JP2004121068A - 新規微生物、それを含有する環状炭化水素分解剤および該分解剤を用いた廃油処理方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】効率良く芳香族炭化水素を含む環状炭化水素を分解することのできる微生物を獲得すること、芳香族炭化水素を含む環状炭化水素分解剤を提供すること、および、該分解剤を用いた廃エンジンオイルの処理方法の提供。
【解決手段】ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、グラム陽性桿菌で、環状炭化水素分解活性を有することを特徴とする微生物、それを含有する環状炭化水素分解剤および該環状炭化水素分解剤を用いた廃油処理方法。
【選択図】 なし
【解決手段】ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、グラム陽性桿菌で、環状炭化水素分解活性を有することを特徴とする微生物、それを含有する環状炭化水素分解剤および該環状炭化水素分解剤を用いた廃油処理方法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な微生物、特に環状炭化水素分解性を有する微生物、それを含む環状炭化水素分解剤およびそれを用いた環状炭化水素含有物質の処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
内燃機関の潤滑に使用されるエンジンオイル中には、使用に伴い多環芳香族炭化水素が蓄積し、その蓄積量は走行距離に比例して増加することが知られている。多環芳香族炭化水素は、毒性、変異原性、発ガン性など、人体に対して有害な作用を示すことが報告されている。
エンジンオイルには、有機塩素系化合物が含まれるものもある。これを焼却処分した場合には、ダイオキシン類が発生する可能性がある。
このように、エンジンオイルの廃油には、多環芳香族炭化水素や発ガン性物質の他、ダイオキシン類発生につながる有機塩素系化合物を含むことから、焼却処分は不適当である。これに代わる安全な廃エンジンオイル処理法の確立が急務となっている。
従来から、このような廃油を微生物により分解除去しようとするバイオレメディエーションの多数の試みがなされており、短い炭素鎖を有する炭化水素分解菌は得られており、また、その分解は解明されている。しかしながら、芳香族炭化水素を含む環状炭化水素の分解菌によるバイオレメディエーションの実用化はいまだ達成されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、効率良く芳香族炭化水素を含む環状炭化水素を分解できる微生物を獲得すること、芳香族炭化水素を含む環状炭化水素分解剤を提供すること、および、該分解剤を用いた廃エンジンオイルの処理方法を提供する点にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、環状炭化水素、特に、廃エンジンオイルを効率的に分解する微生物を分離することに成功し、本発明を完成した。
本発明の環状炭化水素には、脂環式炭化水素、芳香族炭化水素および／又は多環芳香族炭化水素を含む。
本発明の第１は、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、グラム陽性桿菌で、生化学特性が、カタラーゼテスト陽性、硝酸塩還元能陽性、ピラジナミダーゼ陰性、ピロリドニルアリルアミダーゼ陰性、アルカリフォスファターゼ陽性、β−グルクロニダーゼ陰性、β−ガラクトシダーゼ陽性、α−グルコシダーゼ陰性、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ陰性、ウレアーゼ陰性、ゼラチン液化能陰性、エスクリン利用能陰性、グルコース利用能陰性、リボース利用能陰性、キシロース利用能陰性、マンニトール利用能陰性、マルトース利用能陰性、ラクトース利用能陰性、スクロース利用能陰性、グリコーゲン利用能陰性であり、環状炭化水素分解活性を有することを特徴とする微生物に関する。
本発明の第２は、配列番号１で示される１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を有する請求項１記載の微生物に関する。
本発明の第３は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８８０６で示されるゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）
ｓｐ．ＧＲ−００４株に関する。
本発明の第４は、請求項１〜３いずれか記載の微生物を含有することを特徴とする環状炭化水素分解剤に関する。
本発明の第５は、請求項４記載の環状炭化水素分解剤を用いることを特徴とする環状炭化水素含有物質の処理方法に関する。
本発明の第６は、前記環状炭化水素含有物質が廃エンジンオイルであることを特徴とする請求項５記載の環状炭化水素含有物質の処理方法に関する。
【０００５】
使用済みエンジンオイル中の難分解画分（ナフテン画分）をラパス等の方法で分離した〔Ａ．Ｌａｐａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３６，３１１０〜３１１５（１９９７）〕。その画分を次の組成を有する改変Ｗ培地の中に１重量％添加した。
＜改変Ｗ培地の組成＞
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２．０ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４ ０．２４６５ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２７８ｇ／ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ／ｌ
ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １４．３２０４ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５．４４３６ｇ／ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２０１ｇ／ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０．０００１５ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ／ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０００４ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００１４９ｇ／ｌ
ポリペプトン ０．５ｇ／ｌ
イースト エキス ０．２５ｇ／ｌ
蒸留水を加えて、全体で１ｌとした。
ｐＨ ７．０
【０００６】
次いで、上記改変Ｗ培地に兵庫県西宮市の甲子園球場から採取した土壌を０．１ｇ添加後、旺盛に生育する微生物を単コロニー分離した。次に、これら単コロニーをそれぞれ同様の培地に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養して濁度の高い明確な育成を示す菌株を分離し、ＧＲ−００４とした。
分離された本発明の菌株ＧＲ−００４について電子顕微鏡観察を行ったところ、０．５〜０．６×２．０〜３．０μｍの桿菌であった。
本発明の菌株ＧＲ−００４は、下記、実施例１に示した微生物の生化学的同定結果および実施例２に示した１６ＳｒＤＮＡの同定結果と併せてゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属すると判定した。そして、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する従来のゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） テラエ（ｔｅｒｒａｅ）とは生化学的同定結果と同一の結果を示したが、従来のゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） テラエ（ｔｅｒｒａｅ）で環状炭化水素分解活性を示す菌株は、全く知られていないことに対し、本菌株は環状炭化水素分解活性を示すことから、本株菌をゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属の新菌株として、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４と命名した。本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８８０６として寄託されている（寄託日平成１４年４月２日、平成１４年６月２８日記載事項変更届にて、微生物の識別のための表示を変更した。）。
【０００７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【０００８】
実施例１
本発明のＧＲ−００４株の生化学的同定を行った。各種試験は、Ｈｏｌｔ，Ｇ．，Ｋｒｉｅｇ，Ｎ．Ｒ．，Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．，Ｓｔａｌｅｙ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｔ．（ｅｄ．）：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（９版）Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９９４）に従って実施した。
同定結果を以下に示す。
グラム染色 ＋
形態 桿菌
カタラーゼテスト ＋
硝酸塩還元能 ＋
ピラジナミダーゼ −
ピロリドニルアリルアミダーゼ −
アルカリフォスファターゼ ＋
β−グルクロニダーゼ −
β−ガラクトシダーゼ ＋
α−グルコシダーゼ −
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ −
ウレアーゼ −
ゼラチン液化能 −
エスクリン利用能 −
グルコース利用能 −
リボース利用能 −
キシロース利用能 −
マンニトール利用能 −
マルトース利用能 −
ラクトース利用能 −
スクロース利用能 −
グリコーゲン利用能 −
同定結果 Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．
なお、上記テストにおいて「＋」は陽性、「−」は陰性を示す。
【０００９】
実施例２
本発明の菌株を、２５℃において、
ポリペプトン １０ｇ／ｌ（１％）
イースト エキス ５ｇ／ｌ（０．５％）
ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ（０．５％）
蒸留水を加えて、全体で１ｌとした。
ｐＨ ７．０
からなるＬＢ培地を用いて１日間培養した後、ゲノム抽出を行い、サーマルサイクラー（Ｔｅｍｐ・Ｔｒｏｎｉｃ，Ｇ Ｔｈｅｒｍｏｌｉｎｅ社製）でユニバーサルプライマー（２０Ｆ、１５１０Ｒ）を用いて１６ＳｒＤＮＡをコードする塩基配列をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅した。得られたＰＣＲ産物をＱ Ｉ Ａｑｕｉｃ ＴＭ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＩＡＧＥＮ社製）で精製することでテンプレートＤＮＡとした。テンプレートＤＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｐｒｅ−ｍｉｘｅｄ ｃｙｃｌｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（日立計測器サービス社製）を用いて、サイクルシークエンス ＰＣＲ法により、再度増幅した。サイクルシークエンス法の反応液組成は、
ＡＴＧＣ各ｒｅｇｅｎｔ ２μｍ
プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ） ２μｍ
テンプレート（Ｔｅｍｐｌａｔｅ） ４００〜６００ｍｇ
滅菌蒸留水 最終２５μｌ
であり、反応条件は、
【表１】
である。
サイクルシークエンス法により得られたサンプルを、エタノール沈殿により精製した。精製物の塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（ＳＱ ５０００Ｅ 日立計測器サービス社製）により解析し、塩基配列の決定をした。
ＤＮＡシークエンサーによって解析した結果、本発明菌株の１６ＳｒＤＮＡをコードする遺伝子は、配列番号１に示す１３４４ｂａｓｅの塩基対からなることが確認された。
【００１０】
本発明菌株の１６ＳｒＤＮＡと相同菌株上位５菌株の１６ＳｒＤＮＡの比較結果を表２に示す。
【表２】
この結果、本発明のＧＲ−００４株に関しては、ゴルドニア テラエ（Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｔｅｒｒａｅ）とは、９９％、９８％の相同性を示し、またゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）ｓｐ．とは９８％の相同性を示し、ＧＲ−００４株をゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．と同定することが可能となり、最終的に生化学的同定と併せてゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．であると判断し、かつ、従来ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．について、環状炭化水素分解活性を有することが知られていないことから、ＧＲ−００４株は新規な菌株であると判断し、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４とした。
【００１１】
実施例３
ここでは、本発明において用いた分解率を算出する方法について説明する。
クロロホルム・メタノール抽出法は、クロロホルムとメタノールを３：１の割合で混合液を作り、計測する培養液にクロロホルム−メタノール混合液を３０ｍｌ加え、よく攪拌する。次いで、３００ｍｌのクロロホルム−メタノール抽出用遠心チューブに入れる。４，０００×ｇで３０分間、温度２０℃で遠心分離する。上層の水層部分を除去し、中間層と下層を５０ｍｌの遠心チューブに移し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離する。上層と中間層を取り除き、下層のクロロホルム層をあらかじめ重量測定したシャーレに５ｍｌ入れ、室温で２４時間乾燥させる。クロロホルムを乾燥させ除去し終わったシャーレの重量を測定する。比較のために、菌株を植菌していないサンプルを用いこれをコントロールとした。
測定した数値を下記式に入れ分解率を求めた。
分解率（％）＝｛１−（サンプル乾燥重量／コントロール乾燥重量）｝×１００
【００１２】
ガスクロマトグラフィーによる分解率の算出方法は、サンプルをガスクロマトグラフィー解析し、クロマトグラムの総ピーク面積の減少量から分解率を算出した。分解率は次式から算出した。
分解率（％）＝｛１−（残存油分のピーク面積／コントロールのピーク面積）｝×１００
＜ガスクロマトグラフィー設定条件＞
ガスクロマトグラフィーはＨＩＴＡＣＨＩ Ｇ−３５００を用いた。
【００１３】
また、実験に使用した各培地の組成を下記に示す。
前培養の培地はすべてＬＢ培地を用いた。
使用済みエンジンオイル（廃油）の分解には改変Ｗ培地を用いた。
長鎖パラフィンの分解にはＷ培地を用いた。
長鎖ナフテン分解は改変Ｗ培地を用いた。
Ａ重油の分解は改変ＳＷ培地を用いた。
標品炭化水素の分解は改変Ｗ培地を用いた。
【００１４】
＜培地組成＞
ＬＢ培地は前記記載の通り。
Ｗ培地
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２．０ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４ ０．２４６５ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２７８ｇ／ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ／ｌ
ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １４．３２０４ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５．４４３６ｇ／ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２０１ｇ／ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０．０００１５ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ／ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０００４ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００１４９ｇ／ｌ
蒸留水を加えて、全体で１ｌとした。
ｐＨ ７．０
改変Ｗ培地は前記記載の通り。
【００１５】
改変ＳＷ培地
ＮＨ４ＮＯ３ １．２１２ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４ ０．２４６５ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２７８ｇ／ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ／ｌ
ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １４．３２０４ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５．４４３６ｇ／ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２０１ｇ／ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０．０００１５ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ／ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０００４ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００１４９ｇ／ｌ
ポリペプトン ０．５ｇ／ｌ
イースト エキス ０．２５ｇ／ｌ
蒸留水を加えて、全体で１ｌとした。
ｐＨ ７．０
【００１６】
実施例４ 〔使用済み自動車エンジンオイル（廃油）の分解〕
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変Ｗ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよび使用済み自動車エンジンオイル（廃油）を１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、７２時間振とう培養を行った。培養後、クロロホルム・メタノール抽出法により残存油分を抽出した。残存油の重量から実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。
ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４による７２時間後の使用済み自動車エンジンオイル（廃油）の分解率は５２．０％であった。
【００１７】
実施例５ （長鎖パラフィンの分解）
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコにＷ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよび長鎖パラフィンを０．１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、７２時間振とう培養を行った。培養後、クロロホルム・メタノール抽出法により残存油分を抽出した。残存油の重量から実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。
ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４による７２時間後の長鎖パラフィンの分解率は８８％であった。
【００１８】
実施例６ （長鎖ナフテンの分解）
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変Ｗ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよび長鎖ナフテンを１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、７２時間振とう培養を行った。培養後、クロロホルム・メタノール抽出法により残存油分を抽出した。残存油の重量から実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。
ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４による７２時間後の長鎖ナフテンの分解率は５２％であった。
【００１９】
実施例７ （Ａ重油の分解）
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変ＳＷ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよびＡ重油を１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、７２時間振とう培養を行った。培養後、ガスクロマトグラフィー解析した。クロマトグラムの総ピーク面積の減少量から分解率を算出した。実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４による７２時間後のＡ重油の分解率は２１．９％であった。ただし、この培養で、Ａ重油中の３０％程度の揮発性アルカン等が揮発したため、Ａ重油の分解率は、比較的揮発しにくい、または揮発しない成分の分解率を示している。
【００２０】
実施例８ （標品炭化水素の分解）
実施例３に記載したＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変Ｗ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよび標準パラフィンまたは標準ナフテンをそれぞれ０．１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、４８時間振とう培養を行った。培養後、クロロホルム・メタノール抽出法により残存油分を抽出しガスクロマトグラフィー解析した。クロマトグラムの総ピーク面積の減少から分解率を実施例３に示した式を用いて算出した。
【００２１】
実施例９ 〔エンジンオイル廃油分解についてのゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）ｓｐ．ＧＲ−００４と既知の炭化水素分解菌との比較〕
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間前培養した。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変Ｗ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよびエンジンオイル廃油１ｇを添加して、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間培養した。
培養後の残存油分をクロロホルム・メタノール抽出法で抽出し、残存油分の乾燥重量を測定した。菌株を植菌せずに同様に振とうしたものとの重量比から、実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。既知の炭化水素分解菌（登録菌株）についても同様の実験を実施しその分解率を算出した。その結果を以下に示す。
この結果、本発明のゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４は、既知の炭化水素分解菌（登録菌株）と比較して、非常に高いエンジンオイル廃油分解能を有することが明らかとなった。
【００２２】
【発明の効果】
本発明により、脂環式炭化水素、芳香族炭化水素および／又は多環芳香族炭化水素からなる環状炭化水素分解活性を有する微生物、該微生物を含有する環状炭化水素分解剤およびそれを用いる廃エンジンオイルの処理法を提供することができた。
【００２３】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な微生物、特に環状炭化水素分解性を有する微生物、それを含む環状炭化水素分解剤およびそれを用いた環状炭化水素含有物質の処理方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
内燃機関の潤滑に使用されるエンジンオイル中には、使用に伴い多環芳香族炭化水素が蓄積し、その蓄積量は走行距離に比例して増加することが知られている。多環芳香族炭化水素は、毒性、変異原性、発ガン性など、人体に対して有害な作用を示すことが報告されている。
エンジンオイルには、有機塩素系化合物が含まれるものもある。これを焼却処分した場合には、ダイオキシン類が発生する可能性がある。
このように、エンジンオイルの廃油には、多環芳香族炭化水素や発ガン性物質の他、ダイオキシン類発生につながる有機塩素系化合物を含むことから、焼却処分は不適当である。これに代わる安全な廃エンジンオイル処理法の確立が急務となっている。
従来から、このような廃油を微生物により分解除去しようとするバイオレメディエーションの多数の試みがなされており、短い炭素鎖を有する炭化水素分解菌は得られており、また、その分解は解明されている。しかしながら、芳香族炭化水素を含む環状炭化水素の分解菌によるバイオレメディエーションの実用化はいまだ達成されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、効率良く芳香族炭化水素を含む環状炭化水素を分解できる微生物を獲得すること、芳香族炭化水素を含む環状炭化水素分解剤を提供すること、および、該分解剤を用いた廃エンジンオイルの処理方法を提供する点にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、環状炭化水素、特に、廃エンジンオイルを効率的に分解する微生物を分離することに成功し、本発明を完成した。
本発明の環状炭化水素には、脂環式炭化水素、芳香族炭化水素および／又は多環芳香族炭化水素を含む。
本発明の第１は、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、グラム陽性桿菌で、生化学特性が、カタラーゼテスト陽性、硝酸塩還元能陽性、ピラジナミダーゼ陰性、ピロリドニルアリルアミダーゼ陰性、アルカリフォスファターゼ陽性、β−グルクロニダーゼ陰性、β−ガラクトシダーゼ陽性、α−グルコシダーゼ陰性、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ陰性、ウレアーゼ陰性、ゼラチン液化能陰性、エスクリン利用能陰性、グルコース利用能陰性、リボース利用能陰性、キシロース利用能陰性、マンニトール利用能陰性、マルトース利用能陰性、ラクトース利用能陰性、スクロース利用能陰性、グリコーゲン利用能陰性であり、環状炭化水素分解活性を有することを特徴とする微生物に関する。
本発明の第２は、配列番号１で示される１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を有する請求項１記載の微生物に関する。
本発明の第３は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８８０６で示されるゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）
ｓｐ．ＧＲ−００４株に関する。
本発明の第４は、請求項１〜３いずれか記載の微生物を含有することを特徴とする環状炭化水素分解剤に関する。
本発明の第５は、請求項４記載の環状炭化水素分解剤を用いることを特徴とする環状炭化水素含有物質の処理方法に関する。
本発明の第６は、前記環状炭化水素含有物質が廃エンジンオイルであることを特徴とする請求項５記載の環状炭化水素含有物質の処理方法に関する。
【０００５】
使用済みエンジンオイル中の難分解画分（ナフテン画分）をラパス等の方法で分離した〔Ａ．Ｌａｐａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３６，３１１０〜３１１５（１９９７）〕。その画分を次の組成を有する改変Ｗ培地の中に１重量％添加した。
＜改変Ｗ培地の組成＞
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２．０ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４ ０．２４６５ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２７８ｇ／ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ／ｌ
ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １４．３２０４ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５．４４３６ｇ／ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２０１ｇ／ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０．０００１５ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ／ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０００４ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００１４９ｇ／ｌ
ポリペプトン ０．５ｇ／ｌ
イースト エキス ０．２５ｇ／ｌ
蒸留水を加えて、全体で１ｌとした。
ｐＨ ７．０
【０００６】
次いで、上記改変Ｗ培地に兵庫県西宮市の甲子園球場から採取した土壌を０．１ｇ添加後、旺盛に生育する微生物を単コロニー分離した。次に、これら単コロニーをそれぞれ同様の培地に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養して濁度の高い明確な育成を示す菌株を分離し、ＧＲ−００４とした。
分離された本発明の菌株ＧＲ−００４について電子顕微鏡観察を行ったところ、０．５〜０．６×２．０〜３．０μｍの桿菌であった。
本発明の菌株ＧＲ−００４は、下記、実施例１に示した微生物の生化学的同定結果および実施例２に示した１６ＳｒＤＮＡの同定結果と併せてゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属すると判定した。そして、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属する従来のゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） テラエ（ｔｅｒｒａｅ）とは生化学的同定結果と同一の結果を示したが、従来のゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） テラエ（ｔｅｒｒａｅ）で環状炭化水素分解活性を示す菌株は、全く知られていないことに対し、本菌株は環状炭化水素分解活性を示すことから、本株菌をゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属の新菌株として、ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４と命名した。本菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８８０６として寄託されている（寄託日平成１４年４月２日、平成１４年６月２８日記載事項変更届にて、微生物の識別のための表示を変更した。）。
【０００７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【０００８】
実施例１
本発明のＧＲ−００４株の生化学的同定を行った。各種試験は、Ｈｏｌｔ，Ｇ．，Ｋｒｉｅｇ，Ｎ．Ｒ．，Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．，Ｓｔａｌｅｙ，Ｊ．Ｔ．，ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｔ．（ｅｄ．）：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（９版）Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃｏ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９９４）に従って実施した。
同定結果を以下に示す。
グラム染色 ＋
形態 桿菌
カタラーゼテスト ＋
硝酸塩還元能 ＋
ピラジナミダーゼ −
ピロリドニルアリルアミダーゼ −
アルカリフォスファターゼ ＋
β−グルクロニダーゼ −
β−ガラクトシダーゼ ＋
α−グルコシダーゼ −
Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ −
ウレアーゼ −
ゼラチン液化能 −
エスクリン利用能 −
グルコース利用能 −
リボース利用能 −
キシロース利用能 −
マンニトール利用能 −
マルトース利用能 −
ラクトース利用能 −
スクロース利用能 −
グリコーゲン利用能 −
同定結果 Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｓｐ．
なお、上記テストにおいて「＋」は陽性、「−」は陰性を示す。
【０００９】
実施例２
本発明の菌株を、２５℃において、
ポリペプトン １０ｇ／ｌ（１％）
イースト エキス ５ｇ／ｌ（０．５％）
ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ（０．５％）
蒸留水を加えて、全体で１ｌとした。
ｐＨ ７．０
からなるＬＢ培地を用いて１日間培養した後、ゲノム抽出を行い、サーマルサイクラー（Ｔｅｍｐ・Ｔｒｏｎｉｃ，Ｇ Ｔｈｅｒｍｏｌｉｎｅ社製）でユニバーサルプライマー（２０Ｆ、１５１０Ｒ）を用いて１６ＳｒＤＮＡをコードする塩基配列をＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により増幅した。得られたＰＣＲ産物をＱ Ｉ Ａｑｕｉｃ ＴＭ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＩＡＧＥＮ社製）で精製することでテンプレートＤＮＡとした。テンプレートＤＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅｐｒｅ−ｍｉｘｅｄ ｃｙｃｌｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（日立計測器サービス社製）を用いて、サイクルシークエンス ＰＣＲ法により、再度増幅した。サイクルシークエンス法の反応液組成は、
ＡＴＧＣ各ｒｅｇｅｎｔ ２μｍ
プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ） ２μｍ
テンプレート（Ｔｅｍｐｌａｔｅ） ４００〜６００ｍｇ
滅菌蒸留水 最終２５μｌ
であり、反応条件は、
【表１】
サイクルシークエンス法により得られたサンプルを、エタノール沈殿により精製した。精製物の塩基配列を、ＤＮＡシークエンサー（ＳＱ ５０００Ｅ 日立計測器サービス社製）により解析し、塩基配列の決定をした。
ＤＮＡシークエンサーによって解析した結果、本発明菌株の１６ＳｒＤＮＡをコードする遺伝子は、配列番号１に示す１３４４ｂａｓｅの塩基対からなることが確認された。
【００１０】
本発明菌株の１６ＳｒＤＮＡと相同菌株上位５菌株の１６ＳｒＤＮＡの比較結果を表２に示す。
【表２】
【００１１】
実施例３
ここでは、本発明において用いた分解率を算出する方法について説明する。
クロロホルム・メタノール抽出法は、クロロホルムとメタノールを３：１の割合で混合液を作り、計測する培養液にクロロホルム−メタノール混合液を３０ｍｌ加え、よく攪拌する。次いで、３００ｍｌのクロロホルム−メタノール抽出用遠心チューブに入れる。４，０００×ｇで３０分間、温度２０℃で遠心分離する。上層の水層部分を除去し、中間層と下層を５０ｍｌの遠心チューブに移し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離する。上層と中間層を取り除き、下層のクロロホルム層をあらかじめ重量測定したシャーレに５ｍｌ入れ、室温で２４時間乾燥させる。クロロホルムを乾燥させ除去し終わったシャーレの重量を測定する。比較のために、菌株を植菌していないサンプルを用いこれをコントロールとした。
測定した数値を下記式に入れ分解率を求めた。
分解率（％）＝｛１−（サンプル乾燥重量／コントロール乾燥重量）｝×１００
【００１２】
ガスクロマトグラフィーによる分解率の算出方法は、サンプルをガスクロマトグラフィー解析し、クロマトグラムの総ピーク面積の減少量から分解率を算出した。分解率は次式から算出した。
分解率（％）＝｛１−（残存油分のピーク面積／コントロールのピーク面積）｝×１００
＜ガスクロマトグラフィー設定条件＞
ガスクロマトグラフィーはＨＩＴＡＣＨＩ Ｇ−３５００を用いた。
また、実験に使用した各培地の組成を下記に示す。
前培養の培地はすべてＬＢ培地を用いた。
使用済みエンジンオイル（廃油）の分解には改変Ｗ培地を用いた。
長鎖パラフィンの分解にはＷ培地を用いた。
長鎖ナフテン分解は改変Ｗ培地を用いた。
Ａ重油の分解は改変ＳＷ培地を用いた。
標品炭化水素の分解は改変Ｗ培地を用いた。
【００１４】
＜培地組成＞
ＬＢ培地は前記記載の通り。
Ｗ培地
（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２．０ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４ ０．２４６５ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２７８ｇ／ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ／ｌ
ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １４．３２０４ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５．４４３６ｇ／ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２０１ｇ／ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０．０００１５ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ／ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０００４ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００１４９ｇ／ｌ
蒸留水を加えて、全体で１ｌとした。
ｐＨ ７．０
改変Ｗ培地は前記記載の通り。
【００１５】
改変ＳＷ培地
ＮＨ４ＮＯ３ １．２１２ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４ ０．２４６５ｇ／ｌ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２７８ｇ／ｌ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０１４７ｇ／ｌ
ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ １４．３２０４ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４ ５．４４３６ｇ／ｌ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．００２０１ｇ／ｌ
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ ０．０００１５ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ／ｌ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０００４ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．００１４９ｇ／ｌ
ポリペプトン ０．５ｇ／ｌ
イースト エキス ０．２５ｇ／ｌ
蒸留水を加えて、全体で１ｌとした。
ｐＨ ７．０
【００１６】
実施例４ 〔使用済み自動車エンジンオイル（廃油）の分解〕
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変Ｗ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよび使用済み自動車エンジンオイル（廃油）を１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、７２時間振とう培養を行った。培養後、クロロホルム・メタノール抽出法により残存油分を抽出した。残存油の重量から実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。
ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４による７２時間後の使用済み自動車エンジンオイル（廃油）の分解率は５２．０％であった。
【００１７】
実施例５ （長鎖パラフィンの分解）
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコにＷ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよび長鎖パラフィンを０．１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、７２時間振とう培養を行った。培養後、クロロホルム・メタノール抽出法により残存油分を抽出した。残存油の重量から実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。
ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４による７２時間後の長鎖パラフィンの分解率は８８％であった。
【００１８】
実施例６ （長鎖ナフテンの分解）
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変Ｗ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよび長鎖ナフテンを１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、７２時間振とう培養を行った。培養後、クロロホルム・メタノール抽出法により残存油分を抽出した。残存油の重量から実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。
ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４による７２時間後の長鎖ナフテンの分解率は５２％であった。
【００１９】
実施例７ （Ａ重油の分解）
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変ＳＷ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよびＡ重油を１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、７２時間振とう培養を行った。培養後、ガスクロマトグラフィー解析した。クロマトグラムの総ピーク面積の減少量から分解率を算出した。実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４による７２時間後のＡ重油の分解率は２１．９％であった。ただし、この培養で、Ａ重油中の３０％程度の揮発性アルカン等が揮発したため、Ａ重油の分解率は、比較的揮発しにくい、または揮発しない成分の分解率を示している。
【００２０】
実施例８ （標品炭化水素の分解）
実施例３に記載したＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間振とう培養を行ったものを前培養とした。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変Ｗ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよび標準パラフィンまたは標準ナフテンをそれぞれ０．１ｇ加え、３０℃、１２０ｒｐｍ、４８時間振とう培養を行った。培養後、クロロホルム・メタノール抽出法により残存油分を抽出しガスクロマトグラフィー解析した。クロマトグラムの総ピーク面積の減少から分解率を実施例３に示した式を用いて算出した。
実施例９ 〔エンジンオイル廃油分解についてのゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）ｓｐ．ＧＲ−００４と既知の炭化水素分解菌との比較〕
ＬＢ培地５ｍｌにゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ） ｓｐ．ＧＲ−００４を試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間前培養した。５００ｍｌの溝付きフラスコに改変Ｗ培地１００ｍｌ、前記前培養液１ｍｌおよびエンジンオイル廃油１ｇを添加して、３０℃、１２０ｒｐｍで７２時間培養した。
培養後の残存油分をクロロホルム・メタノール抽出法で抽出し、残存油分の乾燥重量を測定した。菌株を植菌せずに同様に振とうしたものとの重量比から、実施例３に示した式を用いて分解率を算出した。既知の炭化水素分解菌（登録菌株）についても同様の実験を実施しその分解率を算出した。その結果を以下に示す。
【００２２】
【発明の効果】
本発明により、脂環式炭化水素、芳香族炭化水素および／又は多環芳香族炭化水素からなる環状炭化水素分解活性を有する微生物、該微生物を含有する環状炭化水素分解剤およびそれを用いる廃エンジンオイルの処理法を提供することができた。
【００２３】
【配列表】
Claims (6)
- ゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）属に属し、グラム陽性桿菌で、生化学特性が、カタラーゼテスト陽性、硝酸塩還元能陽性、ピラジナミダーゼ陰性、ピロリドニルアリルアミダーゼ陰性、アルカリフォスファターゼ陽性、β−グルクロニダーゼ陰性、β−ガラクトシダーゼ陽性、α−グルコシダーゼ陰性、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ陰性、ウレアーゼ陰性、ゼラチン液化能陰性、エスクリン利用能陰性、グルコース利用能陰性、リボース利用能陰性、キシロース利用能陰性、マンニトール利用能陰性、マルトース利用能陰性、ラクトース利用能陰性、スクロース利用能陰性、グリコーゲン利用能陰性であり、環状炭化水素分解活性を有することを特徴とする微生物。
- 配列番号１で示される１６ＳｒＤＮＡの塩基配列を有する請求項１記載の微生物。
- 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８８０６で示されるゴルドニア（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）
ｓｐ．ＧＲ−００４株。 - 請求項１〜３いずれか記載の微生物を含有することを特徴とする環状炭化水素分解剤。
- 請求項４記載の環状炭化水素分解剤を用いることを特徴とする環状炭化水素含有物質の処理方法。
- 前記環状炭化水素含有物質が廃エンジンオイルであることを特徴とする請求項５記載の環状炭化水素含有物質の処理方法。
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