JP2004337004A - 葯特異的遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】新規な葯特異的遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用の提供を課題とする。
【解決手段】幼苗期イネをジベレリンで処理し、ＤＮＡマイクロアレイ解析法やプロテオーム解析法を利用して、発現が制御される遺伝子群やタンパク質群を検索した。その結果、８種類のβチューブリンが検出された。同定された８種類のチューブリンのうちＯｓＴＵＢ８は、葯で特異的な発現を示した。このためＯｓＴＵＢ８は、イネの雄性不稔に関与していることが示唆され、植物においてＯｓＴＵＢ８の発現を調節することにより、植物の稔性を改変することが考えられる。
また、ＯｓＴＵＢ８のプロモーターは、葯特異的な活性を有すると考えられるため、葯特異的な遺伝子発現のためのツールとして高い利用価値を有すると言える。
【選択図】 なし
【解決手段】幼苗期イネをジベレリンで処理し、ＤＮＡマイクロアレイ解析法やプロテオーム解析法を利用して、発現が制御される遺伝子群やタンパク質群を検索した。その結果、８種類のβチューブリンが検出された。同定された８種類のチューブリンのうちＯｓＴＵＢ８は、葯で特異的な発現を示した。このためＯｓＴＵＢ８は、イネの雄性不稔に関与していることが示唆され、植物においてＯｓＴＵＢ８の発現を調節することにより、植物の稔性を改変することが考えられる。
また、ＯｓＴＵＢ８のプロモーターは、葯特異的な活性を有すると考えられるため、葯特異的な遺伝子発現のためのツールとして高い利用価値を有すると言える。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、葯特異的遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
雄性不稔作物には、花粉飛散による生態系への悪影響の回避、および品種改良を行う上での交配の簡便化等の産業上の重要性がある。つまり、植物の遺伝子組換え技術は、現在問題となりつつある食糧問題や環境問題を解決できる技術として期待されている。しかし、日本では健康や生態系への悪影響を不安視する消費者が多いため、遺伝子組換え作物を利用した食品等の商品化は抑制傾向にある。このような問題を解決するために、雄生不稔作出技術は重要な意味合いを持っている。一方、品種改良する上で別の株との交配が容易になるため、現在多くの作物で多数の雄生不稔系統が遺伝資源として選抜・保存されている。
【０００３】
このためこれまで雄性不稔作物の作出における数々の試みが行われてきている。例えば、すでに遺伝子組換えによって雄性不稔ナタネが実用化されている。カルシウム・カルモジュリン依存性プロテインキナーゼが花粉形成期に特異的に発現し、その遺伝子の発現を抑制した形質転換体においては、正常な発芽能をもつ花粉は形成されず植物は雄性不稔になることが報告されている（竹澤ら ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，０７７，９９１ Ｊｕｎｅ，２０，２０００）。さらに、シロイヌナズナの液胞膜のプロトン輸送性ピロフォスファターゼ遺伝子の発現調節領域（プロモーター）に花粉特異的に遺伝子発現を調節している領域が検出され、この領域を利用して遺伝子発現を抑制した形質転換体は雄性不稔になることが報告されている（京都大学・佐藤 ２００２）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な葯特異的遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ジベレリンは、▲１▼茎や葉を伸ばす（伸長成長促進作用）、▲２▼受精なしに果実を大きくさせる（単為結実）、▲３▼開花を早める（開花促進）、▲４▼休眠中の種子を発芽させる（休眠打破）等イネの本質的な生活環の調節に大きく関与している。現在、ジベレリンの生合成に関与する酵素の研究は、その突然変異イネの利用により多くの報告があるが、どのようにジベレリンの情報が伝わり、様々な形態を示すのかについては、未解明な部分が多い。そこで、ジベレリンの作用の分子機構解明を目的に、幼苗期イネをジベレリンで処理し、ＤＮＡマイクロアレイ解析法やプロテオーム解析法を利用して、発現が制御される遺伝子群やタンパク質群を検索した。
【０００６】
その結果、βチューブリン遺伝子が同定された。チューブリンには、α型とβ型があり、細胞骨格の主要成分である。真核生物においてこれらのタンパク質は細胞分裂や細胞の伸長、さらに細胞の運動や核分裂および細胞質分裂など幅広く機能している。特にセルロース微繊維の沈着方向を制御している。従って、本発明者により同定されたチューブリンは、細胞伸長に関わりイネの茎葉伸長に影響を及ぼすことが考えられる。そこで、イネ中のβチューブリンをスクリーニングした結果、８種類のβチューブリンが検出された。同定された８種類のチューブリンのうちＯｓＴＵＢ８は、葯で特異的な発現を示した。このためＯｓＴＵＢ８は、イネの雄性不稔に関与していることが示唆され、植物においてＯｓＴＵＢ８の発現を調節することにより、植物の稔性を改変することが考えられる。
【０００７】
また、ＯｓＴＵＢ８のプロモーターは、葯特異的な活性を有すると考えられるため、葯特異的な遺伝子発現のためのツールとして高い利用価値を有すると言える。
【０００８】
即ち、本発明は、新規な葯特異的遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用に関し、より詳しくは、下記発明に関する。
（１） 下記（ａ）から（ｄ）に記載の単離されたＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸からなり、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ
（２） 配列番号１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（３） （１）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（４） 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１）に記載のＤＮＡの発現を抑制させるＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（５） 植物細胞における内在性の（１）に記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６） （１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
（７） （１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（６）に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞。
（８） （７）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（９） （８）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体。
（１０） （８）または（９）に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
（１１） 葯特異的にプロモーター活性を有する、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号３に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に記載された塩基配列の１または複数の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（１２） （１１）に記載のＤＮＡを含むベクター。
（１３） （１１）に記載のＤＮＡの下流に任意の遺伝子が機能的に結合されている、（１２）に記載のベクター。
（１４） （１３）に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
（１５） （１４）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（１６） （１５）に記載の形質転換植物の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
（１７） （１５）または（１６）に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。イネ日本晴のＯｓＴＵＢ８ ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１０】
本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ の調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、ＯｓＴＵＢ８遺伝子を有するイネ品種（例えば、日本晴）からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡ は、例えばＯｓＴＵＢ８遺伝子を有するイネ品種（例えば、日本晴）から抽出した ｍＲＮＡ を基にｃＤＮＡ を合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【００１１】
本発明は、配列番号：２に記載のＯｓＴＵＢ８タンパク質（日本晴）と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。ここで「ＯｓＴＵＢ８タンパク質（日本晴）と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質がＯｓＴＵＢ８タンパク質と同等の生物学的機能あるいは生化学的機能を有することを意味する。このような機能としては、例えば、葯特異的な発現が挙げられる。葯特異的に発現するとは、実施例３に記載の葯以外の組織における発現量と比較して、少なくとも５倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１５倍以上の量で葯において発現することをいう。被検遺伝子が植物の葯に特異的に発現するタンパク質をコードするか否かは、例えば、実施例３に記載のように、植物の各組織からｍＲＮＡを抽出し、被検遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを利用してノーザンブロット解析をすることにより評価することができる。
【００１２】
その他の機能としては、例えば、植物の稔性の誘導、チューブリンとしての機能（細胞分裂、細胞伸長、細胞の運動、核分裂、細胞質分裂、セルロース繊維の沈着方向の制御）などが挙げられる。被検遺伝子がこれらの機能を有するか否かは、植物における被検遺伝子の発現をアンチセンス技術などにより抑制し、その植物の表現型を解析することにより、評価することができる。
【００１３】
配列番号：２に記載のＯｓＴＵＢ８タンパク質（日本晴）と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡは、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科植物由来であり、もっとも好ましくはイネ由来である。
【００１４】
このようなＤＮＡには、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１５】
アミノ酸配列が人為的に改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ＆ Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．−Ｊ． （１９８７） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５４： ３５０−３６７）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても、天然型のＯｓＴＵＢ８タンパク質（配列番号：２）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１６】
配列番号：２に記載のＯｓＴＵＢ８タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ．Ｍ． （１９７５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ９８： ５０３）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １３５０−１３５４、Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： ４８７−４９１）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、ＯｓＴＵＢ８遺伝子の塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、またＯｓＴＵＢ８遺伝子（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からＯｓＴＵＢ８遺伝子と高い相同性を有するＤＮＡを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうるＯｓＴＵＢ８タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高いＤＮＡの単離を期待することができる。これにより単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、ＯｓＴＵＢ８タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を指す。
【００１７】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ＆ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０： ５８７３−５８７７）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ ＝ １００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ ＝ １２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ ＝ ５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ ＝ ３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００１８】
上記本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡは、葯特異的プロモーター活性を有するＤＮＡの取得（単離）に利用することができる。例えば、本発明のＤＮＡもしくはその一部をプローブとしたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うことにより、本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの上流域のゲノムＤＮＡを取得することができる。この上流域のゲノムＤＮＡは、葯特異的なプロモーター活性を有することが考えられることから、任意の遺伝子を葯特異的に発現させるなどの目的に利用でき産業上の利用価値が高い。また本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡは、植物の葯特異的に発現することから、植物の発生過程における葯に分化する組織のマーカーとして使用することも考えられる。さらに本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、雄性不稔性植物体に稔性を付与するための利用も考えられる。即ち、本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを雄性不稔性の形質を有する植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることにより、雄性不稔性植物体に稔性を付与することが考えられる。雄性不稔性品種は、自家受粉できないため、その品種が優良な形質を有する場合でも、その維持を図ることが難しいが、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡを利用して稔性を回復させれば、自家受粉が可能となり、優良な品質の維持も可能となる。この観点からも、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡは、有用である。
【００１９】
一方、本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの発現が抑制された形質転換植物体を作製する場合には、本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの発現を抑制するためのＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。本発明における「ＤＮＡの発現の抑制」には、ＤＮＡの転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００２０】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、Ｅｃｋｅｒらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した（Ｅｃｋｅｒ， Ｊ．Ｒ． ＆ Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｗ． （１９８６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３： ５３７２）。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスＲＮＡの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており（Ａ．Ｒ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３３： ８６６）、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００２１】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ 遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人，ｐｐ．３１９−３４７，１９９３）。
【００２２】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター（例えば、後述するＯｓＴＵＢ８プロモーター）の下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００２３】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子， （１９９０） 蛋白質核酸酵素，３５：２１９１）。
【００２４】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡまたはＵでも切断されることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２２８： ２２５）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２３９： ２８５、小泉誠および大塚栄子（１９９０） 蛋白質核酸酵素，３５： ２１９１、 Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７： ７０５９）。例えば、ＯｓＴＵＢ８遺伝子のコード領域（配列番号：１）中には標的となりうる部位が複数存在する。
【００２５】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ， Ｊ．Ｍ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ３４９）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ， Ｙ． ＆ Ｓａｓａｋｉ， Ｎ． （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ６７５１、 菊池洋 （１９９２） 化学と生物 ３０： １１２）。
【００２６】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターや後述するＯｓＴＵＢ８プロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたＲＮＡの５’末端や３’末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａｅｔ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ３： ７３３、Ｄｚｉａｎｏｔ， Ａ．Ｍ． ＆ Ｂｕｊａｒｓｋｉ， Ｊ．Ｊ． （１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８６： ４８２３、 Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ， Ｃ．Ａ． ＆ Ｃｅｃｈ， Ｒ．Ｔ． （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ３８７５、Ｔａｉｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ５１２５）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １８６： １２７１）。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００２７】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においては、しばしば観察される（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ． ７：Ｒ７９３， １９９７， Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ． ６： ８１０， １９９６）。例えば、ＯｓＴＵＢ８遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、ＯｓＴＵＢ８遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記した手法により決定できる。
【００２８】
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。
【００２９】
植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物の組織特異的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、後述する本発明のプロモーター）を有するベクター、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここで言う「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００３０】
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １００： １５０３−１５０７参照）。
【００３１】
例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ， Ｓ．Ｋ． （１９９５） Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｅｄｓ．） ｐｐ６６−７４）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １００： １５０３−１５０７）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： ９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６： ２７１−２８２）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００３２】
一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００３３】
このようにして作出された植物体は、野生型植物体と比較して、その稔性が変化していることが示唆される。例えば、アンチセンスＤＮＡの導入などによりＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの発現が抑制された植物体は、雄性不稔性が付与されることが考えられる。本発明の手法を用いれば、有用農作物であるイネにおいては、稔性の調節を通じて、自家受粉を抑制し、他家受粉させることにより、有用な雑種強勢の形質を付与することが可能となる。
【００３４】
また、本発明は、葯特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡを提供する。このようなＤＮＡとしては、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの上流域のゲノムＤＮＡ、例えば、配列番号：３に記載された塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
【００３５】
本発明のプロモーターＤＮＡには、葯特異的なプロモーター活性を有す限り、配列番号：３に記載された塩基配列からなるＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡも含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなり、葯特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡを挙げることができる。このようなＤＮＡを調製するために当業者によく知られた方法としては、例えば、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ＆ Ｆｒｉｔｚ， Ｈ．Ｊ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４： ３５０）により変異を導入する方法が考えられる。
【００３６】
また、配列番号：３に記載された塩基配列からなるＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡは、一般的なハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， ＥＭ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （１９７５） ９８： ５０３）、またはＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １３５０、Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： ４８７）によって取得することも可能である。例えば、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡもしくはその一部をプローブとして、また配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物から配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することができる。このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件のハイブリダイゼーション条件、あるいはこれらと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。高い相同性とは、塩基配列全体で好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を指す。
【００３７】
塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎと ＡｌｔｓｃｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． （１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７： ２２６４−２２６８、Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０： ５８７３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００３８】
また、配列番号：１に記載のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを取得し、取得したＤＮＡの葯特異的な発現を確認し、さらに、このＤＮＡの上流域のゲノムＤＮＡを取得すれば、このゲノムＤＮＡは葯特異的なプロモーター活性を有すると考えられる。本発明の葯特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡはこのように、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡを利用して取得することも可能である。
【００３９】
本発明のプロモーターＤＮＡは、好ましくは単子葉植物由来、より好ましくはイネ科植物由来、もっとも好ましくはイネ由来であるが、葯特異的なプロモーター活性を有する限り、特にその由来は制限されない。
【００４０】
上記のようにして調製されたＤＮＡがプロモーター活性を有するか否かは、レポーター遺伝子を用いた周知のレポーターアッセイ等により検討することが可能である。該レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ（以下、ＧＵＳ）遺伝子、およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。
【００４１】
レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、ＧＵＳ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００４２】
本発明のプロモーターＤＮＡは、任意の遺伝子を葯特異的に発現させるために利用しうる。「任意の遺伝子」とは、本発明のプロモーターＤＮＡにより転写を誘導することが可能なＤＮＡを意味する。従って、任意の遺伝子には、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡの他、ＲＮＡをコードするＤＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、リボザイム活性を有するＤＮＡ）も含まれる。
【００４３】
本発明のプロモーターＤＮＡを利用して、任意の遺伝子を葯特異的に発現させるためには、例えば、本発明のプロモーターＤＮＡを含むベクターを作成し、該ベクターにおける本発明のプロモーターＤＮＡの下流に任意の遺伝子を機能的に結合させ、これにより得られるＤＮＡ構築物を植物細胞に導入し、該植物細胞を植物体へ再生させればよい。ここで「機能的に結合」とは、任意の遺伝子が本発明のプロモーターＤＮＡの活性化に応答して発現することが可能な状態で、本発明のプロモーターＤＮＡと結合していることを意味する。本発明のプロモーターＤＮＡは、葯特異的に高い活性を有するため、任意の遺伝子としては、特に葯において発現させることが望ましい遺伝子、例えば、上述した植物の稔性に関与する遺伝子を好適に用いることができる。本発明のプロモーターＤＮＡを含むベクターの構築は、一般的な遺伝子工学的手法を利用して行うことができる。ベクターを導入する植物細胞としては、特に制限はないが、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科植物由来であり、もっとも好ましくはイネ由来である。ベクターの植物細胞への導入や植物細胞の植物体への再生などについては、上述した当業者に公知の方法を用いることができる。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
なお、イネ（品種：日本晴）は気温２５℃、７５％の湿度で昼／夜１２時間ずつの約６００μｍｏｌ／ｍ２ｓの白色蛍光灯の条件で生育させた。ジベレリン（ＧＡ３）、ブラシノライド（ＢＬ）、オーキシン（ＩＡＡ）、サイトカイニン（ＢＡ）、アブシジン酸（ＡＢＡ）は商業的に得られる高純度のものを用いた。ＲＮＡブロッティング解析用のＲＮＡの抽出はＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ と Ｓａｃｃｈｉ の方法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ， Ｐ． ＆ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ．（１９８７） Ａｎａ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６２： １５６−１５９）を用いた。マイクロアレイ分析のためのｍＲＮＡの調製は、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ−３０のｍＲＮＡ精製キット（タカラ社製）を用いた。
【００４５】
［実施例１］ ジベレリンに応答する遺伝子群およびタンパク質群の網羅的検索ジベレリンに応答する遺伝子群を検索するために、マイクロアレイ分析を実施した。ｃＤＮＡマイクロアレイは８９８７個のＥＳＴクローンを有するものを用いた。１０μＭのＧＡ３で２４時間処理した幼苗期イネの葉鞘から調製した１μｇのｍＲＮＡを用いて、５０μＭのＣｙ５ ｄＣＴＰ（アマシャム ファルマシア社製）の存在下、逆転写反応を行った。４２℃で２時間反応した後、反応を止め、９４℃で３分の熱処理後、ＮａＯＨの３７℃で１５分間処理により、ＲＮＡを分解しｃＤＮＡを回収した。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブをＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （キアゲン社製）を用いて精製した。プローブのハイブリダイゼイションとマイクロアレイスライドのスキャニングは矢崎らの方法（Ｙａｚａｋｉ， Ｊ． （２０００） ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７： ３６７−３７０）を用いた。データは、Ａｒｒａｙ Ｖｉｓｉｏｎ （イメージングリサーチ社）によって解析した。
【００４６】
ジベレリンに応答するタンパク質群の検索のため、さらにプロテオーム解析を実施した。１０μＭのＧＡ３で２４時間処理した幼苗期イネの葉鞘から抽出液を用いて抽出したタンパク質を、一次元目に等電点電気泳動、二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて二次元電気泳動にて分離した（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ， ＰＨ． （１９７５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５０： ４００７−４０２１）。泳動後クマシーブリリアントブルーにて染色し、アマシャムバイオサイエンス社の画像解析装置を用いて、２枚の電気泳動画像を重ね合わせることにより、変動のあるタンパク質を検出した。遺伝子群およびタンパク質群の検索の結果、共にβチューブリンが同定された。
【００４７】
同定されたβチューブリンについて、８種類のβチューブリン特異的プライマーを調整した。各βチューブリンＥＳＴクローンをテンプレートとして、それぞれのβチューブリンの３’側の非翻訳領域に特異的なプライマーとＴ３プライマーを用いて、ＰＣＲを行い、反応後、ゲルより精製した。特異性についてはサザンブロットにて確認した（図１）。得られたＰＣＲ産物を以下のノーザンブロット分析において、各チューブリン特異的プローブとして用いた。
【００４８】
［実施例２］ イネ葉鞘に対するホルモン特異性の解析
組織試料は液体窒素で高速凍結した後、約０．５ｇを乳鉢を用いて粉末にすりつぶし、全ＲＮＡはＣｈｏｍｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ， Ｐ． ＆ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ． （１９８７） Ａｎａ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２： １５６−１５９）によって調節した。ノーザンブロット分析のために、全ＲＮＡの２０μｇを６％のホルムアルデヒドを含む１．２％のアガロースゲルにおいて電気泳動を行い、ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ＋のナイロン膜（アマシャム ファルマシア社）に転写した。ノーザンブロット分析において、泳動したＲＮＡが等量であることを保証するために、臭化エチジウムによって染色したｒＲＮＡの量を比較した。ハイブリダイゼーションはアンビオン社のＵＬＴＲＡｈｙｂ（ＴＭ）を用いて４２℃で一晩行い、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃５分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６８℃１５分間の２回の洗浄を行った。発現量はアマシャムバイオサイエンス社の画像解析装置を用いて解析した。
【００４９】
その結果、８種全てのチューブリンにおいて、アブシジン酸処理では発現が抑制した。ＯｓＴＵＢ５、ＯｓＴＵＢ６、ＯｓＴＵＢ７、ＯｓＴＵＢ８については、ジベレリンとブラシノライド処理で発現量が増加し、特にジベレリン処理で発現量が顕著に増加することが明らかになった（図２）。
【００５０】
［実施例３］ チューブリンの組織特異性解析
チューブリン８種の組織特異性を解析するため、上記プローブを用いて、イネの各組織におけるｍＲＮＡの発現量をノーザンブロットで確認した（図３）。８種類全てにおいて葉身でほとんど発現していなかった。ＯｓＴＵＢ１、ＯｓＴＵＢ３、ＯｓＴＵＢ４、ＯｓＴＵＢ５、ＯｓＴＵＢ７はイネ葉鞘に特異的に発現していた。ＯｓＴＵＢ２は葉鞘とカルスに、ＯｓＴＵＢ６は葉鞘とカルスと葯に存在していた。さらに、ＯｓＴＵＢ８は葉鞘と比較して葯において１５倍の顕著な発現を示した。
【００５１】
［実施例４］ 全長ｃＤＮＡのクローニング
全長ｃＤＮＡをクローニングするためにイネの由来のｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングすると同時に、さらにクローンテック社のＳＭＡＲＴ ＴＭ ＰＣＲ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 用いて、５’レース法で完全長ｃＤＮＡを単離した。ｃＤＮＡの塩基配列はアプライドバイオシステム社のシーケンサーを用いて決定した。
【００５２】
得られたＯｓＴＵＢ８の全長ｃＤＮＡは、１，５７２塩基からなり４４６アミノ酸をコードし、他のチューブリンとの相同性は約９０％であった。ＯｓＴＵＢ８は、ＤＤＢＪ等には登録されておらず新規のβチューブリン遺伝子であった（配列番号：１および２）。βチューブリンについて系統樹を作製したところ、ＯｓＴＵＢ８は他のβチューブリンと離れた位置を示した（図４）。
【００５３】
［実施例５］ ＯｓＴＵＢ８のプロモーター領域の同定
ＯｓＴＵＢ８は国際イネゲノム塩基配列プロジェクトが保有するイネゲノムバッククローン（ＡＣ１３９１７４）上に存在していることが相同検索の結果明らかになり、ＯｓＴＵＢ８の上流にプロモーター領域を含むと予想される上流 ２ ｋｂｐ が存在していることを確認した。見出されたＯｓＴＵＢ８のプロモーター領域の塩基配列を配列番号：３に示す。
【００５４】
【発明の効果】
本発明者により同定されたＯｓＴＵＢ８遺伝子は、他の組織と比較して、葯において顕著に高い発現を示すため、植物の発生・分化過程における葯特異的マーカーとしての利用が考えられる。植物において、ＯｓＴＵＢ８遺伝子の発現を抑制することにより、植物に雄性不稔性の形質を付与できる可能性がある一方、雄性不稔性の植物にＯｓＴＵＢ８遺伝子を導入することにより、稔性の付与を行える可能性がある。従って、ＯｓＴＵＢ８遺伝子は、植物の品種育成において利用価値があると考えられる。また、ＯｓＴＵＢ８遺伝子のプロモーターは、葯特異的活性を有すると考えられるため、任意の遺伝子を葯特異的に発現させる上で有用である。
【００５５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】８種類のβチューブリンのＣ末端側アミノ酸配列（上から順に、配列番号：４から１１に示した）の比較図とサザンブロットによる特異性の比較の写真を示す。８種類のβチューブリンはＣ末端側に特異的アミノ酸配列を持っているので、その配列を利用して、特異的プローブを作成した。
【図２】βチューブリンのホルモン特異性を示す写真である。特異的プローブを利用して各種ホルモン処理後のイネ葉鞘におけるｍＲＮＡの発現をノーザンブロットで確認した。Ｃ：無処理、ＧＡ：ジベレリン、ＢＬ：ブラシノライド、ＡＢＡ：アブシジン酸、ＩＡＡ：オーキシン、ＢＡ：サイトカイニン。ＯｓＴＵＡ２はαチューブリンを示す。
【図３】βチューブリンの組織特異性を示す写真である。特異的プローブを用いてイネの各組織におけるｍＲＮＡの発現量をノーザンブロットで確認した。Ｒ：根、ＬＳ：葉鞘、Ｌ：葉身、Ｎ：節、Ａ：葯、ＳＣ：培養細胞
【図４】βチューブリンの系統樹を示す図である。ＣｌｕｓｔａｌＷのソフトで解析した系統樹を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、葯特異的遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
雄性不稔作物には、花粉飛散による生態系への悪影響の回避、および品種改良を行う上での交配の簡便化等の産業上の重要性がある。つまり、植物の遺伝子組換え技術は、現在問題となりつつある食糧問題や環境問題を解決できる技術として期待されている。しかし、日本では健康や生態系への悪影響を不安視する消費者が多いため、遺伝子組換え作物を利用した食品等の商品化は抑制傾向にある。このような問題を解決するために、雄生不稔作出技術は重要な意味合いを持っている。一方、品種改良する上で別の株との交配が容易になるため、現在多くの作物で多数の雄生不稔系統が遺伝資源として選抜・保存されている。
【０００３】
このためこれまで雄性不稔作物の作出における数々の試みが行われてきている。例えば、すでに遺伝子組換えによって雄性不稔ナタネが実用化されている。カルシウム・カルモジュリン依存性プロテインキナーゼが花粉形成期に特異的に発現し、その遺伝子の発現を抑制した形質転換体においては、正常な発芽能をもつ花粉は形成されず植物は雄性不稔になることが報告されている（竹澤ら ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，０７７，９９１ Ｊｕｎｅ，２０，２０００）。さらに、シロイヌナズナの液胞膜のプロトン輸送性ピロフォスファターゼ遺伝子の発現調節領域（プロモーター）に花粉特異的に遺伝子発現を調節している領域が検出され、この領域を利用して遺伝子発現を抑制した形質転換体は雄性不稔になることが報告されている（京都大学・佐藤 ２００２）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規な葯特異的遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
ジベレリンは、▲１▼茎や葉を伸ばす（伸長成長促進作用）、▲２▼受精なしに果実を大きくさせる（単為結実）、▲３▼開花を早める（開花促進）、▲４▼休眠中の種子を発芽させる（休眠打破）等イネの本質的な生活環の調節に大きく関与している。現在、ジベレリンの生合成に関与する酵素の研究は、その突然変異イネの利用により多くの報告があるが、どのようにジベレリンの情報が伝わり、様々な形態を示すのかについては、未解明な部分が多い。そこで、ジベレリンの作用の分子機構解明を目的に、幼苗期イネをジベレリンで処理し、ＤＮＡマイクロアレイ解析法やプロテオーム解析法を利用して、発現が制御される遺伝子群やタンパク質群を検索した。
【０００６】
その結果、βチューブリン遺伝子が同定された。チューブリンには、α型とβ型があり、細胞骨格の主要成分である。真核生物においてこれらのタンパク質は細胞分裂や細胞の伸長、さらに細胞の運動や核分裂および細胞質分裂など幅広く機能している。特にセルロース微繊維の沈着方向を制御している。従って、本発明者により同定されたチューブリンは、細胞伸長に関わりイネの茎葉伸長に影響を及ぼすことが考えられる。そこで、イネ中のβチューブリンをスクリーニングした結果、８種類のβチューブリンが検出された。同定された８種類のチューブリンのうちＯｓＴＵＢ８は、葯で特異的な発現を示した。このためＯｓＴＵＢ８は、イネの雄性不稔に関与していることが示唆され、植物においてＯｓＴＵＢ８の発現を調節することにより、植物の稔性を改変することが考えられる。
【０００７】
また、ＯｓＴＵＢ８のプロモーターは、葯特異的な活性を有すると考えられるため、葯特異的な遺伝子発現のためのツールとして高い利用価値を有すると言える。
【０００８】
即ち、本発明は、新規な葯特異的遺伝子および該遺伝子のプロモーター、並びにそれらの利用に関し、より詳しくは、下記発明に関する。
（１） 下記（ａ）から（ｄ）に記載の単離されたＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸からなり、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ
（２） 配列番号１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（３） （１）に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（４） 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１）に記載のＤＮＡの発現を抑制させるＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（５） 植物細胞における内在性の（１）に記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６） （１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
（７） （１）から（５）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（６）に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞。
（８） （７）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（９） （８）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体。
（１０） （８）または（９）に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
（１１） 葯特異的にプロモーター活性を有する、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号３に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に記載された塩基配列の１または複数の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
（１２） （１１）に記載のＤＮＡを含むベクター。
（１３） （１１）に記載のＤＮＡの下流に任意の遺伝子が機能的に結合されている、（１２）に記載のベクター。
（１４） （１３）に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
（１５） （１４）に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
（１６） （１５）に記載の形質転換植物の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
（１７） （１５）または（１６）に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡを提供する。イネ日本晴のＯｓＴＵＢ８ ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１に、該ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：２に示す。
【００１０】
本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ の調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、ＯｓＴＵＢ８遺伝子を有するイネ品種（例えば、日本晴）からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号：１）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡ は、例えばＯｓＴＵＢ８遺伝子を有するイネ品種（例えば、日本晴）から抽出した ｍＲＮＡ を基にｃＤＮＡ を合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。
【００１１】
本発明は、配列番号：２に記載のＯｓＴＵＢ８タンパク質（日本晴）と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。ここで「ＯｓＴＵＢ８タンパク質（日本晴）と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質がＯｓＴＵＢ８タンパク質と同等の生物学的機能あるいは生化学的機能を有することを意味する。このような機能としては、例えば、葯特異的な発現が挙げられる。葯特異的に発現するとは、実施例３に記載の葯以外の組織における発現量と比較して、少なくとも５倍以上、好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１５倍以上の量で葯において発現することをいう。被検遺伝子が植物の葯に特異的に発現するタンパク質をコードするか否かは、例えば、実施例３に記載のように、植物の各組織からｍＲＮＡを抽出し、被検遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを利用してノーザンブロット解析をすることにより評価することができる。
【００１２】
その他の機能としては、例えば、植物の稔性の誘導、チューブリンとしての機能（細胞分裂、細胞伸長、細胞の運動、核分裂、細胞質分裂、セルロース繊維の沈着方向の制御）などが挙げられる。被検遺伝子がこれらの機能を有するか否かは、植物における被検遺伝子の発現をアンチセンス技術などにより抑制し、その植物の表現型を解析することにより、評価することができる。
【００１３】
配列番号：２に記載のＯｓＴＵＢ８タンパク質（日本晴）と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡは、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科植物由来であり、もっとも好ましくはイネ由来である。
【００１４】
このようなＤＮＡには、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
【００１５】
アミノ酸配列が人為的に改変されたタンパク質をコードするＤＮＡを調製するための当業者によく知られた方法としては、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ＆ Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．−Ｊ． （１９８７） Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １５４： ３５０−３６７）が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡであっても、天然型のＯｓＴＵＢ８タンパク質（配列番号：２）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のＤＮＡに含まれる。また、たとえ、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１６】
配列番号：２に記載のＯｓＴＵＢ８タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ．Ｍ． （１９７５） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ９８： ５０３）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １３５０−１３５４、Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： ４８７−４９１）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、ＯｓＴＵＢ８遺伝子の塩基配列（配列番号：１）もしくはその一部をプローブとして、またＯｓＴＵＢ８遺伝子（配列番号：１）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からＯｓＴＵＢ８遺伝子と高い相同性を有するＤＮＡを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やＰＣＲ技術により単離しうるＯｓＴＵＢ８タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発明のＤＮＡに含まれる。このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．１ｘＳＳＣの条件を用いれば、より相同性の高いＤＮＡの単離を期待することができる。これにより単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、ＯｓＴＵＢ８タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で、少なくとも５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を指す。
【００１７】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ ＆ ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０： ５８７３−５８７７）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ ＝ １００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ ＝ １２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ ＝ ５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ ＝ ３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
【００１８】
上記本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡは、葯特異的プロモーター活性を有するＤＮＡの取得（単離）に利用することができる。例えば、本発明のＤＮＡもしくはその一部をプローブとしたゲノムＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行うことにより、本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの上流域のゲノムＤＮＡを取得することができる。この上流域のゲノムＤＮＡは、葯特異的なプロモーター活性を有することが考えられることから、任意の遺伝子を葯特異的に発現させるなどの目的に利用でき産業上の利用価値が高い。また本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡは、植物の葯特異的に発現することから、植物の発生過程における葯に分化する組織のマーカーとして使用することも考えられる。さらに本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、雄性不稔性植物体に稔性を付与するための利用も考えられる。即ち、本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを雄性不稔性の形質を有する植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させることにより、雄性不稔性植物体に稔性を付与することが考えられる。雄性不稔性品種は、自家受粉できないため、その品種が優良な形質を有する場合でも、その維持を図ることが難しいが、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡを利用して稔性を回復させれば、自家受粉が可能となり、優良な品質の維持も可能となる。この観点からも、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡは、有用である。
【００１９】
一方、本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの発現が抑制された形質転換植物体を作製する場合には、本発明のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの発現を抑制するためのＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。本発明における「ＤＮＡの発現の抑制」には、ＤＮＡの転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００２０】
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、Ｅｃｋｅｒらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した（Ｅｃｋｅｒ， Ｊ．Ｒ． ＆ Ｄａｖｉｓ， Ｒ．Ｗ． （１９８６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３： ５３７２）。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスＲＮＡの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており（Ａ．Ｒ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｎａｔｕｒｅ ３３３： ８６６）、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００２１】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上「新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ 遺伝子の複製と発現」，日本生化学会編，東京化学同人，ｐｐ．３１９−３４７，１９９３）。
【００２２】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーター（例えば、後述するＯｓＴＵＢ８プロモーター）の下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスＤＮＡの長さは、少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００２３】
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型や、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子， （１９９０） 蛋白質核酸酵素，３５：２１９１）。
【００２４】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５のＣ１５の３’側を切断するが、活性にはＵ１４が９位のＡと塩基対を形成することが重要とされ、１５位の塩基はＣの他にＡまたはＵでも切断されることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２２８： ２２５）。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的になるように設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することが可能である（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．（１９８８） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２３９： ２８５、小泉誠および大塚栄子（１９９０） 蛋白質核酸酵素，３５： ２１９１、 Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７： ７０５９）。例えば、ＯｓＴＵＢ８遺伝子のコード領域（配列番号：１）中には標的となりうる部位が複数存在する。
【００２５】
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ， Ｊ．Ｍ． （１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ３４９）。このリボザイムも、標的特異的なＲＮＡ切断を起こすように設計できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ， Ｙ． ＆ Ｓａｓａｋｉ， Ｎ． （１９９２） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ６７５１、 菊池洋 （１９９２） 化学と生物 ３０： １１２）。
【００２６】
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターや後述するＯｓＴＵＢ８プロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたＲＮＡの５’末端や３’末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａｅｔ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ３： ７３３、Ｄｚｉａｎｏｔ， Ａ．Ｍ． ＆ Ｂｕｊａｒｓｋｉ， Ｊ．Ｊ． （１９８９） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ． ８６： ４８２３、 Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ， Ｃ．Ａ． ＆ Ｃｅｃｈ， Ｒ．Ｔ． （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ３８７５、Ｔａｉｒａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ５１２５）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １８６： １２７１）。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００２７】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においては、しばしば観察される（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ． ７：Ｒ７９３， １９９７， Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ． ６： ８１０， １９９６）。例えば、ＯｓＴＵＢ８遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、ＯｓＴＵＢ８遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体から野生型植物体と比較して開花が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、上記した手法により決定できる。
【００２８】
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。
【００２９】
植物細胞の形質転換に用いられるベクターは、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物の組織特異的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、後述する本発明のプロモーター）を有するベクター、植物細胞内で恒常的に遺伝子を発現させるためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることもできる。ここで言う「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
【００３０】
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １００： １５０３−１５０７参照）。
【００３１】
例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ， Ｓ．Ｋ． （１９９５） Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｅｄｓ．） ｐｐ６６−７４）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １００： １５０３−１５０７）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： ９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６： ２７１−２８２）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００３２】
一旦、ゲノム内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のＤＮＡが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００３３】
このようにして作出された植物体は、野生型植物体と比較して、その稔性が変化していることが示唆される。例えば、アンチセンスＤＮＡの導入などによりＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの発現が抑制された植物体は、雄性不稔性が付与されることが考えられる。本発明の手法を用いれば、有用農作物であるイネにおいては、稔性の調節を通じて、自家受粉を抑制し、他家受粉させることにより、有用な雑種強勢の形質を付与することが可能となる。
【００３４】
また、本発明は、葯特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡを提供する。このようなＤＮＡとしては、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡの上流域のゲノムＤＮＡ、例えば、配列番号：３に記載された塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
【００３５】
本発明のプロモーターＤＮＡには、葯特異的なプロモーター活性を有す限り、配列番号：３に記載された塩基配列からなるＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡも含まれる。このようなＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３に記載の塩基配列において、１または複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入された塩基配列からなり、葯特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡを挙げることができる。このようなＤＮＡを調製するために当業者によく知られた方法としては、例えば、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対して、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ＆ Ｆｒｉｔｚ， Ｈ．Ｊ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５４： ３５０）により変異を導入する方法が考えられる。
【００３６】
また、配列番号：３に記載された塩基配列からなるＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡは、一般的なハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， ＥＭ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （１９７５） ９８： ５０３）、またはＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３０： １３５０、Ｓａｉｋｉ， Ｒ．Ｋ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９： ４８７）によって取得することも可能である。例えば、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡもしくはその一部をプローブとして、また配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物から配列番号：３に記載の塩基配列からなるＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを単離することができる。このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件のハイブリダイゼーション条件、あるいはこれらと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。高い相同性とは、塩基配列全体で好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の配列の同一性を指す。
【００３７】
塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎと ＡｌｔｓｃｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． （１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７： ２２６４−２２６８、Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０： ５８７３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００３８】
また、配列番号：１に記載のＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡを取得し、取得したＤＮＡの葯特異的な発現を確認し、さらに、このＤＮＡの上流域のゲノムＤＮＡを取得すれば、このゲノムＤＮＡは葯特異的なプロモーター活性を有すると考えられる。本発明の葯特異的なプロモーター活性を有するＤＮＡはこのように、ＯｓＴＵＢ８タンパク質をコードするＤＮＡを利用して取得することも可能である。
【００３９】
本発明のプロモーターＤＮＡは、好ましくは単子葉植物由来、より好ましくはイネ科植物由来、もっとも好ましくはイネ由来であるが、葯特異的なプロモーター活性を有する限り、特にその由来は制限されない。
【００４０】
上記のようにして調製されたＤＮＡがプロモーター活性を有するか否かは、レポーター遺伝子を用いた周知のレポーターアッセイ等により検討することが可能である。該レポーター遺伝子としては、その発現が検出可能なものであれば特に制限されず、例えば、当業者において一般的に使用されるＣＡＴ遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ（以下、ＧＵＳ）遺伝子、およびＧＦＰ遺伝子等を挙げることができる。
【００４１】
レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がＣＡＴ遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。レポーター遺伝子がｌａｃＺ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、また、ＧＵＳ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用によるＧｌｕｃｕｒｏｎ（ＩＣＮ社）の発光や５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色を検出することにより、さらに、ＧＦＰ遺伝子である場合には、ＧＦＰタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することができる。
【００４２】
本発明のプロモーターＤＮＡは、任意の遺伝子を葯特異的に発現させるために利用しうる。「任意の遺伝子」とは、本発明のプロモーターＤＮＡにより転写を誘導することが可能なＤＮＡを意味する。従って、任意の遺伝子には、例えば、タンパク質をコードするＤＮＡの他、ＲＮＡをコードするＤＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、リボザイム活性を有するＤＮＡ）も含まれる。
【００４３】
本発明のプロモーターＤＮＡを利用して、任意の遺伝子を葯特異的に発現させるためには、例えば、本発明のプロモーターＤＮＡを含むベクターを作成し、該ベクターにおける本発明のプロモーターＤＮＡの下流に任意の遺伝子を機能的に結合させ、これにより得られるＤＮＡ構築物を植物細胞に導入し、該植物細胞を植物体へ再生させればよい。ここで「機能的に結合」とは、任意の遺伝子が本発明のプロモーターＤＮＡの活性化に応答して発現することが可能な状態で、本発明のプロモーターＤＮＡと結合していることを意味する。本発明のプロモーターＤＮＡは、葯特異的に高い活性を有するため、任意の遺伝子としては、特に葯において発現させることが望ましい遺伝子、例えば、上述した植物の稔性に関与する遺伝子を好適に用いることができる。本発明のプロモーターＤＮＡを含むベクターの構築は、一般的な遺伝子工学的手法を利用して行うことができる。ベクターを導入する植物細胞としては、特に制限はないが、好ましくは単子葉植物由来であり、より好ましくはイネ科植物由来であり、もっとも好ましくはイネ由来である。ベクターの植物細胞への導入や植物細胞の植物体への再生などについては、上述した当業者に公知の方法を用いることができる。
【００４４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
なお、イネ（品種：日本晴）は気温２５℃、７５％の湿度で昼／夜１２時間ずつの約６００μｍｏｌ／ｍ２ｓの白色蛍光灯の条件で生育させた。ジベレリン（ＧＡ３）、ブラシノライド（ＢＬ）、オーキシン（ＩＡＡ）、サイトカイニン（ＢＡ）、アブシジン酸（ＡＢＡ）は商業的に得られる高純度のものを用いた。ＲＮＡブロッティング解析用のＲＮＡの抽出はＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ と Ｓａｃｃｈｉ の方法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ， Ｐ． ＆ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ．（１９８７） Ａｎａ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １６２： １５６−１５９）を用いた。マイクロアレイ分析のためのｍＲＮＡの調製は、ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ−３０のｍＲＮＡ精製キット（タカラ社製）を用いた。
【００４５】
［実施例１］ ジベレリンに応答する遺伝子群およびタンパク質群の網羅的検索ジベレリンに応答する遺伝子群を検索するために、マイクロアレイ分析を実施した。ｃＤＮＡマイクロアレイは８９８７個のＥＳＴクローンを有するものを用いた。１０μＭのＧＡ３で２４時間処理した幼苗期イネの葉鞘から調製した１μｇのｍＲＮＡを用いて、５０μＭのＣｙ５ ｄＣＴＰ（アマシャム ファルマシア社製）の存在下、逆転写反応を行った。４２℃で２時間反応した後、反応を止め、９４℃で３分の熱処理後、ＮａＯＨの３７℃で１５分間処理により、ＲＮＡを分解しｃＤＮＡを回収した。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブをＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ （キアゲン社製）を用いて精製した。プローブのハイブリダイゼイションとマイクロアレイスライドのスキャニングは矢崎らの方法（Ｙａｚａｋｉ， Ｊ． （２０００） ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７： ３６７−３７０）を用いた。データは、Ａｒｒａｙ Ｖｉｓｉｏｎ （イメージングリサーチ社）によって解析した。
【００４６】
ジベレリンに応答するタンパク質群の検索のため、さらにプロテオーム解析を実施した。１０μＭのＧＡ３で２４時間処理した幼苗期イネの葉鞘から抽出液を用いて抽出したタンパク質を、一次元目に等電点電気泳動、二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて二次元電気泳動にて分離した（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ， ＰＨ． （１９７５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５０： ４００７−４０２１）。泳動後クマシーブリリアントブルーにて染色し、アマシャムバイオサイエンス社の画像解析装置を用いて、２枚の電気泳動画像を重ね合わせることにより、変動のあるタンパク質を検出した。遺伝子群およびタンパク質群の検索の結果、共にβチューブリンが同定された。
【００４７】
同定されたβチューブリンについて、８種類のβチューブリン特異的プライマーを調整した。各βチューブリンＥＳＴクローンをテンプレートとして、それぞれのβチューブリンの３’側の非翻訳領域に特異的なプライマーとＴ３プライマーを用いて、ＰＣＲを行い、反応後、ゲルより精製した。特異性についてはサザンブロットにて確認した（図１）。得られたＰＣＲ産物を以下のノーザンブロット分析において、各チューブリン特異的プローブとして用いた。
【００４８】
［実施例２］ イネ葉鞘に対するホルモン特異性の解析
組織試料は液体窒素で高速凍結した後、約０．５ｇを乳鉢を用いて粉末にすりつぶし、全ＲＮＡはＣｈｏｍｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ， Ｐ． ＆ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ． （１９８７） Ａｎａ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２： １５６−１５９）によって調節した。ノーザンブロット分析のために、全ＲＮＡの２０μｇを６％のホルムアルデヒドを含む１．２％のアガロースゲルにおいて電気泳動を行い、ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ＋のナイロン膜（アマシャム ファルマシア社）に転写した。ノーザンブロット分析において、泳動したＲＮＡが等量であることを保証するために、臭化エチジウムによって染色したｒＲＮＡの量を比較した。ハイブリダイゼーションはアンビオン社のＵＬＴＲＡｈｙｂ（ＴＭ）を用いて４２℃で一晩行い、その後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４２℃５分間、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６８℃１５分間の２回の洗浄を行った。発現量はアマシャムバイオサイエンス社の画像解析装置を用いて解析した。
【００４９】
その結果、８種全てのチューブリンにおいて、アブシジン酸処理では発現が抑制した。ＯｓＴＵＢ５、ＯｓＴＵＢ６、ＯｓＴＵＢ７、ＯｓＴＵＢ８については、ジベレリンとブラシノライド処理で発現量が増加し、特にジベレリン処理で発現量が顕著に増加することが明らかになった（図２）。
【００５０】
［実施例３］ チューブリンの組織特異性解析
チューブリン８種の組織特異性を解析するため、上記プローブを用いて、イネの各組織におけるｍＲＮＡの発現量をノーザンブロットで確認した（図３）。８種類全てにおいて葉身でほとんど発現していなかった。ＯｓＴＵＢ１、ＯｓＴＵＢ３、ＯｓＴＵＢ４、ＯｓＴＵＢ５、ＯｓＴＵＢ７はイネ葉鞘に特異的に発現していた。ＯｓＴＵＢ２は葉鞘とカルスに、ＯｓＴＵＢ６は葉鞘とカルスと葯に存在していた。さらに、ＯｓＴＵＢ８は葉鞘と比較して葯において１５倍の顕著な発現を示した。
【００５１】
［実施例４］ 全長ｃＤＮＡのクローニング
全長ｃＤＮＡをクローニングするためにイネの由来のｃＤＮＡ ライブラリーをスクリーニングすると同時に、さらにクローンテック社のＳＭＡＲＴ ＴＭ ＰＣＲ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 用いて、５’レース法で完全長ｃＤＮＡを単離した。ｃＤＮＡの塩基配列はアプライドバイオシステム社のシーケンサーを用いて決定した。
【００５２】
得られたＯｓＴＵＢ８の全長ｃＤＮＡは、１，５７２塩基からなり４４６アミノ酸をコードし、他のチューブリンとの相同性は約９０％であった。ＯｓＴＵＢ８は、ＤＤＢＪ等には登録されておらず新規のβチューブリン遺伝子であった（配列番号：１および２）。βチューブリンについて系統樹を作製したところ、ＯｓＴＵＢ８は他のβチューブリンと離れた位置を示した（図４）。
【００５３】
［実施例５］ ＯｓＴＵＢ８のプロモーター領域の同定
ＯｓＴＵＢ８は国際イネゲノム塩基配列プロジェクトが保有するイネゲノムバッククローン（ＡＣ１３９１７４）上に存在していることが相同検索の結果明らかになり、ＯｓＴＵＢ８の上流にプロモーター領域を含むと予想される上流 ２ ｋｂｐ が存在していることを確認した。見出されたＯｓＴＵＢ８のプロモーター領域の塩基配列を配列番号：３に示す。
【００５４】
【発明の効果】
本発明者により同定されたＯｓＴＵＢ８遺伝子は、他の組織と比較して、葯において顕著に高い発現を示すため、植物の発生・分化過程における葯特異的マーカーとしての利用が考えられる。植物において、ＯｓＴＵＢ８遺伝子の発現を抑制することにより、植物に雄性不稔性の形質を付与できる可能性がある一方、雄性不稔性の植物にＯｓＴＵＢ８遺伝子を導入することにより、稔性の付与を行える可能性がある。従って、ＯｓＴＵＢ８遺伝子は、植物の品種育成において利用価値があると考えられる。また、ＯｓＴＵＢ８遺伝子のプロモーターは、葯特異的活性を有すると考えられるため、任意の遺伝子を葯特異的に発現させる上で有用である。
【００５５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】８種類のβチューブリンのＣ末端側アミノ酸配列（上から順に、配列番号：４から１１に示した）の比較図とサザンブロットによる特異性の比較の写真を示す。８種類のβチューブリンはＣ末端側に特異的アミノ酸配列を持っているので、その配列を利用して、特異的プローブを作成した。
【図２】βチューブリンのホルモン特異性を示す写真である。特異的プローブを利用して各種ホルモン処理後のイネ葉鞘におけるｍＲＮＡの発現をノーザンブロットで確認した。Ｃ：無処理、ＧＡ：ジベレリン、ＢＬ：ブラシノライド、ＡＢＡ：アブシジン酸、ＩＡＡ：オーキシン、ＢＡ：サイトカイニン。ＯｓＴＵＡ２はαチューブリンを示す。
【図３】βチューブリンの組織特異性を示す写真である。特異的プローブを用いてイネの各組織におけるｍＲＮＡの発現量をノーザンブロットで確認した。Ｒ：根、ＬＳ：葉鞘、Ｌ：葉身、Ｎ：節、Ａ：葯、ＳＣ：培養細胞
【図４】βチューブリンの系統樹を示す図である。ＣｌｕｓｔａｌＷのソフトで解析した系統樹を示す。
Claims (17)
- 下記（ａ）から（ｄ）に記載の単離されたＤＮＡ。
（ａ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号２に記載されたアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸からなり、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、配列番号２に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ - 配列番号１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
- 請求項１に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
- 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、請求項１に記載のＤＮＡの発現を抑制させるＲＮＡをコードするＤＮＡ。
- 植物細胞における内在性の請求項１に記載のＤＮＡがコードするタンパク質に対してドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
- 請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項６に記載のベクターが導入された形質転換植物細胞。
- 請求項７に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
- 請求項８に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体。
- 請求項８または９に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
- 葯特異的にプロモーター活性を有する、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号３に記載された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号３に記載された塩基配列の１または複数の塩基が置換、欠失、挿入および／または付加された塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）配列番号３に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ - 請求項１１に記載のＤＮＡを含むベクター。
- 請求項１１に記載のＤＮＡの下流に任意の遺伝子が機能的に結合されている、請求項１２に記載のベクター。
- 請求項１３に記載のベクターを保持する形質転換植物細胞。
- 請求項１４に記載の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体。
- 請求項１５に記載の形質転換植物の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
- 請求項１５または請求項１６に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
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