JP2004516823A - タンパク質に対するホスホキナーゼ活性の定量のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明の背景
本出願は、2000年9月27日に提出された、仮出願番号60/235,620の優先権を主張する。
【0002】
技術分野
本発明は、インビトロでのプロテインキナーゼ活性の測定についてのアッセイおよび試薬に関する。
【0003】
背景技術
薬物開発の努力は、分子の標的選択によって開始される活動の連続を伴う。あらゆる薬物が、細胞レベルで働くので、これらの標的は、通常、とにかく細胞伝達経路に関わり合うタンパク質である。シグナル伝達経路は、正常な細胞機能に不可欠である。細胞内分子の発現の異常、およびシグナル伝達経路の同等の相互作用は、種々の疾患に関連し、従って、薬物発見努力の焦点である。シグナル伝達経路におけるタンパク質のリン酸化は、多細胞生物に生じる重要な共有結合修飾の1つである。この修飾を行う酵素は、プロテインキナーゼであり、これは、リン酸のATPからタンパク質基質上のチロシン残基、セリン残基またはスレオニン残基への転移を触媒する。これらのアミノ酸残基のリン酸化は、酵素活性を調節し、そして下流のシグナリングタンパク質の補充についての結合部位を作製する。プロテインキナーゼは、細胞のシグナリング経路の重大な構成要素であるので、これらの触媒活性は、厳密に調節される。プロテインキナーゼ活性の異常は、リン酸化のパターンを変更し、結果として細胞機能に対して影響を及ぼす。多くの薬物発見努力は、選択的にプロテインキナーゼ活性を抑制する化学薬品の同定を伴う。本発明は、プロテインキナーゼ活性をモニターするためのアッセイおよび試薬を提供するように設計される。
【0004】
リン酸化についての標的残基は、組換え起源または天然の起源の生物学的に活性のある分子の全長に含まれ得る。プロテインキナーゼ活性の測定について現在利用される大半の方法は、ペプチド基質を使用し、これは、標的されるリン酸化残基を含む。この分野は、本明細書中において参考として援用される米国第6,066,462号(個々のプロテインキナーゼ活性の定量)に教示される。この方法は、本発明と、ペプチド基質が、キナーゼによって作用されリン酸化され得るすべての部位を含まず、従って、天然のタンパク質に対する活性を正確には反映しないかもしれない点で異なる。本明細書中に記載される発明は、天然の起源または組換え起源の全体の分子またはフラグメントを用いて使用され得る。また、異なる残基部位での活性の記述は、本発明において、米国第6,066,462号における異なるペプチドとは対照的に、検出について異なるPSSAを必要とする。
【0005】
キナーゼ活性の検出についての別の方法は、すべてのホスホチロシン残基に結合する一般的抗体の使用を伴う。この方法は、本明細書中で参考として援用される米国第5,766,863号(キナーゼレセプター活性化アッセイ)に記載される。この方法は、分子に対するリン酸化チロシン残基間を区別する能力がないことを欠点として有する。この方法はまた、ホスホセリン分子またはホスホスレオニン分子を検出することができない。なぜなら、この抗体は、このようなリン酸化残基を検出しないからである。対照的に、本明細書中に記載される方法は、抗体を使用し、この抗体は、リン酸化アミノ酸およびホスホ残基自身の周囲の配列特異的残基に結合する。本発明において使用される試薬は、リン酸化スレオニン分子、リン酸化セリン分子またはリン酸化チロシン分子を検出し得る。
【0006】
3つの例が利用される;これらのすべては、疾患に向けられる薬学的研究において、現在興味深い重要な分子標的を含む。
【0007】
現在、神経生物学者らは、疾患に関連し得る脳のタンパク質に対する努力に集中している。1つのこのようなタンパク質は、タウ(主に軸索において見出される神経細胞の微小管結合タンパク質)と呼ばれる。タウの機能は、チューブリン重合を促進すること、および微小管を安定することであるが、また、特定のシグナリング経路を細胞骨格に関連させるのに役立つ。タウのリン酸化は、このタンパク質の正常機能および病理学的機能の両方を調節する。タウ(その過剰リン酸化(hyper−phosphorylated)形態において)は、二重らせん状細線維(paired helical filament)(PHF)(アルツハイマー病(AD)脳における神経原線維病変の基本成分)の主要な成分である。過剰リン酸化は、タウの微小管結合機能を損ない、AD脳における微小管の不安定性をもたらし、最後に、神経細胞変性を導く。過剰リン酸化タウはまた、他の中枢神経系障害の範囲において見出される。非常に多数のセリン/スレオニンキナーゼ(GSK−3β、PKA、PKC、CDK5、MARK、JNK、p38MAPKおよびカゼインキナーゼIIを含む)が、タウをリン酸化し得る。
【0008】
インビトロでのキナーゼ活性の検出は、この活性を阻害しうる化合物のスクリーニングに限界があり、従って、それはタウのリン酸化が異常に高い種々の神経変性疾患の改善に有用であり得る。現在でも努力が続けられている、タウタンパク質に対してキナーゼ活性を抑制し得る薬物を同定する方法がある。しかし、これらの方法は、乏しい感受性および低い特異性を欠点として有する。タウタンパク質内部の個々のセリン残基またはスレオニン残基でのリン酸化は、疾患に相関することが示されている。本発明は、記載される「技術」におけるこれらの欠如の両方を克服する。
【0009】
米国特許第5,601,985号は、異常にリン酸化されるタウタンパク質の検出方法に、米国特許第5,843,779号は、微小管結合タンパク質であるタウに対して指向されるモノクローナル抗体、およびこれらの抗体を分泌するハイブリドーマに、米国特許第5,733,734号は、アルツハイマー病または二重らせん状細線維の蓄積に関連する疾患についてのスクリーニング方法に、そして米国特許第6,066,462号は、個々のプロテインキナーゼ活性の定量に、関する。これらの特許は、本明細書中において参考として援用される。
【0010】
キナーゼ活性のモニターについて、このような一般的適用性を示す他のモデルが存在する。例示の目的について、本発明者らは、細胞周期調節に重要な核内分子網膜芽細胞腫タンパク質(Rbタンパク質)、および細胞表面レセプター分子(EGFR)を取り巻くアッセイを設計した。
【0011】
網膜芽細胞腫タンパク質(Rb)(網膜芽細胞腫罹患性遺伝子の腫瘍抑制産物)は、110kDaタンパク質であり、これは、細胞増殖および細胞分化の調節において重要な役割を果たす。その機能の欠如は、制御不能な細胞増殖および腫瘍発達を導く。このRb遺伝子の変異的不活化は、すべての網膜芽細胞腫、および種々の他のヒト悪性腫瘍(乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、骨肉腫、軟部組織肉腫および白血病を含む)において見出される。癌抑制としてのRbタンパク質の役割の中心は、Rbが、細胞周期のG1期において細胞を抑止することによって、不適当な増殖を抑制する能力である。Rbタンパク質は、転写因子(E2F−1、PU.1、ATF−2、UBF、Elf−1およびc−Ablを含む)への結合によって、その増殖抑制機能を発揮する。Rbタンパク質の結合は、そのリン酸化状態によって支配される。低リン酸化(hypo− or under−phosphorylated)Rbは、転写因子(最も顕著な転写因子は、E2F/DPファミリー)を結合および封鎖し、G1期からS期境界へ横切ることが必要とされる遺伝子の転写を阻害する。この細胞周期阻害機能は、Rbが、サイクリン/サイクリン依存性プロテインキナーゼ(cdk)の複合体によって触媒されるリン酸化を受ける場合に阻止される。
【0012】
Rbは、cdkリン酸化について、少なくとも16の共通のセリン/スレオニン配列を含むが、これらすべての部位の重要性は不明である。Rb上のスレオニン821のリン酸化が、cdk2/複合体(例えば、サイクリンE/cdk2およびサイクリンA/cdk2)によって触媒されることが実証されている。このスレオニン821のリン酸化は、配列LXCXEを含むタンパク質とのRbの相互作用を分離する。このRbタンパク質の脱リン酸化は、Rbをその活性な増殖抑制状態に戻す。Rb上のリン酸の除去は、有糸分裂の完了時に、プロテインホスファターゼ1型(PP1)および非触媒調節サブユニットの多重結合複合体によって行われるようである。特定のアミノ酸残基でリン酸化されるRbの定量は、キナーゼの活性、ならびにRbタンパク質自身の活性化の機能的状態に関する重要な情報を提供する。例示の目的について、本発明者らは、スレオニン821で特異的にリン酸化されるRbタンパク質の量を定量するアッセイを設計した。このELISAは、[pT821]以外の部位でリン酸化されるRb、または非リン酸化Rbを認識しない。サンプルは、総Rbの並列測定によって、Rb含量について制御され得る。
【0013】
WO01/11367(網膜芽細胞腫(RB)タンパク質に対するサイクリン/CDK複合体のリン酸化活性を修飾する化合物の同定についてのこの活性のアッセイ)は、合成ペプチド、およびこのペプチドのリン酸化形態を認識するモノクローナル抗体を用いたELSAによるキナーゼ活性の検出についての方法を記載する。この方法の基本原理は、キナーゼが作用する領域の共通配列を含む合成ペプチドを用いた固相のコーティングである。このペプチドは、キナーゼと接触するようになり、このキナーゼは、このペプチド上の特定の残基がリン酸化されるようになることを可能にする。このキナーゼの活性は、モノクローナル抗体の結合によって反映される。本発明は、WO01/11367と、キナーゼ活性についての基質として、天然のタンパク質を使用する能力が異なる。この特徴は、ペプチドの使用よりも優れている。なぜなら、すべての天然に存在するリン酸化部位が表されるからである。ホスホセリンを認識する1つのモノクローナル抗体(クローン2B9)の使用は、天然に存在するタンパク質上のリン酸化部位間の特定のリン酸化部位の任意の区別が不可能である。特定のPSSAの本発明者らの使用は、ホスホスレオニン残基およびホスホチロシン残基の識別ならびに検出を可能にする。
【0014】
別の例において、細胞表面レセプターが研究され、そしてキナーゼ依存性アッセイが設計された。上皮増殖因子レセプター(EGFR)は、レセプターチロシンキナーゼ(RTK)のファミリーに属し、これは、細胞成長、細胞生存、細胞増殖および細胞分化を調節する。EGFRは全長で、170kDaのI型膜貫通糖タンパク質として発現され、これは、細胞外のリガンド結合ドメイン、疎水性膜貫通領域、およびシグナル伝達に関連する高度に保存される細胞内の領域からなる。EGFRの細胞外ドメインおよび細胞内ドメインにおけるいくつかの欠失が、腫瘍の集団において見出されている。例えば、EGFRvIIIは、EGFR mRNAにおけるエキソン2〜7の欠失を含む145kDaタンパク質である。細胞質ドメイン(cytoplasmic domain)を含まない100kDaの短縮型EGFRは、A431細胞(ヒト上皮癌腫細胞株)由来の培養上清において観察される。
【0015】
EGFRは、多くのリガンド(例えば、EGF、トランスフォーミング増殖因子α(TGFα)、アンフィレギュリン(amphiregulin)、ベータセルリン(betacellulin)、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB−EGF)およびエピレギュリン(epiregulin))の結合によって活性化される。この結合は、EGFRホモダイマー化およびヘテロダイマー化、ならびにその内因性チロシンキナーゼの迅速な活性化、その後の細胞質ドメインにおける複数のチロシン残基の自己リン酸化を引き起こす。この分子のCOOH末端テイルにおけるチロシン残基のリン酸化は、サイトゾルのシグナリングタンパク質(Srcホモロジー2(SH2)ドメインを含む)についての結合部位として役立つ。インビボでのリン酸化のいくつかの部位は、EGFR(Tyr845、Tyr992、Tyr1068、Tyr1086およびTyr1173を含む)において同定されている。これらの部位は、種々の下流のシグナリングタンパク質を結合および活性化させ、このタンパク質は、SH2ドメイン(増殖因子レセプター結合タンパク質2(Grb2)、Srcホモロジーおよびコラーゲンドメインタンパク質(Shc)ならびにホスホリパーゼC−γ(PLCγ)を含む)を含む。これらのシグナリングタンパク質もしくは他のシグナリングタンパク質のレセプターへの結合またはそのリン酸化もしくはその両方は、引き続くシグナリング事象の伝達をもたらし、この事象は、DNA合成および細胞分裂となる。
【0016】
EGFRの発現または増幅の上昇もしくはその両方は、乳癌、膀胱癌、神経膠腫癌、結腸癌、肺癌、扁平上皮癌、頭部および頸部癌、卵巣癌ならびに膵臓癌において見出されている。選択的化合物が開発されており、これは、EGFRの細胞外リガンド結合ドメイン、または細胞内チロシンキナーゼ領域のいずれかを標的し、マイトジェン応答および他の癌促進応答を調節するシグナリング経路の妨害をもたらす。これらの潜在的な抗癌因子は、多くの低分子であるチロシンキナーゼインヒビターを含む。
【0017】
発明の要約
本発明は、タンパク質のリン酸化の定量についてのアッセイおよび試薬を記載する。本方法は、タンパク質を、タンパク質をリン酸化するホスホキナーゼに供するステップ、および、このリン酸化タンパク質をこのリン酸化部位に特異的な抗体に接触するステップ、ならびに、このリン酸化部位に結合した抗体を検出するステップを包含する。本発明は、本発明の方法の実施に有用な抗体を含む。本発明は特に、タウタンパク質、Rbタンパク質およびEGFRタンパク質のリン酸化、ならびにこのタウタンパク質、Rbタンパク質およびEGFRタンパク質のリン酸化の部位に特異的な抗体に関する。
【0018】
各々の例において、この標的タンパク質(タウ、RbまたはEGFR)は、インビトロまたはインビボでリン酸化され、そしてこの特異的リン酸化事象は、高度に選択的なリン酸化部位特異的抗体(PSSA)を用いて検出される。この標的されるリン酸化事象の出現または消失は、各々の部位でリン酸化され得るタンパク質の合計のパーセンテージとして定量され得る。
【0019】
このPSSAの高度に特異的な性能は、1つのタンパク質上の複数のリン酸化部位の並列した独立性測定を可能にする。さらに、異なるキナーゼは、異なるPSSA(これは、このタンパク質における異なる部位を選択的に標的化する)を用いることによって、同時に測定されることができ、それによって、リン酸化部位プロフィールの作製についての道を提供する。リン酸化タンパク質を疾患の診断指標または予後指標として定量する現存の方法とは対照的に、本発明は、特定の部位でタンパク質のリン酸化をもたらすプロテインキナーゼの酵素活性を測定する。また、本方法は、現在、製薬会社およびバイオテクノロジー会社によって新規の薬物を発見するために使用されている、大規模の「ハイスループットスクリーニング」フォーマットに適応しやすい。
【0020】
本明細書中で使用される用語、抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、FabフラグメントおよびF(ab)2フラグメント、遺伝子操作される抗体またはそのフラグメントをいう。例えば、ヒト化に改変されうる抗体は、交差種反応を最小化できる。pan抗体は、この用語が、本明細書中で使用される場合、タンパク質のリン酸化形態および非リン酸化形態に結合する抗体をいう。
【0021】
発明の詳細な説明
タウ系:タウタンパク質系は、正常状態および病理学的状態において、細胞内および細胞外の両方で見出されるタンパク質に対する本発明の有用性を実証する。このタウタンパク質は、複数のプロテインキナーゼによって作用される複数のリン酸化部位を有する。ホスホセリン残基およびホスホチロシン残基が存在する。モノホスホ残基および二重(dual)ホスホ残基の両方が、このモデル系において区別可能である。
【0022】
タウ組換えタンパク質:全長のタウ−441タンパク質は、ヒトタウcDNAのクローニング由来であり、そしてE.coliにおいて発現し精製される組換えタンパク質である。このタンパク質は、標準的な方法を介して精製される。このタンパク質は、複数の売り主から市販される。
【0023】
タウpS 199 PSSA:ウサギを、セリン199を含むタウタンパク質の最も長いアイソフォームの領域に対応する化学合成ホスホペプチドおよびKLH結合体化ホスホペプチドを用いて免疫した。この化学合成ホスホペプチド(RSGYS(pS)PGSPG)は、配列番号1である。このタウpS199PSSAを、連続したエピトープ特異性クロマトグラフィーによって、ウサギ血清から精製した。この抗体を、リン酸化部位に対応する非ホスホペプチドを用いて、ネガティブにあらかじめ吸着して、非リン酸化タウと反応性である抗体を除去した。この最終産物は、セリン199でリン酸化されるペプチドを用いて、アフィニティークロマトグラフィーによって作製された。この抗体は、ウェスタンブロッティングアッセイ(western blotting assay)におけるペプチド競合分析によって実証されるように、セリン199上でリン酸化される場合、タウタンパク質を特異的に認識する。セリン199は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−3β(GSK−3β)によって、インビトロおよびインビボでリン酸化される。この試薬は市販される。
【0024】
PSSAタウ特異性は、図1に示される。アフリカミドリザル腎臓(CV−1)細胞由来の細胞抽出物(ヒト4リピートタウおよびプロテインホスファターゼインヒビターを安定に発現させる)を、10% トリス−グリシンゲル上で、SDS−PAGEによって分解した。このタンパク質を、ニトロセルロース(膜)に転移した。ペプチド免疫原の非存在下(a)またはペプチド免疫原の存在下(b)、あるいはタウホスホペプチドに対応する非ホスホペプチドにおいて(c)、あらかじめインキュベートした後、膜を、0.50μg/mL 抗ホスホタウ[pS199]とともにインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギF(ab’)2抗ウサギIgGアルカリホスファターゼとともにインキュベートし、そしてバンドを、Tropix WesternStar(登録商標)検出方法を用いて検出した。図1におけるデータは、この部位に対応するホスホペプチドのみが、抗体シグナルをブロックし、このリン酸化部位についての抗タウ[pS199]抗体の特異性を例示することを示す。
【0025】
タウ[pS 214 ]PSSA。この抗体の作製についての手順は、タウpS199PSSAについての上記の手順と類似した。この化学合成ホスホペプチドは、セリン214を含むタウタンパク質の最も長いアイソフォームの領域(GSRSRTP(pS)LPTPP(配列番号2))に由来した。この抗体は、ウェスタンブロッティングアッセイにおけるペプチド競合分析によって実証されるように、セリン214上でリン酸化される場合、タウタンパク質を特異的に認識する。セリン214は、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)によって、インビトロおよびインビボでリン酸化される。この試薬は、Biosource Internationalから市販される。
【0026】
タウpS214 PSSA特異性は、図2に示される。SF−9細胞抽出物(ヒト4リピートタウを発現する)を、10% トリス−グリシンゲル上で、SDS PAGEによって分析した。このタンパク質を、ニトロセルロース(膜)に転移した。ペプチド免疫原の非存在下(a)またはペプチド免疫原の存在下(b)、あるいはタウホスホペプチドに対応する非ホスホペプチドにおいて(c)、あらかじめインキュベートした後、膜を、0.50μg/mL 抗ホスホタウ[pS214]とともにインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギF(ab’)2抗ウサギIgGアルカリホスファターゼとともにインキュベートし、そしてバンドを、Tropix WesternStar(登録商標)検出方法を用いて検出した。図2におけるデータは、この部位に対応するホスホペプチドのみが、抗体シグナルをブロックし、このリン酸化部位についての抗タウ[pS214]抗体の特異性を例示することを示す。他のタウ部位[pS202、pS396、pT181、pS199/pS202、pS404]に対するPSSAは、類似の方法を用いて特徴付けられる。
【0027】
Pan−タウポリクローナル抗体
ウサギを、組換えタウタンパク質を用いて免疫した。この抗体を、プロテインAアフィニティーカラムを用いて、ウサギ血清から精製した。この抗体は、タウタンパク質上の複数の抗原性部位を認識する。この抗体は、タウタンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方に結合する。
【0028】
タウ−5モノクローナル抗体(mAb)
タウに対するマウスmAbを、精製されたウシ微小管結合タンパク質(MAP)を免疫原として用いて惹起した。そして、免疫化BALB/cマウス脾臓細胞およびマウス骨髄腫Sp2/0−Ag14細胞の融合によってハイブリドーマを産生した。これは、他のMAPまたはチューブリンとの交差反応を示さない。これは、タウの非リン酸化形態、ならびにタウのリン酸化形態と反応し、そしてこの反応性エピトープは、残基210〜230をマッピングする。この試薬は、Biosource Internationalから市販される。
【0029】
全体的タウELISAおよびホスホタウELISA
炭酸塩緩衝液、pH9.4における2.5μg/mLの濃度のタウ−5モノクローナル抗体を、4℃で一晩、マイクロタイタープレートにおいて、1ウェル当たり100μLでインキュベートした。このウェルを、PBS/Tween−20溶液で3回洗浄し、その後、他の部位に対して、このプラスチック表面上で、関連のないタンパク質(例えば、BSA)を含む緩衝化溶液を用いて、室温で2時間ブロックした。GSK−3βリン酸化タウ、PKAリン酸化タウおよび非リン酸化タウを、種々の濃度でウェルに添加し、そして室温で1時間インキュベートした。洗浄緩衝液での3回の洗浄後、このウェルを、それぞれタウpS214PSSA、タウpS199PSSAおよびPan−タウ抗体とともに、最適濃度で(0.1〜1μg/mLの範囲)、室温で1時間インキュベートした。次いで、このプレートを、洗浄緩衝液を用いて3回洗浄し、その後、室温で1時間、1:5000希釈のHRP結合体化抗ウサギIgG二次抗体を添加した。洗浄後、100μLの安定化クロモゲンを、各々のウェルに添加し、次いで、室温、暗所で20分間インキュベートした。450nmでのO.D.値を、各々のウェルへの停止溶液の添加後に測定した。
【0030】
キナーゼ反応
PKAを用いたタウのリン酸化は、以下のように生じた。PKAを、New England Biolabsより購入した。組換えタウタンパク質(1μg)を、種々の濃度のPKA酵素とともに、50mM トリス−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2および100μM ATPを含む緩衝液において、30℃で1時間インキュベートした。
【0031】
GSK−3βを用いたタウのリン酸化
GSK−3βを、Upstate Biotechnology Inc.より購入した。組換えタウタンパク質(1μg)を、種々の濃度の酵素とともに、40mM HEPES(pH7.2)、5mM MgCl2、5mM EDTA、100μM ATPおよび50μg/mL ヘパリンを含む緩衝液において、30℃で1時間インキュベートした。
【0032】
図3aおよび3bは、ELISAによるPKA/Ser214部位での全体的タウリン酸化および選択的タウリン酸化の評価を示す。図3aにおいて、リン酸化タウをELISAに配置し、タウpS214に特異的なPSSAまたはpan−タウ抗体のいずれかによって検出した。両方の検出抗体は、等しいシグナルでリン酸化タウを検出した。図3bにおいて、非リン酸化タウを、同じアッセイに配置した。期待されるように、タウpS214は、リン酸基を含まないタウタンパク質を検出できなかったが、一方、pan−タウ検出器は、このタンパク質を定量した。
【0033】
図4aおよび4bは、ELISAによるGSK−3β/Ser199/202部位での全体的タウリン酸化および選択的タウリン酸化の評価を示す。図4aは、タウpS199/202の検出器を用いたELISAにおいて、非リン酸化タウまたはGSK−3βリン酸化タウのいずれかを使用する。非リン酸化タウは、ELISAにおいて陽性に反応しないが、一方、リン酸化タウは、強力な結果を示す。pan−タウが検出器として使用される場合、両方のタンパク質が、容易に検出される(図4b)。
【0034】
図5は、インビトロでの反応に添加されるキナーゼ活性の量の関係として、ELISAによって検出されるホスホタウの量間の直接的関係を示す。種々の量のPKA酵素を使用して、タウタンパク質をリン酸化した。最も高い濃度のPKAである5単位(PKAタウ1)で開始して、次いでPKA酵素を、示されるように、1:2で系列希釈し、その後1:1000希釈し、次いでELISAアッセイの各々のウェルに適用した。ホスホタウの検出を、タウに対するPSSAを用いて行い、このPSSAは、Ser214(PKA部位)でリン酸化される。これらのデータは、この反応において、キナーゼの量が低い程、より低い量の産生ホスホプロテインが、ELISAにおいて検出されることを示す。従って、このELISAは、ホスホキナーゼ活性の間接的測定である。
【0035】
図6aおよび6bは、タウPSSAおよびELISAを用いた、PKA対GSK3β酵素によって触媒されるタウタンパク質のリン酸化の検出における特異性を示す。この結果は、このタウpS214PSSA ELISAが、PKAによってリン酸化される場合にタウのみを検出し、そしてタウpS199PSSA ELISAが、GSK3βによってリン酸化される場合にタウのみを検出することを実証する。
【0036】
図7は、GSK3β酵素が、タウタンパク質上の複数の部位をリン酸化し得、そしてPSSAが、タウpT181、タウpS202、タウpS199/pS202、タウpS396およびタウpS404でのリン酸化部位を独立して検出し得ることを示す。これは、このELISAが、キナーゼ酵素活性に供されるタンパク質に対するリン酸化事象のプロフィールの作製に有用であるという証拠を提供する。
【0037】
図8は、2つの抗体(一方は、PKAリン酸化部位(pS214)に特異的であり、そして他方は、タウタンパク質上のGSK部位(pS199)に特異的である)を用いたプロフィールとして試験される場合のキナーゼ反応の特異性を示す。PKA特異的阻害剤であるPKI(c−AMP依存性プロテインキナーゼの熱安定性阻害剤;New England Biolab)を、酵素(PKAまたはGSKのいずれか)に対し阻害剤の種々の比で混合し、そして得られる混合物を、タウPSSAを用いたELISAによって分析した。このPKA特異的阻害剤は、pS214部位単独のキナーゼ活性を変更させた。これらのデータは、ELISAの特異性、および同じタンパク質に対する異なる部位でのキナーゼ活性を独立してモニターする能力を再び証明する。これらのデータはまた、キナーゼ活性の薬物妨害についてスクリーニングする能力を示す。
【0038】
表IIに示される他のタウ部位に対する抗体がまた、本発明の代表である。リン酸化部位のいくつかは、表IIにさらに示されるように、疾患に関連することが公知である。
【0039】
【表2】
【0040】
Rb系:このモデル系は、複数のプロテインキナーゼによって作用される複数のリン酸化部位を含む大きな核内タンパク質を与える。ホスホセリン残基およびホスホチロシン残基が存在する。モノホスホ残基および二重ホスホ残基の両方が、このモデル系において識別可能である。
【0041】
Rbタンパク質:全長Rbタンパク質は、ヒトRb cDNAのクローニング由来であり、そしてE.coliにおいて発現される精製組換えタンパク質である。このタンパク質は、標準的な方法を介して精製される。このタンパク質は、複数の売り主から市販される。
【0042】
Rb[pT 821 ]PSSA:ウサギ抗血清を、スレオニン821を含むヒトRbの領域由来の化学合成ホスホペプチドに対して産生した。抗体を、連続したエピトープ特異的クロマトグラフィーによって、ウサギ血清から精製した。この抗体を、リン酸化部位に対応する非ホスホペプチドを用いて、ネガティブにあらかじめ吸着して、非リン酸化pRbと反応性を有する抗体を除去した。この最終産物を、スレオニン821でリン酸化されるpRb由来ペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって作製した。図9は、抗Rb[pT821]の特異性を規定する。7.5% トリス−グリシンゲル上でのSDS−PAGEは、MCF−7細胞から調製される細胞抽出物を分解した。次いで、このタンパク質を、PVDFに転移した。膜を、ペプチド免疫原の非存在下(a)またはペプチド免疫原の存在下(b)、RBホスホペプチドに対応する非ホスホペプチド(c)、ホスホRB上のスレオニン356に対応するホスホペプチド(d)、ホスホRB上のセリン807/811に対応するホスホペプチド(e)、ホスホRB上のセリン249/スレオニン252に対応するホスホペプチド(f)、およびホスホRB上のセリン751に対応するホスホペプチド(g)において、あらかじめインキュベートした後、0.5μg/mL 抗RB[pT821]とともにインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギF(ab’)2抗ウサギIgGアルカリホスファターゼとともにインキュベートし、そしてバンドを、Tropix WesternStar(登録商標)検出方法を用いて検出した。このデータは、この部位に対応するホスホペプチドのみが、抗体シグナルをブロックし、従って、このリン酸化残基についての抗Rb[pT821]抗体の特異性を実証することを示す。
【0043】
全体的なRb[pan]検出抗体:この検出抗体は、モノクローナルであり(クローンG3−245)、BD/Pharmingen(San Diego、CA)から市販される。これは、Rbタンパク質のアミノ酸332〜344間のエピトープを認識する。この抗体は、Rbタンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方に結合する。
【0044】
Rbモノクローナル抗体:この捕捉抗体[固相に結合される]は、モノクローナルであり(クローン3C8)、QED Biosciences(San Diego、CA)から市販される。これは、Rbタンパク質のC末端付近(aa886〜aa905)上のエピトープと反応する。この抗体は、Rbタンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方に結合する。
【0045】
全体的なRb ELISAおよびRb[pT 821 ]ELISA:炭酸塩緩衝液、pH9.4における1.25μg/mLの濃度のRbモノクローナル抗体を、4℃で一晩、マイクロタイタープレートにおいて、1ウェル当たり100μLでインキュベートした。このウェルを、PBS/Tween−20溶液で3回洗浄し、その後、他の部位に対して、このプラスチック表面上で、関連のないタンパク質(例えば、BSA)を含む緩衝化溶液を用いて、室温で2時間ブロックした。リン酸化Rbまたは非リン酸化組換えRbを含むジャーカット細胞溶解物を、種々の濃度でウェルに添加し、そして室温で2時間インキュベートした。洗浄緩衝液での3回の洗浄後、このウェルを、それぞれRb[pT821]PSSA、およびビオチン化(biotinylated)pan−Rb抗体とともに、最適濃度で(0.1〜1μg/mLの範囲)、室温で1時間インキュベートした。次いで、このプレートを、洗浄緩衝液を用いて3回洗浄し、その後、室温で1時間、1:5000希釈でのHRP結合体化抗ウサギIgG二次抗体、または0.25μg/mLのストレプトアビジン−HRPを添加した。洗浄後、100μLの安定化クロモゲンを、各々のウェルに添加し、次いで、室温、暗所で20分間インキュベートした。450nmでのOD値を、各々のウェルへの停止溶液の添加後に測定した。
【0046】
図10は、Rb[pT821]ELISAの特異性を決定するための研究を示す。第一の研究において、ジャーカット、U2OSおよびColo205由来の20ng/mLの濃度でのRbタンパク質を含む溶液を、20ng/mLの精製全長Rbタンパク質(E.coliにおいて発現される(非リン酸化))を含む溶液とともに、Rb[pT821]ELISAキットを用いて分析した。図11は、この細胞株から単離されるRbタンパク質が、強力に認識されたことを示す。これらのデータは、Rbタンパク質の適切なリン酸化が、このアッセイにおける反応性に必要であるという証拠を提供する。
【0047】
第二の研究において、スレオニン821に対する特異性を、ペプチド競合によって決定した。図11に示されるデータは、スレオニン821周囲の領域に対応するペプチド(ホスホスレオニンを含む)のみが、このELISAシグナルをブロックし得ることを示す。
【0048】
Rbについてのキナーゼ反応:Rbについての天然の供給源を、これらの研究について、指数増殖細胞から得た。内因性の細胞性キナーゼは、天然のRbタンパク質のリン酸化を提供した。図12は、キナーゼ反応を研究するためのこのELISAの適用を示す。ジャーカット細胞を、溶解の前に、キナーゼ阻害剤であるスタウロスポリンの存在下で、種々の濃度で36時間増殖させた。溶解物を、BioSource Total Rb ELISA(カタログ番号KHO0011)を用いて、全Rb含量について正規化した。スレオニン821でのRbリン酸化のレベルを決定した。これらのデータは、スタウロスポリンが、おそらくcdkの阻害を通じてスレオニン821でのRbのリン酸化を阻害することを示す。
【0049】
EGFR系:このモデル系は、細胞表面レセプタータンパク質を与える。このタンパク質は大きく、複数のリン酸化部位は、ホスホスレオニン残基、ホスホセリン残基およびホスホチロシン残基からなる。
【0050】
EGFRタンパク質:ヒトEGFRタンパク質を、アフィニティー精製によって、ヒト癌腫A431細胞から精製した。この産物を、Sigma(St.Louis、MO カタログ番号E−2645)から購入する。
【0051】
(EGFR[pY1173]PSSA):ウサギ抗血清を、チロシン1173を含むEGFRの領域由来の化学合成ホスホペプチドに対して産生した。この配列は、ヒト、マウスおよびラットにおいて保存される。抗体を、連続したエピトープ特異的クロマトグラフィーによって、血清から精製した。この抗体を、(i) 非リン酸化EGFR酵素と反応性である抗体を除去するために、リン酸化部位に対応する非ホスホペプチドを用いて、そして(ii)ホスホチロシンと反応性である抗体を除去するために、一般的チロシンリン酸化ペプチドを用いて(配列に関係なく)、ネガティブにあらかじめ吸着した。この最終産物は、チロシン1173でリン酸化される、EGFR由来ペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって作製される。図13は、EGFR PSSA[pY1173]の特異性を例示する。EGFRを発現するNIH3T3細胞から調製される細胞抽出物を、30時間飢餓させ、次いで、30ng/mL EGFを用いて10分間刺激するか(+)、または刺激しないままにし(−)、次いで、6% トリス−グリシンゲル上でのSDS−PAGEによって分解し、そしてニトロセルロースに転移した。膜を、ペプチド免疫原の非存在下(レーン1および2)またはペプチド免疫原の存在下(レーン3および4)、あるいはEGFRホスホペプチドに対応する非ホスホペプチド(レーン5および6)において、あらかじめインキュベートした後、0.50μg/mL 抗EGFR[pY1173]抗体とともにインキュベートした。洗浄後、膜を、ヤギF(ab’)2抗ウサギIgGアルカリホスファターゼとともにインキュベートし、そしてバンドを、Tropix WesternStar(登録商標)検出方法を用いて検出した。このデータは、この部位に対応するホスホペプチドのみが、抗体シグナルをブロックし、このリン酸化残基についての抗EGFR[pY1173]抗体の特異性を実証することを示す。
【0052】
EGFR[pY 845 ]PSSA:EGFR[pY845]PSSAとして本質的に調製されるが、チロシン845を含む領域由来の化学合成ホスホペプチドを用いた。
【0053】
EGFR[pan]モノクローナル抗体:この捕捉抗体は、マウスモノクローナル抗体であり(クローン199.12)、Neomarkers,Inc.(Union City、CA)から市販される。これは、ヒトEGFRに特異的であり、そしてHER2/neu、HER3およびHER4と反応しない。この抗体は、EGFRタンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態の両方に結合する。
【0054】
EGFR[pan]検出抗体:このウサギ抗体を、ヒトEGFRのC末端に対応する合成ペプチドを用いた免疫によって調製した。この抗体を、プロテインAアフィニティーカラムを用いて精製した。これは、HER2/neu、HER3およびHER4との交差反応性を示さない。
【0055】
EGFR PSSAおよび全長ELISA:炭酸塩緩衝液、pH9.4における2.5μg/mLの濃度のpan−EGFRモノクローナル抗体を、4℃で一晩、マイクロタイタープレートにおいて、1ウェル当たり100μLでインキュベートした。このウェルを、PBS/Tween−20溶液で3回洗浄し、その後、他の部位に対して、このプラスチック表面上で、関連のないタンパク質(例えば、BSA)を含む緩衝化溶液を用いて、室温で2時間ブロックした。自己リン酸化EGFRまたは非リン酸化EGFRを、種々の濃度でウェルに添加し、そして室温で1時間インキュベートした。洗浄緩衝液での3回の洗浄後、このウェルを、それぞれEGFR[pY845]PSSA、EGFR[pY1173]PSSAおよびpan−EGFR抗体とともに、最適濃度で(0.1〜1μg/mLの範囲)、室温で1時間インキュベートした。次いで、このプレートを、洗浄緩衝液を用いて3回洗浄し、その後、室温で1時間、1:2000希釈で、HRP結合体化抗ウサギIgG二次抗体を添加した。洗浄後、100μLの安定化クロモゲンを、各々のウェルに添加し、次いで、室温、暗所で20分間インキュベートした。450nmでのOD値を、各々のウェルへの停止溶液の添加後に測定した。
【0056】
チロシン残基1173についてのEGFR[pY1173]ELISAの特異性を、ペプチド競合によって決定した。図14に示されるデータは、チロシン残基1173周囲の領域に対応するペプチド(ホスホスレオニンを含む)のみが、このELISAをブロックし得ることを示す。
【0057】
キナーゼ反応:(自己リン酸化)
EGFRを、1μM ATPを含む、15mM HEPES(pH7.4)、6mM MnCl2および15mM MgCl2の緩衝液において、30℃で30分間インキュベートした(自己リン酸化)。
【0058】
図15は、10分間の1〜500ng/mLでのEGFを用いた処理後の、A431細胞におけるEGFRのリン酸化の応答曲線を実証する。EGFRチロシンのリン酸化を、EGFR[pY1173]ELISAを用いて検出した。
【0059】
図16は、本発明の使用を実証して、残基pY845でのEGFRに関連するプロテインキナーゼ活性、およびプロテインキナーゼ阻害機能によるこの活性の阻害を検出する。1バイアル当たり2ngの精製ヒトEGFRを、1μM ATPを含む、15mM HEPES(pH7.4)、6mM MnCl2および15mM MgCl2の緩衝液において、30℃で30分間インキュベートした(自己リン酸化)。EGFR[pY845]のリン酸化阻害について、チロシンキナーゼインヒビターであるPD158780(Calbiochem、カタログ番号513035)を、指示濃度でバイアルに添加した。EGFR[pY845]のリン酸化を、EGFR[pY845]リン酸化部位特異的ELISAを用いて、4ng/mLで測定した。
【0060】
表1:シグナル伝達タンパク質を列挙し、このリン酸化は、本発明の方法によって決定され得る。
【0061】
表1
シグナル伝達タンパク質の例
タンパク質
A
α−アクチニン
α−シヌクレイン(alpha−synuclein)
ABL/c−Abl(エイブルソン非レセプタータンパク質チロシンキナーゼ(Abelson nonreceptor protein tyrosine kinase))
アセチルコリンレセプター
Ack非レセプタータンパク質チロシンキナーゼ
Akt/PKB セリン/スレオニンプロテインキナーゼ
AP−1(アクチベータータンパク質1jun/fos二量体転写因子)
AP−2(アクチベータータンパク質2転写因子)
Apaf−1(アポトーシスプロテアーゼ活性化因子1)
Apaf−2(アポトーシスプロテアーゼ活性化因子2/シトクロムC)
Apaf−3(アポトーシスプロテアーゼ活性化因子3/カスパーゼ9)
Arp2/3(アクチン関連(related)タンパク質)
Atf−1(活性化転写因子1(Activating transcription factor−1)
Atf−2(活性化転写因子2)
Atf−3(活性化転写因子3)
Atf−4(活性化転写因子4)
ATM(血管拡張性失調症変異タンパク質)
B
B−ATF 核塩基性ロイシンジッパータンパク質/転写因子(nuclear basic leucine zipper protein/transcription factors)
Bad
Bak
Bax
Bcl−2(B細胞慢性リンパ性白血病2)
Bcl−xL
Bcl−xS
BCR/ABLタンパク質チロシンキナーゼ
βカテニン
BID(BH−3相互作用性細胞死誘導領域(Interacting Death Domain))
Blk(Bリンパ球Src非レセプタータンパク質チロシンキナーゼファミリーメンバー)
BMK−1(大MAPキナーゼ(Big MAP Kinase)/ERK5)Btk(ブルトンチロシンキナーゼ(Bruton’s Tyrosine Kinase)
C
カドヘリン
CADTK(カルシウム活性化タンパク質チロシンキナーゼ/Cakβ/Pyk2/FAK2/RAFTK)
CAK(Cdk−活性化キナーゼ)
Cak−β(細胞接着キナーゼβ/CADTK/Pyk2/FAK2/RAFTK)
カルデスモン
カルモジュリン
カルパインシステインプロテアーゼ
CaMキナーゼII(カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII)
CB1(カンナビノイドレセプター1)
CB2(カンナビノイドレセプター2)
カスパーゼ2(システインアスパルチルプロテアーゼ2/ICH−1/NEDD−2)
カスパーゼ3(システインアスパルチルプロテアーゼ3/LICE/CPP32/YAMA/アポパイン(apopain)/SCA−1)
カスパーゼ8(システインアスパルチルプロテアーゼ8/MACH/FLICE/Mch5)
カスパーゼ9(システインアスパルチルプロテアーゼ9/ICE−LAP6/Mch6/APAF−3)
カベオリン1、2および3
CD45膜貫通チロシンホスファターゼ
CD45AP(CD45結合タンパク質)
c−fos転写因子
CDK1/cdc2(サイクリン依存性キナーゼ1)
CDK2(サイクリン依存性キナーゼ2)
CDK4(サイクリン依存性キナーゼ4)
CDK5(サイクリン依存性キナーゼ5)
c−Jun転写因子
c−myc転写因子
コルタクチン(Cortactin)
COX−2(シクロオキシゲナーゼ2/プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ2)
c−kitレセプタータンパク質
c−rafタンパク質セリン/スレオニンキナーゼ
CREB転写因子
Crk SH2およびSH3ドメイン含有アダプタータンパク質
CSK(カルボキシル末端Srcキナーゼ)
シトクロムc
D
DAPK(細胞死(Death)結合プロテインキナーゼ)
デスミン
DNA−PK(DNA依存性プロテインキナーゼ)
E
E2F−1 DNA結合タンパク質
EGF−R(上皮増殖因子レセプター)
eIF−2α(真核生物転写開始因子2α)
ERK1/MAPK(細胞外シグナル制御/マイトジェン活性化プロテインキナーゼ1)
ERK2/MAPK(細胞外シグナル制御/マイトジェン活性化プロテインキナーゼ2)
ERK3(細胞外シグナル制御/p62マイトジェン活性化プロテインキナーゼ3)
ERK4(細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ4)
ERK5(細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ5/大MAPキナーゼ1)
ERK6(細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ6/p38γ)
ERK7(細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ7)
ERK5(細胞外シグナル制御プロテインキナーゼ8)
F
Fアクチン
FADD(Fas結合細胞死誘導領域)
FAK(フォーカルアドヒージョンキナーゼ/pp125FAK)
FAS(FASリガンドレセプター)
Fgr非レセプターSrcファミリーチロシンキナーゼ
FosB
Fra−1(Fos関連(related)抗原1)
Fra−2(Fos関連抗原2)
FRK(Fos制御(regulating)キナーゼ)
FYB(Fyn結合タンパク質)
Fyn非レセプターSrcファミリーチロシンキナーゼ
G
Gab1(Grb2結合バインダー(binder)1)
Gab2(Grb2結合バインダー2)
GCK(胚中心キナーゼ)
GEF(グアニンヌクレオチド交換因子)
Giα抑制性グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Giα inhibitory guanine nucleotide regulatory protein)
Giβ抑制性グアニンヌクレオチド結合タンパク質
Giγ抑制性グアニンヌクレオチド結合タンパク質
Gq/11グアニンヌクレオチド結合タンパク質
Gq/11βグアニンヌクレオチド結合タンパク質
Gq/11γグアニンヌクレオチド結合タンパク質
Grb2(増殖因子レセプター結合タンパク質2)
Grk2(Gタンパク質共役レセプターキナーゼ)
Gsk−3α(グリコーゲンシンターゼキナーゼ3α)
Gsk−3β(グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β)
H
Hck(造血細胞キナーゼ)
HGF−R(肝細胞増殖因子レセプター)
Hrk(3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル補酵素Aレダクターゼキナーゼ)
I
IκBαNFκB抑制性タンパク質
IκBβNFκB抑制性タンパク質
IKKα(IkBキナーゼα)
IKKβ(IkBキナーゼβ)
IKKγ(IkBキナーゼγ/NEMO)
IGF−1レセプター(インスリン様増殖因子Iレセプター)
インスリンレセプター
インテグリン
インテグリン結合タンパク質(IAP/CD47)
IRAK(インターロイキン−1レセプター結合キナーゼ)
IRK(インスリンレセプターキナーゼ)
IRS−1(インスリンレセプター基質1)
IRS−2(インスリンレセプター基質2)
J
JAB1(Jun活性化ドメイン結合タンパク質1(Jun−Activation domain Binding protein 1))
JAK1(Janus活性化キナーゼ1(Janus Activating Kinase1))
JAK2(Janus活性化キナーゼ2)
JAK3(Janus活性化キナーゼ3)
JNK1/SAPKγ(c−Junアミノ末端キナーゼ1/ストレス活性化プロテインキナーゼγ)
JNK2/SAPKβ(c−Junアミノ末端キナーゼ2/ストレス活性化プロテインキナーゼβ)
JNK3/SAPKα(c−Junアミノ末端キナーゼ3/ストレス活性化プロテインキナーゼα)
L
LAT(T細胞の活性化のためのリンカー)
Lck非レセプターSrcファミリータンパク質チロシンキナーゼ
Lyn非レセプターSrcファミリータンパク質チロシンキナーゼ
M
MEF2c転写因子
MEK1(マイトジェン活性化ERK活性化キナーゼ1)
MEK2(マイトジェン活性化ERK活性化キナーゼ2)
MEK3(マイトジェン活性化ERK活性化キナーゼ3)
MEK4(マイトジェン活性化ERK活性化キナーゼ4)
MEK5(マイトジェン活性化ERK活性化キナーゼ5)
MEKK1(MEKキナーゼ1)
Met(c−met/HGFレセプター)
MKP1(MAPキナーゼホスファターゼ1)
MKP2(MAPキナーゼホスファターゼ2)
MKP3(MAPキナーゼホスファターゼ3)
MKP4(MAPキナーゼホスファターゼ4)
MKP5(MAPキナーゼホスファターゼ5)
MKP6(MAPキナーゼホスファターゼ6)
MLCK(ミオシン軽鎖キナーゼ)
MuSK(筋特異的セリン/スレオニンキナーゼ)
ミオシン
MLCK Ppase(ミオシン軽鎖キナーゼホスファターゼ)
N
βNAP(βニューロンアダプタータンパク質/AP−3)
NAT1/DAP−5(新規APOBEC−1標的番号1/細胞死結合タンパク質5(Novel APOBEC−1 Target no.1/Death−Associated Protein−5))
NCK SH2およびSH3ドメイン含有トランスフォーミングタンパク質
Nek2(Nima関連キナーゼ2(Nima−related Kinase2))
NFAT−1(活性化T細胞の核因子(Nuclear Factor of Activated T−cells))
NfκB(核因子κB転写因子)
NIK(NFκB誘導化(Inducing)キナーゼ)
NTK(神経組織およびT細胞キナーゼ)
P
p130cas
p190RhoGAP GTPase
P2Y2プリノセプター(purinoceptor)
p36CAKアセンブリ/活性化因子(assembly/activation factor)
p38(ERK6 MAPK/SAPK)
p38d(SAPK4)
p53癌抑制遺伝子
p58IPK(インターフェロン誘導性二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ、PKRのインヒビター(Inhibitor of the interferon−induced double−stranded RNA−activated Protein Kinase,PKR))
p62dok GAP結合タンパク質
p62lckリガンド/ZIP
p68キナーゼ
p96
PAK1(p21活性化プロテインキナーゼ1)
PAK2(p21活性化プロテインキナーゼ2)
PAK3(p21活性化プロテインキナーゼ3)
PARP(ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ)
パキシリン
PCNA(増殖細胞核抗原)
PDGFレセプター(血小板由来増殖因子レセプター)
PDK1(ホスホイノシチド依存性キナーゼ1)
PDK−2(ホスホイノシチド依存性キナーゼ2/インテグリン結合キナーゼ)PECAM−1(血小板内皮細胞接着分子1)
P13K(ホスファチジルイノシトール3−キナーゼ)
PIAS(活性化STATのタンパク質インヒビター)
PITPα(ホスファチジルイノシトール転移(transfer)タンパク質α)
PKAα/cAMP依存性プロテインキナーゼ
PKB(プロテインキナーゼB)
PKCα(プロテインキナーゼCα)
PKCβ(プロテインキナーゼCβ)
PKCδ(プロテインキナーゼCδ)
PKCγ(プロテインキナーゼCγ)
PKD(プロテインキナーゼD)
PKR(プロテインキナーゼRまたは二本鎖ARNA活性化プロテインキナーゼ)
PLCγ1(ホスホリパーゼC−γ1)
PRK(増殖関連キナーゼ)
PTEN(MMAC1癌抑制遺伝子/タンパク質ホスファターゼ)
Pyk2(CAKβ/FAK2/RAFTK)タンパク質チロシンキナーゼ
R
Rac/cdc42 GTPase
Raf1(C−raf)セリン/スレオニンプロテインキナーゼ
A− Rafセリン/スレオニンプロテインキナーゼ
B−rafセリンスレオニンキナーゼ
V−Rafウイルス性セリン/スレオニンプロテインキナーゼ
RAFTK(関連性接着フォーカルチロシンキナーゼ(Related Adhesion Focal Tyrosine Kinase))
RAIDD(RIP結合ICH−1/細胞死誘導領域とのCED−3相同タンパク質(RIP−Associated ICH−1/CED−3 homologous protein with a Death Domain))
Rap2 GTPase
Rap−1のRap1−GAP(C3G)インアクチベーター(Rap1−GAP(C3G)inactivator of Rap−1)
ラプシン(Rapsyn)
Ras GTPase
Rb(網膜芽細胞腫癌抑制タンパク質)
Rho低分子量GTPase
RIP(レセプター相互作用タンパク質)
ROCK(Rho活性化キナーゼ)
S
S6k(S6キナーゼ)
Shc
SHIP(SH2ドメイン含有イノシトールホスファターゼ)
SH−PTP1タンパク質チロシンホスファターゼ
SH−PTP2タンパク質チロシンホスファターゼ
SIRPα1(シグナル関連タンパク質α)
SIP1(Smad相互作用タンパク質1)
Smad2(SmaおよびMad関連2(Sma and Mad−related2)
Smad3(SmaおよびMad関連3)
Smad5(SmaおよびMad関連5)
Smad7(SmaおよびMad関連7)
SOCS−1(サイトカインシグナリング1のサプレッサー(Suppressor of Cytokine Signaling−1))
SOCS−2(サイトカインシグナリング2のサプレッサー)
SOCS−3(サイトカインシグナリング3のサプレッサー)
SOS(セブンレスの息子(Son of Sevenless))
Src非レセプターチロシンキナーゼ
SRF(血清応答因子)
SRPK1(SRタンパク質特異的キナーゼ1)
SRPK2(SRタンパク質特異的キナーゼ2)
STAT1α(転写1のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター(Signal Transducer and Activator of Transcription 1))
STAT2(転写2のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター)
STAT3(転写3のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター)
STAT4(転写4のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター)
STAT5α(転写5αのシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター)
STAT5β(転写5βのシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター)
STAT6(転写6のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター)
Syk(脾臓チロシンキナーゼ)
シンデカン膜貫通プロテオグリカン
T
Tak1(TGF−b1活性化キナーゼ)
テーリン
TANK/I−TRAF(TNFレセプター活性化因子)
タウ微小管結合タンパク質
TBK−1/T2K(TANK結合キナーゼ1)
テンシン(Tensin)
TNF−RI(腫瘍壊死因子レセプターI)
TRADD(TNFレセプター結合細胞死誘導領域タンパク質)
TRAF1(TNFレセプター結合因子1)
TRAF2(TNFレセプター結合因子2)
TRAF3(TNFレセプター結合因子3)
TRAF4(TNFレセプター結合因子4)
TRAF5(TNFレセプター結合因子5)
TRAF6(TNFレセプター結合因子6)
TrkAタンパク質チロシンレセプターキナーゼA
TrkBタンパク質チロシンレセプターキナーゼB
TrkCタンパク質チロシンレセプターキナーゼC
V
VEGFレセプター(血管内皮増殖因子レセプター1型、2型、3型)
ビンキュリン
W
WASP(ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質)
Z
ZIP(ζ相互作用タンパク質)
ZIPキナーゼ(ジッパーセリン/スレオニンキナーゼ)
ZRP−1(ジキシン関連タンパク質)
ジキシン
【0062】
本発明の抗体はまた、治療目的についてのリン酸化ポリペプチドの不活化に有用である。本実施例は、本発明を例示し、そして趣旨または範囲において、本発明を限定するように意図されない。同様に、これらの試薬および方法の説明は、逆の機能において使用されて、タンパク質特異的ホスファターゼ(特定のアミノ酸残基からリン酸基を除去する酵素)の活性を分析し得る。
【図面の簡単な説明】
【図1】
図1は、抗ホスホタウ[pS199]リン酸化部位特異的抗体(PSSA)の特異性を例示する。
【図2】
図2は、抗ホスホタウ[pS214]PSSA特異性を例示する。
【図3】
図3aおよび3bは、ELISAによる全体的タウ対PKA/セリン214部位でリン酸化されるタウの検出を例示する。
【図4】
図4a〜bは、ELISAによるGSK−3β/セリン199/202でリン酸化されるタウ(4a)対全体的タウ(4b)部位の検出を例示する。
【図5】
図5は、タウセリン214PSSAを用いたELISAにおいて作製される用量反応曲線を例示する。
【図6】
図6は、ELISAにおけるタウPSSAの特異性を例示して、PKA対GSK−3β酵素によって触媒されるタウリン酸化を検出する。
【図7】
図7は、タウ上の複数のGSK−3βリン酸化部位が、タウPSSAを用いたELISAによって検出され得ることを例示する。
【図8】
図8は、PKA活性の特異的インヒビターが、タウのセリン214に対するリン酸化を選択的に阻害するが、ELISAによって検出されるように、タウ[pS214]PSSAおよびタウ[pS199]PSSAを用いて実証されるように、GSK酵素活性を妨害しないことを例示する。
【図9】
図9は、抗Rb[pT821]の特異性を規定する。
【図10】
図10はRb[pT821]ELISAの特異性を決定するための研究を示す。
【図11】
図11は、ペプチド競合によって決定されるように、スレオニン821についてのRb[pT821]ELISAの特異性を示す。
【図12】
図12は、ジャーカット細胞におけるキナーゼ活性の評価におけるRb[pT821]ELISAの適用が、キナーゼインヒビターであるスタウロスポリンの存在下で増加したことを示す。
【図13】
図13は、EGFR PSSA[pY1173]の特異性を例示する。
【図14】
図14は、ペプチド競合によって決定されるように、チロシン残基1173についてのEGFR[pY1173]ELISAの特異性を示す。
【図15】
図15は、EGFR[pY1173]ELISAを使用したEGFでの処理後の、A431細胞におけるEGFRのリン酸化の応答曲線を実証する。
【図16】
図16は、A431細胞におけるキナーゼ活性の評価におけるEGFR[pY845]ELISAの適用が、チロシンキナーゼインヒビターであるPD158780の存在下で増加したことを示す。
Claims (20)
- タンパク質に対するホスホキナーゼ活性を測定するための方法であって、
(a)タンパク質をホスホキナーゼに供して、該タンパク質上のリン酸化部位をリン酸化するステップと、
(b)該タンパク質上のリン酸化されるリン酸化部位に特異的な抗体を提供するステップと、
(c)(a)由来のタンパク質を(b)の抗体と接触させるステップと、
(d)該リン酸化部位に結合した抗体を検出するステップと、
からなる方法。 - 前記タンパク質がタウタンパク質であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ホスホキナーゼがGSK−3β、PKA、PKC、CDK−5、MARK、JNK、p38MAPKまたはカゼインキナーゼIIであることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記抗体が、表IIに示される部位から選択される前記タウタンパク質中の特定の位置におけるリン酸化部位に特異的であることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- 前記タンパク質が表1におけるタンパク質から選択されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質がEGFRであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質がRbであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- リン酸化セリンを有するポリペプチド免疫原から調製される抗体。
- リン酸化スレオニンを有するポリペプチド免疫原に対して惹起される抗体。
- リン酸化チロシンを有するポリペプチド免疫原に対して惹起される抗体。
- 配列番号1に特異性を有する抗体。
- 配列番号2に特異性を有する抗体。
- EGFRリン酸化されたチロシン1173部位またはチロシン845部位に対する抗体。
- リン酸化されたスレオニン821部位に対する抗体。
- タンパク質に対するホスホキナーゼ活性の測定のためのキットであって、
(a)該タンパク質のリン酸化形態および非リン酸化形態の両方に特異的かつ該タンパク質のリン酸化形態および非リン酸化形態の両方に結合する第一のpan抗体と、
(b)標識されることを特徴とする、該第一のpan抗体由来のタンパク質上の独立部位に結合する第二のpan抗体と、
(c)非リン酸化タンパク質スタンダードおよびリン酸化タンパク質スタンダードと、
(d)標識されることを特徴とする、該タンパク質上の標的部位がリン酸化される場合にのみ該タンパク質に結合するリン酸化部位特異的抗体(PSSA)と、
(e)緩衝液と、
からなるキット。 - 前記タンパク質がタウであることを特徴とする請求項11に記載のキット。
- 前記タンパク質が表Iに列挙されるタンパク質から選択されることを特徴とする請求項11に記載のキット。
- リン酸化部位のプロフィールを定量することによる、タンパク質に対する異なるキナーゼ活性の測定のためのキットであって、
(a)該タンパク質のリン酸化形態および非リン酸化形態の両方に結合する第一のpan抗体と、
(b)標識されることを特徴とする、該第一のpan抗体由来のタンパク質上の独立部位に結合する第二のpan抗体と、
(c)該タンパク質の非リン酸化形態およびリン酸化形態についてのタンパク質スタンダードと、
(d)抗体が存在するように標識されることを特徴とする、タンパク質上の標的部位がリン酸化される場合にのみ該タンパク質に結合する2つ以上のPSSAと、
(e)緩衝液と、
からなるキット。 - 前記タンパク質がタウであることを特徴とする請求項14に記載のキット。
- 前記タンパク質が表Iに規定される通りであることを特徴とする請求項14に記載のキット。
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