Ácido Glutámico 420 Tiamina (B ,) 1 Cisteína 0.5 Inositol 2 Fosfoetanolamina 25 a-Tocoferol 0.01 Treonina 200 3-fitilmenadiona (K,) 0.01 Glicina 235 Menadiona (K3) 0.01 Fenilalanina 240 Retinol (A) 0.14 Valina 266 Riboflavina (B2) 0.1 Ácido d-Panténico 1 Ácido 6,8 Tiótico 0.01 Ácido Ascórbico 0.05 Piridoxina (B6) 0.025 Ácido p-Aminobenzoico 0.05 Ácido Fólico 1 Ergocalciferol (D2) 0.1 Niacinamida 1 L-carnitina 0.05 Ácido Tetrahidrofólico 0.5 Cloruro de D L-metionina- Adenosina-5-Trifosfato 5.5 S-metil-sulfonio (U) 0.05 (ATP) Ácido 2-Deoxiadenílico 2'-Deoxiuridina-5-monofosfato (d-UMP) 3.0 (d-AMP) 3.0 Ácido 5'-Deoxiguanílico (d-GMP) Acido 5'-Timid ilico (TMP) 3.0 Hidroxiprolina 3.0 2'-Deoxicitidina-5-monofosfato (d-CM P) 3 262.5 El medio de cultivo que comprende las células protozoarias puede tratarse entonces con objeto de inactivar, y preferentemente eliminar, las células. Después del aislamiento de aquellas células, las proteínas antigénicas pueden purificarse a partir de las mismas e incluirse en un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución reguladora, para crear un agente inmunoterapéutico de segunda generación. Preferentemente, las células se inactivan o eliminan con un agente de no-lisis, por ejemplo, TLCK. Las proteínas antigénicas de la presente invención son proteínas particuladas que pueden aislarse a partir de las células que utilizan métodos aceptados. En una modalidad más específica, el método de crear el agente inmunoterapéutico de segunda generación de la presente invención comprende las etapas de (1 ) cultivar protozoarios, preferentemente en la etapa de amastigoto, en un medio de cultivo adecuado; (2) tratar dichas células de protozoario para inactivar o eliminar las células; (3) aislar las células tratadas; (4) extraer proteínas antigénicas de las células aisladas; y (5) formular la composición de agente inmunoterapéutico de segunda generación mediante combinación de una o más proteínas antigénicas aisladas, con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina regulada con fosfato (PBS). Un vehículo farmacéuticamente aceptable preferido es una solución de PBS que tiene alúmina presente dentro de la solución. Para curar la psoriasis en pacientes con diagnóstico clínico e hispatológico de la enfermedad, el agente inmunoterapéutico polivalente de primera generación se administró de manera intramuscular, en la región deltoide, una vez al mes, una vez cada 1 5 días o una vez a la semana, de acuerdo con la severidad de la enfermedad, durante 7.6 +. 6.0 meses en promedio, a 500 µg/dosis. Además de curar la psoriasis, un agente inmunoterapéutico monovalente con cada una de las especies de Leishmania presente en el agente inmunoterapéutico polivalente de primera generación, se utilizo como una composición sujeto con resultados similares al agente inmunoterapéutico polivalente. Además de curar la psoriasis, un agente inmunoterapéutico de segunda generación que contiene las fracciones de proteína mediante medios cromatográficos a partir del agente inmunoterapéutico de primer generación, junto con 0.1 ml de alúmina/mg de proteína, se administró de manera intramuscular en la región deltoide una vez cada 15 días durante 3-4 dosis a 200 µg/dosis en 0.5 ml. Los siguientes son ejemplos que ilustran procedimientos para practicar la invención. Estos ejemplos no deben considerarse como limitantes. Todos los porcentajes se encuentran en peso y todas las proporciones de mezcla de solvente se encuentran en volumen a menos que se anote de otro modo.

Ejemplo 1 Preparación del I nmunogen Los organismos del, género Leishmania se cultivan en la etapa amastigoto en el medio de cultivo sintético especificado en la Tabla 1 , complementado con 5% de suero bovino fetal típicamente a aproximadamente 30-34°C (O'Daly er al. , 1988, Acta Trópica (Basel), Vol. 45, pp. 109-126).. Para el agente inmunoterapéutico de segunda generación, los amastigotos en la fase estática de crecimiento se recolectaron mediante centrifugación (800 xg durante 20 minutos a 4°C), se enjuagaron en Solución Salina Regulada con Fosfato (PBS) y se incubaron durante 3 días a 30-34°C en Eagle's MEM (Gibco) que contiene 1 50 µg de TLCK para inactivar los parásitos, como se describe (O'Daly et al. , 1986, Acta Trópica (Basel), Vol. 43, pp. 225-236). Después de dos enjuagues con PBS (12.1 00 xg durante 1 0 minutos a 4°C) 1 x 108 parásitos/ml se incubaron en MEM que contiene 0.12% Nonidet P-40 (NP40, Sigma) durante 30 minutos a 4°C para solubilizar los antígenos superficiales que se descartaron (O'Daly et al., 1990 AM J Trop. Med. Hyg., Vol. 43, pp. 44-51 ). Los antígenos particulados se recolectaron por centrifugación (12.1 00 xg durante 10 minutos a 4°C), se enjuagaron dos veces con PBS y se sónico durante 5 minutos a 4°C en un Interruptor Celular Sonificador (Modelo Wl 85, Heath Systems-Ultrasonic, Inc. , Plainview, Nueva York) en el límite de micropunta del control de salida a 50W. El contenido de proteína se determinó mediante el método de Lowry (Lowry O. et al. , 1951, J Biol.. Chem., Vol. 193, pp. 265-275). La preparación de inmunogen de primera generación, monovalente, final contuvo 1 mg/ml de cada antígeno de especie Leishmania en PBS que contiene alúmina (gel de baja viscosidad de hidróxido de aluminio REHYDRAGEL, Reheis Inc. , Nueva Jersey) a una concentración de 0.1 ml/mg (v/p) de proteína parásita. Cada etapa en la preparación del inmunogen se verificó respecto a esterilidad. En otra modalidad de la invención sujeto, los antígenos particulados se recolectaron mediante centrifugación (12.100 xg durante 1 0 minutos a 4°C), se enjuagaron dos veces con PBS, se disolvieron en una solución que contiene 8 Molares de Urea, 0.025 Tris (Tris-hidroxi-metil-amino-metano) y se sonicaron durante 5 minutos a 4°C en un Interrumptor Celular Sonificador (Modelo Wl 85, Heath-Systems-Ultrasonic, Inc., Plainview, Nueva York) en el límite de micrppunta del control de salida a 50W. Las fracciones de proteína se separaron por cromatografía-DEAE. El agente inmunoterapéutico de segunda generación se preparó con cada una de las siete fracciones de proteína aisladas después de la cromatografía-DEAE de la composición sujeto que contiene solo una especie de leishmania, como por ejemplo L. (V)brasiliensis o cualquier otra especie de leishmania presente en el agente inmunoterapéutico de primera generación, crudo. El contenido de proteína se determinó mediante el método de Lowry (Lowry, O. Et al., 1951, J Biol. Chem. , Vol. 193, pp. 265-275) . Cada fracción de proteína se disolvió en PBS y se sónico durante 5 minutos a 4°C en un Interrumptor Celular Sonificador (Modelo Wl 85, Heath-Systems-Ultrasonic, Inc. , Plainview, Nueva York) en el límite de micropunta del control de salida a 50W. Posteriormente, cada fracción se esterilizó por filtro a través de filtros Millipore® de 0.20 µm. La preparación de inmunogen final contuvo 400 µg/ml de cada una de las fracciones antigénicas en PBS que contiene alúmina (Gel de baja viscosidad de hidróxido de aluminio REHYDRAGEL, Reheis Inc. , Nueva Jersey) a una concentración de 0.1 ml/mg (v/p) de la fracción de proteína. Cada etapa en la preparación del inmunogen de segunda generación también se verificó respecto a esterilidad. Las alícuotas de incubaron en ESM que contiene 5% de Suero Bovino Fetal (FBS, Gibco) y en placas de agar que contienen 12.5% (p/v) de Bacto-Peptona (Difco), 12.5% (p/v) de extracto de levadura (Becton Dickinson), 3.75% (p/v) de glucosa y 3.75% (p/v) de agar BBL (Becton Dickinson). Las muestras se incubaron durante 72 horas a 37°C para detectar rápido crecimiento de bacterias y durante 3 semanas a 26°C para lento crecimiento de bacterias y hongos. Cada lote del inmunogen se controló por SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida para asegurar la consistencia en el patrón de bandas de proteína de Leishmania. Cada lote de los agentes inmunoterapéuticos de primera y segunda generación también se examinó con E-TOXATE (Sigma) respecto a la presencia de pirógenos. El inmunogen de primera generación fue estable a 4°C durante al menos 4 semanas.

Ejemplo 2 Componentes de Proteína del I nmunogen A partir de las preparaciones de inmunogen obtenidas de los procedimientos descritos en el Ejemplo 1 arriba, ocho bandas de proteína se identificaron a través de SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida de los amastigotos extraídos con NP-40, tratados con TLCK, provenientes de L. (L)amazonensis, L. (L)venezuelensis, L. (V)brasiliensis, y L. (L)chagasi, con pesos moleculares aparentes de 21 , 33, 44, 50, 55, 58, 65 y 77 kDa. En extractos de amastigoto enteros no tratados, se observaron entre 28 y 30 bandas con pesos moleculares que varían desde 29 hasta 96 kDa en cada especie de Leishmania, y se observaron bandas principales de 29, 34, 43, 58 y 65 kDa. Las preparaciones de inmunogen del agente inmunoterapéutico de segunda generación, el cual contiene fracciones de proteína 3 y 4 obtenidas después de cromatografía DEAE y reducción y alquilación total, tuvieron tres bandas con pesos moleculares de 73, 80 y 82 kDa.

Ejemplo 3 Seguridad e Inmunogenicidad La composición inmunogénica que comprenden las proteínas del agente inmunoterapéutico de segunda generación, descrita en los Ejemplos 1 y 2, arriba, se inyectó en un voluntario humano en intervalos mensuales, comenzando con 50 µg e incrementando la dosis por 50 µg cada mes, con objeto de determinar la dosis capaz de inducir un I DR mayor de 5 mm. Esta dosis se encontró que era de 200 µg. Tanto al mes como a los seis meses después de la última dosis del agente inmunoterapéutico, se llevaron a cabo las siguientes pruebas sanguíneas en este voluntario: conteo sanguíneo completo; conteo diferencial de células sanguíneas bancas; urea; creatinina; fosfatasa alcalina en azúcar; bilirrubina; transaminasas; colesterol; triglicéridos; proteaína reactiva C; pruebas serológicas tales como VDRL, VI H, anticuerpos antinucleares, células LE; y análisis de orina y fecal. Todos los valores se encontraron dentro de límites normales, y no se observaron efectos secundarios.

Ejemplo 4 Preparación de Com posiciones de Agente Inmunoterapéutico Para el agente inmunoterapéutico monovalente, de primera generación, los amastigotos cultivados de cada especie de Leishmania se recolectaron mediante centrifugación (800xg durante 20 minutos a 4°C), se enjuagaron en Solución Salina Regulada con Fosfato (PBS) y se incubaron durante 3 días a 30-34°C en Eagle's MEM (Gibco) que contiene 1 50 µg de TLCK para inactivar los parásitos como se describe, a 1 x 1 08 parásitos/ml. Esta etapa se lleva a cabo preferentemente cuando los amastigotos se encuentran en la fase de crecimiento estático, después de dos enjuagues con PBS (12.100 x g durante 10 minutos a 4°C). En una modalidad particularmente preferida, la preparación de una composición inmunogénica, de primera generación, monovalente, protectora, de acuerdo con la invención sujeto, comprende las siguientes etapas: A) cultivar organismos del género Leishmania en el estado amastigoto en un medio de cultivo sintético que contiene los ingredientes listados en la Tabla 1 complementado con 5% de suero bovino fetal, típicamente a aproximadamente 30-34°C; B) sujetar organismos del género Leishmania en el estado amastigoto y en la fase estática de crecimiento, a un medio que contiene una cantidad de N-p-tosil-L-Lisina clorometil quetona o una sal farmacológicamente aceptable de la misma, eficaz para eliminar dichas células; C) aislar dichas células muertas; D) extraer las proteínas superficiales con el detergente no iónico Nonidet p-40; E) centrifugación de la preparación para aislar antígenos particulados; F) enjuagar dos veces con PBS; y G) formar un inoculo de inmunización que comprende dichos antígenos particulados provenientes de dichas células muertas mediante su re-suspensión en solución salina regulada con fosfato que comprende alúmina. Para la composición de agente inmunoterapéutico de segunda generación, los amastigotos cultivados se recolectaron mediante centrifugación (800 xg durante 20 minutos a 4°C), se enjuagaron con Solución Salina Regulada con Fosfato (PBS) y se incubaron durante 3 días a 30-34°C en Eagle's M EM (Gibco) que contiene 150 µg de TLCK para inactivar los parásitos como se describe, a 1 x 108 parásitos/ml. Esta etapa se lleva a cabo preferentemente cuando los amastigotos se encuentran en la fase de crecimiento estático, después de dos enjuagues con PBS (12.100 x g durante 10 minutos a 4°C).

En una modalidad particularmente preferida, la preparación de una composición inmunogénica, de segunda generación, protectora, de acuerdo con la invención sujeto, comprende las siguientes etapas: A) cultivar organismos del género Leishmania en el estado amastigoto en un medio de cultivo sintético que contiene los ingredientes listados en la Tabla 1 complementado con 5% de suero bovino fetal, típicamente a aproximadamente 30-34°C; B) sujetar organismos del género Leishmania en el estado amastigoto y en la fase estática de crecimiento, a un medio que contiene una cantidad de N-p-tosil-L-Lisina clorometil quetona o una sal farmacológicamente aceptable de la misma, eficaz para eliminar dichas células; C) aislar dichas células muertas; D) extraer las proteínas superficiales con el detergente no iónico Nonidet p-40; E) centrifugación de la preparación para aislar antígenos particulados; F) enjuagar dos veces con PBS; G) disolver en una solución que contiene 8 Molar Urea, 0.025 Molar Tris (Tris-hidroxi-metil-amino-metano) y sonificación durante 5 minutos a 4°C en un Interruptor Celular Sonificador (Modelo Wl 85, Heath-Systems-Ultrasonic, Inc. , Plainview, Nueva York) en el límite de micropunta del control de salida a 50W, H) separar fracciones de proteína en una columna DEAE-Sephadex con una levigación por etapas en NaCI a partir de una concentración Molar de NaCI de 0.05-0.3 en una solución que contiene 8 Molar Urea, 0.025 Molar Tris pH 8.3; y I) formar un inoculo de inmunización que comprende dichos antígenos particulados provenientes de dichas células muertas mediante su re-suspensión en solución salina regulada con fosfato que comprende alúmina. En una modalidad particularmente preferida, la preparación de una composición ¡nmunógénica para remisión clínica de psoriasis, de acuerdo con la invención sujeto de segunda generación, comprende las siguientes etapas: A) cultivar organismos del género Leishmania en el estado amastigoto en un medio de cultivo sintético que contiene los ingredientes listados en la Tabla 1 complementado con 5% de suero bovino fetal, típicamente a aproximadamente 30-34°C; B) sujetar organismos del género Leishmania en el estado amastigoto y en la fase estática de crecimiento, a un medio que contiene una cantidad de N-p-tosil-L-Lisina clorometil quetona o una sal farmacológicamente aceptable de la misma, eficaz para eliminar dichas células; . C) aislar dichas células muertas; D) extraer las proteínas superficiales con el detergente no iónico Nonidet p-40; E) Cromatografía DEAE Sephadex de antígenos particulados provenientes de solo una especie de Leishmania, como por ejemplo, L. (V)brasiliensis o cualquier otra especie de Leishmania presente en el agente inmunoterapéutico de primer generación; F) aislar siete fracciones de proteína en 8 Molar urea, 0.025 Molar Tris pH 8.3, separadas mediante el uso de levigación por etapas con 0.05-0.3 Molar NaCI; G) diálisis contra agua destilada y liofilización de fracciones de proteína; H) disolver las fracciones de proteína en solución salina regulada con fosfato; I) determinar el contenido de proteína de las fracciones mediante el método de Lowry (Lowry, O. , et al., 1951, J Biol.. Chem. , Vol. 193, pp. 265-275); J) sonicar cada fracción de proteína en solución salina regulada con fosfato durante 5 minutos a 4°C en un Interruptor Celular Sonificador (Modelo Wl 85, Heath-Systems-Ultrasonic, I nc. , Plainview, Nueva York) en el límite de micropunta del control de salida a 50W; K) pasar cada fracción a través de filtros de 0.20 µm Millipore®; y (L) formar un inoculo de inmunización de segunda generación que comprende una o más de dichas fracciones de proteína mediante resuspensión de la una o más fracciones en solución salina regulada con fosfato que contiene alúmina.

Ejemplo 5 Tratamiento de Psoriasis con un Agente Inmunoterapéutico Polivalente de Primera Generación que Contiene L.(L) amazonensis, L. (L)venezuelensis, L. (L)brasiliensis y L. (L)chagasi Tabla 2: Grupos de edad en la población de estudio Grupos de Edad Pacientes % [0-5] 0.29 [6-12] 65 2.35 [13-18] 90 3.25 [19-25] 268 9.68 [26-40] 997 35.99 [41-65] 1196 43.18 >65 146 5.27 Total 2770 100 La mayoría de los pacientes (79.17%) se encontró entre 26-65 años de edad con una edad promedio de 42.56 + 26.11 años y un rango entre 1 y 88 años de edad.

Tabla 3: Características de la población de estudio PACIENTES EDAD TIEMPO PACIENTES (AÑOS) CON QUE TIENEN PSORIASIS PARIENTES CON PSORIASIS Machos 1545 (55.8%) 42.1+14.3 11.2+9.6 500 (32.3%) ?embras 1225 (44.2%) 38.6+15.3 12.0+10.0 472 (38.5%) Edad 25 431 (15.6%) 18.7+5.5 6.1+4.8 172 (39.9%) Edad 26 2339 (84.4%) 44.6+12.4 12.6+10.2 800 (34.2%) Total 2770 40.6+14.9 11.6+9.8 972 (35.0%) 35% tuvieron padres con psoriasis y el tiempo de evolución de la enfermedad fue de 11.6+9.8 años, similar en hombres y mujeres, con un rango de entre 2 y 46 años.

Tabla 4: Tipos clínicos de Psoriasis en la población de estudio. PLACA GUTATA PLACA PALMA ERITRO- INVERSA PLACA UNAS + PLANTAR DERMIA + GUTATA ARTRITIS Macho 1229 67 78 37 63 14 53 29 (56.1%) (48.9%) (56.9%) (39.4%) (72.0%) (58.3%) (55.2%) (72.5%) Hembra 963 70 59 57 14 10 43 11 (43.9%) (51.1%) (43.1%) (60.6%) (28.0%) (41.7%) (44.8%) (27.5%) Edad 320 33 24 19 10 3 8 5 <25 (14.6%) (24.1%) (17.5%) (20.2%) (20%) (12.5%) (8.3%) (12.5%) Edad>26 1872 104 113 75 40 21 88 35 (85.4%) (75.9%) (82.5%) (79.8%) (80%) (87.5%) (91.7%) (87.5%) Total 2192 137 137 94 50(1.8%) 24 96 40 (97.1%) (10.1%) (10.1%) (0.3%) (0.8%) (3.4%) (0.3%) 92.6% tuvieron la forma clínica de psoriasis de placa distribuida en su forma pura (79.1%) o asociado con guttata (10.1%) o artritis (3.4%); 10.1% tuvo la forma pura de Gutata; 0.3% tuvo la forma palmar y plantar, 1.8% tuvo Eritrodermia y 3.4% tuvo artritis psoriática. Tabla 5: Población de estudio y respuesta a vacunación en pacientes psoriáticos distribuidos por género y edad. PASG REDUCCIÓN DE PASI1 DESPUÉS DE ABANDONO ANTES VACUNACIÓN2 AGENTE INMUNO- TERAPEUTICO 100% 99-70% 69.40% 39-10% <10% ABANDONO Machos 1545 18.5+16.9 323 600 185 105 55 272 (49.8%) (57.0%) (56.7%) (61.8%) (59.8%) (56.5%) Hembras 1225 13.7+14.9 325 453 141 65 37 209 (50.2%) (43.0%) (43.3%) (38.2%) (40.2%) (43.5%) Edad < 431 13.0+14.7 131 150 50 24 12 69 25 (20.2%) (14.2%) (15.3%) (14.1%) (13.0%) (14.3%) Edad > 2339 17.0+16.4 517 903 276 146 80 412 26 (79.8%) (85.8%) (84.7%) (85.9%) (87.0%) (85.7%) Total 2770 16.4+16.2 648 1053 326 170 92 481 (28.0%) (46%) (14.0%) (7%) (4%) (17.4%) 1PASI = Área de psoriasis e índice de severidad 2Ocho años de seguimiento Noventa y seis % de los pacientes respondió al tratamiento con una disminución en valores PASI mayor de 10% y solo 4% respondió con una disminución en valores PASI menor de 1 0% a partir del valor PASI inicial antes del tratamiento. Veintiocho % tuvo 100% de remisión de lesiones, su enfermedad desapareció por completo, similar en hombres y mujeres. Eh general, 74% tuvo entre 70-100% de remisión de lesiones y 21 % de 10-69% de remisión en comparación con valores PASI iniciales. 17.4% de voluntarios abandonaron el tratamiento después de 1 -2 dosis de agente inmunoterapéutico (ver abajo).

Tabla 6: Comparación de dosis de agente inmunoterapéutico en cada grupo de remisión clínica DOSIS DE AGENTE INMUNOTERAPÉUTICO PARA REDUCCIÓN DE PASI DESPUÉS DE VACUNACIÓN1 100% 99-70% 69-40% 39-10% <10% ABANDONO Machos 1545 7.7+6.5 11.3+10.8 9.2+10.2 5.9+4.5 6.1+4.8 1.6±1.1 Hembras 1225 7.5+5.6 10.6+1 0.0 8.8±8.7 6.0+4.6 5.9+5.0 1 .5+1.1 Edad<25 431 6.5+4.2 10.6+10.0 8.2+8.4 6.1+6.1 6.5+4.6 1 .4+0.6 Edad>26 2339 7.8+6.4 1 1.1 + 10.0 9.2±9.8 5.9±4.2 5.9+5.0 1 .7±1.4 Total 2770 7.6+6.0 1 1.0+10.0 9.0+9.6 6.0+4.5 6.0+4.9 1.7+.1.4 1 La condición de los sujetos se siguió durante ocho años 7.6+6.0 dosis de agente inmunoterapéutico se necesitaron para 100% de remisión de psoriasis. La cantidad de dosis en los grupos con 70-90% y 40-69% de remisión fueron algo mayores, alcanzando valores de 1 1 .0+1 0.0 y 9.0+9.6, respectivamente, lo cual sugiere que la remisión clínica depende principalmente de la respuesta inmunológica del voluntario. El paciente capaz de responder a los antígenos de agente inmunoterapéutico se compromete a hacerlo desde el inicio del tratamiento. El paciente sin respuesta permanece así, a pesar de un mayor número de dosis de agente inmunoterapéutico.

Tabla 7: Aparición de recaídas después de la remisión clínica de Psoriasis APARICIÓN DE RECAÍDAS DESPUÉS DE REMISIÓN EN GRUPO DE REMISIÓN AL 100% Recaídas PASI Dosis Tiempo1 PASI en Tiempo' PASI en Dosis Tiempo %Nuevas Inicial para para recaída de nueva para para remisiones remisión remisión remisión remisión nueva nueva después al 100% al 100% a recaída remisión remisión de recaída 188/6 8 21.0±17.8 7.6+6.0 7.0±5.4 7.7+10.1 15.4±20.6 2.8+3.3 7.1 + 6.8 5.8±4.9 161/188 (28.9%) (85.6%) 1 meses De los 648 pacientes con remisión total de lesiones, 188 (28.9%) voluntarios tuvo recaídas de la enfermedad después de 15.4+20.6 meses. Los valores PASI al momento de la recaída fueron 1/3 del valor 10 PASI inicial antes del tratamiento. El PASI en la nueva remisión clínica fue considerablemente menor que el PASl al momento de la recaída. La nueva remisión ocurrió con 7.1+6.8 dosis de agente inmunoterapéutico después de 5.8+4.9 semanas, un periodo de tiempo menor que el periodo de tiempo observado en el primer ciclo de tratamiento para 15 remisión clínica de lesiones. En este grupo de recaída 85.6% de los pacientes tuvo nuevamente una remisión de las lesiones después de 6-7 dosis de agente inmunoterapéutico.

Tabla 8: Efecto secundarios después de la vacunación n SEÑALES EN EL SITIO DE INOCULACIÓN SÍNTOMAS NINGUNO ^? SISTÉMICQS Dolor Calor Rojez Nodulo 989 (43.2%) 484 (21.1%) 327 (14.3%) 535 (23.4%) 588 (25.7%) 1233 (53.9%) os uuscí vaiun cic iua sc?unuaiiu. mciiuic s?? ci omu us inoculación en menos de la mitad de los pacientes con psoriasis, sin diferencia debido a género o edad. Todos estos desaparecieron en unos 25 cuantos días. Los resultados del análisis de laboratorio de las muestras de 55 pacientes de psoriasis que recibieron dosis de 21 .4+13.1 de agente inmunoterapéutico de primera generación se muestran en la Tabla 9. Todos los valores se encontraron dentro de rangos normales.

Tabla 9: Análisis de laboratorio en 55 pacientes de psoriasis con dosis de 21.4+13.1 de agente inmunoterapéutico de primer generación Ejemplo 6 Ensayo de Agente Inmunoterapéutico Monovalente de Primer Generación Tabla 10: Seguimiento de un solo ensayo ciego después de la inyección de pacientes de psoriasis con una de cuatro especies de Leishmania presenten en ei agente inmunoterapéutico de primer generación PASI ANTES DOSIS AG ENTE PASI %REDU CCI ÓI DE I N M U NOTERAPÉUTICO DES PU ÉS DE PASI TRATAMIENTO TRATAMIE NTO ESPECI E LEIS H MAN IA -.(L)amazonensis 6.4 3 1 .4 78.1 -.(L)amazonensis 3.8 6 1 .7 55.3 ..(L)amazonensis 3.6 3 1 .4 61 .1 ..(L)amazonensis 9.4 5 1 .3 86.2 .. (L)amazonensis 2.3 3 0 100.0 L.(V)brasi l iensis 36 2 15.4 57.2 L.(V)brasil iensis 1 1 .9 2 1.8 84.9 L.(V)brasiliensis 13.9 5 6.4 54.0 L.(V)brasil iensis 5.8 4 1 .9 67.2 L.(L)chagas¡ 2.8 5 0 100.0 L.(L)chagasi 52.2 3 0 100.0 L.(L)chagasi 1 0 3 4.5 55.0 .(L)venezuelensis 15.6 3 E 3 66.0 Los agentes inmunoterapéuticos también se prepararon mediante el uso de especies individuales de Leishmania a partir del agente Inmunoterapéutico de primera generación y se examinaron posteriormente respecto a su habilidad para inducir remisión Clínica de lesiones de psoriasis. Los resultados en la Tabla 15 demuestran claramente que no es necesario preparar una mezcla de cuatro especies de Leishmania en el agente Inmunoterapéutico de primera generación a fin de obtener remisión clínica de lesiones en pacientes de psoriasis. Una especie de Leishmania es tan eficaz como la mezcla de cuatro especies utilizadas en el agente inmunoterapéutico polivalente para inducir valores PASI inferiores de hasta 1 00% después del tratamiento. De este modo, en cada extracto de leishmania, existe un factor que inhibe la inflamación asociada con psoriasis.

Ejemplo 7 Formulación y Administración Los compuestos de la invención son útiles para diversos propósitos, tanto terapéuticos como no terapéuticos. La aplicación terapéutica de los nuevos compuestos y composiciones que los contienen puede contemplarse para llevarse a cabo mediante cualquier método terapéutico adecuado y técnica actualmente o prospectivamente conocida por aquellos expertos en la materia. Además, los compuestos de la invención tienen utilidad como materiales de inicio o compuestos intermedios para la preparación de otros compuestos y composiciones útiles. La dosis administrada a un huésped en las indicaciones anteriores dependerá de la identidad de la infección, el tipo de huésped involucrado, incluyendo la edad del huésped, el peso y la salud, la existencia y naturaleza de tratamientos concurrentes, si es que existen, la frecuencia de tratamiento, y la proporción terapéutica. Los compuestos de la invención sujeto pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos para la preparación de composiciones farmacéuticas. Las formulaciones se describen en detalle en un número de fuentes que son muy conocidas y fácilmente disponibles para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science de E.W. Martín describe formulaciones que pueden utilizarse en conexión con la invención sujeto. En general, las composiciones de la invención sujeto se formularán de tal manera que una cantidad eficaz del (de los) compuesto(s) bioactivo(s) se combine con un vehículo adecuado con objeto de facilitar la administración eficaz de la composición.

Ejemplo 8 Separación Cromatográfica de Fracciones de Proteína de Especies de Leishmania y Ensayo Blastogénico con Células Mononucleares de Sangre Periférica Humana Se separaron siete fracciones del extracto de Leishmania chagasi particulado (PP75), el primer componente del agente inmunoterapéutico de primera generación, después del tratamiento de los parásitos de amastigoto respectivos con TLCK y extracción con NP-40, como se mencionó previamente. Las fracciones se examinaron en un ensayo blastogénico con células mononucleares de sangre periférica provenientes de pacientes psoriáticos antes y después de la vacunación, de acuerdo con métodos utilizados por rutina en la materia. Para este ejemplo, se pre-incubaron alícuotas de 100 µl (triplicados) de cada una de las fracciones disueltas en RPMI-1640, en placas de microtítulo de fondo plano (Falcon Plastics) con 2 x 105 células mononucleares de sangre periférica, separadas en HISTOPAQUE (Sigma) y re-suspendidas en 100 µl de RPMI-1640 que contiene 20% de suero bovino fetal inactivado por calor, bajo métodos de rutina en la materia. La concanavalina A se utilizó como control positivo de estim ulación de linfocitos. 48 horas después, se agregaron 0.2 µCi/cavidad de 3H-Timidina en alícuotas de 10 µl y las muestras se incubaron durante 1 8 horas adicionales. Las células se cosecharon en papel de filtro (Revé Ángel) mediante el uso de un cosechador celular automático (MASHI I). Los discos de papel seco se colocaron en mini-frascos con 2.5 ml de Áquasol (NEN) y se cuantificó durante 1 min. en un contador de centelleo Packard Tri-Carb Modelo 3385. El índice de estimulación (S. l .) se calculó para cada muestra mediante división de los conteos experimentales por minuto (c.p.m.) mediante control de c. p. m. (cultivos con fracciones o mitógenos/cultivos de control en medio de cultivo solo). Los resultados se ¡lustran en las Tablas 1 1 -14 a continuación.

Tabla 1 1 : Blastogénesis de células mononucleares de sangre periférica con fracciones de L.(L)chagasi (PP75) antes y después de la vacunación ANTES VACUNACIÓN CURADO DESPUÉS VACUNACIÓN n = 3 n = 5 DEAE ug proteína/ cpm/cavidad S.l. cpm/cavldad S.l.

Sephadex cavidad X+SD X+SD X+SD X+SD Fracción 1 20 823+215 1.90±0.22 2044+1825 3.22+286 No NaCI 10 1297+835 2.81+1.5 1442+1425 2.59+276 5 1587+1429 3.40±2.79 1424+1150 2.44±21 2.5 627+282 1.40+0.41 1366±951 2.27±1.66 Fracción 2 20 908+103 2.22±0.79 2643±1 98 4.36+2.96 0.05M NaCI 10 821+660 1.87+1.1 1880+1571 3.13+2.83 5 761+324 1.73±0.49 1627+1137 2.75+2.05 2.5 532+347 1.19+0.63 1129±900 1.94+1.7 Fracción 3 20 933+728 2.03+1.37 1735+1764 3.03±3.4 0.1M NaCI 10 941+552 2.08±1.77 1368+1528 2.51±2.94 5 706+376 1.57+0.61 1360+1681 2.45±3.23 2.5 717±632 1.57+1.21 1174±1382 2.09±2.66 Fracción 4 20 674+405 1.54±0.74 2514+1552 4.25±2.73 0.15 M NaCI 10 600+305 1.38±0.55 1541+1548 2.74+3.0 5 767+275 1.87+0.84 1330+1520 2.36±2.93 2.5 940+346 2.35+1.29 1216+1225 2.16±2.37 Fracción 5 20 549+197 1.24+0.21 1411+1629 2.52±3.14 0.2 NaCI 10 472+181 1.48+0.58 1398±1562 2.49+3.01 5 470+205 1.06+0.31 1095±1023 1.94+1.98 2.5 353+112 0.87+0.03 1059±907 1.86±1.76 Fracción 6 20 726+126 1.70+0.12 1448±1127 2.52+2.17 0.25M NaCI 10 558+225 1.26+0.31 1354±818 2.46±1.77 5 778±456 1.71+0.78 1280±752 2.28±1.52 2.5 688±574 1.52±1.09 927+710 1.61+1.36 Fracción 7 20 694+325 1.54+0.48 1180±747 1.91+1.09 0.3WI NaCI 10 676+154 1.56+0.10 1608±1107 2.96±2.27 5 604+217 1.39+0.31 1325±601 2.40+1.32 2.5 580+315 1.28±0.52 1466±810 2.75±1.89 Concanavalina 10 8452+7470 23.12+24.89 7988±2805 13.58+4.31 A 5 22479+10642 55.05+29.29 28011±8183 52.67±22.89 Amastigoto 4x106 795+209 1.85+0.32 2099±1454 3.4Q±2.02 Parásitos 2x1 O6 741+307 1.68+0.45 1725±1028 2.75±0.99 Medio de 323+79 1.0+0.2 987+226 1.0+0.3 Cultivo El grupo de pacientes antes de la vacunación tuvo S. l . >1 .0. Estos valores se incrementaron notablemente después de la vacunación.

Los resultados del análisis estático de ambos grupos son como sigue: Antes de la vacunación Después de la vacunación Parámetro Medio 1 .697143 2.571072 # puntos 28 28 Desviación std. .5298834 .6259645 Error std. .1001 386 .1 182962 Mínimo .87 1 .61 Máximo 3.4 4.36 Prueba t emparejada: Diferencia media = -.8739286 (Media de diferencias emparejadas) 95% intervalo de confidencia de la diferencia: -1 .150029 a -0.5978283 Valor p de dos colas es <0.0001 — extremadamente significativo - Estos resultados demuestran que, después de la vacunación de pacientes psoriáticos con cualquiera de las fracciones del extracto L. (L)chagasi, los linfocitos se estimulan significativamente. Se observó un mayor índice de estimulación con las fracciones 3 y 4 así como también amastigotos vivos. Se separaron siete fracciones del extracto particulado de L(V)brasiliensis (PMH27), un segundo componente del agente inmunoterapéutico de primera generación, después del tratamiento de los respectivos parásitos amastigotos con TLCK y extracción con NP-40, como se mencionó previamente.

Tabla 12: Blastogénesis de células mononucleares de sangre periférica con fracciones de L.(V)brasiliensis (PW1H27) antes y después de la vacu nación ANTES VACUNACIÓN ANTES VACUNACIÓN DESPUÉS VACUNACIÓN N=3, S. l.<1.0 N=2, S. CURADO , N=3 DEAE ug cpm/ S.l. cpm/ S.l. cpm/ cavidad S.l.

Sephadex proteína/ cavidad X±SD cavidad X±SD X±SD X±SD cavidad X±SD X±SD Fracción 1 20.00 379±23 0.85+0.35 812+416 1.74±0.47 107 +509 1.98+0.86 No NaCI 10.00 391+65 0.84+0.17 1423+1173 2.99±1.78 1945+2481 3.51+ .41 5.00 491+115 1.10±0. 6 1391+1120 3.04±1.8 683±224 1.26±0.36 2.50 376+105 0.80+0.18 879±137 2.06±0.59 650±240 1.19+0.39 Fracción 2 20.00 902+775 1.76+1.28 2686±2098 5.88+3.4 2157+267 4.01±0.48 0.05M NaCI 10.00 709+555 1.39±0.89 1971±399 5.05+3.13 1428±351 2.65±0.61 5.00 1385+639 3.12±1.65 1690±203 4.30±2.51 1911+533 3.56+1.01 2.50 1117+1004 2.19±1.67 2887±716 6.59±1.28 1661±1225 3.01±2.15 Fracción 3 20.00 263+21 0.58+0.19 1028+163 2.59±1.46 2237±1002 413±1.75 0.1M NaCI 10.00 231+65 0.48+0.07 928+314 2.06±0.25 1633+59 3.01±1.0 5.00 207+44 0. 4+0.05 787±365 1.74±0.47 1479+983 2.74±1.7G 2.50 200+41 0.42+0.04 618+252 1.40+0.-41 • 1140±767 2.09±1.36 Fracción 4 20.00 251+51 0.58+0.30 1046±335 2.41±0.7 946±513 2.75±0.92 0.15 M NaCI 10.00 260±87 0.54+0.09 1272±767 2.74±1.04 1118±349 2.06±0.56 5.00 279±67 0.59±0.08 1442+821 3.27+1.42 915+362 1.68±0.6 2.50 233+37 0.50±0.13 1335+783 2.83+0.96 930±414 1.71±0.71 Fracción 5 20.00 232+59 0.49±0.05 669+157 1.54±0.39 1306±365 2.42+0.62 0.2M NaCI 10.00 275+37 0.62+0.25 577+170 1.29+0.12 911+196 1.69±0.33 5.00 252±64 0.54±0.11 660±228 1.45±0.1 753+240 1.38±0.38 2.50 285±135 0.58+0.16 704+9 1.69+0.65 822+323 1.51±0.53 Fracción 6 20.00 233+84 0.48+0.10 873+566 1.81+0.76 909+123 1.68+0.17 0.25IW NaCI 10.00 372±215 0.74±0.3 895±705 1.89±1.08 1043±406 1.97±0.88 5.00 36+258 0.87+0.37 1053+427 2.54±1.24 971±201 1.82+0.48 2.50 310+76 0.66+0.14 1308±489 3.24±1.82 773±206 1.43±0.32 Fracción 7 20.00 1004±881 2.03±1. 2 1406±277 3.26±0.8 1413±638 2.60±1.08 0.3M NaCI 10.00 211 +1366 . 4+1.92 25 5+1170 5.52+1.16 1955±472 3.62+0.75 5.00 2295+2915 4.19+1.03 2549±1291 5.71±2.02 931+179 1.74±0.41 2.50 3 9+206 0.70±0.28 1479±1503 2.99±2.42 558+186 1.02±0.3 Concanavalina 10.00 17443±9651 41.98±32.89 7180±2557 19.31±1519 20051±12578 37.29±22.55 A 5.00 30323+22 2 67.32±21.79 14665±12253 31.21+19.01 33798+4946 62.89+8. 6 Amastigoto 4 X 106 1035±526 2.19±0.87 2327+974 5.17±1.23 5128±826 9.52±1.21 Parásitos 2 x 106 395±1 7 1±0.05 2427±1968 .37+3.52 520±33 0.90±0.5 Medio de 390+11 1.0+0 557+49 1.0±0.3 580±0 1.0±0 Cultivo En la Tabla 12, dos grupos de pacientes fueron evidentes antes de la vacunación, específicamente, un grupo con S. l . < 1 .0 y otro grupo con S. l. > 1 .0. El grupo de pacientes curados después de la vacunación tuvo, valores notablemente incrementados cuando se compararon con cualquiera de estos grupos antes de la vacunación. Los resultados del análisis estadístico son los siguientes: Grupo con S.l. < 1.0 Antes de la vacunación Después de la vacunación Parámetro Medio 1.150714 2.257857 # puntos 28 28 Desviación std. 1.062052 .8876538 Error std. .200709 .1677508 Mínimo .42 1.02 Máximo 4.19 4.13 Prueba t emparejada: Diferencia media = -1.107143 (Media de diferencias emparejadas) 95% intervalo de confidencia de la diferencia: -1.534381 a -.6799043 Valor p de dos colas es <0.0001 — extremadamente significativo - Grupo con S.l. > 1.0 Antes de la vacunación Después de la vacunación Parámetro Medio 2.986429 2.257857 # puntos ' 28 28 Desviación std. 1.504479 .8876538 Error std. .2843199 .1677508 Mínimo 1.29 1.02 Máximo 6.59 4.13 Prueba t emparejada: Diferencia media = -.7285719 (Media de B menos media de A) 95% intervalo de confidencia de la diferencia: -1 .3904 a -6.674413E-02 Valor p de dos colas es <0.0316 — significativo - Estos resultados demuestran que los linfocitos provenientes de ambos grupos de pre-vacunación se estimulan significativamente por vacunación con cualquiera de las fracciones del extracto de L. (V)brasiliensis. Se observó un mayor índice de estimulación con fracciones 3 y 4 así como también amastigotos vivos. Se separaron seis fracciones del extracto particulado de L. (L)venezuelensis (PMH 16), el tercer componente del agente inmunoterapéutico de primera generación, después del tratamiento de los parásitos de amastigoto respectivos con TLCK y extracción con NP-40 como se mencionó previamente.

Tabla 13: Blastogénesis de células mononucleares de sangre periférica con fracciones de L.(L)venezuelensis (PMH16) antes y después de la vacunación ANTES VACUNACIÓN ANTES VACUNACIÓN CURADO DESPUÉS VACUNACIÓN n=5, S.I.<1.0 p=2, S.l.>1.0 n = 2 DEAE ug protefna/ cpm/ cpm/ cpm/ cavidad Sephadex cavidad cavidad S.l. cavidad S.l. X±SD S.l. X±SD X±SD X+SD X±SD X±SD Fracción 1 20.00 1617+1622 1.95+1.51 480±92 0.89±0.3 826+104 1.78±0.42 No NaCI 10.00 1455+1241 1.82±1.03 737+57 1.36+0.72 518±74 - 1.11 + 0.62 5.00 1222±905 1.57+0.66 488±75 0.90+0.43 551±42 1.1 + 0.63 2.50 1376±1147 1.73±0.93 468+63 0.87+0.27 377+27 0.812±0.3 Fracción 2 20.00 1579±1259 1.77+1.39 1997+1965 1.86+1.05 2201±419 3.52±0.82 0.05M NaCl 10.00 1371+476 1.65+0.93 2163±489 2.65+102 1840±1895 2.41±1.89 5.00 1003+455 1.11 + 0.48 1521±1235 1.52±0.46 1238+1093 1.68+0.97 2.50 785+164 0.87 + 0.19 1398±1309 1.33±0.65 1259±1256 1.66+1.23 Fracción 3 20.00 896+358 0.98 + 0.36 1859±2160 1.61 + 1.41 3681±170 6.08±2.25 0.1M NaCI 10.00 948+594 1.02+0.53 4858±6397 3.92+4.67 4178+1306 7.41±5.06 5.00 689+268 0.77±0.35 1299+1182 1.25 + 0.56 3802±1792 6.96±5.61 2.50 707+302 0.77±0.29 1760±1967 1.55±1.23 2775±276 .53±1.45 Fracción 4 20.00 848±401 0.89 + 0.25 1859±1316 1.93±0.3 2797±1204 4.24+0.08 0.15 M NaCI 10.00 886+810 0.91±0.58 1930±95 2.49±1.35 3734±2376 5.40±1.39 5.00 1105+1103 1.07±0.76 2024±402 2.81+2.08 1539±182 2.63±1.37 2.50 826±479 0.90±0.49 1065+794 1.09±0.23 1151+442 1.76±0.06 Fracción 5 20.00 1087+618 0.91 + 0.53 2416±651 2.92+1.0 2612±1583 4.90+4. 4 0.2M NaCi 10.00 848+601 1.14±1.26 1912+427 2.34+0.91 1648±165 2.80 + 1.41 5.00 587±230 0.65±0.22 2092±108 2.78±1.75 2324±2119 4.60+5.13 2.50 553+186 0.62+0.21 1434±842 1.56+0.1 1235±150 2.11 + 1.1 Fracción 6 20.00 767+15 1.14±0.42 129±15 2.40±0.57 1583±640 3.41±1.5 0.25M NaCI 10.00 515+91 0.74 + 0.16 852+22 1.58+0.63 1659±315 3.57+0.95 5.00 374+31 0.55 + 0.17 577± 6 1.07±0.38 592±92 1.27±0.47 2.50 422±17 0.62±0.21 446±2 0.82+0.59 491+27 1.05+0.35 Concanavalina 20.00 29329±13560 134+237 22781+8014 23.01+6.19 10028+4113 21.61+11.25 A 10.00 34463+10198 40+17 48480+8611 66.96±48 24309+12540 52.39+36 5.00 33799+7901 52+31 49409+7469 63.8+39 43290±6532 93.29±22.5 2.50 35113±1040 52.28±18 42183+10112 58.2±19 35165+4526 75.78±36.5 Amastigoto 4 x 106 1315±404 1.55+0.78 2933±429 3.22+0.11 2500±715 S.38±1.2 Parásitos 2 x 106 1665±452 ' 2.36+0.27 3032+1256 6.5±3.4 Medio de 914+237 1.0+0.3 539±74 1.0+0.2 464459 1.0±0 Cultivo En la Tabla 13, dos grupos de pacientes son evidentes antes de la vacunación, específicamente, un grupo con S.l.<1.0 y otro grupo con S.L>1.0. El grupo de pacientes curado después de la vacunación tuvo valores notablemente incrementados cuando se compararon con cualquiera de estos grupos de pre-vacunación. Los resultados del análisis estadístico fueron los siguientes: Grupo con S.l. < 1.0 Antes de la vacunación Después de la vacunación Parámetro Medio 1.089583 3.205 # puntos 24 24 Desviación std. .4250269 1.938181 Error std. 8.675825 E-02 .39.56296 Mínimo .55 .81 Máximo 1.95 7.41 Prueba t emparejada: Diferencia media = -2.115417 (Media de diferencias emparejadas) 95% intervalo de confidencia de la diferencia: -3.008944 a -1.22189 Valor p de dos colas es <0.0001 — extremadamente significativo - Grupo con S.l. > 1.0 Antes de la vacunación Después de la vacunación Parámetro Medio 1.814167 3.205 # puntos 24 24 Desviación std. .8092286 1.938181 Error std. .165183 .3956296 Mínimo .83 .81 Máximo 3.92 7.41 Prueba t emparejada: Diferencia media = -.7285719 (Media de B menos media de A) 95% intervalo de confidencia de la diferencia: -1 .3904 a -6.674413E-02 Valor p de dos colas es <0.0316 — significativo - Estos resultados demuestran que los linfocitos de ambos grupos de pre-vacunación de pacientes se estimulan significativamente por vacunación con cualquiera de las fracciones del extracto de L. (L)venezuelensis. El mayor índice de estimulación se observó con fracciones 3 y 4 así como también con amastigotos vivos. Se separaron siete fracciones del extracto L. (L)amazonensis (PMH8), el cuarto componente del agente inmunoterapéutico de primera generación .después del tratamiento de los parásitos amastigotos respectivos con TLCK y extracción con NP-40, como se mencionó previamente.

Tabla 14: Blastogénesis de cél ulas mononucleares de sangre periférica con fracciones de L.(L)amazonensis (PM H8) antes y después de la vacunación. ANTES VACUNACIÓN ANTES VACUNACIÓN CURADO DESPUÉS VACUNACIÓN n=4, S.l .<1.0 n=4, S. l.>1.0 n =4 DEAE ug proteína/ cpm/ cpm/ cpm/ cavidad Sephadex cavidad cavidad S.l. cavidad S.l. X+SD S.l. X±SD X+SD X+SD X+SD X±SD Fracción 1 20.00 450+22 0.84±0.1 265+22 1 +0 1525+1374 1.48+0.97 No NaCI 10.00 371 +19 0.70+0.35 285+45 1.07+0.3 1392+1222 1.95+1.27 5.00 392445 0.74+0.14 448+17 1.69+0.45 1211+584 1.79+0.46 2.50 480+62 0.9+0.32 31 1+42 1.17+0.25 1152±733 1 .67+0.71 Fracción 2 20.00 735+405 0.64+0.16 3576±4474 3.37±2.57 1614±1540 2.22+1.66 0.05M NaCl 10.00 574+356 0.59+0.26 1 107+1066 1.38 + 0.07 1939+1297 2.24±1.35 5.00 580+238 0.60+0.13 1181 +1311 1.29±0.47 1569±970 2.28+1.10 2.50 522+68 0.61+0.25 1 173±1217 1.37+0.27 1180±1215 1.61 ±1.3 Fracción 3 20.00 885+928 0.84+0.61 1488+1524 1.76+0.3 1716+1355 2.4941.49 0.1 M NaCI 10.00 585+164 0.59±0.16 1582+285 3.29+2.71 2453±2095 3.5642.31 5.00 676+284 0.75+0.08 1073+850 1.53+0.35 807+423 1.2140.42 2.50 593+398 0.81+0.51 1267+1003 1.81 +0.41 807±452 1.2040.45 Fracción 4 20.00 733+64 1.3840.6 349±15 1.31+0.4 1759+374 2.80+0.74 0.15 M NaCI 10.00 428+26 0.8440.2 1293+254 4.87+0.52 1424+152 1.57+0.72 5.00 297+37 0.56+0.15 627+90 2.36+0.45 927+97 1.4940.4 2.50 374±29 0.70±0.14 397+26 1.49+0.65 939+559 1.41+0.78 Fracción 5 20.00 236+16 0.44+0.2 287+46 1.08+0.4 442±226 0.74±0.5 0.2M NaCI 10.00 373±45 0.72+0.15 231+26 0.87+0.22 421+127 0.67+0.24 5.00 250+39 0.47+0.18 236+39 0.89+0.16 280+55 0.44+0.09 2.50 276+52 0.52 + 0.27 302+1 1 1.13+0.45 334+43 0.54+0.17 Fracción 6 20.00 251 ±45 0.47+0.14 265±93 1 +0 779+354 1.0540.1 1 0.25M NaCI 10.00 284417 0.53+0.21 250+42 0.94+0.4 679+235 1.0340.24 5.00 262+26 0.49+0.11 323+ 96 1.22+0.38 532+222 1.01+0.26 2.50 264+32 0.49+0.12 298±29 1.12+0.6 450+236 0.7340.48 Fracción 7 20.00 1038±453 2.03±0.5 522+125 1.97+0.5 1074±658 1.6240.92 0.3M NaCI 10.00 507+144 0.96+0.32 697474 2.63+0.58 668+275 1.0140.27 5.00 395461 0.74±0.37 61 1 +85 2.30+0.45 898±674 1.37±0.9 2.50 485±56 0.91 ±0.26 626+92 2.36±0.62 732±403 1.0940.52 Concanavalina 10.00 33179+9137 37.67±16.2 25676+13921 43.56+22.88 18975+10149 28.27+11.54 A 5.00 31012±12118 36.31 ±7.42 39742±3747 86.32+75.86 17425±7521 26.31+8.18 Amastigoto 4 X 10d 1775±702 2.15+0.67 227142564 2.44±1.0 3027±2268 4.3342.69 Parásitos Medio de Cultivo 510±89 1.00±0.1 265+59 1.0+0 529±67 1.040 En la Tabla 14, dos grupos de pacientes son evidentes antes de la vacunación, específicamente, un grupo con S. l .<1 .0 y otro grupo con S. L>1 .0. El grupo de pacientes curado después de la vacunación tuvo valores notablemente incrementados cuando se compararon con cualquiera de estos grupos de pre-vacunación. Los resultados del análisis estadístico fueron los siguientes: Grupo con S. l . < 1 .0 Antes de la vacunación Después de la vacunación Parámetro Medio .7007408 1 .271786 # puntos 27 24 Desviación std. .2043736 .5430509 Error std. .0393317 .1 02627 Mínimo .45 .47 Máximo 1 .39 3.15 Prueba t emparejada: Diferencia media = -.5710449 (Media de diferencias emparejadas) 95% intervalo de confidencia de la diferencia: .3475174 a .7945725 Valor p de dos colas es <0.0001 — extremadamente significativo - Grupo con S.l . > 1 .0 Antes de la vacunación Después de la vacunación Parámetro Medio 1 .726786 1 .271786 # puntos 28 28 Desviación std. .9234719 .5430509 Error std. .17451 98 .102627 Mínimo .88 .47 Máximo 4.88 3.15 Prueba t emparejada: Diferencia media = -.4549999 (Media de B menos media de A) 95% intervalo de confidencia de la diferencia: -.8608927 a -4.910712E-02 Valor p de dos colas es <0.0287 — significativo - Estos resultados demuestran que los linfocitos de ambos grupos de pre-vacunación de pacientes se estimulan significativamente por vacunación con cualquiera de las fracciones del extracto de L. (L)amazonensis. El mayor índice de estimulación se observó con fracciones 3 y 4 así como también con amastigotos vivos. En resumen, cada uno de los experimentos de blastogénesis demuestra que la vacunación con cualquiera de las fracciones de proteína de cada especie de leishmania incluida en el agente inmunoterapéutico de primera generación, y particularmente las fracciones 3 y 4, da como resultado la estimulación significativa de linfocitos. Los linfocitos estimulados producen citocinas que pueden inhibir la respuesta inflamatoria en pacientes psoriáticos, induciendo así la remisión clínica de las lesiones psoriáticas.

Ejemplo 14 Inmunidad Humoral en Pacientes Psoriáticos Tabla 15: ELISA en pacientes psoriáticos antes y después de la vacunación. (O'Daly eí al., 1994 Acta Trópica 56:265-287) Número de Dosis Agente Densi ¡dad Óptica 405 nm (Promedio+SD) Pacient es Inm uno- terapéutico La Lv Lb Lch 36 0 0.21+0.20 0.40+0.18 0.37+0.22 0.35+0.18 13 1 0.12+0.00 0.21 +0.09 0.22+0.1 0 0.19+0.07 18 2 0.37+0.27 0.35+0.16 0.32+0.17 0.33+0.14 17 3 0.47+0.22 0.38±0.15 0.41 +0.20 0.36+0.10 12 4 0.41 +0.28 0.30+0.1 1 0.22±0.09 0.26+0.03 12 6 0.38+0.27 0.34±0.18 0.36±0.05 0.30+0.01 16 Leishmaniasis activa 0.91+0.27 0.82+0.21 0.77+0.24 0.92+0.26 La: Leishmania amazonensis; Lv: L.venezuelensis Lb: L.brasiliensis; Lch: Lchagasi El suero proveniente de pacientes con psoriasis se ensayó antes y después de la vacunación con un Ensayo Inmunosorbente Enlazado a Enzima (ELISA), los resultados de lo cual se muestran en la Tabla 15. No se observaron diferencias en los valores de densidad óptica entre muestras de pre-vacunación y post-vacunación hasta la remisión clínica de lesiones después de seis dosis del agente inmunoterapéutico de primera generación. El punto de corte para una reacción positiva fue de 0.5 unidades. El único suero positivo perteneció a muestras de pacientes con leishmaniasis activa. Esto demuestra que el agente inmunoterapéutico de primera generación no induce Inmunidad Humoral o respuestas TH2.

Ejemplo 15 Inmunidad Celular en Pacientes Psoriáticos Tabla 16: Reacción intradérmica a fracciones antigénicas en pacientes después de remisión clínica de psoriasis. 1 Fracción 3 contra otras fracciones Los resultados de los ensayos de reacción intradérmica para inmunidad celular se muestran en la Tabla 16. Los datos indican que el agente inmunoterapéutico de primera generación está induciendo una respuesta TH 1 en pacientes de psoriasis curados. La fracción 3 de los componentes antigénicos L. (L)chagasi y L. (V)brasiliensis del agente inmunoterapéutico de primera generación demuestra la más elevada actividad inmunogénica in vivo con el ensayo de reacción intradérmica después de la remisión clínica de lesiones. La fracción 4 de cualquiera de estas especies también muestra un alto grado de actividad.

Ejemplo 16 Ensayo Ciego Individual con Agente Inmunoterapéutico de Segunda Generación que Contiene Fracciones Antigénicas de Proteína Aislada Tabla 17: Respuesta a vacunación con agente inmunoterapéutico de segunda generación Número de Fracción Número de PASI Inicial PASI Final %D isminución Pacientes Dosis en PAS I Final 3 1 2.0+1 .0 25.0+13.1 10.8±4.6 56.8 7 2 2.0+1 .3 24.9+22.4 13.1 +23.9 47.4 14 3 2.1 + 1 .1 16.1 + 14.7 1 .9+2.9 88.2 1 1 4 2.3±0.5 19.3+15.1 2.4±3.8 87.6 8 5 2.2±0.8 28.8+21 .3 52.8 13.5±1 5.5 3 6 50.9 2.3±0.6 16.7+1 .0 8.2+6.8 El efecto de la vacunación con las fracciones del agente inmunoterapéutico de segunda generación en valores PASI se muestra en la Tabla 17. Las fracciones 3 y 4 muestran la mayor actividad para remisión clínica de psoriasis. Dos dosis de agente inmunoterapéutico que incorpora cualquiera de estas fracciones disminuyen el PASI en 88% de sus valores iniciales en pacientes antes de la vacunación. Estas fracciones también muestran los máximos índices de estimulación en los experimentos de blastogénesis in vitro y el mayor diámetro de reacción intradérmica in vivo (IDR) después de la vacunación en los pacientes curados de psoriasis.

Ejemplo 17 Identificación y Caracterización de Fracciones de Proteína que I nducen Remisión Clínica de Lesiones Psoriáticas Los péptidos de geles de acrilamida se transfirieron a papeles de nitrocelulosa y se analizaron en la Instalación de NÚCLEO de Química Proteínica ICBR en la Universidad de Florida, Gainsville, Florida. HPLC se llevó a cabo utilizando un HPLC Hewlett Packard 1090, la digestión se llevó a cabo con Endo-Lys-C, y el análisis amino ácido se llevó a cabo utilizando un Ordenador en Secuencia de Proteínas ABI 494. La homología de secuencias amino acidas se investigó mediante el uso del programa BLAST. Tabla 18: Secuencia Amino Acida de Péptidos La fracción 3 contuvo tres bandas después de la reducción y alquilación total, como se sabe en la materia. Todas excepto dos de las secuencias de péptido mostraron homología con las proteínas humanas de Queratina de Tipo I o I I . La fracción 4 mostró resultados similares a la fracción3. Esta queratina de parásito amastigoto explica el efecto de los agentes ¡nmunoterapéuticos de la presente invención en pacientes de psoriasis. Muchos autores han postulado que la psoriasis es un desorden en la queratina humana de queratinocitos epidérmicos. Ejemplo 18 Análisis de Linfocitos de Sangre Periférica con el Citómetro de Flujo Tabla 19: Comparación de poblaciones de linfocito contra controles saludables en pacientes de psoriasis después de tratamiento. 0 DOSIS CONTROLES n = 95 n=49 CD4 30.7+12.8 40.8+9.6 <0.0001 CD8 20.3+9.3 28.4+9.7 <0.0001 CD8-C D4 + 29+9.9 38.9+9.9 <0.0001 C D3 66.7±9.8 73.2±90.8 <0.0004 CD8+CD3+ 13.1 +7.3 19.5±8.6 <0.0001 H LA+ 34.4+9.5 29.8+1 1 .5 <0.0150 CD8 + HLA- 1 1 .9+5.9 14.7+7 <0.0129 ig E 4.8+2.2 <0.0061 igG 6.7+3.8 <0.0026 0.8+0.5 1 .2+0.6 Todos los pacientes de psoriasis, antes del tratamiento con el agente inmunoterapéutico de primera generación, mostraron poblaciones de linfocitos sanguíneos periféricos, significativamente inferiores a los controles de salud normales, con excepción de los marcadores de HLA e IgE, los cuales se presentaron a niveles elevados.

Tabla 20: Comparación de poblaciones de linfocito contra controles saludables en pacientes de psoriasis con diferentes grados de severidad de enfermedad que siguen valores PASI PASI 1 -9 p vs. PASI 10-20 p vs. PASI 21 -65 p vs. co NTROL CONTROL CON TROL n=38 n=49 n=32 n=49 n=25 N=49 CD45 98.9+1.4 0.1283 99.0±0.1 0.1 98.9+1.2 0.1 CD4 36.6+9.2 0.0353 34.7±12.6 0.0334 22.4±10.2 <0.0001 CD8 23.1+8.6 0.0047 20.0+9.3 0.0008 18.06±6.7 <0.0001 CD8+CD4+ 2.2+1.5 0.6253 1.7+1.3 0.8163 1.6+1.1 0.8379 CD8-CD4 + 36.3±9.7 0.1838 28.6+10.4 0.0014 28.1+8.3 <0.0001 CD3 70.8±9.4 0.1100 66.3+10.9 0.0055 62.0+9.8 <0.0001 CD3 + CD8- 57.1±10 0.0765 51.2+11.6 0.9311 51.3+7.9 0.9802 CD8+CD3+ 0.0184 0.0100 0.0030 CD8 + CD3- 15.5+8.5 0.4337 14.0+8.5 0.1182 12.8+6.9 0.0344 TCR 6.8+3.6 0.4337 4.7+2.6 0.3633 4.4+3.9 0.1441 HLA+ 2.1+1 0.3389 2.1+1.7 0.2202 2.1+0.8 0.0424 CD8+HLA+ 32.5+7.9 0.0574 32.8+7.7 0.0418 35.8±9.2 0.4227 CD8+HLA- 8.4+4.9 0.0483 7.6+5.2 0.1801 12.8±9.6 0.0039 ' CD19 12.1+4.6 0.8455 12.6±5.8 0.2806 9.8+3.7 0.5216 7.4+3.6 8.4+4.3 8.0±3.5 Las poblaciones de linfocitos de sangre periférica se estudiaron en pacientes de psoriasis antes del tratamiento con el agente inmunoterapéutico de primera generación. Los pacientes de distribuyeron de acuerdo con la severidad de la enfermedad, se 5 tabularon de acuerdo con valores PASI . Los resultados se muestran en la Tabla 20. A medida que los valores PASI se incrementaron en pacientes de psoriasis, las poblaciones de linfocitos de sangre periférica de CD4+, CD8+, CD8-CD4+, CD3, CD8+CD3+, CD8+CD3-,CD8+HLA- disminuyeron mientras que las poblaciones de HLA+ se incrementaron 10 con relación a controles saludables. En el grupo con PASI 21 -65, siete poblaciones de linfocitos fueron inferiores a los valores para controles saludables. Esto sugiere que los linfocitos migran de sangre periférica a dermis y epidermis en la piel de pacientes psoriáticos para inducir la inflamación crónica característica de la enfermedad. 15 Tabla 21 : Comparación de poblaciones de linfocitos en pacientes de psoriasis con diferentes grados de severidad de la enfermedad PASI PASI p I.C. 95% PASI p I.C.95% [1 -9] [10-20] [>20] CD4+ 36.6+9.2 30.5+13.9 <0.4982 22.4±10.2 <0.0001 [-19.1 a-9.7] CD8 23.1±8.6 23.8+13.5 <0.1984 18.0±6.7 <0.039 [-9.3a-1.8] CD8+CD + 2.2±1.5 2.0+2.1 0.2139 1.6±1 .1 <0.0001 [34.2a44.5] CD8-CD4+ 35 3±g ? 2e 7±12 \ <0.0330 [-14.7 a -0.6] 23 -j + ß 3 <0.0001 [-20a-7.5] 9D C D3 7?!8+9 67!5±1 l '5 <0- 0792 SI?±S.Z <0.0002 [-15.5a-4.9] ^u CD3+CD8- 57 1 + 1 0 0 50+14 2 <0 0476 [-1 1.9a0.05] 51 3+7 o <0.01 18 [-13.9a-1.8] CD8+HLA- 1 9 r. 4 R ? A^R <0.07337 , '. „ <0.0310 [-4.4a-0.21 ] 1GA+ 5 1 +2 9 7 4+3 6 -=0 0443 1 -06 a 4.6] ß¿8±+3 0 <0.0001 [5.3a12.8] 1G D+ 1 1 5±3 5 16 4+9 <0 °387 t° ^ 3 6.25] j ^ <0.1462 Existen diferencias significativas en poblaciones de linfocitos entre pacientes con diferentes valores PASI. La comparación de grupos 1 -9 y 25 10-20 mostró cuatro poblaciones de linfocitos con valores inferiores en el grupo con psoriasis más severa. La comparación entre grupos con PASI 1 -9 y PASI mayor de 20 unidades mostró siete poblaciones de linfocitos con valores inferiores en el grupo con lesiones psoriáticas severas. IgA + linfocitos fueron mayores en el grupo con enfermedad 5 más severa.

Tabla 22: Comparación de poblaciones de linfocitos contra controles saludables en pacientes de psoriasis con remisión total de lesiones después de más de 10 dosis de agente 10 inmunoterapéutico de primera generación Pacientes curados >10 DOSIS de agente inm unoterapéutico p vs. CONTROL n=49 n=49 CD45 99.2+0.4 0.1283 i c 1 5 20 Después de la remisión clínica de lesiones, todas las poblaciones de linfocitos sanguíneos regresaron a valores normales, similares a los controles saludables. Solo las poblaciones de linfocitos HLA+ y CD1 9 tuvieron valores mayores a los controles normales, probablemente debido a la estimulación de linfocitos después del tratamiento de agente 25 inmunoterapéutico.

Las lesiones de psoriasis se inducen en la piel debido a que los linfocitos T se transfieren desde las capilaridades dérmicas dilatadas hacia la dermis. El infiltrado inflamatorio abundante en linfocitos induce la proliferación dérmica, el grosor epidérmico, paraqueratosis y formación de escamas. Esta es la actividad del infiltrado de linfocitos, que consiste básicamente en células T que son la fuerza motora para la inducción de los cambios, en la psoriasis, aunque siendo también necesario el mantenimiento de las placas. El proceso de inicio y mantenimiento de la psoriasis depende de la activación de células T, la migración de células T y la secreción de citocinas mediante células T en la piel. Las células T deben activarse para inducir y/o mantener la psoriasis ya que deben presentarse en la piel. El proceso de células T que se alojan en la piel se regula por factores segregados e interacciones entre la célula T y el endotelio. La primer etapa o renovación se media mediante interacción de célula-célula entre antígeno de linfocito cutáneo (CLA) sobre la célula T migrante y selección E en la célula endotelial. Este proceso incluye la activación de proteínas superficiales sobre las células T mediadas por quimoquinas y enlace proteínico superficial endotelial de célula T mediante interacciones de LFA-1/ICAM y VLA/VCAM que completan la migración de células T a través del vaso sanguíneo, un proceso llamado diapédesis. Finalmente, las células T, macrófagos locales, células dendríticas, endotelio vascular e incluso queratinocitos en sí, mediante una cascada de citocinas segregadas por muchas células diferentes, inducen los cambios de queratinocitos en la psoriasis. Además de la psoriasis, otras enfermedades relacionadas tienen un mecanismo de acción similar. Por ejemplo, la dermatitis atópica parece tener un mecanismo de acción similar. La administración de los compuestos con la misma metodología expuesta en la presente ha demostrado regresiones significativas en lesiones de pacientes, con dermatitis atópica. Adicionalmente, la artritis psoriática tiene un mecanismo de acción similar. La artritis psoriática ocurre en aproximadamente 1 5-20% de los pacientes psoriáticos. La artritis psoriática efectúa uniones sinoviales que se componen de dos extremos óseos adyacentes, cada uno cubierto con una capa de cartílago, separados por un espacio adjunto y rodeados por una membrana sinovial y cápsula de unión. La artritis se caracteriza por una respuesta inflamatoria de la membrana sinovial que se transporta por un flujo interno transendotelial de células linfoides y la activación local de una variedad de células mononucleares tales como células T, células B, células de plasma, macrófagos de células dendríticas y células de masto así como también la formación de nuevos vasos. Con objeto de tratar cualquier enfermedad que surja de la actividad de infiltrado linfocítico uno no necesita inmunosuprimir o eliminar células T, sino más bien uno puede proporcionar un inmunoestimulados, como se ilustra por el ensayo blastogénico reportado en las Tablas 1 1 , 12, 13 y 14. Las fracciones 3 y 4 tuvieron los mayores índices de estimulación en linfocitos de sangre periférica humana de pacientes después de 1 00% de remisión de lesiones psoriáticas. Después del análisis de las poblaciones de linfocitos en sangre periférica con varias poblaciones de linfocitos del citómetro de flujo disminuidas a medida que los valores PASI se incrementaron en pacientes psoriáticos, como se muestra en las Tablas 20 y 21 , en comparación con controles saludables normales, como se muestra en la Tabla 1 9. Después de la remisión clínica de lesiones, los linfocitos de sangre periférica regresaron a valores normales, como se muestra en la Tabla 22. Por consiguiente, un tratamiento de la psoriasis y las enfermedades relacionadas tiene un mecanismo de acción que incluye una inhibición o bloqueo de renovación de células T mediante interferencia con la interacción de selectina CLA-E mediante una novedosa citosina e interferencia de enlace endotelial o diapédesis por una citosina novedosa inducida por estimulación de un clon de célula T desconocido que bloquea la interacción LFA-1/ICAM y/o la interacción VLA/VCAM con células endoteliales. No obstante, la primer señal clínica observada en los pacientes después de la administración de las composiciones actualmente expuestas es la disminución en lo rojo de la piel, que es el resultado de una disminución en la vasodilatación capilar dérmica, típica de psoriasis. La artritis psoriática ocurre en aproximadamente 15-20% de los pacientes psoriáticos. La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad de articulaciones, destructiva, inflamatoria y crónica que afecta a aproximadamente 0.5-1 % de la población del mundo industrializado y conduce a una significativa discapacidad y a una consecuente reducción de la calidad de vida. RA es una enfermedad en la cual los sistemas inmunes e inflamatorios se enlazan a la destrucción de cartílagos y huesos. Los enlaces entre los dos sistemas permanecen elusivos, sin embargo, y la causa subyacente de RA desconocida. RA es similar a la psoriasis y tiene una base poligénica, pero los genes involucrados no se han definido. Existe una fuerte asociación entre RA y varios tipos de autoanticuerpos. El autoanticuerpo más importantes es el factor reumatoide (RF), que se dirige contra la porción Fe de IgG. Se ha especulado que RA, así como también la psoriasis, podrían activarse mediante agentes infecciosos, pero aún se carece de pruebas de esto. La razón para la ubicación específica de articulación de la respuesta inflamatoria también se desconoce. Como muchas formas de artritis, RA se caracteriza inicialmente por una respuesta inflamatoria de la membrana sinovial (sinovitis) que se transporta por un flujo interno transendotelial y la activación local de una variedad de células mononucleares, tal como células T, células B, células de plasma, células dendríticas, macrófagos, células masto, así como también nuevas formaciones de vasos. Existe una fuerte asociación con los mecanismos que conducen a alojamiento de células involucradas en la articulación y que posteriormente activan una respuesta de célula T. La articulación sinovial se compone de dos extremos óseos adyacentes, cada uno cubierto con un estrato de cartílago, separado por un espacio de articulación y rodeado por la membrana sinovial y cápsula de articulación. La membrana sinovial es normalmente menor de 100µ. Las células T que se infiltran en la membrana sinovial son básicamente células de memoria CD4+ similares a las células T encontradas en la piel de pacientes psoriáticos. La membrana sinovial es normalmente menor de 1 00 µm de grosor y el revestimiento sinovial, que enfrenta el cartílago y el hueso, consiste en una capa delgada de sinoviocitos, con un tipo derivado de macrófagos y el otro tipo de fibroblastos. No existe membrana de basamento. Solo una cuantas células mononucleares (si s que existen) pueden encontrarse en el estrato de tejido conectivo de sub-revestimiento, el cual tiene considerable vascularidad. La membrana sinovial cubre todas las estructuras intra-articulares, excepto para el cartílago y áreas pequeñas de hueso e injertos expuestos cerca de la unión de cartílago-hueso. El infiltrado de linfoide puede difuminarse o puede formar estructuras similares a linfoide-folículo. Este proceso es similar al proceso inflamatorio en la piel psoriática. El estrato sinovial de revestimiento se divide continuamente, se vuelve hiperplástico, con un grosor mayor de 20 células (es decir, 100 µm , y posteriormente la membrana sinovial se expande y forma microvellosidades. Además, existe destrucción ósea. Este proceso también puede observarse en la artritis psoriática. Como resultado, el tratamiento con los polipéptidos de la presente invención puede obstruir el tráfico de las células linfoides provenientes de la sangre a la piel, y también de la sangre a la membrana sinovial, actuando así para invertir el proceso inflamatorio que conduce a inflamación crónica tanto en RA como en artritis psoriática. Mediante inmunoestimulación de las células T que producen las citocinas novedosas que inhiben el proceso vascular en el receptor de células T o en el receptor de células endoteliales, los polipéptidos de la presente invención pueden detener el tráfico de las células linfoides.

La descripción anterior de las modalidades específicas es meramente ilustrativa y pueden hacerse diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la presente invención, la cual se limita solo por las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVI NDICACIONES 1 . Un método para inhibir de manera selectiva la renovación de células T en un huésped humano, caracterizado porque comprende la administración de un compuesto que interfiere de manera selectiva con la interacción de CLA-E selectina e interacciones de LFA-1 /1CAM y VLA/VACM. 2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto es un inmunoestimulador. 3. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto incluye un agente inmunoterapéutico, comprendiendo dicho agente un extracto de proteína purificado en donde dicho extracto purificado se aisla por cromatografía Sephadex de dietilaminoetilo de una fracción antígena de particulado insoluble de Nonidet P-40, derivada de células muertas aisladas de amastogotos de al menos una especie del género Leishmania, solubilizada dicha fracción de antígeno particulado con 8 M urea y 0.025 M. Tris[hidroximetil]aminometano pH 8.3 aplicado a dietilaminoetilo Sephadex y levigada con una solución que comprende 0.1 M cloruro de sodio, 8M urea y 0.025 M Tris[hidroximetil]aminometano pH 8.3, incluyendo dicho extracto de proteína purificada polipéptidos que tienen pesos moleculares aparentes después de la reducción y alquilación total de 73, 80 y 82 kDa. 4. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque la especie es Leishmania amazonensis. 5. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque la especie es Leishmania venezuelensis. 6. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque la especie es Leishmania brasiliensis. 7. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque la especie es Leishmania chagasi. 8. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque las especies son Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania brasiliensis y Leishmania chagasi. 9. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque el polipéptido de 73 kDa comprende las secuencias amino acidas establecidas en las SEQ ID NOS: 1 , 5 y 6; en donde el polipéptido de 80 kDa comprende las secuencias amino acidas establecidas en las SEQ ID NOS: 1 , 3 y 4 y en donde el polipéptido de 82 kDa comprende las secuencias amino acidas establecidas en las SEQ ID NOS: 1 y 2. 10. El método según cualquiera de las reivindicaciones 3-9, caracterizado además porque comprende un adyuvante. 1 1 . El método según la reivindicación 1 0, caracterizado porque el adyuvante es alúmina. 12. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicho compuesto incluye un agente inmunoterapéutico, comprendiendo dicho agente un agente inmunoterapéutico, comprendiendo dicho agente un extracto de proteína purificado en donde dicho extracto purificado se aisla por cromatografía Sephadex de dietilaminoetilo de una fracción antígena de particulado insoluble de Nonidet P-40, derivada de células muertas aisladas de amastogotos de al menos una especie del género Leishmania, solubilizada dicha fracción de antígeno particulado con 8 M urea y 0.025 M. Tris[hidroximetil]aminometano pH 8.3 aplicado a dietilaminoetilo Sephadex y levigada con una solución que comprende 0.1 M cloruro de sodio, 8M urea y 0.025 M Tris[hidroximetiI]aminometano pH 8.3, incluyendo dicho extracto de proteína purificada polipéptidos que tienen pesos moleculares aparentes después de la reducción y alquilación total de 73, 80 y 82 kDa. 13. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la especie es Leishmania amazonensis. 14. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la especie es Leishmania venezuelensis. 15. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la especie es Leishmania brasiliensis. 16. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la especie es Leishmania chagasi. 17. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque las especies son Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis, Leishmania brasiliensis y Leishmania chagasi. 18. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido de 73 kDa comprende las secuencias amino acidas establecidas en las SE I D NOS: 12, 13 y 14, en donde el polipéptido de 80 kDa comprende las secuencias amino acidas establecidas en las SEQ I D NOS: 1 , 3 y 1 0 y en donde el polipéptído de 82 kDa comprende las secuencias amino acidas establecidas en las SEQ I D NOS: 7, 8 y 9. 19. El método según cualquiera de las reivindicaciones 12-18, caracterizado porque comprende además un adyuvante. 20. El método según la reivindicación 19, caracterizado porque el adyuvante es alúmina.