JP2004337100A - 試料中カルシウムの測定試薬及び測定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、ＰＬＤ５７に比べてＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が高いホスホリパーゼＤを使用した、試料中のカルシウム測定試薬及び試料中のカルシウム測定方法を提供する。
【解決手段】分子量約４２キロダルトン及び分子量約２０キロダルトンのアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにその基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬である。
また、試料中のカルシウムを測定する方法であって、ａ）該試料と前記のホスホリパーゼＤ、並びに前記の化合物を混合し反応させ、発色性基を遊離させる工程、及びｂ）遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなる。
【選択図】なし
【解決手段】分子量約４２キロダルトン及び分子量約２０キロダルトンのアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにその基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬である。
また、試料中のカルシウムを測定する方法であって、ａ）該試料と前記のホスホリパーゼＤ、並びに前記の化合物を混合し反応させ、発色性基を遊離させる工程、及びｂ）遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなる。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、試料中のカルシウムを測定するためのカルシウム測定試薬及び測定方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
カルシウムは、人体内に約１，２００ｇ存在しており、その約９９％が骨と歯に存在し、残りの約１％が血液などの体液や筋肉などに存在している。この１％のカルシウムが、出血を止めたり、神経の働きや筋肉運動など、生命の維持や活動に重要な役割を果たしている。血液中のカルシウム濃度は、カルシウムの吸収異常、骨疾患、内分泌疾患、高血圧、又は動脈硬化症等により変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。
【０００３】
現在、カルシウムの測定方法として使用されている方法としては、原子吸光法、電極法、ο−クレゾールフタレイン・コンプレクソン法（以下、ＯＣＰＣ法と略すこともある）がある。これらの方法は、高価な機器を必要としたり、試料の前処理を必要とする場合がある。特にＯＣＰＣ法ではマグネシウムイオンの影響を受けたり、温度や測定時間によって吸光度が変化するなどの欠点がある。
【０００４】
このため、最近では、カルシウムイオンによる酵素の活性化又は阻害を利用した測定方法として、カルシウムイオンによるピルビン酸キナーゼ活性の阻害を利用した測定（例えば、特許文献１参照。）、カルシウムイオンによるα−アミラーゼの活性化を利用した測定（例えば、特許文献２参照。）又はカルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定（例えば、特許文献３及び４参照。）等が提案されている。
また、ホスホリパーゼＤのカルシウムイオンによる活性化を利用したものは特異性に優れ、測定感度も高いものであるため、広く利用されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平２−１４２４９８号公報
【０００６】
【特許文献２】
特開平２−２７６５９７号公報
【０００７】
【特許文献３】
特開昭６２−１９５２９７号公報
【０００８】
【特許文献４】
特開平４−１８７０９８号公報
【０００９】
ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）は、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素である。
また、このホスホリパーゼＤとしては、植物組織由来、動物組織由来、又はストレプトマイセス属等の微生物由来のものなどがあり、各種アイソザイムの報告も行われている。
例えば、ストレプトマイセス族微生物由来のホスホリパーゼＤには、分子量が約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ５７ということもある。）、分子量が約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ４２ということもある。）、分子量が約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ２０ということもある。）が存在することが知られている。また、ＰＬＤ４２とＰＬＤ２０は主に複合体（以下、ＰＬＤ４２／２０ということもある。）として存在していることが知られている。なお、ＰＬＤ２０には、ホスホリパーゼＤ活性がないことも知られている。
更に、ＰＬＤ４２とＰＬＤ２０はＰＬＤ５７の構成成分であり、ＰＬＤ４２／２０はホスホリパーゼＤの精製過程でＰＬＤ５７から分離されてくる可能性のあることが示唆されている。（例えば、非特許文献１参照。）
【００１０】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１４３０巻、２３４〜２４４頁、１９９９年
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の課題は、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、ＰＬＤ５７に比べてＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が高いホスホリパーゼＤを使用した、試料中のカルシウム濃度を正確に測定することのできる、試料中のカルシウム測定試薬及び試料中のカルシウム測定方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤ及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質としての下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を使用し、これにより試料中のカルシウムを正確に測定できることを見出した。
更に、測定系に金属イオン、又はキレート剤を共存させることによって試料中のカルシウム濃度の測定範囲を拡大できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
【化３】
【００１４】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） 分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬。
【００１５】
【化４】
【００１６】
（２） ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、前記（１）記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００１７】
（３） ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことを特徴とする、前記（１）又は前記（２）記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００１８】
（４） コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを含むことを特徴とする、前記（１）〜前記（３）のいずれかに記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００１９】
（５） 試料中のカルシウムを測定する方法であって、
ａ） 該試料と、分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
【化５】
ｂ） この遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなる試料中のカルシウム測定方法。
【００２０】
（６） ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、前記（５）記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００２１】
（７） 前記工程ａ）において、ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることを特徴とする、前記（５）又は前記（６）記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００２２】
（８） 前記工程ａ）において、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを共存させることを特徴とする、前記（５）〜前記（７）のいずれかに記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００２３】
【発明の実施の形態】
（１） 分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ
本発明においては、分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（ＰＬＤ４２）及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（ＰＬＤ２０）の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤを使用する。
ここで、ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）とは、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸及び塩基を遊離させる酵素である。
【００２４】
本発明におけるホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマイセス属微生物から調製されたものを使用することが好ましい。なお、このストレプトマイセス属微生物から調製されたホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマイセス属微生物の遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良したストレプトマイセス属微生物から調製したホスホリパーゼＤ等も含まれる。
【００２５】
本発明で使用するホスホリパーゼＤは、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のものである。例えば、本発明で使用する、ホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の存在比率が５０％以上であればよい。この存在比率としては、例えば、モル濃度比、蛋白濃度比等を挙げることができる。また、ホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の存在比率が５０％以上とは、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の総量が５０％以上であってもよいし、ＰＬＤ４２／２０の存在比率が５０％以上であってもよい。
なお、本発明で使用するホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の活性比率が５０％以上であってもよい。ただし、この場合、ＰＬＤ２０にはホスホリパーゼＤ活性がないことが分かっているので、使用するホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ４２の活性比率を５０％以上とする。なお、ホスホリパーゼＤにおいて、ＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、ＰＬＤ２０及び／又はＰＬＤ４２／２０が混在しているときに、ＰＬＤ４２の活性を増加させたり及び／又はＰＬＤ５７の活性を低下させるような条件を設定することにより、ＰＬＤ４２の活性比率を５０％以上となるようにしてもよい。
【００２６】
このＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上であるホスホリパーゼＤを、試料及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値は、０．０１〜５単位／ｍＬであり、０．０１〜２単位／ｍＬの範囲にあることが好ましく、０．０１〜０．５単位／ｍＬの範囲が特に好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上であるホスホリパーゼＤの活性値は、試料及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値が０．０１〜５単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．０１〜２単位／ｍＬとなるように、特に好ましくは０．０１〜０．５単位／ｍＬとなるように設定すればよい。
例えば、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上であるホスホリパーゼＤを、０．０１〜５単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．０１〜２単位／ｍＬとなるように、特に好ましくは０．０１〜０．５単位／ｍＬとなるように含有させればよい。
【００２７】
（２） ホスホリパーゼＤの基質
本発明においては、下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を、ホスホリパーゼＤの基質として使用する。
【００２８】
【化６】
【００２９】
前記の一般式（Ｉ）で表される化合物において、発色性基としては、リン酸基にエステル結合した状態と、加水分解によりリン酸基より遊離した状態での吸光度又は透過率等のシグナルに差がある発色性基であればどのようなものでもよい。
【００３０】
なお、この発色性基としては、リン酸基にエステル結合した状態と、リン酸基から遊離した状態での吸光度又は透過率等のシグナルの差が大きいものが好ましい。
【００３１】
そして、発色性基Ｘ１と発色性基Ｘ２とは、それぞれ同じものであってもよく、あるいは異なるものであってもよい。
この発色性基Ｘ１と発色性基Ｘ２が異なるものである場合には、各々の測定波長域、すなわち極大吸収波長が同一であるか又は近傍にあるものであることが好ましい。
【００３２】
前記の一般式（Ｉ）で表される化合物における発色性基としては、例えば、４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−アセチルフェニル基、又はアセチルフェニル基等を挙げることができる。
【００３３】
また、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物において、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基等を挙げることができる。
更に、置換アルキル基及び置換フェニル基の置換基としては、同一又は異なる、置換数１〜３の、例えば、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アミノ基、又はハロゲン基等を挙げることができる。
【００３４】
また、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｘ２が発色性基でない場合の化合物としては、例えば、４−ニトロフェニルリン酸〔以下、４−ＮＰＰということもある〕、４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、４−ＮＰＰＰということもある〕、２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸〔以下、４−ＣＮＰＰということもある〕、２−クロロ−４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、４−ＣＮＰＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＮＰＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−アセチルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−アセチルフェニルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＡＰＰＰということもある〕、アセチルフェニルリン酸〔以下、ＡＰＰということもある〕、若しくはアセチルフェニルフェニルリン酸〔以下、ＡＰＰＰということもある〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００３５】
更に、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｘ２が発色性基である場合の化合物としては、例えば、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−４−ＮＰＰということもある〕、ビス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−４−ＣＮＰＰということもある〕、ビス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、ビス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、若しくはビスアセチルフェニルリン酸〔Ｂｉｓ−ＡＰＰ〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００３６】
本発明における前記の一般式（Ｉ）で表される化合物としては、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸、若しくはビスアセチルフェニルリン酸、又はこれらの塩等のＸ２が発色性基であるものが好ましい。
それは、カルシウムにより活性化されるホスホリパーゼＤの触媒作用によりリン酸基から遊離する発色性基が、Ｘ２が発色性基でない場合にはＸ１だけであるのに対し、Ｘ２も発色性基である場合にはＸ１とＸ２の両方であって得られるシグナルが２倍となり、これにより高感度に測定を行うことが可能となるからである。
【００３７】
なお、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を、試料及びＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度は、０．０１〜５０ｍＭであり、０．０１〜２０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．０１〜１０ｍＭの範囲が特に好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の一般式（Ｉ）で表される化合物の濃度は、試料、並びにＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度が０．０１〜５０ｍＭとなるように、好ましくは０．０１〜２０ｍＭとなるように、特に好ましくは０．０１〜１０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を、０．０１〜５０ｍＭとなるように、好ましくは０．０１〜２０ｍＭとなるように、特に好ましくは０．０１〜１０ｍＭとなるように含有させればよい。
なお、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の一般式（Ｉ）で表される化合物として、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸を使用する場合は、試料、並びにＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度を、０．０１〜１０ｍＭとなるように設定することが好ましく、０．０１〜５ｍＭとなるように設定することがより好ましく、更に０．０１〜０．５ｍＭとなるように設定することが特に好ましい。
例えば、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸を、好ましくは０．０１〜１０ｍＭとなるように、より好ましくは０．０１〜５ｍＭとなるように、特に好ましくは０．０１〜０．５ｍＭとなるように含有させればよい。
【００３８】
なお、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物は、市販品として容易に入手することができるが、当業者に周知の合成方法を適宜組み合わせることにより、容易に製造することもできる。
【００３９】
（３） ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことが好ましい。
そして、見掛けのＫｍ値を０．１〜３ｍＭに調節する物質を含むことがより好ましい。
【００４０】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることが好ましい。
そして、見掛けのＫｍ値を０．１〜３ｍＭに調節する物質を共存させることがより好ましい。
【００４１】
このＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質を測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００４２】
このＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質としては、例えば、金属イオン等を挙げることができる。
ここで、金属イオンとしては、例えば、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオン等を挙げることができる。
これらの金属イオンは１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００４３】
なお、この金属イオンを、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．００５〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましい。
例えば、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭの範囲にあることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００４４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の金属イオンの濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．００５〜５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記の金属イオンを、０．００５〜５０ｍＭとなるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
例としては、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭとなるようにすることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭとなるようにすることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭとなるようにすることが好ましい。
【００４５】
また、本発明においては、前記のＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質として、キレート剤を使用することもできる。
【００４６】
ここで、キレート剤としては、例えば、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、若しくはリンゴ酸などのカルボン酸又はその塩等を挙げることができる。
これらのキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００４７】
なお、このキレート剤を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．１〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００４８】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記のキレート剤の濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記のキレート剤を、０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
なお、本発明においては、前記の金属イオンとキレート剤を同時に用いてもよい。
【００４９】
（４） コバルトイオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを含むことが好ましい。
【００５０】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを共存させることが好ましい。
【００５１】
このコバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００５２】
これらは１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００５３】
なお、これらの金属イオンを、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭの範囲にあることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００５４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の金属イオンの濃度は、試料、ＰＬＤ４２並びにＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が各々前記の濃度となるように設定すればよい。
例えば、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭとなるように含有させればよく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭとなるように含有させればよく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭとなるように含有させればよい。
【００５５】
（５） キレート剤
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、キレート剤を含むことが好ましい。
【００５６】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ＰＬＤ４２並びにＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、キレート剤を共存させることが好ましい。
【００５７】
このキレート剤を測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００５８】
ここで、キレート剤としては、例えば、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、若しくはリンゴ酸などのカルボン酸又はその塩等を挙げることができる。
【００５９】
これらのキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００６０】
なお、このキレート剤を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．１〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００６１】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるこのキレート剤の濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、このキレート剤を、０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
【００６２】
（６） 試料中のカルシウム測定時のｐＨ
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際のｐＨとして、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０を挙げることができる。
【００６３】
ところで、試料が体液等の場合、この試料中にホスフォジエステラーゼが混在する可能性があり、そうすると例え試料中にカルシウムが存在しなくともこのホスフォジエステラーゼが前記の一般式（Ｉ）で表される化合物より発色性基を遊離させ、シグナルを生じさせ、測定値に正の誤差を与えてしまうことになる。
そして、このホスフォジエステラーゼの酵素活性の至適ｐＨ域は、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０である。
【００６４】
よって、このホスフォジエステラーゼによる誤差のことを考えると、前記の混合し反応させる際のｐＨとしては、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．０が好ましく、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が特に好ましい。
【００６５】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬のｐＨとしては、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際のｐＨがｐＨ５．０〜ｐＨ９．０、好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ８．０、特に好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５となるように設定すればよい。
【００６６】
なお、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝液としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することができる。
このような緩衝液としては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ等の各緩衝液を挙げることができる。
【００６７】
（７） 非イオン性界面活性剤
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、反応のタイムコースを安定化するため、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、非イオン性界面活性剤を共存させることが好ましい。
また、同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、非イオン性界面活性剤を含ませることが好ましい。
【００６８】
このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。
【００６９】
（ｂ） グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。
【００７０】
（ｃ） ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。
【００７１】
（ｄ） 脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。
【００７２】
なお、この非イオン性界面活性剤としては、例えば、トライトンＸ−１００（和光純薬工業社）又はＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）等が好ましい。
【００７３】
そして、この非イオン性界面活性剤を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．０００１〜１％の範囲にあることが好ましく、０．００１〜０．５％の範囲にあることが特に好ましい。
【００７４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の非イオン性界面活性剤の濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるように設定すればよい。
例えば、前記の非イオン性界面活性剤を、０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
【００７５】
（８） 陰イオン性界面活性剤
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、ホスフォジエステラーゼ活性を阻害するため、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、陰イオン性界面活性剤を共存させることが好ましい。
また、同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、陰イオン性界面活性剤を含ませることが好ましい。
【００７６】
このような陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） 脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、Ｎ−アシロイル−β−アラニン塩、若しくはＮ−アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。
【００７７】
（ｂ） ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ−メチル−Ｎ−オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ−アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。
【００７８】
（ｃ） 硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。
【００７９】
（ｄ） アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。
【００８０】
（ｅ） スチレン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。
【００８１】
（ｆ） ナフタレンスルホン酸塩−ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。
【００８２】
この陰イオン性界面活性剤を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．０００１〜１％の範囲にあることが好ましく、０．００１〜０．５％の範囲にあることが特に好ましい。
【００８３】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の陰イオン性界面活性剤の濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるように設定すればよい。
例えば、前記の陰イオン性界面活性剤を、０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
【００８４】
（９） 測定試薬等の構成成分
本発明の試料中のカルシウム測定試薬又はカルシウム測定方法においては、前記の成分の他に、公知の防腐剤等を必要に応じて適宜含ませ又は共存させることができる。
【００８５】
（１０） 試薬等の構成
本発明の試料中のカルシウム測定方法及びカルシウム測定試薬は、１ステップ法（１試薬系）で実施、構成することもできるが、測定試薬を長期間保存して用いる場合には２ステップ法（２試薬系）等の多ステップ法（多試薬系）で実施、構成することが測定試薬の安定性の面からより好ましい。
【００８６】
なお、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物とは、別々の測定試薬に含有させておくことが好ましい。
それは、共存させた場合、微量でもカルシウムが混入することにより、長期保存されるうちに、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物がホスホリパーゼＤにより分解されてしまうからである。
【００８７】
（１１） リン酸モノエステル化合物に作用する酵素
本発明の試料中のカルシウム測定方法において、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２が発色基である場合、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、リン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を共存させることが好ましい。
【００８８】
それは、試料中にカルシウムが存在する場合、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ１（発色性基）及びＸ２（発色性基）を加水分解して遊離させるのであるが、反応時の条件によっては、一つ目の発色性基の加水分解から二つ目の発色性基の加水分解までに時間が掛かることがある。
【００８９】
このときにリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素が共存していると、一つ目の発色性基の加水分解により生成したリン酸モノエステル化合物にリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素が作用して、二つ目の発色性基を短時間のうちに加水分解することができるからである。
【００９０】
なお、この酵素はリン酸ジエステル化合物には作用しないので、試料中にカルシウムが存在せず、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが前記の一般式（Ｉ）で表される化合物に作用しない（加水分解しない）場合には、この酵素も発色性基を加水分解することはないので、測定値に正の誤差を生じさせることはない。
【００９１】
同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２が発色基である場合、リン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を含ませることが好ましい。
【００９２】
このリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素としては、例えば、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）又は酸性ホスファターゼ（ＡＣＰ）等を挙げることができる。
【００９３】
このリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値は、０．０１〜１０単位／ｍＬの範囲にあることが好ましく、０．１〜５単位／ｍＬの範囲が特に好ましい。
【００９４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素の活性値は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際に０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５単位／ｍＬとなるように設定すればよい。
例えば、このリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を、０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５単位／ｍＬとなるように含有させればよい。
【００９５】
（１２） 試料中のカルシウム測定の一例
本発明の試料中のカルシウム測定方法は、
ａ） 試料と、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質としての前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
ｂ） この遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなるものである。
【００９６】
なお、本発明の試料中のカルシウム測定方法は、コリンオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又は酸性ホスファターゼ等の共役酵素を介在させなくとも測定が行えるという点で特徴的である。
【００９７】
本発明の試料中のカルシウム測定方法及び測定試薬を用いて試料中のカルシウムを測定する場合の一例をより具体的に説明すると、例えば、試料中に含まれるカルシウムとＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤとが接触すると、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤがこのカルシウムによって活性化される。
【００９８】
このカルシウムによって活性化されたＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と接触すると、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤは、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ１及びＸ２を加水分解して遊離させる。
【００９９】
すなわち、４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−アセチルフェニル基、又はアシルフェニル基等の発色性基が遊離される。
【０１００】
ここで遊離した４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジクロロ−アセチルフェノール、又はアシルフェノール等が吸収を示す任意の波長において、分光光度計を用いて吸光度などを測定すること等により、遊離した発色性基の量を求め、これよりＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤの活性値を求め、更には試料中のカルシウム濃度の算出を行うことができる。
【０１０１】
本発明の測定原理を、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合を例として示すと下記のようになる。
【０１０２】
【化７】
【０１０３】
本発明において前記の一般式（Ｉ）で表される化合物として基質としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合は、試料中のカルシウムイオンによって活性化されたＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸のリン酸基と２つの４−ニトロフェニル基との間のエステル結合をそれぞれ加水分解して、２分子の４−ニトロフェノールを遊離させる。
【０１０４】
この遊離した４−ニトロフェノールの吸光度を測定波長４０５ｎｍ等において分光光度計等を用いて測定することによって、試料中のカルシウム濃度を測定することが可能となる。
【０１０５】
（１４） 試料
本発明において、試料とは、試料中のカルシウム濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出液；食品又はこれの抽出液；農林水産物又はこれの抽出物；飲料水；飲料；環境試料（土壌、海水、河川水、湖沼水、地下水など）；あるいは薬剤等が挙げられる。
【０１０６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。
【０１０７】
〔実施例１〕
（ホスホリパーゼＤの各製品ロットの分析）
ホスホリパーゼＤの各製品ロットの蛋白質の存在パターンをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確かめた。
【０１０８】
（１） 市販ホスホリパーゼＤの各製品ロット〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来；製品ロットＡ、及び製品ロットＢ〕、並びに蛋白質分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ；バイオラッド社）の各々を試料とし、還元条件下で、１２．５％ポリアクリルアミドゲル〔フナコシ イージーゲル（ＩＩ）；フナコシ社）〕を支持体とし、０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−２００ｍＭグリシン緩衝液を泳動緩衝液として使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年参照）を行った。
【０１０９】
（２） ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示した。なお、この図において、ゲルのレーンの左端は、蛋白質分子量マーカーの蛋白質のパターンを示している。また、それ以外のレーンは、ホスホリパーゼＤの各製品ロットの蛋白質のパターンを示している。
【０１１０】
図１に示すように、このＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動結果においては、主にそれぞれ分子量約５７キロダルトンの蛋白質、約４２キロダルトンの蛋白質、及び約２０キロダルトンの蛋白質のバンドが観察された。すなわち、これらのバンドは、ホスホリパーゼＤのアイソザイムとして知られているＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、及びＰＬＤ２０であることが分かる。
【０１１１】
（３） 次に、このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果をＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ画像解析ソフト（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて画像解析し、各レーンのＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、及びＰＬＤ２０のバンドの「発色強度×面積」を各々測定し、ホスホリパーゼ全体の中での比率をそれぞれ求めた。この結果を表１に示した。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
各ホスホリパーゼＤアイソザイムの比率は、製品ロットＡでは、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝２７％：５３％：２０％であり、製品ロットＢでは、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝４２％：４４％：１４％であった。
【０１１４】
なお、前述したようにＰＬＤ４２とＰＬＤ２０は、通常、複合体（ＰＬＤ４２／２０）として存在しているが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う過程でＰＬＤ４２とＰＬＤ２０に分離されたものと推察される。
【０１１５】
〔実施例２〕
（市販ホスホリパーゼＤの各製品ロットにおけるカルシウム測定時の直線性の検討）
市販ホスホリパーゼＤを用いたカルシウム測定試薬において、ホスホリパーゼＤの各製品ロットによるカルシウム測定を行う際の直線性の検討を行った。
【０１１６】
（１） 試薬の調製
▲１▼ 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、ホスホリパーゼＤ濃度が異なる８種類の本発明・第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ ６０ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〔非イオン性界面活性剤〕 ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕 ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕
０．１単位／ｍＬ、０．２５単位／ｍＬ、０．５単位／ｍＬ、
０．７５単位／ｍＬ、１単位／ｍＬ、２単位／ｍＬ、３単位／ｍＬ、
又は４単位／ｍＬ
・製品ロットＡ、
又は
・製品ロットＢ
【０１１７】
▲２▼ 第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、第２試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ ６０ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〔非イオン性界面活性剤〕 ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕 ０．０５％
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社） ０．７５ｍＭ
クエン酸 １８ｍＭ
【０１１８】
（２） 試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、下記の濃度のカルシウムを含む試料をそれぞれ調製した。
【０１１９】
▲１▼ ２０．０ｍｇ／ｄＬ
▲２▼ １５．０ｍｇ／ｄＬ
▲３▼ １０．０ｍｇ／ｄＬ
▲４▼ ５．０ｍｇ／ｄＬ
▲５▼ ２．５ｍｇ／ｄＬ
【０１２０】
また、純水を、カルシウムを含まない試料すなわち「▲６▼カルシウム濃度０ｍｇ／ｄＬの試料」とした。
以上６種類の試料を調製した。
【０１２１】
（３） 試料中のカルシウム濃度の測定
日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて試料中のカルシウム濃度の測定を行った。
【０１２２】
▲１▼ 前記（２）で調製した６種類の試料をそれぞれ試料とし、この６μＬに前記（１）の▲１▼で調製した８種類の第１試薬の一つを１２０μＬ添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
【０１２３】
▲２▼ その後、これに前記（１）の▲２▼で調製した第２試薬の１２０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０１２４】
▲３▼ そして、主波長４０５ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を、第２試薬添加後１分５５秒目（２３ポイント目）から５分８秒目（３４ポイント目）まで測定した。
【０１２５】
▲４▼ 前記▲３▼において測定した吸光度より、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を算出した。
なお、試料▲６▼（０ｍｇ／ｄＬ）の吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を試薬盲検値として差し引いた。
【０１２６】
▲５▼ 以上の操作を８種類の第１試薬について行った。
【０１２７】
（４） 測定結果
ホスホリパーゼＤの製品ロットＡを使用した場合の測定結果を図２に、製品ロットＢを使用した場合の測定結果を図３に示した。
【０１２８】
なお、これらの図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１２９】
この図２及び図３から明らかなように、ホスホリパーゼＤの製品ロットＡ（ＰＬＤ４２比率５３％、及びＰＬＤ２０比率２０％））を使用し、基質濃度を固定して（変化させずに）、ホスホリパーゼＤの濃度を低濃度から高濃度まで変化させて測定を行った場合には、それぞれ試料中のカルシウム濃度の増加に伴って各吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値が高濃度域まで直線的に増加していることが分かる。また、これはホスホリパーゼＤの製品ロットＢ（ＰＬＤ５７比率４４％、ＰＬＤ２０比率１４％）を使用した場合も同様であった。
【０１３０】
この結果から、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤを用いてカルシウムの測定を行う場合には、基質の濃度及びホスホリパーゼＤの濃度を低めに設定することにより、試料中のカルシウム濃度と測定により得られる吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値との関係が直線的となり、これにより直線的な検量線が得られ、そして低濃度域から高濃度域までカルシウム濃度測定値がほぼ直線上に位置するようになることが分かる。
従って、低濃度域から高濃度域まで試料中のカルシウム濃度を精度よくかつ正確に測定できるようになる。
特に、第１試薬中のホスホリパーゼＤの濃度が１単位／ｍＬ以下の場合に、試料中のカルシウムの測定において極めて良好な直線性が得られることが確認された。
【０１３１】
〔実施例３〕
（市販ホスホリパーゼＤの各製品ロットにおけるカルシウム測定時の直線性の検討）
市販ホスホリパーゼＤを用いたカルシウム測定試薬において、ホスホリパーゼＤの各製品ロットによるカルシウム測定を行う際の直線性の検討を行った。
【０１３２】
（１） 試薬の調製
▲１▼ 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ ６０ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〔非イオン性界面活性剤〕 ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕 ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕 ０．７５単位／ｍＬ
・製品ロットＡ、
又は
・製品ロットＢ
【０１３３】
▲２▼ 第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、基質濃度が異なる８種類の第２試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ ６０ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〔非イオン性界面活性剤〕 ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕 ０．０５％
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社） ０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭ
クエン酸 １８ｍＭ
【０１３４】
（２） 試料の調製
実施例２の（２）で調製した試料をそのまま使用した。
【０１３５】
（３） 試料中のカルシウム濃度の測定
前記（２）の各試料中のカルシウム濃度を、前記（１）で調製した第１試薬及び第２試薬を用いて、前記実施例２の（３）の▲１▼〜▲４▼の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。この操作を８種類の第２試薬について行った。
【０１３６】
（４） 測定結果
ホスホリパーゼＤの製品ロットＡを使用した場合の測定結果を図４に、製品ロットＢを使用した場合の測定結果を図５に示した。
【０１３７】
なお、これらの図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１３８】
この図４及び図５から明らかなように、ホスホリパーゼＤの製品ロットＡ（ＰＬＤ４２比率５３％、及びＰＬＤ２０比率２０％）を使用し、ホスホリパーゼＤの濃度を固定して（変化させずに）、基質の濃度を低濃度から高濃度まで変化させて測定を行った場合には、それぞれ試料中のカルシウム濃度の増加に伴って各吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値が高濃度域まで直線的に増加していることが分かる。また、これはホスホリパーゼＤの製品ロットＢ（ＰＬＤ５７比率４４％、ＰＬＤ２０比率１４％）を使用した場合も同様であった。
【０１３９】
この結果から、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤを用いてカルシウムの測定を行う場合には、ホスホリパーゼＤの濃度及び基質の濃度を低めに設定することにより、試料中のカルシウム濃度と測定により得られる吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値との関係が直線的となり、これにより直線的な検量線が得られ、そして低濃度域から高濃度域までカルシウム濃度測定値がほぼ直線上に位置するようになることが分かる。
従って、低濃度域から高濃度域まで試料中のカルシウム濃度を精度よくかつ正確に測定できるようになる。
特に、第２試薬中の基質の濃度が１ｍＭ以下の場合に、試料中のカルシウムの測定において極めて良好な直線性が得られることが確認された。
【０１４０】
【発明の効果】
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法では、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、分子量約４２キロダルトン及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質として前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を使用した場合に、低濃度域から高濃度域までカルシウム濃度測定値が、ほぼ直線上に位置するようになるので、試料中のカルシウム濃度を低濃度域から高濃度域まで精度よくかつ正確に測定できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】市販ホスホリパーゼＤのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示した写真である。
【図２】市販ホスホリパーゼＤを用いて、試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図３】市販ホスホリパーゼＤを用いて、試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図４】市販ホスホリパーゼＤを用いて、試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図５】市販ホスホリパーゼＤを用いて、試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【産業上の利用分野】
本発明は、試料中のカルシウムを測定するためのカルシウム測定試薬及び測定方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
カルシウムは、人体内に約１，２００ｇ存在しており、その約９９％が骨と歯に存在し、残りの約１％が血液などの体液や筋肉などに存在している。この１％のカルシウムが、出血を止めたり、神経の働きや筋肉運動など、生命の維持や活動に重要な役割を果たしている。血液中のカルシウム濃度は、カルシウムの吸収異常、骨疾患、内分泌疾患、高血圧、又は動脈硬化症等により変動し、その測定は臨床上極めて重要とされている。
【０００３】
現在、カルシウムの測定方法として使用されている方法としては、原子吸光法、電極法、ο−クレゾールフタレイン・コンプレクソン法（以下、ＯＣＰＣ法と略すこともある）がある。これらの方法は、高価な機器を必要としたり、試料の前処理を必要とする場合がある。特にＯＣＰＣ法ではマグネシウムイオンの影響を受けたり、温度や測定時間によって吸光度が変化するなどの欠点がある。
【０００４】
このため、最近では、カルシウムイオンによる酵素の活性化又は阻害を利用した測定方法として、カルシウムイオンによるピルビン酸キナーゼ活性の阻害を利用した測定（例えば、特許文献１参照。）、カルシウムイオンによるα−アミラーゼの活性化を利用した測定（例えば、特許文献２参照。）又はカルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定（例えば、特許文献３及び４参照。）等が提案されている。
また、ホスホリパーゼＤのカルシウムイオンによる活性化を利用したものは特異性に優れ、測定感度も高いものであるため、広く利用されている。
【０００５】
【特許文献１】
特開平２−１４２４９８号公報
【０００６】
【特許文献２】
特開平２−２７６５９７号公報
【０００７】
【特許文献３】
特開昭６２−１９５２９７号公報
【０００８】
【特許文献４】
特開平４−１８７０９８号公報
【０００９】
ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）は、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸および塩基を遊離させる酵素である。
また、このホスホリパーゼＤとしては、植物組織由来、動物組織由来、又はストレプトマイセス属等の微生物由来のものなどがあり、各種アイソザイムの報告も行われている。
例えば、ストレプトマイセス族微生物由来のホスホリパーゼＤには、分子量が約５７キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ５７ということもある。）、分子量が約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ４２ということもある。）、分子量が約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（以下、ＰＬＤ２０ということもある。）が存在することが知られている。また、ＰＬＤ４２とＰＬＤ２０は主に複合体（以下、ＰＬＤ４２／２０ということもある。）として存在していることが知られている。なお、ＰＬＤ２０には、ホスホリパーゼＤ活性がないことも知られている。
更に、ＰＬＤ４２とＰＬＤ２０はＰＬＤ５７の構成成分であり、ＰＬＤ４２／２０はホスホリパーゼＤの精製過程でＰＬＤ５７から分離されてくる可能性のあることが示唆されている。（例えば、非特許文献１参照。）
【００１０】
【非特許文献１】
Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ、１４３０巻、２３４〜２４４頁、１９９９年
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の課題は、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、ＰＬＤ５７に比べてＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が高いホスホリパーゼＤを使用した、試料中のカルシウム濃度を正確に測定することのできる、試料中のカルシウム測定試薬及び試料中のカルシウム測定方法を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記の課題の解決を目指して鋭意検討を行った結果、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤ及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質としての下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を使用し、これにより試料中のカルシウムを正確に測定できることを見出した。
更に、測定系に金属イオン、又はキレート剤を共存させることによって試料中のカルシウム濃度の測定範囲を拡大できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
【化３】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） 分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬。
【００１５】
【化４】
（２） ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、前記（１）記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００１７】
（３） ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことを特徴とする、前記（１）又は前記（２）記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００１８】
（４） コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを含むことを特徴とする、前記（１）〜前記（３）のいずれかに記載の試料中のカルシウム測定試薬。
【００１９】
（５） 試料中のカルシウムを測定する方法であって、
ａ） 該試料と、分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
【化５】
【００２０】
（６） ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、前記（５）記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００２１】
（７） 前記工程ａ）において、ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることを特徴とする、前記（５）又は前記（６）記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００２２】
（８） 前記工程ａ）において、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを共存させることを特徴とする、前記（５）〜前記（７）のいずれかに記載の試料中のカルシウム測定方法。
【００２３】
【発明の実施の形態】
（１） 分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ
本発明においては、分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（ＰＬＤ４２）及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム（ＰＬＤ２０）の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤを使用する。
ここで、ホスホリパーゼＤ（ＥＣ３．１．４．４）とは、グリセロリン脂質のホスファチジル基と塩基との間のエステル結合を加水分解してホスファチジン酸及び塩基を遊離させる酵素である。
【００２４】
本発明におけるホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマイセス属微生物から調製されたものを使用することが好ましい。なお、このストレプトマイセス属微生物から調製されたホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマイセス属微生物の遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良したストレプトマイセス属微生物から調製したホスホリパーゼＤ等も含まれる。
【００２５】
本発明で使用するホスホリパーゼＤは、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のものである。例えば、本発明で使用する、ホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の存在比率が５０％以上であればよい。この存在比率としては、例えば、モル濃度比、蛋白濃度比等を挙げることができる。また、ホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の存在比率が５０％以上とは、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の総量が５０％以上であってもよいし、ＰＬＤ４２／２０の存在比率が５０％以上であってもよい。
なお、本発明で使用するホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の活性比率が５０％以上であってもよい。ただし、この場合、ＰＬＤ２０にはホスホリパーゼＤ活性がないことが分かっているので、使用するホスホリパーゼＤにおけるＰＬＤ４２の活性比率を５０％以上とする。なお、ホスホリパーゼＤにおいて、ＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、ＰＬＤ２０及び／又はＰＬＤ４２／２０が混在しているときに、ＰＬＤ４２の活性を増加させたり及び／又はＰＬＤ５７の活性を低下させるような条件を設定することにより、ＰＬＤ４２の活性比率を５０％以上となるようにしてもよい。
【００２６】
このＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上であるホスホリパーゼＤを、試料及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値は、０．０１〜５単位／ｍＬであり、０．０１〜２単位／ｍＬの範囲にあることが好ましく、０．０１〜０．５単位／ｍＬの範囲が特に好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上であるホスホリパーゼＤの活性値は、試料及び前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値が０．０１〜５単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．０１〜２単位／ｍＬとなるように、特に好ましくは０．０１〜０．５単位／ｍＬとなるように設定すればよい。
例えば、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上であるホスホリパーゼＤを、０．０１〜５単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．０１〜２単位／ｍＬとなるように、特に好ましくは０．０１〜０．５単位／ｍＬとなるように含有させればよい。
【００２７】
（２） ホスホリパーゼＤの基質
本発明においては、下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を、ホスホリパーゼＤの基質として使用する。
【００２８】
【化６】
前記の一般式（Ｉ）で表される化合物において、発色性基としては、リン酸基にエステル結合した状態と、加水分解によりリン酸基より遊離した状態での吸光度又は透過率等のシグナルに差がある発色性基であればどのようなものでもよい。
【００３０】
なお、この発色性基としては、リン酸基にエステル結合した状態と、リン酸基から遊離した状態での吸光度又は透過率等のシグナルの差が大きいものが好ましい。
【００３１】
そして、発色性基Ｘ１と発色性基Ｘ２とは、それぞれ同じものであってもよく、あるいは異なるものであってもよい。
この発色性基Ｘ１と発色性基Ｘ２が異なるものである場合には、各々の測定波長域、すなわち極大吸収波長が同一であるか又は近傍にあるものであることが好ましい。
【００３２】
前記の一般式（Ｉ）で表される化合物における発色性基としては、例えば、４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−アセチルフェニル基、又はアセチルフェニル基等を挙げることができる。
【００３３】
また、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物において、アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、又はイソプロピル基等を挙げることができる。
更に、置換アルキル基及び置換フェニル基の置換基としては、同一又は異なる、置換数１〜３の、例えば、ヒドロキシ基、低級アルコキシ基、アミノ基、又はハロゲン基等を挙げることができる。
【００３４】
また、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｘ２が発色性基でない場合の化合物としては、例えば、４−ニトロフェニルリン酸〔以下、４−ＮＰＰということもある〕、４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、４−ＮＰＰＰということもある〕、２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸〔以下、４−ＣＮＰＰということもある〕、２−クロロ−４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、４−ＣＮＰＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＮＰＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−アセチルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、２，６−ジクロロ−アセチルフェニルフェニルリン酸〔以下、２，６−ＤＣＡＰＰＰということもある〕、アセチルフェニルリン酸〔以下、ＡＰＰということもある〕、若しくはアセチルフェニルフェニルリン酸〔以下、ＡＰＰＰということもある〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００３５】
更に、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のうち、Ｘ２が発色性基である場合の化合物としては、例えば、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−４−ＮＰＰということもある〕、ビス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−４−ＣＮＰＰということもある〕、ビス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−２，６−ＤＣＮＰＰということもある〕、ビス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸〔以下、Ｂｉｓ−２，６−ＤＣＡＰＰということもある〕、若しくはビスアセチルフェニルリン酸〔Ｂｉｓ−ＡＰＰ〕、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００３６】
本発明における前記の一般式（Ｉ）で表される化合物としては、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２−クロロ−４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル）リン酸、ビス（２，６−ジクロロ−アセチルフェニル）リン酸、若しくはビスアセチルフェニルリン酸、又はこれらの塩等のＸ２が発色性基であるものが好ましい。
それは、カルシウムにより活性化されるホスホリパーゼＤの触媒作用によりリン酸基から遊離する発色性基が、Ｘ２が発色性基でない場合にはＸ１だけであるのに対し、Ｘ２も発色性基である場合にはＸ１とＸ２の両方であって得られるシグナルが２倍となり、これにより高感度に測定を行うことが可能となるからである。
【００３７】
なお、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を、試料及びＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度は、０．０１〜５０ｍＭであり、０．０１〜２０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．０１〜１０ｍＭの範囲が特に好ましい。
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の一般式（Ｉ）で表される化合物の濃度は、試料、並びにＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度が０．０１〜５０ｍＭとなるように、好ましくは０．０１〜２０ｍＭとなるように、特に好ましくは０．０１〜１０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を、０．０１〜５０ｍＭとなるように、好ましくは０．０１〜２０ｍＭとなるように、特に好ましくは０．０１〜１０ｍＭとなるように含有させればよい。
なお、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の一般式（Ｉ）で表される化合物として、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸を使用する場合は、試料、並びにＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと混合し反応させる際の濃度を、０．０１〜１０ｍＭとなるように設定することが好ましく、０．０１〜５ｍＭとなるように設定することがより好ましく、更に０．０１〜０．５ｍＭとなるように設定することが特に好ましい。
例えば、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸を、好ましくは０．０１〜１０ｍＭとなるように、より好ましくは０．０１〜５ｍＭとなるように、特に好ましくは０．０１〜０．５ｍＭとなるように含有させればよい。
【００３８】
なお、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物は、市販品として容易に入手することができるが、当業者に周知の合成方法を適宜組み合わせることにより、容易に製造することもできる。
【００３９】
（３） ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことが好ましい。
そして、見掛けのＫｍ値を０．１〜３ｍＭに調節する物質を含むことがより好ましい。
【００４０】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることが好ましい。
そして、見掛けのＫｍ値を０．１〜３ｍＭに調節する物質を共存させることがより好ましい。
【００４１】
このＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質を測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００４２】
このＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質としては、例えば、金属イオン等を挙げることができる。
ここで、金属イオンとしては、例えば、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオン等を挙げることができる。
これらの金属イオンは１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００４３】
なお、この金属イオンを、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．００５〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましい。
例えば、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭの範囲にあることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００４４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の金属イオンの濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．００５〜５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記の金属イオンを、０．００５〜５０ｍＭとなるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
例としては、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭとなるようにすることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭとなるようにすることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭとなるようにすることが好ましい。
【００４５】
また、本発明においては、前記のＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭ（より好ましくは０．１〜３ｍＭ）に調節する物質として、キレート剤を使用することもできる。
【００４６】
ここで、キレート剤としては、例えば、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、若しくはリンゴ酸などのカルボン酸又はその塩等を挙げることができる。
これらのキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００４７】
なお、このキレート剤を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．１〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００４８】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記のキレート剤の濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、前記のキレート剤を、０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
なお、本発明においては、前記の金属イオンとキレート剤を同時に用いてもよい。
【００４９】
（４） コバルトイオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを含むことが好ましい。
【００５０】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを共存させることが好ましい。
【００５１】
このコバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００５２】
これらは１種類のものだけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００５３】
なお、これらの金属イオンを、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭの範囲にあることが好ましく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭの範囲にあることが好ましい。
【００５４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の金属イオンの濃度は、試料、ＰＬＤ４２並びにＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が各々前記の濃度となるように設定すればよい。
例えば、コバルトイオンにおいては、０．１〜５０ｍＭとなるように含有させればよく、ニッケルイオンにおいては、０．０５〜２５ｍＭとなるように含有させればよく、そして、亜鉛イオンにおいては、０．００５〜２．５ｍＭとなるように含有させればよい。
【００５５】
（５） キレート剤
本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、キレート剤を含むことが好ましい。
【００５６】
また、本発明の試料中のカルシウム測定方法では、試料と、ＰＬＤ４２並びにＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程において、キレート剤を共存させることが好ましい。
【００５７】
このキレート剤を測定試薬に含ませ、又は共存させて測定を行うことにより、試料中のカルシウム測定の直線性を高濃度域まで伸ばすことが可能となる。
【００５８】
ここで、キレート剤としては、例えば、クエン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、フマル酸、コハク酸、若しくはリンゴ酸などのカルボン酸又はその塩等を挙げることができる。
【００５９】
これらのキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００６０】
なお、このキレート剤を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．１〜２００ｍＭの範囲にあることが好ましく、５〜１５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００６１】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるこのキレート剤の濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
例えば、このキレート剤を、０．１〜２００ｍＭとなるように、特に５〜１５０ｍＭとなるように設定すればよい。
【００６２】
（６） 試料中のカルシウム測定時のｐＨ
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際のｐＨとして、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０を挙げることができる。
【００６３】
ところで、試料が体液等の場合、この試料中にホスフォジエステラーゼが混在する可能性があり、そうすると例え試料中にカルシウムが存在しなくともこのホスフォジエステラーゼが前記の一般式（Ｉ）で表される化合物より発色性基を遊離させ、シグナルを生じさせ、測定値に正の誤差を与えてしまうことになる。
そして、このホスフォジエステラーゼの酵素活性の至適ｐＨ域は、ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０である。
【００６４】
よって、このホスフォジエステラーゼによる誤差のことを考えると、前記の混合し反応させる際のｐＨとしては、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．０が好ましく、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が特に好ましい。
【００６５】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬のｐＨとしては、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際のｐＨがｐＨ５．０〜ｐＨ９．０、好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ８．０、特に好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ７．５となるように設定すればよい。
【００６６】
なお、前記のｐＨ範囲となるように使用する緩衝液としては、前記のｐＨ範囲に緩衝能がある従来公知の緩衝液を適宜使用することができる。
このような緩衝液としては、例えば、リン酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ等の各緩衝液を挙げることができる。
【００６７】
（７） 非イオン性界面活性剤
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、反応のタイムコースを安定化するため、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、非イオン性界面活性剤を共存させることが好ましい。
また、同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、非イオン性界面活性剤を含ませることが好ましい。
【００６８】
このような非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシプロピレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリスチリルフェニルエーテル、又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレンエーテル化合物。
【００６９】
（ｂ） グリセリン脂肪酸部分エステル、ソルビタン脂肪酸部分エステル、ペンタエリスリトール脂肪酸部分エステル、プロピレングリコールモノ脂肪酸エステル、又はショ糖脂肪酸部分エステルなどの多価アルコール部分エステル化合物。
【００７０】
（ｃ） ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸部分エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸部分エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸部分エステル、又はポリオキシエチレン化ひまし油などのポリオキシエチレン化多価アルコール脂肪酸エステル。
【００７１】
（ｄ） 脂肪酸ジエタノールアミド、Ｎ，Ｎ−ビス−２−ヒドロキシアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルアミン、トリエタノールアミン脂肪酸エステル、又はトリアルキルアミンオキシドなどのアミド若しくはアミン化合物。
【００７２】
なお、この非イオン性界面活性剤としては、例えば、トライトンＸ−１００（和光純薬工業社）又はＢＯ−１０ＴＸ（日光ケミカルズ社）等が好ましい。
【００７３】
そして、この非イオン性界面活性剤を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．０００１〜１％の範囲にあることが好ましく、０．００１〜０．５％の範囲にあることが特に好ましい。
【００７４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の非イオン性界面活性剤の濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるように設定すればよい。
例えば、前記の非イオン性界面活性剤を、０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
【００７５】
（８） 陰イオン性界面活性剤
本発明の試料中のカルシウム測定方法においては、ホスフォジエステラーゼ活性を阻害するため、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、陰イオン性界面活性剤を共存させることが好ましい。
また、同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、陰イオン性界面活性剤を含ませることが好ましい。
【００７６】
このような陰イオン性界面活性剤としては、例えば、以下のもの等を挙げることができる。
（ａ） 脂肪族モノカルボン酸塩、Ｎ−アシロイルサルコシン塩、Ｎ−アシロイル−β−アラニン塩、若しくはＮ−アシロイルグルタミン酸塩などの脂肪族化合物カルボン酸塩；又はアビエチン酸塩などの環式化合物カルボン酸塩。
【００７７】
（ｂ） ジアルキルスルホコハク酸塩、アルカンスルホン酸塩、若しくはヒドロキシアルカンスルホン酸塩などの脂肪族化合物スルホン酸塩；直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル（分岐鎖）ベンゼンスルホン酸塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルフェノキシポリオキシエチレンプロピルスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸塩、若しくはナフタレンスルホン酸塩−ホルムアルデヒド縮合物などの環式化合物スルホン酸塩；又はＮ−メチル−Ｎ−オレイルタウリンナトリウム、若しくはＮ−アルキルスルホコハク酸モノアミド二ナトリウム塩などの含窒素化合物スルホン酸塩。
【００７８】
（ｃ） 硫酸化ひまし油、硫酸化牛脚油、脂肪酸アルキルエステル・硫酸エステル塩、アルキル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、脂肪酸モノグリセリド硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキロイルアミド硫酸塩などの脂肪族化合物硫酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル硫酸エステル塩などの環式化合物硫酸エステル塩。
【００７９】
（ｄ） アルキルリン酸エステル塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル塩などの脂肪族化合物リン酸エステル塩；又はポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸エステル塩などの環式化合物リン酸エステル塩。
【００８０】
（ｅ） スチレン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物、又はオレフィン−無水マレイン酸共重合物の部分けん化物などの重合型高分子化合物のけん化物。
【００８１】
（ｆ） ナフタレンスルホン酸塩−ホルマリン縮合物などの重縮合型高分子化合物。
【００８２】
この陰イオン性界面活性剤を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と共存させる際の濃度は、０．０００１〜１％の範囲にあることが好ましく、０．００１〜０．５％の範囲にあることが特に好ましい。
【００８３】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させる前記の陰イオン性界面活性剤の濃度は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の濃度が０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるように設定すればよい。
例えば、前記の陰イオン性界面活性剤を、０．０００１〜１％となるように、特に０．００１〜０．５％となるようにカルシウム測定試薬に含有させればよい。
【００８４】
（９） 測定試薬等の構成成分
本発明の試料中のカルシウム測定試薬又はカルシウム測定方法においては、前記の成分の他に、公知の防腐剤等を必要に応じて適宜含ませ又は共存させることができる。
【００８５】
（１０） 試薬等の構成
本発明の試料中のカルシウム測定方法及びカルシウム測定試薬は、１ステップ法（１試薬系）で実施、構成することもできるが、測定試薬を長期間保存して用いる場合には２ステップ法（２試薬系）等の多ステップ法（多試薬系）で実施、構成することが測定試薬の安定性の面からより好ましい。
【００８６】
なお、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤと、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物とは、別々の測定試薬に含有させておくことが好ましい。
それは、共存させた場合、微量でもカルシウムが混入することにより、長期保存されるうちに、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物がホスホリパーゼＤにより分解されてしまうからである。
【００８７】
（１１） リン酸モノエステル化合物に作用する酵素
本発明の試料中のカルシウム測定方法において、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２が発色基である場合、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させる際に、リン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を共存させることが好ましい。
【００８８】
それは、試料中にカルシウムが存在する場合、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ１（発色性基）及びＸ２（発色性基）を加水分解して遊離させるのであるが、反応時の条件によっては、一つ目の発色性基の加水分解から二つ目の発色性基の加水分解までに時間が掛かることがある。
【００８９】
このときにリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素が共存していると、一つ目の発色性基の加水分解により生成したリン酸モノエステル化合物にリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素が作用して、二つ目の発色性基を短時間のうちに加水分解することができるからである。
【００９０】
なお、この酵素はリン酸ジエステル化合物には作用しないので、試料中にカルシウムが存在せず、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが前記の一般式（Ｉ）で表される化合物に作用しない（加水分解しない）場合には、この酵素も発色性基を加水分解することはないので、測定値に正の誤差を生じさせることはない。
【００９１】
同じ理由により、本発明の試料中のカルシウム測定試薬においては、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ２が発色基である場合、リン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を含ませることが好ましい。
【００９２】
このリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素としては、例えば、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）又は酸性ホスファターゼ（ＡＣＰ）等を挙げることができる。
【００９３】
このリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際の活性値は、０．０１〜１０単位／ｍＬの範囲にあることが好ましく、０．１〜５単位／ｍＬの範囲が特に好ましい。
【００９４】
また、本発明の試料中のカルシウム測定試薬に含有させるリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素の活性値は、試料、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びに前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と混合し反応させる際に０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５単位／ｍＬとなるように設定すればよい。
例えば、このリン酸ジエステル化合物には作用せずリン酸モノエステル化合物のエステル結合を加水分解する酵素を、０．０１〜１０単位／ｍＬとなるように、好ましくは０．１〜５単位／ｍＬとなるように含有させればよい。
【００９５】
（１２） 試料中のカルシウム測定の一例
本発明の試料中のカルシウム測定方法は、
ａ） 試料と、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質としての前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
ｂ） この遊離した発色性基を比色測定する工程、よりなるものである。
【００９６】
なお、本発明の試料中のカルシウム測定方法は、コリンオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又は酸性ホスファターゼ等の共役酵素を介在させなくとも測定が行えるという点で特徴的である。
【００９７】
本発明の試料中のカルシウム測定方法及び測定試薬を用いて試料中のカルシウムを測定する場合の一例をより具体的に説明すると、例えば、試料中に含まれるカルシウムとＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤとが接触すると、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤがこのカルシウムによって活性化される。
【００９８】
このカルシウムによって活性化されたＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物と接触すると、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤは、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物のＸ１及びＸ２を加水分解して遊離させる。
【００９９】
すなわち、４−ニトロフェニル基、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニル基、２，６−ジクロロ−アセチルフェニル基、又はアシルフェニル基等の発色性基が遊離される。
【０１００】
ここで遊離した４−ニトロフェノール、２−クロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジクロロ−４−ニトロフェノール、２，６−ジクロロ−アセチルフェノール、又はアシルフェノール等が吸収を示す任意の波長において、分光光度計を用いて吸光度などを測定すること等により、遊離した発色性基の量を求め、これよりＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤの活性値を求め、更には試料中のカルシウム濃度の算出を行うことができる。
【０１０１】
本発明の測定原理を、前記の一般式（Ｉ）で表される化合物としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合を例として示すと下記のようになる。
【０１０２】
【化７】
本発明において前記の一般式（Ｉ）で表される化合物として基質としてビス（４−ニトロフェニル）リン酸を用いた場合は、試料中のカルシウムイオンによって活性化されたＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤが、ビス（４−ニトロフェニル）リン酸のリン酸基と２つの４−ニトロフェニル基との間のエステル結合をそれぞれ加水分解して、２分子の４−ニトロフェノールを遊離させる。
【０１０４】
この遊離した４−ニトロフェノールの吸光度を測定波長４０５ｎｍ等において分光光度計等を用いて測定することによって、試料中のカルシウム濃度を測定することが可能となる。
【０１０５】
（１４） 試料
本発明において、試料とは、試料中のカルシウム濃度の測定を行おうとするもののことであり、このようなものであれば特に限定されない。
このような試料としては、例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、汗等の体液、ヒト若しくは動物の腎臓、心臓、肺、脳等の臓器等の抽出液；骨格筋、骨髄、皮膚、又は神経組織等の抽出液；毛髪等の抽出液、ヒト又は動物の糞便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出液；食品又はこれの抽出液；農林水産物又はこれの抽出物；飲料水；飲料；環境試料（土壌、海水、河川水、湖沼水、地下水など）；あるいは薬剤等が挙げられる。
【０１０６】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。
【０１０７】
〔実施例１〕
（ホスホリパーゼＤの各製品ロットの分析）
ホスホリパーゼＤの各製品ロットの蛋白質の存在パターンをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確かめた。
【０１０８】
（１） 市販ホスホリパーゼＤの各製品ロット〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来；製品ロットＡ、及び製品ロットＢ〕、並びに蛋白質分子量マーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ；バイオラッド社）の各々を試料とし、還元条件下で、１２．５％ポリアクリルアミドゲル〔フナコシ イージーゲル（ＩＩ）；フナコシ社）〕を支持体とし、０．１％ＳＤＳを含む２５ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−２００ｍＭグリシン緩衝液を泳動緩衝液として使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｕ．Ｋ．Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年参照）を行った。
【０１０９】
（２） ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示した。なお、この図において、ゲルのレーンの左端は、蛋白質分子量マーカーの蛋白質のパターンを示している。また、それ以外のレーンは、ホスホリパーゼＤの各製品ロットの蛋白質のパターンを示している。
【０１１０】
図１に示すように、このＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動結果においては、主にそれぞれ分子量約５７キロダルトンの蛋白質、約４２キロダルトンの蛋白質、及び約２０キロダルトンの蛋白質のバンドが観察された。すなわち、これらのバンドは、ホスホリパーゼＤのアイソザイムとして知られているＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、及びＰＬＤ２０であることが分かる。
【０１１１】
（３） 次に、このＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果をＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ画像解析ソフト（米国Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて画像解析し、各レーンのＰＬＤ５７、ＰＬＤ４２、及びＰＬＤ２０のバンドの「発色強度×面積」を各々測定し、ホスホリパーゼ全体の中での比率をそれぞれ求めた。この結果を表１に示した。
【０１１２】
【表１】
各ホスホリパーゼＤアイソザイムの比率は、製品ロットＡでは、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝２７％：５３％：２０％であり、製品ロットＢでは、ＰＬＤ５７：ＰＬＤ４２：ＰＬＤ２０＝４２％：４４％：１４％であった。
【０１１４】
なお、前述したようにＰＬＤ４２とＰＬＤ２０は、通常、複合体（ＰＬＤ４２／２０）として存在しているが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う過程でＰＬＤ４２とＰＬＤ２０に分離されたものと推察される。
【０１１５】
〔実施例２〕
（市販ホスホリパーゼＤの各製品ロットにおけるカルシウム測定時の直線性の検討）
市販ホスホリパーゼＤを用いたカルシウム測定試薬において、ホスホリパーゼＤの各製品ロットによるカルシウム測定を行う際の直線性の検討を行った。
【０１１６】
（１） 試薬の調製
▲１▼ 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、ホスホリパーゼＤ濃度が異なる８種類の本発明・第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ ６０ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〔非イオン性界面活性剤〕 ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕 ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕
０．１単位／ｍＬ、０．２５単位／ｍＬ、０．５単位／ｍＬ、
０．７５単位／ｍＬ、１単位／ｍＬ、２単位／ｍＬ、３単位／ｍＬ、
又は４単位／ｍＬ
・製品ロットＡ、
又は
・製品ロットＢ
【０１１７】
▲２▼ 第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、第２試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ ６０ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〔非イオン性界面活性剤〕 ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕 ０．０５％
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社） ０．７５ｍＭ
クエン酸 １８ｍＭ
【０１１８】
（２） 試料の調製
カルシウム標準液〔１，０００ｍｇ／ｍＬの炭酸カルシウムを含む０．１Ｍ硝酸水溶液；原子吸光用〕（和光純薬工業社）を純水で希釈して、下記の濃度のカルシウムを含む試料をそれぞれ調製した。
【０１１９】
▲１▼ ２０．０ｍｇ／ｄＬ
▲２▼ １５．０ｍｇ／ｄＬ
▲３▼ １０．０ｍｇ／ｄＬ
▲４▼ ５．０ｍｇ／ｄＬ
▲５▼ ２．５ｍｇ／ｄＬ
【０１２０】
また、純水を、カルシウムを含まない試料すなわち「▲６▼カルシウム濃度０ｍｇ／ｄＬの試料」とした。
以上６種類の試料を調製した。
【０１２１】
（３） 試料中のカルシウム濃度の測定
日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて試料中のカルシウム濃度の測定を行った。
【０１２２】
▲１▼ 前記（２）で調製した６種類の試料をそれぞれ試料とし、この６μＬに前記（１）の▲１▼で調製した８種類の第１試薬の一つを１２０μＬ添加して、混和後３７℃で５分間反応させた。
【０１２３】
▲２▼ その後、これに前記（１）の▲２▼で調製した第２試薬の１２０μＬを添加し、３７℃で反応させた。
【０１２４】
▲３▼ そして、主波長４０５ｎｍ及び副波長６６０ｎｍにおける吸光度を、第２試薬添加後１分５５秒目（２３ポイント目）から５分８秒目（３４ポイント目）まで測定した。
【０１２５】
▲４▼ 前記▲３▼において測定した吸光度より、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を算出した。
なお、試料▲６▼（０ｍｇ／ｄＬ）の吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を試薬盲検値として差し引いた。
【０１２６】
▲５▼ 以上の操作を８種類の第１試薬について行った。
【０１２７】
（４） 測定結果
ホスホリパーゼＤの製品ロットＡを使用した場合の測定結果を図２に、製品ロットＢを使用した場合の測定結果を図３に示した。
【０１２８】
なお、これらの図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１２９】
この図２及び図３から明らかなように、ホスホリパーゼＤの製品ロットＡ（ＰＬＤ４２比率５３％、及びＰＬＤ２０比率２０％））を使用し、基質濃度を固定して（変化させずに）、ホスホリパーゼＤの濃度を低濃度から高濃度まで変化させて測定を行った場合には、それぞれ試料中のカルシウム濃度の増加に伴って各吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値が高濃度域まで直線的に増加していることが分かる。また、これはホスホリパーゼＤの製品ロットＢ（ＰＬＤ５７比率４４％、ＰＬＤ２０比率１４％）を使用した場合も同様であった。
【０１３０】
この結果から、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤを用いてカルシウムの測定を行う場合には、基質の濃度及びホスホリパーゼＤの濃度を低めに設定することにより、試料中のカルシウム濃度と測定により得られる吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値との関係が直線的となり、これにより直線的な検量線が得られ、そして低濃度域から高濃度域までカルシウム濃度測定値がほぼ直線上に位置するようになることが分かる。
従って、低濃度域から高濃度域まで試料中のカルシウム濃度を精度よくかつ正確に測定できるようになる。
特に、第１試薬中のホスホリパーゼＤの濃度が１単位／ｍＬ以下の場合に、試料中のカルシウムの測定において極めて良好な直線性が得られることが確認された。
【０１３１】
〔実施例３〕
（市販ホスホリパーゼＤの各製品ロットにおけるカルシウム測定時の直線性の検討）
市販ホスホリパーゼＤを用いたカルシウム測定試薬において、ホスホリパーゼＤの各製品ロットによるカルシウム測定を行う際の直線性の検討を行った。
【０１３２】
（１） 試薬の調製
▲１▼ 第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、第１試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ ６０ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〔非イオン性界面活性剤〕 ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕 ０．０５％
ホスホリパーゼＤ〔ストレプトマイセス・クロモフスカス由来〕 ０．７５単位／ｍＬ
・製品ロットＡ、
又は
・製品ロットＢ
【０１３３】
▲２▼ 第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．２５（２０℃）に調整し、基質濃度が異なる８種類の第２試薬を調製した。
ＰＩＰＥＳ ６０ｍＭ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００〔非イオン性界面活性剤〕 ０．１％
ケーソンＣＧ〔防腐剤〕 ０．０５％
ビス（４−ニトロフェニル）リン酸〔基質〕（和光純薬工業社） ０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．７５ｍＭ、１ｍＭ、２．５ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭ
クエン酸 １８ｍＭ
【０１３４】
（２） 試料の調製
実施例２の（２）で調製した試料をそのまま使用した。
【０１３５】
（３） 試料中のカルシウム濃度の測定
前記（２）の各試料中のカルシウム濃度を、前記（１）で調製した第１試薬及び第２試薬を用いて、前記実施例２の（３）の▲１▼〜▲４▼の通りに操作を行い、１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を求めた。この操作を８種類の第２試薬について行った。
【０１３６】
（４） 測定結果
ホスホリパーゼＤの製品ロットＡを使用した場合の測定結果を図４に、製品ロットＢを使用した場合の測定結果を図５に示した。
【０１３７】
なお、これらの図において横軸は試料中のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は測定により得られた１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）を表す。
【０１３８】
この図４及び図５から明らかなように、ホスホリパーゼＤの製品ロットＡ（ＰＬＤ４２比率５３％、及びＰＬＤ２０比率２０％）を使用し、ホスホリパーゼＤの濃度を固定して（変化させずに）、基質の濃度を低濃度から高濃度まで変化させて測定を行った場合には、それぞれ試料中のカルシウム濃度の増加に伴って各吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値が高濃度域まで直線的に増加していることが分かる。また、これはホスホリパーゼＤの製品ロットＢ（ＰＬＤ５７比率４４％、ＰＬＤ２０比率１４％）を使用した場合も同様であった。
【０１３９】
この結果から、ＰＬＤ４２及びＰＬＤ２０の比率が５０％以上のホスホリパーゼＤを用いてカルシウムの測定を行う場合には、ホスホリパーゼＤの濃度及び基質の濃度を低めに設定することにより、試料中のカルシウム濃度と測定により得られる吸光度変化量（ΔＡｂｓ．／分）の値との関係が直線的となり、これにより直線的な検量線が得られ、そして低濃度域から高濃度域までカルシウム濃度測定値がほぼ直線上に位置するようになることが分かる。
従って、低濃度域から高濃度域まで試料中のカルシウム濃度を精度よくかつ正確に測定できるようになる。
特に、第２試薬中の基質の濃度が１ｍＭ以下の場合に、試料中のカルシウムの測定において極めて良好な直線性が得られることが確認された。
【０１４０】
【発明の効果】
本発明の試料中のカルシウム測定試薬及びカルシウム測定方法では、カルシウムイオンによるホスホリパーゼＤの活性化を利用した測定において、分子量約４２キロダルトン及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質として前記の一般式（Ｉ）で表される化合物を使用した場合に、低濃度域から高濃度域までカルシウム濃度測定値が、ほぼ直線上に位置するようになるので、試料中のカルシウム濃度を低濃度域から高濃度域まで精度よくかつ正確に測定できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】市販ホスホリパーゼＤのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示した写真である。
【図２】市販ホスホリパーゼＤを用いて、試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図３】市販ホスホリパーゼＤを用いて、試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図４】市販ホスホリパーゼＤを用いて、試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
【図５】市販ホスホリパーゼＤを用いて、試料中のカルシウムを測定した結果を示したグラフである。
Claims (8)
- 分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を含有する、試料中のカルシウム測定試薬。
- ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、請求項１記載の試料中のカルシウム測定試薬。
- ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を含むことを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の試料中のカルシウム測定試薬。
- コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを含むことを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の試料中のカルシウム測定試薬。
- 試料中のカルシウムを測定する方法であって、
ａ） 該試料と、分子量約４２キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイム及び分子量約２０キロダルトンのホスホリパーゼＤアイソザイムの比率が５０％以上のホスホリパーゼＤ、並びにホスホリパーゼＤの基質として下記の一般式（Ｉ）（式中、Ｘ１は発色性基であり、Ｘ２は水素原子、発色性基あるいは、置換されていないか若しくは置換されている、アルキル基又はフェニル基）で表される化合物を混合し反応させ、前記の化合物から発色性基を遊離させる工程、及び
- ホスホリパーゼＤがストレプトマイセス属微生物由来であることを特徴とする、請求項５記載の試料中のカルシウム測定方法。
- 前記工程ａ）において、ホスホリパーゼＤのカルシウムに対する見掛けのＫｍ値を０．０３〜１０ｍＭに調節する物質を共存させることを特徴とする、請求項５又は請求項６記載の試料中のカルシウム測定方法。
- 前記工程ａ）において、コバルトイオン、ニッケルイオン、又は亜鉛イオンのうち少なくとも一つから選択されるものを共存させることを特徴とする、請求項５〜請求項７のいずれか一項に記載の試料中のカルシウム測定方法。
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