JP2004267059A - 光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類の製造方法 - Google Patents
光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類の製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】医薬、農薬等の原料又は中間体として有用な光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類を、光学選択性に優れた新たな酵素により製造する方法を提供する。
【解決手段】２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属細菌、好ましくはゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ）由来の加水分解酵素を用いて、不斉加水分解反応を実施することにより、高純度の光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類を取得する。
【解決手段】２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属細菌、好ましくはゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ）由来の加水分解酵素を用いて、不斉加水分解反応を実施することにより、高純度の光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類を取得する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、農薬等の原料又は中間体として有用な光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を酵素により不斉加水分解し、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸及びその対掌体エステルを製造する方法について提案されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献１）。
【０００３】
その際使用する酵素として、特許文献１では、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来の細菌を起源とする酵素、特許文献２ではキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、及びサーモアナエロビューム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）属由来の細菌を起源とする酵素、特許文献３ではキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属由来の細菌を起源とする酵素、特許文献４ではアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ストレプトマセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来の細菌を起源とする酵素、並びにブタ肝臓、ブタ膵臓、及び牛腎臓を起源とする酵素、及び小麦を起源とする酵素、非特許文献１ではバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、及びストレプトマセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属由来の細菌を起源とする酵素が開示されている。
【０００４】
また、特許文献３では、光学選択性の向上を目的として、立体的に嵩高い芳香族アルコールと２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸によりエステル体を調製し、酵素の基質として使用することを提案している。
【０００５】
しかし、これらの酵素は、光学選択性が低いため、高純度の光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類を製造することができない。
【０００６】
従って、光学選択性に優れた新たな酵素による製造方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】
特表２０００−５０９２５４号公報
【０００８】
【特許文献２】
独国特許出願公開１９７２５８０２号明細書
【０００９】
【特許文献３】
特開平１１−７５８８９号公報
【００１０】
【特許文献４】
特開２０００−１４３９７号公報
【００１１】
【非特許文献１】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ， （１９９９），１０（４），６７９−８７
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、光学選択性に優れた新たな酵素による光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類の製造方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく、新たな酵素を探索した結果、驚くべきことに本反応を触媒することがこれまでに知られていない微生物から、光学選択性に優れた酵素を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、一般式（Ｉ）：
【化２】
（式中、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立して、置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基である。）で示される２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属細菌由来の加水分解酵素を用いて、不斉加水分解することを含む、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類の製造方法、である。一般式（Ｉ）の式中、Ｒ及びＲ’は、置換又は非置換の炭素原子数１〜４の炭化水素基であることが好ましい。
【００１５】
また、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属細菌が、ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ）であることが好ましい。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、 一般式（Ｉ）：
【化３】
（式中、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立して、置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基である。）で示される２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属細菌由来の加水分解酵素を用いて、不斉加水分解することを含む、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類の製造方法、である。
【００１７】
本発明において、加水分解反応の基質となる２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類は、種々の方法で合成されるが、例えば、Ｒａｍａｉａｈらの方法（Ｓｙｎｌｅｔｔ， １９９１， ６４３（１９９１年））やＤａｒｒａｌｌらの方法（Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９５１， ２３２９．
（１９５１年） ）に準じて行うことで合成される。
【００１８】
上記一般式（Ｉ）のＲがメチル基である、α−トリフルオロメチル乳酸エステルであれば、１，１，１−トリフルオロアセトン水溶液に、冷却下でシアン化ナトリウム水溶液を滴下した後、硫酸を添加して室温にて一昼夜、反応させることによってα−トリフルオロメチルラクトニトリルを合成し、次いで、これを硫酸等の強酸で加水分解することによりα−トリフルオロメチル乳酸を合成し、次いでこれを常法に従いエステル化することにより製造することができる。
【００１９】
一般式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類には、＊で示されるひとつの不斉炭素原子を不斉中心とする２種類の光学活性体が存在するが、本発明の方法に用いられる２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類はこれらの光学活性体をそれぞれ等量ずつ含むラセミ体であってもよいし、一方の光学活性体を過剰に含む光学活性な化合物であってもよい。
【００２０】
一般式（Ｉ）中において、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立して、置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基を示す。
【００２１】
具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基等の炭素原子数１〜８のアルキル基、ビニル基、プロペニル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基等の炭素原子数２〜８のアルケニル基、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等の炭素原子数２〜８のアルキニル基等が例示される。好ましくは炭素数１〜４のアルキル基である。
【００２２】
好ましくは、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立して、置換又は非置換の炭素原子数１〜４の炭化水素基である。
【００２３】
また、炭化水素基は分岐していても良い。さらには、炭素原子に結合する水素原子がハロゲン等の置換基で置換されていてもよい。
【００２４】
本発明において使用する加水分解酵素は、ゴングロネラ属細菌に由来する不斉加水分解酵素である。ゴングロネラ属細菌の中でもゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ）が好適に使用される。この菌種は公知の分譲機関より容易に入手することが可能である。さらに好適には、ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ） Ｒ−４６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１１０）が使用される。
【００２５】
ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ） Ｒ−４６６株は、本発明者らが新たに土壌中より分離したもので、上記寄託番号にて独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東一丁目１番１号 中央第６）に寄託されており、その生物学的性状は表１の通りである。
【００２６】
【表１】
また、これらの微生物を元に薬剤や紫外線等により変異操作を行い、変異酵素を取得することもできる。
【００２７】
さらには、本発明の酵素のアミノ酸配列を決定し、該アミノ酸配列に基づいて、本酵素をコードする遺伝子を通常の方法によりクローニングし、該遺伝子をプロモーターと連結した状態で適当な宿主細胞に導入した形質転換体が産生する酵素も使用することができる〈Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ〔Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕〉。
【００２８】
また、該遺伝子は適当なベクターに挿入され、宿主細胞へ導入することにより形質転換体を作成することができる。ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能なベクターであればよく、例えば宿主が大腸菌である場合には、大腸菌内で複製可能な市販のプラスミドやファージ等が利用できる。ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、通常の遺伝子工学的方法を用いることができ、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ． Ｉｎｃ． （１９８７））等の、通常の方法が挙げられる。
【００２９】
さらには、相同組換えを利用して宿主細胞の染色体に目的の遺伝子を挿入することにより計質転換体を作成することもできる。例えば、本酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片の両端に、宿主由来の染色体ＤＮＡ断片を結合してベクターに挿入し、これを宿主に導入する。これにより本酵素をコードする遺伝子が宿主の染色体に導入された形質転換体が得られる。
【００３０】
上記加水分解酵素を産生する微生物等は通常の方法により培養される。培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。
【００３１】
炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸又はその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。
【００３２】
窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキスやアミノ酸等の天然窒素源、及び／又はアンモニウム塩等が使用できる。
【００３３】
その他、微量成分として、無機塩、金属塩、ビタミン等が適宜添加される。
【００３４】
また、高い酵素活性を得るために、エステル結合あるいはアミド結合を持つ化合物等を酵素産生の誘導物質として培地に添加することも有効である。
【００３５】
そのような誘導物質としては、オリーブ油、トリブチリン等のトリグリセリド又は加水分解反応の際に使用する基質そのものが例示できる。
【００３６】
また、ベクターが導入された形質転換体の場合には、ベクターの有する選択マーカーに対応した選択剤、例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合にはアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等の抗生物質を培地に加えることができる。
【００３７】
培養は常法に従って行えばよく、例えば、好気条件下、ｐＨ４〜１０、温度１５〜４０℃の範囲にて６〜９６時間培養する。また、必要に応じて固体培養法も採用することができる。
【００３８】
本発明において、使用される加水分解酵素の使用形態は特に制限されず、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、菌体処理物等、種々の形態で用いることができる。
【００３９】
ここで菌体処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、またはアルカリ処理物等をいう。
【００４０】
さらに、上記のような種々の形態の酵素を、例えば、吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法、アルギン酸ゲル法等の公知方法により固定化して用いてもよい。
【００４１】
固定化して用いることにより、酵素活性が上昇する場合があり、更に反応終了後の酵素の分離及び回収が容易になる。
【００４２】
さらに、通常これら酵素は１種類用いるが、同様な能力を有する２種以上の酵素を混合して用いることも可能である。
【００４３】
微生物の培養物からの酵素精製法としては、通常一般の酵素の精製において使用される方法を適用することができ、例えば次のような方法を挙げることができる。
【００４４】
まず、微生物の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕方法、またはリゾチーム等の菌体溶菌酵素処理等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって本酵素を精製することができる。
【００４５】
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ＤＥＡＥ基、フェニル基、またはブチル基等を導入したセルロース、デキストランまたはアガロース等の樹脂担体が挙げられる。市販の担体充填済みカラムを用いることもでき、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
【００４６】
本酵素の精製操作の一例を示す。本酵素を産生する微生物の菌体を遠心分離により集めた後、例えば２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）等のバッファー液に懸濁する。これを超音波破砕機にて２０分間程度破砕処理し、得られた菌体破砕液を約１３０００×ｇで１５分間程度遠心分離した後、上清を回収してメンブレンフィルターにてろ過して不溶物を除去し、無細胞抽出液を調製する。こうして得られた無細胞抽出液を例えば Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（商品名、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に導入し、塩化ナトリウム直線濃度勾配によりカラムへの吸着物を順次を溶出させ溶出液を分画する。本酵素を含む画分を次いで、例えば Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ カラム（商品名、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に導入し、硫酸アンモニウム直線濃度勾配によりカラムへの吸着物を順次溶出させ溶出液を分画する。本酵素を含む画分を、さらに、限外ろ過膜等を用いて濃縮した後、例えばＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（６００ｍｍ×７．５ｍｍＩＤ）（商品名、東ソー社製）に導入し、例えば０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー等で溶出させ溶出液を分画することによって、本酵素を精製することができる。尚、本酵素を含む画分は、２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を不斉加水分解する能力を指標にして選抜することができる。
【００４７】
本発明において、２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類の不斉加水分解反応は、基質、酵素、反応溶媒を含む反応溶液を調製して反応を開始し、反応温度、ｐＨ等を制御しながら反応させる。
【００４８】
反応液の基質濃度は、０．１ 〜８０質量％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると０．５〜５０質量％の濃度で実施するのが好ましい。
【００４９】
反応液の酵素濃度は、その活性で適宜決定され、特に制限はないが、通常、微生物菌体換算で０．００１〜２０質量％であり、好ましくは ０．００５ 〜１０質量％である。
【００５０】
反応溶媒としては、通常、イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用する。また、水性媒体中へ有機溶媒を共存させることで、選択率、変換率、収率等が向上することも多いことから、有機溶媒の存在下、反応を実施しても良い。例えば、水性媒体中へ過飽和の有機溶媒を添加して２層系以上で反応を行っても良い。
【００５１】
有機溶媒としては、疎水性、親水性いずれの有機溶媒も使用できる。
【００５２】
例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｔ−アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。
【００５３】
反応液のｐＨは、用いる酵素の至適ｐＨに依存するが、一般的にはｐＨ３〜１１の範囲である。化学的加水分解反応による光学純度の低下及び収率の低下を抑制するためにｐＨ４〜９で反応を行うのが好ましい。また、反応が進行するに従いｐＨが低下してくるが、この場合は例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム水溶液等を添加して上記のｐＨ範囲に調整することが望ましい。
【００５４】
反応温度は化学的加水分解反応の抑制および用いる酵素の至適温度によって適宜決定されるもので特に制限はないが、０〜７０℃が好ましく、５〜５０℃がより好ましい。
【００５５】
反応時間は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜７２時間である。
【００５６】
上記の反応により、２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類が不斉加水分解され、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類が生成する。また、反応後の反応液には、加水分解により生成した光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類の対掌体エステル類が含まれている。
【００５７】
上記光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類及びその対掌体エステル類は、抽出、蒸留、昇華、カラム分離等通常の方法で反応混合液からの単離することができる。
【００５８】
例えば光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類は、上記抽出残液に硫酸、塩酸等の強酸を加えた後に、一般的な有機溶媒で抽出分離することができる。
【００５９】
一方、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類は、反応液のｐＨを中性付近に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル等のエステル類、ヘキサン、オクタン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等、一般的な有機溶媒により抽出分離することができる。
【００６０】
更に、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類は、通常の方法で加水分解することにより、光学活性を維持したまま光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類に変換することができる。
【００６１】
また、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類は、通常の方法でエステル化することにより光学活性を維持したまま２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類にすることができる。
【００６２】
光学純度の測定は、光学分割カラムを備えた高速液体クロマトグラフィーを使用することによりにより容易に測定することができる。
【００６３】
光学純度（エナンチオマー過剰率；％ｅ．ｅ．）は、一般的に、高速液体クロマトグラフィーによる（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類及び（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類の各ピーク面積から、以下の式によって算出することができる。
【００６４】
【式１】
Ｒ＞Ｓの場合：Ｒ体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ｒ−Ｓ／Ｒ＋Ｓ）×１００
Ｓ＞Ｒの場合：Ｓ体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ｓ−Ｒ／Ｒ＋Ｓ）×１００
Ｓ：（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸のピーク面積
Ｒ：（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸のピーク面積
【００６５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００６６】
〔実施例１〕
グルコース２０ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス １ｇ、蒸留水１Ｌ（ｐＨ７．０）からなる液体培地を調製し、三角フラスコに１００ｍｌづつ分注し、１２１ ℃で１５分間蒸気滅菌した。
【００６７】
次にその液体培地にゴルドナ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ） Ｒ−４６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１１０）を植菌し、３０℃で３日間振盪培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０） にて３回、洗浄した（１０℃以下）。
【００６８】
その洗浄菌体に０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）を加え、全量を１０ｇとし、菌体懸濁液を調製した。
【００６９】
この菌体懸濁液にラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸メチルエステル０．１ｇを加え、３０℃にて５時間、振盪しながら反応した。
【００７０】
反応液を遠心分離にて除菌後、分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および以下の分析条件にて高速液体クロマトグラフィーにて光学純度を分析したところ、収率４２％（ラセミ体基準の収率、以下同様）で９８％ｅｅ（Ｒ）α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７１】
＜分析条件＞
カラム： Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００（φ４．６×１５０ ｍｍ）
住化分析センター株式会社製
移動相：２ｍＭ ＣｕＳＯ４水溶液／２−プロパノール＝８５／１５
流速：１．０ ｍＬ／分
検出：ＵＶ ２３０ｎｍ
〔実施例２〕
実施例１と同様にして菌体懸濁液１０ｇを調製した。これにラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸メチルエステル１．０ｇを加え、３０℃にて２４時間、振盪しながら反応した。反応液を遠心分離にて除菌後、分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率４７％で９５％ｅｅ（Ｒ）α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７２】
〔実施例３〕
実施例１と同様にして菌体懸濁液１０ｇを調製した。これにラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸ｎ−ブチルエステル０．３ｇを加え、３０℃にて２時間、振盪しながら反応した。反応液を遠心分離にて除菌後、分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率１１％で９９％ｅｅ（Ｒ）α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７３】
〔実施例４〕
実施例１と同様にして菌体懸濁液１０ｇを調製した。これにラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸ｎ−ブチルエステル１．０ｇを加え、３０℃にて１８時間、振盪しながら反応した。反応液を遠心分離にて除菌後、分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率３８％で９６％ｅｅ（Ｒ）α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７４】
〔実施例５〕
実施例１に記載の方法で、洗浄菌体１２０ｇを得た。冷却下（１０℃以下）、その菌体を乳鉢ですりつぶし、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）で全量を２４０ｇとし、菌体破砕液を得た。
【００７５】
その菌体破砕液を遠心分離（１６，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）し、上清（２２８ｇ）を回収し、その上清に５０％飽和量の硫酸アンモニウムを溶解させた。
【００７６】
４℃で１８時間放置後、遠心分離（４℃，１５，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）により、沈殿物を除去し、上清にさらに７５％飽和量の硫酸アンモニウムを溶解させた。
【００７７】
４℃で１８時間放置後、同様に遠心分離により、沈殿を回収した。得られた沈殿を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）で透析し、粗酵素溶液を得た。
【００７８】
その粗酵素液に対して、１質量％になるよう、ラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸ｎ−ブチルエステルを加え、３０℃にて３時間、振盪しながら反応した。分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率５％で９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７９】
【発明の効果】
２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属細菌、好ましくはゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ）由来の加水分解酵素を用いて、不斉加水分解反応を実施することにより、高純度の光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類を取得することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、医薬、農薬等の原料又は中間体として有用な光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を酵素により不斉加水分解し、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸及びその対掌体エステルを製造する方法について提案されている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、非特許文献１）。
【０００３】
その際使用する酵素として、特許文献１では、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来の細菌を起源とする酵素、特許文献２ではキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、及びサーモアナエロビューム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）属由来の細菌を起源とする酵素、特許文献３ではキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属由来の細菌を起源とする酵素、特許文献４ではアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、ストレプトマセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、及びサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属由来の細菌を起源とする酵素、並びにブタ肝臓、ブタ膵臓、及び牛腎臓を起源とする酵素、及び小麦を起源とする酵素、非特許文献１ではバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、及びストレプトマセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属由来の細菌を起源とする酵素が開示されている。
【０００４】
また、特許文献３では、光学選択性の向上を目的として、立体的に嵩高い芳香族アルコールと２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸によりエステル体を調製し、酵素の基質として使用することを提案している。
【０００５】
しかし、これらの酵素は、光学選択性が低いため、高純度の光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類を製造することができない。
【０００６】
従って、光学選択性に優れた新たな酵素による製造方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【特許文献１】
特表２０００−５０９２５４号公報
【０００８】
【特許文献２】
独国特許出願公開１９７２５８０２号明細書
【０００９】
【特許文献３】
特開平１１−７５８８９号公報
【００１０】
【特許文献４】
特開２０００−１４３９７号公報
【００１１】
【非特許文献１】
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ， （１９９９），１０（４），６７９−８７
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、光学選択性に優れた新たな酵素による光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類の製造方法を提供することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく、新たな酵素を探索した結果、驚くべきことに本反応を触媒することがこれまでに知られていない微生物から、光学選択性に優れた酵素を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち本発明は、一般式（Ｉ）：
【化２】
【００１５】
また、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属細菌が、ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ）であることが好ましい。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明は、 一般式（Ｉ）：
【化３】
【００１７】
本発明において、加水分解反応の基質となる２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類は、種々の方法で合成されるが、例えば、Ｒａｍａｉａｈらの方法（Ｓｙｎｌｅｔｔ， １９９１， ６４３（１９９１年））やＤａｒｒａｌｌらの方法（Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １９５１， ２３２９．
（１９５１年） ）に準じて行うことで合成される。
【００１８】
上記一般式（Ｉ）のＲがメチル基である、α−トリフルオロメチル乳酸エステルであれば、１，１，１−トリフルオロアセトン水溶液に、冷却下でシアン化ナトリウム水溶液を滴下した後、硫酸を添加して室温にて一昼夜、反応させることによってα−トリフルオロメチルラクトニトリルを合成し、次いで、これを硫酸等の強酸で加水分解することによりα−トリフルオロメチル乳酸を合成し、次いでこれを常法に従いエステル化することにより製造することができる。
【００１９】
一般式（Ｉ）で示される２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類には、＊で示されるひとつの不斉炭素原子を不斉中心とする２種類の光学活性体が存在するが、本発明の方法に用いられる２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類はこれらの光学活性体をそれぞれ等量ずつ含むラセミ体であってもよいし、一方の光学活性体を過剰に含む光学活性な化合物であってもよい。
【００２０】
一般式（Ｉ）中において、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立して、置換又は非置換の炭素原子数１〜８の炭化水素基を示す。
【００２１】
具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基等の炭素原子数１〜８のアルキル基、ビニル基、プロペニル基、イソプロペニル基、ブテニル基、イソブテニル基等の炭素原子数２〜８のアルケニル基、エチニル基、プロピニル基、ブチニル基等の炭素原子数２〜８のアルキニル基等が例示される。好ましくは炭素数１〜４のアルキル基である。
【００２２】
好ましくは、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立して、置換又は非置換の炭素原子数１〜４の炭化水素基である。
【００２３】
また、炭化水素基は分岐していても良い。さらには、炭素原子に結合する水素原子がハロゲン等の置換基で置換されていてもよい。
【００２４】
本発明において使用する加水分解酵素は、ゴングロネラ属細菌に由来する不斉加水分解酵素である。ゴングロネラ属細菌の中でもゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ）が好適に使用される。この菌種は公知の分譲機関より容易に入手することが可能である。さらに好適には、ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ） Ｒ−４６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１１０）が使用される。
【００２５】
ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ） Ｒ−４６６株は、本発明者らが新たに土壌中より分離したもので、上記寄託番号にて独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東一丁目１番１号 中央第６）に寄託されており、その生物学的性状は表１の通りである。
【００２６】
【表１】
【００２７】
さらには、本発明の酵素のアミノ酸配列を決定し、該アミノ酸配列に基づいて、本酵素をコードする遺伝子を通常の方法によりクローニングし、該遺伝子をプロモーターと連結した状態で適当な宿主細胞に導入した形質転換体が産生する酵素も使用することができる〈Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ〔Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）〕〉。
【００２８】
また、該遺伝子は適当なベクターに挿入され、宿主細胞へ導入することにより形質転換体を作成することができる。ベクターとしては、宿主細胞内で複製可能なベクターであればよく、例えば宿主が大腸菌である場合には、大腸菌内で複製可能な市販のプラスミドやファージ等が利用できる。ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、通常の遺伝子工学的方法を用いることができ、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．１， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ． Ｉｎｃ． （１９８７））等の、通常の方法が挙げられる。
【００２９】
さらには、相同組換えを利用して宿主細胞の染色体に目的の遺伝子を挿入することにより計質転換体を作成することもできる。例えば、本酵素をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片の両端に、宿主由来の染色体ＤＮＡ断片を結合してベクターに挿入し、これを宿主に導入する。これにより本酵素をコードする遺伝子が宿主の染色体に導入された形質転換体が得られる。
【００３０】
上記加水分解酵素を産生する微生物等は通常の方法により培養される。培地としては、通常これらの微生物が生育し得るものであれば何れのものでも使用できる。
【００３１】
炭素源としては、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸又はその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類等を使用できる。
【００３２】
窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキスやアミノ酸等の天然窒素源、及び／又はアンモニウム塩等が使用できる。
【００３３】
その他、微量成分として、無機塩、金属塩、ビタミン等が適宜添加される。
【００３４】
また、高い酵素活性を得るために、エステル結合あるいはアミド結合を持つ化合物等を酵素産生の誘導物質として培地に添加することも有効である。
【００３５】
そのような誘導物質としては、オリーブ油、トリブチリン等のトリグリセリド又は加水分解反応の際に使用する基質そのものが例示できる。
【００３６】
また、ベクターが導入された形質転換体の場合には、ベクターの有する選択マーカーに対応した選択剤、例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合にはアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン等の抗生物質を培地に加えることができる。
【００３７】
培養は常法に従って行えばよく、例えば、好気条件下、ｐＨ４〜１０、温度１５〜４０℃の範囲にて６〜９６時間培養する。また、必要に応じて固体培養法も採用することができる。
【００３８】
本発明において、使用される加水分解酵素の使用形態は特に制限されず、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、菌体処理物等、種々の形態で用いることができる。
【００３９】
ここで菌体処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、トルエン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、またはアルカリ処理物等をいう。
【００４０】
さらに、上記のような種々の形態の酵素を、例えば、吸着法、ポリアクリルアミド法、含硫多糖ゲル法、アルギン酸ゲル法等の公知方法により固定化して用いてもよい。
【００４１】
固定化して用いることにより、酵素活性が上昇する場合があり、更に反応終了後の酵素の分離及び回収が容易になる。
【００４２】
さらに、通常これら酵素は１種類用いるが、同様な能力を有する２種以上の酵素を混合して用いることも可能である。
【００４３】
微生物の培養物からの酵素精製法としては、通常一般の酵素の精製において使用される方法を適用することができ、例えば次のような方法を挙げることができる。
【００４４】
まず、微生物の培養物から遠心分離等により菌体を集めた後、これを超音波処理、ダイノミル処理、フレンチプレス処理等の物理的破砕方法、またはリゾチーム等の菌体溶菌酵素処理等によって破砕する。得られた破砕液から遠心分離、メンブレンフィルターろ過等により不溶物を除去して無細胞抽出液を調製し、これを陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー等の分離精製方法を適宜用いて分画することによって本酵素を精製することができる。
【００４５】
クロマトグラフィーに使用する担体としては、例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）基、ＤＥＡＥ基、フェニル基、またはブチル基等を導入したセルロース、デキストランまたはアガロース等の樹脂担体が挙げられる。市販の担体充填済みカラムを用いることもでき、例えば、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（商品名、いずれもアマシャム ファルマシア バイオテク社製）、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷ（商品名、東ソー社製）等が挙げられる。
【００４６】
本酵素の精製操作の一例を示す。本酵素を産生する微生物の菌体を遠心分離により集めた後、例えば２０ｍＭビストリスプロパン（ｐＨ７．０）等のバッファー液に懸濁する。これを超音波破砕機にて２０分間程度破砕処理し、得られた菌体破砕液を約１３０００×ｇで１５分間程度遠心分離した後、上清を回収してメンブレンフィルターにてろ過して不溶物を除去し、無細胞抽出液を調製する。こうして得られた無細胞抽出液を例えば Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（商品名、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に導入し、塩化ナトリウム直線濃度勾配によりカラムへの吸着物を順次を溶出させ溶出液を分画する。本酵素を含む画分を次いで、例えば Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ カラム（商品名、アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に導入し、硫酸アンモニウム直線濃度勾配によりカラムへの吸着物を順次溶出させ溶出液を分画する。本酵素を含む画分を、さらに、限外ろ過膜等を用いて濃縮した後、例えばＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（６００ｍｍ×７．５ｍｍＩＤ）（商品名、東ソー社製）に導入し、例えば０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー等で溶出させ溶出液を分画することによって、本酵素を精製することができる。尚、本酵素を含む画分は、２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を不斉加水分解する能力を指標にして選抜することができる。
【００４７】
本発明において、２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類の不斉加水分解反応は、基質、酵素、反応溶媒を含む反応溶液を調製して反応を開始し、反応温度、ｐＨ等を制御しながら反応させる。
【００４８】
反応液の基質濃度は、０．１ 〜８０質量％の間で特に制限はないが、生産性等を考慮すると０．５〜５０質量％の濃度で実施するのが好ましい。
【００４９】
反応液の酵素濃度は、その活性で適宜決定され、特に制限はないが、通常、微生物菌体換算で０．００１〜２０質量％であり、好ましくは ０．００５ 〜１０質量％である。
【００５０】
反応溶媒としては、通常、イオン交換水、緩衝液等の水性媒体を使用する。また、水性媒体中へ有機溶媒を共存させることで、選択率、変換率、収率等が向上することも多いことから、有機溶媒の存在下、反応を実施しても良い。例えば、水性媒体中へ過飽和の有機溶媒を添加して２層系以上で反応を行っても良い。
【００５１】
有機溶媒としては、疎水性、親水性いずれの有機溶媒も使用できる。
【００５２】
例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、イソブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｔ−アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等を適宜使用できる。
【００５３】
反応液のｐＨは、用いる酵素の至適ｐＨに依存するが、一般的にはｐＨ３〜１１の範囲である。化学的加水分解反応による光学純度の低下及び収率の低下を抑制するためにｐＨ４〜９で反応を行うのが好ましい。また、反応が進行するに従いｐＨが低下してくるが、この場合は例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム水溶液等を添加して上記のｐＨ範囲に調整することが望ましい。
【００５４】
反応温度は化学的加水分解反応の抑制および用いる酵素の至適温度によって適宜決定されるもので特に制限はないが、０〜７０℃が好ましく、５〜５０℃がより好ましい。
【００５５】
反応時間は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜７２時間である。
【００５６】
上記の反応により、２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類が不斉加水分解され、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類が生成する。また、反応後の反応液には、加水分解により生成した光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類の対掌体エステル類が含まれている。
【００５７】
上記光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類及びその対掌体エステル類は、抽出、蒸留、昇華、カラム分離等通常の方法で反応混合液からの単離することができる。
【００５８】
例えば光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類は、上記抽出残液に硫酸、塩酸等の強酸を加えた後に、一般的な有機溶媒で抽出分離することができる。
【００５９】
一方、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類は、反応液のｐＨを中性付近に調整後、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類、酢酸エチル等のエステル類、ヘキサン、オクタン、ベンゼン、トルエン等の炭化水素類、塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等、一般的な有機溶媒により抽出分離することができる。
【００６０】
更に、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類は、通常の方法で加水分解することにより、光学活性を維持したまま光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類に変換することができる。
【００６１】
また、光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類は、通常の方法でエステル化することにより光学活性を維持したまま２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類にすることができる。
【００６２】
光学純度の測定は、光学分割カラムを備えた高速液体クロマトグラフィーを使用することによりにより容易に測定することができる。
【００６３】
光学純度（エナンチオマー過剰率；％ｅ．ｅ．）は、一般的に、高速液体クロマトグラフィーによる（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類及び（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類の各ピーク面積から、以下の式によって算出することができる。
【００６４】
【式１】
Ｒ＞Ｓの場合：Ｒ体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ｒ−Ｓ／Ｒ＋Ｓ）×１００
Ｓ＞Ｒの場合：Ｓ体の光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ｓ−Ｒ／Ｒ＋Ｓ）×１００
Ｓ：（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸のピーク面積
Ｒ：（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸のピーク面積
【００６５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００６６】
〔実施例１〕
グルコース２０ｇ、ペプトン５ｇ、酵母エキス １ｇ、蒸留水１Ｌ（ｐＨ７．０）からなる液体培地を調製し、三角フラスコに１００ｍｌづつ分注し、１２１ ℃で１５分間蒸気滅菌した。
【００６７】
次にその液体培地にゴルドナ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ） Ｒ−４６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１１０）を植菌し、３０℃で３日間振盪培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０） にて３回、洗浄した（１０℃以下）。
【００６８】
その洗浄菌体に０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）を加え、全量を１０ｇとし、菌体懸濁液を調製した。
【００６９】
この菌体懸濁液にラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸メチルエステル０．１ｇを加え、３０℃にて５時間、振盪しながら反応した。
【００７０】
反応液を遠心分離にて除菌後、分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および以下の分析条件にて高速液体クロマトグラフィーにて光学純度を分析したところ、収率４２％（ラセミ体基準の収率、以下同様）で９８％ｅｅ（Ｒ）α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７１】
＜分析条件＞
カラム： Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００（φ４．６×１５０ ｍｍ）
住化分析センター株式会社製
移動相：２ｍＭ ＣｕＳＯ４水溶液／２−プロパノール＝８５／１５
流速：１．０ ｍＬ／分
検出：ＵＶ ２３０ｎｍ
〔実施例２〕
実施例１と同様にして菌体懸濁液１０ｇを調製した。これにラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸メチルエステル１．０ｇを加え、３０℃にて２４時間、振盪しながら反応した。反応液を遠心分離にて除菌後、分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率４７％で９５％ｅｅ（Ｒ）α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７２】
〔実施例３〕
実施例１と同様にして菌体懸濁液１０ｇを調製した。これにラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸ｎ−ブチルエステル０．３ｇを加え、３０℃にて２時間、振盪しながら反応した。反応液を遠心分離にて除菌後、分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率１１％で９９％ｅｅ（Ｒ）α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７３】
〔実施例４〕
実施例１と同様にして菌体懸濁液１０ｇを調製した。これにラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸ｎ−ブチルエステル１．０ｇを加え、３０℃にて１８時間、振盪しながら反応した。反応液を遠心分離にて除菌後、分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率３８％で９６％ｅｅ（Ｒ）α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７４】
〔実施例５〕
実施例１に記載の方法で、洗浄菌体１２０ｇを得た。冷却下（１０℃以下）、その菌体を乳鉢ですりつぶし、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）で全量を２４０ｇとし、菌体破砕液を得た。
【００７５】
その菌体破砕液を遠心分離（１６，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）し、上清（２２８ｇ）を回収し、その上清に５０％飽和量の硫酸アンモニウムを溶解させた。
【００７６】
４℃で１８時間放置後、遠心分離（４℃，１５，０００ｒｐｍ，３０ｍｉｎ）により、沈殿物を除去し、上清にさらに７５％飽和量の硫酸アンモニウムを溶解させた。
【００７７】
４℃で１８時間放置後、同様に遠心分離により、沈殿を回収した。得られた沈殿を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）で透析し、粗酵素溶液を得た。
【００７８】
その粗酵素液に対して、１質量％になるよう、ラセミ体α−トリフルオロメチル乳酸ｎ−ブチルエステルを加え、３０℃にて３時間、振盪しながら反応した。分解されたα−トリフルオロメチル乳酸および光学純度を分析したところ、収率５％で９９％ｅｅ以上の（Ｒ）−α−トリフルオロメチル乳酸が得られた。
【００７９】
【発明の効果】
２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸エステル類を、ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属細菌、好ましくはゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ）由来の加水分解酵素を用いて、不斉加水分解反応を実施することにより、高純度の光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ酢酸類及びその対掌体エステル類を取得することができる。
Claims (9)
- 一般式（Ｉ）：
- 一般式（Ｉ）において、Ｒ及びＲ’はそれぞれ独立して、置換又は非置換の炭素原子数１〜４の炭化水素基を示すことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
- ゴングロネラ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ）属細菌が、ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ）である請求項１又は２記載の製造方法。
- ゴングロネラ・ブトレリ（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａ ｂｕｔｌｅｒｉ） Ｒ−４６６株（ＦＥＲＭ Ｐ−１９１１０）。
- 請求項４記載の菌株より取得した加水分解酵素。
- 請求項５記載の酵素をコードする遺伝子。
- 請求項６記載の遺伝子を含むベクター。
- 請求項７記載のベクターを含む形質転換体。
- 請求項８記載の形質転換体を培養することを含む加水分解酵素の製造方法。
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