JP2004500110A

JP2004500110A - 自己反応性ｔ細胞による組織破壊をブロックする方法

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Publication number: JP2004500110A
Application number: JP2001570286A
Authority: JP
Inventors: リウ，　ヤン; チェン，　パン; バイ，　シュエ−フェン
Original assignee: Ohio State University Research Foundation
Current assignee: Ohio State University Research Foundation
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-29
Publication date: 2004-01-08
Also published as: CA2404340C; AU5979201A; CA2404340A1; EP1267909A1; EP1267909B1; EP1267909A4; DK1267909T3; WO2001072325A1; ATE475428T1; DE60142684D1; AU2001259792B2; WO2001072325A9

Abstract

哺乳動物における、組織の自己反応性Ｔ細胞惹起破壊をブロックする方法が提供される。１つの実施形態において、この方法は、生物学的有効量の単離されかつ精製されたＣＤ２４ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドを含む融合タンパク質、を含む薬学的組成物を、自己免疫疾患を有する疑いのある哺乳動物被験体に投与する工程、を包含する。別の実施形態において、この方法は、生物学的に活性な量の抗ＣＤ２４抗体または抗ＣＤ２４　Ｆａｂフラグメントを含む薬学的組成物を被験体に投与する工程、を包含する。本発明はまた、本発明において使用される単離かつ精製されたＣＤ２４融合タンパク質、ならびにトランスジェニックマウスであってそのＴ細胞および／またはその血管上皮細胞においてヒトＣＤ２４タンパク質を発現するが、いずれの細胞上においてもマウス熱ショック抗原を発現しない、トランスジェニックマウスに関する。

Description

【０００１】
本発明は、少なくとも一部は、アメリカ合衆国、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金番号Ａ１３２９８１によって支援されている。合衆国政府は、本発明に対して特定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、有害なＴ細胞媒介免疫応答をブロック（阻止）するための因子（薬剤）および方法に関する。このような反応は、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬、糖尿病、およびアレルギーなど）において生じる。このような反応はまた、移植片の拒絶の間にも生じる。
【０００３】
Ｔ細胞の活性化および増殖には、２つのタイプのシグナルが必要である。第一は、免疫応答に対して特異性を与えるものであり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上の、Ｔ細胞レセプター／ＣＤ３複合体と、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩタンパク質との間の相互作用に関する。第二のタイプのシグナルは、同時刺激シグナルと呼ばれ、ＡＰＣおよびＴ細胞の表面上で発現されたレセプター−リガンド対の間の相互作用に関する。同時刺激レセプター−リガンド対の１例は、Ｂ７リガンドおよびその対応するレセプターＣＤ２８である。ＡＰＣの表面上の、そのリガンドＢ７−１またはＢ７−２によるＣＤ２８の係合によって、シグナル伝達ケスケードが開始され、特定のＴ細胞のサイトカイン産生および増殖が頂点に達する。
【０００４】
理論的には、自己免疫疾患は、Ｔ細胞の活性化および自己反応性Ｔ細胞の形成をブロック（阻止）することによって防止され得る。従って、Ｔ細胞の活性化をブロックするために用いられ得る方法または因子を同定するために、多数の研究が行われている。不幸にも、自己免疫疾患を有する患者は、すでに自己反応性Ｔ細胞を発生させているので、これらの方法は、自己免疫疾患の処置には限られた価値しか有さない。さらに、全身のＴ細胞活性化を防止する因子は、しばしば重篤な副作用を生じる。例えば、Ｔ細胞の活性化をブロックする因子を用いた処置はまた、この患者を感染および癌に対してさらに感受性にし得る。従って、自己免疫疾患を処置する新しい方法が所望される。自己反応性Ｔ細胞によって惹起される標的組織の破壊を軽減する方法が特に所望され得る。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物の組織の自己反応性Ｔ細胞惹起破壊（Ｔ細胞が惹起する破壊）（Ｔ　ｃｅｌｌ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）をブロック（阻止）する方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、生物学的に有効な量の単離されかつ精製されたポリペプチド（本明細書において、以降ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドと呼ぶ）、またはこのようなポリペプチドを含む融合タンパク質を含む薬学的組成物を、自己免疫疾患を有することが疑われる哺乳動物被験体に投与する工程、を包含する。本明細書において用いる場合、用語ＨＳＡ／ＣＤ２４は、マウス細胞の表面に見出された熱ショックタンパク質（ＨＳＡ）のタンパク質部分だけでなく、マウスＨＳＡの哺乳動物相同体もいう。従って、用語ＨＳＡ／ＣＤ２４は、本出願において用いられる場合、ヒトＣＤ２４およびラットＣＤ２４（マウスＨＳＡの既知のヒトおよびラットの相同体）のポリペプチド部分を包含する。好ましくは、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドは、グリコシル化されている。この融合タンパク質は、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはＨＳＡ／ＣＤ２４の短縮型（ペプチドまたはタンパク質のタグに対してペプチド結合によって連結されている）を含む。別の実施形態において、この方法は、生物学的に有効な量の抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体、または抗ＨＳＡ／ＣＤ２４　Ｆａｂフラグメントを含む薬学的組成物を、この被験体に対して、投与する工程を包含する。
【０００６】
本発明はまた、血管内皮細胞に対する自己反応性Ｔ細胞の結合をブロックする方法に関する。この方法は、血管内皮細胞を、この血管内皮細胞との自己反応性Ｔ細胞の相互作用を阻害する十分な量のＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドもしくはそのフラグメント、またはＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドもしくはそのフラグメントを含む融合タンパク質、または抗ＨＳＡ抗体と接触させる工程、を包含する。
【０００７】
本発明はまた、上記の方法において使用される単離かつ精製されたＨＳＡ／ＣＤ２４融合タンパク質、ならびにトランスジェニックマウスであって、そのＴ細胞および／またはその血管内皮細胞において、ヒトＣＤ２４タンパク質を発現するが、いずれの細胞においてもマウスＨＳＡを発現しない、トランスジェニックマウス、に関する。このようなマウスは、ヒトＣＤ２４媒介自己免疫疾患の生物学的機能をブロック（阻止）または強化するように設計された薬物の有効性を試験するための特有のモデルを提供する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、哺乳動物被験体における自己反応性Ｔ細胞による組織の破壊をブロックするための方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、自己免疫疾患を有することが疑われる哺乳動物に、生物学的有効量の単離および精製されたＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む薬学的組成物を投与する工程を包含する。別の実施形態において、ペプチドまたはタンパク質タグに結合されたペプチドによって連結されたＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む融合タンパク質は、哺乳動物に投与される。好ましくは、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドは、グリコシル化されている。別の実施形態において、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドに免疫特異的である抗体は、哺乳動物に投与される。
【０００９】
本発明はまた、自己免疫疾患を有することが疑われるヒト被験体を処置する方法に関する。１つの実施形態において、この方法は、生物学的に有効量の単離および精製されたＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのフラグメント、またはこのような分子を含む融合タンパク質を含む薬学的組成物を、ヒト被験体に投与する工程を包含する。別の実施形態において、この薬学的組成物は、抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体またはそのＦａｂフラグメントを含む。好ましくは、抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体は、モノクローナル抗体、より好ましくは、ヒト化モノクローナル抗ヒトＣＤ２４抗体である。好ましくは、薬学的組成物は、自己反応性Ｔ細胞が、ヒト被験体中で検出された後、投与される。
【００１０】
好ましくは、薬学的組成物は、静脈内注射によって投与される。本発明の方法は、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、慢性関節リウマチ、およびインシュリン依存糖尿病のような自己免疫疾患を有することが疑われる被験体を処置するために有用である。「処置すること」は、状態の重症度を軽減または妨げることを意味する。例えば、ＭＳのようなＣＮＳの自己免疫脱髄性疾患の場合では、この薬学的組成物は、患者が臨床的症状を有する場合か、またはそれらが一過的な寛解にある場合のいずれかに、投与される。好ましくは、プロトコルは、静脈内投与を含む。慢性関節リウマチの場合では、この薬学的組成物は、急性症状が他の治療方法によって軽減された後、好ましくは静脈内（ｉ．ｖ．）投与される。インシュリン依存糖尿病の場合において、この薬学的組成物は、好ましくは、自己反応性Ｔ細胞が末梢血液中で検出された後、静脈内投与される。
【００１１】
（薬学的組成物）
薬学的組成物は、生物学的に有効量のＨＳＡポリペプチドまたはそのフラグメント、そして好ましくは比較的不活性の局所的キャリアを含む。多数のこのようなキャリアは、慣用的に使用され、そして薬学的な教科書に対する参考文献によって同定され得る。
【００１２】
（ＨＳＡ抗原）
マウスＨＳＡ抗原およびその哺乳動物ホモログは、約７６アミノ酸を含むポリペプチドである。ＨＳＡポリペプチドおよびその哺乳動物ホモログは、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）テールを介して細胞膜に結合されている細胞表面分子である。ＨＳＡ抗原は、多数の造血細胞および発達するニューロン細胞において構成的に発現されている。いくつかのリンパ球（例えば、Ｔ細胞）において、ＨＳＡポリペプチドの発現は、誘導される。図７〜９において示されるように、マウスＨ抗原、ヒトＣＤ２４およびラットＣＤ２４の未成熟形態は、シグナル配列、成熟形態において維持されるコア領域、およびＧＰＩアンカー領域を含む。ヒトＣＤ４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＫ０００１６８で入手可能である。ラットＣＤ４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷＫ１２１６４で入手可能である。マウスＨＳＡ抗原をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ５８６６１で入手可能である。
【００１３】
本発明は、自己免疫疾患を処置するためにＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのフラグメントを使用する新規の方法に関する。好ましくは、ポリペプチドまたはフラグメントは、グリコシル化されている。１つの実施形態において、ＨＳＡ／ＣＤ２４フラグメントは、そのアミノ末端またはカルボキシ末端において、いくつかのアミノ酸（すなわち、１〜２アミノ酸）を欠くＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドの短縮形態である。別の実施形態において、ＨＳＡ／ＣＤ２４フラグメントは、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドのコア領域のみを含むポリペプチド（すなわち、全体のシグナルペプチドおよびＣＰＩアンカー領域を欠くＨＳＡ／ＣＤ２４フラグメント）である。本明細書中で使用される場合、用語ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドは、ヒトＣＤ２４およびラットＣＤ２４を含む、マウスＨＳＡの全ての哺乳動物ホモログを含む。
【００１４】
好ましくは、薬学的組成物中で使用されるＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはＨＳＡ／ＣＤ２４フラグメントは、薬学的組成物が投与される哺乳動物に存在する天然に存在するＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはＨＳＡ／ＣＤ２４のアミノ酸配列に、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９３％、最も好ましくは９６％同一であるアミノ酸配列を有する。マウスＨＳＡについては、成熟ペプチドの１位（Ａｓｎ）、４位（Ｓｅｒ）、１３位（Ａｓｎ）、１５位（Ｓｅｒ）、１７位（Ｓｅｒ）、２１位（Ｓｅｒ）、２２位（Ａｓｎ）、２４位（Ｔｈｒ）および２５位（Ｔｈｒ）における変更（すなわち、シグナルペプチドを欠くペプチド）は、グリコシル化を変化させ得、そして自己反応性Ｔ細胞による組織の破壊をブロックするためのその能力と干渉し得る。従って、変更は、これらの部位において行なわれないことが好ましい。ＨＳＡのヒトホモログ（すなわち、ヒトＣＤ２４）において、３１アミノ酸中２０アミノ酸が、潜在的なグリコシル化部位である。
【００１５】
天然に存在するＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドに１００％未満同一であるＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸がＨＳＡホモログにおいて欠失または置換されているか、または１つ以上のアミノ酸が天然に存在するＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドの配列に挿入されている、変更されたアミノ酸を有する。天然に存在するＨＳＡ／ＣＤ２４配列に少なくとも９５％同一であるＨＳＡ／ＣＤ２４配列は、参照配列の１００アミノ酸あたり、５を超える変更（すなわち、欠失、挿入または置換の組み合わせ）を有さない。配列同一性は、ＤＮＡ　ＳＴＡＲプログラム中のＭＥＧＡＬＩＧＮプロジェクトを使用して、変更されたＨＳＡ／ＣＤ２４配列のアミノ酸配列を、天然に存在する配列と比較することによって決定される。配列は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０の方法を使用する、ＢＬＡＳＴネットワークサービス（ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）におけるソフトウェア基礎的局所的整列研究ツールの方法を使用する同一性計算のために整列される。全ての場合において、整列される場合、候補配列における内部ギャップおよびアミノ酸挿入は、同一性計算を行なう場合に無視されない。
【００１６】
非保存的なアミノ酸置換を有することが可能である場合、置換は、保存的なアミノ酸置換であることが好ましく、このにおいて、置換されたアミノ酸は、参照配列における対応するアミノ酸と類似した構造特性または化学的特性を有する。例として、保存的なアミノ酸置換は、１つの脂肪性または疎水性アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）の別のアミノ酸との置換；１つの水酸基含有アミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）の別のアミノ酸との置換；１つの酸性残基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）の別のアミノ酸との置換；１つのアミド含有残基（例えば、アスパラギンおよびグルタミン）の別のアミノ酸との置換；１つの芳香族残基（例えば、フェニルアラニンおよびチロシン）の別のアミノ酸との置換；１つの塩基性残基（例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン）の別のアミノ酸との置換；ならびに１つの小アミノ酸（例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、およびグリシン）の別のアミノ酸との置換；を含む。
【００１７】
変更は、実験的な自己免疫モデル（例えば、ＥＡＥまたはＮＯＤマウスもしくはラットにおけるＩＩ型糖尿病）の臨床的症状を抑制する際にこのようなポリペプチドを含むＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたは融合タンパク質のＩＤ_５０を消滅させないかまたは実質的に減少させないように設計されている。あるいは、接着アッセイにおけるＩＤ_５０を決定し得る。活性化されたＴ細胞の血管内皮細胞への結合を少なくとも５０％減少するために必要な改変体の量は、好ましくは、天然に存在するＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドの２倍の量を超えない。
【００１８】
本発明はまた、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのコア領域およびタグを含む融合タンパク質（すなわち、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのコア領域のアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ酸配列内の任意の地点に負荷される、１つ以上のアミノ酸、好ましくは約５〜３００のアミノ酸）を使用する。好ましくは、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのコア領域は、グリコシル化されている。代表的には、このような付加は、対応するＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのコア領域の発現された組換え形態の精製を単純化するために行なわれる。このようなタグは、当該分野で公知である。このようなタグの代表的な例としては、一連のヒスチジン残基、エピトープタグＦＬＡＧ、ヘルペス単純糖タンパク質Ｄ、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードする配列が挙げられる。好ましくは、この融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＧ１（「ＩｇＧ１」）のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域へのペプチド結合によって連結されたＨＳＡポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。この融合タンパク質は、抗ＩｇＧまたはプロテインＡまたはプロテインＧのいずれかを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製され得る。ＩｇＧは、ヒトにおいて免疫原性ではないので、この融合タンパク質は、必要な場合、繰り返して投与され得る。
【００１９】
（ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製する方法）
ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドおよび融合タンパク質は、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物に由来する無細胞翻訳系およびＲＮＡ分子によって生成され得る。好ましくは、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたは融合タンパク質は、それぞれのＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、次いで、宿主細胞中でポリペプチドの発現を誘導することによって作製される。組換え産物に関しては、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする１つ以上の配列を含む組換え構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレ−ション、形質導入、スクレイプレーディング（ｓｃｒａｐｅ　ｌａｄｉｎｇ）、弾道導入または感染のような従来の方法によって宿主細胞に導入される。
【００２０】
ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたは融合タンパク質は、従来の技術を使用して適切なプロモーターの制御下で、適切な宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、酵母、昆虫細胞または他の細胞）において発現され得る。適切な宿主としては、ＣＨＯ、ＣＯＳ細胞および２９３ＨＥＫ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。適切な宿主株形質転換および適切な細胞密度への宿主株の増殖後、細胞を遠心分離によって収穫し、物理的または化学的手段によって破壊し、そして得られた粗抽出物を、エピトープまたはキメラペプチドのさらなる精製のために保持した。タンパク質の適切にグリコシル化された形態を得るために、ＣＨＯ細胞が使用されることが好ましい。
【００２１】
形質転換された宿主細胞から組換えタンパク質を単離するための従来の手順（例えば、細胞ペレットまたは細胞培養培地からの最初の抽出による単離）後に、塩析、および１つ以上のクロマトグラフィー工程（水性イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー工程、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む）が続き、そしてアフィニティークロマトグラフィーを使用して、組換えポリペプチドを単離し得る。
【００２２】
（キャリア）
受容可能なキャリアは、薬学的に受容可能な希釈剤またはアジュバントである。用語生理学的に受容可能は、ＨＳＡの効果と干渉しない非毒性物質を意味する。このキャリアの特徴は、投与経路および組成物中の特定の化合物または化合物の組み合わせに依存する。このような処方物の調製物は、当業者のレベル以内である。この組成物は、ＨＳＡの活性またはその活性の補体のいずれかを強化する他の薬剤をさらに含む。この組成物は、賦形剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤および当業者に公知の他の物質をさらに含み得る。
【００２３】
（用量）
生物学的な有効量は、自己反応性Ｔ細胞によって開始される標的化された組織の破壊を部分的もしくは完全にブロックするか、または自己免疫疾患の病理学的効果を軽減するのに十分な量である。有効量は、組成物の一回の投与によって達成され得る。あるいは、有効量は、組成物の哺乳動物への複数回の投与によって達成される。
【００２４】
（抗体）
本発明はさらに、薬学的に有効量の抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体、好ましくはヒト化抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体を、自己免疫疾患を有する疑いのあるヒト被験体に投与する工程を包含する治療方法を提供する。抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体の種々の形態は、この治療方法において使用され得る。例えば、抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体は、全長抗体（例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域を有する）または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２）であり得る。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、およびそれらが所望の生物学的活性を示す限り抗体フラグメントを含む。「抗体フラグメント」は、全長抗体の部分、一般的には、抗原結合領域またはその可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖフラグメントが挙げられる。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に相同な抗体の集団から得られた抗体（すなわち、少量で存在し得る可能な天然に存在する変異を除いて同一である集団を含む個々の抗体）をいう。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して、高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向された異なる抗体を代表的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対して指向される。本発明に従って使用され得るモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）において記載される技術を使用してファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００２７】
本明細書中のモノクローナル抗体は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む。「キメラ」抗体において、重鎖および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるかまたは相同であり、一方、残りの鎖は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体のフラグメント（これらが所望の活性を示す限り）における対応する配列と同一であるかまたは相同である。
【００２８】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶ_ＨドメインおよびＶ_Ｌドメインを含み、ここで、これらのドメインは、単鎖ポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成するのを可能にするＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。
【００２９】
「単離された」抗体は、同定され、そしてその天然の環境の成分から分離および／または回収される抗体である。その天然の環境の混入成分は、抗体の診断用途および治療用途と干渉する物質であり、そして酵素、ホルモン、および他のタンパク様または非タンパク様溶質を含み得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ方法によって決定されるように、抗体の９５重量％を超えて、そして最も好ましくは９９重量％を超えて、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によって、Ｎ末端の少なくとも１５残基または内部アミノ酸配列を得るために十分な程度、または（３）クマシーブルー染色もしくは好ましくは銀染色を使用する、還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精製される。単離された抗体は、組換え細胞中のインサイチュでの抗体を含む。なぜなら、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分は、存在しないためである。しかし、本来は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００３０】
ヒトにおいてｍＡｂの潜在的な免疫原性を回避するために、所望の機能を有するｍＡｂは、ヒト化される。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域の残基によって置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能を規定するためにさらに行なわれる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、そして代表的に２つの可変領域の実質的に全てを含み、これらの可変領域において、全てまたは実質的に全ての超可変ループが、非ヒト免疫グロブリンの超ループに対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリン配列の領域である。ヒト化抗体はまた、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、代表的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも部分を含む。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照のこと。
【００３１】
あるいは、ヒトＩｇＶおよびＩｇＣ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを使用して、ヒトＣＤ２４について特異的なヒトｍＡｂを産生する。これらのマウスは、Ｏｂｇｅｎｉｘから入手可能であり、そしてこれらの技術は、完全に記載されている（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９７．１５：１４６）。
【００３２】
（インビボにおいてＣＤ２４ブロッカーの効果を試験するためのトランスジェニックモデル）
ＨＳＡを発現するＣＮＳ中の主要な細胞型が、脳血管内皮細胞であるので、ヒトＴ細胞および血管内皮細胞の両方においてヒトＣＤ２４の特異的な発現を与えるトランスジェニックベクターが、トランスジェニックマウスを調製するために使用される。１つの好ましい実施形態において、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，９４：３０５８−６３（１９９７）記載されるように、Ｔ細胞特異的発現は、ヒトＣＤ２４オープンリーディングフレームおよび近位のｌｃｋプロモーターを含むトランスジェニックベクターを使用して達成され、そして血管内皮細胞特異的発現は、ヒトＣＤ２４オープンリーディングフレームおよびＴｉｅ　ＩＩプロモーターを含むトランスジェニックベクターを使用して達成される。内因性ＨＳＡによる干渉を回避するために、このトランスジェニックベクターは、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．８５：２５１−２６２（１９９８５）に記載されるように、マウスＣＤ２４の標的化変異を有するマウス由来の受精胚に注射する。あるいは、ＣＤ２４遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを、ＣＤ２４（−／−）マウスと交配させて、内因性ＣＤ２４の発現を回避し得る。導入遺伝子発現の組織特異性は、抗ＣＤ２４　ｍＡｂ（これは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能である）、確立された手順に従うフローサイトメトリーおよび免疫組織化学を用いて、確認され得る。
【００３３】
上記のように作製されたトランスジェニックマウスを使用して、ヒトＣＤ２４分子を標的化する薬物をスクリーニングする。１つの例は、自己免疫状態（例えば、多発性硬化症）および糖尿病を阻害または改善する薬物についてスクリーニングする。多発性硬化症に関する最も適切なマウスモデルは、ＥＡＥ（これは、確立された手段に従ってＭＯＧを用いてマウスを免疫することによって誘導される）である。
【００３４】
糖尿病に関してＣＤ２４を標的化する薬物を試験するための好ましい方法は、ヒトＣＤ２４トランスジェニックマウスを非肥満糖尿病性（ＮＯＤ）マウスと交配させて、導入遺伝子をＮＯＤバックグラウンドと交雑させることである。ＨＳＡを標的化する薬物またはそのホモログが、約２〜３週間で投与されて、インスリンおよび自発的な糖尿病の低下におけるそのＩＤ５０が決定される。
【００３５】
本発明はまた、内皮細胞への自己反応性Ｔ細胞の結合をブロックする方法に関する。この方法は、内皮細胞と、十分な量のＨＳＡまたはＨＳＡを含む融合タンパク質とを接触させて、自己反応性Ｔ細胞とこの内皮細胞の表面上に提示されるＨＳＡ分子との相互作用を阻害する工程を包含する。これらの細胞は、インビトロ（すなわち、組織培養物中）、またはインビボ（すなわち、哺乳動物の体内）であり得る。内皮細胞とＴ細胞との間の、インビトロのブロッキング相互作用は、タンパク質を、Ｔ細胞および内皮細胞の両方を含むチャンバに添加することによって達成される。ＨＳＡタンパク質の存在下または非存在下における内皮細胞の単層に結合したＴ細胞の量は、結合した細胞数を計数することによってか、またはこの単層に添加する前に標識されたＴ細胞の数を定量するための他の方法のいずれかによって、定量される。
【００３６】
インビボにおける内皮細胞と自己反応性Ｔ細胞との間の相互作用は、タンパク質を静脈内注射することによって阻害される。阻害の程度を定量するために、蛍光標識されたＴ細胞が、動物に投与され、そして血管に沿ったＴ細胞の回転が、当該分野で公知の確立された手順を用いて測定される。
【００３７】
（実施例１　ＨＳＡＩｇを用いた、実験的自己免疫脳脊髄炎を有する動物の処置）
（方法）
野生型マウスＣ５７ＢＬ／６マウス（ＷＴ）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から購入した。崩壊したＨＳＡについてのマウスホモ接合体（Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞を用いて産生された）（１８）（２４）またはＣＤ２８遺伝子座についてのマウスホモ接合体（８世代より多くＣ５７ＢＬ／６に対して戻し交雑された）は、以前に記載され、そしてＯｈｉｏ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒの動物施設に維持されている。ＨＳＡトランスジェニックマウス（ＨＳＡＴＧ）は、以前に記載されている（Ｚｈｏｕ，Ｑ．，Ｗｕ，Ｙ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．，およびＬｉｕ，Ｙ．１９９７を参照のこと）。熱安定性抗原の同型相互作用は、Ｔ細胞のクローン性拡大についてのその同時刺激活性の原因ではなく（Ｅｕｒ．Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２５２４−２５２８（これは、本明細書中に参考として詳細に援用される））、そして、５世代より多くＣ５７ＢＬ／６ｊバックグラウンドに戻し交雑された。Ｔ細胞系統上に排他的に発現されるＨＳＡを有するマウス（ＨＳＡＴＧ／ＨＳＡ（−／−））を、ＨＳＡＴＧマウスをＨＳＡ（−／−）マウスと交雑させることによって作製した。
【００３８】
（ＥＡＥの誘導および臨床的な評価）免疫原であるラット起源のＭＯＧペプチド３５〜５５（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）によって合成した。ペプチドの純度は、９０％よりも高かった。８〜１２週齢のマウスを、総容量１００μｌ中の完全フロイントアジュバント（１ｍｌ当たり４００μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中の２００μｇ　ＭＯＧペプチドを用いて皮下的に免疫した。このマウスに、この免疫の直後、２００μｌ　ＰＢＳ中の２００μｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｍｂｅｌｌ，ＣＡ）を尾静脈中に与え、そして再び４８時間後に与えた。このマウスを、１日置きに観察し、そして中間的なスコアについては０．５の段階を設けて、０〜５の尺度に対してスコア付けした：０、臨床的な徴候なし；１、尾の感受性（ｔｏｎｅ）の喪失；２、不安定な歩行；３、後肢の麻痺；４、後肢および前肢の麻痺；５、死。
【００３９】
（Ｔ細胞増殖アッセイ）排出リンパ節細胞（ｄｒａｉｎｉｎｇ　ｌｙｍｐｈｏ　ｎｏｄｅ　ｃｅｌｌ）を、免疫の１０日後に単離した。５×１０^５細胞／ウェルを、照射した（２，０００ｒａｄ）同系脾細胞の６×１０^５細胞／ウェルの存在下で、所定の濃度のＭＯＧペプチドを用いて６０時間、刺激した。この培養物を、^３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル；ＩＣＮ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ．，Ｃｏｓｔａ　Ｍｅｓａ，ＣＡ　ＵＳＡ）を用いてさらに１２時間パルスし、そして３Ｈ−チミジンの取り込みを、液体シンチレーションＰ−プレート計測器で測定した。
【００４０】
（インビトロにおけるＭＯＧペプチドを用いた再刺激の際に、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４を産生するＴ細胞の頻度を評価するための、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）抗体対および手順は、刺激のためにＭＯＧペプチドを１０μｇ／ｍｌで使用した以外は、記載されている（２０）。示される数は、１００万個の排出リンパ節細胞当たりのサイトカイン産生細胞の数である。
【００４１】
（組織学）
マウスを、ＣＯ_２吸入によって屠殺した。脊髄を、吸入によって取り出し、そして１０％　ホルマリン／ＰＢＳ中に固定した。パラフィン切片を調製し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。神経学的病変を、以下の基準に従って、１脊髄あたり１０切断面の各々に対して等級に分けた：０、浸潤なし；１、３以下の病巣の髄膜浸潤；２、３より多くの病巣の髄膜浸潤；３、白質の５％未満の関与を伴なう実質中の５までの脈管周囲浸潤病巣；４、実質中の５〜１０の脈管周囲病巣または白質の５〜２５％を含む浸潤；５、１０より多くの脈管周囲病巣または白質の２５％より多くを含む広汎性の浸潤。
【００４２】
（ＥＡＥの受動伝達）
８〜１０匹のＷＴマウスまたはＨＳＡ（−／−）マウスの群を、２００μｇのＭＯＧペプチドを用いて皮下的に免疫した。免疫の１０日後、排出リンパ節を、収集し、そして１５％ウシ胎仔血清、５％　ＩＬ−２上清、および５０μｇ／ｍｌのＭＯＧペプチドを補充したＣｌｉｃｋ’ｓ　ＥＨＡＡ培地中、４×１０^６／ｍｌで４日間刺激した。１×１０^８細胞を、１時間前にγ照射した（５５０ｒａｄ）各レシピエントマウスに、腹腔内注射した。
【００４３】
（融合タンパク質の調製およびＥＡＥ　ｚの処理）
シグナルペプチドおよび成熟タンパク質配列をコードするＨＳＡフラグメントを、順方向プライマーとしてのＧＧＡ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＡＧＡ　ＧＣ（配列番号６）、逆方向プライマーとしてのＣＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＴＧＧ　ＴＧＧ　ＴＡＧ　ＣＧ（配列番号７）、鋳型としてのＨＳＡ　ｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ酵素およびＢｇｉ　ＩＩ酵素を用いて消化し、そしてＨｉｎｄ　ＩＩＩおよびＸｂａ　Ｉで消化したｐＣＤＭ８ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）ならびにヒトＩｇＧ１　ＦｃをコードするＸｂａ　ＩおよびＢａｍ　ＨＩ処理したＤＮＡフラグメント（これは、順方向プライマーとして、ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＣＧＡ　ＧＧＧ　ＴＧＡ　ＧＴＡ　ＣＴＡ　ＡＧＣ　ＴＡＧ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　ＣＧＣ　ＴＣＣ　ＴＧＣ　ＣＴＧ（配列番号７）、および逆方向プライマーとして、ＣＴＴ　ＣＧＡ　ＣＣＡ　ＧＴＣ　ＴＡＧ　ＡＡＧ　ＣＡＴ　ＣＣＴ　ＣＧＴ　ＧＣＧ　ＡＣＣ　ＧＣＧ　ＡＧＡ　ＧＣ（配列番号８）、ならびに鋳型として、ヒト末梢血由来のＤＮＡを用いるＰＣＲによって増幅した）に連結した。この構築物を、ＤＮＡ配列決定によって確認し、そしてチャイニーズハムスター卵巣細胞株をトランスフェクトするために使用した。ＨＳＡＩｇ融合タンパク質を分泌する細胞を、５％　ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中でコンフルエントになるまで増殖させた。細胞単層を、無血清培地を用いて洗浄し、そして最適なＭ培地中で７２時間培養した。この上清を収集し、そしてＨＳＡＩｇを、製造業者らのプロトコールに従ってプロテインＧカラムを用いて精製した。このタンパク質の純度を、ＳＤＳ　ＰＡＧＥによって確認した。
【００４４】
（結果）
ＨＳＡがＥＡＥの発生に必須であるか否かを試験するために、本発明者らは、完全フロイントアジュバントおよび百日咳毒素と組合わせてミエリン稀突起神経膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドＡＡ３５〜５５を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウス、およびＨＳＡ欠損マウスまたはＣＤ２８欠損マウスを免疫した。図１ａに示されるように、野生型マウスはペプチド免疫の２週間以内に急性ＥＡＥを発生したが、ＨＳＡまたはＣＤ２８のいずれかの標的化された変異を有するマウスは、ＥＡＥ誘導に完全に耐性であった。興味深いことに、排出リンパ節細胞の増殖性応答によって明らかなように、ＣＤ２８の標的化された変異は、ＭＯＧ特異的Ｔ細胞の誘導を除去したが、ＨＳＡの標的化された変異は、ペプチド特異的Ｔ細胞増殖にほとんど影響しなかった（図１ｂ）。さらに、抗原特異的ＩＬ２産生細胞、ＩＬ４産生細胞、およびＩＦＮγ産生細胞の頻度は、ＨＳＡ（−／−）マウスにおいて変更されなかった（図１ｃ）。抗ＭＯＧペプチドＩｇＧ応答がまた、ＨＳＡ欠損マウスにおいて検出された（データは示さず）。Ｔ細胞初回免疫に際してのＨＳＡ変異およびＣＤ２８変異の異なる効果は、これらの遺伝子が、ＥＡＥの発生において２つの異なるチェックポイントを媒介することを明らかにする（ＣＤ２８は、急性反応性Ｔ細胞の誘導を制御するが、ＨＳＡは、その病原性を決定する）。
【００４５】
ＭＯＧペプチドで免疫されたＷＴおよびＨＳＡの組織学的分析によって、臨床的なスコアが確認される。この組織学的スコアを、図２ａに要約し、一方、代表的な組織学切片を、図２ｂ〜ｄに示した。図２ｂに示されるように、ＭＯＧペプチドを用いた活性な免疫は、実質の拡張性浸潤を伴なう複数の病変によって特徴付けられる、野生型マウスにおける複数の神経学的病変を誘導する。対照的に、ＨＳＡ−ＫＯマウスの脊髄は、いずれの病変も欠くか（図２ｃ）、または髄膜を含む１もしくは２の低いグレードの病変を伴なう（図２ｄ）かのいずれかである。
【００４６】
本発明者らは、ＷＴおよびＨＳＡ欠損レシピエントに、活性化された排出リンパ節細胞を養子的に移入した。図３および図４に示されるように、ＷＴのＴ細胞は、養子移入の８日以内にＷＴレシピエント中に重篤なＥＡＥを誘導した。興味深いことに、ＨＳＡ欠損レシピエントは、ＥＡＥを発生しなかった。従って、Ｔ細胞におけるＨＳＡ発現単独では、ＥＡＥ発生には不十分なようである。さらに、ＨＳＡ欠損マウス由来のＴ細胞は、レシピエント中のＨＳＡ遺伝子の状態に関わらず疾患を誘導できず、このことは、Ｔ細胞におけるＨＳＡ発現が、ＥＡＥ発生に必要であることを示す。これらの結果は、ＨＳＡが、ＥＡＥを誘導するために、宿主細胞および自己反応性Ｔ細胞の両方において発現されなければならないことを強く示唆する。
【００４７】
これらの観察を強固にするために、本発明者らは、Ｔ細胞においてＨＳＡを排他的に発現するマウスを作製した。本発明者らは、ＨＳＡの発現がｌｃｋ近位プロモーターの制御下であったトランスジェニックマウス（ＨＳＡＴＧ）を以前に報告している（２２）。この研究のために、本発明者らは、ＨＳＡ導入遺伝子をＨＳＡ欠損マウスに交雑させて、Ｔ細胞においてＨＳＡを排他的に発現するマウスを作製した（図５ａ）。Ｔ細胞系統におけるＨＳＡ発現が、ＥＡＥ発生に十分であるか否かを試験するために、本発明者らは、ＷＴマウス、ＨＳＡ−ＴＧマウス、ＨＳＡ（−／−）マウス、およびＨＳＡＴＧ　ＨＳＡ（−／−）マウスを、ＭＯＧを用いて免疫した。図５ｂに示されるように、野生型マウスおよびＨＳＡＴＧマウスは、本質的に同一の動態でＥＡＥを発生し、このことは、Ｔ細胞におけるＨＳＡのトランスジェニック発現が、自己反応性Ｔ細胞の産生およびエフェクター機能を妨害しないことを示す。それにもかかわらず、ＨＳＡ（−／−）マウスと類似して、Ｔ細胞系統において排他的なＨＳＡ発現を伴なうマウスは、ＥＡＥを発生し得なかった。これらの結果は、Ｔ細胞系統におけるＨＳＡ発現のみでは、ＥＡＥ発生には不十分であることを明らかに実証した。
【００４８】
ＨＳＡが、自己反応性Ｔ細胞の活性化後の重要なチェックポイントであり得るという事実は、自己免疫神経学的疾患を処置する際の新規なアプローチを示唆する。抗ＨＳＡ　ｍＡｂは、この問題を扱うためのＥＡＥモデルにおいて毒性であったので（データは示さず）、本発明者らは、ＨＳＡの細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ部分との間の融合タンパク質を作製して、ＨＳＡ媒介相互作用をブロックした。図６ａに示されるように、この融合タンパク質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ下において約１００ｋＤの見かけの分子量を有する。還元後、この融合タンパク質は、５０ｋＤのバンドとして移動した。本発明者らは、ＭＯＧペプチドを用いた免疫の８〜１０日後（このとき、ＭＯＧ特異的Ｔ細胞応答は、局所リンパ節中に既に拡大していた）にマウスの処理を開始した。図６ｂに示されるように、ＨＳＡＩｇは、ＥＡＥを劇的に改良した。ＨＳＡＩｇ処理した全てのマウスは、コントロールマウスよりも、実質的に早く回復した。ＭＯＧ反応性Ｔ細胞が、ＨＳＡＩｇ投与の前に活性化されていたので、処置群における臨床徴候は、いくらかの自己反応性Ｔ細胞が中枢神経系に既に移動したという事実を反映し得る。
【００４９】
ＨＳＡＩｇ（マウスＨＡＳの細胞外ドメインおよび免疫グロブリンのＦｃ部分からなる融合タンパク質）は、自己反応性Ｔ細胞が拡大された後に投与された場合でさえ、ＥＡＥの臨床徴候を劇的に改善する。従って、新規チェックポイントとしてのＨＳＡの同定は、（たとえ、自己反応性Ｔ細胞の活性化および拡大の後であっても）自己免疫神経学的疾患（例えば、多発性硬化症）の免疫治療のための新規アプローチを提供する。
【００５０】
（実施例２　ヒトＣＤ２４Ｉｇ融合タンパク質の産生）
ＧＰＩアンカー領域を欠くヒトＣＤ２４ポリペプチドのフラグメントを、ヒトＩｇ定常領域と融合させ、ＣＤ２４−Ｉｇ融合タンパク質を形成する。１つの実施形態において、このＣＤ２４ポリペプチドフラグメントは、シグナルペプチドを含む。別の実施形態において、このＣＤ２４ポリペプチドフラグメントは、シグナルペプチドを欠く。ヒトＣＤ２４コード配列のフラグメントを、ベクターｐＩｇ（Ｎｏｖａｇｅｎより）のＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位およびＢａｍＨＩ部位にサブクローン化する。サブクローニングに有用な適切なプライマーとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ヒトＣＤ２４において、ＣＤ２４順方向プライマー（ＣＤ２４Ｆ．Ｈ３）：Ｇ　ＧＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＧＴＧ（配列番号９）（ＡＴＧ開始コドンに対して５’側にＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位を有する）、ＣＤ２４−Ｉｇ　逆方向プライマー（ＣＤ２４Ｒｉｇ．Ｂｍ）：ＧＧ　ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＣＣＡ　ＣＴＴ　ＡＣＣ　ＴＧＴ　ＣＧＣ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ　ＡＴＴ（配列番号１０）（ＴＴＫＡ（直接配列ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＡＡＧ　ＧＣＧ（配列番号１２））の３’末端の隣にＢａｍ　ＨＩ部位およびＳＤ配列（Ａ　ＣＴＴ　ＡＣＣ　ＴＧＴ（配列番号１１）を有する）。この構築物を、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、そしてＣＤ２４Ｉｇは、組織培養培地中に分泌される。ＣＤ２４Ｉｇを、プロテインＧカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。このクローンは、ＣＤ２４シグナルペプチド、ＣＤ２４コアペプチドおよびＩｇＧ／Ｆｃ部分を含むが、ＧＰＩアンカーシグナル伝達領域は欠く。
【００５１】
（実施例３　自己活性化Ｔ細胞によって開始される組織破壊をブロックする抗ヒトＣＤ２４　ｍＡｂの産生）
ヒトＣＤ２４コード配列を、ベクターｐＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより）のＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位およびＸｈｏ　Ｉ部位にサブクローン化する。ＣＤ２４順方向プライマー（ＣＤ２４Ｆ．Ｈ３）：Ｇ　ＧＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＧＴＧ（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ部位を有し、ＡＴＧ開始コドンに対して５’側）。ＣＤ２４　逆方向プライマー（ＣＤ２４Ｒ．Ｘｈｏ）：Ａ　ＴＣＣ　ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＡＧＡ　ＧＴＡ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＣＡＧ（Ｘｈｏ　Ｉ部位を有し、ＴＡＡ終止コドンに対して３’側）。ＣＤ２４　ｃＤＮＡを、マウス３Ｔ３細胞にトランスフェクトする。ヒトＣＤ２４分子を安定に発現するこの３Ｔ３細胞株を使用して、同系マウスを免疫する。免疫の２〜３後、脾細胞を、骨髄腫ＡｇＸ８６５と融合させ、ＨＡＴ培地を用いた選択後に、その上清を、抗ヒトＣＤ２４　ｍＡｂについてスクリーニングする。インビトロにおいてヒト内皮細胞に対するヒトＴ細胞の接着をブロックする能力、ならびに標的組織（例えば、以下に詳述するトランスジェニックモデルを用いた膵臓および中枢神経系）へのヒトＣＤ２４媒介Ｔ細胞輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）をブロックする能力の両方について、この抗体を試験する。
【００５２】
（実施例４　トランスジェニックマウスを用いた多発性硬化症の推定インヒビターの試験）
免疫原であるラット起源のＭＯＧペプチド３５〜５５（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号１３））は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，ＵＳＡ）から利用可能である。８〜１２週齢のマウスを、総容量１００μｌの、完全フロイントアジュバント（１ｍｌ当たり４００μｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）中の２００μｇ　ＭＯＧペプチドを用いて皮下的に免疫した。このマウスに、この免疫の直後、２００μｌ（２００Ｉｄ）ＰＢＳ中の２００μｇの百日咳毒素（Ｌｉｓｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｍｂｅｌｌ，ＣＡ）を尾静脈中に与え、そして再び４８時間後に与えた。このマウスを、１日おきに観察し、そして中間的なスコアについては０．５の段階を設けて、０〜５の尺度に対してスコア付けした：０、臨床的な徴候なし；１、尾の感受性の喪失；２、不安定な歩行；３、後肢の麻痺；４、後肢および前肢の麻痺；５、死。推定阻害分子を、免疫の１週間後に注射する。ＥＡＥの臨床スコアを実質的に低下したマウスを、さらなる試験のために選択する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＳＡおよびＣＤ２８の標的化変異は、ＥＡＥの発生における２つの異なるチエックポイントを示す。（ａ）ＨＳＡまたはＣＤ２８のいずれかの標的化された変異は、ＥＡＥの誘導を防止する。ＷＴ、ＣＤ２８（−／−）またはＨＳＡ（−／−）マウスを、ＭＯＧペプチドで免疫した。臨床兆候を、方法の節に記載のようにスコア付けした。（ｂ）ＭＯＧペプチドに対するリンパ節Ｔ細胞の増殖性応答。１０日目の免疫したマウス由来の流入領域リンパ節細胞を、所定の濃度のＭＯＧペプチドで刺激した。そして抗原提示細胞として同系のナイーブ脾臓細胞を照射した。（ｃ）ＥＬＩＳｐｏｔによるサイトカインプロデューサーの列挙。（ｂ）で用いた流入領域リンパ節細胞を、キラー細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ　ｃｅｌｌ）として用いた。ＭＯＧペプチド（ＡＡ３５−５５）に応答して１×１０^６のリンパ節細胞のなかからＩＬ２、ＩＬ４およびＩＦＮγのいずれかを分泌する細胞の数を示した。示したデータは、３つの独立した実験からの平均＋／−ＳＥＭであった。
【図２】
ＭＯＧで免疫したＷＴマウスまたはＨＳＡ（−／−）マウスの脊髄の組織学的分析。（ａ）：ＷＴマウスおよびＨＳＡ（−／−）マウスの組織学的スコアの平均およびＳＥＭ。各脊髄において、頸部領域から仙骨領域への、１０の独立した断面を、試験した。このデータは、各群において３匹のマウスからの３０の脊髄部分をまとめている。（ｂ）免疫したＷＴマウスにおける代表的な組織学。試験した全ての切片が、組織学的病変を含む。（ｃ）および（ｄ）免疫したＨＳＡ（−／−）マウスの組織学的切片（１００×）。病変のない切片を（ｃ）に示しており、一方、病変を含む切片を（ｄ）に示している。
【図３】
ＥＡＥの誘導のためのＴ細胞およびＴ細胞でない宿主細胞の両方におけるＨＳＡ発現の必要性。養子移入後１２日でのＨＳＡ（−／−）（ａ，ｂ）またはＷＴ（ｃ，ｄ）レシピエントマウスの脊髄の組織学（ａ、ｂ、ｃおよびｄの左パネルについて６３×；ｄの右パネルについて２００×）。流入領域リンパ節細胞を、免疫後、ＷＴマウスまたはＨＳＡ（　／−）マウスのいずれかから単離し、そしてインビトロで４日間抗原およびＩＬ２で刺激した。活性化Ｔ細胞をＷＴマウスまたはＨＳＡ（−／−）マウスのいずれかに注射した（１マウスあたり、１００×１０^６細胞）。ＥＡＥ発生を、臨床兆候について毎日モニターした。移入の１２日後に、レシピエントマウスを屠殺し、そして組織学試験用に脊髄を処理した。ＷＴ＞ＨＳＡ（−／−）、ＨＳＡ（−／−）＞ＷＴ、またはＨＳＡ（−／）＞ＨＳＡ（−／−）のレシピエントにおいては、疾患は観察されなかった。
【図４】
１群あたり、４匹のマウス（ＷＴ＞ＨＳＡ（−／−）およびＨＳＡ（−／−）＞ＷＴ群）、または５匹のマウス（ＷＴ＞ＷＴおよびＨＳＡ（−／−）＞ＨＳＡ（−／−）群）の養子移入実験の臨床的スコア。
【図５】
Ｔ細胞系列での排他的なＨＳＡのトランスジェニック発現は、ＥＡＥ発生には不十分である。抗ＨＳＡおよび抗ＣＤ３　ｍＡｂを用いたフローサイトメトリーによる、（ａ）ＷＴ、ＨＳＡ−ＴＧ、ＨＳＡ（−／−）およびＨＳＡＴＧ／ＨＳＡ（−／−）のマウスの表現型。（ｂ）ＭＯＧペプチドでの免疫後の、ＷＴ、ＨＳＡＴＧ、ＨＳＡ（−／−）およびＨＳＡＴＧ／ＨＳＡ（−／−）のマウスにおけるＥＡＥスコア。
【図６】
ＨＳＡＩｇは、ＥＡＥを寛解する。（ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＨＳＡＩｇの分析。１０μｇの精製したＨＳＡＩｇを、１０％還元（Ｒ）および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。このタンパク質をクマーシーブルーで染色した。コントロール（ＰＢＳ）またはＨＳＡＩｇ処置マウスについてのＥＡＥスコア。材料および方法に記載のとおり、ＥＡＥを、ＷＴマウスにおいて誘導した。免疫後、８日、１０日、１２日、１４日および２２日で、１グループあたり、５匹のマウスに、ＨＳＡＩｇまたはコントロールとして１００ｍｌのＰＢＳのいずれかを、マウス１匹あたり１００μｇ注射した（ｉ．ｐ．）。ＨＳＡＩｇの効果を、類似の結果を有する３つの独立した実験で評価した。
【図７】
図７は、マウスＨＳＡポリペプチドのアミノ酸配列である配列番号１を示す。このシグナルペプチドは、この配列のアミノ酸１からアミノ酸２６にわたる。グリコホスファチジル（ＧＰＩ）アンカー領域は、アミノ酸５４からアミノ酸７６をふくみ、これにまたがる。
【図８】
図８は、ヒトＣＤ２４ポリペプチドのアミノ酸配列である配列番号２を示す。このシグナルペプチドは、この配列のアミノ酸１からアミノ酸２６にわたる。グリコホスファチジル（ＧＰＩ）アンカー領域は、アミノ酸６０からアミノ酸８０をふくみ、これにまたがる。
【図９】
図９は、ラットＣＤ２４ポリペプチドのアミノ酸配列である配列番号３を示す。このシグナルペプチドは、この配列のアミノ酸１からアミノ酸２６にわたる。グリコホスファチジル（ＧＰＩ）アンカー領域は、アミノ酸５７からアミノ酸７６をふくみ、これにまたがる。
【図１０】
図１０は、ヒトＩｇＧ１　Ｆｃのゲノム配列に融合したＨＳＡをコードするヌクレオチド配列を含む融合遺伝子のＤＮＡ配列である、配列番号４を示す。このｃＤＮＡの予測される配列である配列番号５（これは、イントロンＩｇＧ１　Ｆｃ配列および推定アミノ酸配列である配列番号１４のスプライシングから生じる）がまた、この図に示される。下線を付した通常のフォントは、ＨＳＡ配列であり、太文字は、新しい配列であり、イタリック体はＩｇＧ１　Ｆｃの配列である。

Claims

哺乳動物において自己反応性Ｔ細胞によって惹起される組織の破壊を阻害する方法であって、以下：
薬学的組成物を投与する工程であって、該薬学的組成物が、以下：単離されたＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチド、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドの単離された生物学的に活性なフラグメント、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドを含む融合タンパク質、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを含む融合タンパク質、ならびに抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体からなる群より選択される因子を含み、ここで該薬学的組成物が、該哺乳動物における自己反応性Ｔ細胞惹起組織破壊を減少するのに十分な量で投与される、工程、
を包含する、方法。
前記ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのフラグメントが、グリコシル化されている、請求項１に記載の方法。
自己免疫疾患を有することが疑われる患者を処置する方法であって、該方法は、以下：
該患者に薬学的組成物を投与する工程であって、該薬学的組成物が、以下：ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドの単離された生物学的に活性なフラグメント、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドを含む融合タンパク質、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを含む融合タンパク質、ならびに抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体からなる群より選択される因子を含む工程、
を包含する、方法。
前記ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのフラグメントがグリコシル化されている、請求項３に記載の方法。
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
前記抗体が、ヒト化されたモノクローナル抗体である、請求項３に記載の方法。
前記因子が、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドのコア領域に対してペプチド結合で連結されたペプチドタグを含む融合タンパク質である、請求項２に記載の方法。
前記ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのフラグメントが、グリコシル化されている、請求項７に記載の方法。
前記ペプチドタグがヒトＩｇＧ１　Ｆｃであり、そして前記ポリペプチドが、ヒトＣＤ２４ポリペプチドである、請求項８に記載の方法。
ヒトＩｇＧ　１Ｆｃ、およびヒトＣＤ２４ポリペプチドまたはそのコアフラグメントを含む融合タンパク質。
前記ヒトＣＤ２４ポリペプチドまたはそのフラグメントが、グリコシル化されている、請求項１０に記載の方法。
前記フラグメントが、前記ヒトＣＤ２４ポリペプチドのコア領域である、請求項１１に記載の方法。
トランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスのゲノムが、ヒトＣＤ２４ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで該ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結されており；そしてここで該トランスジェニックマウスは、そのＴ細胞の表面上でヒトＣＤ２４を発現する、トランスジェニックマウス。
前記マウスが、その内皮細胞上でヒトＣＤ２４ポリペプチドをさらに発現する、請求項８に記載のトランスジェニックマウス。
前記トランスジェニックマウスが、内因性マウスＨＳＡを欠く、請求項１３に記載のトランスジェニックマウス。
血管内皮細胞に対する自己反応性Ｔ細胞の結合をブロックする方法であって、以下：
該血管内皮細胞を、因子であって、以下：単離されたＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチド、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドの単離された生物学的に活性なフラグメント、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドを含む融合タンパク質、ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントを含む融合タンパク質、ならびに抗ＨＳＡ／ＣＤ２４抗体からなる群より選択される因子、と接触させる工程であって、ここで該細胞が、該血管内皮細胞との該自己反応性Ｔ細胞の相互作用を阻害するのに十分な量の該因子と接触させられる、工程、
を包含する、方法。
前記ＨＳＡ／ＣＤ２４ポリペプチドまたはそのフラグメントが、グリコシル化されている、請求項１６に記載の方法。