JP2018515605A - 低密度リポタンパク質コレステロールレベルを低下させるためのｃｄ２４の使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、低密度リポタンパク質コレステロールレベルを低下させるための、アテローム性動脈硬化症を処置および防止するための、ならびに心血管疾患のリスクを低減するための、ＣＤ２４タンパク質の使用に関する。特定の実施形態では、被験体において低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させるための方法であって、該方法は、ＣＤ２４タンパク質をその必要性のある被験体に投与することを包含する方法が提供される。

Description

（発明の分野）
本発明は、低密度リポタンパク質コレステロールレベルを低下させるためのＣＤ２４タンパク質の使用に関する。

（発明の背景）
脂質異常症（高レベルの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を包含する）は、動脈硬化性心血管疾患（atherosclerotic cardiovascular disease；ＡＳＣＶＤ）の主要リスク因子であり、これは、死因第１位であり、全世界で大きなヘルスケアコストがかかっている。ＬＤＬ−ＣとＡＳＣＶＤのリスクとの間の関連は、数十年にわたる遺学的研究および生化学研究、観察的疫学研究および地域相関研究、ならびにインビトロ実験および動物実験によって確立されてきた。ＬＤＬ−Ｃを低下させると、ＡＳＣＶＤ事象が低減し、これは、ＬＤＬ−Ｃが冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）およびＡＳＣＶＤにおける中心的な因果的役割を有することを示す。よって、固定用量のコレステロール低下薬は、ＡＳＣＶＤリスクを低減するための一次アプローチとして使用される。特に、上昇したＬＤＬ−Ｃは、スタチン（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コエンザイムＡレダクターゼインヒビター）で最も頻繁に処置される。スタチンは、ＬＤＬ−Ｃをベースラインから５０％まで低下させ、ＡＳＣＶＤリスクを１５〜３７％低減する。

しかし、ＡＳＣＶＤリスクの残り６０〜８０％は残ったままであり、これは、最適なスタチン処置の下ですら、ＣＨＤを有する患者のうちの約２０％において大きな血管事象を引き起こす。さらに、スタチンは、筋症状（例えば、疼痛、圧痛、こわばり、痙攣、脱力、疲労、ミオパチー、および横紋筋融解症）を引き起こし得る。さらに、非スタチン剤（胆汁酸結合樹脂、フィブレート、ナイアシン、およびエゼチミブを包含する）は、脂質プロフィールを有意に改善するが、スタチンと組み合わされた場合に、いずれも心血管事象のさらなるリスク低減を提供しない。よって、ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させかつＡＳＣＶＤのリスクを低減するために改善された非スタチン薬物が必要である。

（発明の要旨）
被験体においてＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるための方法であって、ＣＤ２４タンパク質をその必要性のある被験体に投与することによる方法が本明細書で提供される。被験体においてアテローム性動脈硬化症を処置または防止するための方法であって、ＣＤ２４タンパク質をその必要性のある被験体に投与することによる方法もまた、提供される。心血管疾患（これは、動脈硬化性心血管疾患であり得る）のリスクを低減するための方法であって、ＣＤ２４タンパク質をその必要性のある被験体に投与することによる方法がさらに提供される。上記被験体は、上昇したＬＤＬ−Ｃ（これは、７０ｍｇ／ｄＬ、７５ｍｇ／ｄＬ、または１９０ｍｇ／ｄＬより大きくてもよいしこれらに等しくてもよい）を有し得る。上記被験体は、別のＬＤＬ−Ｃ低下薬（これは、スタチンまたはＰＣＳＫ９のアンタゴニストであり得る）で以前に処置されたことがあってもよい。

上記ＣＤ２４タンパク質は、成熟ヒトＣＤ２４またはそのバリアントの配列を含み得る。上記成熟ヒトＣＤ２４は、配列番号１または配列番号２の配列を含み得る。上記ＣＤ２４タンパク質は、ヒトＣＤ２４の細胞外ドメインのうちのいずれかまたは全てを含み得る。上記ＣＤ２４タンパク質は、シグナル配列を含んでいてもよく、これは、上記タンパク質を発現する細胞からの分泌を可能にし得る。このシグナルペプチド配列は、ヒトＣＤ２４のシグナルペプチド（これは配列番号４を有し得る）を含んでいてもよいし、他の膜貫通タンパク質または分泌型タンパク質で見出されるものであっても、当該分野で公知の既存のシグナルペプチドから改変されたものであってもよい。上記ＣＤ２４タンパク質は、可溶性であり得、そしてグリコシル化され得る。上記ＣＤ２４タンパク質は、真核生物タンパク質発現系を使用して生成され得、この発現系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株中に含まれるベクターまたは複製欠損レトロウイルスベクターを含み得る。複製欠損レトロウイルスベクターは、真核生物細胞のゲノムへと安定して組み込まれ得る。

上記ＣＤ２４タンパク質は、タンパク質タグを含み得、これは、上記ＣＤ２４タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合され得る。上記ＣＤ２４タンパク質は、哺乳動物の免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質（これは、ヒトのものであり得る）の一部を含み得る。上記Ｉｇタンパク質の一部は、Ｆｃ領域であり得る。このＦｃ領域は、Ｉｇタンパク質のヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み得、上記Ｉｇタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＡであり得る。上記Ｆｃ領域はまた、ＩｇＭのヒンジ領域ならびにＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインを含み得る。上記ＣＤ２４タンパク質は、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、または配列番号１２の配列を含み得る。

被験体において上記ＣＤ２４タンパク質の活性をモニターする方法もまた、本明細書で提供される。 上記方法は、上記被験体にＣＤ２４タンパク質を投与した後の時点で上記被験体から得られる血液サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量と、その時点の前に上記被験体から得られる血液サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量とを比較することを包含し得る。経時的なＬＤＬ−Ｃの量の減少は、ＣＤ２４タンパク質活性の増大を示し得る。上記方法は、上記被験体へのＣＤ２４タンパク質の投与後に得られる血液サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量を測定することをさらに包含し得る。上記方法はまた、その時点の前に上記被験体から得られる血液サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量を測定することを包含し得る。上記被験体にその後に投与される上記ＣＤ２４タンパク質の量は、上記被験体への上記ＣＤ２４タンパク質の投与後に得られるサンプル中のＬＤＬ−Ｃの量に応じて調節され得る。上記その後の投与における上記ＣＤ２４タンパク質の量は、上記被験体におけるＣＤ２４タンパク質の濃度レベルの比活性（specific activity of concentration level）を維持するために調節され得る。

図１Ａは、全長ＣＤ２４融合タンパク質であるＣＤ２４Ｆｃ（本明細書中、ＣＤ２４Ｉｇともいわれる）（配列番号５）のアミノ酸組成を示す。下線を付した２６アミノ酸は、ＣＤ２４のシグナルペプチド（配列番号４）であり、これは、そのタンパク質を発現する細胞からの分泌の間に切断され、従って、このタンパク質のプロセシングされたバージョン（配列番号６）からは失われている。上記配列の太字部分は、融合タンパク質において使用される成熟ＣＤ２４タンパク質の細胞外ドメインである（配列番号２）。成熟ＣＤ２４タンパク質中に通常存在する最後のアミノ酸（ＡまたはＶ）は、免疫原性を回避するために、構築物から欠失されている。下線を付しておらず太字でない文字は、ＩｇＧ１ Ｆｃの配列である（ヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む（配列番号７））。図１Ｂは、ＣＤ２４^ＶＦｃの配列（配列番号８）を示し、ここで成熟ヒトＣＤ２４タンパク質（太字）は、配列番号１のバリン多型バリアントである。図１Ｃは、ＣＤ２４^ＡＦｃの配列（配列番号９）を示し、ここで成熟ヒトＣＤ２４タンパク質（太字）は、配列番号１のアラニン多型バリアントである。図１Ｂおよび図１Ｃ中の融合タンパク質の種々の部分は、図１Ａ中にあるように印が付けられ、上記バリアントのバリン／アラニンアミノ酸は、二重下線が付されている。

図２は、哺乳動物細胞株から発現されるＣＤ２４タンパク質の精製およびプロセシングのための方法を示す。

図３は、マウス由来の成熟ＣＤ２４タンパク質（配列番号３）とヒト由来の成熟ＣＤ２４タンパク質（配列番号１）との間のアミノ酸配列バリエーションを示す。潜在的なＯ−グリコシル化部位は太字にされており、Ｎ−グリコシル化部位には下線が付されている。

図４Ａ〜Ｃは、マウスにおけるＣＤ２４Ｆｃ（ＣＤ２４Ｉｇ）の薬物動態のＷｉｎＮｏｎｌｉｎコンパートメントモデリング分析を示す。白丸は、３匹のマウスの平均を表し、線は、推定薬物動態曲線である。図４Ａ。１ｍｇ ＣＤ２４Ｆｃのｉ．ｖ．注射。図４Ｂ。１ｍｇ ＣＤ２４Ｆｃのｓ．ｃ．注射。図４Ｃ。曲線下面積（ＡＵＣ）、半減期および最大血中濃度によって測定される場合の血中の抗体の総量の比較。ｓ．ｃ．注射のＡＵＣおよびＣｍａｘは、全体としてｉ．ｖ．注射の約８０％であるが、その差異は、統計的に有意ではないことに注意のこと。

図５は、ヒト被験体におけるＰＫ評価可能集団（ＰＫ Ｅｖａｌｕａｂｌｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に関する処置による平均血漿ＣＤ２４Ｆｃ濃度（±ＳＤ）のプロットを示す。ＰＫ＝薬物動態；ＳＤ＝標準偏差。

図６は、ＰＫ評価可能集団に関するＣＤ２４Ｆｃ Ｃ_ｍａｘ 対 用量の用量比例性プロットを示す。

図７は、ＰＫ評価可能集団に関するＣＤ２４Ｆｃ ＡＵＣ_{０−４２ｄ} 対 用量の用量比例性プロットを示す。

図８は、ＰＫ評価可能集団に関するＣＤ２４Ｆｃ ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ} 対 用量の用量比例性プロットを示す。

（詳細な説明）
本発明者らは、驚くべきことに、成熟ＣＤ２４配列を含むタンパク質がＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるために有効であり、アテローム性動脈硬化症を処置および／または防止するために、ならびに心血管疾患（例えば、動脈硬化性心血管疾患）のリスクを低減するためにさらに有用であることを見出した。本明細書でより詳細に記載されるように、ＣＤ２４は、２４０塩基対のコード配列によってコードされる、造血細胞および非造血細胞の両方の間で広く発現される小さなグリコシル−ホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）結合（anchored）糖タンパク質である。この８０アミノ酸のうち、最初の２６個は、シグナルペプチドを構成する一方で、最後の２３個は、切断のためのシグナルとして働いて、ＧＰＩテールの結合を可能にする。結果として、成熟ヒトＣＤ２４分子は、わずか３１アミノ酸を有する。アミノ酸３１は、ヒト集団の中で多型性である。ヌクレオチド２２６でのＣからＴへのトランジションは、アラニン（Ａ）のバリン（Ｖ）での置換を生じる。この残基は、切断部位のすぐＮ末端側の位置にあるので、そしてその置換は、非保存的であるので、これら２つの対立遺伝子は、細胞表面上で異なる効率において発現され得る。コピーＤＮＡでのトランスフェクション研究は、ＣＤ２４^ｖ対立遺伝子が細胞表面上でより効率的に発現されることを示した。これと一致して、ＣＤ２４^ｖ／ｖ末梢血白血球は、特にＴ細胞上で、より高いレベルのＣＤ２４を発現した。３系統の証拠から、ＣＤ２４は、ＭＳの遺伝子改変因子（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）であることが示されている。集団レベルでは、ＣＤ２４^ｖ／ｖ遺伝子型の頻度は、正常集団における頻度の２倍より高い。複数のＭＳファミリーの中で、ＣＤ２４^ｖ対立遺伝子は、健康な対照と比較して、ＭＳ患者に優先的に伝えられる。さらに、疾患のより重度の形態（患者がひとりで歩く能力を失う場合に、６．０またはこれを超える総合障害度評価尺度［ＥＤＳＳ］）を有するＭＳ患者の中で、ＣＤ２４^ｖ／ｖ個体は、最初の臨床症状からＥＤＳＳ ６．０に達するのに平均して７年かかったが、ＣＤ２４^ａ／ｖ個体またはＣＤ２４^ａ／ａ個体は、１３〜１５年でＥＤＳＳ ６．０に達した。逆に、ＣＤ２４メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の３’非翻訳領域におけるジヌクレオチド欠失（これは、ＣＤ２４ ｍＲＮＡ安定性を低下させ、従って、ＣＤ２４発現を低下させる）は、ＭＳおよび他の自己免疫疾患からヒトを保護する。今日まで、ＣＤ２４は、脂質レベルに影響を及ぼすことは示されていない。

１．定義
本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載する目的に過ぎず、限定することを意図しているのではない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に規定しなければ、複数形への言及を含む。

本明細書中の数値範囲の記載に関して、その間にある各数字は、同程度の正確さで明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲に関して、数字７および８は、６および９に加えて意図され、範囲６．０〜７．０に関しては、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に企図される。

「ペプチド」または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結した配列であり、天然のもの、合成のもの、または天然および合成のものの改変または組み合わせであり得る。

「実質的に同一」とは、第１のおよび第２のアミノ酸配列が、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個または３００個のアミノ酸の領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを意味し得る。

「処置」または「処置する」とは、疾患から動物を保護することに言及する場合、その疾患を防止すること、抑制すること、抑えること、または完全に除去することを意味する。その疾患を防止することは、その疾患の開始前に動物に本発明の組成物を投与することを包含する。その疾患を抑制することは、その疾患の誘発後であるがその臨床的出現の前に、動物に本発明の組成物を投与することを包含する。疾患を抑えることは、その疾患の臨床的出現の後に、動物に本発明の組成物を投与することを包含する。

「バリアント」は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１種の生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを意味し得る。「生物学的活性」の代表例としては、ｔｏｌｌ様レセプターに結合し、特異的抗体によって結合される能力が挙げられる。バリアントはまた、少なくとも１種の生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されたタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換（すなわち、あるアミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置換すること）は、小さな変化を代表的には含むとして当該分野で認識される。これらの小さな変化は、部分的には、当該分野で理解されるように、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することによって同定され得る。Ｋｙｔｅら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５７：１０５−１３２ （１９８２）。アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似のハイドロパシーインデックスのアミノ酸は、置換され得かつタンパク質機能をなお保持し得ることは、当該分野で公知である。一局面において、±２のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸は、置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持するタンパク質を生じる置換を明らかにするために使用され得る。ペプチドの状況におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大の局所的平均親水性（抗原性および免疫原性と十分に相関することが報告された有用な尺度）の計算を可能にする。米国特許第４，５５４，１０１号（本明細書に参考として完全に援用される）。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該分野で理解されるように、生物学的活性（例えば、免疫原性）を保持するペプチドを生じ得る。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行われ得る。アミノ酸の疎水性インデックスおよび親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を及ぼされる。その観察と一致して、生物学的機能と適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズおよび他の特性によって明らかにされるように、アミノ酸の相対的類似性、および特に、それらアミノ酸の側鎖に依存することは理解される。

２．ＣＤ２４
ＣＤ２４タンパク質（これは、成熟ヒトＣＤ２４または他の哺乳動物に由来する成熟ＣＤ２４のアミノ酸配列を含み得る）またはそのバリアントが本明細書で提供され、このＣＤ２４タンパク質は、ＣＤ２４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に相当する。上記のように、成熟ヒトＣＤ２４タンパク質の配列は、そのＣ末端においてアラニン（Ａ）残基とバリン（Ｖ）残基とが可変であり、３１アミノ酸の長さである：

ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（Ｖ／Ａ） （配列番号１）

Ｃ末端のバリンまたはアラニンは、免疫原性であり得、その免疫原性を低下させるために、ＣＤ２４タンパク質から省略され得る。従って、ＣＤ２４タンパク質は、Ｃ末端アミノ酸を欠いている成熟ヒトＣＤ２４のアミノ酸配列を含み得る：

ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ （配列番号２）

マウスおよびヒトに由来する成熟ＣＤ２４タンパク質のアミノ酸配列においてかなりの配列バリエーションがあるにも関わらず、それらは機能的に等価である。なぜならヒトＣＤ２４Ｆｃは、マウスにおいて活性であることが示されているからである。ヒトＣＤ２４ ＥＣＤのアミノ酸配列は、図３に示されるように、マウスタンパク質とある程度の配列保存を示す（３９％の同一性； Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３３９７６）。しかし、ＣＤ２４ ＥＣＤが種に依存してわずか２７〜３１アミノ酸の長さであり、ならびにそのレセプター（例えば、Ｓｉｇｌｅｃ １０／Ｇ）のうちの一部への結合が糖タンパク質のそのシアル酸および／またはガラクトース糖によって媒介されることから、同一性％がさらに高いわけではないことは、驚くべきことではない。ヒトＳｉｇｌｅｃ−１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３１０２３３）とそのマウスホモログＳｉｇｌｅｃ−Ｇ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７６６４８８）レセプタータンパク質との細胞外ドメイン間のアミノ酸配列同一性は、６３％である。主にＣ末端においてマウスＣＤ２４とヒトＣＤ２４との間で配列が保存されていること、およびグリコシル化部位の豊富さの結果として、成熟ＣＤ２４タンパク質における顕著なバリエーションは、特に、それらバリエーションがＣ末端における保存された残基に影響を及ぼさないか、またはマウスもしくはヒトいずれかのＣＤ２４に由来するグリコシル化部位に影響を及ぼさない場合に、ＣＤ２４タンパク質を使用するにあたって許容され得る。従って、ＣＤ２４タンパク質は、成熟マウスＣＤ２４のアミノ酸配列を含み得る：

ＮＱＴＳＶＡＰＦＰＧＮＱＮＩＳＡＳＰＮＰＴＮＡＴＴＲＧ （配列番号３）。

ヒトＣＤ２４ ＥＣＤのアミノ酸配列は、マウスタンパク質とよりもカニクイザルタンパク質とにより大きな配列保存（５２％ 同一性；ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｉ７ＧＫＫ１）を示す。さらに、ＥＣＤがこれらの種においてわずか２９〜３１アミノ酸の長さであることからパーセント同一性が高くないことおよびそのレセプターへの結合における糖残基の役割を考慮すれば、これは驚くべきことではない。カニクイザルＳｉｇｌｅｃ−１０レセプターのアミノ酸配列は決定されていないが、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１０タンパク質とアカゲザルＳｉｇｌｅｃ−１０タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１１１６３５２）との間のアミノ酸配列同一性は、８９％である。従って、ＣＤ２４タンパク質はまた、成熟カニクイザル（またはアカゲザル）ＣＤ２４のアミノ酸配列を含み得る：

ＴＶＴＴＳＡＰＬＳＳＮＳＰＱＮＴＳＴＴＰＮＰＡＮＴＴＴＫＡ （配列番号１０）

ＣＤ２４タンパク質は、可溶性であり得る。ＣＤ２４タンパク質は、このタンパク質を発現する細胞からの分泌を可能にするために、Ｎ末端シグナルペプチドを含み得る。このシグナルペプチド配列は、アミノ酸配列 ＭＧＲＡＭＶＡＲＬＧＬＧＬＬＬＬＡＬＬＬＰＴＱＩＹＳ（配列番号４）を含み得る。あるいは、シグナル配列は、他の膜貫通タンパク質または分泌型タンパク質に見出されるもののうちのいずれかであってもよいし、当該分野で公知の既存のシグナルペプチドから改変されたものであってもよい。

ａ．融合
ＣＤ２４タンパク質は、そのＮ末端またはＣ末端においてタンパク質タグに融合され得る。上記タンパク質タグは、哺乳動物Ｉｇタンパク質の一部を含み得、これは、ヒトもしくはマウス、または別の種のものであり得る。上記部分は、Ｉｇタンパク質のＦｃ領域を含み得る。このＦｃ領域は、Ｉｇタンパク質のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびＣＨ４ドメインのうちの少なくとも１つを含み得る。このＩｇタンパク質は、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、またはＩｇＡであり得、上記Ｆｃ領域は、Ｉｇのヒンジ領域、ならびにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み得る。上記Ｆｃ領域は、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）アイソタイプを含み得、これは、配列番号７の配列を有し得る。このＩｇタンパク質はまた、ＩｇＭであってもよく、そのＦｃ領域は、ＩｇＭのヒンジ領域、ならびにＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、およびＣＨ４ドメインを含み得る。上記タンパク質タグは、タンパク質の精製を補助するアフィニティータグ、または機能的タンパク質の溶解度および回収を向上させる溶解度向上タグであり得る。タンパク質タグはまた、ＣＤ２４タンパク質の結合価を増大し得る。タンパク質タグはまた、ＧＳＴ、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、低分子ユビキチン様改変因子（ｓｍａｌｌ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｌｉｋｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（ＳＵＭＯ）、ユビキチン（Ｕｂ）、アルブミン、またはラクダ科動物のＩｇを含み得る。融合タンパク質を作製し、融合タンパク質を精製するための方法は、当該分野で周知である。

前臨床研究に基づいて、実施例において同定される融合タンパク質ＣＤ２４Ｆｃの構築のために、３０アミノ酸の、ＧＰＩシグナル切断部位の前で最後の多型性アミノ酸を欠いている天然のＣＤ２４分子（すなわち、配列番号２を有する成熟ＣＤ２４タンパク質）の切断形態を使用した。この成熟ヒトＣＤ２４配列は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（配列番号７）に融合される。全長ＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５（図１）において提供され、細胞から分泌される（すなわち、切断されるシグナル配列を欠いている）ＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質のプロセシングされたバージョンは、配列番号６において提供される。ＩｇＧ１ Ｆｃに融合された成熟ＣＤ２４（すなわち、配列番号１を有する成熟ＣＤ２４タンパク質）のプロセシングされた多型バリアントは、配列番号１１または配列番号１２を含み得る。

ｂ．生成
ＣＤ２４タンパク質は、大いにグリコシル化され得、免疫細胞の共刺激および損傷関連分子パターン分子（ｄａｍａｇｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＤＡＭＰ）との相互作用のようなＣＤ２４の機能に関与し得る。ＣＤ２４タンパク質は、真核生物発現系を使用して調製され得る。この発現系は、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）中でベクターからの発現を必要とし得る。この系はまた、ウイルスベクター（例えば、真核生物細胞に感染させるために使用され得る複製欠損レトロウイルスベクター）であり得る。ＣＤ２４タンパク質はまた、細胞ゲノムへと組み込まれたベクターまたはベクターの一部からＣＤ２４タンパク質を発現する安定な細胞株から生成され得る。安定な細胞株は、組み込まれた複製欠損レトロウイルスベクターからＣＤ２４タンパク質を発現し得る。この発現系は、ＧＰＥｘ^ＴＭであり得る。

ｃ．薬学的組成物
ＣＤ２４タンパク質は、薬学的組成物中に含まれ得、この組成物は、薬学的に受容可能な量のＣＤ２４タンパク質を含み得る。薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。薬学的組成物は、溶媒を含み得、この溶媒は、ＣＤ２４タンパク質を長期間安定に維持し得る。溶媒は、ＰＢＳであり得、これは、ＣＤ２４タンパク質を−２０℃（−１５〜−２５℃）において少なくとも６６ヶ月間安定に維持し得る。溶媒は、別の薬物と組み合わせてＣＤ２４タンパク質を収容し得る。

薬学的組成物は、非経口投与（注射または連続注入によるものが挙げられるが、これらに限定されない）のために製剤化され得る。注射用の製剤は、油性または水性のビヒクル中で、懸濁物、液剤、またはエマルジョンの形態にあり得、そして懸濁剤、安定化剤、および分散剤が挙げられるが、これらに限定されない製剤用剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を含み得る。組成物はまた、適切なビヒクル（無菌で発熱物質を含まない水が挙げられるが、これらに限定されない）での再構成のために散剤形態で提供され得る。

薬学的組成物はまた、デポー調製物として製剤化され得、これは、埋め込みによって、または筋肉内注射によって投与され得る。組成物は、適切なポリマー物質または疎水性物質（例えば、受容可能な油中のエマルジョンとして）、イオン交換樹脂とともに、またはやや難溶性（sparingly soluble）の誘導体（例えば、やや難溶性の塩として）製剤化され得る。

ｄ．投与量
ＣＤ２４タンパク質の用量は、許容可能な毒性および臨床効力を有する用量を決定するために臨床試験を通じて最終的に決定され得る。最初の臨床用量は、齧歯類および非ヒト霊長類での薬物動態および毒性研究を通じて概算され得る。ＣＤ２４タンパク質の用量は、ＬＤＬ−Ｃ低下の望ましい量および投与経路に依存して、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇであってもよく、１〜５００ｍｇ／ｋｇであってもよい。ＣＤ２４タンパク質は、静脈内注入または皮下注射もしくは壁内（すなわち、内腔または器官の壁内）注射によって投与され得、被験体がヒトである場合、用量は、１０〜１０００ｍｇ、１０〜５００ｍｇ、１０〜２４０ｍｇ、１０〜１２０ｍｇ、または１０ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ、もしくは２４０ｍｇであり得る。

３．処置方法
ＣＤ２４タンパク質は、ＬＤＬ−Ｃレベル（これは、上昇していてもよいし、正常範囲を上回ってさらに上昇していてもよい）を低下させるために被験体に投与され得る。正常範囲は、当該分野で公知の基準（例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ （ＡＴＰ）ＩＩＩまたはその２００５年度最新版（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００２；１０６：３１４３−４２１；およびＪ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ． ２００４ Ａｕｇ ４；４４（３）：７２０−３２に記載される；その両方の内容は、本明細書に参考として援用される）、またはＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ（ＮＩＣＥ）によって示されるとおりの基準によって定義され得る。被験体は、ライソゾーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、家族性高コレステロール血症、または高脂血症を有し得る。ＣＤ２４タンパク質はまた、アテローム性動脈硬化症を処置もしくは防止するために、または心血管疾患事象（これは、動脈硬化性心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）事象であり得る）のリスクを低減するために、被験体に投与され得る。このＡＳＣＶＤ事象は、急性冠動脈症候群、心筋梗塞、安定狭心症もしくは不安定狭心症、冠状動脈血行再建もしくは他の動脈血行再建、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、一過性脳虚血性発作、またはアテローム硬化が起源のものであると推測される末梢動脈疾患であり得る。被験体は、ヒトのような哺乳動物であり得る。

被験体は、雄性または雌性であり得る。被験体は、任意の年齢であり得るが、特に、４０〜７５歳の年齢、または７５歳を超える年齢を有し得る。被験体は、７０ｍｇ／ｄＬ、７５ｍｇ／ｄＬまたは１９０ｍｇ／ｄＬよりも高いかまたはこれらに等しいＬＤＬ−Ｃを有し得る。被験体はまた、糖尿病であっても糖尿病でなくてもよく、４０〜７５歳であり得、７０〜１８９ｍｇ／ｄＬのＬＤＬ−Ｃを有し得る。被験体は、７．５％より高いかもしくはこれに等しい、または５〜７．５％の１０年ＡＳＣＶＤリスク（非致死性心筋梗塞、冠動脈心疾患死亡、または非致死性および致死性の脳卒中として定義される）を有し得る。被験体は、２０１３ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ（Ｓｔｏｎｅ ＮＪ， ｅｔ ａｌ．， ２０１３ ＡＣＣ／ＡＨＡ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｉｓｋ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ： ａ ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ， Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０１４；６３：２８８９−９３４）に従って、ＬＤＬ−Ｃ低下が推奨される被験体の特徴を有し得る。被験体は、家族性高コレステロール血症を有し得、これは、ＬＤＬレセプター遺伝子、アポリポタンパク質Ｂ遺伝子、またはプロタンパク質コンベルターゼズブチリシン／ケキシンタイプ９遺伝子における変異によって引き起こされ得る。

被験体は、スタチンのようなＬＤＬ−Ｃ低下薬で以前に処置されたことがあってもよい。被験体はまた、この薬物の結果として有害事象を経験したことがあってもよい。この有害事象は、筋肉症状（例えば、疼痛、圧痛、こわばり、痙攣、脱力、または全身疲労）であったかもしれず、有害筋肉事象の増大したリスクを示すクレアチンホスホキナーゼレベル（これは、正常の上限の＞１０倍であり得る）であったかもしれない。被験体は、別のコレステロール低下薬での処置に不応性であってもよく、他の薬物（これは、スタチンであり得る）で処置された後に７５ｍｇ／ｄＬより高いかもしくはこれに等しいＬＤＬ−Ｃを有していてもよい。被験体は、移植片対宿主病を有していてもよく、移植前の被験体のＬＤＬ−Ｃと比較して、移植を行った後のＬＤＬ−Ｃが１０％もしくはこれより大きな増大を示していてもよい。被験体は、多発性硬化症、関節リウマチ、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患を有していてもよい。

ａ．投与
薬学的組成物の投与経路は、非経口であり得る。非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、髄腔内、関節内、および直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的組成物は、ヒト患者、ネコ、イヌ、大型動物、またはトリに投与され得る。組成物は、１日あたり１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、または１２回投与され得る。

ｂ．併用処置
ＣＤ２４タンパク質は、別の処置（例えば、薬物（スタチン、胆汁酸結合樹脂、フィブレート、ナイアシン、エゼチミブが挙げられる）、またはＬＤＬレセプターレベルを増大させる薬物（ＰＣＳＫ９の機能に拮抗するかまたはこの機能をブロックする抗体または他のインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない））と併用され得る（組み合わされ得る）。ＣＤ２４タンパク質および他の薬物は、ともに（together）または逐次（sequentially）投与され得る。

ＣＤ２４タンパク質は、他の処置と同時にまたは規則正しいテンポで投与され得る。用語「一緒の」（simultaneous）または「一緒に」（simultaneously）とは、本明細書で使用される場合、ＣＤ２４タンパク質および他の処置が、互いに、４８時間以内、好ましくは、２４時間以内、より好ましくは、１２時間以内、さらにより好ましくは６時間以内、および最も好ましくは、３時間もしくはこれより短い時間以内に投与されることを意味する。用語「規則正しいテンポで（ｍｅｔｒｏｎｏｍｉｃａｌｌｙ）」とは、本明細書で使用される場合、他の処置とは異なる時間での、および反復投与と比較してある特定の頻度での薬剤の投与を意味する。

ＣＤ２４タンパク質は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０ｈｒ， ４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分間、５０分間、４５分間、４０分間、３５分間、３０分間、２５分間、２０分間、１５分間、１０分間、９分間、８分間、７分間、６分間、５分間、４分間、３分間、２分間および１分間を包含する、別の処置の前の任意の時点で投与され得る。ＣＤ２４タンパク質は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分間、５０分間、４５分間、４０分間、３５分間、３０分間、２５分間、２０分間、１５分間、１０分間、９分間、８分間、７分間、６分間、５分間、４分間、３分間、２分間および１分間を包含する、ＣＤ２４タンパク質の第二の処置の前の任意の時点で投与され得る。

ＣＤ２４タンパク質は、約１分間、２分間、３分間、４分間、５分間、６分間、７分間、８分間、９分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間、１１０時間、１１２時間、１１４時間、１１６時間、１１８時間および１２０時間を包含する、別の処置の後の任意の時点で投与され得る。ＣＤ２４タンパク質は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分間、５０分間、４５分間、４０分間、３５分間、３０分間、２５分間、２０分間、１５分間、１０分間、９分間、８分間、７分間、６分間、５分間、４分間、３分間、２分間および１分間を包含する、以前のＣＤ２４処置の前後（prior after）の任意の時点で投与され得る。

４．ＣＤ２４タンパク質活性をモニターするための方法
被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の活性は、被験体においてＬＤＬ−Ｃの濃度を検出することによってモニターされ得る。被験体は、ＣＤ２４タンパク質での処置（例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、移植片対宿主病、免疫媒介性組織傷害などの処置）を経験している最中であり得る。ＬＤＬ−Ｃの濃度は、被験体におけるＣＤ２４タンパク質活性のレベルを示し得る。ここで患者におけるＬＤＬ−Ｃの低下は、より高いＣＤ２４タンパク質活性を示す。上記方法は、被験体からサンプルを得ることおよびサンプル中のＬＤＬ−Ｃの量を検出することを包含し得る。サンプルは、血液サンプル（例えば、血清または血漿）であり得る。ＬＤＬ−Ｃ濃度を測定する方法は、当該分野で周知である（例えば、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ、またはコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ処理後の比色／蛍光測定アッセイ）。ＬＤＬ−Ｃの量は、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ計算によって測定され得る。これは、サンプル中で測定される総コレステロール、トリグリセリド、および高密度リポタンパク質−コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の量に基づいてＬＤＬ−Ｃの量を計算することを包含し得る。ＨＤＬ−Ｃの量は、デキストラン硫酸−Ｍｇ^２＋での沈殿手順によって、または直接ＨＤＬ−Ｃアッセイによってのいずれかで測定され得る。ＬＤＬ−Ｃの量はまた、ＤＩＲＥＣＴ ＬＤＬ^ＴＭアッセイ、ホモジニアス（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）Ｎ−ＧＥＮＥＯＵＳ^ＴＭ ＬＤＬアッセイ、またはＡｐｏＢベースの式：０．４１ＴＣ−０．３２ＴＧ＋１．７０ＡｐｏＢ−０．２７（Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ １９９７；４３：８０８-８１５；その内容は、本明細書に参考として援用される）から導出する計算されたＬＤＬ−Ｃ値によって測定され得る。ＬＤＬ−Ｃのレベルは、処置への応答をモニターするために、経時的におよびＣＤ２４タンパク質処置の過程の間にモニターされ得る。

本明細書で記載されるかまたは当該分野で公知である適応症を処置するために被験体に投与されているＣＤ２４タンパク質の量は、ＬＤＬ−Ｃを使用して検出されるＣＤ２４タンパク質活性のレベルに基づいて調節され得る。ＬＤＬ−Ｃのレベルは、ある期間にわたってまたはＣＤ２４タンパク質処置の過程の間にモニターされ得る。被験体におけるＬＤＬ−Ｃ濃度が正常の範囲内のレベルに低下される場合、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、例えば、ＣＤ２４タンパク質の用量を低下させるかまたはそれをより低い頻度で投与することによって、低減され得る。ＬＤＬ−Ｃ濃度が変化しないままであるかまたは正常範囲を上回っているままである場合、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、例えば、ＣＤ２４タンパク質の用量を増大させるかまたはそれをより頻繁に投与することによって、増大され得る。ＬＤＬ−Ｃの代替手段として、ＬＤＬ粒子（ＬＤＬ−Ｐ）の濃度もまた、ＣＤ２４タンパク質活性をモニターするために測定され得る。ＬＤＬ−Ｐ濃度は、ＮＭＲを直接使用して検出され得る。

被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質のレベルはまた、モニターされ得、これは、被験体からサンプルを得ることおよびサンプル中のＣＤ２４タンパク質の量を検出することを包含する方法によってであり得る。サンプルは、血液サンプル（例えば、血清または血漿）であり得る。タンパク質検出法は、当該分野で周知である。サンプル中のＣＤ２４タンパク質は、任意のタンパク質検出法（例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｇｙｒｏｓ、ＭＳＤ、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、Ｄｅｌｆｉａ、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ、細胞ベースのアッセイ、ＲＩＡ、ウェスタンブロット、アフィニティーカラムなどを含むイムノアッセイ）によって検出され得る。ＥＬＩＳＡ法は、サンドイッチＥＬＩＳＡまたは競合ＥＬＩＳＡであり得る。例えば、ＥＬＩＳＡは、サンプルを抗ＣＤ２４タンパク質抗体に接触させること、ＣＤ２４タンパク質−ＣＤ２４タンパク質抗体複合体と、抗ＣＤ２４タンパク質抗体に結合する標識抗体とを接触させること、および標識によって生成されるシグナルを検出することによって標識抗体の量を測定することであって、ここでシグナルの量は、サンプル中のＣＤ２４タンパク質の量に相関することを包含し得る。

被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、ＣＤ２４タンパク質の薬物動態パラメーターに基づいて（例えば、用量および投与頻度を調節することによって）調節され得る。例えば、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、１ｎｇ／ｍｌより高い血漿ＣＤ２４濃度を得るために調節され得る。別の例では、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、１ｎｇ／ｍＬより高い定常状態血漿濃度を維持するために調節される。別の例では、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬのＣＤ２４タンパク質のＣ_ｍａｘを得るために調節され得る。さらに別の例では、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}によって定義されるとおりの、少なくとも約４００，０００ｎｇ×時間／ｍＬというＣＤ２４タンパク質の薬物曝露レベルを達成するために調節され得る。

本発明は、以下の非限定的実施例によって例証される複数の局面を有する。

実施例１
可溶性ＣＤ２４タンパク質の作製
ＣＤ２４の成熟配列を、ＩｇＧ１ Ｆｃに融合した。ＣＤ２４融合タンパク質のアミノ酸組成は、図１に提供される。次いで、ＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質の発現を駆動する複製欠損レトロウイルスベクターを生成した。ＧＰＥｘ^ＴＭ（遺伝子産物発現（ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）の頭字語）系は、いくつかの重要な利点を与える。そのうちの最も重要なものは、平均して、＞１０００ 挿入／細胞であるが、わずか１コピー／挿入である。さらに、レトロウイルスは、転写活性な遺伝子座に優先的に挿入するので、ＧＰＥｘ^ＴＭは、標的とされたタンパク質の高レベルの発現を生じた。ＣＤ２４Ｆｃの高収量を生じる安定な細胞株を生成した。さらに、４５グラムのＧＬＰグレードの産物および約１００グラムのｃＧＭＰグレードの産物が生成された。バイオリアクターから採取される培地の下流の加工に使用される方法は、下のフローチャート（図２）にまとめられる。

採取物清澄化
バイオリアクター培養培地を、Ｃｕｎｏ ６０Ｍ０２ Ｍａｘｉｍｉｚｅｒデプスフィルタ、続いて、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｏｐｔｉｃａｐ ０．２２μｍフィルタを使用して清澄化した。その濾液を滅菌収集バッグに集めた。サンプルを、ＥＬＩＳＡによるＣＤ２４−Ｆｃ収量定量のために得た。

プロテインＡ捕捉
清澄化した培地を、１６ｇ／Ｌの樹脂を超えない濃度（ＥＬＩＳＡに基づく）および４分間の接触時間でプロテインＡ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）のカラムに通過させた。このカラムを、平衡化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＋ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ７．５）で洗浄し、次いで、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム／クエン酸 ｐＨ６．０（５カラム容積）で洗浄した。結合したＣＤ２４Ｆｃを、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム／クエン酸 ｐＨ３．５を使用してカラムから溶離した。

ウイルス不活性化
上記プロテインＡ溶離液画分を、２Ｍ 塩酸を添加して直ぐにｐＨ３．０にし、このｐＨで３０分間、周囲温度で保持した。次いで、これを、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を添加してｐＨ５．０にし、０．６５μｍガラス繊維フィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＧＦ２）および０．２μｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２）を使用して滅菌収集バッグへと濾過して、清澄化した。

ＳＰ−セファロースクロマトグラフィー
上記ウイルス不活性化した材料を、２５ｇ／Ｌの樹脂を超えない濃度（１．２２のＡ２８０ｎｍ＝１ｍｇ／ｍＬに基づく）および線形流速２５０ｃｍ／時間で、ＳＰ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカラムに適用した。このカラムを、平衡化緩衝液（１０ｍＭ クエン酸ナトリウム／クエン酸 ｐＨ５．０）で洗浄し、結合したＣＤ２４Ｆｃを、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム／クエン酸 ＋ ０．２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ５．０を使用してカラムから溶離した。溶出液（effluent）を滅菌収集バッグに集めた。

ムスタングＱクロマトグラフィー
上記ＳＰ−セファロース溶出液（elute）を、１Ｍ Ｔｒｉｓ塩基を添加してｐＨ７．５に調節し、ＷＦＩで希釈して、伝導度を低下させた。この希釈した材料を、ムスタングＱフィルタ（Ｐａｌｌ）に、０．５ｇ／Ｌの樹脂を超えない濃度（１．２２のＡ２８０ｎｍ＝１ｍｇ／ｍＬに基づく）および流速５カラム容積／分で適用した。このフィルタを平衡化緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５）で洗浄した。ＣＤ２４−Ｆｃは、フロースルーの中に含まれ、これを滅菌収集バッグに集める。

ウイルス濾過
次いで、上記ムスタングＱフロースルーを、０．２ｍＭフィルタおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＮＦＰウイルスフィルタ（公称ポアサイズ２０ｎｍ）を通して３０ｐｓｉの一定圧で濾過し、滅菌収集バッグに集めた。

濃度および最終製剤
産物を濃縮し、１０ｋＤａ限外濾過膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｅｐ／Ｓｃａｌｅ）を使用して、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム ｐＨ７．２の中に、２８０ｎｍの吸光度によって決定される場合におよそ１０ｍｇ／ｍＬ 最終濃度においてダイアフィルトレーションした。分析用サンプルを、バイオセイフティーキャビネットの中にある間に、バルクから引き抜いた。ラベリングを行い、サンプルを試験のためにＱＣに送り、その間に、バルクアリコートを、発売するまで２〜８℃において貯蔵した。

実施例２
マウスにおけるＣＤ２４薬物動態
１ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ（ＣＤ２４Ｆｃ）を、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスへと注射し、種々の時点（５分間、１時間、４時間、２４時間、４８時間、７日間、１４日間および２１日間）において、各時点において３匹のマウスで、血液サンプルを集めた。血清を１：１００希釈し、ＣＤ２４Ｆｃのレベルを、捕捉抗体として精製抗ヒトＣＤ２４（３．３μｇ／ｍｌ）を使用し、検出抗体としてペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（５μｇ／ｍｌ）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して検出した。図４ａで示されるとおり。ＣＤ２４Ｆｃの崩壊曲線は、タンパク質の代表的な二相崩壊を明らかにした。第１の生体分布相は、１２．４時間の半減期を有した。第２相は、中心コンパートメントからの一次排除のモデルに倣う。第２相の半減期は、９．５４日であった。これは、インビボでの抗体の半減期に類似である。これらデータは、融合タンパク質が血流中で非常に安定であることを示唆する。融合タンパク質を皮下注射した別の研究では、９．５２日というほぼ同一の半減期が観察された（図４ｂ）。より重要なことには、ＣＤ２４Ｆｃが血中でピークレベルに達するにはおよそ４８時間かかった一方で、血中の融合タンパク質の総量は、ＡＵＣによって測定される場合、いずれの注射経路によっても実質的に同じであった。従って、治療的観点から、異なる注射経路は、薬物の治療効果に影響を及ぼさないはずである。この観察は、霊長類の毒性および臨床試験の実験デザインを大いに単純化した。

実施例３
ＣＤ２４は、ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる
この実施例は、ＣＤ２４がＬＤＬ−Ｃを低下させることを示す。血漿中の絶食時ＬＤＬ−Ｃのベースラインからの変化は、以下でより詳細に記載される臨床試験において分析した（この実施例の方法の節を参照のこと）。絶食時ＬＤＬ−Ｃレベルを、コホート１（ＣＤ２４Ｆｃ １０ｍｇ群）に関して−１日目、７日目、および４２日目に得たサンプル間で決定した。コホート２（ＣＤ２４Ｆｃ ３０ｍｇ群）で開始するときには、この脂質サンプリングを、１４日目を含むように拡大した。データを表１にまとめる。コホート１の不完全なデータセットに起因して、コホート２〜５を、ＬＤＬ−Ｃレベルの用量依存性減少を分析するために使用した。統計的に有意な用量依存性減少が観察された（表１）。

基準としてコホート１を使用して、ＣＤ２４Ｆｃが用量依存性および時間依存性の様式においてＬＤＬ−Ｃレベルを低下させるか否かを決定した。表２に示されるように、１０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃを受容したコホート１と比較すると、ＬＤＬ−Ｃレベルの用量依存性の有意な低下が観察された（ｐ＜０．０００１）。

ＬＤＬ−Ｃの統計的に有意な、用量依存性の低下が観察された。これは、ＣＤ２４Ｆｃがヒト患者においてＬＤＬ−Ｃを低下させるために有効であることを示す。

方法

これは、健康な成人男性および成人女性被験体においてＣＤ２４Ｆｃの安全性、耐容性、およびＰＫを評価するためのフェーズＩでプラセボを対照とした無作為化二重盲検単回投与用量漸増試験であった。５コホートで各々８名の被験体で合計４０名の被験体を、この研究に登録した。各コホートにおいて８名の被験体のうちの６名が、治験薬を受容し、２名の被験体がプラセボ（０．９％ 塩化ナトリウム、生理食塩水）を受容した。第１のコホートは、１０ｍｇを投与されたその後のコホートは、３０ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ、および２４０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃを受容したかまたは応分のプラセボを受容し、そして少なくとも３週間空けて投与して、各前のコホートに関して安全性および耐容性のデータの検討を可能にした。被験体の新たなコホートに対する次のさらに高用量の投与は、適切な安全性および耐容性が示された場合にのみ許容した。

各コホートにおいて、最初の２名の被験体は、１日目に、１名の治験薬レシピエントおよび１名のプラセボレシピエントであった。第３〜第５の被験体および第６〜第８の被験体には、７日目より後に投与した（下位群の間で最低２４時間空ける）。各被験体には、同じ下位群において少なくとも１時間空けて投与した。必要であれば、そのコホートにおける第１または第２の下位群に伴う投与後期間の間に生じた可能性のある何らかの顕著な安全性の問題を検討するまで、被験体の残りの投与を遅らせた。その後のコホートに、前のコホートの少なくとも３週間後に投与した。

スクリーニング期間：

クリーニング来院（来院１）は、積極的処置期間を開始する２１日前までに行った。インフォームド・コンセントを提供した後に、被験体は、適格性に関するスクリーニング手順を受けた。

処置期間：

被験体を、−１日目（来院２）に臨床薬理ユニット（ＣＰＵ）へと入れ、無作為化した処置期間を、１０時間の最小夜間絶食の後に、１日目に開始した。被験体を、単一用量としてのＣＤ２４Ｆｃまたはプラセボでの処置に無作為に割り当てた。被験体は、４日目の朝まで閉じ込められたままであった。

追跡：

全ての被験体は、追跡来院（来院３、来院４、来院５、来院６、および来院７）のために、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、および４２日目（±１日）にＣＰＵへと戻った。来院７は、全ての被験体にとっての最終来院であった。

処置の継続期間： 各被験体に関する総研究継続期間は、６３日間までであった。単一用量投与は、１日目行われた。

被験体の数：

予定： ４０名の被験体

スクリーニング済み： ２２４名の被験体

無作為化： ４０名の被験体

完了： ３９名の被験体

中止： １名の被験体

診断および主要な組み入れ基準： この試験研究の集団は、１８ｋｇ／ｍ^２〜３０ｋｇ／ｍ^２（両端を含む）の間のボディマスインデックスを有する１８歳〜５５歳（両端を含む）の間の年齢の健康な男性および女性であった。

治験薬および比較対照薬情報：

ＣＤ２４Ｆｃ：１０ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ、または２４０ｍｇの単一用量を、ＩＶ注入を介して投与した；ロット番号：０９ＭＭ−０３６。ＣＤ２４Ｆｃは、ヒトＣＤ２４の成熟配列およびヒト免疫グロブリンＧ１の結晶化可能領域のフラグメント（ＩｇＧ１Ｆｃ）からなる完全ヒト化融合タンパク質であった。ＣＤ２４Ｆｃを、ＩＶ投与用の無菌の透明で無色の保存剤非含有水性溶液として供給した。ＣＤ２４Ｆｃを、濃度１０ｍｇ／ｍＬおよびｐＨ７．２の単一用量注射液剤として製剤化した。各ＣＤ２４Ｆｃバイアルには、１６ｍＬ±０．２ｍＬのＣＤ２４Ｆｃ中に、１６０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ、５．３ｍｇの塩化ナトリウム、３２．６ｍｇのリン酸水素二ナトリウム七水和物、および１４０ｍｇのリン酸一ナトリウム一水和物を含めた。ＣＤ２４Ｆｃを、クロロブチルゴム栓およびアルミニウムフリップオフシール付きの透明なホウケイ酸ガラスバイアルに入れて供給した。

応分のプラセボ（０．９％ 塩化ナトリウム、生理食塩水）を、ＩＶ注入を介して投与した；ロット番号：Ｐ２９６８５５、Ｐ３１１８５２、Ｐ３００７１５、Ｐ３１５９５２。

治療意図（ＩＴＴ）集団は、少なくとも１用量の治験薬を受容した全ての被験体からなった。このＩＴＴ集団は、被験体情報および安全性評価の一次分析集団であった。

臨床検査評価（化学的性質、血液学、および尿検査）を、処置および来院によりまとめた。ベースラインからの変化もまた、まとめた。バイタルサイン（血圧、心拍数、呼吸数、および体温）を、処置および時点によりまとめた。ベースラインからの変化もまた、まとめた。全ての身体検査データを列挙した。心電図パラメーターおよびベースラインからの変化をまとめた。全体的な解釈を列挙した。絶食時ＬＤＬ−Ｃおよび高密度リポタンパク質コレステロールを、コホート１（ＣＤ２４Ｆｃ １０ｍｇ群）に関して−１日目、７日目、および４２日目に得た。コホート２（Ｃｄ２４Ｆｃ ３０ｍｇ群）で開始するときには、この脂質サンプリングを、１４日目を含むように拡大した。

実施例４
ヒトにおけるＣＤ２４薬物動態
この実施例は、ヒトにおけるＣＤ２４タンパク質の薬物動態分析を示す。

血漿ＣＤ２４Ｆｃ濃度

図５で示されるように、ＣＤ２４Ｆｃの平均血漿濃度は、投与されたＣＤ２４Ｆｃの用量に比例して増大した。１２０ｍｇを除く全ての用量群に関して、投与後１時間でＣＤ２４Ｆｃの最大平均血漿濃度に達した。１２０ｍｇ群に関しては、投与後２時間でＣＤ２４Ｆｃの最大平均血漿濃度に達した。４２日目（９８４時間）までには、全ての群のＣＤ２４Ｆｃの平均血漿濃度が、最大平均血漿濃度の２％〜４％の間へと低下した。

表３は、ＰＫ評価可能集団の処置による血漿ＣＤ２４Ｆｃ ＰＫパラメーターをまとめる。

血漿ＣＤ２４Ｆｃ用量比例性分析

図６は、ＰＫ評価可能集団の用量に対するＣＤ２４Ｆｃ Ｃ_ｍａｘの用量比例性プロットを示す。図７は、ＰＫ評価可能集団の用量に対するＣＤ２４Ｆｃ ＡＵＣ_{０−４２ｄ}の用量比例性プロットを示す。図８は、ＰＫ評価可能集団の用量に対するＣＤ２４Ｆｃ ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}の用量比例性プロットを示す。表４は、用量比例性の検定力分析を示す。

Ｃ_ｍａｘ傾き概算値は、１．１０５〜１．２４０の９０％ ＣＩで１．１７２であった。ＡＵＣ_{０−４２ｄ}傾き概算値は、１．０２７〜１．１４８の９０％ ＣＩで１．０８８であった。ＡＵＣ_{０−ｉｎｆ}傾き概算値は、１．０２６〜１．１の９０％ ＣＩで１．０８７であった。

薬物動態の結論

血漿ＣＤ２４ＦｃのＣ_ｍａｘおよびＡＵＣは、マウス、サルおよびヒトにおいて投与された用量に比例して増大した。血漿ＣＤ２４Ｆｃは、１．０１〜１．３４時間の間にＴ_ｍａｘに達した。血漿ＣＤ２４Ｆｃのｔ_１／２は、２８０．８３時間〜３２７．１０時間の間の範囲に及んだ。

Claims (25)

1. 被験体において低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルを低下させるための方法であって、該方法は、ＣＤ２４タンパク質をその必要性のある被験体に投与することを包含する方法。
2. 前記被験体は、上昇したＬＤＬ−Ｃを有する、請求項１に記載の方法。
3. 前記被験体は、７５ｍｇ／ｄＬより高いかもしくはこれに等しいＬＤＬ−Ｃを有する、請求項２に記載の方法。
4. 前記被験体は、７０ｍｇ／ｄＬもしくは１９０ｍｇ／ｄＬより高いかまたはこれらに等しいＬＤＬ−Ｃを有する、請求項２に記載の方法。
5. 前記被験体は、以前に別のＬＤＬ−Ｃ低下薬で処置されたことがある、請求項１に記載の方法。
6. 前記他のＬＤＬ−Ｃ低下薬は、スタチンである、請求項５に記載の方法。
7. 前記他のＬＤＬ−Ｃ低下薬は、ＰＣＳＫ９のアンタゴニストである、請求項５に記載の方法。
8. 前記ＣＤ２４タンパク質は、成熟ヒトＣＤ２４またはそのバリアントの配列を含む、請求項１に記載の方法。
9. 前記成熟ヒトＣＤ２４は、配列番号１および配列番号２の配列からなる群より選択される配列を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記ＣＤ２４タンパク質は、可溶性である、請求項１に記載の方法。
11. 前記ＣＤ２４タンパク質は、グリコシル化されている、請求項１に記載の方法。
12. 前記ＣＤ２４タンパク質は、タンパク質タグをさらに含み、ここで該タンパク質タグは、該ＣＤ２４タンパク質のＮ末端またはＣ末端において融合されている、請求項８に記載の方法。
13. 前記タンパク質タグは、哺乳動物の免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記Ｉｇ部分は、ヒトＩｇタンパク質のＦｃ領域である、請求項１３に記載の方法。
15. 前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇタンパク質のヒンジ領域、ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここで該Ｉｇは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＡからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記Ｆｃ領域は、ＩｇＭのヒンジ領域ならびにＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む、請求項１４に記載の方法。
17. 前記ＣＤ２４タンパク質は、配列番号６、配列番号１１、または配列番号１２の配列を含む、請求項１５に記載の方法。
18. 前記ＣＤ２４タンパク質は、真核生物タンパク質発現系を使用して生成される、請求項１に記載の方法。
19. 前記発現系は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株に含まれるベクターまたは複製欠損レトロウイルスベクターを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記複製欠損レトロウイルスベクターは、真核生物細胞のゲノムへと安定して組み込まれる、請求項１９に記載の方法。
21. 被験体におけるアテローム性動脈硬化症を処置または防止するための方法であって、該方法は、ＣＤ２４タンパク質をその必要性のある被験体に投与することを包含する方法。
22. 被験体における動脈硬化性心血管疾患のリスクを低減するための方法であって、該方法は、ＣＤ２４タンパク質をその必要性のある被験体に投与することを包含する方法。
23. 被験体におけるＣＤ２４タンパク質の活性をモニターする方法であって、該方法は、該被験体に該ＣＤ２４タンパク質を投与した後の時点で該被験体から得られる血液サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量と、該時点の前に該被験体から得られる血液サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量とを比較することを包含し、ここで経時的なＬＤＬ−Ｃの量の減少は、ＣＤ２４タンパク質活性の増大を示す、方法。
24. 前記被験体に続いて投与される前記ＣＤ２４タンパク質の量は、該被験体に該ＣＤ２４タンパク質を投与した後に得られるサンプル中のＬＤＬ−Ｃの量に応じて調節される、請求項２３に記載の方法。
25. 前記続く投与における前記ＣＤ２４タンパク質の量は、該被験体における該ＣＤ２４タンパク質の比活性または濃度レベルを維持するために調節される、請求項２４に記載の方法。

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