JP2004269420A - 食中毒細菌不活化組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】オボムチンの酵素分解物を有効成分とする食中毒細菌不活化組成物を提供すること。
【解決手段】オボムチンをセリンプロティナーゼ、パパイン、メタロプロティナーゼ、トリプシン及びペプシンから選ばれる１種又は２種以上のプロテアーゼで反応したときの酵素分解物（平均分子量が、２．０ｋＤａ〜７０．０ｋＤａ）は、食中毒細菌（毒素原性大腸菌、病原性大腸菌、細胞侵入性大腸菌、ベロ毒素産生大腸菌、病原性ビブリオ細菌、赤痢菌、緑濃菌、シュードモナス・セパシィアから選ばれる１種又は２種以上の細菌）に対して、強力な不活化作用を示す。
【選択図】 なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、オボムチン酵素分解物を有効成分として含有する食中毒細菌不活化組成物に関する。さらに詳しくは、オボムチンを次のプロテアーゼ群（すなわちセリンプロティナーゼ、パパイン、メタロプロティナーゼ、トリプシン及びペプシン）から選ばれる１種又は２種以上のプロテアーゼの作用により酵素分解することで得られるオボムチン酵素分解物を有効成分として含有することを特徴とする食中毒細菌不活化組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年までに、多くの食品の保蔵技術、及び食品衛生思想が普及しているものの、世界的には食中毒の発生状況は好転していない。例えば、１９９０年の世界保健機構（ＷＨＯ）の統計によれば、世界中の全死亡者の１／３は感染症によるものである。その中でも急性呼吸器感染症、下痢症及び結核の死亡者が最も多く、これらの３疾患で、年間死亡者数が１０００万人に達していると言われている。
一方、近年の国際交通の増加と高速化により、人々の各国間の往来は益々頻繁になってきている。それに伴って、人の移動と共に広がる重大感染疾患の拡散が問題となっている。中でも旅行者下痢症と呼ばれる腸管感染症が、問題となってきている。この腸管感染症を引き起こす細菌としては、毒素原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ，ＥＴＥＣ）、病原性ビブリオ菌（コレラ菌、腸炎ビブリオ）及び赤痢菌などの細菌が知られている。
【０００３】
また、病原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ，ＥＰＥＣ）は、上記ＥＴＥＣと共に、発展途上国における乳幼児下痢症の原因菌として知られている。また、細胞侵入性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ，ＥＩＥＣ）は、赤痢菌と同様の病原性を有することが知られている。特に、ベロ毒素産生性大腸菌である病原性大腸菌Ｏ１５７は、我が国においても大きな問題となっている。
食中毒細菌感染予防対策としては、食品や調理器具・食品加工機器などからの感染を未然に防止することが第一である。しかしながら、細菌感染予防に効果がある薬剤及び組成物については、食品の調理器具等に使用する場合に、安全性の面から使用が制限されるものが多い。加えて、充分に有効かつ安全なものは知られていない。また、感染後の対策に、抗生物質などの薬剤を投与する場合には、副作用や耐性菌の出現等の問題がある。
【０００４】
ところで、本発明の出願人は、永年に渡って、タマゴ及びその成分の研究を鋭意継続しているものである。タマゴには多くの成分が含まれており、各成分について種々の効能が知られている。本発明は、そのような研究の一端からなされたものである。タマゴ成分の一つであるオボムチンには、従来より免疫不活作用（特開平９−４０６９６）や血中コレステロール低下作用（特開２０００−１６９５０）が知られている。
【特許文献１】特開平９−４０６９６号公報
【特許文献２】特開２０００−１６９５０号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、オボムチンの酵素分解物に対する細菌不活性化作用については、ほとんど調べられていなかった。
本発明は、上記した課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、オボムチンの酵素分解物を有効成分とする食中毒細菌不活化組成物を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段、発明の作用、及び発明の効果】
本発明者らは、鋭意検討した結果、オボムチンをプロテアーゼで処理することによって得られたオボムチン酵素分解物の一部が、食中毒細菌に対する不活化作用があることを見出し、基本的には本発明を完成するに至った。
オボムチンとは、鳥類の卵白に含まれるタンパク質の一部を意味している。一般的には、α−オボムチンとβ−オボムチンとの二種類のサブユニットで会合体を形成することで、卵白中に存在している。本発明におけるオボムチンの供給源としては特に限定されず、例えば、鳥類由来の卵白そのもの及びその抽出物、並びに遺伝子組換え技術を応用してオボムチンを発現・精製したものなどが例示される。但し、コスト及び入手の容易さ等の観点からすると、鶏卵由来の卵白（及びその抽出物）を用いることが好ましい。
【０００７】
本発明におけるオボムチン酵素分解物とは、オボムチンをプロテアーゼ処理により得られるものを指すが、好ましくは、食中毒細菌を不活化する効果の観点から、セリンプロティナーゼ、パパイン、メタロプロティナーゼ、トリプシン及びペプシンから選ばれる１種又は２種以上のプロテアーゼ処理に得られるものである。
本発明のセリンプロティナーゼとは、酵素番号（ＥＣ Ｎｕｍｂｅｒ）が、ＥＣ３．４．２１．１４３のプロテアーゼを意味しており、微生物からの抽出物、又は遺伝子組換え技術により生産されもの等を用いることができる。その由来は限定されないが、オボムチンの分解活性の強度の観点からすると、ＥＣ３．４．２１．１４のセリンプロティナーゼに分類されるプロティナーゼＫが好ましい。
【０００８】
本発明のパパインとは、酵素番号が、ＥＣ３．４．２２．２のプロテアーゼを意味しており、例えば、パイナップル・パパイヤ等の果実からの抽出物、又は遺伝子組換え技術により生産されたもの等を用いることができ、その由来は限定されない。
本発明のメタロプロティナーゼとは、酵素番号が、ＥＣ３．４．２４．４のプロテアーゼを意味しており、微生物からの抽出物、又は遺伝子組換え技術により生産されたもの等を用いることができる。その由来は限定されないが、オボムチンの分解活性の強度の観点からすると、ＥＣ３．４．２４．４のメタロプロティナーゼに分類され、ストレプトマイセス・グリセウスが産生するプロナーゼが好ましい。
【０００９】
本発明のトリプシンとは、酵素番号が、ＥＣ３．４．２１．４のプロテアーゼを意味しており、例えばウシ膵臓・ブタ膵臓等の臓器からの抽出物、又は遺伝子組換え技術により生産されたもの等を用いることができ、その由来は限定されない。
本発明のペプシンとは、酵素番号が、ＥＣ３．４．２３．１のプロテアーゼを意味しており、例えばウシ胃・ブタ胃等の臓器からの抽出物、又は遺伝子組換え技術により生産されたもの等を用いることができ、その由来は限定されない。
本発明において、食中毒細菌不活化組成物を得るためのオボムチンの酵素分解を得るための反応温度及びｐＨは、使用される酵素の至適作用範囲内であれば特に問題はない。また、処理時間及び酵素の量は、使用される酵素の比活性の強さに合わせて適宜選択できる。
【００１０】
本発明におけるオボムチン酵素分解物の平均分子量は、２．０ｋＤａ〜７０．０ｋＤａの範囲であり、好ましくは３．０ｋＤａ〜６５．０ｋＤａの範囲であり、さらに好ましくは３．５ｋＤａ〜６０．０ｋＤａの範囲である。また、オボムチン酵素分解物の平均分子量の測定方法は、生化学的に用いられる測定法であれば特に限定されず、例えばゲルろ過法、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法、及び超遠心法等が例示されるが、好ましくはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びゲルろ過法であり、最も好ましくはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法である。また、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法での測定方法は特に限定されないが、例えば、０．１％ＳＤＳを含む１０％アクリルアミド分離ゲルと３％固定ゲルを用いたＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０，１９７０年）等が挙げられる。ゲルろ過法での測定方法は特に限定されないが、例えば、カラム ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００（４．６ｍｍＩ．Ｄ．ｘ ３００ｍｍ，東ソー（株）製）を用い、移動層：０．１Ｍ リン酸緩衝液＋０．１Ｍ硫酸ナトリウム（ｐＨ６．７）、流速：０．３５ｍＬ／ｍｉｎ、温度：２５℃、検出波長：２２０ｎｍの条件で、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定することができる。
【００１１】
本発明において、食中毒細菌とは、下痢症及び腸炎等の疾病を引き起こす細菌を指し、好ましくは、サルモネラ属細菌を除く下痢症及び腸炎等の疾病を引き起こす細菌を指し、さらに好ましくは毒素原性大腸菌、病原性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ，ＥＰＥＣ）、細胞侵入性大腸菌（ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ，ＥＩＥＣ）、ベロ毒素産生大腸菌、病原性ビブリオ細菌、赤痢菌、緑濃菌、シュードモナス・セパシィア等を指し、最も好ましくは毒素原性大腸菌、ベロ毒素産生大腸菌及び病原性ビブリオ細菌を指す。
本発明において、食中毒細菌不活化とは、オボムチン酵素分解物が食中毒細菌の細胞の表面に結合することによって、細菌の増殖抑制作用及び毒素の産生抑制作用を示すことを意味している。また、食中毒細菌不活化の程度の測定は、顕微鏡、電気泳動法及び酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の手法により測定可能であり、その手法は特に限定されないが、好ましくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。
【００１２】
本発明の食中毒細菌不活化組成物は、単独で使用、または他の成分と併用して使用することができる。その形態としては、例えば溶液、粉末等が例示される。
粉末化の方法としては、熱風乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥等、通常の公知の粉末化方法を用いることができる。
本発明の食中毒細菌不活化組成物は、医薬、食品、飼料等に添加して使用することができる。例えば、（１）上記組成物をカプセル、錠剤、打錠品、洗口液等の形態として利用する、（２）生鮮野菜、鮮魚、蒲鉾、カスタードクリーム、漬物、ソーセージ、ハム、炊飯米、鶏卵加工品等の食品に対して、腐敗防止や殺菌を目的として利用する、（３）或いは、家畜や水産動物の疾病予防を目的とした飼料添加剤や動物医薬品としての利用、等が可能である。
【００１３】
また、食品調理用の機械、器具、包丁、まな板などの調理器具の殺菌、食品調理者の手指の消毒、及び室内殺菌などに用いることができる。その際、本発明の食中毒細菌不活化組成物を噴霧、または上記組成物を含有する液体を噴霧又は、この液体に対象物を浸漬することにより使用することができる。
これらの目的に使用する本発明の食中毒細菌不活化組成物の配合量は、特に限定されるものではないが、通常０．００５質量％以上、好ましくは０．０１質量％以上となるように、各種用途に応じてその使用量を適宜変える事ができる。
【００１４】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の一実施形態について詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１５】
＜実施例１＞ オボムチンの調製
約１５０００個の新鮮鶏卵を割卵し、分割器を用いて、卵黄および卵白部を分離し、卵白を回収した。得られた卵白の約５５０ｋｇに脱イオン水を加えて１０倍に希釈し、攪拌機で穏やかに５分間撹拌した後に、４℃で一晩静置した。デカンテーションで上層を除き、沈殿部を５回遠心洗浄（遠心加速度：５０００ｘＧ）した。更に、３％ＮａＣｌ溶液１００Ｌを添加して遠心洗浄（遠心加速度：５０００ｘＧ）を行い、リゾチームを除去した。最後に、脱イオン水１００Ｌを添加して遠心洗浄を行った後、沈殿部を凍結乾燥し、オボムチン約１．８ｋｇを得た。
【００１６】
＜実施例２＞ 食中毒細菌不活化組成物の調製１
実施例１により調製したオボムチン１００ｇと、セリンプロティナーゼ（シグマアルドリッチジャパン（株）製、プロテイナーゼＫ、トリティラチウム・アルブム由来）１０ｇとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）２０Ｌに溶解し、３７℃で反応させた。反応開始４、８、及び２０時間後に、それぞれセリンプロティナーゼ（プロテイナーゼＫ）を１０ｇ追加して加え、２４時間まで反応させた。２４時間後に反応溶液を１００℃の沸騰水中に５分間放置することで、分解反応を停止した。得られた反応液を遠心分離（１２０００ｘＧ、３０分）した後、蒸留水に対して透析した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、食中毒細菌不活化組成物７４ｇを得た（サンプル１）。
【００１７】
＜実施例３＞ 食中毒細菌不活化組成物の調製２
実施例１により調製したオボムチン１００ｇと、セリンプロティナーゼ（大和化成（株）製、プロチンＡ、バチルス・ズブチリス由来）４０ｇとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）２０Ｌに溶解し、３７℃で反応させた。反応開始４、８、及び２０時間後に、それぞれセリンプロティナーゼ（プロチンＡ）を４０ｇ追加して加え、２４時間まで反応させた。２４時間後に反応溶液を１００℃の沸騰水中に５分間放置することで、分解反応を停止した。得られた反応液を遠心分離（１２０００ｘＧ、３０分）した後、蒸留水に対して透析した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、食中毒細菌不活化組成物８５ｇを得た（サンプル２）。
【００１８】
＜実施例４＞ 食中毒細菌不活化組成物の調製３
実施例１により調製したオボムチン１００ｇと、パパイン（天野エンザイム（株）製、パパイン−Ｗ４０、パパイヤ由来）３０ｇとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０Ｌに溶解し、３７℃で反応させた。反応開始４、８、及び２０時間後に、それぞれパパインを３０ｇ追加して加え、２４時間まで反応させた。
２４時間後に反応溶液を１００℃の沸騰水中に５分間放置することで、反応を停止した。得られた反応液を遠心分離（１２０００ｘＧ、３０分）した後、蒸留水に対して透析した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、食中毒細菌不活化組成物８４ｇを得た（サンプル３）。
【００１９】
＜実施例５＞ 食中毒細菌不活化組成物の調製４
実施例１により調製したオボムチン１００ｇと、メタロプロティナーゼ（科研製薬（株）製、アクチナーゼＥ、ストレプトマイセス・グリセウス由来）４０ｇとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）２０Ｌに溶解し、３７℃で反応させた。反応開始４、８、及び２０時間後に、それぞれメタロプロティナーゼを４０ｇ追加して加え、２４時間まで反応させた。２４時間後の反応液を１００℃の沸騰水中に５分間放置することで、反応を停止した。得られた反応液を遠心分離（１２０００ｘＧ、３０分）した後、蒸留水に対して透析した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、食中毒細菌不活化組成物８０ｇを得た（サンプル４）。
【００２０】
＜実施例６＞ 食中毒細菌不活化組成物の調製５
実施例１により調製したオボムチン１００ｇと、トリプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ウシ膵臓由来、ＴｙｐｅＩ）３０ｇとを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２０Ｌに溶解し、３７℃で反応させた。反応開始４、８、及び２０時間後に、それぞれトリプシンを３０ｇ追加して加え、２４時間まで反応させた。２４時間後の反応液を１００℃の沸騰水中に５分間放置することで、反応を停止した。得られた反応液を遠心分離（１２０００ｘＧ、３０分）した後、蒸留水に対して透析した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、食中毒細菌不活化組成物８３ｇを得た（サンプル５）。
【００２１】
＜実施例７＞ 食中毒細菌不活化組成物の調製６
実施例１により調製したオボムチン１００ｇと、ペプシン（シグマアルドリッチジャパン（株）製、ブタ胃粘膜由来）３４ｇとを０．１５Ｎ塩酸２０Ｌに添加し、３７℃で反応させた。反応開始４、８、及び２０時間後に、それぞれペプシンを３４ｇ追加して加え、２４時間まで反応させた。２４時間後の反応液を１００℃の沸騰水中に５分間放置することで、反応を停止した。得られた反応液を遠心分離（１２０００ｘＧ、３０分）した後、蒸留水に対して透析した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、食中毒細菌不活化組成物７８ｇを得た（サンプル６）。
【００２２】
＜実施例８＞ チューインガムへの利用
ガムベース２０．０質量％、砂糖６０．０質量％、結晶ブドウ糖１８．９質量％、香料１．０質量％、及びサンプル１の０．１質量％からなるチューインガムを常法により作成した。
＜実施例９＞ 養豚用飼料への利用
脱脂粉乳３２．１質量％、小麦粉２９．９質量％、パン粉７．０質量％、大豆粕５．０質量％、魚粉５．０質量％、砂糖４．０質量％、ブドウ糖９．０質量％、油脂２．０質量％、ビタミン・ミネラル類３．０質量％、及びサンプル２の１．０質量％を混合し、常法により養豚用飼料を作成した。
【００２３】
＜実施例１０＞ ブロイラー用飼料への利用
トウモロコシ５８．０質量％、大豆粕１５．９質量％、ふすま５．０質量％、魚粉６．０質量％、アルファルファ３．０質量％、炭酸カルシウム７．０質量％、リン酸カルシウム１．６質量％、食塩０．４質量％、ビタミン・ミネラル類０．１質量％、大豆油２．０質量％、及びサンプル３の１．０質量％を混合し、常法によりブロイラー用飼料を作成した。
＜実施例１１＞ 養殖魚用飼料への利用
魚粉３．２ｋｇ、小麦グルテン０．５ｋｇ、デキストリン０．４ｋｇ、ビタミン・ミネラル類０．２５ｋｇ、セルロース０．１５ｋｇ、タラ肝油０．２５ｋｇ、及びサンプル４の０．０５ｋｇを混合し、湿式造粒後、乾燥し養殖魚用飼料５．０ｋｇを得た。
【００２４】
＜実施例１２＞ トローチ剤への利用
アラビアガム６．０質量％、ブドウ糖７２．０質量％、モノフルオロリン酸ナトリウム０．７質量％、ゼラチン１．０質量％、乳糖１９．０質量％、香料１．０質量％、サンプル５の１．５質量％、及びステアリン酸マグネシウム適量を混合し、常法によりトローチ剤を作成した。
＜実施例１３＞ 飲料への利用
果糖ぶどう糖液糖１５．０質量％、クエン酸０．２質量％、香料、着色料適量、及びサンプル６の０．１質量％を混合し、常法により飲料を作成した。
【００２５】
＜実施例１４＞ かまぼこへの利用
冷凍ヘイクすり身１ｋｇにサンプル１の０．５質量％を混合し、空ずりした後、食塩３０ｇを加え塩ずりし、澱粉３０ｇ及び水１００ｇを加えてねり上げ、成型した後、９０℃で３０分間加熱し、冷却してかまぼこを作成した。
＜実施例１５＞ 魚肉ソーセージへの利用
冷凍スケソウダラすり身１５０ｇ、マグロ挽肉６０ｇ、バレイショ澱粉３５ｇ、食塩２０ｇ、砂糖５ｇ、亜硝酸ナトリウム０．２ｇ、リン酸ナトリウム３ｇ、香辛料を適量加え、サイレントカッターで２分間混合した。これにサンプル２の１５ｇを加え、さらに３分間混合した。得られた混合物をフィルムケーシングに充填し、８５℃で６０分間の加熱を行い、魚肉ソーセージを得た。
【００２６】
＜実施例１６＞ 鶏卵加工品への利用
コーンサラダ油７４．０質量％、全卵液１５．０質量％、リンゴ酢５．０質量％、水２．３質量％、食塩２．０質量％、辛子粉０．５質量％、キサンタンガム０．２質量％、サンプル３の１．０質量％とした配合割合で、常法により、水中油型のドレッシングを調製した。
＜比較例１＞
実施例１により調製したオボムチン１００ｇと、メタロプロティナーゼ（科研製薬（株）製、アクチナーゼＥ、ストレプトマイセス・グリセウス由来）４０ｇとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）２０Ｌに溶解し、３７℃で反応させた。反応開始４、及び８時間後に、それぞれメタロプロティナーゼ４０ｇを追加して加え、１２時間まで反応させた。１２時間後の反応液を１００℃の沸騰水中に５分間放置することで、反応を停止した。得られた反応液を遠心分離（１２０００ｘＧ、３０分）した後、蒸留水に対して透析した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、比較品３３ｇを得た（比較品１）。
【００２７】
＜比較例２＞
実施例１により調製したオボムチン１００ｇと、メタロプロティナーゼ（科研製薬（株）製、アクチナーゼＥ、ストレプトマイセス・グリセウス由来）４０ｇとを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．４）２０Ｌに溶解し、３７℃で反応させた。反応開始４、８、２０及び３６時間後に、それぞれメタロプロティナーゼ４０ｇを追加して加え、４８時間まで反応させた。４８時間後の反応液を１００℃の沸騰水中に５分間放置することで、反応を停止した。得られた反応液を遠心分離（１２０００ｘＧ、３０分）した後、蒸留水に対して透析した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、比較品９２ｇを得た（比較品２）。
【００２８】
＜試験例１＞ 食中毒細菌不活化組成物の平均分子量の測定
実施例２〜実施例７で得られたサンプル１〜サンプル６の平均分子量と、比較例１及び比較例２で得られた比較品１及び比較品２の平均分子量とをそれぞれ測定した。平均分子量は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した。測定は、０．１％ＳＤＳを含む１０％アクリルアミド分離ゲルと３％固定ゲルを用いて、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０，１９７０年）に準じて行った。
その結果、サンプル１、サンプル２、サンプル３、サンプル４、サンプル５及びサンプル６の平均分子量は、それぞれ３９．２ｋＤａ、４０．７ｋＤａ、７．０ｋＤａ、６．３ｋＤａ、４．０ｋＤａ及び４．３ｋＤａであった。一方、比較品１及び２の平均分子量は、それぞれ８１．３ｋＤａ及び１．３ｋＤａであった。
【００２９】
＜試験例２＞ 食中毒細菌に対する不活化効果の測定
実施例２〜実施例７で得られたサンプル１〜サンプル６と、比較例１及び比較例２で得られた比較品１及び比較品２とが、食中毒細菌に対して示す不活化効果を９６ウェルのイムノプレートを用いた酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。
食中毒細菌として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７（ベロ毒素産生大腸菌）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ３１７０５（毒素原性大腸菌）及びＶｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（病原性ビブリオ細菌）の三種類の菌株を用いた。
【００３０】
まず、これらの菌体をＰＢＳに添加して、６６０ｎｍにおける吸光度が１．０となるように調製した菌体懸濁液を用いて菌体のビオチン化を行った。菌体懸濁液に、ビオチン化試薬であるＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ＰＩＥＲＣＥ社製）を１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、未反応のビオチン化試薬を除去するために、遠心分離（２８００ｘＧ、４℃、３０分間）で上清を除去後、沈殿菌体を３ｍＬのＰＢＳに懸濁し、再度遠心分離（２８００ｘＧ、４℃、３０分間）した。さらに上清除去後、沈殿菌体をＰＢＳに再懸濁し、遠心分離を２回行った後、遠心分離前の液量と同じ量のＰＢＳを加え、懸濁した菌体をビオチン化菌体とした。
【００３１】
サンプル１〜サンプル６、比較品１、及び比較品２をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬとなるように、０．１Ｍ炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解後、順次２倍希釈し、１００μＬづつ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）に分注し、４℃で１晩インキュベートした。また、ネガティブコントロールとしてゼラチン加水分解物（（株）ニッピ製、ＴｙｐｅＡ、平均分子量：０．９ｋＤａ）を分注し、ブランクとして０．１Ｍ炭酸−炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）を同様な方法で分注した。
インキュベート後、１０ｍＭリン酸緩衝液−０．１５Ｍ ＮａＣＬ（ｐＨ６．８、以下：ＰＢＳと略す）２００μＬで３回洗浄し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを２００μＬづつ９６ウェルプレートに分注し、室温で２時間ブロッキングした。ＰＢＳ２００μＬで３回洗浄後、ビオチン化菌体／ＰＢＳ懸濁液を１００μＬづつ分注し、室温で１時間インキュベートした。２００μＬのＰＢＳで３回洗浄後、菌体をウエルに固定するために、６０℃で１５分間プレートを乾燥した。プレートを自然冷却後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｚｙｍｅｄ社製）を１００μＬづつ分注し、室温で１時間インキュベートした。次に、２００μＬのＰＢＳで３回洗浄後、０．１％ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム／ジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．８）を１００μＬづつ分注し、室温でインキュベートした。５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を２０μＬづつ分注することで、アルカリフォスファターゼの反応を停止した後、マイクロプレートリーダー（東ソー（株）製、ＭＰＲ−４Ｉ型）を用いて、４０５ｎｍの吸光度を測定し、菌体に対する不活化効果を測定した。数値は、供試試料１００μｇ当たりの４０５ｎｍにおける吸光度で示した。上記試験の結果を表１に示した。
【００３２】
【表１】

表１に示したように、本発明の実施形態品であるサンプル１〜サンプル６は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７（ベロ毒素産生大腸菌）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ３１７０５（毒素原性大腸菌）及びＶ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（病原性ビブリオ細菌）といった食中毒細菌に対して、強い不活化効果を示した。
一方、比較品１及び比較品２は、ネガティブコントロールであるゼラチン加水分解物と同程度の値であり、食中毒細菌の不活化効果は認められなかった。
【００３３】
【発明の効果】
本発明の食中毒細菌不活化組成物は、食中毒の原因となっている細菌を不活化し、下痢症及び腸炎等の疾病の発生を抑制することが可能となる。また、本発明の食中毒細菌不活化組成物は、鳥類の卵白に含まれているオボムチンを酵素分解して得られるものであり、天然物由来であり安全性も高いことから、食品及び食品関連機器に対して極めて有効に利用することができる。

Claims (4)

1. オボムチン酵素分解物を有効成分とすることを特徴とする食中毒細菌不活化組成物。
2. 前記オボムチン酵素分解物が、セリンプロティナーゼ、パパイン、メタロプロティナーゼ、トリプシン及びペプシンから選ばれる１種又は２種以上のプロテアーゼの分解作用により得られるものであることを特徴とする請求項１に記載の食中毒細菌不活化組成物。
3. 前記オボムチン酵素分解物の平均分子量が、２．０ｋＤａ〜７０．０ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項１または請求項２のいずれかに記載の食中毒細菌不活化組成物。
4. 食中毒細菌が、毒素原性大腸菌、病原性大腸菌、細胞侵入性大腸菌、ベロ毒素産生大腸菌、病原性ビブリオ細菌、赤痢菌、緑濃菌、シュードモナス・セパシィアから選ばれる１種又は２種以上の細菌であることを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれかに記載の食中毒細菌不活化組成物。