ES2315349T3 - Genes ii de antigeno de carcinoma de celula escamosa reordenados. - Google Patents

Abstract

Transcrito de fusión consistente en un cruzamiento homólogo entre dos genes diferentes con más de un 80% de homología de secuencia en ciertas regiones, caracterizado porque los cruzamientos están codificados por los exones 2-7 del gen SCCA1 fusionados con el exón 8 del gen SCCA2, y los exones 2-7 del gen SCCA2 fusionados con el exón 8 del gen SCCA1.

Description

Genes II de antígeno de carcinoma de célula escamosa reordenados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un gen de fusión encontrado en carcinomas de células escamosas, a la detección de la reordenación y a anticuerpos monoclonales específicos de SCCA1, SCCA1/A2, SCCA2/A1 y SCCA2.

Antecedentes de la invención

El antígeno de carcinoma de células escamosas (SCCA en inglés) es un marcador serológico de carcinomas de células escamosas (SCC en inglés) de cuello uterino, pulmón, cabeza y cuello, vulva y esófago (1, 2). Se purificó originalmente a partir del complejo TA-4 de carcinoma de células escamosas cervicouterinas humanas, con un peso molecular de 42-48 kDa (1, 3). El antígeno consiste en más de 10 proteínas y el enfoque isoeléctrico del antígeno revela dos subfracciones, una isoforma ácida (pI< 6,25) y una neutra (pI\geq 6,25) (4). La diferencia en el peso molecular es probablemente debido a la modificación (5).

La clonación del ADNc de SCCA muestra que pertenece a la familia de los inhibidores de serinproteasas (serpinas) (6). La clonación adicional de la región genómica del cromosoma 18q21.3 revela dos genes dispuestos en serie (7). El más telomérico, el SCCA original, se designó SCCA1, mientras que el más centromérico se designó SCCA2 (Figura 1A). Ambos contienen ocho exones y los supuestos límites intrón-exón, sitios de corte y empalme, codones de iniciación y codones terminales son idénticos. Son un 98% idénticos a nivel nucleotídico (Figura 2) y un 92% idénticos a nivel aminoacídico (Figura 3). El valor de pI deducido muestra que la isoforma neutra está codificada por SCCA1, y la isoforma ácida por SCCA2. Como alternativa, se ha encontrado una variante cortada y empalmada de ARNm de ambos genes que da como resultado proteínas de 52 y 21 aminoácidos más cortas (5).

En seres humanos, las serpinas se cartografían en uno de dos complejos cromosómicos. PI6, PI9 y ELNAH2 se cartografían en 6p25, mientras que PI8, bomapina (del inglés bone marrow serine protease inhibitor), PAI2, SCCA1, SCCA2, headpina (del inglés head and neck serine protease inhibitor) y maspina (del inglés mammary serine protease inhibitor) se cartografían en 18q21.3 (Figura 1A) (7-12). Se supone que estos complejos han surgido mediante dos duplicaciones intercromosómicas independientes y varias rondas de duplicaciones intracromosómicas (9). La región cromosómica 18q se ha reseñado a menudo como una región con una alta frecuencia de reordenamientos (9, 13-16). Las dianas y funciones de las serpinas no se conocen completamente. Para la mayoría, las funciones primarias son la regulación de eventos proteolíticos asociados a coagulación, fibrinólisis, apoptosis e inflamación, pero se han reseñado funciones alternativas tales como transporte hormonal y regulación de la presión sanguínea
(17-24).

Aunque SCCA1 y SCCA2 son casi idénticos, difieren en sus bucles de sitio reactivo (Figuras 2 y 3). El SCCA1 inhibe las cisteinproteinasas similares a papaína catepsina S, K y L (25, 26), mientras que el SCCA2 inhibe las serinproteasas similares a quimotripsina catepsina G y quimasa de mastocitos (27). Los estudios del bucle de sitio reactivo (RSL en inglés) del SCCA1 muestran que el RSL es esencial para la inhibición de la cisteinproteinasa (28). La porción variable del RSL dicta la especificidad de las proteinasas diana mostrada por los mutantes de sustitución de RSL de SCCA1 y SCCA2 y mutantes sencillos (28, 29). Es probable que las serpinas utilicen un mecanismo dependiente de RSL común para inhibir tanto serin- como cisteinproteinasas.

El papel biológico del SCCA1 y el SCCA2 no se conoce completamente. Se considera que son serpinas inhibidoras. Los datos sugieren que el SCCA1 está implicado en la apoptosis y su expresión hace a las células cancerosas resistentes a varios mecanismos de destrucción mediante la inhibición de la apoptosis (30). El papel de la expresión del SCCA2 en células cancerosas no está claro todavía. En tejido normal, el antígeno SCCA puede tener algún papel específico durante la maduración epidérmica (5).

Estudios recientes que usaban anticuerpos monoclonales discriminatorios y reacción en cadena con polimerasa (PCR) han mostrado que tanto el SCCA1 como el SCCA2 se expresan en las capas suprabasales del epitelio escamoso estratificado de la lengua, amígdala, esófago, cuello uterino y vagina, corpúsculos de Hassall del timo, algunas zonas de la piel y en el epitelio columnar estratificado de las vías respiratorias conductoras (31). En carcinomas de células escamosas de pulmón y cabeza y cuello, se coexpresaban SCCA1 y SCCA2 en tumores moderadamente y bien diferenciados. En contraposición con estudios anteriores que usaban anticuerpos no discriminatorios, estos datos muestran que no había expresión diferencial entre SCCA1 y SCCA2 en tejido normal y maligno. Los estudios anteriores han mostrado que el SCCA2 se detectaba sólo en las partes periféricas del tumor (32). Esta discrepancia puede deberse a diferencias entre las técnicas inmunohistoquímicas y las especificidades de anticuerpo (31). Se ha reseñado que los resultados falsos positivos pueden estar causados a menudo por contaminación con saliva o sudor durante el procedimiento de ensayo (1). Cataltepe et al. sugieren que los SCCA de la saliva derivan de las células epiteliales escamosas que recubren las superficies mucosas del tracto digestivo superior (31).

Normalmente, se detectan SCCA1 y SCCA2 en el citoplasma de células epiteliales escamosas (31), pero no en la circulación (33). El antígeno, que aparece en el suero de pacientes con SCC, puede ser una función de la sobreproducción de SCCA por células tumorales y su recambio normal (34). Se ha reseñado que el SCCA detectado en suero usando radioinmunoensayo de anticuerpo o PCR-TI es principalmente SCCA2 (1, 35, 36), pero otros estudios que usan PCR indican que pueden amplificarse y detectarse ambos antígenos en muestras de pacientes (37).

Las concentraciones séricas presentes en pacientes con SCC se correlacionan con la etapa clínica y con el grado de diferenciación histológica del tumor (1). Para el cáncer de cuello uterino, varios estudios muestran una correlación entre los valores de pretratamiento y el resultado clínico (1, 38-43). Los estudios muestran también una correlación entre altos niveles de SCCA y volumen tumoral. La recurrencia o enfermedad progresiva podría detectarse varios meses antes de la evidencia clínica (39). Se observan resultados similares para carcinomas de células escamosas de pulmón, vulva, cabeza y cuello y esófago (1, 2, 44 y 45). En todos estos estudios, se ha medido el nivel de SCCA total. Recientemente, se ha desarrollado un nuevo sELISA usando anticuerpos discriminatorios de SCCA1 y SCCA2 (33).

Compendio de la invención

La presente invención proporciona la detección de un gen de fusión constituido por SCCA1 y SCCA2. Este gen de fusión se ha encontrado ahora en estirpes celulares de SCC de diferente origen (cuello uterino, pulmón y faringe). La invención proporciona también métodos para el establecimiento de reactivos inmunológicos específicos para la determinación/detección de la proteína de fusión.

La proteína de fusión se define mediante la siguiente secuencia aminoacídica

1

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basada en la secuencia de ADN

2

Descripción de realizaciones específicas

Se encontró el gen de fusión (Figura 4) secuenciando ADNc de estirpes celulares SCC.

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3

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Según el desplazamiento de secuencia de SCCA1 a SCCA2, el punto de ruptura de ADN estaría en el intrón 7 (Figura 2). El gen debería estar controlado por consiguiente mediante la región promotora de SCCA1, pero producir una proteína con especificidad de SCCA2.

Los genes de fusión se clonan y se mantienen como constructos de plásmido, así como se transforman en diferentes cepas de E. coli.

Se ha depositado un plásmido, pGEX6P-3 SCCA1/A2, que contiene el gen de fusión en la "European Collection of Cell Cultures" el 14 de marzo de 2001, con número de depósito ECACC 01031315.

Se ha producido la proteína de fusión y los estudios de unión a complejo muestran unión a sustrato del gen de fusión con catepsina G pero no con catepsina L.

El gen de fusión puede detectarse mediante análisis de transferencia Southern de ADN tumoral. El gen de fusión puede detectarse también mediante análisis de PCR así como mediante clonación y secuenciación de ADNc.

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Ejemplo 1 Clonación de SCCA 1.1. Amplificación por PCR

Se preparó ARNm a partir de las estirpes celulares Caski (cuello uterino), C4-I (cuello uterino), A549 (pulmón), CaLu3 (pulmón), SkMes (pulmón) y RPMI2650 (faringe) usando el kit de purificación de ARNm QuickPrep Micro (Pharmacia) y se preparó ADNc usando el kit de síntesis de ADNc First-Strand (Pharmacia). Se amplificó un fragmento de ADN de 1218 pb que cubre la secuencia de codificación de SCCA mediante PCR en una reacción de 100 \mul que contiene Tris-HCl 10 mM, pH 8,85, KCl 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 5 mM, MgSO_{4} 2 M (Boehringer), dNTP 0,2 mM (Pharmacia), SCCA 1-7F 10 \muM (las secuencias de ADN para todos los cebadores se muestran en la Tabla 1), SCCA 391-397B 10 \muM, 2 \mul de ADNc y 2,5 U de polimerasa Pwo (Boehringer). Después de desnaturalizar las muestras durante 5 min a 96ºC, se efectuaron un total de 30 ciclos, constituido cada uno por desnaturalización durante 15 s a 96ºC, asociación durante 15 s a 60ºC y extensión durante 30 s a 72ºC. Se completó la reacción PCR mediante una extensión final de 10 min a 72ºC.

TABLA 1 Cebadores de PCR

5

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1.2. Detección de SCCA1 y SCCA2

Se detectó la presencia de SCCA1 en productos de PCR mediante escisión con la enzima de restricción SacII, dando como resultado dos fragmentos, de 245 y 973 pb, respectivamente, o mediante PCR específica de SCCA1 usando los cebadores SCCA1-7F y SCCA1 323-329B en una reacción PCR estándar (Tris-HCl 75 mM, pH 8,8, (NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, 0,01% de Tween 20, MgCl_{2} 2 mM, dNTP 0,2 mM, 10 \muM de cada cebador, molde y 0,025 U de polimerasa Taq/\mul de reacción; después de desnaturalizar muestras durante 5 min a 96ºC, se efectuaron un total de 30 ciclos, constituido cada uno por desnaturalización durante 15 s a 96ºC, asociación durante 15 s a la temperatura de asociación óptima y extensión durante 30 s a 72ºC. Se completó la reacción PCR mediante una extensión final durante 10 min 72ºC), Ta=50ºC, dando como resultado un fragmento de 997 pb. Se detectó la presencia de SCCA2 mediante PCR estándar usando SCCA 1-7F y un cebador específico de SCCA2, SCCA2 357-363B, Ta=60ºC, dando un fragmento de 1090 pb.

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1.3. Clonación

Se clonaron los productos de PCR usando el kit de clonación PCR-Script Amp (Stratagene). Se efectuó el examen de colonias mediante PCR como se describe en 1.2 anteriormente. Se preparó ADN de plásmido a partir de clones seleccionados que contenían SCCA1 o SCCA2 usando el sistema de purificación de ADN Wizard Plus Minipreps (Promega).

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1.4. Secuenciación de ADN

Se secuenciaron los clones usando ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing (PE Biosystems). Se procesaron las muestras en un ABI Prism 310.

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1.5. Reclonación

Se reclonaron genes seleccionados en el vector de expresión pGEX-6P-3 (Pharmacia). Se escindieron los fragmentos del vector PCR-Script Amp usando BamHI y XhoI y se ligaron en el vector de expresión en una reacción de 10 \mul que contenía 1 x OPA, ATP 1 mM, 50 ng de vector escindido, inserto de SCCA correspondiente a un vector de moles de extremos: relación de inserción de 1:5-1:8, y 7,5-10 U de ADN ligasa de T4 (todo de Pharmacia). Se incubaron los tubos de reacción a 10ºC durante una noche y se inactivaron durante 10 min a 65ºC. Se transformaron 2-4 \mul de la reacción en JM109 de E. coli (46). Se transformó entonces ADN de plásmido de clones seleccionados en BL21 de E. coli para expresión de proteína.

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1.6. Mantenimiento del gen clonado

Se almacena el ADN de plásmido (pGEX-6P-3 que contiene el gen de fusión SCCA1/A2) en una disolución tampón de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 a -80ºC. Para retomar la expresión de proteína, se transforma el ADN de plásmido en BL21 de E. coli competentes según Sambrook et al. (p 1.82-1.84 en la ref. 45). Para la preparación de más ADN de plásmido, se prefiere la transformación en JM109 de E. coli.

Ejemplo 2 Expresión y purificación de proteína 2.1. Expresión de proteína

Se determinaron las condiciones de expresión mediante preparaciones a pequeña escala. Para expresión a gran escala, se inocularon cultivos de 500 ml de 2 x YT y ampicilina 100 \mul/ml con 5 ml durante una noche y se cultivaron a 37ºC. Se indujo la expresión de proteína a DO_{600}=0,5-1,3 añadiendo IPTG a una concentración final de 0,1 mM. Se cultivaron los cultivos productores de SCCA1 durante 4-16 h, los de SCCA1/A2 durante 16-18 h. Se indujeron los cultivos productores de proteína SCCA2 a DO_{600} = 1,2-1,4 y se cultivaron durante 2-3 h.

2.2. Purificación de proteína

Se recogieron las células mediante centrifugación durante 10 min a 2.000 g, se lavaron con 50 ml de TE a pH 8,0 y se disolvieron en 3 ml de TE/g de sedimento bacteriano. Se añadió lisozima a una concentración final de 800 \mug/g de sedimento, se incubaron las mezclas en hielo durante 30-60 min y después se congelaron durante una noche a -70ºC. Se añadieron cloruro de magnesio y ADNasa a una concentración final de 12 mM y 20 \mug/g de sedimento, respectivamente. Después de la incubación en hielo durante 30 min, se centrifugaron las muestras durante 30 min a 40.000 g. Se añadieron a cada sobrenadante 0,5 ml de Sepharose de glutation al 50% (Pharmacia) y se incubaron durante 30 min-2 h a temperatura ambiente con agitación suave. Se lavó la suspensión densa 5-7 veces usando 1 x PBS, se eluyó la proteína de fusión GST-SCCA usando 0,5-1 ml de glutation reducido (Pharmacia) y se incubó durante 30-60 min a temperatura ambiente o durante una noche a 4ºC, todo con agitación suave. Se eluyó la proteína SCCA mediante escisión entre GST y SCCA. Se añadieron 0,48 ml de tampón de escisión (Tris-HCl 50 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM) y 20 \mul de proteasa PreScission y se incubaron las muestras a 4ºC con agitación suave durante 4 h o durante una noche. Se analizaron las proteínas por PAGE-SDA mediante un sistema Phast (Pharmacia).

2.3. Unión de complejo

Se efectuó la unión de complejo de SCCA a sustratos mezclando 2 \mug de proteína SCCA con 0,5 \mug de catepsina G (Biodesign Int.) o 0,5 \mug o 0,9 \mug de catepsina L (Calbiochem) en 1 x tampón PBS en un volumen total de 4,5 \mul. Se incubaron las muestras a 37ºC durante 30 minutos. Se añadieron a cada muestra 0,5 \mul de 10 x tampón Complex (20% de SDS, mercaptoetanol 140 mM, azul de bromofenol). Se incubaron las muestras durante 3 minutos a 95ºC y se analizaron en un gel PAGE-SDS al 12,5%. La proteína de fusión SCCA1/A2 forma un complejo con catepsina G pero no con catepsina L, mostrando que la proteína de fusión es funcional y tiene la especificidad de sustrato de SCCA2.

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Ejemplo 3 Análisis de ADN 3.1. Análisis de transferencia Southern

Se digirieron aproximadamente 10 \mug de ADN, preparado a partir de estirpes celulares de SCC así como a partir de muestras de sangre de voluntarios sanos normales, con las endonucleasas de restricción PstI o BamHI. Se separó el ADN digerido en agarosa al 0,8% y se transfirió a membranas (Hybond N+, Pharmacia). Se prehibridaron los filtros durante 1 h y se hibridaron durante una noche a 60ºC en 20 ml de una disolución que contenía 5 x SSC, 0,1% de SDS, 5% de sulfato de dextrano, Liquid block (Pharmacia) diluido 1:20 y ADN de esperma de salmón 100 \mug/ml. La concentración de sonda durante la hibridación fue de 10 ng/ml. Después de la hibridación, se lavaron rigurosamente los filtros durante 15 min con 1 x SSC/0,1% de SDS y durante 15 min con 0,2 x SSC/1% de SDS, ambos a 60ºC. Se detectó la hibridación de sonda usando el módulo de detección Gene Images CDP-Star (Pharmacia) con modificaciones menores. Se bloquearon los filtros durante 1 hora a temperatura ambiente en una disolución que contenía Liquid block diluido 1:7,5. Se incubaron después en tampón A (Tris 0,1 M, NaCl 0,3 M, pH 9,5)/0,5% de BSA durante 15 min antes de añadir el conjugado de anti-fluoresceína HRP diluido 1:6800, y se incubaron después durante otros 45 min. Se lavaron los filtros durante 3 x 10 min con tampón A/0,3% de Tween 20 antes de añadir el reactivo de detección. Se incubaron los filtros durante 2 min, se lavaron brevemente con 2 x SCC y se envolvieron en película de plástico. Se expuso Hyperfilm MP durante 35 min.

3.2. Sondas de hibridación

Se generaron sondas y se marcaron mediante PCR en una reacción que contenía 60 \muM de cada uno de dATP, dCTP y dGTP, 24 \muM de dTTP, 40 \muM de fluorescein-11-dUTP, MgCl_{2} 2 mM, 3 \muM de cebador directo, 3 \muM de cebador inverso, 15 ng de ADN molde (plásmido que contiene SCCA2), 1 U de polimerasa Taq y 1 x tampón PCR (Advanced Biotechnologies). Sonda I: un fragmento de 393 pb del exón 8 (nucleótidos 802-1194), cebadores SCCA 266-273F y SCCA 391-397B, Ta=50ºC; sonda II: un fragmento de 126 pb del exón 8 (nucleótidos 957-1082), cebadores SCCA2 319-324F y SCCA2 357-363B, Ta=50ºC; sonda III: un fragmento de 1194 pb que cubre la secuencia de codificación y 22 nucleótidos en el extremo 3' del gen, cebadores SCCA 1-7F y SCCA 391-397B, Ta=60ºC.

La transferencia Southern de ADN digerido con PstI hibridado con la sonda I muestra un patrón de bandas diferente de ADN de una estirpe celular SCC comparado con el de un ADN de control normal. El ADN digerido con BamHI muestra también bandas aberrantes en comparación con ADN de control normal.

3.3. Análisis por PCR

El ADN aislado mediante procedimientos rutinarios a partir de muestras analizadas mediante PCR usando los cebadores 7 y 8 (véase la Tabla 1) en una reacción PCR estándar muestra producto sólo en muestras que contienen el gen de fusión.

Ejemplo 4 Hibridomas y anticuerpos monoclonales 4.1. Establecimiento de hibridomas y producción de anticuerpos monoclonales reactivos con SCCA1/A2, SCCA2 y SCCA1

Se obtuvieron antisueros policlonales reactivos con el antígeno de SCC mediante inmunización subcutánea de conejos con antígeno de SCC recombinante y recogida de los sueros inmunes según procedimientos estándar. Se ensayó el título de los antisueros policlonales mediante la determinación de la reactividad de los antisueros con SCCA1/A2 y SCCA1 biotinilados inmovilizados en placas de estreptavidina (Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia), (Figura 6). Se biotinilaron SCCA1/A2 recombinante y SCCA1 con éster caproato de biotin-N-succinimida según procedimientos estándar.

Se establecieron los anticuerpos monoclonales reactivos con SCCA1/A2 y SCCA2 mediante inmunización de ratones Balb/c por vía intraperitoneal con 10-50 \mug de SCCA1/A2 recombinante en coadyuvante Ribi. Después de la inmunización y 2-4 dosis de recuerdo durante 60-90 días, se fusionaron células de bazo de los ratones inmunizados con células de mieloma P3 x 63Ag 8 como se ha descrito (47).

Se seleccionaron hibridomas productores de anticuerpos que reaccionan con SCCA1/A2 mediante examen con ELISA de los sobrenadantes de hibridoma en pocillos de microvaloración recubiertos con antisuero policlonal purificado por afinidad contra IgG + M de ratón, (Jackson Immuno Res Lab, EE.UU.). Se incubaron después los pocillos con antígeno SCCA1/A2, y después de lavar se detectó el antígeno unido mediante incubación con anti-SCC policlonal de conejo e Ig de cerdo anti-conejo marcada con HRP (Dako AS, Copenhague, Dinamarca).

4.2. Reactividad de hibridomas seleccionados con antígenos de SCC

Se ensayó la reactividad de los hibridomas establecidos en un ELISA similar al procedimiento de examen ELISA. Brevemente, se inmovilizaron los anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas en placas de microvaloración recubiertas con antisuero policlonal contra IgG + M de ratón (Jackson Immuno Res Lab, EE.UU.). Se incubaron después los pocillos con 50 \mul de los diferentes antígenos de SCC recombinante en PBS con 1% de BSA durante 1 h, después de lavar las placas se incubaron con 100 \mul de anti-SCC de conejo diluido 1/5000 en PBS-1% de BSA y se incubaron durante 1 h adicional. Se detectó entonces el anti-SCC de conejo unido mediante incubación con Ig de cerdo anti-conejo marcada con HRP y se visualizó con sustrato OPD y determinación de la DO a 450 nm.

En la Figura 7, se muestra la reactividad de hibridomas seleccionados. Los SCC106, SCC114 y SCC115 reaccionaron sólo con SCCA1/A2, lo que indica que son específicos de la proteína de fusión SCCA1/A2. Los SCC100, SCC103 y SCC109 reaccionaron con SCCA2 y SCCA1/A2 pero no con SCCA1, indicando que son específicos de SCCA2. Los SCC110, SCC111 y SCC124 reaccionaron con SCCA1 y SCCA1/A2 pero no con SCCA2, sugiriendo que son específicos de SCCA1.

Los SCC107, SCC119 y SCC128 reaccionaron con todos los antígenos de SCC, sugiriendo que reconocen un epítopo común en SCCA1 y SCCA2.

Se produjeron clones clonados a dos veces la dilución limitante productores de anticuerpos que reaccionan con SCCA1/A2 pero son negativos de SCCA1.

Se produjeron anticuerpos monoclonales mediante cultivo in vitro de los clones de hibridoma mediante inoculación de 10^{4} células/ml en DMEM, 5% de suero fetal de ternero en matraces rodantes y se dejaron crecer durante 10-14 días. Se purificaron después los anticuerpos monoclonales del medio de cultivo mediante cromatografía de afinidad con proteína A (Bioprocessing Ltd, Durham, R.U.) según la recomendación de los fabricantes.

Ejemplo 5

Usando los anticuerpos monoclonales y proteínas recombinantes establecidos, fue posible desarrollar inmunoensayos para la determinación específica de la proteína de fusión SCCA1/A2 y ensayos específicos de SCCA2 y SCCA1, respectivamente.

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5.1. Inmunoensayos para la determinación de la proteína de fusión SCCA1/A2

Se diseñaron ensayos específicos de la proteína de fusión SCCA1/A2 pero esencialmente negativos de SCCA1 y SCCA1 usando anticuerpos entre SCC106, SCCC114 o SCC115 en combinación con anticuerpos entre SCC107, SCC119 o SCC128, véase la figura 7. En la configuración preferida, se usó el anticuerpo SCC107 como anticuerpo de captura y SCC106 como anticuerpo detector.

Se biotiniló el mAb SCC107 con éster caproato de biotina-NHRS, Sigma Chemical Co, EE.UU., usando procedimientos estándar, y se usó como anticuerpo de captura. Se conjugó el mAb SCC106 con HRP según una modificación del procedimiento de Nakone.

Se usaron el mAb SCC197 biotinilado y el mAb SCC106 conjugado con HRP en EIA de dos sitios según el siguiente protocolo. Procedimiento de ensayo

1.

Añadir 50 \mul de antígeno recombinante de SCCA (0-100 \mug/l en PBS, BSA 60 g/l, pH 7,2) + 100 \mul de mAb biotina-SCC107, 2 \mug/ml, en tampón de ensayo a placas de microvaloración recubiertas con estreptavidina, Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia.

2.

Incubar durante 1 h \pm 10 min con agitación.

3.

Lavar 3 veces con tampón Tris 5 mM, 0,05% de Tween 40, pH 7,75.

4.

Añadir 100 \mul de mAb HRP-SCC106, 2 \mug/ml, en tampón de ensayo.

5.

Incubar durante 1 h \pm 10 min con agitación

6.

Lavar 6 veces con tampón Tris 5 mM, 0,05% de Tween 40, pH 7,75.

7.

Añadir 100 \mul de TMB, ELISA Technology, EE.UU.

8.

Incubar durante 30 min \pm 5 min.

9.

Determinar la DO a 620 nm en lector ELISA.

Las curvas de dosis y respuesta para antígenos SCCA1, SCCA2 y SCCA1/A2 reveló que el ensayo era específico del antígeno recombinante SCCA1/A2 con <5% de reactividad cruzada con SCCA1 o SCCA2.

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5.2. Ensayos para la determinación específica de SCCA2

Se diseñaron ensayos específicos de SCCA2 sin reactividad significativa con SCCA1/2 y SCCA1 usando anticuerpos entre SCC100, SCC103 o SCC109 en combinación con anticuerpos entre SCC107, SCC119 o SCC128. En la configuración preferida, se usó el mAb SCC107 como anticuerpo de captura y SCC103 como anticuerpo detector.

Se biotiniló el mAb SCC107 con éster caproato de biotina-NHRS (Sigma Chemical Co, EE.UU.) usando procedimientos estándar, y se usó como anticuerpo de captura. Se conjugó el mAb SCC103 con HRP de tipo V (Sigma Chemical Co, EE.UU.), según una modificación del procedimiento de Nakone.

Se usaron el mAb SCC107 biotinilado y el mAb SCC103 conjugado con HRP en EIA de dos sitios según el siguiente protocolo. Procedimiento de ensayo:

1.

Añadir 50 \mul de antígeno recombinante de SCC (0-100 \mug/l en PBS, BSA 60 g/l, pH 7,2) + 100 \mul de mAb biotina-SCC107, 2 \mug/ml, en tampón de ensayo en placas de microvaloración recubiertas con estreptavidina (Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia).

2.

Incubar durante 1 h \pm 10 min con agitación.

3.

Lavar 3 veces con tampón Tris 5 mM, 0,05% de Tween 40, pH 7,75.

4.

Añadir 100 \mul de mAb HRP-SCC103 2 \mug/ml en tampón de ensayo.

5.

Incubar durante 1 h \pm 10 min con agitación.

6.

Lavar 6 veces con tampón Tris 5 mM, 0,05% de Tween 40, pH 7,75.

7.

Añadir 100 \mul de TMB, ELISA Technology, EE.UU.

8.

Incubar durante 30 min \pm 5 min.

9.

Determinar la DO a 620 nm en lector ELISA.

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Basándose en las curvas de dosis y respuesta para SCCA2, SCCA1 y la proteína de fusión SCCA1/A2, se concluyó que el ensayo según el ejemplo 5.2 era específico de SCCA2 con una reactividad cruzada < 5% por SCCA1 y SCCA1/A2.

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5.3. Ensayos para la determinación específica de SCCA1

Se diseñaron ensayos específicos de SCCA1 sin reactividad significativa con SCCA2 y SCCA1/A2 usando anticuerpos entre SCC110, SCC111 o SCC124 en combinación con anticuerpos entre SCC107, SCC119 o SCC128. En las configuraciones preferidas, se usó el mAb SCC107 como anticuerpo de captura y el mAb SCC124 como anticuerpo detector.

Se biotiniló el mAb SCC107 con éster caproato de biotina-NHRS (Sigma Chemical Co, EE.UU.) usando procedimientos estándar, y se usó como anticuerpo de captura. Se conjugó el mAb SCC124 con HRP de tipo V (Sigma Chemical Co., EE.UU.) según una modificación del procedimiento de Nakone.

Se usaron el mAb SCC107 biotinilado y el mAb SCC124 conjugado con HRP en EIA de dos sitios según el siguiente protocolo. Procedimiento de ensayo:

1.

Añadir 50 \mul de antígeno de SCC (0-100 \mug/l en PBS, BSA 60 g/l, pH 7,2) + 100 \mul de mAb biotina-SCC107, 2 \mug/ml, en tampón de ensayo a placas de microvaloración recubiertas con estreptavidina (Labsystems Oy, Helsinki, Finlandia).

2.

Incubar durante 1 \pm 10 min con agitación.

3.

Lavar 3 veces con tampón Tris 5 mM, 0,05% de Tween 40, pH 7,75.

4.

Añadir 100 \mul de mAb HRP-SCC124, 2 \mug/ml, en tampón de ensayo.

5.

Incubar durante 1 h \pm 10 min con agitación.

6.

Lavar 6 veces con tampón Tris 5 mM, 0,05% de Tween 40, pH 7,75.

7.

Añadir 100 \mul de TMB, (ELISA Technology, EE.UU.).

8.

Incubar durante 30 min \pm 5 min.

9.

Determinar la DO a 620 nm en lector ELISA.

Basándose en los anticuerpos según 5.3, pueden diseñarse inmunoensayos específicos de SCCA1 con < 10% de reactividad cruzada por antígeno SCCA2 o SCCA1/A2.

Leyendas de las figuras

1.

Reordenación del cromosoma 18.

2.

Alineamiento de las regiones de ADN codificantes, exón 2-8 de SCCA1 y SCCA2. Las posiciones de intrón se indican como -Ix-. Las diferencias entre los genes se indican en negrita. Las regiones que codifican bucles de sitio reactivo se muestran en letras minúsculas.

3.

Alineamiento de las secuencias proteicas de SCCA1 y SCCA2. Las posiciones de intrón se indican con líneas de puntos. Las diferencias entre las proteínas están subrayadas. Los recuadros muestran los bucles de sitio reactivo.

4.

Región de ADN codificante nucleotídica, exón 2-8 de SCCA1/SCCA2 reordenado. Se muestran las secuencias derivadas de SCCA1 en estilo normal, mientras que las secuencias derivadas de SCCA2 se muestran en negrita. Las posiciones de intrón se indican como -Ix-. Las diferencias entre los genes están subrayadas. La región que codifica el bucle de sitio activo se muestra en letras minúsculas.

5.

Secuencia proteica de la proteína de fusión SCCA1/SCCA2. Los aminoácidos derivados de SCCA1 se muestran en letras normales. Los aminoácidos derivados de SCCA2 se muestran en negrita. Las posiciones de intrón se indican con líneas de puntos. Las diferencias entre las proteínas están subrayadas. El bucle de sitio reactivo está marcado con un recuadro.

6.

Título de pAB a antígeno de SCC.

7.

Reactividad de hibridomas establecidos con diferentes antígenos de SCC

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41. de Bruijn, H. W., Duk, J. M., van der Zee, A. G., Pras, E., Willemse, P. H., Boonstra, H., Hollema, H., Mourits, M. J., de Vries, E. G. y Aalders, J. G. (1998) Tumour Biol. 19, 505-16.

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Claims (7)

1. Transcrito de fusión consistente en un cruzamiento homólogo entre dos genes diferentes con más de un 80% de homología de secuencia en ciertas regiones, caracterizado porque los cruzamientos están codificados por los exones 2-7 del gen SCCA1 fusionados con el exón 8 del gen SCCA2, y los exones 2-7 del gen SCCA2 fusionados con el exón 8 del gen SCCA1.

2. Un transcrito de fusión según la reivindicación 1, en el que la secuencia proteica es

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

3. Una secuencia de ADN que comprende la secuencia nucleotídica de los exones 2-7 del gen SCCA1 fusionada con la secuencia nucleotídica del exón 8 del gen SCCA2.

4. Una secuencia de ADN según la reivindicación 3, en la que la secuencia nucleotídica es

\vskip1.000000\baselineskip

7

70

5. Plásmido que comprende la secuencia nucleotídica correspondiente a los exones 2-7 del gen SCCA1 fusionada con la secuencia nucleotídica del exón 8 del gen SCCA2.

6. Plásmido que comprende la secuencia nucleotídica correspondiente a los exones 2-7 del gen SCCA2 fusionada con el exón 8 del gen SCCA1.

7. Plásmido según la reivindicación 5, que comprende la secuencia nucleotídica de la reivindicación 4, y depositado en la ECACC con el número de depósito ECACC 01031315.