JP2004529634A - 転位した扁平上皮癌抗原遺伝子ii - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は融合タンパク質の生産のための融合タンパク質転写物、扁平上皮癌に見出された融合遺伝子、転位の検出、およびSCCA1、SCCA1/A2、SCCA2/A1及びSCCA2に特異的なモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
扁平上皮癌抗原(SCCA)は子宮の頚部、肺、頭および首、外陰および食道の扁平上皮癌(SCC)のための血清学的マーカーである(1、2)。これは、もともとヒトの頚部の扁平上皮癌からのTA-4複合体から、42-48 kDaの分子量で精製された(1、3)。この抗原は10個より多いタンパク質からなり、該抗原の等電点電気泳動により、2つのサブフラクション、酸性(pI<6.25)および中性(pI∃6.25)アイソホーム(4)が明らかにされる。分子量の差は恐らく修飾による(5)。
【0003】
SCCAのcDNAのクローニングにより、これがセリンプロテアーゼインヒビター(セルピンズ)のファミリーに属することが示される(6)。染色体18q21.3上のゲノム領域のさらなるクローニングにより、2つのタンデムに配列された遺伝子が明らかになった(7)。よりテロメリック(telomeric)なオリジナルのSCCAをSCCA1と呼び、よりセントロメリック(centromeric)なものをSCCA2と呼ぶ(図1A−C)。それらはいずれも8つのエキソンを含み、推定上のイントロン−エキソン境界、スプライス部位、開始コドンおよびターミナルのコドンが同一である。これらは、ヌクレオチドレベルで98%(図2)、アミノ酸レベルで92%(図3)の同一性を有する。推定されたpI値は、SCCA1が中性アイソホームをコードし、SCCA2が酸性アイソホームをコードすることを示す。さもなければ、両方の遺伝子からスプライスされた変異mRNAが、50及び21アミノ酸短いタンパク質を生じることが見出されている(5)。
【0004】
ヒトでは、セルピンズが1個または2個の染色体のクラスタにマッピングされる。PI6、PI9およびELNAH2は6p25にマッピングされ、PI8、ボマピン(Bomapin)、PAI2、SCCA1、SCCA2、ヘッドピン(Headpin)およびマスピン(Maspin)は、18q21.3にマッピングされる(図1B)(7−12)。これらのクラスタは、2つの独立した染色体間の複製および何回かの染色体間重複によって発生したと考えられる(9)。染色体領域18qは、高頻度の転位領域としてしばしば報告されてきた(9、13−16)。セルピンズの標的および機能は完全には理解されていない。大部分については、主要な機能は、凝固、繊維素溶解、アポトーシスおよび炎症に関連したタンパク質分解の調節であるが、ホルモン輸送および血圧調節のような別の機能も報告されている(17−24)。
【0005】
SCCA1とSCCA2はほとんど同一であるが、反応部位ループが異なる(図2及び3)。SCCA1はパパイン様のシステイン・プロテイナーゼ・カテプシンS、KおよびLを阻害し(25、26)、SCCA2はキモトリプシン様のセリンプロテイナーゼ・カテプシンG及び肥満細胞キマーゼ(27)を阻害する。SCCA1の反応部位ループ(RSL)に関する研究により、RSLがシステインプロテイナーゼ阻害(28)に不可欠であることが示された。RSLの可変部分は、SCCA1とSCCA2のRSL交換突然変異体および単一の突然変異体(28、29)によって示される標的プロテイナーゼの特異性を必要とする。セリンおよびシステインプロテイナーゼの両方を阻害するために、セルピンズが共通のRSL依存のメカニズムを利用することが考えられる。
【0006】
SCCA1およびSCCA2の生物学の役割は完全には理解されていない。それらは抑制セルピンズであると考えられる。データは、SCCA1がアポトーシスに関係し、発現がアポトーシスの阻害によって癌細胞をいくつかの殺すメカニズムに対して耐性にするということを提案する(30)。癌細胞におけるSCCA2発現の役割はまだ不明瞭である。正常な組織では、SCCA抗原は表皮の成熟中にある種の特定の役割を持っているかもしれない(5)。
【0007】
識別可能なモノクローナル抗体およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用した最近の研究により、SCCA1およびSCCA2のいずれも、舌、扁桃腺、食道、子宮の頚部および膣、胸腺のハッサルの(Hassall's)小体、皮膚のある領域の重層扁平上皮の基底上層で、また誘導気道(31)の階層化された円柱上皮中で発現することが示された。肺および頭、および首の扁平上皮癌では、SCCA1とSCCA2は中程度に共発現され、よく区別される腫瘍である。非差別的な抗体を使用する従来の研究とは対照的に、これらのデータは、正常組織及び悪性組織でSCCA1とSCCA2の間に異なる発現がなかったことを示す。以前の結果は、腫瘍の周辺の部分ではSCCA2のみが検出されることを示した(32)。この不一致は、免疫組織化学の技術と抗体特異性の差によるかもしれない(31)。分析操作の間に唾液または汗による汚染によって誤って肯定的な結果が出ることが多いであろうという報告がなされた(1)。カタルテペ(Cataltepe)らは、唾液中のSCCAが上部の消化管の粘膜の表面に並ぶ扁平上皮細胞に由来することを提案する(31)。
【0008】
通常は、SCCA1とSCCA2は、循環でではなく(33)扁平上皮細胞の細胞質で(31)検出される。 SCCの患者の血清に現われる抗原は、腫瘍細胞によるSCCAの過剰生産およびそれらの正常なターンオーバーの機能であるかもしれない(34)。抗体ラジオイムノアッセーあるいはRT−PCRを使用することにより血清に検出されるSCCAは、主としてSCCA2であることが報告されている(1、35、36)。しかし、PCRを使用する他の研究は、患者の試料中で両方の抗原が増幅され、検出され得ることを示す(37)。
SCCの患者の血清中の濃度は、臨床的段階および腫瘍の組織学的差異の程度に関連づけられる(1)。子宮頸癌については、いくつかの研究が、前処理値と臨床の結果の間の相関性を示している(1、38−43)。研究により、高いSCCAレベルと腫瘍の体積のさらに高い相関性が示される。臨床的に証明されるより数か月前に再発あるいは進行性の疾病を検出することができるかもしれない(39)。同様の結果は、肺、外陰、頭および首、および食道(1、2、44および45)の扁平上皮癌にも見られる。これらのすべての研究において、総SCCAレベルが測定された。近年、SCCA1およびSCCA2を識別可能な抗体を使用して新しいsELISAが開発された(33)。
【発明の開示】
【0009】
本発明は融合タンパク質を提供するための異なる遺伝子の融合タンパク質転写物、mRNAに関し、特にSCCA1とSCCA2の部分からなる融合遺伝子の検出を提供する。そのような融合遺伝子は、今回、異なる起源(頚部、肺および咽頭)のSCC細胞系で見出された。本発明は、さらに、融合タンパク質の測定/検出のための特異的な免疫学的試薬の確立のための方法を提供する。
【0010】
融合タンパク質の一つは、下記のDNA配列:
に基づく、下記のアミノ酸配列:
により定められる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0011】
一つの融合遺伝子(図4)はSCC細胞系からのcDNAのシーケンシングにより見出された。
【0012】
SCCA1からSCCA2の速い配列によると、DNA破壊点はイントロン7(図2)にあるであろう。従って、該遺伝子は、SCCA1のプロモーター領域により制御されるが、SCCA2特異性を備えたタンパク質を生産しているであろう。
【0013】
さらに調べることにより、SCCA1/A2あるいはSCCA2/A1を見出し、融合タンパク質転写物が異なる部位で生じること、すなわち、これらの抗原の異なる遺伝子が1つの遺伝子のプロモーター領域および別の遺伝子の反応部位ループを有するクロスオーバー転写物を提供することが示された。
【0014】
これにより、ある領域、クロスオーバー反応領域において、少なくとも80%相同のヌクレオチドを有する二つの異なる遺伝子の融合タンパク質転写物に関する基礎的な発明が導かれる。
【0015】
この融合遺伝子は、クローニングされ、プラスミド構築物として保持され、異なる大腸菌株に形質転換されている。
【0016】
この融合遺伝子を含むプラスミド、pGEX6P−3 SCCA1/A2は、寄託番号ECACC 01031315として2001年3月14日に欧州細胞カルチャーコレクション(European Collection of Cell Culture)に寄託された。
【0017】
融合タンパク質が生産され、複合結合の研究は、カテプシンLではなくカテプシンGに融合遺伝子が結合する基質を示す(図9)。
【0018】
該融合遺伝子は腫瘍DNAのサザンブロット分析により検出することができる(図8)。該融合遺伝子は、PCR分析、ならびにcDNAクローニングおよびシーケンシングにより検出することもできる。
【0019】
実施例1 SCCAのクローニング。
【0020】
1.1 PCR増幅
細胞系Caski(頚部)、C4−I(頚部)、A549(肺)、CaLu3(肺)、SkMes(肺)およびRPMI2650(咽頭)からのmRNAを、クイックプレップマイクロ(QuickPrep Micro)mRNA精製キット(ファーマシア(Pharmacia))を使用して調製し、cDNAをファースト−ストランド(First-Strand)cDNA合成キット(ファーマシア)を使用して調製した。SCCAのコード配列をカバーする1218bpのDNA断片を、10mMのトリス−HCl pH 8.85、25mMのKCI、5mMの(NH4)2SO4、2mM のMgSO4(ボエリンガー(Boehringer))、0.2mMのdNTP(ファーマシア)、10μMのSCCA1−7F(すべてのプライマーのDNA配列は表1中に示す)、10μMのSCCA 391−397B、2μlのcDNA及び2.5UのPwo−ポリメラーゼ(Pwo-polymerase)(ボエリンガー)を含む100μlの反応中でのPCRによって増幅した。試料を96℃で5分間変性させた後に、96℃で15秒の変性、60℃で15秒のアニーリング、72℃で30秒の伸張からなるサイクルを合計30サイクル行い、最終的な伸張を72℃で10分間行い、PCR反応を完了した。
【0021】
表1 PCRプライマー
【0022】
1.2. SCCA1とSCCA2の検出
PCR生成物中のSCCA1の存在は、各々245および973bpの二つの断片を生じる制限酵素SacIIによる開裂により、または、標準のPCR反応(75mMのトリスHCl pH 8.8、20mMの(NH4)SO4、0.01%のトゥイーン(Tween)20、2mMのMgCl2、0.2mMのdNTP、10μMの各プライマー、鋳型、0.025U/μlの反応Taqポリメラーゼ;試料を96℃で5分間変性させた後に、96℃で15秒の変性、最適アニーリング温度で15秒のアニーリング、72℃で30秒の伸張からなるサイクルを合計30サイクル行い、最終的な伸張を72℃で10分間行い、PCR反応を完了した。)でプライマーSCCA1−7FおよびSCCA1 323−329Bを使用するSCCA1特異的PCRにより検出され、Ta=50℃、997bpの断片を得た。SCCA2の存在は、SCCA 1−7FおよびSCCA2に特異的なプライマー(SCCA2 357−363B)を使用して、標準のPCRによって検出された、Ta=60℃で、1090bpの断片が得られた。
【0023】
1.3. クローニング
PCR生成物はPCRスクリプト(Script)Ampクローニングキット(ストラタジーン(Stratagene))を使用してクローニングした。コロニースクリーニングは、上記の1.2に記載したPCRによって行われた。ウィザードプラスミニプレップス(Wizard Plus Minipreps)DNA精製システム(プロメガ(Promega))を使用して、選択されたSCCA1あるいはSCCA2を含むクローンからプラスミドDNAを調製した。
【0024】
1.4. DNAシーケンシング
クローンはABIプリズムビッグダイターミネイターサイクルシーケンシング(ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing)(PEバイオシステムズ(PE Biosystems))を使用してシーケンシングした。試料はABIプリズム(ABI Prism)310上でランオンした。
【0025】
1.5. 再クローニング
選択されたクローンを、発現ベクターpGEX−6P−3(ファーマシア)に再クローニングした。断片はBamHIとXhoIを使用してPCRスクリプトアンプ・ベクターから切り出し、1xOPA、1mMのATP、50ngの開裂ベクター、1:5−1:8の挿入比のモルオブエンドベクターに対応するSCCA挿入物及び7.5−10UのT4DNAリガーゼ(全てファーマシア製)を含有する10μlの反応物中で発現ベクターにリゲート(ligate)した。反応管を、10℃で一晩インキュベート(incubate)し、65℃で10分間不活性化し、この反応物2−4μlで大腸菌JM109(46)を形質転換した。その後、選択されたクローンからのプラスミドDNAで、タンパク質発現用の大腸菌BL21を形質転換した。
【0026】
1. 6. クローン化された遺伝子の維持
10mMのトリス−HClpH8.0緩衝液中のプラスミドDNA(SCCA1/A2融合遺伝子を含むpGEX−6P−3)を、−80℃で保存する。タンパク質発現の再開のために、プラスミドDNAでサムブルック(Sambrook)ら(参考文献45のp 1.82−1.84)によるコンピテントな大腸菌BL21を形質転換した。より多くのプラスミドDNAの調製のためには、大腸菌JM109の形質転換が好ましい。
【0027】
実施例2 タンパク質の発現および精製
【0028】
2.1タンパク質の発現
発現条件は小規模調製により決定した。大規模発現のためには、500mlの2xYTおよび100μg/mlのアンピシリンの培地中に、一晩培養した培養液5mlを接種し、37℃で増殖させた。タンパク質発現はOD600=0.5−1.3で、最終濃度が0.1mMとなるようにIPTGを加えることにより誘導した。
【0029】
SCC1を生産する培養物は、4−16時間培養した。SCCA1/A2については16−18時間培養した。SCCA2タンパク質を生産する培養物は、OD600=1.2−1.4で誘導され、2−3時間培養した。
【0030】
2.2. タンパク質の精製
細胞を2000gで10分間遠心分離することによって収穫し、50mlのTE pH 8.0で洗浄し、3mlTE/g細菌ペレットに溶解した。リゾチームを、800μg/gペレットの最終濃度となるように添加し、この混合物を30−60分間の氷上でインキュベートし、その後、−70℃で一晩凍結した。塩化マグネシウムおよびDNアーゼを、各々12mMおよび20μg/gペレットの最終濃度となるように添加した。30分間氷上でインキュベートした後に、試料を40000gで30分間遠心分離した。各上清に50%のグルタチオンセファロース(ファーマシア)を0.5ml添加し、穏やかに攪拌しながら室温で30分間−2時間インキュベートした。このスラリーを、1xPBSで5−7回洗浄した。0.5−1mlの還元グルタチオン(ファーマシア)を使用してGST−SCCA融合タンパク質を溶離し、室温で30−60分間、4℃で一晩、全て穏やかに攪拌しながらインキュベートした。SCCAタンパク質は、GSTとSCCAの間の開裂によって溶出された。0.48mlの開裂バッファー(50mMのトリス−HClpH7.0、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのDTT)および20μlのプレシジョン(PreScission)プロテアーゼを添加し、試料を4℃で穏やかに攪拌しながら4時間または一晩インキュベートした。タンパク質はファスト(Phast)システム(ファーマシア)によりSDS−PAGEで分析した。
【0031】
2 3. 複合結合
SCCAの基質への複合結合は、総容量4.5μlの1xPBSバッファー中、2μgのSCCAタンパク質を、0.5μgのカテプシンG(バイオデザイン インターナショナル(Biodesign Int))または0.5μgの0.9μgカテプシンL(カルバイオケム(Calbiochem))と混合することにより行われた。試料は30分間37℃でインキュベートした。各試料に、10xコンプレックス(Complex)−バッファー(20%のSDS、140mMのメルカプトエタノール、ブロモフェノールブルー)0.5μlを添加した。試料を95℃で3分間インキュベートし、12.5%のSDS−PAGEゲル上で分析した。SCCA1/A2融合タンパク質は、カテプシンGと複合体を形成したが、カテプシンLとは形成しなかった。これは、この融合タンパク質が機能的であり、SCCA2の基質特異性を有することを示す(図8)。
【0032】
実施例3 DNA分析
【0033】
3.1サザンブロット分析
SCC細胞系から並びに正常な健康なボランティアの血液試料から調製されたDNA約10μgを、制限酵素PstIまたはBamHIで消化した。消化されたDNAを、0.8%のアガロース上で分離し、薄膜(ハイボンドN(Hybond N)+、ファーマシア)に転写した。フィルタを、5xSSC、0.1%のSDS、5%の硫酸デキストラン、1:20に希釈したリキッドブロック(LiquidBlock)(ファーマシア)およびサケ精液DNA100μg/mlを含む溶液20ml中、1時間プレハイブリダイズ(prehybridize)し、60℃で一晩ハイブリダイズ(hybridize)した。ハイブリダイズ中のプローブ濃度は10ng/mlであった。ハイブリダイズ後、フィルタを、lxSSC/0.1%SDS中で15分間、0.2xSSC/1%SDS中で15分間、いずれも60℃でストリンジェントに洗浄した。プローブハイブリダイゼーションは、遺伝子像(Gene Images)CDP−Star検出モジュール(ファーマシア)をマイナーな変更を加えて使用し、検出した。フィルタは1:7.5に希釈したリキッドブロック液体のブロックを含む溶液中、室温で1時間ブロッキングした。その後、それらを、1:6800に希釈した抗フルオレセインHRP接合体を添加する前に加える前に、バッファーA(0.1Mトリス、0.3M NaCl、pH 9.5)/0.5%のBSA中、15分間インキュベートし、その後さらに45分間インキュベートした。フィルタを、検出試薬を加える前に、バッファーA/0.3%トゥイーン20中、3x10分間洗浄した。フィルタを2分間でインキュベートし、2xSCCの中で短時間洗浄し、プラスチックフィルムでラップした。ハイパーフィルム(Hyperfilm)MPを35分で露出した。
【0034】
3.2. ハイブリダイゼーションプローブ
プローブは、各々60μmのdATP、dCTPおよびdGTP、24μMのdTTP、40μMのフルオレセイン−11−dUTP、2mMの MgCl2、3μMのフォワードプライマー、3μMのバックワードプライマー、15ngのDNA鋳型(SCCA2を含むプラスミド)、1UのTaqポリメラーゼ及び1xPCRバッファー(アドバンスドバイオテクノロジーズ(Advanced Biotechnologies))を含有する反応物でのPCRにより生成し、標識された。
プローブI:エキソン8の393bp断片(ヌクレオチド802−1194)、プライマーSCCA 266−273FおよびSCCA 391−397B、Ta=50℃;プローブII:エキソン8の126bp断片(ヌクレオチド957−1082)、プライマーSCCA2 319−324FおよびSCCA2 357−363B、Ta=50℃;プローブIII:コード配列をカバーする1194bp断片、および遺伝子の3’−末端の22のヌクレオチド、プライマーSCCA 1−7FおよびSCCA 391−397B、Ta=60℃。
【0035】
プローブIとハイブリダイズしたPstI消化DNAのサザンブロットは、正常なコントロールDNA(図9)のそれと比較して、SCC細胞系からの異なるバンド・パターンのDNAを示す。BamHIで消化されたDNAも正常なコントロールDNAと比較して、異常なバンドを示す。
【0036】
3.3. PCR分析
標準のPCR反応においてプライマー7および8(表1を参照)により分析されたサンプルから常法により単離されたDNAは、融合遺伝子を含むサンプルにおいて唯一の生成物を示す。
【0037】
実施例4 ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体
【0038】
4.1 ハイブリドーマの確立、および、SCCA1/A2、SCCA2、およびSCCA1と反応するモノクローナル抗体の生産
【0039】
組換えSCC抗原によるウサギの皮下免疫および標準的な操作による免疫血清の回収によりSCC抗原と反応するポリクローナル抗血清を得た。ポリクローナル抗血清の力価は、ストレプトアビジンプレート(ラブシステムズ オーワイ(Labsystems Oy)、ヘルシンキ(フィンランド))、図6に固定されたビオチニル化されたSCCA1/A2およびSCCA1と抗血清との反応性の測定によって試験した。組換えSCCA1/A2およびSCCA1は、標準的な方法によりビオチン(Biotin)N−スクシンイミドカプロン酸塩エステルでビオチニル化された。
【0040】
SCCA1/A2およびSCCA2と反応するモノクローナル抗体は、Ribiアジュバント中の10−50μgの組換えSCCA1/A2で、Balb/cマウスを腹腔内免疫することにより確立された。免疫及び60−90日の間で2−4回のブースターの後に、免疫化したマウスから得た脾細胞を記載されているように(47)P3x63Ag8ミエローマ細胞と融合した。
【0041】
SCCA1/A2と反応する抗体を生産するハイブリドーマを、マウス免疫グロブリンIgG+Mに対するアフィニティ精製されたポリクローナル抗血清(ジャクソン イムノ リサーチ ラボラトリーズ(Jackson Immuno Res Lab),米国)をコートしたマイクロタイターウェル中のハイブリドーマ上清のELISAスクリーニングにより選択した。その後、ウェルをSCCA1/A2抗原と共にインキュベートし、洗浄後、結合抗原をポリクローナルウサギ抗SCC及びHRP標識ブタ抗ウサギIg(ダコ エイエス(Dako AS)、コペンハーゲン、デンマーク)と共にインキュベートすることにより検出した。
【0042】
4.2. SCC抗原と選択されたハイブリドーマの反応性
確立したハイブリドーマの反応性は、ELISAスクリーニング法と類似のELISAにより試験された。簡潔に言えば、このハイブリドーマによって生産されたモノクローナル抗体を、マウス免疫グロブリンIgG+Mに対するアフィニティ精製されたポリクローナル抗血清(ジャクソン イムノ リサーチ ラボラトリーズ,米国)をコートしたマイクロタイターウェルに固定した。その後、ウェルをPBS1%BSA中の異なる組換えSCC抗原50μlと1時間インキュベートし、プレートを洗浄した後、PBS−1%BSA中で1/5000に希釈したラビット抗SCC100μlとインキュベートし、さらに1時間インキュベートした。
【0043】
その後、結合したウサギ抗SCCを、HRP−ブタ抗ウサギIgとインキュベートし、OPD基質で可視化し、450nmでODを測定することにより検出した。
【0044】
図7に、選択されたハイブリドーマの反応性を示す。SCC106、SCC114、SCC115はSCCA1/A2とのみ反応し、これはそれらがSCCA1/A2融合タンパク質に特異的であることを示す。SCC100、SCC103およびSCC109は、SCCA2およびSCCA1/A2と反応したがSCCA1とは反応せず、これらはSCCA2に特異的であることが示された。SCC110、SCC111およびSCC124は、SCCA1およびSCCA1/A2と反応したが、SCCA2とは反応せず、それらがSCCA1に特異的であることが示唆された。
【0045】
SCC107、SCC119およびSCC128は、すべてのSCC抗原と反応した。これにより、それらがSVVA1とSCCA2の共通のエピトープを認識することが示唆される。
【0046】
2回限界希釈法により、SCCA1/A2と反応するがSCCA1とは反応しない抗体を産生するクローンがクローニングされた。
【0047】
モノクローナル抗体は、ローラー・ボトル中のDMEM、5%ウシ胎児血清中の104個の細胞/mlの接種によるハイブリドーマ・クローンの生体外培養によって生産され、10−14日間培養した。その後、モノクローナル抗体を、プロテインA(バイオプロセシングリミテッド(Bioprocessing Ltd.)ダーラム、英国)アフィニティークロマトグラフィー(affinity chromatography)により、生産者の推奨に従って培地から精製した。
【0048】
実施例5
確立されたモノクローナル抗体および組換えタンパク質を使用して、SCCA1/A2融合タンパク質を特異的に測定するためのイムノアッセー及びSCCA2とSCCA1の各々に特異的なアッセーを開発することができた。
【0049】
5.1 SCCA1/A2融合タンパク質の測定のためのイムノアッセー(Immunoassays)
SCCA1/A”融合タンパク質に特異的だが、SCCA1とSCCA2には本質的に非反応するアッセーを、SCC107、SCC119あるいはSCC128の抗体と組み合わせて、SCC106、SCCC114あるいはSCC115の抗体を使用することにより設計した。図参照。
【0050】
好ましい構成の抗体においては、SCC107を捕獲抗体(catching antibody)として、SCC106を検出抗体(detecting antibody)として使用した。
【0051】
SCC107 MAbはビオチンNHRSカプロン酸エステル、シグマケミカル コーポレイション(Sigma Chemical Co),米国を用いて標準の操作を使用してビオチニル化し、捕獲抗体として使用した。SCC106 MAbは、、ナコネ(Nakone)操作の改変によりHRPと結合した。
【0052】
ビオチニル化されたSCC107 MAbおよびHRP結合SCC106 MAbを、下記のプロトコルによる2部位EIA(two-site EIA)に使用した。
【0053】
アッセー(assay)操作
1. ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート、ラブシステムズ オーワイ、ヘルシンキ(フィンランド)に、50μlのSCCA組換え抗原(PBS中0−100μg/l、60g/lのBSA、pH 7.2)+100μlのビオチンSCC107 MAb(アッセーバッファー中2μg/ml)を添加する。
2. 振盪しながら1時間±10分間インキュベートする。
3. 5mMのトリス緩衝液、0.05%のトゥイーン40、pH7.75で3回洗浄する。
4. アッセーバッファー中、2μg/mlのHRP SCC106 MAbを100μl加える。
5. 振盪しながら1時間±10分間インキュベートする。
6. 5mMのトリス緩衝液、0.05%のトゥイーン40、pH7.75で6回洗浄する。
7. 100μLのTMB、エリサテクノロジー(ELISA Technology)、米国を加える。
8. 30分間±5分間インキュベートする。
9. ELISAリーダ中でOD620nmを測定する。
【0054】
SCCA1、SCCA2およびSCCA1/A2抗原のための用量−応答曲線により、このアッセーがSCCA1/A2組換え抗原に特異的であり、SCCA1またはSCCA2との交差反応性が5%未満であることを明らかにした。
【0055】
5.2 SCCA2の特異的測定のためのアッセー
SCCA1/A2およびSCCA1とは顕著な反応性がなく、SCCA2に特異的なアッセーを、SCC107、SCC119あるいはSCC128の抗体と組み合わせてSCCC100、SCC103あるいはSCC109の抗体を使用することにより設計した。好ましい構成においては、SCC107 MAbを捕獲抗体として使用し、SCC103を検出抗体として使用した。
【0056】
SCC107 MAbはビオチンNHRSカプロン酸エステル(シグマケミカル コーポレイション,米国)を用いて標準の操作を使用してビオチニル化し、捕獲抗体として使用した。SCC103 MAbは、ナコネ操作の改変によりHRP,タイプV(Type V)(シグマケミカル コーポレイション,米国)と結合した。
【0057】
ビオチニル化されたSCC107 MAbおよびHRP結合SCC103 MAbを、下記のプロトコルによる2部位EIAに使用した。
【0058】
アッセー操作
1. 50μLのSCC組換え抗原(PBS中0−100μg/L、60g/lのBSA、pH 7.2)+100μLを添加する。
2. 振盪しながら1時間±10分間インキュベートする。
3. 5mMのトリス緩衝液、0.05%のトゥイーン40、pH7.75で3回洗浄する。
4. アッセーバッファー中、2μg/mLのHRP SCC103 MAbを100μL加える。
5. 振盪しながら1時間±10分間インキュベートする。
6. 5mMのトリス緩衝液、0.05%のトゥイーン40、pH7.75で6回洗浄する。
7. 100μLのTMB、エリサテクノロジー、米国を加える。
8. 30分間±5分間インキュベートする。
9. ELISAリーダ中でOD620nmを測定する。
【0059】
SCCA2、SCCA1およびSCCA1/A2抗原のための用量−応答曲線により、実施例5.2によるアッセーがSCCA2抗原に特異的であり、SCCA1またはSCCA1/A2との交差反応性が5%未満であるという結論に達した。
【0060】
5.3 SCCA1の特異的測定のためのアッセー
SCCA2およびSCCA1/A2とは顕著な反応性がなく、SCCA1に特異的なアッセーを、SCC107、SCC119あるいはSCC128の抗体と組み合わせてSCCC110、SCC111あるいはSCC124の抗体を使用することにより設計した。好ましい構成においては、SCC107MAbを捕獲抗体として使用し、SCC124 MAbを検出抗体として使用した。
【0061】
SCC107 MAbはビオチンNHRSカプロン酸エステル(シグマケミカル コーポレイション,米国)を用いて標準の操作を使用してビオチニル化し、捕獲抗体として使用した。SCC124 MAbは、ナコネ操作の改変によりHRP,タイプV(シグマケミカル コーポレイション,米国)と結合した。
【0062】
ビオチニル化されたSCC107 MAbおよびHRP結合SCC124 MAbを、下記のプロトコルによる2部位EIAに使用した。
【0063】
アッセー操作
1. ストレプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート、ラブシステムズ オーワイ、ヘルシンキ(フィンランド)に、50μlのSCC抗原(PBS中0−100μg/L、60g/LのBSA、pH 7.2)+100μlのビオチンSCC107 MAb(アッセーバッファー中2μg/mL)を添加する。
2. 振盪しながら1時間±10分間インキュベートする。
3. 5mMのトリス緩衝液、0.05%のトゥイーン40、pH7.75で3回洗浄する。
4. アッセーバッファーに、2μg/mLのHRP SCC124 MAbを100μL加える。
5. 振盪しながら1時間±10分間インキュベートする。
6. 5mMのトリス緩衝液、0.05%のトゥイーン40、pH7.75で6回洗浄する。
7. 100μLのTMB、(エリサテクノロジー、米国)を加える。
8. 30分間±5分間インキュベートする。
9. ELISAリーダ中でOD620nmを測定する。
【0064】
5.3による抗体に基づき、SCCA1に特異的で、SCCA2またはSCCA1/A2抗原との交差反応性が10%未満であるイムノアッセーが設計され得る。
【図面の簡単な説明】
【0065】
【図1】染色体18転位
【図2】SCCA1およびSCCA2のコードDNA領域、エキソン2−8のアラインメント。イントロン位置は−Ix−で示した。遺伝子間の違いは灰色で示す。イタリック体の文字は、反応部位ループをコードする領域を示す。矢印はプライマー(表1)位置を示す。
【図3】SCCA1とSCCA2のタンパク質配列のアラインメント。イントロン位置は点線で示す。タンパク質間の違いは灰色の色調で示す。囲みは反応部位ループを示す。
【図4】転位されたSCCA1/SCCA2ののコードDNA領域、エキソン2−8のヌクレオチド。SCCA1に由来する配列は通常のスタイルで示し、SCCA2に由来する配列は太字で示す。イントロン位置は−Ixで示す。遺伝子間の違いは灰色で示す。イタリック体の文字は、反応部位ループをコードする領域を示す。
【図5】SCCA1/SCCA2融合タンパク質のタンパク質配列。SCCA1に由来するアミノ酸は、通常の文字で示す。SCCA2に由来するアミノ酸は、太字で示す。イントロン位置は点線で示す。タンパク質間の違いは灰色で示す。反応部位ループはボックスで示す。
【図6】SCC抗原へのPABanの力価。
【図7】異なるSCC抗原と確立したハイブリドーマの反応性。
【図8】SCCA1/A2融合タンパク質の複合結合分析。レーンA:SCCA1/A2。レーンB:カテプシンGとインキュベートしたSCCA1/A2。レーンC:カテプシンLとインキュベートしたSCCA1/A2。SCCA1/A2とカテプシンGの複合体は矢印によって示す。分子量マーカーが示されている。
【図9】PstIで消化され、プローブIとハイブリダイズしたゲノムDNAのサザンブロット分析。レーンA:SCCA1/SCCA2融合遺伝子を含むRPMI2650。レーンB:正常なDNA。異常なバンドは矢で示す。分子量マーカーが示されている。
Claims (46)
- 一定の領域、特に交差(cross-over)の領域において80%より高い相同性を有する二つの異なる遺伝子の間で交差する同族体からなる融合転写物。
- 二つの遺伝子がSCCA1及びSCCA2である請求項1記載の融合転写物。
- 基本的なプロモーターに比べてスイッチされた(switched)反応部位ループを有するSCCA1とSCCA2の間の完全長融合転写タンパク質。
- 基本的なプロモーターに比べてスイッチされた反応部位ループを有するSCCA1とSCCA2の間の実質的に完全長の融合転写タンパク質。
- SCCA2遺伝子のエキソン8に融合したSCCA1遺伝子のエキソン2−7の一種以上によりコードされる請求項4記載の融合タンパク質。
- SCCA2遺伝子のエキソン8に融合したSCCA1遺伝子のエキソン2−7によりコードされる請求項1記載の融合タンパク質。
- SCCA1遺伝子のエキソン8に融合したSCCA2遺伝子のエキソン2−7の一種以上によりコードされる請求項4記載の融合タンパク質。
- SCCA1遺伝子のエキソン8に融合したSCCA2遺伝子のエキソン2−7によりコードされる請求項1記載の融合タンパク質。
- 該配列がTAVVVVELSSPSTである請求項3記載の融合タンパク質配列。
- 融合SCCA1/SCCA2タンパク質をコードするDNA配列。
- SCCA2遺伝子のエキソン8に融合したSCCA1遺伝子のエキソン2−7のヌクレオチド配列を含むDNA配列。
- 該DNA配列がCGCTGTAGTAGTAGTCGAATTATCATCTCCTTCAACTである請求項13記載のDNA配列。
- SCCA2遺伝子のエキソン8に融合したSCCA1遺伝子のエキソン2−7の一種以上に対応するヌクレオチド配列を含むプラスミド。
- SCCA2遺伝子のエキソン8に融合したSCCA1遺伝子のエキソン2−7に対応するヌクレオチド配列を含むプラスミド。
- SCCA1遺伝子のエキソン8に融合したSCCA2遺伝子のエキソン2−7の一種以上に対応するヌクレオチド配列を含むプラスミド。
- SCCA1遺伝子のエキソン8に融合したSCCA2遺伝子のエキソン2−7に対応するヌクレオチド配列を含むプラスミド。
- 請求項13記載のヌクレオチド配列を含み、かつ寄託番号ECACC01031315でECACCに寄託された請求項15または16記載のプラスミド。
- SCCA1/SCCA2融合タンパク質の生産のためのタンパク質発現系。
- 請求項15乃至19記載のプラスミドを含む組換え細菌。
- 請求項16記載のプラスミドを含む組換え細菌。
- 請求項15記載のプラスミドを含む組換え大腸菌。
- 請求項16記載のプラスミドを含む組換え大腸菌。
- 腫瘍DNAのcDNAクローニング及び配列解析を用いたSCCA1/SCCA2融合タンパク質を生じる遺伝子転位の検出方法。
- 腫瘍DNAのcDNAクローニング及び配列解析を用いたSCCA2/SCCA1融合タンパク質を生じる遺伝子転位の検出方法。
- 腫瘍DNAにサザンブロット技術を適用してSCCA1/SCCA2融合タンパク質を生じる遺伝子転位の検出方法。
- 腫瘍DNAにサザンブロット技術を適用してSCCA2/SCCA1融合タンパク質を生じる遺伝子転位の検出方法。
- PCR分析技術を用いるSCCA1/SCCA2融合タンパク質を生じる遺伝子転位の検出方法。
- PCR分析技術を用いるSCCA2/SCCA1融合タンパク質を生じる遺伝子転位の検出方法。
- アミノ酸シーケンシング技術を用いるSCCA1/SCCA2融合タンパク質を生じる遺伝子転位の検出方法。
- アミノ酸シーケンシング技術を用いるSCCA2/SCCA1融合タンパク質を生じる遺伝子転位の検出方法。
- ウェスタンブロッティングを用いるSCCA1/A2融合タンパク質の検出方法。
- ウェスタンブロッティングを用いるSCCA2/A1融合タンパク質の検出方法。
- SCCA1/SCCA2融合タンパク質に特異的なモノクローナル抗体。
- SCCA2/SCCA1融合タンパク質に特異的なモノクローナル抗体。
- SCCA1/SCCA2融合タンパク質に特異的なポリクローナル抗体。
- SCCA2/SCCA1融合タンパク質に特異的なモノクローナル抗体。
- SCCA1/SCCA2融合タンパク質に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、SCCA1/SCCA2融合タンパク質の存在及び濃度を検出するためのイムノアッセー。
- SCCA2/SCCA1融合タンパク質に特異的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて、SCCA2/SCCA1融合タンパク質の存在及び濃度を検出するためのイムノアッセー。
- ヒト試料中のSCCA1/SCCA2融合タンパク質を検出することにより、扁平上皮癌の存在または不存在を診断する方法。
- ヒト試料中のSCCA2/SCCA1融合タンパク質を検出することにより、扁平上皮癌の存在または不存在を診断する方法。
- 該融合タンパク質を組織化学分析で用いる請求項41または42記載の方法。
- 扁平上皮癌(SCC)の存在または不存在の決定に使用されるSCCA1/SCCA2融合タンパク質抗体を含むキット。
- 扁平上皮癌(SCC)の存在または不存在の決定に使用されるSCCA2/SCCA1融合タンパク質抗体を含むキット。
- さらにSCCA1及び/またはSCCA2に関する抗体を含む請求項44または45記載のキット。
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