ES2829235T3

ES2829235T3 - Uso de CD24 para disminuir los niveles de colesterol en lipoproteínas de baja densidad

Info

Publication number: ES2829235T3
Application number: ES16790128T
Authority: ES
Inventors: Yang Liu; Pan Zheng
Original assignee: Oncoimmune Inc
Current assignee: Oncoimmune Inc
Priority date: 2015-05-07
Filing date: 2016-05-06
Publication date: 2021-05-31
Anticipated expiration: 2036-05-06
Also published as: US10369197B2; JP6751756B2; AU2016258084B2; IL255086A0; PT3292144T; BR112017022394A2; ZA201706846B; HUE051866T2; KR20170141216A; US20180110828A1; MX2017014095A; US11026995B2; EP3292144A1; US20190307841A1; WO2016179456A1; AU2016258084A1; IL255086B; HK1249521A1; EP3292144B1; EA038520B1

Abstract

Una proteína CD24 para su uso en reducir los niveles de colesterol en lipoproteínas de baja densidad (LBD) (CLBD) en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de CD24 para disminuir los niveles de colesterol en lipoproteínas de baja densidad

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una proteína CD24 para disminuir los niveles de colesterol en lipoproteínas de baja densidad.

Antecedentes de la invención

La dislipidemia, incluyendo altos niveles de colesterol en lipoproteínas de baja densidad (LBD) (CLBD), es un factor de riesgo importante para la enfermedad cardiovascular aterosclerótica (ECAE), que es la principal causa de muerte y de los principales costos de atención sanitaria en todo el mundo. La asociación entre CLBD y el riesgo de ECAE se ha establecido durante décadas de estudios genéticos y bioquímicos, estudios epidemiológicos y ecológicos observacionales, y en experimentos in vitro y en animales. La reducción de CLBD reduce los eventos de ECAE, lo que demuestra que CLBD tiene un papel central, causal en la enfermedad cardíaca coronaria (ECC) y ECAE. Por consiguiente, las dosis fijas de fármacos reductores del colesterol se usan como enfoque principal para la reducción del riesgo de ECAE. En particular, los niveles elevados de CLBD se tratan más frecuentemente con estatinas (inhibidores de la 3-hidroxi-3-metilglutaril-co-enzima-A reductasa). Las estatinas reducen el CLBD hasta un 50 % del valor inicial, y reducen el riesgo de ECAE en un 15-37 %.

Con todo, sigue habiendo un riesgo residual de ECAE del 60-80 %, que provoca eventos vasculares mayores en aproximadamente un 20 % de los pacientes con CHD, incluso bajo un tratamiento óptimo con estatina. Asimismo, las estatinas pueden causar síntomas musculares tales como dolor, sensibilidad, rigidez, calambres, debilidad, fatiga, miopatía y rabdomiólisis. Además, aunque los agentes no estatinas, incluyendo resinas de unión a ácidos biliares, fibratos, niacina, y ezetimibe mejoran significativamente los perfiles de lípidos, ninguno proporciona una reducción de riesgo adicional para los eventos cardiovasculares cuando se combinan con una estatina. Por consiguiente, existe una necesidad de mejorar los fármacos no estatinas para disminuir los niveles de CLBD y reducir el riesgo de ECAE. El documento US 2001/029248 A1 divulga una composición y un método de reducción de la concentración de colesterol en lipoproteínas de baja densidad (LBD), pero no se pronuncia sobre CD24.

Sumario de la invención

En el presente documento se proporciona un método para reducir los niveles de CLBD en un sujeto mediante la administración de una proteína CD24 a un sujeto que lo necesita. También se proporciona un método para tratar o prevenir la aterosclerosis en un sujeto mediante la administración de la proteína CD24 a un sujeto que lo necesita. Además se proporciona un método para disminuir el riesgo de enfermedad cardiovascular, que puede ser la enfermedad cardiovascular aterosclerótica, mediante la administración de la proteína CD24 a un sujeto que lo necesita. El sujeto puede tener un nivel elevado de CLBD, que puede ser superior o igual a 70, 75, o 190 mg/dl. El sujeto puede haberse tratado previamente con otro fármaco que disminuye el nivel de CLBD, que puede ser una estatina o un antagonista de PCSK9.

La proteína CD24 puede comprender la secuencia de una CD24 humana madura o una variante de la misma. La CD24 humana madura puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 1 o 2. La proteína CD24 puede comprender cualquiera o todo el dominio extracelular de CD24 humana. La proteína CD24 puede comprender una secuencia señal, que puede permitir la secreción de una célula que expresa la proteína. La secuencia del péptido señal puede comprender el péptido señal de CD24 humana, que puede tener s Eq ID NO: 4, o puede ser uno que se encuentra en otra transmembrana o proteínas secretadas, o uno modificado a partir de los péptidos señal existentes conocidos en la técnica. La proteína CD24 puede ser soluble y puede ser glicosilada. La proteína CD24 se puede producir usando un sistema de expresión de la proteína eucariota, que puede comprender un vector contenido en una línea celular de ovario de hámster chino o un vector retroviral de replicación defectuosa. El vector retroviral de replicación defectuosa puede integrarse de manera estable en el genoma de una célula eucariota.

La proteína CD24 puede comprender una etiqueta de proteína, que puede estar fusionada en el extremo N- o C-terminal de la proteína CD24. La proteína CD24 puede comprender una porción de una proteína de inmunoglobulina (lg) de mamífero, que puede ser un humano. La porción de la proteína de lg puede ser una región Fc. La región Fc puede comprender la región bisagra y los dominios CH2 y CH3 de la proteína de Ig y la proteína de lg puede ser IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, o IgA. La región Fc también puede comprender la región bisagra y los dominios CH2, CH3, y CH4 de IgM. La proteína CD24 puede comprender la secuencia de SEQ ID NO: 5, 6, 8, 9, 11, o 12.

También se proporciona en el presente documento un método de control de la actividad de la proteína CD24 en un sujeto. El método puede comprender la comparación de la cantidad de CLBD en una muestra de sangre obtenida del sujeto en un punto de tiempo después de la administración de la proteína CD24 al sujeto a una cantidad de CLBD en una muestra de sangre obtenida del sujeto antes del punto de tiempo. Una disminución en la cantidad de CLBD con el tiempo puede ser indicativo de un aumento en la actividad de la proteína CD24. El método puede comprender además medir la cantidad de CLBD en la muestra de sangre obtenida después de la administración de la proteína CD24 al sujeto. El método también puede comprender medir la cantidad de CLBD en la muestra de sangre obtenida del sujeto antes del punto de tiempo. La cantidad de la proteína CD24 que se administra posteriormente al sujeto puede ser ajustada de acuerdo con la cantidad de CLBD en la muestra obtenida después de la administración de la proteína CD24 al sujeto. La cantidad de la proteína CD24 en la administración subsiguiente puede ser ajustada para mantener una actividad específica del nivel de concentración de la proteína CD24 en el sujeto.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1A muestra la composición de aminoácidos de la proteína de fusión CD24 de longitud completa, CD24Fc (también se denomina en el presente documento CD24Ig) (SEQ ID NO: 5). Los 26 aminoácidos subrayados son el péptido señal de CD24 (SEQ ID NO: 4), que son escindidos durante la secreción a partir de una célula que expresa la proteína y, por tanto, falta de la versión procesada de la proteína (SEQ ID NO: 6). La porción en negrita de la secuencia es el dominio extracelular de la proteína CD24 madura usada en la proteína de fusión (SEQ ID NO: 2). El último aminoácido (A o V) que está comúnmente presente en la proteína CD24 madura ha sido eliminado de la construcción para evitar la inmunogenicidad. Las letras no subrayadas, no en negrita son la secuencia de Fc de IgG1, incluyendo la región bisagra y los dominios CH2 y CH3 (SEQ ID NO: 7). La FIG. 1B muestra la secuencia de CD24VFc (SEQ ID NO: 8), en la que la proteína CD24 humana madura (negrita) es la variante polimórfica de valina de Se Q ID NO: 1. La FIG. 1C muestra la secuencia de CD24AFc (SEQ ID NO: 9), en la que la proteína CD24 humana madura (negrita) es la variante polimórfica de alanina de SEQ ID NO: 1. Las diversas partes de la proteína de fusión en las FIGS. 1B y 1C se marcan como en la FIG. 1A y el aminoácido valina/alanina variante tiene doble subrayado.

La Fig. 2 muestra un método para purificar y procesar una proteína CD24 expresada a partir de líneas celulares de mamífero.

La Fig. 3 muestra variaciones de la secuencia de aminoácidos entre las proteínas CD24 maduras de ratón (SEQ ID NO: 3) y humano (SEQ ID NO: 1). Los posibles sitios de O-glicosilación están en negrita, y los sitios de N-glicosilación están subrayados.

La Fig. 4A-C muestra un análisis de modelado compartimental WinNonlin de farmacocinética de CD24Fe (CD24Ig) en ratones. Los círculos abiertos representan la media de 3 ratones, y la línea es la curva farmacocinética prevista. Fig. 4A. Inyección i.v. de 1 mg de CD24Fc. Fig. 4B. Inyección s.c. de 1 mg de CD24Fc. Fig. 4C. Comparación de las cantidades totales de anticuerpo en la sangre medida por las áreas bajo la curva (ABC), semivida y la concentración máxima en sangre. Tenga en cuenta que, en general, las ABC y Cmáx de la inyección s.c. es de aproximadamente 80 % de la inyección i.v., aunque la diferencia no es estadísticamente significativa.

La Fig. 5 muestra una gráfica de concentración media de CD24Fc en plasma (±DT) por un tratamiento para una población evaluable de FC en sujetos humanos. FC = farmacocinética; DT = desviación típica.

La Fig. 6 muestra un gráfico de proporcionalidad de dosis de CD24FC Cmáx en comparación con una dosis para una población evaluable de FC.

La Fig. 7 muestra un gráfico de proporcionalidad de dosis de CD24FC ABCo-42d en comparación con una dosis para una población evaluable de FC.

La Fig. 8 muestra un gráfico de proporcionalidad de dosis de CD24FC ABCo-inf en comparación con una dosis para una población evaluable de FC.

Descripción detallada

Los inventores han descubierto que, sorprendentemente, las proteínas que contienen una secuencia CD24 madura son eficaces para disminuir los niveles de CLBD, y son adicionalmente útiles para el tratamiento y/o la prevención de la aterosclerosis, y para reducir el riesgo de enfermedad cardiovascular tal como enfermedad cardiovascular aterosclerótica. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Tal como se describe con más detalle en el presente documento, CD24 es una glicoproteína pequeña anclada a glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) con la expresión generalizada entre tanto las células hematopoyéticas como las no hematopoyéticas, que está codificada por una secuencia de codificación de 240 pares de bases. De los 80 aminoácidos, los primeros 26 constituyen el péptido señal, mientras que los últimos 23 sirven como una señal de escisión para permitir la fijación de la cola de GPI. Como resultado, la molécula CD24 humana madura tiene solo 31 aminoácidos. El aminoácido 31 es polimórfico entre la población humana. Una transición de C a T en el nucleótido 226 da como resultado la sustitución de alanina (A) con valina (V). Dado que este residuo está en la posición inmediatamente N-terminal al sitio de escisión, y dado que la sustitución es no conservadora, estos dos alelos pueden expresarse en diferentes eficiencias en la superficie celular. Los estudios de transfección con ADN de copia demostraron que se expresan alelos CD24v de manera más eficiente en la superficie celular. De acuerdo con esto, los leucocitos de sangre periférica CD24v/v expresaron mayores niveles de CD24, especialmente en células T. Tres líneas de evidencia demuestran que CD24 es un modificador genético para la EM. En el nivel de población, el genotipo CD24v/v es más de dos veces tan frecuente como lo es en la población normal. Entre las familias de EM, el alelo CD24v se transmite preferentemente a los pacientes con EM en comparación con controles sanos. Es más, entre los pacientes con EM que tienen una forma más grave de la enfermedad (escala ampliada del estado de discapacidad [EAEE] igual o superior a 6,0, cuando los pacientes pierden la capacidad de caminar de forma independiente), los individuos CD24v/v tuvieron, en promedio, 7 años para llegar a EAEE 6,0 desde el primer síntoma clínico, sin embargo, los individuos CD24a/v o CD24a/a alcanzaron EAEE 6,0 de 13 a 15 años. En cambio, una eliminación del dinucleótido en la región no traducida 3' de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de CD24, que reduce la estabilidad del ARNm de CD24 y, por tanto, reduce la expresión de CD24, protege a los humanos contra la EM y otras enfermedades autoinmunitarias. Hasta ahora, no se ha demostrado que CD24 afecte a los niveles de lípidos.

1. Definiciones.

La terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitante. Como se utiliza en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "uno", "una" y "el", "la" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Para la recitación de intervalos numéricos en el presente documento, se contempla de manera explícita cada número intermedio entre ellos con el mismo grado de precisión. Por ejemplo, para el intervalo de 6-9, se contemplan los números 7 y 8 además de 6 y 9, y para el intervalo 6,0-7,0, se contemplan de manera explícita los números 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 y 7,0.

Un "péptido" o "polipéptido" es una secuencia es una secuencia enlazada de aminoácidos y puede ser natural, sintético, o una modificación o combinación de natural y sintético.

"Sustancialmente idéntica" puede significar que una secuencia de aminoácidos primera y segunda es al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % sobre una región de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, o 300 aminoácidos.

"Tratamiento" o "tratar", cuando se refiere a la protección de un animal de una enfermedad, significa prevenir, suprimir, reprimir, o eliminar completamente la enfermedad. La prevención de la enfermedad implica administrar una composición de la presente invención a un sujeto antes de la aparición de la enfermedad. La supresión de la enfermedad implica la administrar una composición de la presente invención a un animal después de la inducción de la enfermedad, pero antes de su aparición clínica. La represión de la enfermedad implica administrar una composición de la presente invención a un sujeto después de la aparición de la enfermedad.

Una "variante" puede significar un péptido o polipéptido que difiere en la secuencia de aminoácidos por la inserción, deleción o sustitución conservativa de aminoácidos, pero conserva al menos una actividad biológica. Los ejemplos representativos de "actividad biológica" incluyen la capacidad de unirse a un receptor de tipo Toll y estar unido por un anticuerpo específico. Variante también puede significar una proteína con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una proteína de referencia con una secuencia de aminoácidos que conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservativa de un aminoácido, es decir, reemplazar un aminoácido con un aminoácido diferente de propiedades similares (p. ej., hidrofilicidad, grado y distribución de las regiones cargadas) se reconoce en la técnica como que implica generalmente un cambio menor. Estos cambios menores se pueden identificar, en parte, considerando el índice hidropático de los aminoácidos, según lo entendido en la técnica. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). El índice hidropático de un aminoácido se basa en una consideración de su hidrofobicidad y carga. Se sabe en la técnica que los aminoácidos de índices hidropáticos similares pueden sustituirse y aún conservar la función proteica. En un aspecto, están sustituidos los aminoácidos que tienen índices hidropáticos de ± 2. La hidrofilicidad de los aminoácidos también se puede utilizar para revelar sustituciones que darían como resultado proteínas que conservan la función biológica. Una consideración de la hidrofilicidad de los aminoácidos en el contexto de un péptido permite el cálculo de la mayor hidrofilicidad media local de ese péptido, una medida útil que se ha informado que se correlaciona bien con la antigenicidad y la inmunogenicidad. La patente de EE.Uu . N.° 4.554.101, que se incorpora completamente en el presente documento por referencia. La sustitución de aminoácidos que tiene valores de hidrofilicidad similares puede dar como resultado péptidos que conservan actividad biológica, por ejemplo, inmunogenicidad, como se entiende en la técnica. Las sustituciones se pueden realizar con aminoácidos que tienen valores de hidrofilicidad dentro de ± 2 entre sí. Tanto el índice de hidrofobicidad como el valor de hidrofilicidad de los aminoácidos están influenciados por la cadena lateral particular de ese aminoácido. De acuerdo con esa observación, se entiende que las sustituciones de aminoácidos que son compatibles con la función biológica dependen de la similitud relativa de los aminoácidos, y particularmente de las cadenas laterales de esos aminoácidos, como lo revela la hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y otras propiedades.

2. CD24

En el presente documento se incluye una proteína CD24, que puede comprender la secuencia de aminoácidos de CD24 humana madura o aquellas de otros mamíferos, que corresponde al dominio extracelular (DEC) de CD24, o una variante de la misma. Como se ha descrito anteriormente, la secuencia de la proteína CD24 humana madura es de 31 aminoácidos de longitud con un residuo variable de alanina (A) con valina (V) en su extremo C-terminal:

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK(V/A) (SEQ ID NO: 1)

La valina o alanina en su extremo C-terminal pueden ser inmunogénica y puede ser omitida de la proteína CD24 para reducir su inmunogenicidad. Por lo tanto, la proteína CD24 puede comprender la secuencia de aminoácidos o CD24 humana madura que carece del aminoácido en el extremo C-terminal:

SETTTGTSSNSSQSTSNSGLAPNPTNATTK (SEQ ID NO: 2)

A pesar de considerables variaciones de secuencia en la secuencia de aminoácidos de las proteínas CD24 maduras de ratón y humano, son funcionalmente equivalentes, ya que CD24Fc humana se ha mostrado que es activa en el ratón. La secuencia de aminoácidos del DEC de CD24 humana muestra alguna conservación de secuencia con la proteína de ratón (39 % de identidad; número de acceso a GenBank NP_033976), como se muestra en la Fig. 3. Sin embargo, no es sorprendente que el porcentaje de identidad no es más alto ya que el DEC de CD24 es solo 27-31 aminoácidos de longitud, dependiendo de la especie, y la unión a parte de su(s) receptor(es), tales como Siglec 10/G, está mediada por su ácido siálico y/o azúcares de galactosa de la glicoproteína. La identidad de secuencia de aminoácidos entre los dominios extracelulares de Siglec-10 humana (número de acceso a GenBank AF310233) y sus proteínas del receptor de Siglec-G homóloga murina (número de acceso a GenBank NP_766488) es de 63 %. Como resultado de la conservación de la secuencia entre CD24 de ratón y humana principalmente en C-terminal y en la abundancia de sitios de glicosilación, variaciones significativas en las proteínas CD24 madura pueden ser toleradas en el uso de la proteína CD24, especialmente si estas variaciones no afectan a los residuos conservados en el extremo C-terminal o no afectan a los sitios de glicosilación de CD24 de ratón o de humano. Por lo tanto, la proteína CD24 puede comprender la secuencia de aminoácidos de CD24 murina madura:

NQTSVAPFPGNQNISASPNPTNATTRG (SEQ ID NO: 3).

La secuencia de aminoácidos del DEC de CD24 humana muestra más conservación de secuencia con la proteína de mono cangrejero (52 % de identidad; número de acceso a UniProtkKB UniProt -I7GKK1) que con ratón. De nuevo, esto no es sorprendente dado que el porcentaje de identidad no es mayor ya que el DEC es solo 29-31 aminoácidos de longitud en estas especies, y el papel de los residuos de azúcar en la unión a su(s) receptor(es). La secuencia de aminoácidos del receptor Siglec-10 de cangrejero no se ha determinado pero la identidad de secuencia de aminoácidos entre la proteína Siglec-10 humana y de mono Rhesus (número de acceso a GenBank XP_001116352) es de 89 %. Por lo tanto, la proteína CD24 también puede comprender la secuencia de aminoácidos de CD24 de mono cangrejero (o Rhesus) madura:

TVTTSAPLSSNSPQNTSTTPNPANTTTKA (SEQ ID NO: 10)

La proteína CD24 puede ser soluble. La proteína CD24 puede comprender un péptido señal N-terminal, para permitir la secreción de una célula que expresa la proteína. La secuencia de péptido señal puede comprender la secuencia de aminoácidos MGRAMVAr Lg l g Ll LLALLLPTOIYS (SEQ ID NO: 4). Como alternativa, la secuencia señal puede ser cualquiera de las que se encuentran en otra transmembrana o proteínas secretadas, o las modificadas a partir de los péptidos señal existentes conocidos en la técnica.

a. Fusión

La proteína CD24 puede ser fusionada en su extremo N- o C-terminal a una etiqueta de proteína. La etiqueta de la proteína puede comprender una porción de una proteína de lg de mamífero, que puede ser humano o de ratón o de otra especie. La porción puede comprender una región Fc de la proteína de Ig. La región Fc puede comprender al menos uno de la región de bisagra, dominios CH2, CH3, CH4 de la proteína de Ig. La proteína de lg puede ser IgG 1, IgG2, IgG3, lgG4, o IgA humana, y la región Fc puede comprender la región bisagra, y los dominios CH2 y CH3 de la Ig. La región Fc puede comprender el isotipo G1 de inmunoglobulina humana (IgG1), que puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 7. La proteína de lg puede ser también IgM, y la región Fc puede comprender la región bisagra y dominios CH2, CH3, y CH4 de IgM. La etiqueta de la proteína puede ser una etiqueta de afinidad que ayuda en la purificación de la proteína, o una etiqueta que mejora la solubilidad que mejora la solubilidad y la recuperación de proteínas funcionales. La etiqueta de la proteína también puede aumentar la valencia de la proteína CD24. La etiqueta de la proteína también puede comprender GST, His, FLAG, Myc, MBP, NusA, tiorredoxina (TrX), modificador pequeño tipo ubiquitina (SUMO), ubiquitina (Ub), albúmina, o una lg de camélidos. Los métodos para preparar proteínas de fusión y purificación de proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica.

Basándose en la investigación preclínica, para la construcción de la proteína de fusión CD24Fc identificada en los ejemplos, se ha utilizado la forma truncada de la molécula CD24 nativa de 30 aminoácidos, que carece del aminoácido polimórfico final antes del sitio de escisión de la señal de GPI (es decir, una proteína CD24 madura que tiene SEQ ID NO: 2). La secuencia de CD24 humana madura se fusiona a un dominio Fc de IgG 1 humana (SEQ ID NO: 7). La proteína de fusión CD24Fc de longitud completa se proporciona en SEQ ID NO: 5 (Fig. 1), y la versión procesada de la proteína de fusión CD24Fc que se secreta de la célula (es decir, carece de la secuencia señal que se escinde) se proporciona en SEQ ID NO: 6. Las variantes polimórficas procesadas de CD24 madura (es decir, la proteína CD24 madura que tiene SEQ ID NO: 1) fusionada a Fc de IgG 1 puede comprender SEQ ID NO: 11 o 12.

b. Producción

La proteína CD24 puede ser fuertemente glicosilada, y puede estar implicada en funciones de CD24 tales como la coestimulación de las células inmunitarias y la interacción con una molécula de patrón molecular asociada con daño (DAMP). La proteína CD24 se puede preparar usando un sistema de expresión eucariota. El sistema de expresión puede implicar la expresión de un vector en células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster chino (CHO). El sistema puede ser un vector viral, tal como un vector retroviral de replicación defectuosa que se puede usar para infectar células eucarióticas. La proteína CD24 también puede ser producida a partir de una línea celular estable que expresa la proteína CD24 a partir de un vector o una porción de un vector que se ha integrado en el genoma celular. La línea celular estable puede expresar la proteína CD24 a partir de un vector retroviral integrado de replicación defectuosa. El sistema de expresión puede ser GPEx™.

c. Composición farmacéutica

La proteína CD24 puede estar contenida en una composición farmacéutica, que puede comprender una cantidad farmacéuticamente aceptable de la proteína CD24. La composición farmacéutica puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un disolvente, que puede mantener la proteína CD24 estable durante un período prolongado. El disolvente puede ser PBS, que puede mantener la proteína CD24 estable durante al menos 66 meses a -20 °C (-15~-25 °C). El disolvente puede ser capaz de acomodar la proteína CD24 en combinación con otro fármaco.

La composición farmacéutica puede formularse para la administración parenteral, incluyendo, pero sin limitación, por inyección o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden estar en forma de suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos o acuosos y pueden contener agentes de formulación que incluyen, pero sin limitación, agentes de suspensión, estabilizantes y dispersantes. La composición también puede proporcionarse en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado que incluye, pero sin limitación, agua estéril, libre de pirógenos.

La composición farmacéutica también se puede formular como una preparación de liberación lenta, que puede administrarse mediante implante o mediante inyección intramuscular. La composición puede formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (como una emulsión en un aceite adecuado, por ejemplo), resinas de intercambio iónico o como derivados escasamente solubles (como una sal escasamente soluble, por ejemplo).

D. Dosificación

La dosis de la proteína CD24 puede en última instancia ser determinada a través de un ensayo clínico para determinar una dosis con toxicidad aceptable y eficacia clínica. La dosis clínica inicial puede ser estimada a través de la farmacocinética y los estudios de toxicidad en roedores y primates no humanos. La dosis de la proteína CD24 puede ser de 0,01 mg/kg a 1000 mg/kg, y puede ser de 1 a 500 mg/kg, dependiendo de la cantidad deseada de disminución de CLBD y la vía de administración. La proteína CD24 se puede administrar por infusión intravenosa o inyección subcutánea o intramural (es decir, dentro de la pared de una cavidad u órgano), y la dosis puede ser 10-1000 mg, 10 500 mg, 10-240 mg, 10-120 mg, o 10, 30, 60, 120, o 240 mg, donde el sujeto es un humano.

3. Métodos de tratamiento

La proteína CD24 se puede administrar a un sujeto para disminuir los niveles de CLBD, que pueden ser elevados, y pueden además ser elevados por encima de un intervalo normal. El intervalo normal puede estar definido por un patrón conocido en la técnica, tal como el Panel de tratamiento para adultos (PTA) III del National Cholesterol Education Panel o la actualización de 2005 al mismo (descrito en Circulation 2002; 106:3143-421; y J Am Coll Cardiol. 4 de agosto de 2004;44(3): 720-32) o conforme lo establecido por el National Institute for Health and Care Excellence (NICE). El sujeto puede tener una deficiencia de lipasa ácida lisosómica (LAL), hipercolesterolemia familiar, o hiperlipidemia. La proteína CD24 también se puede administrar a un sujeto para tratar o prevenir la aterosclerosis, o para disminuir el riesgo de un evento de enfermedad cardiovascular, que puede ser un evento de enfermedades cardiovascular aterosclerótica (ECAE). El evento de ECAE puede ser un síndrome coronario agudo, infarto de miocardio, angina estable o angina inestable, una revascularización arterial coronaria u otra, ictus, ataque isquémico transitorio, enfermedad arterial periférica que se presume que es de origen aterosclerótico. El sujeto puede ser un mamífero tal como un ser humano.

El sujeto puede ser hombre o mujer. El sujeto puede ser de cualquier edad, pero en particular puede tener una edad de 40-75 años, o mayor de 75 años. El sujeto puede tener un CLBD superior o igual a 70 mg/dl, 75 mg/dl, o 190 mg/dl. El sujeto también puede ser diabético o no diabético, tener 40-75 años de edad, y tener un nivel de CLBD de 70-189 mg/dl. El sujeto puede tener un riesgo de ECEA de 10 años (definido como infarto de miocardio no fatal, muerte de la enfermedad coronaria del corazón, o un ictus no fatal y fatal) superior o igual a 7,5 %, o de 5-7,5 %. El sujeto puede tener características de un sujeto para el cual se recomienda disminuir el nivel de CLBD de acuerdo con las pautas de American College of Cardiology/American Heart Association de 2013 (Stone NJ, et al., 2013 ACC/AHA guideline of the treatment of blood cholesterol to reduce atherosclerotic cardiovascular risk in adults: a report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines, J Am Coll Cardiol 2014;63:2889-934). El sujeto puede tener hipercolesterolemia familiar, que puede ser causada por una mutación en el gen del receptor de LBD, gen de la apolipoproteína B, o gen pro-proteína subtilisina convertasa/kexina tipo 9.

El sujeto puede haber sido tratado previamente con un fármaco de disminución del nivel de CLBD, tal como una estatina. El sujeto también puede haber experimentado un evento adverso como consecuencia del fármaco. El evento adverso puede haber sido un síntoma muscular, tal como dolor, sensibilidad, rigidez, calambres, debilidad o fatiga general, y puede haber tenido un nivel de creatina fosfoquinasa indicativo de un mayor riesgo de eventos musculares adversos (que pueden ser >10 veces el límite superior del normal). El sujeto puede ser reacio a tratamiento con otro fármaco de disminución del colesterol, y puede tener un nivel de CLBD superior o igual a 75 mg/dl después de ser tratado con el otro fármaco, que puede ser una estatina. El sujeto puede tener enfermedad de injerto contra huésped, y puede haber exhibido un aumento del 10 % o un mayor aumento del nivel de CLBD después de haber sido sometido

a un trasplante en comparación con el nivel de CLBD del sujeto antes del trasplante. El sujeto puede tener esclerosis múltiple, artritis reumatoide, o una enfermedad autoinmune o inflamatoria.

a. Adm inistración

La vía de administración de la composición farmacéutica puede ser parenteral. La administración parenteral incluye, pero no se limita a, inyección intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intratecal, intraarticular, y directa. La composición farmacéutica puede administrarse a un paciente humano, gato, perro, animal grande, o un ave. La composición puede administrarse 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 veces por día.

b. Tratamiento de combinación

La proteína CD24 puede combinarse con otro tratamiento tal como un fármaco, incluyendo una estatina, una resina

de unión a ácido biliar, fibrato, niacina, ezetimiba, o un fármaco que aumenta los niveles de los receptores de LBD, incluyendo, pero sin limitación, un anticuerpo u otro inhibidor que antagoniza o bloquea la función de PCSK9. La proteína CD24 y el otro fármaco pueden administrarse juntos o secuencialmente.

La proteína CD24 se puede administrar simultánea o metronómicamente con otros tratamientos. El término "simultáneo" o "simultáneamente", como se utiliza en el presente documento, significa que la proteína CD24 y otro tratamiento se administran en un plazo de 48 horas, preferentemente de 24 horas, más preferentemente de 12 horas, aún más preferentemente de 6 horas, y los más preferentemente de 3 horas o menos, entre sí. El término "metronómicamente", como se utiliza en el presente documento, significa la administración del agente a veces diferente del otro tratamiento y a una cierta frecuencia con respecto a la administración repetida.

La proteína CD24 puede administrarse en cualquier punto antes de otro tratamiento que incluya aproximadamente

120 h, 118 h, 116 h, 114 h, 112 h, 110 h, 108 h, 106 h, 104 h, 102 h, 100 h, 98 h, 96 h, 94 h, 92 h, 90 h, 88 h, 86 h, 84

h, 82 h, 80 h, 78 h, 76 h, 74 h, 72 h, 70 h, 68 h, 66 h, 64 h, 62 h, 60 h, 58 h, 56 h, 54 h, 52 h, 50hr, 48 h, 46 h, 44 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h, 1

h, 55 min, 50 min, 45 min, 40 min, 35 min, 30 min, 25 min, 20 min, 15 min, 10 min, 9 min, 8 min, 7 min, 6 min, 5 min, 4

min, 3 min, 2 min, y 1 min. La proteína CD24 puede administrarse en cualquier punto antes de un segundo tratamiento

de la proteína CD24 que incluye aproximadamente 120 h, 118 h, 116 h, 114 h, 112 h, 110 h, 108 h, 106 h, 104 h, 102

h, 100 h, 98 h, 96 h, 94 h, 92 h, 90 h, 88 h, 86 h, 84 h, 82 h, 80 h, 78 h, 76 h, 74 h, 72 h, 70 h, 68 h, 66 h, 64 h, 62 h,

60 h, 58 h, 56 h, 54 h, 52 h, 50hr, 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h, 1 h, 55 min, 50 min, 45 min, 40 min, 35 min, 30 min, 25 min, 20 min, 15 min, 10 min, 9 min, 8 min, 7 min, 6 min, 5 min, 4 min, 3 min, 2 min, y 1 min.

La proteína CD24 puede administrarse en cualquier punto después de otro tratamiento que incluye aproximadamente

1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 6 min, 7 min, 8 min, 9 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min, 30 min, 35 min, 40 min,

45 min, 50 min, 55 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h, 30 h, 32 h,

34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h, 48 h, 50 h, 52 h, 54 h, 56 h, 58 h, 60 h, 62 h, 64 h, 66 h, 68 h, 70 h, 76 h, 78 h, 80 h, 82 h, 84 h, 86 h, 88 h, 90 h, 92 h, 94 h, 96 h, 98 h, 100 h, 102 h, 104 h, 106 h, 108 h, 110 h, 112 h,

114 h, 116 h, 118 h, y 120 h. La proteína CD24 puede administrarse en cualquier punto antes de un tratamiento previo

con CD24 que incluya aproximadamente 120 h, 118 h, 116 h, 114 h, 112 h, 110 h, 108 h, 106 h, 104 h, 102 h, 100 h,

98 h, 96 h, 94 h, 92 h, 90 h, 88 h, 86 h, 84 h, 82 h, 80 h, 78 h, 76 h, 74 h, 72 h, 70 h, 68 h, 66 h, 64 h, 62 h, 56 h, 54 h, 52 h, 50hr, 48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h, 22 h, 20 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h, 1 h, 55 min, 50 min, 45 min, 40 min, 35 min, 30 min, 25 min, 20 min, 15 min, 10

min, 9 min, 8 min, 7 min, 6 min, 5 min, 4 min, 3 min, 2 min, y 1 min.

4. Métodos de control de la actividad de la proteína CD24

La actividad de la proteína CD24 que se administra a un sujeto puede ser controlada mediante la detección de la concentración de CLBD en el sujeto. El sujeto puede ser sometido a un tratamiento con la proteína CD24, tal como el tratamiento para la esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad del injerto contra huésped, lesión tisular mediada por el sistema inmunitario, y similares. La concentración de CLBD puede ser indicativo del nivel de actividad

de la proteína CD24 en el sujeto, donde una disminución de CLBD en el paciente indica una mayor actividad de la proteína CD24. El método puede comprender la obtención de una muestra del sujeto y la detección de la cantidad de

CLBD en la muestra. La muestra puede ser una muestra de sangre tal como suero o plasma. Los métodos para medir las concentraciones de CLBD son bien conocidos en la técnica, tal como un ensayo basado en ELISA o un ensayo colorimétrico/fluorométrico tras el tratamiento con colesterol esterasa y colesterol oxidasa. La cantidad de CLBD se

puede medir mediante el cálculo de Friede-wald, que puede comprender el cálculo de la cantidad de CLBD basado en cantidades de colesterol total, triglicéridos y colesterol en lipoproteínas de alta densidad (CLAD) medidas en la muestra. La cantidad de CLAD se puede medir ya sea por un procedimiento de precipitación con sulfato de dextrano-Mg2+ o mediante un ensayo de CLAD directo. La cantidad de CLBD se puede medir también mediante el ensayo de LBD DIRECT™, el ensayo homogéneo de LBD N-GENEOUS™, o los valores de CLBD calculados que se derivan de la ecuación basada en ApoB: 0,41TC - 0,32TG 1,70ApoB - 0,27, (Clin Chem 1997;43:808-815). El nivel de CLBD se puede controlar con el tiempo y durante el curso del tratamiento con proteína CD24 con el fin de controlar la respuesta al tratamiento.

La cantidad de proteína CD24 que se administra al sujeto, para el tratamiento de una indicación descrito en esta invención o conocido en la técnica, puede ajustarse basándose en el nivel de actividad de la proteína CD24 detectado usando CLBD. El nivel de CLDB se puede controlar durante un período de tiempo o durante el curso del tratamiento con proteína CD24. Si la concentración de CLBD en el sujeto se reduce a un nivel dentro del intervalo de normal, entonces la cantidad de proteína CD24 administrada al sujeto puede reducirse, tal como mediante la disminución de la dosis de la proteína CD24 o su administración con menos frecuencia. Si la concentración de CLBD se mantiene sin cambios o se mantiene por encima del intervalo de normal, entonces la cantidad de proteína CD24 administrada al sujeto puede aumentarse, tal como mediante el aumento de la dosis de la proteína CD24 o su administración con más frecuencia. Como alternativa a CLDB, la concentración de las partículas de LBD (PLBD) también puede medirse para controlar la actividad de la proteína CD24. La concentración de PLBD se puede detectar directamente usando r Mn .

Los niveles de la proteína CD24 administrada al sujeto puede también ser controlados, que puede realizarse por un método que comprende la obtención de una muestra del sujeto y la detección de la cantidad de la proteína CD24 en la muestra. La muestra puede ser una muestra de sangre como suero o plasma. Los métodos de detección de proteínas son bien conocidos en la técnica. La proteína CD24 en la muestra puede ser detectada por cualquier método de detección de proteínas, tal como un inmunoensayo incluyendo ELISA, Gyros, MSD, Biacore, AlphaLISA, Delfia, Singulex, Luminex, Immuno-PCR, ensayos basados en células, RIA, transferencia Western, una columna de afinidad, y similares. El método ELISA puede ser ELISA sándwich o ELISA competitivo. Por ejemplo, el ELISA puede comprender poner en contacto la muestra con un anticuerpo de proteína anti-CD24, que pone en contacto el complejo de proteína CD24-anticuerpo de proteína CD24 con un anticuerpo etiquetado que se une al anticuerpo de proteína anti-CD24, y que mide la cantidad de anticuerpo etiquetado al detectar una señal producida por la etiqueta, donde la cantidad de señal se correlaciona con la cantidad de proteína CD24 en la muestra.

La cantidad de proteína CD24 administrada al sujeto puede ser ajustada (tal como mediante el ajuste de dosis y frecuencia de administración) basándose en un parámetro farmacocinético para la proteína CD24. Por ejemplo, la cantidad de proteína CD24 administrada al sujeto puede ser ajustada para obtener una concentración de CD24 en plasma superior a 1 ng/ml. En otro ejemplo, la cantidad de proteína CD24 administrada al sujeto se ajusta para mantener una concentración plasmática en estado estacionario superior a 1 ng/ml. En otro ejemplo, la cantidad de proteína CD24 administrada al sujeto puede ser ajustada para obtener Cmáx de la proteína CD24 de al menos aproximadamente 1 ng/ml. En otro ejemplo más, la cantidad de proteína CD24 administrada al sujeto puede ser ajustada para conseguir un nivel de exposición al fármaco, como se define por ABCo-inf, de la proteína CD24 de al menos aproximadamente 400.000 ng*h/ml.

La presente invención tiene múltiples aspectos, ilustrados mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Producción de proteínas CD24 solubles

La secuencia madura de CD24 se fusionó a Fc de IgG1. La composición de aminoácidos de la proteína de fusión CD24 se proporciona en la Fig. 1. Acto seguido se generó un vector retroviral de replicación defectuosa que estimula la expresión de la proteína de fusión CD24Fc. El sistema GPEx™ (un acrónimo de la expresión del producto de genes) ofrece varias ventajas importantes, la más importante de las cuales es, en promedio, > 1000 inserciones/célula, pero con solo 1 copia/inserción. Asimismo, puesto que el retrovirus se inserta preferentemente en el locus activo transcripcional, GPExTM dio como resultado un alto nivel de expresión de la proteína diana. Se generaron líneas celulares estables que producen un alto rendimiento de CD24Fc. Además se produjeron 45 gramos de productos de calidad de GLP y ~100 gramos de productos de calidad de cGMP. Los métodos usados para el procedimiento corriente abajo de medios recogidos del biorreactor se resumen en el siguiente diagrama de flujo (Fig. 2).

Clarificación de recogida

El medio de cultivo del biorreactor se clarificó utilizando filtros de profundidad Cuno 60M02 Maximizer seguido de un filtro Millipore Opticap de 0,22 um. El filtrado se recogió en una bolsa de recolección estéril. Se obtuvieron muestras para la cuantificación del rendimiento de CD24-Fc por ELISA.

Captura de proteína A

El medio clarificado se pasó sobre una columna de resina de proteína A (GE Healthcare MabSelect) a una concentración no superior a 16 g/l de resina (basado en ELISA) y un tiempo de contacto de 4 minutos. La columna se lavó con el tampón de equilibrio (Tris 50 mM NaCl 0,15 M pH 7,5), a continuación, con citrato de sodio/ácido cítrico 10 mM pH 6,0 para 5 vcs. CD24F unida se eluyó de la columna usando citrato de sodio/ácido cítrico 10 mM pH 3,5.

Inactivación viral

La fracción del eluato de proteína A fue llevada inmediatamente a pH 3,0 con la adición de ácido clorhídrico 2 M y se mantuvo en este pH durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se llevó a pH 5,0 con la adición de base Tris 1 M, y se filtró para claridad utilizando un filtro de fibra de vidrio de 0,65 um (Sartorius Sartopure GF2) y 0,2 um (Sartorius Sartopore 2) en una bolsa de recolección estéril.

Cromatografía SP-Sepharose

El material inactivado viral se aplicó a una columna de SP-Sepharose (GE Healthcare) a una concentración no superior a 25 g/l de resina (basándose en A280 nm de 1,22 = 1 mg/ml) y un caudal lineal de 250 cm/h. La columna se lavó con el tampón de equilibrio (citrato de sodio /ácido cítrico 10 mM pH 5,0) y CD24Fc unida se eluyó de la columna usando citrato de sodio/ácido cítrico 10 mM NaCl 0,2 M pH 5,0. El efluente se recogió en una bolsa de recolección estéril.

Cromatografía Mustang Q

El eluato de SP-Sepharose se ajustó a pH 7,5 mediante la adición de base Tris 1 M y se diluyó con WFI para reducir la conductividad. El material diluido se aplicó a un filtro Mustang Q (Pall) a una concentración no superior a 0,5 g/l de resina (basándose en A280 nm de 1,22 = 1 mg/ml) y un caudal de 5 volúmenes de columna/minuto. El filtro se lavó con el tampón de equilibrio (Tris 10 mM pH 7,5) y la CD24-Fc está contenida en el flujo a través y se recoge en una bolsa de recolección estéril.

Filtración viral

El flujo a través Mustang Q se filtró acto seguido a una presión constante de 30 psi a través de un filtro de 0,2 mM y un filtro viral Millipore NFP (poro nominal de 20 nm de tamaño) y se recogió en una bolsa de recolección estéril.

Concentración y formulación final

El producto se concentró y se diafiltró usando una membrana de ultrafiltración de 10 kDa (Millipore Prep/Scale) en un fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 150 mM pH 7,2 a una concentración final de aproximadamente 10 mg/ml como se determina por absorbancia a 280 nm. Las muestras analíticas se obtuvieron del residuo, mientras está en una cabina de bioseguridad. El etiquetado se realizó y las muestras se entregaron al CC para las pruebas, mientras que las alícuotas a granel se almacenaron a liberación pendiente de 2-8 °C.

Ejemplo 2

Farmacocinética de CD24 en ratones

Se inyectó 1 mg de CD24Fc (CD24Fc) en ratones C57BL/6 sin tratamiento previo y se recogieron muestras de sangre a diferentes puntos de tiempo (5 min, 1 h, 4 h, 24 h, 48 h, 7 días, 14 días y 21 días) con 3 ratones en cada punto de tiempo. Los sueros se diluyeron 1: 100 y se detectó los niveles de CD24Fc utilizando un ELISA sándwich usando CD24 anti-humana purificada (3,3 pg/ml) como el anticuerpo de captura y Fc de IgG anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa (5 pg/ml) como los anticuerpos de detección. Como se muestra en la Fig. 4a. La curva de decaimiento de CD24Fc reveló un decaimiento bifásico típico de la proteína. La primera fase de biodistribución tenía una vida media de 12,4 horas. La segunda fase sigue un modelo de eliminación de primer orden desde el compartimento central. La vida media para la segunda fase fue de 9,54 días, que es similar a la de los anticuerpos in vivo. Estos datos sugieren que la proteína de fusión es muy estable en la corriente sanguínea. En otro estudio en el que se inyectó la proteína de fusión por vía subcutánea, se observó una vida media casi idéntica de 9,52 días (Fig. 4b). Más importante aún, mientras se tardó aproximadamente 48 horas para que CD24Fc alcanzara los niveles máximos en la sangre, la cantidad total de la proteína de fusión en la sangre, según medición por ABC, fue sustancialmente la misma por vía de inyección. Por tanto, desde un punto de vista terapéutico, una vía de inyección diferente no debe afectar el efecto terapéutico del fármaco. Esta observación simplifica en gran medida el diseño experimental para la toxicidad de los primates y los ensayos clínicos.

Ejemplo 3

CD24 dism inuye los niveles de CLBD

Este ejemplo demuestra que CD24 disminuye el nivel de CLBD. Los cambios de CLBD en ayuno en el plasma del valor inicial se analizaron en un estudio clínico que se describe en más detalle más adelante (véase la sección Métodos de este ejemplo). Los niveles en ayuno de CLBD se determinaron entre muestras obtenidas en el Día -1, Día 7 y el Día 42 para la Cohorte 1 (grupo CD24Fc de 10 mg). Comenzando con la Cohorte 2 (grupo CD24Fc de 30 mg), este muestreo de lípidos se amplió para incluir el Día 14. Los datos se resumen en la Tabla 1. Debido a un conjunto de datos incompletos en la Cohorte 1, las Cohortes 2-5 se utilizaron para analizar para la reducción dependiente de la dosis de los niveles de CLBD. Se observó una reducción estadísticamente significativa dependiente de la dosis (Tabla 1).

Tabla 1 Cambio en niveles de CLBD en el Día 7 (U1), Día 14 (U2), y Día 42 (U3) del valor inicial (U0, definido como

100 %)

Dosis Obs Variable Etiqueta N Media Desv. Est. Mínimo Máximo 10 mg 6 u0 Valor inicial LBD 6 100,0000000 0 100,0000000 100,0000000 u 1 Relación de LBD a 7 días 5 99,6785886 8,5665505 87,0370370 107,7586207 u2 Relación de LBD a 14 días 0 - - - -u3 Relación de LBD a 42 días 6 102,9957054 5,3134796 96,8085106 110,5769231 30 mg 6 u0 Valor inicial LBD 6 100,0000000 0 100,0000000 100,0000000 u 1 Relación de LBD a 7 días 6 96,9190313 9,5257894 86,9047619 113,4328358 u2 Relación de LBD a 14 días 6 97,5816504 15,2482354 84,5238095 122,3880597 u3 Relación de LBD a 42 días 6 106,1959745 8,2383407 95,2830189 113,4328358 60 mg 6 u0 Valor inicial LBD 6 100,0000000 0 100,0000000 100,0000000 u 1 Relación de LBD a 7 días 6 90,7620588 12,6697467 72,0720721 106,1728395 u2 Relación de LBD a 14 días 6 102,5671170 5,2461286 96,5517241 110,3773585 u3 Relación de LBD a 42 días 6 105,1546943 13,4340830 93,2773109 127,1604938 120 mg 6 u0 Valor inicial LBD 6 100,0000000 0 100,0000000 100,0000000 u 1 Relación de LBD a 7 días 6 87,1476632 16,0595374 61,7391304 106,4516129 u2 Relación de LBD a 14 días 6 95,2625418 11,8341667 83,4782609 116,1290323 u3 Relación de LBD a 42 días 6 100,1377165 9,9404474 87,1794872 112,3456790 240 mg 6 u0 Valor inicial LBD 6 100,0000000 0 100,0000000 100,0000000 u1* Relación de LBD a 7 días 6 84,6472221 7,6553896 71,5596330 94,0476190 u2* Relación de LBD a 14 días 5 90,1393086 5,2501807 86,2385321 99,0825688 u3 Relación de LBD a 42 días 6 107,0369419 14,7154796 79,8449612 121,1009174 Control 10 u0 Valor inicial LBD 10 100,0000000 0 100,0000000 100,0000000 u 1 Relación de LBD a 7 días 10 93,7350811 8,9747121 83,7837838 107,1428571 u2 Relación de LBD a 14 días 8 104,5965396 13,8625952 83,7837838 125,2631579 u3 Relación de LBD a 42 días 10 102,6699920 16,2815599 77,0270270 138,1578947 *P<0.05 cuando se compara con el grupo de placebo, prueba t de Student.

El uso de cohorte 1 como referencia, se determinó si CD24Fc redujo los niveles de CLBD de manera dependiente de la dosis y del tiempo. Como se muestra en la Tabla 2, en comparación con la cohorte 1, que recibió 10 mg de CD24Fc, se observó una reducción significativa dependiente de la dosis de los niveles de CLBD (p <0,0001).

Tabla 2 Reducción dependiente de la dosis y del tiempo de CLBD en Cohortes por modelo GEE, usando la cohorte 1 (la dosis más baja como referencia)

Confianza del 95 %

Parámetro Estimación Error típ ico Límites Z Pr > |Z| Intersección 98,0544 5,4745 87,3245 108,7842 17,91 <,0001 tiempo 1,6471 2,1861 -2,6375 5,9317 0,75 0,4512 30 mg 3,7167 7,3244 -10,6389 18,0722 0,51 0,6118 tiempo* 30 mg -1,4733 3,5435 -8,4183 5,4718 -0,42 0,6776 60 mg -25,4898 14,4124 -53,7377 2,7581 -1,77 0,0770 tiempo* 60 mg 10,7245 5,0225 0,8805 20,5685 2,14 0,0327 120 mg -21,2684 9,4771 -39,8431 -2,6936 -2,24 0,0248 tiempo* 120 mg 6,6669 3,9357 -1,0468 14,3806 1,69 0,0903 240 mg -15,8681 6,9247 -29,4402 -2,2960 -2,29 0,0219 tiempo* 240 mg 5,4390 2,8825 -0,2106 11,0887 1,89 0,0592

Se observó una reducción estadísticamente significativa dependiente de la dosis de CLBD, lo que indica que CD24Fc es eficaz para la disminución de CLBD en pacientes humanos.

Métodos

Esto fue un estudio de una sola dosis ascendente, controlado con placebo, doble ciego, aleatorizado, en fase I, para evaluar la seguridad, tolerancia y PK de CD24Fc en sujetos adultos sanos de género masculino y femenino. Un total de 40 sujetos en 5 cohortes de 8 sujetos cada uno se inscribieron en este estudio. Seis de los 8 sujetos en cada cohorte recibió un fármaco y 2 sujetos recibieron placebo (cloruro de sodio al 0,9 %, solución salina). La primera cohorte se dosificó con 10 mg. Las cohortes sucesivas recibieron 30 mg, 60 mg, 120 mg, y 240 mg de CD24Fc o placebo coincidente y se dosificaron al menos 3 semanas de separación para permitir la revisión de los datos de seguridad y tolerancia para cada cohorte anterior. Se permitió la administración de la siguiente dosis más alta a una nueva cohorte de sujetos solo si habían sido demostradas la seguridad y la tolerancia adecuadas.

En cada cohorte, los 2 sujetos iniciales fueron 1 receptor del fármaco del estudio y 1 receptor del placebo en el Día 1. Se dosificaron el 3° hasta 5° y 6° al 8° sujetos después del Día 7 (un mínimo de 24 horas de diferencia entre los subgrupos). Cada sujeto se dosificó al menos 1 hora de diferencia en el mismo subgrupo. Si fuera necesario, La dosificación del resto de los sujetos se retrasó en espera de que se revisara cualquier problema de seguridad significativo que pueda haber surgido durante el período post-dosis que implica los primer o segundo subgrupos en esa cohorte. La cohorte subsiguiente se dosificó al menos 3 semanas después de la cohorte anterior.

Periodo de evaluación:

La visita de evaluación (Visita 1) se produjo hasta 21 días anteriores al comienzo del período de tratamiento activo. Después de dar su consentimiento informado, los sujetos fueron sometidos a procedimientos de selección para la elegibilidad.

Período de tratamiento:

Los sujetos fueron ingresados en la Unidad de Farmacología Clínica (UFC) en el Día -1 (Visita 2), y el período de tratamiento aleatorizado comenzó el Día 1 después de un mínimo de 10 horas de ayuno. Los sujetos fueron asignados aleatoriamente a un tratamiento con CD24Fc o placebo como una dosis única. Los sujetos permanecieron confinados hasta la mañana del Día 4.

Seguimiento:

Todos los sujetos volvieron a la UFC en el Día 7, Día 14, Día 21, Día 28 y Día 42 (±1 día) para las visitas de seguimiento (Visita 3, Visita 4, Visita 5, Visita 6, y Visita 7). La Visita 7 fue la visita final para todos los sujetos.

Duración del tratamiento: La duración total del estudio para cada sujeto fue de hasta 63 días. La administración de una dosis única se produjo en el Día 1.

Número de sujetos:

Planificado: 40 sujetos

Seleccionados: 224 sujetos

Aleatorizados: 40 sujetos

Completados: 39 sujetos

Abandonos: 1 sujeto

Diagnóstico y principales criterios de inclusión: La población de este estudio fue hombres y mujeres sanos entre las edades de 18 y 55 años, ambos inclusive, con un índice de masa corporal de entre 18 kg/m2 y 30 kg/m2, ambos inclusive.

Producto de investigación e información del comparador:

CD24Fc: dosis única de 10 mg, 30 mg, 60 mg, 120 mg o 240 mg administrada mediante infusión IV; número de lote: 09MM-036. CD24Fc era una proteína de fusión completamente humanizada que consiste en la secuencia madura de CD24 humana y la región cristalizable del fragmento de inmunoglobulina G1 humana (IgG1Fc). CD24Fc se suministró como una solución estéril, transparente, incolora, sin conservantes, acuosa para administración IV. CD24Fc se formuló como una solución para inyección de dosis única, a una concentración de 10 mg/ml y un pH de 7,2. Cada vial de CD24Fc contenía 160 mg de CD24Fc, 5,3 mg de cloruro de sodio, 32,6 mg de fosfato de sodio dibásico heptahidrato, y 140 mg de fosfato de sodio monobásico monohidrato en 16 ml ± 0,2 ml de CD24Fc. CD24Fc se suministró en viales de vidrio de borosilicato transparentes con tapones de caucho de clorobutilo y sellos herméticos de aluminio de apertura fácil.

Placebo coincidente (cloruro de sodio al 0,9 %, solución salina) administrado mediante infusión IV; números de lote: P296855, P311852, P300715, P315952.

La población con intención de tratar (IDT) consistió en todos los sujetos que recibieron al menos 1 dosis del fármaco del estudio. La población con IDT fue la población de análisis principal de información temática y evaluación de la seguridad.

Las evaluaciones de laboratorio clínico (química, hematología y análisis de orina) se resumieron por tratamiento y visita. También se resumió el cambio desde el valor inicial. Los signos vitales (presión arterial, frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria y temperatura) se resumieron por tratamiento y punto de tiempo. También se resumió el cambio desde el valor inicial. Se enumeran todos los datos de la exploración física. Se resumen los parámetros del electrocardiograma y el cambio desde el valor inicial. Se enumeran interpretaciones generales. El CLBD en ayuno y el colesterol en lipoproteínas de alta densidad se obtuvieron en el Día -1, Día 7 y el Día 42 para la Cohorte 1 (grupo CD24Fc de 10 mg). Comenzando con la Cohorte 2 (grupo Cd24Fc de 30 mg), este muestreo de lípidos se amplió para incluir el Día 14.

Ejemplo 4

Farmacocinética de CD24 en humanos

Este ejemplo muestra un análisis de la farmacocinética de una proteína CD24 en humanos.

Concentración de CD24Fc en plasma

Como se muestra en la Fig. 5, la concentración plasmática media de CD24Fc aumentó proporcionalmente a la dosis de CD24Fc administrada. Para todos los grupos de dosis excepto 120 mg, se alcanzó la concentración plasmática media máxima de CD24Fc en 1 hora después de la dosis. Se alcanzó la concentración plasmática media máxima de CD24Fc para el grupo de 120 mg a las 2 horas después de la dosis. En el Día 42 (984 horas), la concentración media en plasma de CD24Fc para todos los grupos había disminuido a entre 2 % y 4 % de la concentración plasmática media máxima.

La Tabla 3 resume los parámetros de FC en plasma de CD24Fc por el tratamiento para la población evaluable de FC. Tabla 3 Resumen de los parámetros farmacocinéticos en plasma de CD24Fc por tratamiento - Población evaluable de FC

continuación

Análisis de proporcionalidad de dosis de CD24Fc en plasma

La Figura 6 muestra un gráfico de proporcionalidad de dosis Cmáx CD24FC en comparación con la dosis para la población evaluable de FC. La Fig. 7 muestra un gráfico de proporcionalidad de dosis de ABCo-42d CD24FC en comparación con una dosis para una población evaluable de FC. La Fig. 8 muestra un gráfico de proporcionalidad de dosis de ABCo-inf CD24FC en comparación con una dosis para una población evaluable de FC. La Tabla 4 muestra un análisis de potencia de proporcionalidad de la dosis.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína CD24 para su uso en reducir los niveles de colesterol en lipoproteínas de baja densidad (LBD) (CLBD) en un sujeto.

2. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sujeto tiene un nivel de CLBD elevado.

3. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el sujeto tiene un nivel de CLBD superior o igual a 75 mg/dl, o un nivel de CLBD superior o igual a 70 mg/dl o 190 mg/dl.

4. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sujeto puede haberse tratado previamente con otro fármaco que disminuye el nivel de CLBD, en donde el otro fármaco que disminuye el CPBD no es una proteína CD24.

5. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el otro fármaco que disminuye el CLBD es una estatina o un antagonista de PCSK9.

6. Una proteína CD24 para su uso en el tratamiento o la prevención de la aterosclerosis, o en la disminución del riesgo de enfermedad cardiovascular aterosclerótica, en un sujeto.

7. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína CD24 comprende un polipéptido CD24 humano maduro o una variante del mismo.

8. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el polipéptido CD24 humano maduro comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las secuencias establecidas en los SEQ ID NO: 1 y 2.

9. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, en donde la proteína CD24 comprende además una etiqueta de proteína, en donde la etiqueta de proteína está fusionada en el extremo N- o C-terminal de la proteína CD24.

10. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la etiqueta de proteína comprende una región Fc de una proteína de inmunoglobulina (lg) de mamífero.

11. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la proteína de Ig de mamífero es una proteína de Ig humana, y en donde la región Fc comprende: (a) una región bisagra y dominios CH2 y CH3 de la proteína de Ig humana, y en donde la proteína de Ig humana se selecciona entre el grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgA; o, (b) una región bisagra y dominios CH2, CH3 y CH4 de IgM humana.

12. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la proteína CD24 comprende la secuencia expuesta en los SEQ ID NO: 6, 11 o 12.

13. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia de la proteína CD24 consiste en la secuencia expuesta en los SEQ ID NO: 6, 11 o 12.

14. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína CD24 es soluble.

15. La proteína CD24 para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína CD24 está glicosilada.