JP2004339383A

JP2004339383A - 機能性ピペットチップ及びチューブ

Info

Publication number: JP2004339383A
Application number: JP2003138188A
Authority: JP
Inventors: Kyoichi Saito; 恭一斎藤; Tomofumi Shiraishi; 朋文白石
Original assignee: Kankyo Joka Kenkyusyo KK
Current assignee: Kankyo Joka Kenkyusyo KK
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2003-05-16
Publication date: 2004-12-02

Abstract

【課題】プラスチック製ピペットチップ及びチューブの内表面に、直接、機能をもつ高分子鎖を付与することによって、液の吸引及び排出速度を大きく保ちながら、生体成分、例えば、タンパク質の捕集又は分離精製を高効率で行える機能性ピペットチップ及びチューブを提供すること。
【解決手段】プラスチック製ピペット材料の表面に、重合性単量体をグラフト重合することにより、生体成分捕集機能を有する官能基を導入したことを特徴とする機能性ピペット材料。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体中から、タンパク質、酵素、核酸、アミノ酸などの生体成分を捕集又は分離精製するための機能性ピペットチップ及びチューブ、並びにその製造方法に関する。更に詳しくは、本発明は、バイオテクノロジーに関連した分野に利用されるものであり、例えば、遺伝子操作、ゲノミクス、タンパク質の網羅的・系統的研究（プロテオミクス）において、生体成分を捕集又は分離精製するための機能性ピペットチップ及びチューブ、並びにその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質に代表される生体成分の取り扱いは、従来からピペットチップでの操作が頻繁に行われているところ、バイオテクノロジーの発展に伴い、生体成分のハイスループットな分離精製が要求されている。
【０００３】
そこで、ピペットチップの先端付近に、イオン交換基、疎水性リガンド、又はアフィニティリガンドを有するビーズを充填することによって、チップヘの液の吸引や排出の間に生体成分をそのビーズに吸着させる方法が提案されている。
【０００４】
しかしながらこの方法は、ビーズ充填部の流動抵抗のため、液の吸引又は排出速度が遅く、ビーズ内部への生体成分の拡散にも時間がかかるという欠点を有していた。また、ビーズの充填に手間がかかるため、製品の製造コストにも問題があった。
【０００５】
一方、放射線グラフト重合技術を応用した有害重金属の吸着除去材料に関する技術が報告されており（例えば、非特許文献１参照）、本技術を応用して既存の材料に新たな機能を導入する研究が行われてきている。
【０００６】
【非特許文献１】
須郷高信，「排水中の重金属吸着分離材料の開発」，ゼロエミッション構築技術「ＯＨＭ」９月別冊，株式会社オーム社２００２年９月１３日，ｐ．１０５〜１１０
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
上記の従来技術に鑑み、本発明は、プラスチック製ピペットチップ及びチューブの表面に、生体成分捕集機能を有する高分子鎖を直接付与することによって、液の吸引及び排出速度を大きく保ちながら、生体成分、例えば、タンパク質の捕集又は分離精製を高効率で行える機能性ピペットチップ及びチューブを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、本発明者らは、グラフト重合法により機能性官能基を有する重合性単量体を導入することにより、ピペット材料に直接生体成分捕集機能を付与することができることを発見し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は、機能性ピペット材料であって、プラスチック製ピペット材料の表面に、重合性単量体をグラフト重合することにより、生体成分捕集機能を有する官能基を導入したことを特徴とするものである。
【００１０】
また、本発明は、上記の機能性ピペット材料であって、生体成分捕集機能を有する官能基が、親水性基、カチオン性解離基、アニオン性解離基、疎水性リガンド、及びアフィニティリガンドからなる群から選択される１種又はそれ以上であることを特徴とするものである。
【００１１】
更に、本発明は、上記の機能性ピペット材料であって、アフィニティリガンドが、プロテインＡ、抗体、抗原、酵素、基質、固定化金属、及び染料からなる群から選択される１種又はそれ以上であることを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明は、上記の機能性ピペット材料であって、生体成分捕集機能を有する官能基が、スルホン基、オキソスルホン基、メチルスルホン基、エチルスルホン基、リン酸基、ホスホン酸基、カルボキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、４級アンモニウム塩基、アミドキシム基、イミノジ酢酸基、アルキル基、及びフェニル基からなる群から選択される１種又はそれ以上であることを特徴とするものである。
【００１３】
更に、本発明は、機能性ピペット材料の製造方法であって、プラスチック製ピペット材料の表面に、重合性単量体をグラフト重合することにより、生体成分捕集機能を有する官能基を導入することを特徴とするものである。
【００１４】本発明によれば、プラスチック製ピペット材料の表面に、重合性単量体をグラフト重合することにより、生体成分捕集機能を有する官能基を導入したことを特徴とする機能性ピペット材料が提供される。ここで、本発明において「ピペット材料」とはピペットチップ又はピペットチューブをいうものとする。
【００１５】
また、本発明においては、目的・用途に応じて、ピペット材料の外表面若しくは内表面、又はその両方に選択的に生体成分捕集機能を付与することができる。
【００１６】
本発明は、既存のプラスチック製ピペットチップやチューブを基材にして、グラフト重合法により、その表面に直接グラフト（接ぎ木）高分子鎖を付与することを特徴とする。グラフト高分子鎖は重合性単量体を重合させることにより形成され、その重合性単量体は、生体成分捕集機能を有する官能基を初めから含むか、又は後の反応によって生体成分機能をもたせることが可能な官能基（例えば、エポキシ基）を含むかのいずれであってもよい。本発明のピペットチップ及びチューブは、付与するグラフト高分子鎖の量と、生体成分捕集機能を有する官能基の密度とを調節することにより、流動抵抗と生体捕集機能とのつりあいをとることができるという特徴を有する。
【００１７】
本発明の機能性ピペットチップ及びチューブとして用いられる基材には特に制限はなく、重合性単量体が結合し得るものであればいかなる材料をも使用できる。本発明においては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリテトラフルオロエチレン、又はこれらの組み合わせを使用することができる。
【００１８】
本発明のピペットチップ状及びチューブ状の吸着材料における基材の役割は、捕集機能を有する官能基を含む重合性単量体を支持することである。本発明においては、捕集機能を有する官能基を含む重合性単量体が、グラフト重合により、基材である高分子鎖の幹に側鎖として導入される。従って、一般に、基材それ自身は、原則的に捕集物質に対して非反応性の材料である。基材のこのような役割に対して、対象物質を捕集する役割は重合性単量体が担う。このように、基材と重合性単量体とで、捕集材料としての役割を分担することが、本発明の大きな特徴の一つである。
【００１９】
本発明における「生体成分捕集機能を有する官能基」には、それ自体が生体成分捕集機能を有する官能基だけでなく、適当な反応により、生体成分捕集機能を有する官能基に変換することができる官能基も含まれる。本発明における生体成分の捕集機能を有する官能基としては、例えば、親水性基、カチオン性解離基、アニオン性解離基、疎水性リガンド、及びアフィニティリガンドがあげられる。従って、重合性単量体は、親水性基、カチオン性解離基、アニオン性解離基、疎水性リガンド、若しくはアフィニティリガンド、又はこれらの官能基に変換しうる官能基のうち１種又はそれ以上を含んでいればよい。生体成分捕集機能を有する官能基に変換しうる官能基とは、例えば、エポキシ基である。
【００２０】
グラフト重合法としては、例えば、反応開始剤重合法又は電離性放射線重合法を用いることができる。この場合、反応条件を適宜制御することによって、目的の重合度を得ることができる。電離性放射線を用いる場合には、紫外線、電子線、Ｘ線、α線、β線及びγ線などを使用することができる。このようなグラフト重合により、例えば、エポキシ基を有する重合性単量体、親水性基を有する重合性単量体、カチオン性解離基を有する重合性単量体、及びアニオン性解離基を有する重合性単量体を基材に重合することができる。目的とする捕集材料の用途や機能に応じて、これらの重合性単量体を混合して重合することもできる。
【００２１】
エポキシ基は反応性が高く、適当な試薬との反応によって、親水性基、カチオン性解離基、アニオン性解離基、疎水性リガンド、及びアフィニティリガンドに変換することができる。エポキシ基を有する重合性単量体として特に有用な重合性単量体には、グリシジルメタクリレートやグリシジルアクリレートがある。
【００２２】
親水性基としては、例えば、水酸基、ヒドロキシルアルキル基（ここで、アルキル基は、好ましくは低級アルキル基である）、ジオール基、アミノ基、又はピロリドニル基を用いることができる。好ましい親水性基は、水酸基、ヒドロキシルアルキル基である。親水性基を有する重合性単量体として本発明において有用なものとしては、例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ビニルピロリドン、ジメチルアクリルアミド、エチレングリコールモノメタクリレート、エチレングリコールモノアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、トリエチレングリコールジアクリレート、及びトリエチレングリコールジメタクリレートがある。このうち、特に有用な重合性単量体は、ヒドロキシエチルメタクリレートである。
【００２３】
本発明において、「カチオン性解離基」とは、対イオンがカチオンであるイオン交換基をいう。典型的なカチオン性解離基は酸基であり、例えば、カルボキシル基、スルホン基、リン酸基、スルホエチル基、ホスホメチル基、カルボメチルなどが含まれる。好ましいカチオン性解離基としては、スルホン酸基やカルボキシル基がある。カチオン性解離基を有する重合性単量体として本発明において有用なものには、例えば、アクリル酸、メタクリル酸、アリルスルホン酸、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸及びそれらの塩、並びに２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸がある。また、カチオン性解離基に変換可能な基を有する重合性単量体も本発明において有用である。そのような重合性単量体には、グリシジルメタクリレートがある。
【００２４】
本発明において、「アニオン性解離基」とは、対イオンがアニオンであるイオン交換基をいう。アニオン性解離基には、例えば、４級アンモニウム塩基や、アミノ基、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、及びジエチルアミノ基のような１級〜３級アミノ基がある。好ましいアニオン性解離基は、４級アンモニウム塩基やアミノ基である。アニオン性解離基を有する重合性単量体として本発明において有用なものには、例えば、ビニルベンジルトリメチルアンモニウム塩、ジエチルアミノエチルメタクリレート、ジエチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチルアクリレート、ジエチルアミノメチルメタクリレート、ターシャリーブチルアミノエチルメタクリレート、ターシャリーブチルアミノエチルアクリレート、ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、アクリルアミド、アリルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドがある。これらのうち、特に有用な重合性単量体は、ビニルベンジルトリメチルアンモニウム塩及びジエチルアミノエチルメタクリレートである。また、アニオン性解離基に変換可能な基を有する重合性単量体も本発明において有用である。そのような重合性単量体には、クロロメチルスチレンがある。
【００２５】
本発明において、「疎水性リガンド」とは、疎水性相互作用に基づいて、生体成分を選択的に捕集する官能基をいう。疎水性リガンドには、ブチル基、オクチル基、オクタデシル基、フェニル基などがある。
【００２６】
本発明において、「アフィニティリガンド」とは、抗原と抗体のペア及び基質と酵素のペアで代表される特異的親和力に基づいて、生体成分を特異的に捕集する官能基をいう。アフィニティリガンドには、抗体、抗原、酵素、基質、プロテインＡ、固定化金属、染料などがある。
【００２７】
以下、本発明を実施例に従って、更に詳細に説明する。
【００２８】
【実施例】
（実施例１）
市販のポリプロピレン製のピペットチップを基材として用いて、電子線を常温、窒素雰囲気下で２００ｋＧｙ照射した。照射ピペットチップを、１０％グリシジルメタクリレートのブタノール溶液に浸すことによってグラフト重合させた。その後、グリシジルメタクリレートグラフト重合ピペットチップを、亜硫酸ナトリウムの５０％溶液に浸した。イオン交換容量を測定した結果、ピペットチップ１本あたり１６μｍｏｌのスルホン基が導入された。
【００２９】
得られたカチオン交換ピペットチップを市販のピペットに取り付け、容器の中の０．５ｇ／Ｌのリゾチーム溶液２００μＬを吸引、排出する操作を繰り返した。一定時間ごとに容器中のリゾチーム濃度を測定した。その結果、累積ピペッティング時間（ピペッティング１回あたりに要する時間×ピペッティング回数；液とピペットが接触している累積時間を表す）１４０秒で、リゾチーム濃度は初期濃度の４０％までに減少した。これは、カチオン交換チップヘのリゾチーム吸着量６０μｇに相当した。
【００３０】
（実施例２）
市販のポリプロピレン製のピペットチップを基材として用いて、電子線を常温、窒素雰囲気下で２００ｋＧｙ照射した。照射ピペットチップを、１０％グリシジルメタクリレートのブタノール溶液に浸すことによってグラフト重合させた。その後、グリシジルメタクリレートグラフト重合ピペットチップを、トリメチルアミンの５０％溶液に浸した。イオン交換容量を測定した結果、ピペットチップ１本に５．９μｍｏｌのトリメチルアンモニウム塩基が導入された。
【００３１】
得られたアニオン交換ピペットチップの吸着性能を実施例１と同様の手順により試験した。捕集対象のタンパク質としてウシ血清アルブミンを用いた。容器の中のＯ．５ｇ／Ｌのアルブミン溶液２００μＬを吸引、排出する操作を繰り返した。一定時間ごとにアルブミン濃度を測定した。その結果、累積ピペッティング時間１４０秒で、アルブミン濃度は初期濃度の７０％までに減少した。これは、アニオン交換チップヘのアルブミン吸着量３０μｇに相当した。
【００３２】
（実施例３）
市販のテフロン（Ｒ）製チューブ（内径１ｍｍ）を基材として用いて、電子線を常温、窒素雰囲気下で５０ｋＧｙ照射した。照射チューブを、１０％グリシジルメタクリレートのブタノール溶液に浸すことによってグラフト重合させた。その後、グリシジルメタクリレートグラフト重合チューブを、亜硫酸ナトリウムの５０％溶液に浸して、エポキシ基をスルホン酸基へ定量的に転化した。
【００３３】
得られたカチオン交換チューブ（長さ１０ｃｍ）をシリンジポンプに取り付け、カチオン交換チューブの一端（入口）から他端（出口）へ一定流量（５ｍＬ／ｈ）で、５００ｍｇ／Ｌのリゾチーム溶液を流通させた。出口からの流出液を連続的に採取して、リゾチーム濃度を追跡した。流出液濃度と供給液濃度が一致するまで実験を行った。カチオン交換チューブヘのリゾチームの高分子鎖体積あたりの平衡吸着容量は７３ｍｇ／ｃｍ^３であった。
【００３４】
（実施例４）
市販のテフロン（Ｒ）製チューブを基材として用いて、電子線を常温、窒素雰囲気下で５０ｋＧｙ照射した。照射チューブを、１０％グリシジルメタクリレートのブタノール溶液に浸すことによってグラフト重合させた。その後、グリシジルメタクリレートグラフト重合チューブを、１００％オクタデカンチオールに浸した。
【００３５】
得られた疎水性チューブ（長さ１０ｃｍ）の吸着性能を実施例３と同様の手順により試験した。疎水性チューブの一端（入口）から他端（出口）へ一定流量（５ｍＬ／ｈ）で、５ｍｇ／Ｌのリゾチーム溶液を流通させた。リゾチームを溶かす緩衝液には１００ｍＭトリス塩酸緩衝液を用いた。出口からの流出液を連続的に採取して、リゾチーム濃度を追跡した。流出液濃度と供給液濃度が一致するまで実験を行った。疎水性チューブヘのリゾチームのチューブ内面積あたりの平衡吸着容量は０．３μｇ／ｃｍ^２であった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明は、既存のピペットチップ及びチューブを基材として、化学的・物理的に安定な機能性高分子鎖をグラフト重合により固定化することによって、捕集又は分離精製機能を有するピペットチップ及びチューブとしての用途が拡がることを狙ったものである。
【００３７】
上述の通り、本発明の機能性ピペットチップ及びチューブによれば、生体成分の捕集又は分離精製を高容量かつ低い操作圧力で行える点で優れている。また、本発明によれば、種々の生体成分を高効率で捕集又は分離精製することが可能であることから、遺伝子操作、デノミクス、プロテオミクスなどバイオ技術の道具として広範な用途に利用できる。

Claims

プラスチック製ピペット材料の表面に、重合性単量体をグラフト重合することにより、生体成分捕集機能を有する官能基を導入したことを特徴とする機能性ピペット材料。
生体成分捕集機能を有する官能基が、親水性基、カチオン性解離基、アニオン性解離基、疎水性リガンド、及びアフィニティリガンドからなる群から選択される１種又はそれ以上である、請求項１記載の機能性ピペット材料。
アフィニティリガンドが、プロテインＡ、抗体、抗原、酵素、基質、固定化金属、及び染料からなる群から選択される１種又はそれ以上である、請求項２記載の機能性ピペット材料。
生体成分捕集機能を有する官能基が、スルホン基、オキソスルホン基、メチルスルホン基、エチルスルホン基、リン酸基、ホスホン酸基、カルボキシル基、１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基、４級アミノ基、４級アンモニウム塩基、アミドキシム基、イミノジ酢酸基、アルキル基、及びフェニル基からなる群から選択される１種又はそれ以上である、請求項１記載の機能性ピペット材料。
プラスチック製ピペット材料の表面に、重合性単量体をグラフト重合することにより、生体成分捕集機能を有する官能基を導入することを特徴とする機能性ピペット材料の製造方法。