JP2004002313A - 抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤およびタンパク質中空ナノ粒子 - Google Patents
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Abstract
【課題】特定細胞または組織に対する抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤であって、動物実験により実際に治療効果が認められた薬剤、およびこの薬剤を用いる治療方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る薬剤は、粒子形成能を有するタンパク質（たとえば、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変され、さらに抗体を提示するように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質）からなる中空ナノ粒子に、疾患治療用の細胞導入物質（たとえば、癌治療用遺伝子である単純ヘルペスウィルス由来チミジンキナーゼ遺伝子）が包含されたものであって、さらに、上記の粒子表面に、特定の癌細胞表面に存在する分子を抗原として認識する癌特異的抗体などの抗体が提示されたものである。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明に係る薬剤は、粒子形成能を有するタンパク質（たとえば、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変され、さらに抗体を提示するように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質）からなる中空ナノ粒子に、疾患治療用の細胞導入物質（たとえば、癌治療用遺伝子である単純ヘルペスウィルス由来チミジンキナーゼ遺伝子）が包含されたものであって、さらに、上記の粒子表面に、特定の癌細胞表面に存在する分子を抗原として認識する癌特異的抗体などの抗体が提示されたものである。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤およびタンパク質中空ナノ粒子に関し、より詳細には、特定の細胞または組織に対する抗体などの生体認識分子が粒子表面に提示される一方、粒子内部には疾患治療用の細胞導入物質が包含されており、この細胞導入物質を特定細胞または組織内に特異的に導入可能な薬剤およびその薬剤に好適に利用できる粒子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。
【０００３】
また、最近の分子細胞生物学の分野においても特定細胞への遺伝子導入は必要不可欠な技術として盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展により各種疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある現在、このような細胞および組織に対する特異性の高い遺伝子導入法が確立されれば遺伝子治療の分野での応用も可能となる。
【０００４】
細胞に遺伝子を導入する方法としては、これまでに、遺伝子を巨大分子化してエンドサイトーシスによって遺伝子を取込ませる方法（リン酸カルシウム法、リポフェクタミン法）や、電気パルス刺激により細胞膜に穿孔を開け、遺伝子を流入させる方法（エレクトロポレーション法、遺伝子銃法）が知られており、いずれも今日では分子生物学的実験において、一般的に実施されている手法である。
【０００５】
これらの方法は簡便であるが、細胞を直接、物理的に傷つけ、遺伝子導入部位を外科的に露出させる必要があるため、生体内部の細胞や組織には容易に適用できない。また、１００％近い導入率を得ることは難しい。
【０００６】
一方、安全性の高い物質導入方法としてはリポソーム法が知られている。この方法は、細胞を傷つけることがないため、生体内部の細胞や組織にも適用することが可能である。しかし、単純な脂質であるリポソームに高度な細胞および組織特異性を付与することは困難であり、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子導入率は、要求される値に比べてはるかに低いという問題がある。
【０００７】
最近になって、ウィルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遺伝子導入を行う技術が開発された。この方法は導入部位を露出する必要がなく、個体にも応用でき、導入効率も１００％近い画期的な方法として注目されるが、ウィルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。また、ウィルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予期できぬ副作用を引き起こす可能性があるため、実際には疾病の初期治療等には用いられず、末期の患者に適用されるに留まっているのが現状である。
【０００８】
このように、従来の遺伝子導入方法は、いずれも、目的の細胞に対して特異的に遺伝子を送り込み、細胞内で薬剤となるタンパク質を発現させる方法としては不十分なものであった。他方、薬剤となるタンパク質を直接的に目的細胞、あるいは、目的組織に送り込む方法については、未だ有効な方法が開発されていない状況にある。
【０００９】
【特許文献１】
国際出願番号ＷＯ０１／６４９３０（出願日２００１年２月９日）
【００１０】
【特許文献２】
特開２００１−３１６２９８（公開日２００１年１１月１３日）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、国際出願番号ＷＯ０１／６４９３０の国際出願（以下、「国際出願ＷＯ０１／６４９３０」という、（特許文献１））および特許文献２において、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提案しているが、この方法を用いた特定細胞または組織に対する疾患（例えば癌）治療用の薬剤の開発等がさらなる課題となっていた。とりわけ、特定の癌細胞または癌組織などに対する特異的抗体を提示する薬剤の開発は以下のような問題を克服する上からも重要な課題の１つとなっていた。
【００１２】
従来、薬剤となるタンパク質を、目的とする細胞や組織に特異的かつ安全に運搬、導入することが困難であったため、このようなタンパク質薬剤を用いた治療は患者に大きな負担を与えていた。
【００１３】
例えば、ウィルス性肝炎（特にＣ型肝炎）の治療には、静脈注射により、タンパク質薬剤であるインターフェロンを長期間全身投与する方法をとっている。この方法は、高い治療効果が認められるものの、患部以外にもインターフェロンが作用するため、投与のたびに高熱、脱毛、虚脱感、免疫反応などの副作用がおきるという問題を有している。
【００１４】
また、肝細胞成長因子は肝硬変治療に有効であることが分かっているが、静脈注射で全身投与すると、予測できない副作用が起こる可能性があるので、カテーテルにより肝臓に直接投与する方法を採用している。しかし、カテーテルによる投与のためには、手術が必要であり、長期間の治療では患者に負担がかかっていた。
【００１５】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、抗体などの生体認識分子を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いた目的の細胞や組織に特異的に作用する治療薬剤であって、動物実験により実際に治療効果が認められた薬剤、およびこの薬剤を用いた治療方法、さらにはこれらに用いる中空ナノ粒子を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を複数作製することに成功し、さらに、このうちヒト扁平上皮癌細胞に対する特異的な抗体を提示する中空ナノ粒子に癌治療遺伝子を包含させた薬剤を、実験動物に対して静脈注射により投与したところ、実際に移植癌を治療する効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
即ち、本発明に係る薬剤は、特定の細胞または組織に対する抗体が提示され、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、疾患治療用の細胞導入物質が包含されてなる薬剤である。
【００１８】
上記「粒子形成能を有するタンパク質」としては、たとえば本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変され、さらに抗体を提示するように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。こうして得られた中空ナノ粒子は、粒子表面に抗体が提示されているので、特定の細胞または組織に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。ここで、「特定の細胞または組織」とは、上記抗体に対する抗原を細胞表面に有しているため、抗体と抗原との結合を介して、上記中空ナノ粒子内の物質が細胞内に導入され得る細胞、またはこのような細胞から構成されることで同物質が組織内に導入され得る組織をいう。
【００１９】
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質のｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１，ｐｒｅＳ２）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を果たしている。したがって、ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失するように改変すれば、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変することができる。これにより、肝細胞以外の細胞や臓器へも、その内部の物質を導入することができる。
【００２０】
ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失させて肝細胞に対する感染能を欠失するように改変する場合、欠失させるアミノ酸領域によって、真核細胞での改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質の発現量が異なる。このタンパク質の真核細胞での発現量は、抗体を提示するように改変した場合に、特に、低下する傾向にある。
【００２１】
したがって、後述の実施例に示すように、真核細胞での発現量を多くするためには、ｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１ｐｒｅＳ２領域）の全アミノ酸配列のうち、血清型ｙタイプの場合は、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変することが好ましく、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変することがより好ましい。一方、血清型ｄタイプの場合は、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変することが好ましく、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から６１番目〜１６４番目のアミノ酸を欠失するように改変することがより好ましい。
【００２２】
これにより、肝細胞に対する感染能を欠失し、さらに抗体を提示するように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質が、真核細胞で大量に発現する。その結果、このタンパク質内の物質が特定の細胞または組織により多く運ばれるので、その物質による治療効果を飛躍的に上昇させることができる。
【００２３】
上記抗体としては、癌特異的抗体または抗ウィルス性タンパク質抗体が挙げられる。例えば、癌特異的抗体を提示した中空ナノ粒子に、癌を治療するための物質（薬剤）を包含させることにより、癌細胞に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治療薬となる。他方、抗ウイルス性タンパク質抗体を提示させた場合は、ウィルス感染細胞の除去に有効である。
【００２４】
上記抗体としては、一本鎖抗体と二本鎖抗体とが挙げられる。二本鎖抗体は、その構造に起因して粒子形成能を有するタンパク質と直接融合したかたちで粒子表面に提示させることが困難である。そこで、本発明者らは、この二本鎖抗体を上記タンパク質に間接的に結合させることにより、中空ナノ粒子の表面に提示させることに成功した。具体的には、上記タンパク質に、上記二本鎖抗体の持つＦｃ部位と特異的に結合するＺＺタグを導入（融合）し、このＺＺタグと上記Ｆｃ部位とを結合させることにより、二本鎖抗体を粒子表面に提示させることができる。また、上記タンパク質に、ストレプトアビジン（またはその誘導体）と特異的に結合するストレプトタグを導入（融合）し、このストレプトタグとストレプトアビジン（またはその誘導体）とを結合させ、さらに、ストレプトアビジン（またはその誘導体）と特異的に結合するビオチンで修飾した二本鎖抗体を結合させることにより、抗体を粒子表面に提示させることができる。他方、一本鎖抗体は、上記タンパク質と直接融合したかたちで発現させることにより、粒子表面に提示させることができる。
【００２５】
抗体を粒子表面に提示させる方法としては、上記各方法以外に、一般的な化学修飾による抗体と粒子との結合法も可能である。
【００２６】
また、上記タンパク質からなる中空ナノ粒子は、真核細胞で発現させることにより得られるものであることが好ましく、この真核細胞には、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物等の動物細胞が挙げられる。
【００２７】
上記中空ナノ粒子内に包含させる細胞導入物質としては、たとえば癌治療用の遺伝子を挙げることができる。癌治療用遺伝子として、単純ヘルペスウィルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ ｔｋ）遺伝子を包含した薬剤を用いる場合は、後述の実施例に示すとおり、別途ガンシクロビルを投与する。
【００２８】
本発明の薬剤は、静脈注射という簡便な方法で特定の細胞および組織における疾患を効果的に治療することができ、従来の疾患の治療方法と大きく異なり、多量の薬剤の投与あるいは遺伝子治療等における外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【００２９】
本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与することによる疾患の治療方法である。
【００３０】
本発明の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有し、かつ、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変された血清型ｙタイプのＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなることを特徴とし、好ましくは、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変されていることを特徴としている。
【００３１】
本発明の別の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有し、かつ、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変された血清型ｄタイプのＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなることを特徴とし、好ましくは、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から６１番目〜１６４番目のアミノ酸を欠失するように改変されていることを特徴としている。
【００３２】
このような中空ナノ粒子は、真核細胞において特に発現量が多く、生体認識分子提示に適しており、例えば、遺伝子治療やＤＤＳなどに用いる中空バイオナノ粒子として利用することができる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明の薬剤を構成する中空ナノ粒子は、生体認識分子（換言すれば、特定の細胞を認識する分子）として粒子表面に抗体が提示され、粒子内部に疾患治療用の細胞導入物質が包含されることによって、目的細胞あるいは目的組織に特異的に物質を運搬することができる。上記中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質から形成することができ、このような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）表面抗原タンパク質等が例示される。
【００３４】
また、このような粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出されるのである。このとき、真核細胞としては、酵母、昆虫細胞、または哺乳細胞等の動物細胞などが適用できる。
【００３５】
本発明者らは、後述の実施例に示すとおり、遺伝子組換え酵母で上記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質を発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２６７， Ｎｏ．３， １９５３−１９６１， １９９２）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムを全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、上記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質を、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変し、さらに抗体（たとえば癌特異的抗体）を粒子表面に提示するように改変して発現させた場合は、抗体を粒子表面に提示しているため、その抗体に対する抗原を細胞表面に有する細胞または組織（癌特異的抗体を提示させた場合は、癌細胞または癌組織）に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。
【００３６】
ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質のｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１，ｐｒｅＳ２）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を果たしている（図１参照）。したがって、ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失するように改変すれば、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変することができる。ここで、「ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失」とは、ｐｒｅＳ１領域のアミノ酸の一部、ｐｒｅＳ２領域のアミノ酸の一部、または両方の領域のアミノ酸の一部を欠失させることを意味する。例えば、ヒト肝細胞認識部位として知られているｐｒｅＳ領域（より詳細にはｐｒｅＳ１領域）のＮ末端から３番目〜６６番目（血清型ｙタイプ）または４番目〜７７番目（血清型ｄタイプ）のアミノ酸を欠失させることによって、肝細胞に対する感染能を欠失することができる。
【００３７】
ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の少なくとも一部を欠失させて肝細胞に対する感染能を欠失するように改変する場合、欠失させるアミノ酸領域によって、真核細胞での改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質の発現量が異なる。このタンパク質の真核細胞での発現量は、抗体を提示するように改変した場合に、特に、低下する傾向にある。
【００３８】
そこで、後述の実施例に示すように、ｐｒｅＳ領域のアミノ酸をドメイン単位で欠失させることによって、改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を真核細胞で大量に発現させることができる。具体的には、前述のようにヒト肝細胞認識部位として知られているｐｒｅＳ１領域のＮ末端から３番目〜６６番目（血清型ｙタイプ）または４番目〜７７番目（血清型ｄタイプ）のアミノ酸を欠失させることによって、真核細胞での発現量を多くすることができる。なお、血清型ｙタイプの場合は、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変、血清型ｄタイプの場合は、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変すればよい。
【００３９】
さらに、発現量を多くするには、ｐｒｅＳ１領域中の上記ヒト肝細胞認識部位の一部のアミノ酸に加えて、ｐｒｅＳ２領域のアミノ酸の一部を欠失させることが好ましい。
【００４０】
より詳細には、ｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２領域）の全アミノ酸配列のうち、血清型ｙタイプの場合は、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変することが好ましく、さらに、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変することがより好ましい。例えば、血清型ｙタイプの場合、後述の実施例に示すように、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１５３番目のアミノ酸からドメイン単位でアミノ酸を欠失させた、５０番目〜１５３番目、３３番目〜１５３番目、および２１番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変することがより好ましく、このうち５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変することが特に好ましい。なお、アミノ酸を欠失させる範囲は、これに限定されるものではない。
【００４１】
一方、血清型ｄタイプの場合は、ｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２領域）の全アミノ酸配列のうち、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から６１番目〜１６４番目のアミノ酸を欠失するように改変することが好ましく、さらに、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変することがより好ましい。
【００４２】
このようにして、肝細胞に対する感染能を欠失し、さらに抗体を提示するように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は、真核細胞で大量に発現するので生産性において非常に有利である。その結果、このタンパク質内の物質が特定の細胞または組織により多く運ばれるので、その物質による治療効果を飛躍的に上昇させることができる。
【００４３】
このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。
【００４４】
一方、昆虫細胞は、遺伝子組換え酵母よりも高等動物に近い真核細胞であるといえ、酵母では再現しきれない糖鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞の系はバキュロウイルスを用いた系で、ウイルス発現を伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテアーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があった。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培地中に含まれる大量の牛胎仔血清が混入することで、折角培地中に分泌されても精製が困難であった。しかし、最近になって、バキュロウイルスを介さない昆虫細胞系で、無血清培養可能なものがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により開発され、市販されている。従って、このような昆虫細胞を用いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタンパク質粒子が得られる。
【００４５】
本発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以上のような種々の方法によって得られた粒子表面に抗体を提示し、種々の物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ぺプチド、および薬剤等）を粒子内に導入することにより、その抗体に対応する抗原を細胞表面に有する細胞に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。
【００４６】
もちろん、粒子形性能を有するタンパク質は、上記の改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。例えば、粒子形成能を有するタンパク質としては、国際出願ＷＯ０１／６４９３０に開示される抗原性を減少させたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であってもよいし、同国際出願に開示される他の改変型タンパク質（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、遺伝子操作技術を用いて改変したタンパク質）であってもよい。
【００４７】
上記の粒子表面に提示する抗体としては、特定の細胞表面に存在する分子を抗原として認識するものであれば特に限定されるものではなく、たとえば特定の癌細胞表面に存在する分子を抗原として認識する癌特異的抗体、特定の細胞表面に存在する成長因子受容体やサイトカイン受容体などのレセプターを抗原として特異的に認識する抗体、その他の細胞表面抗原、組織特異的抗原等に対する抗体などが例示される。より具体的には、後述の実施例において使用した各抗体のほかに、抗ウィルス性タンパク質抗体などが挙げられる。このうち、どの抗体を提示させるかは、目的とする細胞あるいは組織に応じて適宜選択すればよい。
【００４８】
本発明では、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子に、目的の細胞あるいは組織に導入したい物質（細胞導入物質）を内包させることによって、細胞特異性を有する物質運搬体（薬剤）が得られる。この物質運搬体に内包される細胞導入物質とは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレオチド、ぺプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物など、どのようなものであってもよい。
【００４９】
具体的には、既に発明者らにより報告されたヒトＲＮａｓｅ１（Ｊｉｎｎｏ Ｈ， Ｕｅｄａ Ｍ， Ｏｚａｗａ Ｓ， Ｉｋｅｄａ Ｔ， Ｅｎｏｍｏｔｏ Ｋ， Ｐｓａｒｒａｓ Ｋ， Ｋｉｔａｊｉｍａ Ｍ， Ｙａｍａｄａ Ｈ， Ｓｅｎｏ Ｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． １９９６；５８（２１）：１９０１−８）またはＲＮａｓｅ３（別名ＥＣＰ：ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ；Ｍａｌｌｏｒｑｕｉ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｇ， Ｐｏｕｓ Ｊ， Ｐｅｒａｃａｕｌａ Ｒ， ＡｙｍａｍｉＪ， Ｍａｅｄａ Ｔ， Ｔａｄａ Ｈ， Ｙａｍａｄａ Ｈ， Ｓｅｎｏ Ｍ， ｄｅ Ｌｌｏｒｅｎｓ Ｒ， Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ ＦＸ， ＣｏｌｌＭ； Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０００ Ｊｕｌ ２８；３００（５）：１２９７−３０７．）等が適用される。
【００５０】
これらのタンパク質は、細胞内外で作用し細胞傷害活性を有するものであるが、これらのＲＮａｓｅを本発明の物質運搬体（薬剤）に内包させて運搬することにより、細胞外では無毒化する一方、細胞内だけで作用させることができるので、より副作用の少ない新しい癌治療方法として期待される。
【００５１】
なお、上記細胞導入物質として、ほかに下記表１に示すタンパク質あるいは当該タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、さらに、癌抑制遺伝子類（ｐ５３等）や、インターフェロン類、インターロイキン類、サイトカイン類、コロニー刺激因子類、腫瘍壊死因子類、トランスフォーミング増殖因子β類、血小板由来増殖因子類、エリスロポイエチン類、Ｆａｓ抗原類などのタンパク質あるいは当該タンパク質をコードする遺伝子も挙げることができる。
【００５２】
【表１】
【００５３】
また、これらの細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に導入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクトロポレーション法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。
【００５４】
そして、これらのタンパク質中空ナノ粒子、あるいは物質運搬体を用いて、ｉｎｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞、または組織に特異的に物質を導入することが可能となる。さらには、上記のＲＮａｓｅを用いた例のように、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子や物質運搬体を用いて、特定細胞または組織に物質を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の１ステップとして行うことも可能になるのである。
【００５５】
本発明に係る薬剤において、上記抗体を粒子表面に提示させる方法としては、後述の実施例に示すとおり、▲１▼粒子形成能を有するタンパク質に、二本鎖抗体の持つＦｃ部位と特異的に結合するＺＺタグを導入し（換言すれば、粒子形成能を有するタンパク質とＺＺタグとを融合させたかたちで発現させて粒子を形成し）、このＺＺタグと上記Ｆｃ部位とを結合させることにより、二本鎖抗体を粒子表面に提示させる方法、▲２▼粒子形成能を有するタンパク質に、ストレプトアビジンと特異的に結合するストレプトタグを導入し（換言すれば、粒子形成能を有するタンパク質とストレプトタグとを融合させたかたちで発現させて粒子を形成し）、このストレプトタグとストレプトアビジン（またはその誘導体）とを結合させ、さらに、ストレプトアビジン（またはその誘導体）と特異的に結合するビオチンで修飾した二本鎖抗体を結合させることにより、抗体を粒子表面に提示させる方法、▲３▼粒子形成能を有するタンパク質と一本鎖抗体とを融合させたかたちで発現させて粒子を形成することにより、抗体を粒子表面に提示させる方法、あるいは、▲４▼一般的な架橋試薬（例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）基、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ基、Ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ基等を有する化合物。ＰＩＥＲＣＥ社から入手可能）を使用して、化学的に抗体と粒子とを結合する方法などが挙げられ、さらに、これら各方法の原理を利用しつつ、その一部を変更した変更方法などを用いるものであってよい。
【００５６】
本発明の薬剤による治療効果については、後述の実施例に示すとおり、動物実験により実際に確認された。この実施例では、ヒト扁平上皮癌由来の細胞を移植したヌードラットに対して、この癌細胞が発現する上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）を抗原として認識する抗体を粒子表面に提示し、単純ヘルペスウィルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ ｔｋ）遺伝子を包含した本発明の薬剤を投与し、さらにガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ：ＧＣＶ）を投与した後、移植した癌組織の大きさを観察することにより治療効果を確認した。薬剤の投与は静脈内投与により行ったが、投与方法としては、このほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。
【００５７】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００５８】
なお、実施例に示すように、欠失型ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質のｐｒｅＳ１領域にタンパク質を組込む技術、真核細胞での高発現に好適な欠失型ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質を作製する技術、この欠失型ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質に提示を目的として生体認識分子（抗体）を組込む技術、およびこれを用いた遺伝子治療やＤＤＳに応用する技術については、全く知られておらず、本願発明者らが独自に開発した技術である。
【００５９】
【実施例】
以下の実施例において、ＨＢｓＡｇとは、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）を示す。ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶの外被タンパク質であり、図１の摸式図に示すように、ＨＢｓＡｇには、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の３種類がある。このうち、Ｓタンパク質は、３種のタンパク質に共通した、重要な外被タンパク質であり、Ｍタンパク質は、Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ２ ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものである。また、Ｌタンパク質は、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８（血清型ｙタイプ）もしくは１１９（血清型ｄタイプ）アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ１ ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものである。なお、以下の実施例では、血清型ｙタイプを使用した。
【００６０】
ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＰｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１， ｐｒｅ−Ｓ２）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。Ｐｒｅ−Ｓ１は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、ｐｒｅ−Ｓ２は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプターを有するのである。
【００６１】
真核細胞でＨＢｓＡｇを発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。
【００６２】
以下の実施例では、ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を用いた。また、図２に以下の実施例に記載されるＨＢｓＡｇ粒子の発現および精製操作の概略説明図を示した。
【００６３】
（実施例Ａ） 遺伝子組換え酵母によるＨＢｓＡｇ粒子の発現
本発明者らによって報告されたＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２６７， Ｎｏ．３， １９５３−１９６１， １９９２記載の方法に基づいて、ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴを保持した遺伝子組換え酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−株）を、合成培地Ｈｉｇｈ−Ｐｉおよび８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００中で培養し、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子を発現させた。（図２ａ〜ｃ）定常成長期（約７２時間後）にある遺伝子組換え酵母から、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）を用いて、ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔを準備し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離して、銀染色によって試料中のＨＢｓＡｇの同定を行った。
【００６４】
これより、ＨＢｓＡｇは分子量約５２ｋＤａのタンパク質であることが明らかとなった。
【００６５】
（実施例Ｂ） ＨＢｓＡｇ粒子の遺伝子組換え酵母からの精製
（１）合成培地８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００で培養された遺伝子組換え酵母（湿重量２６ｇ）をｂｕｆｆｅｒ Ａ溶液（７．５Ｍ 尿素、０．１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０）１００ｍｌに懸濁し、グラスビーズを用いてビードビーター（ＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲ）にて酵母を破砕した。破砕後、上清を遠心分離により回収した。（図２ｄ）
（２）次に、上清を０．７５倍容の３３％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６０００と混合し、３０分間氷冷した。その後、遠心分離（７０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、ペレットを回収した。同ペレットは、Ｔｗｅｅｎ８０を含まないｂｕｆｆｅｒ Ａ溶液中で再懸濁した。
【００６６】
（３）再懸濁した液を、１０〜４０％の勾配をかけたＣｓＣｌに重層し、２８０００ｒｐｍ、１６時間の超遠心分離を行った。遠心分離後の試料を１２画分に分け、ウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）（１次抗体は、ａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体）によりＨＢｓＡｇを含む画分を同定した。さらに、ＨＢｓＡｇを含む画分を、Ｔｗｅｅｎ８０を含まないｂｕｆｆｅｒ Ａ溶液で透析した。
【００６７】
（４）（３）で得られた透析液（１２ｍｌ）を５〜５０％の勾配をかけたショ糖に重層し、２８０００ｒｐｍ、１６時間の超遠心分離を行った。遠心分離後、（３）と同様に、ＨＢｓＡｇを含む画分を同定し、ＨＢｓＡｇを含む画分を尿素とＴｗｅｅｎ８０は含まず、代わりに０．８５％のＮａＣｌを含むｂｕｆｆｅｒ Ａ溶液で透析した。（（２）〜（４）：図２ｅ）
（５）（４）と同様の操作を繰り返し、透析後の試料をウルトラフィルター（Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ） Ｑ２０００（アドバンテック社製）を用いて濃縮し、使用する時まで４℃にて冷蔵保存した。（図２ｆ）
ＣｓＣｌ平衡遠心分離後のウェスタンブロット（３）の結果から、ＨＢｓＡｇは、分子量５２ｋＤａでＳ抗原性を有するタンパク質であることが分かった。最終的に、培地２．５Ｌ由来、湿重量２６ｇの菌体から、約２４ｍｇの精製ＨＢｓＡｇ粒子を得た。
【００６８】
一連の精製過程における画分を銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。また、精製により酵母由来のプロテアーゼが除去されていることを確認するために、（５）で得られたＨＢｓＡｇ粒子を３７℃で１２時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色により同定を行った。
【００６９】
その結果、酵母由来のプロテアーゼは、一連の精製過程において完全に除去されていることが確認された。
【００７０】
ところで、上記ＨＢｓＡｇ粒子はヒト肝細胞特異的に感染することができるが、その高い感染性を担う同粒子表面に提示されている肝細胞認識部位は、ｐｒｅ−Ｓ１領域の３から７７アミノ酸残基に含まれていることが判明している（Ｌｅ Ｓｅｙｅｃ Ｊ， Ｃｈｏｕｔｅａｕ Ｐ， Ｃａｎｎｉｅ Ｉ， Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏ Ｃ， Ｇｒｉｐｏｎ Ｐ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９９， Ｍａｒ； ７３（３）： ２０５２−７）。
【００７１】
以下では、癌特異的抗体を粒子表面に提示させた本発明の薬剤の作製方法について説明するが、下記作製方法においては、その抗体の抗原となる分子を細胞表面に有する特定の癌細胞に対してのみ本発明の薬剤を作用させるため、上記ＨＢｓＡｇ粒子の本来の肝細胞に対する高い感染能を欠失させた。また、本発明の薬剤として、▲１▼ストレプトタグを用いて癌特異的抗体を提示させたＨＢｓＡｇ粒子、▲２▼ＺＺタグを用いて癌特異的抗体を提示させたＨＢｓＡｇ粒子、および▲３▼癌特異的な一本鎖抗体をＨＢｓＡｇタンパク質と融合させて発現させることにより、粒子表面に提示させたＨＢｓＡｇ粒子、をそれぞれ作製した。
【００７２】
（実施例Ｃ） ストレプトタグを用いた癌特異的抗体を提示するＨＢｓＡｇ粒子の作製
（実施例Ｃ−１）酵母細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の作製
実施例Ａに記載されたｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴプラスミドのヒト肝細胞認識部位をコードする遺伝子領域を欠失させ、同時に制限酵素ＮｏｔＩサイト（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）を挿入するために、配列番号１のオリゴヌクレオチドと配列番号２のオリゴヌクレオチドとをＰＣＲ用プライマーとして使用して、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いたＰＣＲ法をｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴプラスミドに対して行った。
【００７３】
具体的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を用い、ＰＣＲスケジュールは、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分間のアニーリング、６８℃３０分間の合成反応を３０回繰り返した。その後、ＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、出現コロニーからベクターＤＮＡを抽出し、塩基配列から変異導入されたｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴプラスミドを選抜した。以下、ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Ｎｕｌｌプラスミドと呼ぶ。なお、図３以降の図面では、このプラスミドが持つ、上記ヒト肝細胞認識部位を欠くＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質をコードする遺伝子領域を「Ｎｕｌｌ」と表示している。以下では便宜上、この遺伝子領域を「Ｎｕｌｌ領域」と呼ぶこととする。
【００７４】
図３に示すように、上記ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Ｎｕｌｌプラスミドに対し、ＳａｃＩサイトおよびＳａｌＩサイトを付加するために、ＳａｃＩサイトを付加した配列番号３のオリゴヌクレオチドとＳａｌＩサイトを付加した配列番号４のオリゴヌクレオチドとをＰＣＲ用プライマーとして使用して、ＰＣＲを行った。これにより、プロモーター（ＧＬＤｐ）およびターミネーター（ＰＧＫｔ）を含むＮｕｌｌ領域を増幅させ、Ｎｕｌｌ領域を含むｃＤＮＡ断片を得た。
【００７５】
次いで、ｐＲＳ４０５＋２μｍプラスミド（汎用型酵母ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＡａｔＩＩサイトに酵母用多コピー型２μｍ複製部位を組み込むことにより作製）を制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｌＩにより消化した後、Ｎｕｌｌ領域を含む上記ｃＤＮＡ断片を開裂したプラスミドｐＲＳ４０５＋２μｍに挿入して、ｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドを作製した。
【００７６】
次に、ストレプトタグ（ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号５およびこれと相補的な配列番号６のオリゴヌクレオチド）をアニーリングさせ、上記ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ＮｕｌｌプラスミドをＮｏｔＩ消化したものに挿入して、ストレプトタグをコードする遺伝子領域
を有するｐＲＳ４０５＋２μｍ−ｓｔｒｅｐ−ｔａｇプラスミドを作製した。ここで、ストレプトタグとは、ストレプトアビジンに対してビオチンの様に高い親和性で結合するペプチドであり、Ｎ末から順に、１）ＳＡＷＲＨＰＱＦＧＧあるいは２）ＷＳＨＰＱＦＥＫの配列からなるものである。前者１）は、タンパク質のＣ末で機能するものであり、本実施例では、後者２）の配列のストレプトタグを用いた。
【００７７】
その後、上記ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ｓｔｒｅｐ−ｔａｇプラスミドにより酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−株）を形質転換させ、得られたトランスフォーマントを培養後、実施例Ｂに記載の方法に従って、培養細胞から改変型ＨＢｓＡｇ粒子（上記ヒト肝細胞認識部位を欠くＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質とストレプトタグとを融合させたかたちで発現させて得られた粒子。以下、「ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子」という）を精製したところ、培地１．０Ｌ由来の菌体から、約２００μｇの精製ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を得た。
【００７８】
（実施例Ｃ−２）無血清培養の昆虫細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の作製
以下では、糖鎖等の高次構造の再現も可能な作製方法として、バキュロウィルスを介さず、無血清培養が可能な昆虫細胞系を用いたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の作製方法について説明する。
【００７９】
図４に示すように、実施例Ｃ−１に記載の上記ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Ｎｕｌｌプラスミドから、配列番号７のオリゴヌクレオチド（ＫｐｎＩサイトｇｇｔａｃｃを有する）及び配列番号８のオリゴヌクレオチド（ＳａｃＩＩサイトｃｃｇｃｇｇを有する）の各プライマーを用いたＰＣＲにより、ニワトリ由来リゾチーム分泌シグナルペプチドのコード領域を含む上記Ｎｕｌｌ領域を増幅した。
【００８０】
ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離し、約１．３ｋｂｐの目的バンドの遺伝子断片を回収した後、昆虫細胞安定発現用ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＫｐｎＩサイトとＳａｃＩＩサイトとの間に、上記遺伝子断片をＴａＫａＲａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ社）を用いて、閉環結合させた。塩基配列を確認した後、このプラスミドをｐＩＺＴ−Ｎｕｌｌと命名した。
【００８１】
次に、実施例Ｃ−１と同様に、ｓｔｒｅｐｔａｇをコードした合成オリゴヌクレオチド（配列番号５およびこれと相補的な配列番号６のオリゴヌクレオチド）をアニーリングさせ、上記ｐＩＺＴ−ＮｕｌｌプラスミドをＮｏｔＩ消化したものに挿入して、ストレプトタグをコードする領域を有する
ｐＩＺＴ−ｓｔｒｅｐｔａｇプラスミドを作製した。
【００８２】
一方、昆虫細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ株（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、約１ヶ月かけて次第に牛胎仔血清入り培地から無血清培地（Ｕｌｔｉｍａｔｅ Ｉｎｓｅｃｔ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に馴化させた。次に、上記ｐＩＺＴ−ｓｔｒｅｐｔａｇプラスミドを遺伝子導入用脂質Ｉｎｓｅｃｔｉｎ−Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて無血清培地に馴化させたＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ株に形質転換した。その後、無血清培地で２７℃４８時間培養し、抗生物質ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を４００ μｇ／ｍＬ含有する無血清培地で更に細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで４〜７日間培養し、ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を得た。
【００８３】
１５００×ｇ、５分間遠心により培養上清を回収し、ＩＭｘキット（ダイナボット社）により、培地中のＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の発現測定したところ、ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子が発現していることが確認された。さらに、上記培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体（発明者らが作製）によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。その結果、ストレプトタグが融合したＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子は分子量約４２ｋＤａであった。
【００８４】
以上のようにして得られた培養上清１Ｌを用いて、限外濾過器（使用フィルターはＵＫ−２００：ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、排除分子量２００Ｋ）で濃縮した後、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ、東洋ソーダ社）により精製したところ、均一なＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子約１ｍｇを精製することができた。
【００８５】
（実施例Ｃ−３）動物細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の作製
図５に示すように、制限酵素ＸｈｏＩを用いて、上記ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−ＮｕｌｌプラスミドにおけるＸｈｏＩサイトでターミネーター（ＰＧＫｔ）を含むＮｕｌｌ領域を含む断片を取り出した。次いで、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｈｏＩにより消化した後、上記断片をｐｃＤＮＡ３．１に挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｕｌｌプラスミドを作製した。
【００８６】
次に、実施例Ｃ−１と同様に、ｓｔｒｅｐｔａｇ遺伝子をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号５およびこれと相補的な配列番号６のオリゴヌクレオチド）をアニーリングさせ、上記ｐｃＤＮＡ３．１−ＮｕｌｌプラスミドをＮｏｔＩ消化したものに挿入して、ストレプトタグのコード領
域を有するｐｃＤＮＡ３．１−ｓｔｒｅｐｔａｇプラスミドを作製した。
【００８７】
上記ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｔｒｅｐｔａｇプラスミドを、サル腎由来ＣＯＳ７細胞へ、遺伝子導入装置ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いて導入した。導入後、１０％子牛胎児血清を含むダルベッコ改変培地で一晩培養した後、培地を無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に置き換えて、さらに１週間培養して、培地からＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を精製した。
【００８８】
また、実施例Ｃ−２と同様に、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。その結果、ストレプトタグが融合されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子は分子量約４２ｋＤａであることがわかった。ＩＭｘによる測定値は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを用いてＨＢｓＡｇ Ｌ粒子野生型を発現したもの：８．８１（対カットオフ値）、ＨＢｓＡｇ Ｎｕｌｌ粒子：３．４７、ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子：２．４１であり、それぞれ十分な生産量を示していた。
【００８９】
（実施例Ｃ−４）ストレプトタグを有するＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子に抗体を提示させる方法
上記実施例Ｃ−１〜Ｃ−３では、ストレプトタグを有するＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を作製した。このストレプトタグは、ストレプトアビジンと特異的に結合する。さらに、このストレプトアビジンは、ビオチンと特異的に結合する。そこで、上記各ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子とストレプトアビジンとを結合させ、その後、ストレプトアビジンとビオチン修飾した抗体とを結合させることにより、粒子表面に抗体が整列提示されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子（以下、このように抗体が提示されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を「ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子」という）を作製した。
【００９０】
具体的には、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体である抗ヒトＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体７Ｇ７Ｂ６（精製品）を抗体に使用し、この抗体に対して、ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）により、Ｐｉｅｒｃｅ社の説明書のプロトコルに従ってビオチン標識した。次に、上記精製したＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子と、アビジンタンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ａｖｉｄｉｎ）とを、ＰＢＳ中常温で３０分間、モル比ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子（モル計算は構成分子単位で行った）２：アビジンタンパク質１で混合結合させた。その後、上記のビオチン標識した抗ヒトＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体を、上記アビジンタンパク質が結合したＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子に対して等モル加えてＰＢＳ中常温で３０分間反応させた。これにより、粒子表面に上記抗体が提示されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子を作製した。
【００９１】
（実施例Ｃ−５）上記ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子への遺伝子導入
まず、国際出願ＷＯ０１／６４９３０に開示される方法と同様に、上記ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子と緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））とを混合し、エレクトロポレーション法により、ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子内にｐＥＧＦＰ−Ｆを封入した。これにより、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子を作製した。
【００９２】
次に、ヒト扁平上皮癌由来細胞Ａ４３１（ＪＣＲＢ９００９）および陰性対照としてヒト肝癌由来細胞ＮＵＥ、ヒト大腸癌由来細胞ＷｉＤｒを準備した。上記Ａ４３１および陰性対照（ＮＵＥ、ＷｉＤｒ）を、それぞれ３．５ｃｍガラス底皿シャーレ上に培養し、上記のＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子を１μｇ混合し、４日間培養を継続した。その後、各細胞内でのＧＦＰの発現の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した。
【００９３】
その結果、Ａ４３１細胞ではＧＦＰの蛍光が観察されたが、陰性対照（ＮＵＥ細胞、ＷｉＤｒ）ではＧＦＰの蛍光が観察されなかった。
【００９４】
以上のように、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子を用いて、培養細胞レベルで、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入し発現させることができた。これにより、上記ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子に細胞を治療する細胞導入物質を包含させることにより、特定の細胞および組織における疾患を効果的に治療することができる可能性が示された。
【００９５】
（実施例Ｄ） ＺＺタグを用いた抗体提示型ＨＢｓＡｇ粒子の作製
（実施例Ｄ−１）酵母細胞によるＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子の作製
まず、図６に示すように、実施例Ｃ−１と同様にして、ｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドを作製した。
【００９６】
次いで、ＺＺタグ（ＺＺｔａｇ）をコードする遺伝子領域（図中、「ＺＺ」。以下、「ＺＺ領域」という）を有するプラスミド（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ＰｒｏｔｅｉｎＡ遺伝子を基にＺＺ領域を挿入して作製）に対して、ＮｏｔＩサイトを付加した配列番号９および配列番号１０の各オリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プライマーとして使用してＰＣＲを行い、ＺＺ領域を含む領域を増幅した。上記ＺＺタグとは、イムノグロブリンＧのＦｃ領域と結合する能力を有するアミノ酸配列と規定され、次の２回繰り返し配列からなる（ＺＺタグの配列：Ｎ末から、ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ）。
【００９７】
次いで、上記ｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩにより消化し、開裂した当該プラスミドに上記増幅断片を挿入して、ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ＺＺプラスミドを作製した。
【００９８】
実施例Ａと同様に、上記プラスミド遺伝子ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ＺＺを酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ‐にスフェロプラスト法により形質転換し、得られたトランスフォーマントを培地Ｈｉｇｈ−Ｐｉ３ｍｌにて３０度３日間、続いて、８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００ ３ｍｌにて３０度３日間培養し、ＺＺタグを提示するＨＢｓＡｇ粒子を得た。
【００９９】
その後、上記ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ＺＺプラスミドにより酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−株）を形質転換させ、得られたトランスフォーマントを培養後、実施例Ｂに記載の方法に従って、培養細胞から改変型ＨＢｓＡｇ粒子（上記ヒト肝細胞認識部位を欠くＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質とＺＺタグとを融合させたかたちで発現させて得られた粒子。以下、「ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子」という）を精製したところ、粒子の発現量は極めて高く、培地１．０Ｌ由来の菌体から、約２０ｍｇの精製ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を得た。
【０１００】
さらに、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。図７にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す。また、ＩＭｘの結果は、ｐＲＳ４０５＋２μｍベクターを用いてＨＢｓＡｇ Ｌ粒子野生型を発現したもの：４９．４３（対カットオフ値、１００倍希釈時）、ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子：２１．８７、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子：２５３．６４であり、それぞれ十分な生産量を示していた。これらの結果より、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子は分子量約５６ｋＤａであることがわかった。
【０１０１】
（実施例Ｄ−２）無血清培養の昆虫細胞によるＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子の作製まず、図８に示すように、実施例Ｃ−２と同様の方法により、ｐＩＺＴ−Ｎｕｌｌプラスミドを得た。
【０１０２】
次に、実施例Ｄ−１と同様の方法により、ＺＺ領域を含む領域を上記ｐＩＺＴ−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入して、ｐＩＺＴ−ＺＺプラスミドを作製した。
【０１０３】
次いで、実施例Ｃ−２と同様の方法により、上記ｐＩＺＴ−ＺＺプラスミドを昆虫細胞に導入して、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を発現させた。
【０１０４】
また、上記昆虫細胞を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体（発明者らが作製、マウスポリクローナル抗体）によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより解析した。その結果、ＺＺタグを提示するＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子は分子量約５６ｋＤａであることがわかった。
【０１０５】
また、Ｃ−２と同様の方法により培養上清１ＬからＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子約１ｍｇが得られた。
【０１０６】
（実施例Ｄ−３）動物細胞によるＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子の作製
まず、図９に示すように、実施例Ｃ−３と同様の方法により、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｕｌｌプラスミドを作製した。
【０１０７】
次に、実施例Ｄ−１と同様の方法により、ＺＺ領域を含む領域を上記ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＺＺプラスミドを作製した。
【０１０８】
次いで、実施例Ｃ−３と同様の方法により、上記ｐｃＤＮＡ３．１−ＺＺプラスミドをＣＯＳ７細胞に導入して、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を発現させた。
また、上記ＣＯＳ７細胞を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ＺＺｐｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体（発明者らが作製、マウスポリクローナル抗体）によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。ＩＭｘの結果は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを用いてＨＢｓＡｇ Ｌ粒子野生型を発現したもの：８．８１（対カットオフ値）、ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子：３．４７、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子：２．４１であり、それぞれ非常に高い生産量を示していた。その結果、ＺＺタグを提示するＨＢｓＡｇ−ＺＺｐｔａｇ粒子は分子量約５６ｋＤａであることがわかった。
【０１０９】
（実施例Ｄ−４）上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子に対する抗体の提示方法
上記ＺＺタグは、抗体分子のＦｃ部分に対して高い親和性を有しており、たとえば、癌特異的抗体である、ヒトＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に対するマウスモノクローナル抗体７Ｇ７Ｂ６、ヒトＩＬ−２受容体（Ｔａｃ抗原）に対するマウスモノクローナル抗体５２８、およびヒト大腸癌に対する大腸癌特異的マウスモノクローナル抗体ＳＴ−４２１等と特異的に結合することができる。そこで、上記各ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子とこれらいずれかの抗体とを結合させることにより、粒子表面に抗体が整列提示されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子（以下、このように抗体が提示されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を「ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子」という）を作製した。
【０１１０】
具体的には、上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子と、抗ヒトＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体７Ｇ７Ｂ６（精製品）とを等モル（モル計算は構成分子単位で行った）混合し、ＰＢＳ中で約１時間反応させた。これにより粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を作製することができた。
【０１１１】
（実施例Ｄ−５）上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子への遺伝子導入
まず、国際出願ＷＯ０１／６４９３０に開示される方法と同様に、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子と緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））とを混合し、エレクトロポレーション法により、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子内にｐＥＧＦＰ−Ｆを封入した。これにより、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を作製した。
【０１１２】
次に、実施例Ｃ−５と同様に、ヒト扁平上皮癌由来細胞Ａ４３１および陰性対照として、ヒト肝癌由来細胞であるＮＵＥとＨｕＨ−７（ＪＣＲＢ０４０３）、ヒト大腸癌由来細胞ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）を準備した。上記Ａ４３１およびＮＵＥ、ＨｕＨ−７、ＷｉＤｒを、それぞれ３．５ｃｍガラス底皿シャーレ上に培養し、上記ＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ−ＧＦＰ粒子を１μｇ混合し、４日間培養を継続した。その後、各細胞内でのＧＦＰの発現の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１３】
その結果、Ａ４３１細胞ではＧＦＰの蛍光が観察されたが、ＮＵＥ細胞など他の細胞ではＧＦＰの蛍光が観察されなかった。
【０１１４】
以上のように、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を用いて、培養細胞レベルで、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入し発現できることが示された。
【０１１５】
さらに、ヌードマウス（系統：ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ、微生物学的品質：ＳＰＦ、性別：オス５週齢）の両側背部皮下に、ヒト腫瘍株（Ａ４３１、ＨｕＨ−７、ＷｉＤｒ）をそれぞれ１×１０７細胞皮下に注射し、移植腫瘍が直径２ｃｍ程度の固形癌になるまで２〜４週間生育させて、担癌マウスを得た。
【０１１６】
次に、上記のＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を、マウス腹腔内に２６Ｇ注射針を使用して投与した。投与後４日目にマウスを屠殺し、腫瘍部、肝臓、脾臓、腎臓、腸管を摘出し、ＧＦＰ用樹脂包埋キット（Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００）を用いて組織を固定・包埋した。
【０１１７】
具体的には、固定は４％中和ホルムアルデヒドに浸漬して行い、脱水は７０％ＥｔＯＨで室温２時間、９６％ＥｔＯＨで室温２時間、１００％ＥｔＯＨで室温１時間、予備浸漬は１００％ＥｔＯＨ／Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００等量混合液で室温２時間行った。その後、Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００で室温２４時間以内の浸漬を行い、取り出した後、室温で１時間および３７℃で１時間静置して重合反応させた。
【０１１８】
常法に従って、切片を作製し、同時にヘマトキシンエオリン染色（一般的な組織染色）を行って、蛍光顕微鏡により各切片のＧＦＰによる蛍光を比較した。その結果、ヒト扁平上皮癌由来細胞Ａ４３１においては、ＧＦＰによる蛍光が認められた。一方、同マウスより同時に摘出した肝臓、脾臓、腎臓、腸管においては蛍光を認められなかった。これに対して、他のヒト癌由来細胞（ＨｕＨ−７、ＷｉＤｒ）による担癌マウスにおいては、腫瘍部においても肝臓、脾臓、腎臓、腸管においてもＧＦＰに由来する蛍光は認められなかった。また、上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を投与しなかった担癌マウスにおいても蛍光を認めなかった。
【０１１９】
以上のように、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を用いて、実験動物レベルで、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入し発現できることが示された。
【０１２０】
（実施例Ｄ−６）上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子による治療効果
次に、上記各作製方法のうち酵母を用いて作製したＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子内へ、癌治療用遺伝子として単純ヘルペスウィルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ ｔｋ）遺伝子を封入し、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が包含された本発明の薬剤としてのＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を製造した。
【０１２１】
上記ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が導入された癌細胞では、このＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が発現することによりガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ：ＧＣＶ）に対して感受性になり、ガンシクロビルが投与されると、強力な巻き添え効果を惹起しつつ、癌細胞は死滅する。このように、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子は、癌遺伝子治療に広く使用される遺伝子の１つである。
【０１２２】
本実施例では、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子内へＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子を封入するため、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子を発現するＩｎｖｉｖｏｇｅｎ社製のベクターｐＧＴ６５−ｈＩＦＮ−αを使用し、この発現ベクターをエレクトロポレーション法によりＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子内に導入することによって、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を作製した。具体的には、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子中のＬタンパク質粒子５０μｇに対し、上記発現ベクター１０μｇ導入した。またこのとき、ＰＢＳバッファーを使用し、エレクトロポレーションの条件は、２２０Ｖ、９５０μＦで４ｍｍのキュベットを使用して行った。
【０１２３】
また、本実施例では、実験動物として日本クレアから購入したヌードラット（系統：Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ、性別：メス）を使用し、このヌードラットの両側背部皮下に、ヒト扁平上皮癌由来細胞Ａ４３１、および陰性対照としてヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞をそれぞれ１×１０７細胞程度皮下注射により移植し、移植腫瘍が直径２〜３ｃｍ程度の固形癌になるまで約３週間生育させて得た。
【０１２４】
その後、上記ヌードラットに、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が包含された上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を１０μｇ尾静脈より投与した（静脈注射した）。そして、静脈注射の５日後から、上記ヌードラットに対し、浸透圧ポンプ（ａｌｚｅｔ ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｕｍｐ；Ｃａｔ番号２ＭＬ２）を使用してガンシクロビル（ＧＣＶ）を５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの割合で投与した。上記浸透圧ポンプは、ＧＣＶを含む薬液とともに上記ヌードラットの背中皮下に移植した。このガンシクロビルの投与は、最大１４日間行った。ガンシクロビル投与後、上記ヌードラットの腫瘍組織の状態（大きさ）を経時的に観察した。具体的には、ノギスで腫瘍部分の短径と長径とを測定し、腫瘍容積近似式（長径×短径×短径／２）を計算して行った。測定は、全てネズミ３連で行った。その結果を表２および図１０に示す。
【０１２５】
【表２】
【０１２６】
以上の結果から、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を用いて、実験動物レベルで、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入し発現でき、癌の治療効果を有することが認められた。
【０１２７】
（実施例Ｅ）一本鎖抗体を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子の作製
（実施例Ｅ−１）酵母細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子の作製
まず、図６に示すように、実施例Ｄ−１と同様の方法により、但し同実施例で使用したＺＺ領域を有するプラスミドおよびＰＣＲ用プライマーに代えて、プラスミドには、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒト血清アルブミン抗体であるＡ２２をコードする遺伝子領域を有するプラスミド（ＴＯＴＯ株式会社から分与）、あるいは、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒトＲＮａｓｅ抗体である３Ａ２１をコードする遺伝子領域を有するプラスミド（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７ Ａｕｇ−Ｓｅｐ；３４（１２−１３）：８８７−９０ Ｋａｔａｋｕｒａ Ｙ， Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｔ， Ｉｗａｉ Ｙ， Ｋｕｒｏｋａｗａ Ｙ， Ｏｍａｓａ Ｔ， Ｓｕｇａ Ｋ．およびＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ １９９７ Ｊｕｌ；３４（１０）：７３１−４ Ｋａｔａｋｕｒａ Ｙ， Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｔ， Ｉｗａｉ Ｙ， ＫｕｒｏｋａｗａＹ， Ｏｍａｓａ Ｔ， Ｓｕｇａ Ｋ．に記載の方法により作製）を使用し、ＰＣＲ用プライマーには、ＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１１および配列番号１２の各オリゴヌクレオチド（上記Ａ２２の場合）、あるいはＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１３および配列番号１４の各オリゴヌクレオチド（上記３Ａ２１の場合）を使用してＰＣＲを行い、上記抗体Ａ２２または３Ａ２１をコードする遺伝子領域を含む領域を増幅した。上記一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｓｃＦｖ）とは、本来２本のポリペプチドで構成される抗体の抗原認識部位を一本のポリペプチド上で再構成した擬似抗体分子のことである。
【０１２８】
次に、上記ＰＣＲにより得られた増幅断片をｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入してｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ａ２２プラスミドあるいはｐＲＳ４０５＋２μｍ−３Ａ２１プラスミドを作製した。そして、これらいずれかのプラスミドを酵母に導入して発現させることにより、一本鎖抗体Ａ２２あるいは３Ａ２１がＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質と融合したかたちで発現され、粒子表面に提示された粒子（以下、このように一本鎖抗体Ａ２２あるいは３Ａ２１が提示された粒子を「ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子」という）を得た。
【０１２９】
また、上記酵母を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。図１１にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す。ＩＭｘの結果は、ｐＲＳ４０５＋２μｍベクターを用いてＨＢｓＡｇ Ｌ粒子野生型を発現したもの：４９．４３（対カットオフ値、１００倍希釈時）、ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子：２１．８７、Ａ２２を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子：２．４１、３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子：４．０２であり、それぞれ非常に高い生産量を示していた。これらの結果より、抗体Ａ２２を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであり、抗体３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであることが明らかとなった。なお、実施例Ｃ−２と同様の方法により、それぞれ培地１．０Ｌ由来の菌体から、約２００μｇの精製ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子を得た。
【０１３０】
（実施例Ｅ−２）無血清培養の昆虫細胞によるＨＢｓＡｇ―ｓｃＦｖ粒子の作製まず、図８に示すように、実施例Ｄ−２と同様の方法により、但し同実施例で使用したＺＺ領域を有するプラスミドおよびＰＣＲ用プライマーに代えて、プラスミドには、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒト血清アルブミン抗体であるＡ２２、あるいは、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒトＲＮａｓｅ抗体である３Ａ２１をコードする遺伝子領域を有するプラスミドを使用し、ＰＣＲ用プライマーには、ＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１１および配列番号１２の各オリゴヌクレオチド（上記Ａ２２の場合）、あるいはＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１３および配列番号１４の各オリゴヌクレオチド（上記３Ａ２１の場合）を使用してＰＣＲを行い、上記抗体Ａ２２または３Ａ２１をコードする遺伝子領域を含む領域を増幅した。
【０１３１】
次に、上記ＰＣＲにより得られた増幅断片をｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入してｐＩＺＴ−Ａ２２プラスミドあるいはｐＩＺＴ−３Ａ２１プラスミドを作製した。そして、これらいずれかのプラスミドを前記昆虫細胞に導入して発現させることにより、一本鎖抗体Ａ２２あるいは３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子を得た。
【０１３２】
また、上記昆虫細胞を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより解析した。この結果より、Ａ２２を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであり、３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであることがわかった。
【０１３３】
また、Ｃ−２と同様の方法により、それぞれ培養上清１ＬからＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子約１ｍｇが得られた。
【０１３４】
（実施例Ｅ−３）動物細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子の作製
まず、図９に示すように、実施例Ｄ−３と同様の方法により、但し同実施例で使用したＺＺ領域を有するプラスミドおよびＰＣＲ用プライマーに代えて、プラスミドには、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒト血清アルブミン抗体であるＡ２２、あるいは、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒトＲＮａｓｅ抗体である３Ａ２１をコードする遺伝子領域を有するプラスミドを使用し、ＰＣＲ用プライマーには、ＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１１および配列番号１２の各オリゴヌクレオチド（上記Ａ２２の場合）、あるいはＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１３および配列番号１４の各オリゴヌクレオチド（上記３Ａ２１の場合）を使用してＰＣＲを行い、上記抗体Ａ２２または３Ａ２１をコードする遺伝子領域を含む領域を増幅した。
【０１３５】
次に、上記ＰＣＲにより得られた増幅断片をｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入してｐｃＤＮＡ３．１−Ａ２２プラスミドあるいはｐｃＤＮＡ３．１−３Ａ２１プラスミドを作製した。そして、これらいずれかのプラスミドを前記ＣＯＳ７細胞に導入して発現させることにより、一本鎖抗体Ａ２２あるいは３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子を得た。
【０１３６】
また、上記ＣＯＳ７細胞を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより解析した。この結果より、Ａ２２を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであり、３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであることがわかった。
【０１３７】
（実施例Ｅ−４）上記ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子への遺伝子導入
上記のように作製したＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子のうち、抗体として上記Ａ２２を提示させたものに対してはヒト血清アルブミンを、一方、抗体として上記３Ａ２１を提示させたものに対してはヒトＲＮａｓｅ１を、それぞれ９６穴プレートに固定し、ＥＬＩＳＡ法により結合係数を測定した。この際、固相に結合したＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子の量を、ダイナボット社のＡＵＳＺＹＭＥ ＩＩに付属しているＨＲＰ標識抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体で定量した。その結果、ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子単位ではなく、粒子の部品であるタンパク質単位で、ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子（Ａ２２の場合）は１００ｎＭ以下の結合定数、ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子（３Ａ２１の場合）は５０ｎＭ以下の結合係数をそれぞれ示した。これらの値は、両方のＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子が生体内で特定の部位に薬剤等を運搬できる運搬体となり得るために有効な値である。
【０１３８】
このように、抗体として上記Ａ２２または３Ａ２１が粒子表面に提示されたＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性を有することが示された。
【０１３９】
（実施例Ｆ）
本実施例では、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のヒト肝細胞認識部位であるｐｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１， ｐｒｅ−Ｓ２）のアミノ酸を欠失した、種々の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現させ、欠失させるアミノ酸領域の相違による、真核細胞での発現量の違いと抗原性とについて評価した。
【０１４０】
（実施例Ｆ−１）欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子の作成
以下の方法でＰＣＲを行い、欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子を作成した。
【０１４１】
欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質として、ｐｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１， ｐｒｅ−Ｓ２）の一部を欠失させた下記（ａ）〜（ｅ）に示す５種類の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現する欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子を作成した。本実施例における欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質は、具体的には、（ａ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から２１番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（図１２においては、Δ２１−１５３、以下同様）、（ｂ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から３３番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（Δ３３−１５３）、（ｃ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（Δ５０−１５３）、（ｄ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から１０８番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（Δ１０８−１５３）、（ｅ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から１２７番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（Δ１０８−１５３）、しているものである。
【０１４２】
まず、（ａ）〜（ｅ）に相当する欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子を増幅するために、前述のようにして、ＰＣＲ法をｐＢＯ４７７（発明者が作成したＨｂｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子組み込み済みプラスミド）に対して行った。ＰＣＲ用のプライマーとしては、配列番号１５〜２４に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。なお、配列番号１５〜２４に記載のオリゴヌクレオチドは、配列番号１５および１６が（ａ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌ遺伝子を増幅するためのものであり、同様に、配列番号１７および１８が（ｂ）、配列番号１９および２０が（ｃ）、配列番号２１および２２が（ｄ）、配列番号２３および２４が（ｅ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌ遺伝子を増幅するためのものである。また、配列番号１５〜２４のプライマーのうち、奇数がフォワードプライマー、偶数がリバースプライマーである。
【０１４３】
ＰＣＲの反応組成は、図１３に示すように、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）（０．５μＬ）、ＰＣＲ緩衝液（５μＬ×１０）、ｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ、５μＬ）、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ（ｐＢＯ４７７（発明者が作成したＨｂｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子組み込み済みプラスミド））（５μｇ／ｍＬ、２μＬ）、プライマーセット（配列番号１５〜２４）（各１μＬ）を含み、蒸留水で全量を５０μＬとした。
【０１４４】
また、ＰＣＲの反応サイクルは、図１４に示すように、９５℃３０秒間の変性後、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分間のアニーリング、および６８℃３０分間の合成反応を３０回繰り返した後、４℃に冷却して反応を終了した。その後、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡを切断するために、ＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩ（１０Ｕ）を加え、３７℃で１時間のインキュベートの後、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。次に、出現コロニーからプラスミドを抽出し、塩基配列の確認を行った。
【０１４５】
続いて、欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子に制限酵素ＮｏｔＩサイトを導入した。図１５は、このようにして増幅した欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子に制限酵素ＮｏｔＩサイトを導入した発現遺伝子および当該遺伝子を組込んだプラスミド、模式図である。同図において、０ａａとは、欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子の先頭（５’末端）に制限酵素ＮｏｔＩ
サイトを、２５ａａとは、５’末端より２５アミノ酸残基分後ろ（３’末端側）の位置にＮｏｔＩサイト
を、ΔＰｒｅＳとはＳタンパク質発現遺伝子の先頭（５’末端）に制限酵素ＮｏｔＩサイトを挿入
したものである。
【０１４６】
このような、ＮｏｔＩサイトが挿入された欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子を、動物細胞発現用のプラスミドｐＢＯ４７７（発明者が作成したＨＢｓＡｇＬタンパク質発現遺伝子組み込み済みプラスミド）に、ＸｈｏＩにより、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子の組換えを行った。
【０１４７】
なお、図１５以降の図面においては、例えば、Δ１２７−１５３とは、図１２のＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子における、１２７番目〜１５３番目までのアミノ酸をコードする遺伝子が欠失していることを示す（以下同様）。また、ΔｐｒｅＳとは、ｐｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１， ｐｒｅ−Ｓ２）の全アミノ酸をコードする遺伝子が欠失していることを示す。
【０１４８】
（実施例Ｆ−２）動物細胞による欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の作製
実施例Ｆ−１で構築を終えたプラスミド（２μｇ）をＣｏｓ７細胞（３〜８×１０４個）
にエレクトロポレーション（３００Ｖ、９５０μＦ）にて形質転換し、４日間３７℃、５％ＣＯ２存在下で静置培養を行った。その後、培地上清及び細胞抽出液を酵素免疫測定装置ＩＭｘ（ダイナボット）で変異型Ｌ粒子（欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質）の生成量を抗原性に基づき測定した。培地上清の測定では、ＰＢＳにより等倍希釈したものを、細胞内は、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）により、細胞を溶解させ、遠心の上澄みをＰＢＳで２００倍希釈することで測定を行った。
【０１４９】
図１６および１７に変異型Ｌ粒子の生成量を測定した結果（数値・グラフ）を示す。なお、図１６および１７において、Ｓ／Ｎ値およびＲＡＴＥが大きいほど、抗原性が高いことを示している。つまり、Δ２１−１５３、Δ３３−１５３、Δ５０−１５３、特に、Δ５０−１５３の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質が良好な結果が得られた。
【０１５０】
また、図１８および１９に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにウエスタンブロットによっても発現量を確認した。このときの１次抗体には、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−Ｓタンパク質抗体（発明者らが作成）を、２次抗体にはａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体ＡＰ標識（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。なお、図１９は、Ｎ結合型糖鎖除去のための酵素処理（ＥｎｄＨ）後のウエスタンブロットの結果であり、分子量を併せて記載している。また、ＥｎｄＨ処理することにより、生成した変異型Ｌ粒子のＰｒｅ−Ｓ領域にＮ結合型糖鎖が付加している事が判明した。また、図１９におけるΔ５１−６６については、実施例Ｆ−１の方法にしたがって、配列番号２５および２６に記載のプライマーを用いて作製したプラスミドを用いた。
【０１５１】
以上の結果、特に、上記（ａ）〜（ｃ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現量が良好な結果を示した。
【０１５２】
（実施例Ｆ−３）上皮増殖因子（ＥＧＦ）を挿入した欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子の作製
次に、発現量が良好であった上記（ａ）から（ｃ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子（Δ２１−１５３，Δ３３−１５３，Δ５０−１５３）にＮｏｔＩサイトによりＥＧＦ遺伝子を挿入し、発現させた
。ＥＧＦ遺伝子は、発明者らが作製したｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−ＥＧＦから制限酵素ＮｏｔＩを用いて切り出して得た。これらをＣｏｓ７細胞に形質転換し、血清培地にて２４ｈｒ培養の後、無血清培地に交換し、３日間培養を行った。それらの培地を回収し、限外ろ過により濃縮を行い、各変異型Ｌ粒子（上記（ａ）〜（ｃ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質）を得た。
【０１５３】
それぞれの粒子に緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を５０Ｖ，７５０μＦの条件でエレクトロポレーションし、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドを包含させ、肝細胞ＨｅｐＧ２及び上皮細胞Ａ４３１に遺伝子導入実験を試みた。ＧＦＰによる蛍光を観察した結果、肝細胞ＨｅｐＧ２への特異性は消失し、上皮細胞Ａ４３１に対して高い選択性を示した。このようにして、上皮細胞Ａ４３１に対する再標的化に成功した。
【０１５４】
（実施例Ｆ−４）酵母細胞への形質転換による欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の作製
Ｃｏｓ７細胞で発現量が多かったΔ２１−１５３，Δ３３−１５３，Δ５０−１５３（上記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質）を発現する遺伝子をＸｈｏＩサイトにより切り出し、酵母発現用プラスミドｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−Ｒ
ｃＴのＸｈｏＩサイトに挿入して構築した。（図２０参照）。これらの酵母発現用プラスミドを、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−にスフェロプラスト法により形質転換し、形質転換体を得た。これらの形質転換体を工業用培地Ｈｉｇｈ−Ｐｉ３日間、８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地３日間培養を行い、菌体を回収した。菌体をガラスビーズにより破砕し、細胞抽出液を培養酵母酵素免疫測定装置ＩＭｘ（ダイナボット）により抗原性を測定すると共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにウエスタンブロット（１次抗体ａｎｔｉ−Ｓタンパク質抗体、２次抗体ＡＰ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体使用）により発現量を確認した（図２１〜図２２参照）。
【０１５５】
また、以前に用いているＰｒｏｔｅｉｎＡのＺＺドメイン遺伝子を提示するためのプラスミド、ＥＧＦを提示させるためのプラスミドもＮｏｔＩサイトを用いて構築を行った（図２０参照）。こうして、欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質高発現酵母菌体内高発現用プラスミド（ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ５０−１５３， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ３３−１５３， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ２１−１５３， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ５０−１５３−ＺＺ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ３３−１５３−ＺＺ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ２１−１５３−ＺＺ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ５０−１５３−ＥＧＦ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ３３−１５３−ＥＧＦ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ２１−１５３−ＥＧＦ，及びコントロールとしてｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ３−６６）を得た。これらの酵母発現用プラスミドも酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−にスフェロプラスト法により形質転換し、形質転換体を得た。これらを工業用培地Ｈｉｇｈ−ＰｉＩＩ３日間、８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地３日間培養を行い、菌体を回収した。菌体をガラスビーズにより破砕し、細胞抽出液を培養酵母酵素免疫測定装置ＩＭｘ（ダイナボット）により抗原性を測定（図２１および図２２）することにより発現量を確認した。
【０１５６】
その結果、酵素免疫測定により欠失型粒子の形成が確認された。Δ２１−１５３．、Δ３３−１５３．、Δ５０−１５３． 欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（欠失型ＨＢｓＡｇ粒子）の抗原性は、野生型粒子（図中ＬＡｇ）に近い値を示した（図２１および図２２参照）。一方、図示しないが、コントロールとして作製したΔ３−６６．欠失型ＨＢｓＡｇ粒子は形質転換体が得られなかった。なかでもΔ５０−１５３欠失型ＨＢｓＡｇ粒子は、ＺＺドメインを提示した欠失型ＨＢｓＡｇ粒子（Δ５０−１５３＋ＺＺ）の発現量も極めて高いことから、発現量が野生型より多く生産性においてかなり有利である。
【０１５７】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係る薬剤は、粒子表面に癌特異的抗体などの抗体が提示されているので、静脈注射という簡便な方法で、特定の細胞または組織における疾患を特異的かつ効果的に治療することができ、従来の遺伝子治療と大きく異なり、外科手術を必要とせず、副作用の心配もきわめて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【０１５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の実施例におけるＨＢｓＡｇ遺伝子の各タンパク質領域を表す概略摸式図である。１〜８は、表面抗原における各部位の働きを示している。血清型ｙ型はＰｒｅ−Ｓ１が１０８アミノ酸残基、血清型ｄ型はＰｒｅ−Ｓ１が１１９アミノ酸残基である。
【図２】
本発明の実施例における遺伝子組換え酵母を用いたＨＢｓＡｇ粒子の発現および精製操作を例示した概略説明図である。（ａ）遺伝子組換え酵母の作製、（ｂ）Ｈｉｇｈ−Ｐｉ培地における培養、（ｃ）８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地における培養、（ｄ）破砕、（ｅ）密度勾配遠心分離、（ｆ）ＨＢｓＡｇ粒子。
【図３】
本発明の実施例における、酵母を用いたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図４】
本発明の実施例における、昆虫細胞を用いたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図５】
本発明の実施例における、動物細胞を用いたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図６】
本発明の実施例における、酵母を用いたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図７】
酵母を用いて得られた上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す図である。
【図８】
本発明の実施例における、昆虫細胞を用いたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子（あるいは、一本鎖抗体Ａ２２または３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子）製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図９】
本発明の実施例における、動物細胞を用いたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子（あるいは、一本鎖抗体Ａ２２または３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子）製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図１０】
本発明に係る薬剤として上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を使用して、実験動物で行った治療効果を示すグラフである。
【図１１】
上記ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す図である。
【図１２】
本発明の実施例における欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質発現遺伝子を表す概略摸式図である。
【図１３】
本発明の実施例におけるＰＣＲ法の反応組成を示す図である。
【図１４】
本発明の実施例におけるＰＣＲサイクルを示す図である。
【図１５】
本発明の実施例における欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質発現遺伝子と、その遺伝子を組込むプラスミドを表す概略摸式図である。
【図１６】
本発明の実施例における動物細胞での欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質の酵素免疫測定の結果を表すグラフであり、（ａ）は培地上清、（ｂ）は細胞内部での結果を示すグラフである。
【図１７】
図１６の結果のデータを示す図である。
【図１８】
図１６で発現した欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図であり、（ａ）は培地上清、（ｂ）は細胞内部の結果を示す図である。
【図１９】
図１６で発現した欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質のウエスタンブロットの結果を示す図であり、（ａ）は培地上清、（ｂ）は細胞内部の結果を示す図である。
【図２０】
本発明の実施例における酵母に導入する欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質発現遺伝子と、その遺伝子を組込むプラスミドを表す概略摸式図である。
【図２１】
図２０のプラスミドを用いた時の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現を確認するための図であり、酵素免疫測定のデータを示す図である。
【図２２】
図２０のプラスミドを用いた時の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現を確認するための図であり、酵素免疫測定の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
１ 粒子形成抑制部位
２ 直接的なヒト肝細胞特異的レセプター
３ 糖鎖１
４ 間接的なヒト肝細胞特異的レセプター（重合ヒト血清アルブミンレセプター）
５ 膜貫通領域１
６ 膜貫通領域２
７ 糖鎖２
８ 膜貫通領域３
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いる治療薬剤およびタンパク質中空ナノ粒子に関し、より詳細には、特定の細胞または組織に対する抗体などの生体認識分子が粒子表面に提示される一方、粒子内部には疾患治療用の細胞導入物質が包含されており、この細胞導入物質を特定細胞または組織内に特異的に導入可能な薬剤およびその薬剤に好適に利用できる粒子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、医学の分野において、患部に直接作用し、高い効果を示す副作用の少ない薬品の開発が盛んに行われている。特に、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる方法は、目的細胞、あるいは、目的組織に対して特異的に薬剤等の有効成分を運搬し、目的箇所で有効成分を作用させることのできる方法として注目されている。
【０００３】
また、最近の分子細胞生物学の分野においても特定細胞への遺伝子導入は必要不可欠な技術として盛んに研究されている。さらに、ヒトゲノム計画の進展により各種疾患の遺伝的な背景が明らかになりつつある現在、このような細胞および組織に対する特異性の高い遺伝子導入法が確立されれば遺伝子治療の分野での応用も可能となる。
【０００４】
細胞に遺伝子を導入する方法としては、これまでに、遺伝子を巨大分子化してエンドサイトーシスによって遺伝子を取込ませる方法（リン酸カルシウム法、リポフェクタミン法）や、電気パルス刺激により細胞膜に穿孔を開け、遺伝子を流入させる方法（エレクトロポレーション法、遺伝子銃法）が知られており、いずれも今日では分子生物学的実験において、一般的に実施されている手法である。
【０００５】
これらの方法は簡便であるが、細胞を直接、物理的に傷つけ、遺伝子導入部位を外科的に露出させる必要があるため、生体内部の細胞や組織には容易に適用できない。また、１００％近い導入率を得ることは難しい。
【０００６】
一方、安全性の高い物質導入方法としてはリポソーム法が知られている。この方法は、細胞を傷つけることがないため、生体内部の細胞や組織にも適用することが可能である。しかし、単純な脂質であるリポソームに高度な細胞および組織特異性を付与することは困難であり、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子導入率は、要求される値に比べてはるかに低いという問題がある。
【０００７】
最近になって、ウィルスＤＮＡに目的の遺伝子を組み込み、感染性ウィルスを生成して遺伝子導入を行う技術が開発された。この方法は導入部位を露出する必要がなく、個体にも応用でき、導入効率も１００％近い画期的な方法として注目されるが、ウィルスが広範囲の細胞に非特異的に感染するため目的の細胞以外にも遺伝子が導入されてしまうという重大な問題がある。また、ウィルスゲノム本体が染色体に組み込まれ、将来予期できぬ副作用を引き起こす可能性があるため、実際には疾病の初期治療等には用いられず、末期の患者に適用されるに留まっているのが現状である。
【０００８】
このように、従来の遺伝子導入方法は、いずれも、目的の細胞に対して特異的に遺伝子を送り込み、細胞内で薬剤となるタンパク質を発現させる方法としては不十分なものであった。他方、薬剤となるタンパク質を直接的に目的細胞、あるいは、目的組織に送り込む方法については、未だ有効な方法が開発されていない状況にある。
【０００９】
【特許文献１】
国際出願番号ＷＯ０１／６４９３０（出願日２００１年２月９日）
【００１０】
【特許文献２】
特開２００１−３１６２９８（公開日２００１年１１月１３日）
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
以上のような状況に鑑み、本発明者らは、国際出願番号ＷＯ０１／６４９３０の国際出願（以下、「国際出願ＷＯ０１／６４９３０」という、（特許文献１））および特許文献２において、粒子形成能を有するタンパク質に生体認識分子が導入された中空ナノ粒子を用いて、目的とする細胞や組織に、物質（遺伝子、タンパク質、化合物等）を特異的かつ安全に運搬、導入するための方法を提案しているが、この方法を用いた特定細胞または組織に対する疾患（例えば癌）治療用の薬剤の開発等がさらなる課題となっていた。とりわけ、特定の癌細胞または癌組織などに対する特異的抗体を提示する薬剤の開発は以下のような問題を克服する上からも重要な課題の１つとなっていた。
【００１２】
従来、薬剤となるタンパク質を、目的とする細胞や組織に特異的かつ安全に運搬、導入することが困難であったため、このようなタンパク質薬剤を用いた治療は患者に大きな負担を与えていた。
【００１３】
例えば、ウィルス性肝炎（特にＣ型肝炎）の治療には、静脈注射により、タンパク質薬剤であるインターフェロンを長期間全身投与する方法をとっている。この方法は、高い治療効果が認められるものの、患部以外にもインターフェロンが作用するため、投与のたびに高熱、脱毛、虚脱感、免疫反応などの副作用がおきるという問題を有している。
【００１４】
また、肝細胞成長因子は肝硬変治療に有効であることが分かっているが、静脈注射で全身投与すると、予測できない副作用が起こる可能性があるので、カテーテルにより肝臓に直接投与する方法を採用している。しかし、カテーテルによる投与のためには、手術が必要であり、長期間の治療では患者に負担がかかっていた。
【００１５】
本発明は、上記の課題に鑑みなされたものであり、その目的は、抗体などの生体認識分子を提示するタンパク質中空ナノ粒子を用いた目的の細胞や組織に特異的に作用する治療薬剤であって、動物実験により実際に治療効果が認められた薬剤、およびこの薬剤を用いた治療方法、さらにはこれらに用いる中空ナノ粒子を提供することにある。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、抗体を提示するタンパク質中空ナノ粒子を複数作製することに成功し、さらに、このうちヒト扁平上皮癌細胞に対する特異的な抗体を提示する中空ナノ粒子に癌治療遺伝子を包含させた薬剤を、実験動物に対して静脈注射により投与したところ、実際に移植癌を治療する効果があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１７】
即ち、本発明に係る薬剤は、特定の細胞または組織に対する抗体が提示され、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、疾患治療用の細胞導入物質が包含されてなる薬剤である。
【００１８】
上記「粒子形成能を有するタンパク質」としては、たとえば本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変され、さらに抗体を提示するように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を挙げることができる。このタンパク質は、真核細胞で発現させると、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出される。こうして得られた中空ナノ粒子は、粒子表面に抗体が提示されているので、特定の細胞または組織に対して特異的に粒子内の物質を運搬することができる。ここで、「特定の細胞または組織」とは、上記抗体に対する抗原を細胞表面に有しているため、抗体と抗原との結合を介して、上記中空ナノ粒子内の物質が細胞内に導入され得る細胞、またはこのような細胞から構成されることで同物質が組織内に導入され得る組織をいう。
【００１９】
Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質のｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１，ｐｒｅＳ２）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を果たしている。したがって、ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失するように改変すれば、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変することができる。これにより、肝細胞以外の細胞や臓器へも、その内部の物質を導入することができる。
【００２０】
ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失させて肝細胞に対する感染能を欠失するように改変する場合、欠失させるアミノ酸領域によって、真核細胞での改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質の発現量が異なる。このタンパク質の真核細胞での発現量は、抗体を提示するように改変した場合に、特に、低下する傾向にある。
【００２１】
したがって、後述の実施例に示すように、真核細胞での発現量を多くするためには、ｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１ｐｒｅＳ２領域）の全アミノ酸配列のうち、血清型ｙタイプの場合は、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変することが好ましく、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変することがより好ましい。一方、血清型ｄタイプの場合は、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変することが好ましく、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から６１番目〜１６４番目のアミノ酸を欠失するように改変することがより好ましい。
【００２２】
これにより、肝細胞に対する感染能を欠失し、さらに抗体を提示するように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質が、真核細胞で大量に発現する。その結果、このタンパク質内の物質が特定の細胞または組織により多く運ばれるので、その物質による治療効果を飛躍的に上昇させることができる。
【００２３】
上記抗体としては、癌特異的抗体または抗ウィルス性タンパク質抗体が挙げられる。例えば、癌特異的抗体を提示した中空ナノ粒子に、癌を治療するための物質（薬剤）を包含させることにより、癌細胞に対して特異的かつ効果的に作用する有効な治療薬となる。他方、抗ウイルス性タンパク質抗体を提示させた場合は、ウィルス感染細胞の除去に有効である。
【００２４】
上記抗体としては、一本鎖抗体と二本鎖抗体とが挙げられる。二本鎖抗体は、その構造に起因して粒子形成能を有するタンパク質と直接融合したかたちで粒子表面に提示させることが困難である。そこで、本発明者らは、この二本鎖抗体を上記タンパク質に間接的に結合させることにより、中空ナノ粒子の表面に提示させることに成功した。具体的には、上記タンパク質に、上記二本鎖抗体の持つＦｃ部位と特異的に結合するＺＺタグを導入（融合）し、このＺＺタグと上記Ｆｃ部位とを結合させることにより、二本鎖抗体を粒子表面に提示させることができる。また、上記タンパク質に、ストレプトアビジン（またはその誘導体）と特異的に結合するストレプトタグを導入（融合）し、このストレプトタグとストレプトアビジン（またはその誘導体）とを結合させ、さらに、ストレプトアビジン（またはその誘導体）と特異的に結合するビオチンで修飾した二本鎖抗体を結合させることにより、抗体を粒子表面に提示させることができる。他方、一本鎖抗体は、上記タンパク質と直接融合したかたちで発現させることにより、粒子表面に提示させることができる。
【００２５】
抗体を粒子表面に提示させる方法としては、上記各方法以外に、一般的な化学修飾による抗体と粒子との結合法も可能である。
【００２６】
また、上記タンパク質からなる中空ナノ粒子は、真核細胞で発現させることにより得られるものであることが好ましく、この真核細胞には、酵母、昆虫細胞、または哺乳動物等の動物細胞が挙げられる。
【００２７】
上記中空ナノ粒子内に包含させる細胞導入物質としては、たとえば癌治療用の遺伝子を挙げることができる。癌治療用遺伝子として、単純ヘルペスウィルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ ｔｋ）遺伝子を包含した薬剤を用いる場合は、後述の実施例に示すとおり、別途ガンシクロビルを投与する。
【００２８】
本発明の薬剤は、静脈注射という簡便な方法で特定の細胞および組織における疾患を効果的に治療することができ、従来の疾患の治療方法と大きく異なり、多量の薬剤の投与あるいは遺伝子治療等における外科手術を必要とせず、副作用の心配も極めて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【００２９】
本発明の治療方法は、本発明の薬剤を投与することによる疾患の治療方法である。
【００３０】
本発明の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有し、かつ、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変された血清型ｙタイプのＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなることを特徴とし、好ましくは、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変されていることを特徴としている。
【００３１】
本発明の別の中空ナノ粒子は、粒子形成能を有し、かつ、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変された血清型ｄタイプのＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなることを特徴とし、好ましくは、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から６１番目〜１６４番目のアミノ酸を欠失するように改変されていることを特徴としている。
【００３２】
このような中空ナノ粒子は、真核細胞において特に発現量が多く、生体認識分子提示に適しており、例えば、遺伝子治療やＤＤＳなどに用いる中空バイオナノ粒子として利用することができる。
【００３３】
【発明の実施の形態】
本発明の薬剤を構成する中空ナノ粒子は、生体認識分子（換言すれば、特定の細胞を認識する分子）として粒子表面に抗体が提示され、粒子内部に疾患治療用の細胞導入物質が包含されることによって、目的細胞あるいは目的組織に特異的に物質を運搬することができる。上記中空ナノ粒子は、粒子形成能を有するタンパク質から形成することができ、このような粒子形成能を有するタンパク質としては、種々のウィルスから得られるサブウィルス粒子を適用することができる。具体的には、Ｂ型肝炎ウィルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）表面抗原タンパク質等が例示される。
【００３４】
また、このような粒子形成能を有するタンパク質からなるタンパク質粒子としては、真核細胞でタンパク質を発現させることにより得られるものが挙げられる。つまり、真核細胞で粒子形成能を有するタンパク質を発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積され、粒子として放出されるのである。このとき、真核細胞としては、酵母、昆虫細胞、または哺乳細胞等の動物細胞などが適用できる。
【００３５】
本発明者らは、後述の実施例に示すとおり、遺伝子組換え酵母で上記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質を発現させることにより、発現されたＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質から酵母由来の脂質二重膜に多数の同タンパク質が埋め込まれた短径約２０ｎｍ、長径約１５０ｎｍの楕円状中空粒子が形成されることを見出し、報告している（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２６７， Ｎｏ．３， １９５３−１９６１， １９９２）。このような粒子は、ＨＢＶゲノムを全く含まないので、ウィルスとしては機能せず、人体への安全性が極めて高い。また、上記ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質を、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変し、さらに抗体（たとえば癌特異的抗体）を粒子表面に提示するように改変して発現させた場合は、抗体を粒子表面に提示しているため、その抗体に対する抗原を細胞表面に有する細胞または組織（癌特異的抗体を提示させた場合は、癌細胞または癌組織）に対して特異的に物質を運搬する運搬体としての効果も高いのである。
【００３６】
ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質のｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１，ｐｒｅＳ２）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を果たしている（図１参照）。したがって、ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失するように改変すれば、本来の肝細胞に対する感染能を欠失するように改変することができる。ここで、「ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失」とは、ｐｒｅＳ１領域のアミノ酸の一部、ｐｒｅＳ２領域のアミノ酸の一部、または両方の領域のアミノ酸の一部を欠失させることを意味する。例えば、ヒト肝細胞認識部位として知られているｐｒｅＳ領域（より詳細にはｐｒｅＳ１領域）のＮ末端から３番目〜６６番目（血清型ｙタイプ）または４番目〜７７番目（血清型ｄタイプ）のアミノ酸を欠失させることによって、肝細胞に対する感染能を欠失することができる。
【００３７】
ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の少なくとも一部を欠失させて肝細胞に対する感染能を欠失するように改変する場合、欠失させるアミノ酸領域によって、真核細胞での改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質の発現量が異なる。このタンパク質の真核細胞での発現量は、抗体を提示するように改変した場合に、特に、低下する傾向にある。
【００３８】
そこで、後述の実施例に示すように、ｐｒｅＳ領域のアミノ酸をドメイン単位で欠失させることによって、改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を真核細胞で大量に発現させることができる。具体的には、前述のようにヒト肝細胞認識部位として知られているｐｒｅＳ１領域のＮ末端から３番目〜６６番目（血清型ｙタイプ）または４番目〜７７番目（血清型ｄタイプ）のアミノ酸を欠失させることによって、真核細胞での発現量を多くすることができる。なお、血清型ｙタイプの場合は、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変、血清型ｄタイプの場合は、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変すればよい。
【００３９】
さらに、発現量を多くするには、ｐｒｅＳ１領域中の上記ヒト肝細胞認識部位の一部のアミノ酸に加えて、ｐｒｅＳ２領域のアミノ酸の一部を欠失させることが好ましい。
【００４０】
より詳細には、ｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２領域）の全アミノ酸配列のうち、血清型ｙタイプの場合は、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変することが好ましく、さらに、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変することがより好ましい。例えば、血清型ｙタイプの場合、後述の実施例に示すように、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から１５３番目のアミノ酸からドメイン単位でアミノ酸を欠失させた、５０番目〜１５３番目、３３番目〜１５３番目、および２１番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変することがより好ましく、このうち５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変することが特に好ましい。なお、アミノ酸を欠失させる範囲は、これに限定されるものではない。
【００４１】
一方、血清型ｄタイプの場合は、ｐｒｅＳ領域（ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２領域）の全アミノ酸配列のうち、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から６１番目〜１６４番目のアミノ酸を欠失するように改変することが好ましく、さらに、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変することがより好ましい。
【００４２】
このようにして、肝細胞に対する感染能を欠失し、さらに抗体を提示するように改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は、真核細胞で大量に発現するので生産性において非常に有利である。その結果、このタンパク質内の物質が特定の細胞または組織により多く運ばれるので、その物質による治療効果を飛躍的に上昇させることができる。
【００４３】
このように遺伝子組換え酵母を用いてタンパク質粒子を形成する方法は、菌体内の可溶性タンパク質から高効率で粒子が生産される点で好適である。
【００４４】
一方、昆虫細胞は、遺伝子組換え酵母よりも高等動物に近い真核細胞であるといえ、酵母では再現しきれない糖鎖等の高次構造をも再現できる点で異種タンパク質の大量生産において好ましい方法といえる。従来の昆虫細胞の系はバキュロウイルスを用いた系で、ウイルス発現を伴うものであったために、タンパク質発現に際して細胞が死滅したり溶解したりした。その結果、タンパク質発現を連続的に行ったり、死滅細胞から遊離したプロテアーゼによりタンパク質が分解したりするという問題があった。また、タンパク質を分泌発現させる場合には、培地中に含まれる大量の牛胎仔血清が混入することで、折角培地中に分泌されても精製が困難であった。しかし、最近になって、バキュロウイルスを介さない昆虫細胞系で、無血清培養可能なものがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社により開発され、市販されている。従って、このような昆虫細胞を用いれば、精製が容易で高次構造をも再現されたタンパク質粒子が得られる。
【００４５】
本発明のタンパク質中空ナノ粒子では、以上のような種々の方法によって得られた粒子表面に抗体を提示し、種々の物質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ぺプチド、および薬剤等）を粒子内に導入することにより、その抗体に対応する抗原を細胞表面に有する細胞に極めて高い特異性で物質を運搬、導入することが可能となる。
【００４６】
もちろん、粒子形性能を有するタンパク質は、上記の改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質に限られるものではなく、動物細胞、植物細胞、ウィルス、菌類等に由来する天然タンパク質や、種々の合成タンパク質等が考慮される。また、例えばウィルス由来の抗原タンパク質等が生体内において抗体を惹起する可能性がある場合などは、改変して抗原性を減少させたものを粒子形成能を有するタンパク質として用いてもよい。例えば、粒子形成能を有するタンパク質としては、国際出願ＷＯ０１／６４９３０に開示される抗原性を減少させたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であってもよいし、同国際出願に開示される他の改変型タンパク質（Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質を、遺伝子操作技術を用いて改変したタンパク質）であってもよい。
【００４７】
上記の粒子表面に提示する抗体としては、特定の細胞表面に存在する分子を抗原として認識するものであれば特に限定されるものではなく、たとえば特定の癌細胞表面に存在する分子を抗原として認識する癌特異的抗体、特定の細胞表面に存在する成長因子受容体やサイトカイン受容体などのレセプターを抗原として特異的に認識する抗体、その他の細胞表面抗原、組織特異的抗原等に対する抗体などが例示される。より具体的には、後述の実施例において使用した各抗体のほかに、抗ウィルス性タンパク質抗体などが挙げられる。このうち、どの抗体を提示させるかは、目的とする細胞あるいは組織に応じて適宜選択すればよい。
【００４８】
本発明では、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子に、目的の細胞あるいは組織に導入したい物質（細胞導入物質）を内包させることによって、細胞特異性を有する物質運搬体（薬剤）が得られる。この物質運搬体に内包される細胞導入物質とは、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどの遺伝子、天然あるいは合成タンパク質、オリゴヌクレオチド、ぺプチド、薬剤、天然あるいは合成化合物など、どのようなものであってもよい。
【００４９】
具体的には、既に発明者らにより報告されたヒトＲＮａｓｅ１（Ｊｉｎｎｏ Ｈ， Ｕｅｄａ Ｍ， Ｏｚａｗａ Ｓ， Ｉｋｅｄａ Ｔ， Ｅｎｏｍｏｔｏ Ｋ， Ｐｓａｒｒａｓ Ｋ， Ｋｉｔａｊｉｍａ Ｍ， Ｙａｍａｄａ Ｈ， Ｓｅｎｏ Ｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． １９９６；５８（２１）：１９０１−８）またはＲＮａｓｅ３（別名ＥＣＰ：ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ；Ｍａｌｌｏｒｑｕｉ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｇ， Ｐｏｕｓ Ｊ， Ｐｅｒａｃａｕｌａ Ｒ， ＡｙｍａｍｉＪ， Ｍａｅｄａ Ｔ， Ｔａｄａ Ｈ， Ｙａｍａｄａ Ｈ， Ｓｅｎｏ Ｍ， ｄｅ Ｌｌｏｒｅｎｓ Ｒ， Ｇｏｍｉｓ−Ｒｕｔｈ ＦＸ， ＣｏｌｌＭ； Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２０００ Ｊｕｌ ２８；３００（５）：１２９７−３０７．）等が適用される。
【００５０】
これらのタンパク質は、細胞内外で作用し細胞傷害活性を有するものであるが、これらのＲＮａｓｅを本発明の物質運搬体（薬剤）に内包させて運搬することにより、細胞外では無毒化する一方、細胞内だけで作用させることができるので、より副作用の少ない新しい癌治療方法として期待される。
【００５１】
なお、上記細胞導入物質として、ほかに下記表１に示すタンパク質あるいは当該タンパク質をコードする遺伝子が挙げられ、さらに、癌抑制遺伝子類（ｐ５３等）や、インターフェロン類、インターロイキン類、サイトカイン類、コロニー刺激因子類、腫瘍壊死因子類、トランスフォーミング増殖因子β類、血小板由来増殖因子類、エリスロポイエチン類、Ｆａｓ抗原類などのタンパク質あるいは当該タンパク質をコードする遺伝子も挙げることができる。
【００５２】
【表１】
また、これらの細胞導入物質を上記の中空ナノ粒子に導入する方法としては、通常の化学的、分子生物学的実験手法で用いられる様々な方法が適用される。たとえば、エレクトロポレーション法、超音波法、単純拡散法、あるいは電荷を有する脂質を用いる方法等が好ましく例示される。
【００５４】
そして、これらのタンパク質中空ナノ粒子、あるいは物質運搬体を用いて、ｉｎｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞、または組織に特異的に物質を導入することが可能となる。さらには、上記のＲＮａｓｅを用いた例のように、以上のとおりのタンパク質中空ナノ粒子や物質運搬体を用いて、特定細胞または組織に物質を導入することを各種疾患の治療法あるいは治療法の１ステップとして行うことも可能になるのである。
【００５５】
本発明に係る薬剤において、上記抗体を粒子表面に提示させる方法としては、後述の実施例に示すとおり、▲１▼粒子形成能を有するタンパク質に、二本鎖抗体の持つＦｃ部位と特異的に結合するＺＺタグを導入し（換言すれば、粒子形成能を有するタンパク質とＺＺタグとを融合させたかたちで発現させて粒子を形成し）、このＺＺタグと上記Ｆｃ部位とを結合させることにより、二本鎖抗体を粒子表面に提示させる方法、▲２▼粒子形成能を有するタンパク質に、ストレプトアビジンと特異的に結合するストレプトタグを導入し（換言すれば、粒子形成能を有するタンパク質とストレプトタグとを融合させたかたちで発現させて粒子を形成し）、このストレプトタグとストレプトアビジン（またはその誘導体）とを結合させ、さらに、ストレプトアビジン（またはその誘導体）と特異的に結合するビオチンで修飾した二本鎖抗体を結合させることにより、抗体を粒子表面に提示させる方法、▲３▼粒子形成能を有するタンパク質と一本鎖抗体とを融合させたかたちで発現させて粒子を形成することにより、抗体を粒子表面に提示させる方法、あるいは、▲４▼一般的な架橋試薬（例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）基、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ基、Ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒ基等を有する化合物。ＰＩＥＲＣＥ社から入手可能）を使用して、化学的に抗体と粒子とを結合する方法などが挙げられ、さらに、これら各方法の原理を利用しつつ、その一部を変更した変更方法などを用いるものであってよい。
【００５６】
本発明の薬剤による治療効果については、後述の実施例に示すとおり、動物実験により実際に確認された。この実施例では、ヒト扁平上皮癌由来の細胞を移植したヌードラットに対して、この癌細胞が発現する上皮成長因子受容体（ＥＧＦ受容体）を抗原として認識する抗体を粒子表面に提示し、単純ヘルペスウィルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ ｔｋ）遺伝子を包含した本発明の薬剤を投与し、さらにガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ：ＧＣＶ）を投与した後、移植した癌組織の大きさを観察することにより治療効果を確認した。薬剤の投与は静脈内投与により行ったが、投与方法としては、このほかに、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与等が挙げられる。
【００５７】
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【００５８】
なお、実施例に示すように、欠失型ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質のｐｒｅＳ１領域にタンパク質を組込む技術、真核細胞での高発現に好適な欠失型ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質を作製する技術、この欠失型ＨＢＶ表面抗原Ｌタンパク質に提示を目的として生体認識分子（抗体）を組込む技術、およびこれを用いた遺伝子治療やＤＤＳに応用する技術については、全く知られておらず、本願発明者らが独自に開発した技術である。
【００５９】
【実施例】
以下の実施例において、ＨＢｓＡｇとは、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）を示す。ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶの外被タンパク質であり、図１の摸式図に示すように、ＨＢｓＡｇには、Ｓタンパク質、Ｍタンパク質、Ｌタンパク質の３種類がある。このうち、Ｓタンパク質は、３種のタンパク質に共通した、重要な外被タンパク質であり、Ｍタンパク質は、Ｓタンパク質のＮ末端側に５５アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ２ ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものである。また、Ｌタンパク質は、Ｍタンパク質のＮ末端側に、１０８（血清型ｙタイプ）もしくは１１９（血清型ｄタイプ）アミノ酸（ｐｒｅ−Ｓ１ ｐｅｐｔｉｄｅ）が付加したものである。なお、以下の実施例では、血清型ｙタイプを使用した。
【００６０】
ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のＰｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１， ｐｒｅ−Ｓ２）は、ＨＢＶが肝細胞に結合する際に、それぞれ重要な役割を担うことが知られている。Ｐｒｅ−Ｓ１は、肝細胞に直接結合する部位を持ち、ｐｒｅ−Ｓ２は、血中の重合アルブミンを介して肝細胞に結合する重合アルブミンレセプターを有するのである。
【００６１】
真核細胞でＨＢｓＡｇを発現させると、同タンパク質は、小胞体膜上に膜タンパク質として発現、蓄積される。ＨＢｓＡｇのＬタンパク質は、分子間で凝集を起こし、小胞体膜を取り込みながら、出芽様式でルーメン側に粒子として放出される。
【００６２】
以下の実施例では、ＨＢｓＡｇのＬタンパク質を用いた。また、図２に以下の実施例に記載されるＨＢｓＡｇ粒子の発現および精製操作の概略説明図を示した。
【００６３】
（実施例Ａ） 遺伝子組換え酵母によるＨＢｓＡｇ粒子の発現
本発明者らによって報告されたＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， Ｖｏｌ．２６７， Ｎｏ．３， １９５３−１９６１， １９９２記載の方法に基づいて、ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴを保持した遺伝子組換え酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−株）を、合成培地Ｈｉｇｈ−Ｐｉおよび８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００中で培養し、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子を発現させた。（図２ａ〜ｃ）定常成長期（約７２時間後）にある遺伝子組換え酵母から、Ｙｅａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製）を用いて、ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｅｘｔｒａｃｔを準備し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離して、銀染色によって試料中のＨＢｓＡｇの同定を行った。
【００６４】
これより、ＨＢｓＡｇは分子量約５２ｋＤａのタンパク質であることが明らかとなった。
【００６５】
（実施例Ｂ） ＨＢｓＡｇ粒子の遺伝子組換え酵母からの精製
（１）合成培地８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００で培養された遺伝子組換え酵母（湿重量２６ｇ）をｂｕｆｆｅｒ Ａ溶液（７．５Ｍ 尿素、０．１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ８０）１００ｍｌに懸濁し、グラスビーズを用いてビードビーター（ＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲ）にて酵母を破砕した。破砕後、上清を遠心分離により回収した。（図２ｄ）
（２）次に、上清を０．７５倍容の３３％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６０００と混合し、３０分間氷冷した。その後、遠心分離（７０００ｒｐｍ、３０分間）を行い、ペレットを回収した。同ペレットは、Ｔｗｅｅｎ８０を含まないｂｕｆｆｅｒ Ａ溶液中で再懸濁した。
【００６６】
（３）再懸濁した液を、１０〜４０％の勾配をかけたＣｓＣｌに重層し、２８０００ｒｐｍ、１６時間の超遠心分離を行った。遠心分離後の試料を１２画分に分け、ウェスタンブロット法（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）（１次抗体は、ａｎｔｉ−ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体）によりＨＢｓＡｇを含む画分を同定した。さらに、ＨＢｓＡｇを含む画分を、Ｔｗｅｅｎ８０を含まないｂｕｆｆｅｒ Ａ溶液で透析した。
【００６７】
（４）（３）で得られた透析液（１２ｍｌ）を５〜５０％の勾配をかけたショ糖に重層し、２８０００ｒｐｍ、１６時間の超遠心分離を行った。遠心分離後、（３）と同様に、ＨＢｓＡｇを含む画分を同定し、ＨＢｓＡｇを含む画分を尿素とＴｗｅｅｎ８０は含まず、代わりに０．８５％のＮａＣｌを含むｂｕｆｆｅｒ Ａ溶液で透析した。（（２）〜（４）：図２ｅ）
（５）（４）と同様の操作を繰り返し、透析後の試料をウルトラフィルター（Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ） Ｑ２０００（アドバンテック社製）を用いて濃縮し、使用する時まで４℃にて冷蔵保存した。（図２ｆ）
ＣｓＣｌ平衡遠心分離後のウェスタンブロット（３）の結果から、ＨＢｓＡｇは、分子量５２ｋＤａでＳ抗原性を有するタンパク質であることが分かった。最終的に、培地２．５Ｌ由来、湿重量２６ｇの菌体から、約２４ｍｇの精製ＨＢｓＡｇ粒子を得た。
【００６８】
一連の精製過程における画分を銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。また、精製により酵母由来のプロテアーゼが除去されていることを確認するために、（５）で得られたＨＢｓＡｇ粒子を３７℃で１２時間インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色により同定を行った。
【００６９】
その結果、酵母由来のプロテアーゼは、一連の精製過程において完全に除去されていることが確認された。
【００７０】
ところで、上記ＨＢｓＡｇ粒子はヒト肝細胞特異的に感染することができるが、その高い感染性を担う同粒子表面に提示されている肝細胞認識部位は、ｐｒｅ−Ｓ１領域の３から７７アミノ酸残基に含まれていることが判明している（Ｌｅ Ｓｅｙｅｃ Ｊ， Ｃｈｏｕｔｅａｕ Ｐ， Ｃａｎｎｉｅ Ｉ， Ｇｕｇｕｅｎ−Ｇｕｉｌｌｏｕｚｏ Ｃ， Ｇｒｉｐｏｎ Ｐ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． １９９９， Ｍａｒ； ７３（３）： ２０５２−７）。
【００７１】
以下では、癌特異的抗体を粒子表面に提示させた本発明の薬剤の作製方法について説明するが、下記作製方法においては、その抗体の抗原となる分子を細胞表面に有する特定の癌細胞に対してのみ本発明の薬剤を作用させるため、上記ＨＢｓＡｇ粒子の本来の肝細胞に対する高い感染能を欠失させた。また、本発明の薬剤として、▲１▼ストレプトタグを用いて癌特異的抗体を提示させたＨＢｓＡｇ粒子、▲２▼ＺＺタグを用いて癌特異的抗体を提示させたＨＢｓＡｇ粒子、および▲３▼癌特異的な一本鎖抗体をＨＢｓＡｇタンパク質と融合させて発現させることにより、粒子表面に提示させたＨＢｓＡｇ粒子、をそれぞれ作製した。
【００７２】
（実施例Ｃ） ストレプトタグを用いた癌特異的抗体を提示するＨＢｓＡｇ粒子の作製
（実施例Ｃ−１）酵母細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の作製
実施例Ａに記載されたｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴプラスミドのヒト肝細胞認識部位をコードする遺伝子領域を欠失させ、同時に制限酵素ＮｏｔＩサイト（ｇｃｇｇｃｃｇｃ）を挿入するために、配列番号１のオリゴヌクレオチドと配列番号２のオリゴヌクレオチドとをＰＣＲ用プライマーとして使用して、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いたＰＣＲ法をｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴプラスミドに対して行った。
【００７３】
具体的には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ） を用い、ＰＣＲスケジュールは、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分間のアニーリング、６８℃３０分間の合成反応を３０回繰り返した。その後、ＰＣＲ産物を制限酵素ＤｐｎＩで処理し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、出現コロニーからベクターＤＮＡを抽出し、塩基配列から変異導入されたｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴプラスミドを選抜した。以下、ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Ｎｕｌｌプラスミドと呼ぶ。なお、図３以降の図面では、このプラスミドが持つ、上記ヒト肝細胞認識部位を欠くＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質をコードする遺伝子領域を「Ｎｕｌｌ」と表示している。以下では便宜上、この遺伝子領域を「Ｎｕｌｌ領域」と呼ぶこととする。
【００７４】
図３に示すように、上記ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Ｎｕｌｌプラスミドに対し、ＳａｃＩサイトおよびＳａｌＩサイトを付加するために、ＳａｃＩサイトを付加した配列番号３のオリゴヌクレオチドとＳａｌＩサイトを付加した配列番号４のオリゴヌクレオチドとをＰＣＲ用プライマーとして使用して、ＰＣＲを行った。これにより、プロモーター（ＧＬＤｐ）およびターミネーター（ＰＧＫｔ）を含むＮｕｌｌ領域を増幅させ、Ｎｕｌｌ領域を含むｃＤＮＡ断片を得た。
【００７５】
次いで、ｐＲＳ４０５＋２μｍプラスミド（汎用型酵母ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＡａｔＩＩサイトに酵母用多コピー型２μｍ複製部位を組み込むことにより作製）を制限酵素ＳａｃＩおよびＳａｌＩにより消化した後、Ｎｕｌｌ領域を含む上記ｃＤＮＡ断片を開裂したプラスミドｐＲＳ４０５＋２μｍに挿入して、ｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドを作製した。
【００７６】
次に、ストレプトタグ（ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ）をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号５およびこれと相補的な配列番号６のオリゴヌクレオチド）をアニーリングさせ、上記ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ＮｕｌｌプラスミドをＮｏｔＩ消化したものに挿入して、ストレプトタグをコードする遺伝子領域
を有するｐＲＳ４０５＋２μｍ−ｓｔｒｅｐ−ｔａｇプラスミドを作製した。ここで、ストレプトタグとは、ストレプトアビジンに対してビオチンの様に高い親和性で結合するペプチドであり、Ｎ末から順に、１）ＳＡＷＲＨＰＱＦＧＧあるいは２）ＷＳＨＰＱＦＥＫの配列からなるものである。前者１）は、タンパク質のＣ末で機能するものであり、本実施例では、後者２）の配列のストレプトタグを用いた。
【００７７】
その後、上記ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ｓｔｒｅｐ−ｔａｇプラスミドにより酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−株）を形質転換させ、得られたトランスフォーマントを培養後、実施例Ｂに記載の方法に従って、培養細胞から改変型ＨＢｓＡｇ粒子（上記ヒト肝細胞認識部位を欠くＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質とストレプトタグとを融合させたかたちで発現させて得られた粒子。以下、「ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子」という）を精製したところ、培地１．０Ｌ由来の菌体から、約２００μｇの精製ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を得た。
【００７８】
（実施例Ｃ−２）無血清培養の昆虫細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の作製
以下では、糖鎖等の高次構造の再現も可能な作製方法として、バキュロウィルスを介さず、無血清培養が可能な昆虫細胞系を用いたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の作製方法について説明する。
【００７９】
図４に示すように、実施例Ｃ−１に記載の上記ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Ｎｕｌｌプラスミドから、配列番号７のオリゴヌクレオチド（ＫｐｎＩサイトｇｇｔａｃｃを有する）及び配列番号８のオリゴヌクレオチド（ＳａｃＩＩサイトｃｃｇｃｇｇを有する）の各プライマーを用いたＰＣＲにより、ニワトリ由来リゾチーム分泌シグナルペプチドのコード領域を含む上記Ｎｕｌｌ領域を増幅した。
【００８０】
ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で分離し、約１．３ｋｂｐの目的バンドの遺伝子断片を回収した後、昆虫細胞安定発現用ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のＫｐｎＩサイトとＳａｃＩＩサイトとの間に、上記遺伝子断片をＴａＫａＲａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（ＴａＫａＲａ社）を用いて、閉環結合させた。塩基配列を確認した後、このプラスミドをｐＩＺＴ−Ｎｕｌｌと命名した。
【００８１】
次に、実施例Ｃ−１と同様に、ｓｔｒｅｐｔａｇをコードした合成オリゴヌクレオチド（配列番号５およびこれと相補的な配列番号６のオリゴヌクレオチド）をアニーリングさせ、上記ｐＩＺＴ−ＮｕｌｌプラスミドをＮｏｔＩ消化したものに挿入して、ストレプトタグをコードする領域を有する
ｐＩＺＴ−ｓｔｒｅｐｔａｇプラスミドを作製した。
【００８２】
一方、昆虫細胞Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ株（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を、約１ヶ月かけて次第に牛胎仔血清入り培地から無血清培地（Ｕｌｔｉｍａｔｅ Ｉｎｓｅｃｔ Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に馴化させた。次に、上記ｐＩＺＴ−ｓｔｒｅｐｔａｇプラスミドを遺伝子導入用脂質Ｉｎｓｅｃｔｉｎ−Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて無血清培地に馴化させたＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ株に形質転換した。その後、無血清培地で２７℃４８時間培養し、抗生物質ｚｅｏｃｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を４００ μｇ／ｍＬ含有する無血清培地で更に細胞がｃｏｎｆｌｕｅｎｔになるまで４〜７日間培養し、ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を得た。
【００８３】
１５００×ｇ、５分間遠心により培養上清を回収し、ＩＭｘキット（ダイナボット社）により、培地中のＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の発現測定したところ、ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子が発現していることが確認された。さらに、上記培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体（発明者らが作製）によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。その結果、ストレプトタグが融合したＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子は分子量約４２ｋＤａであった。
【００８４】
以上のようにして得られた培養上清１Ｌを用いて、限外濾過器（使用フィルターはＵＫ−２００：ＡＤＶＡＮＴＥＣ社、排除分子量２００Ｋ）で濃縮した後、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ、東洋ソーダ社）により精製したところ、均一なＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子約１ｍｇを精製することができた。
【００８５】
（実施例Ｃ−３）動物細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子の作製
図５に示すように、制限酵素ＸｈｏＩを用いて、上記ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−ＮｕｌｌプラスミドにおけるＸｈｏＩサイトでターミネーター（ＰＧＫｔ）を含むＮｕｌｌ領域を含む断片を取り出した。次いで、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｈｏＩにより消化した後、上記断片をｐｃＤＮＡ３．１に挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｕｌｌプラスミドを作製した。
【００８６】
次に、実施例Ｃ−１と同様に、ｓｔｒｅｐｔａｇ遺伝子をコードする合成オリゴヌクレオチド（配列番号５およびこれと相補的な配列番号６のオリゴヌクレオチド）をアニーリングさせ、上記ｐｃＤＮＡ３．１−ＮｕｌｌプラスミドをＮｏｔＩ消化したものに挿入して、ストレプトタグのコード領
域を有するｐｃＤＮＡ３．１−ｓｔｒｅｐｔａｇプラスミドを作製した。
【００８７】
上記ｐｃＤＮＡ３．１−ｓｔｒｅｐｔａｇプラスミドを、サル腎由来ＣＯＳ７細胞へ、遺伝子導入装置ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いて導入した。導入後、１０％子牛胎児血清を含むダルベッコ改変培地で一晩培養した後、培地を無血清培地ＣＨＯ−ＳＦＭＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）に置き換えて、さらに１週間培養して、培地からＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を精製した。
【００８８】
また、実施例Ｃ−２と同様に、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。その結果、ストレプトタグが融合されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子は分子量約４２ｋＤａであることがわかった。ＩＭｘによる測定値は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを用いてＨＢｓＡｇ Ｌ粒子野生型を発現したもの：８．８１（対カットオフ値）、ＨＢｓＡｇ Ｎｕｌｌ粒子：３．４７、ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子：２．４１であり、それぞれ十分な生産量を示していた。
【００８９】
（実施例Ｃ−４）ストレプトタグを有するＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子に抗体を提示させる方法
上記実施例Ｃ−１〜Ｃ−３では、ストレプトタグを有するＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を作製した。このストレプトタグは、ストレプトアビジンと特異的に結合する。さらに、このストレプトアビジンは、ビオチンと特異的に結合する。そこで、上記各ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子とストレプトアビジンとを結合させ、その後、ストレプトアビジンとビオチン修飾した抗体とを結合させることにより、粒子表面に抗体が整列提示されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子（以下、このように抗体が提示されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子を「ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子」という）を作製した。
【００９０】
具体的には、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体である抗ヒトＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体７Ｇ７Ｂ６（精製品）を抗体に使用し、この抗体に対して、ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）により、Ｐｉｅｒｃｅ社の説明書のプロトコルに従ってビオチン標識した。次に、上記精製したＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子と、アビジンタンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ社製ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ａｖｉｄｉｎ）とを、ＰＢＳ中常温で３０分間、モル比ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子（モル計算は構成分子単位で行った）２：アビジンタンパク質１で混合結合させた。その後、上記のビオチン標識した抗ヒトＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体を、上記アビジンタンパク質が結合したＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子に対して等モル加えてＰＢＳ中常温で３０分間反応させた。これにより、粒子表面に上記抗体が提示されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子を作製した。
【００９１】
（実施例Ｃ−５）上記ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子への遺伝子導入
まず、国際出願ＷＯ０１／６４９３０に開示される方法と同様に、上記ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子と緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））とを混合し、エレクトロポレーション法により、ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子内にｐＥＧＦＰ−Ｆを封入した。これにより、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子を作製した。
【００９２】
次に、ヒト扁平上皮癌由来細胞Ａ４３１（ＪＣＲＢ９００９）および陰性対照としてヒト肝癌由来細胞ＮＵＥ、ヒト大腸癌由来細胞ＷｉＤｒを準備した。上記Ａ４３１および陰性対照（ＮＵＥ、ＷｉＤｒ）を、それぞれ３．５ｃｍガラス底皿シャーレ上に培養し、上記のＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子を１μｇ混合し、４日間培養を継続した。その後、各細胞内でのＧＦＰの発現の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した。
【００９３】
その結果、Ａ４３１細胞ではＧＦＰの蛍光が観察されたが、陰性対照（ＮＵＥ細胞、ＷｉＤｒ）ではＧＦＰの蛍光が観察されなかった。
【００９４】
以上のように、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子を用いて、培養細胞レベルで、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入し発現させることができた。これにより、上記ＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ−Ａｂ粒子に細胞を治療する細胞導入物質を包含させることにより、特定の細胞および組織における疾患を効果的に治療することができる可能性が示された。
【００９５】
（実施例Ｄ） ＺＺタグを用いた抗体提示型ＨＢｓＡｇ粒子の作製
（実施例Ｄ−１）酵母細胞によるＨＢｓＡｇ−ＺＺ粒子の作製
まず、図６に示すように、実施例Ｃ−１と同様にして、ｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドを作製した。
【００９６】
次いで、ＺＺタグ（ＺＺｔａｇ）をコードする遺伝子領域（図中、「ＺＺ」。以下、「ＺＺ領域」という）を有するプラスミド（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来ＰｒｏｔｅｉｎＡ遺伝子を基にＺＺ領域を挿入して作製）に対して、ＮｏｔＩサイトを付加した配列番号９および配列番号１０の各オリゴヌクレオチドをＰＣＲ用プライマーとして使用してＰＣＲを行い、ＺＺ領域を含む領域を増幅した。上記ＺＺタグとは、イムノグロブリンＧのＦｃ領域と結合する能力を有するアミノ酸配列と規定され、次の２回繰り返し配列からなる（ＺＺタグの配列：Ｎ末から、ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ）。
【００９７】
次いで、上記ｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドを制限酵素ＮｏｔＩにより消化し、開裂した当該プラスミドに上記増幅断片を挿入して、ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ＺＺプラスミドを作製した。
【００９８】
実施例Ａと同様に、上記プラスミド遺伝子ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ＺＺを酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ‐にスフェロプラスト法により形質転換し、得られたトランスフォーマントを培地Ｈｉｇｈ−Ｐｉ３ｍｌにて３０度３日間、続いて、８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００ ３ｍｌにて３０度３日間培養し、ＺＺタグを提示するＨＢｓＡｇ粒子を得た。
【００９９】
その後、上記ｐＲＳ４０５＋２μｍ−ＺＺプラスミドにより酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−株）を形質転換させ、得られたトランスフォーマントを培養後、実施例Ｂに記載の方法に従って、培養細胞から改変型ＨＢｓＡｇ粒子（上記ヒト肝細胞認識部位を欠くＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質とＺＺタグとを融合させたかたちで発現させて得られた粒子。以下、「ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子」という）を精製したところ、粒子の発現量は極めて高く、培地１．０Ｌ由来の菌体から、約２０ｍｇの精製ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を得た。
【０１００】
さらに、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。図７にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す。また、ＩＭｘの結果は、ｐＲＳ４０５＋２μｍベクターを用いてＨＢｓＡｇ Ｌ粒子野生型を発現したもの：４９．４３（対カットオフ値、１００倍希釈時）、ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子：２１．８７、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子：２５３．６４であり、それぞれ十分な生産量を示していた。これらの結果より、ＺＺタグを有するＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子は分子量約５６ｋＤａであることがわかった。
【０１０１】
（実施例Ｄ−２）無血清培養の昆虫細胞によるＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子の作製まず、図８に示すように、実施例Ｃ−２と同様の方法により、ｐＩＺＴ−Ｎｕｌｌプラスミドを得た。
【０１０２】
次に、実施例Ｄ−１と同様の方法により、ＺＺ領域を含む領域を上記ｐＩＺＴ−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入して、ｐＩＺＴ−ＺＺプラスミドを作製した。
【０１０３】
次いで、実施例Ｃ−２と同様の方法により、上記ｐＩＺＴ−ＺＺプラスミドを昆虫細胞に導入して、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を発現させた。
【０１０４】
また、上記昆虫細胞を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体（発明者らが作製、マウスポリクローナル抗体）によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより解析した。その結果、ＺＺタグを提示するＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子は分子量約５６ｋＤａであることがわかった。
【０１０５】
また、Ｃ−２と同様の方法により培養上清１ＬからＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子約１ｍｇが得られた。
【０１０６】
（実施例Ｄ−３）動物細胞によるＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子の作製
まず、図９に示すように、実施例Ｃ−３と同様の方法により、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｕｌｌプラスミドを作製した。
【０１０７】
次に、実施例Ｄ−１と同様の方法により、ＺＺ領域を含む領域を上記ｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１−ＺＺプラスミドを作製した。
【０１０８】
次いで、実施例Ｃ−３と同様の方法により、上記ｐｃＤＮＡ３．１−ＺＺプラスミドをＣＯＳ７細胞に導入して、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を発現させた。
また、上記ＣＯＳ７細胞を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ＺＺｐｔａｇ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体（発明者らが作製、マウスポリクローナル抗体）によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。ＩＭｘの結果は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを用いてＨＢｓＡｇ Ｌ粒子野生型を発現したもの：８．８１（対カットオフ値）、ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子：３．４７、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子：２．４１であり、それぞれ非常に高い生産量を示していた。その結果、ＺＺタグを提示するＨＢｓＡｇ−ＺＺｐｔａｇ粒子は分子量約５６ｋＤａであることがわかった。
【０１０９】
（実施例Ｄ−４）上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子に対する抗体の提示方法
上記ＺＺタグは、抗体分子のＦｃ部分に対して高い親和性を有しており、たとえば、癌特異的抗体である、ヒトＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に対するマウスモノクローナル抗体７Ｇ７Ｂ６、ヒトＩＬ−２受容体（Ｔａｃ抗原）に対するマウスモノクローナル抗体５２８、およびヒト大腸癌に対する大腸癌特異的マウスモノクローナル抗体ＳＴ−４２１等と特異的に結合することができる。そこで、上記各ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子とこれらいずれかの抗体とを結合させることにより、粒子表面に抗体が整列提示されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子（以下、このように抗体が提示されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を「ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子」という）を作製した。
【０１１０】
具体的には、上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子と、抗ヒトＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体７Ｇ７Ｂ６（精製品）とを等モル（モル計算は構成分子単位で行った）混合し、ＰＢＳ中で約１時間反応させた。これにより粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を作製することができた。
【０１１１】
（実施例Ｄ−５）上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子への遺伝子導入
まず、国際出願ＷＯ０１／６４９３０に開示される方法と同様に、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子と緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））とを混合し、エレクトロポレーション法により、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子内にｐＥＧＦＰ−Ｆを封入した。これにより、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を作製した。
【０１１２】
次に、実施例Ｃ−５と同様に、ヒト扁平上皮癌由来細胞Ａ４３１および陰性対照として、ヒト肝癌由来細胞であるＮＵＥとＨｕＨ−７（ＪＣＲＢ０４０３）、ヒト大腸癌由来細胞ＷｉＤｒ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２１８）を準備した。上記Ａ４３１およびＮＵＥ、ＨｕＨ−７、ＷｉＤｒを、それぞれ３．５ｃｍガラス底皿シャーレ上に培養し、上記ＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ−ＧＦＰ粒子を１μｇ混合し、４日間培養を継続した。その後、各細胞内でのＧＦＰの発現の様子を共焦点レーザー蛍光顕微鏡で観察した。
【０１１３】
その結果、Ａ４３１細胞ではＧＦＰの蛍光が観察されたが、ＮＵＥ細胞など他の細胞ではＧＦＰの蛍光が観察されなかった。
【０１１４】
以上のように、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を用いて、培養細胞レベルで、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入し発現できることが示された。
【０１１５】
さらに、ヌードマウス（系統：ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ、微生物学的品質：ＳＰＦ、性別：オス５週齢）の両側背部皮下に、ヒト腫瘍株（Ａ４３１、ＨｕＨ−７、ＷｉＤｒ）をそれぞれ１×１０７細胞皮下に注射し、移植腫瘍が直径２ｃｍ程度の固形癌になるまで２〜４週間生育させて、担癌マウスを得た。
【０１１６】
次に、上記のＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を、マウス腹腔内に２６Ｇ注射針を使用して投与した。投与後４日目にマウスを屠殺し、腫瘍部、肝臓、脾臓、腎臓、腸管を摘出し、ＧＦＰ用樹脂包埋キット（Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００）を用いて組織を固定・包埋した。
【０１１７】
具体的には、固定は４％中和ホルムアルデヒドに浸漬して行い、脱水は７０％ＥｔＯＨで室温２時間、９６％ＥｔＯＨで室温２時間、１００％ＥｔＯＨで室温１時間、予備浸漬は１００％ＥｔＯＨ／Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００等量混合液で室温２時間行った。その後、Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００で室温２４時間以内の浸漬を行い、取り出した後、室温で１時間および３７℃で１時間静置して重合反応させた。
【０１１８】
常法に従って、切片を作製し、同時にヘマトキシンエオリン染色（一般的な組織染色）を行って、蛍光顕微鏡により各切片のＧＦＰによる蛍光を比較した。その結果、ヒト扁平上皮癌由来細胞Ａ４３１においては、ＧＦＰによる蛍光が認められた。一方、同マウスより同時に摘出した肝臓、脾臓、腎臓、腸管においては蛍光を認められなかった。これに対して、他のヒト癌由来細胞（ＨｕＨ−７、ＷｉＤｒ）による担癌マウスにおいては、腫瘍部においても肝臓、脾臓、腎臓、腸管においてもＧＦＰに由来する蛍光は認められなかった。また、上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を投与しなかった担癌マウスにおいても蛍光を認めなかった。
【０１１９】
以上のように、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドが包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を用いて、実験動物レベルで、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入し発現できることが示された。
【０１２０】
（実施例Ｄ−６）上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子による治療効果
次に、上記各作製方法のうち酵母を用いて作製したＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子内へ、癌治療用遺伝子として単純ヘルペスウィルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ ｔｋ）遺伝子を封入し、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が包含された本発明の薬剤としてのＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を製造した。
【０１２１】
上記ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が導入された癌細胞では、このＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が発現することによりガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ：ＧＣＶ）に対して感受性になり、ガンシクロビルが投与されると、強力な巻き添え効果を惹起しつつ、癌細胞は死滅する。このように、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子は、癌遺伝子治療に広く使用される遺伝子の１つである。
【０１２２】
本実施例では、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子内へＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子を封入するため、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子を発現するＩｎｖｉｖｏｇｅｎ社製のベクターｐＧＴ６５−ｈＩＦＮ−αを使用し、この発現ベクターをエレクトロポレーション法によりＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子内に導入することによって、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を作製した。具体的には、ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子中のＬタンパク質粒子５０μｇに対し、上記発現ベクター１０μｇ導入した。またこのとき、ＰＢＳバッファーを使用し、エレクトロポレーションの条件は、２２０Ｖ、９５０μＦで４ｍｍのキュベットを使用して行った。
【０１２３】
また、本実施例では、実験動物として日本クレアから購入したヌードラット（系統：Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ、性別：メス）を使用し、このヌードラットの両側背部皮下に、ヒト扁平上皮癌由来細胞Ａ４３１、および陰性対照としてヒト大腸癌由来ＷｉＤｒ細胞をそれぞれ１×１０７細胞程度皮下注射により移植し、移植腫瘍が直径２〜３ｃｍ程度の固形癌になるまで約３週間生育させて得た。
【０１２４】
その後、上記ヌードラットに、ＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が包含された上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を１０μｇ尾静脈より投与した（静脈注射した）。そして、静脈注射の５日後から、上記ヌードラットに対し、浸透圧ポンプ（ａｌｚｅｔ ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｕｍｐ；Ｃａｔ番号２ＭＬ２）を使用してガンシクロビル（ＧＣＶ）を５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの割合で投与した。上記浸透圧ポンプは、ＧＣＶを含む薬液とともに上記ヌードラットの背中皮下に移植した。このガンシクロビルの投与は、最大１４日間行った。ガンシクロビル投与後、上記ヌードラットの腫瘍組織の状態（大きさ）を経時的に観察した。具体的には、ノギスで腫瘍部分の短径と長径とを測定し、腫瘍容積近似式（長径×短径×短径／２）を計算して行った。測定は、全てネズミ３連で行った。その結果を表２および図１０に示す。
【０１２５】
【表２】
以上の結果から、粒子表面に抗ヒトＥＧＦＲ抗体が提示され、粒子内部にＨＳＶ１ ｔｋ遺伝子が包含されたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ−Ａｂ粒子を用いて、実験動物レベルで、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性と効率で遺伝子を導入し発現でき、癌の治療効果を有することが認められた。
【０１２７】
（実施例Ｅ）一本鎖抗体を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子の作製
（実施例Ｅ−１）酵母細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子の作製
まず、図６に示すように、実施例Ｄ−１と同様の方法により、但し同実施例で使用したＺＺ領域を有するプラスミドおよびＰＣＲ用プライマーに代えて、プラスミドには、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒト血清アルブミン抗体であるＡ２２をコードする遺伝子領域を有するプラスミド（ＴＯＴＯ株式会社から分与）、あるいは、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒトＲＮａｓｅ抗体である３Ａ２１をコードする遺伝子領域を有するプラスミド（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７ Ａｕｇ−Ｓｅｐ；３４（１２−１３）：８８７−９０ Ｋａｔａｋｕｒａ Ｙ， Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｔ， Ｉｗａｉ Ｙ， Ｋｕｒｏｋａｗａ Ｙ， Ｏｍａｓａ Ｔ， Ｓｕｇａ Ｋ．およびＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ １９９７ Ｊｕｌ；３４（１０）：７３１−４ Ｋａｔａｋｕｒａ Ｙ， Ｋｕｍａｍｏｔｏ Ｔ， Ｉｗａｉ Ｙ， ＫｕｒｏｋａｗａＹ， Ｏｍａｓａ Ｔ， Ｓｕｇａ Ｋ．に記載の方法により作製）を使用し、ＰＣＲ用プライマーには、ＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１１および配列番号１２の各オリゴヌクレオチド（上記Ａ２２の場合）、あるいはＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１３および配列番号１４の各オリゴヌクレオチド（上記３Ａ２１の場合）を使用してＰＣＲを行い、上記抗体Ａ２２または３Ａ２１をコードする遺伝子領域を含む領域を増幅した。上記一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ｓｃＦｖ）とは、本来２本のポリペプチドで構成される抗体の抗原認識部位を一本のポリペプチド上で再構成した擬似抗体分子のことである。
【０１２８】
次に、上記ＰＣＲにより得られた増幅断片をｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入してｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ａ２２プラスミドあるいはｐＲＳ４０５＋２μｍ−３Ａ２１プラスミドを作製した。そして、これらいずれかのプラスミドを酵母に導入して発現させることにより、一本鎖抗体Ａ２２あるいは３Ａ２１がＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質と融合したかたちで発現され、粒子表面に提示された粒子（以下、このように一本鎖抗体Ａ２２あるいは３Ａ２１が提示された粒子を「ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子」という）を得た。
【０１２９】
また、上記酵母を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇおよび酵素免疫測定ＩＭｘにより解析した。図１１にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す。ＩＭｘの結果は、ｐＲＳ４０５＋２μｍベクターを用いてＨＢｓＡｇ Ｌ粒子野生型を発現したもの：４９．４３（対カットオフ値、１００倍希釈時）、ＨＢｓＡｇ−Ｎｕｌｌ粒子：２１．８７、Ａ２２を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子：２．４１、３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子：４．０２であり、それぞれ非常に高い生産量を示していた。これらの結果より、抗体Ａ２２を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであり、抗体３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであることが明らかとなった。なお、実施例Ｃ−２と同様の方法により、それぞれ培地１．０Ｌ由来の菌体から、約２００μｇの精製ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子を得た。
【０１３０】
（実施例Ｅ−２）無血清培養の昆虫細胞によるＨＢｓＡｇ―ｓｃＦｖ粒子の作製まず、図８に示すように、実施例Ｄ−２と同様の方法により、但し同実施例で使用したＺＺ領域を有するプラスミドおよびＰＣＲ用プライマーに代えて、プラスミドには、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒト血清アルブミン抗体であるＡ２２、あるいは、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒトＲＮａｓｅ抗体である３Ａ２１をコードする遺伝子領域を有するプラスミドを使用し、ＰＣＲ用プライマーには、ＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１１および配列番号１２の各オリゴヌクレオチド（上記Ａ２２の場合）、あるいはＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１３および配列番号１４の各オリゴヌクレオチド（上記３Ａ２１の場合）を使用してＰＣＲを行い、上記抗体Ａ２２または３Ａ２１をコードする遺伝子領域を含む領域を増幅した。
【０１３１】
次に、上記ＰＣＲにより得られた増幅断片をｐＲＳ４０５＋２μｍ−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入してｐＩＺＴ−Ａ２２プラスミドあるいはｐＩＺＴ−３Ａ２１プラスミドを作製した。そして、これらいずれかのプラスミドを前記昆虫細胞に導入して発現させることにより、一本鎖抗体Ａ２２あるいは３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子を得た。
【０１３２】
また、上記昆虫細胞を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより解析した。この結果より、Ａ２２を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであり、３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであることがわかった。
【０１３３】
また、Ｃ−２と同様の方法により、それぞれ培養上清１ＬからＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子約１ｍｇが得られた。
【０１３４】
（実施例Ｅ−３）動物細胞によるＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子の作製
まず、図９に示すように、実施例Ｄ−３と同様の方法により、但し同実施例で使用したＺＺ領域を有するプラスミドおよびＰＣＲ用プライマーに代えて、プラスミドには、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒト血清アルブミン抗体であるＡ２２、あるいは、一本鎖抗体マウス由来の抗ヒトＲＮａｓｅ抗体である３Ａ２１をコードする遺伝子領域を有するプラスミドを使用し、ＰＣＲ用プライマーには、ＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１１および配列番号１２の各オリゴヌクレオチド（上記Ａ２２の場合）、あるいはＮｏｔＩサイトを付加した配列番号１３および配列番号１４の各オリゴヌクレオチド（上記３Ａ２１の場合）を使用してＰＣＲを行い、上記抗体Ａ２２または３Ａ２１をコードする遺伝子領域を含む領域を増幅した。
【０１３５】
次に、上記ＰＣＲにより得られた増幅断片をｐｃＤＮＡ３．１−Ｎｕｌｌプラスミドに挿入してｐｃＤＮＡ３．１−Ａ２２プラスミドあるいはｐｃＤＮＡ３．１−３Ａ２１プラスミドを作製した。そして、これらいずれかのプラスミドを前記ＣＯＳ７細胞に導入して発現させることにより、一本鎖抗体Ａ２２あるいは３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子を得た。
【０１３６】
また、上記ＣＯＳ７細胞を培養後、培養上清を回収し、培養上清から得たＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｓ抗体によるＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔｔｉｎｇにより解析した。この結果より、Ａ２２を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであり、３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は分子量約７６ｋＤａであることがわかった。
【０１３７】
（実施例Ｅ−４）上記ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子への遺伝子導入
上記のように作製したＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子のうち、抗体として上記Ａ２２を提示させたものに対してはヒト血清アルブミンを、一方、抗体として上記３Ａ２１を提示させたものに対してはヒトＲＮａｓｅ１を、それぞれ９６穴プレートに固定し、ＥＬＩＳＡ法により結合係数を測定した。この際、固相に結合したＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子の量を、ダイナボット社のＡＵＳＺＹＭＥ ＩＩに付属しているＨＲＰ標識抗ＨＢｓＡｇポリクローナル抗体で定量した。その結果、ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子単位ではなく、粒子の部品であるタンパク質単位で、ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子（Ａ２２の場合）は１００ｎＭ以下の結合定数、ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子（３Ａ２１の場合）は５０ｎＭ以下の結合係数をそれぞれ示した。これらの値は、両方のＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子が生体内で特定の部位に薬剤等を運搬できる運搬体となり得るために有効な値である。
【０１３８】
このように、抗体として上記Ａ２２または３Ａ２１が粒子表面に提示されたＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子は、実際にＡ４３１細胞に対して極めて高い特異性を有することが示された。
【０１３９】
（実施例Ｆ）
本実施例では、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質のヒト肝細胞認識部位であるｐｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１， ｐｒｅ−Ｓ２）のアミノ酸を欠失した、種々の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現させ、欠失させるアミノ酸領域の相違による、真核細胞での発現量の違いと抗原性とについて評価した。
【０１４０】
（実施例Ｆ−１）欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子の作成
以下の方法でＰＣＲを行い、欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子を作成した。
【０１４１】
欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質として、ｐｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１， ｐｒｅ−Ｓ２）の一部を欠失させた下記（ａ）〜（ｅ）に示す５種類の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質を発現する欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子を作成した。本実施例における欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質は、具体的には、（ａ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から２１番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（図１２においては、Δ２１−１５３、以下同様）、（ｂ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から３３番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（Δ３３−１５３）、（ｃ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（Δ５０−１５３）、（ｄ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から１０８番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（Δ１０８−１５３）、（ｅ）ｐｒｅ−Ｓ領域のＮ末端から１２７番目〜１５３番目のアミノ酸が欠失（Δ１０８−１５３）、しているものである。
【０１４２】
まず、（ａ）〜（ｅ）に相当する欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子を増幅するために、前述のようにして、ＰＣＲ法をｐＢＯ４７７（発明者が作成したＨｂｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子組み込み済みプラスミド）に対して行った。ＰＣＲ用のプライマーとしては、配列番号１５〜２４に記載のオリゴヌクレオチドを使用した。なお、配列番号１５〜２４に記載のオリゴヌクレオチドは、配列番号１５および１６が（ａ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌ遺伝子を増幅するためのものであり、同様に、配列番号１７および１８が（ｂ）、配列番号１９および２０が（ｃ）、配列番号２１および２２が（ｄ）、配列番号２３および２４が（ｅ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌ遺伝子を増幅するためのものである。また、配列番号１５〜２４のプライマーのうち、奇数がフォワードプライマー、偶数がリバースプライマーである。
【０１４３】
ＰＣＲの反応組成は、図１３に示すように、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）（０．５μＬ）、ＰＣＲ緩衝液（５μＬ×１０）、ｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭ、５μＬ）、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ（ｐＢＯ４７７（発明者が作成したＨｂｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子組み込み済みプラスミド））（５μｇ／ｍＬ、２μＬ）、プライマーセット（配列番号１５〜２４）（各１μＬ）を含み、蒸留水で全量を５０μＬとした。
【０１４４】
また、ＰＣＲの反応サイクルは、図１４に示すように、９５℃３０秒間の変性後、９５℃３０秒間の変性、５５℃１分間のアニーリング、および６８℃３０分間の合成反応を３０回繰り返した後、４℃に冷却して反応を終了した。その後、Ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡを切断するために、ＰＣＲ産物に制限酵素ＤｐｎＩ（１０Ｕ）を加え、３７℃で１時間のインキュベートの後、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。次に、出現コロニーからプラスミドを抽出し、塩基配列の確認を行った。
【０１４５】
続いて、欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子に制限酵素ＮｏｔＩサイトを導入した。図１５は、このようにして増幅した欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子に制限酵素ＮｏｔＩサイトを導入した発現遺伝子および当該遺伝子を組込んだプラスミド、模式図である。同図において、０ａａとは、欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子の先頭（５’末端）に制限酵素ＮｏｔＩ
サイトを、２５ａａとは、５’末端より２５アミノ酸残基分後ろ（３’末端側）の位置にＮｏｔＩサイト
を、ΔＰｒｅＳとはＳタンパク質発現遺伝子の先頭（５’末端）に制限酵素ＮｏｔＩサイトを挿入
したものである。
【０１４６】
このような、ＮｏｔＩサイトが挿入された欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子を、動物細胞発現用のプラスミドｐＢＯ４７７（発明者が作成したＨＢｓＡｇＬタンパク質発現遺伝子組み込み済みプラスミド）に、ＸｈｏＩにより、ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子の組換えを行った。
【０１４７】
なお、図１５以降の図面においては、例えば、Δ１２７−１５３とは、図１２のＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子における、１２７番目〜１５３番目までのアミノ酸をコードする遺伝子が欠失していることを示す（以下同様）。また、ΔｐｒｅＳとは、ｐｒｅ−Ｓ領域（ｐｒｅ−Ｓ１， ｐｒｅ−Ｓ２）の全アミノ酸をコードする遺伝子が欠失していることを示す。
【０１４８】
（実施例Ｆ−２）動物細胞による欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の作製
実施例Ｆ−１で構築を終えたプラスミド（２μｇ）をＣｏｓ７細胞（３〜８×１０４個）
にエレクトロポレーション（３００Ｖ、９５０μＦ）にて形質転換し、４日間３７℃、５％ＣＯ２存在下で静置培養を行った。その後、培地上清及び細胞抽出液を酵素免疫測定装置ＩＭｘ（ダイナボット）で変異型Ｌ粒子（欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質）の生成量を抗原性に基づき測定した。培地上清の測定では、ＰＢＳにより等倍希釈したものを、細胞内は、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール，１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）により、細胞を溶解させ、遠心の上澄みをＰＢＳで２００倍希釈することで測定を行った。
【０１４９】
図１６および１７に変異型Ｌ粒子の生成量を測定した結果（数値・グラフ）を示す。なお、図１６および１７において、Ｓ／Ｎ値およびＲＡＴＥが大きいほど、抗原性が高いことを示している。つまり、Δ２１−１５３、Δ３３−１５３、Δ５０−１５３、特に、Δ５０−１５３の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質が良好な結果が得られた。
【０１５０】
また、図１８および１９に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにウエスタンブロットによっても発現量を確認した。このときの１次抗体には、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ−Ｓタンパク質抗体（発明者らが作成）を、２次抗体にはａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体ＡＰ標識（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。なお、図１９は、Ｎ結合型糖鎖除去のための酵素処理（ＥｎｄＨ）後のウエスタンブロットの結果であり、分子量を併せて記載している。また、ＥｎｄＨ処理することにより、生成した変異型Ｌ粒子のＰｒｅ−Ｓ領域にＮ結合型糖鎖が付加している事が判明した。また、図１９におけるΔ５１−６６については、実施例Ｆ−１の方法にしたがって、配列番号２５および２６に記載のプライマーを用いて作製したプラスミドを用いた。
【０１５１】
以上の結果、特に、上記（ａ）〜（ｃ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現量が良好な結果を示した。
【０１５２】
（実施例Ｆ−３）上皮増殖因子（ＥＧＦ）を挿入した欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質粒子の作製
次に、発現量が良好であった上記（ａ）から（ｃ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質発現遺伝子（Δ２１−１５３，Δ３３−１５３，Δ５０−１５３）にＮｏｔＩサイトによりＥＧＦ遺伝子を挿入し、発現させた
。ＥＧＦ遺伝子は、発明者らが作製したｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−ＥＧＦから制限酵素ＮｏｔＩを用いて切り出して得た。これらをＣｏｓ７細胞に形質転換し、血清培地にて２４ｈｒ培養の後、無血清培地に交換し、３日間培養を行った。それらの培地を回収し、限外ろ過により濃縮を行い、各変異型Ｌ粒子（上記（ａ）〜（ｃ）の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質）を得た。
【０１５３】
それぞれの粒子に緑色蛍光タンパク質発現プラスミド（ｐＥＧＦＰ−Ｆ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を５０Ｖ，７５０μＦの条件でエレクトロポレーションし、粒子内部にＧＦＰ発現プラスミドを包含させ、肝細胞ＨｅｐＧ２及び上皮細胞Ａ４３１に遺伝子導入実験を試みた。ＧＦＰによる蛍光を観察した結果、肝細胞ＨｅｐＧ２への特異性は消失し、上皮細胞Ａ４３１に対して高い選択性を示した。このようにして、上皮細胞Ａ４３１に対する再標的化に成功した。
【０１５４】
（実施例Ｆ−４）酵母細胞への形質転換による欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の作製
Ｃｏｓ７細胞で発現量が多かったΔ２１−１５３，Δ３３−１５３，Δ５０−１５３（上記（ａ）〜（ｃ）のタンパク質）を発現する遺伝子をＸｈｏＩサイトにより切り出し、酵母発現用プラスミドｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−Ｒ
ｃＴのＸｈｏＩサイトに挿入して構築した。（図２０参照）。これらの酵母発現用プラスミドを、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−にスフェロプラスト法により形質転換し、形質転換体を得た。これらの形質転換体を工業用培地Ｈｉｇｈ−Ｐｉ３日間、８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地３日間培養を行い、菌体を回収した。菌体をガラスビーズにより破砕し、細胞抽出液を培養酵母酵素免疫測定装置ＩＭｘ（ダイナボット）により抗原性を測定すると共に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにウエスタンブロット（１次抗体ａｎｔｉ−Ｓタンパク質抗体、２次抗体ＡＰ標識ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ抗体使用）により発現量を確認した（図２１〜図２２参照）。
【０１５５】
また、以前に用いているＰｒｏｔｅｉｎＡのＺＺドメイン遺伝子を提示するためのプラスミド、ＥＧＦを提示させるためのプラスミドもＮｏｔＩサイトを用いて構築を行った（図２０参照）。こうして、欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質高発現酵母菌体内高発現用プラスミド（ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ５０−１５３， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ３３−１５３， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ２１−１５３， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ５０−１５３−ＺＺ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ３３−１５３−ＺＺ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ２１−１５３−ＺＺ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ５０−１５３−ＥＧＦ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ３３−１５３−ＥＧＦ， ｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ２１−１５３−ＥＧＦ，及びコントロールとしてｐＧＬＤＬＩＩＰ３９−ＲｃＴ−Δ３−６６）を得た。これらの酵母発現用プラスミドも酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２Ｒ−にスフェロプラスト法により形質転換し、形質転換体を得た。これらを工業用培地Ｈｉｇｈ−ＰｉＩＩ３日間、８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地３日間培養を行い、菌体を回収した。菌体をガラスビーズにより破砕し、細胞抽出液を培養酵母酵素免疫測定装置ＩＭｘ（ダイナボット）により抗原性を測定（図２１および図２２）することにより発現量を確認した。
【０１５６】
その結果、酵素免疫測定により欠失型粒子の形成が確認された。Δ２１−１５３．、Δ３３−１５３．、Δ５０−１５３． 欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質（欠失型ＨＢｓＡｇ粒子）の抗原性は、野生型粒子（図中ＬＡｇ）に近い値を示した（図２１および図２２参照）。一方、図示しないが、コントロールとして作製したΔ３−６６．欠失型ＨＢｓＡｇ粒子は形質転換体が得られなかった。なかでもΔ５０−１５３欠失型ＨＢｓＡｇ粒子は、ＺＺドメインを提示した欠失型ＨＢｓＡｇ粒子（Δ５０−１５３＋ＺＺ）の発現量も極めて高いことから、発現量が野生型より多く生産性においてかなり有利である。
【０１５７】
【発明の効果】
以上のように、本発明に係る薬剤は、粒子表面に癌特異的抗体などの抗体が提示されているので、静脈注射という簡便な方法で、特定の細胞または組織における疾患を特異的かつ効果的に治療することができ、従来の遺伝子治療と大きく異なり、外科手術を必要とせず、副作用の心配もきわめて低く、そのまま臨床応用可能なものである。
【０１５８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の実施例におけるＨＢｓＡｇ遺伝子の各タンパク質領域を表す概略摸式図である。１〜８は、表面抗原における各部位の働きを示している。血清型ｙ型はＰｒｅ−Ｓ１が１０８アミノ酸残基、血清型ｄ型はＰｒｅ−Ｓ１が１１９アミノ酸残基である。
【図２】
本発明の実施例における遺伝子組換え酵母を用いたＨＢｓＡｇ粒子の発現および精製操作を例示した概略説明図である。（ａ）遺伝子組換え酵母の作製、（ｂ）Ｈｉｇｈ−Ｐｉ培地における培養、（ｃ）８Ｓ５Ｎ−Ｐ４００培地における培養、（ｄ）破砕、（ｅ）密度勾配遠心分離、（ｆ）ＨＢｓＡｇ粒子。
【図３】
本発明の実施例における、酵母を用いたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図４】
本発明の実施例における、昆虫細胞を用いたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図５】
本発明の実施例における、動物細胞を用いたＨＢｓＡｇ−ｓｔｒｅｐｔａｇ粒子製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図６】
本発明の実施例における、酵母を用いたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図７】
酵母を用いて得られた上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す図である。
【図８】
本発明の実施例における、昆虫細胞を用いたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子（あるいは、一本鎖抗体Ａ２２または３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子）製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図９】
本発明の実施例における、動物細胞を用いたＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子（あるいは、一本鎖抗体Ａ２２または３Ａ２１を提示するＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子）製造用プラスミドの作製工程を示す図である。
【図１０】
本発明に係る薬剤として上記ＨＢｓＡｇ−ＺＺｔａｇ粒子を使用して、実験動物で行った治療効果を示すグラフである。
【図１１】
上記ＨＢｓＡｇ−ｓｃＦｖ粒子に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇの結果を示す図である。
【図１２】
本発明の実施例における欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質発現遺伝子を表す概略摸式図である。
【図１３】
本発明の実施例におけるＰＣＲ法の反応組成を示す図である。
【図１４】
本発明の実施例におけるＰＣＲサイクルを示す図である。
【図１５】
本発明の実施例における欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質発現遺伝子と、その遺伝子を組込むプラスミドを表す概略摸式図である。
【図１６】
本発明の実施例における動物細胞での欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質の酵素免疫測定の結果を表すグラフであり、（ａ）は培地上清、（ｂ）は細胞内部での結果を示すグラフである。
【図１７】
図１６の結果のデータを示す図である。
【図１８】
図１６で発現した欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図であり、（ａ）は培地上清、（ｂ）は細胞内部の結果を示す図である。
【図１９】
図１６で発現した欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質のウエスタンブロットの結果を示す図であり、（ａ）は培地上清、（ｂ）は細胞内部の結果を示す図である。
【図２０】
本発明の実施例における酵母に導入する欠失型ＨＢｓＡｇタンパク質発現遺伝子と、その遺伝子を組込むプラスミドを表す概略摸式図である。
【図２１】
図２０のプラスミドを用いた時の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現を確認するための図であり、酵素免疫測定のデータを示す図である。
【図２２】
図２０のプラスミドを用いた時の欠失型ＨＢｓＡｇ Ｌタンパク質の発現を確認するための図であり、酵素免疫測定の結果を示すグラフである。
【符号の説明】
１ 粒子形成抑制部位
２ 直接的なヒト肝細胞特異的レセプター
３ 糖鎖１
４ 間接的なヒト肝細胞特異的レセプター（重合ヒト血清アルブミンレセプター）
５ 膜貫通領域１
６ 膜貫通領域２
７ 糖鎖２
８ 膜貫通領域３
Claims (21)
- 特定の細胞または組織に対する抗体が提示され、粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子に、疾患治療用の細胞導入物質が包含されてなる薬剤。
- 上記抗体は、癌特異的抗体または抗ウィルス性タンパク質抗体であることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
- 上記抗体は、上記粒子形成能を有するタンパク質に融合したＺＺタグとの結合により粒子表面に提示されることを特徴とする請求項１または２記載の薬剤。
- 上記抗体は、ビオチン修飾され、上記粒子形成能を有するタンパク質に融合したストレプトタグと結合したストレプトアビジンまたはその誘導体と、上記ビオチンとの結合により粒子表面に提示されることを特徴とする請求項１または２記載の薬剤。
- 上記抗体は、上記粒子形成能を有するタンパク質に融合した一本鎖抗体であることを特徴とする請求項１または２記載の薬剤。
- 上記粒子形成能を有するタンパク質からなる中空ナノ粒子は、真核細胞で発現させることにより得られることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
- 上記真核細胞は、酵母、昆虫細胞または動物細胞のいずれかであることを特徴とする請求項６記載の薬剤。
- 上記粒子形成能を有するタンパク質は、改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質であることを特徴する請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬剤。
- 上記改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は、ｐｒｅＳ領域のアミノ酸の一部を欠失するように改変されていることを特徴とする請求項８に記載の薬剤。
- 上記改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は、血清型ｙタイプであり、かつ、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変されていることを特徴とする請求項８または９に記載の薬剤。
- 上記改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変されていることを特徴とする請求項１０に記載の薬剤。
- 上記改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は、血清型ｄタイプであり、かつ、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変されていることを特徴とする請求項８または９に記載の薬剤。
- 上記改変されたＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から６１番目〜１６４番目のアミノ酸を欠失するように改変されていることを特徴とする請求項１２に記載の薬剤。
- 上記細胞導入物質は、遺伝子であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の薬剤。
- 上記遺伝子は、単純ヘルペスウィルス由来チミジンキナーゼ（ＨＳＶ１ ｔｋ）遺伝子であることを特徴とする請求項１４記載の薬剤。
- 静脈注射により人体に投与されることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の薬剤。
- 請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬剤を投与することによる疾患の治療方法。
- 粒子形成能を有し、かつ、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、少なくともＮ末端から１番目〜２０番目のアミノ酸残基を保持するように改変された血清型ｙタイプのＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなることを特徴とする中空ナノ粒子。
- 上記改変された血清型ｙタイプのＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から５０番目〜１５３番目のアミノ酸を欠失するように改変されていることを特徴とする請求項１８に記載の中空ナノ粒子。
- 粒子形成能を有し、かつ、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、少なくともＮ末端から１２番目〜３１番目のアミノ酸残基を保持するように改変された血清型ｄタイプのＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質からなることを特徴とする中空ナノ粒子。
- 上記改変された血清型ｄタイプのＢ型肝炎ウィルス表面抗原タンパク質は、さらに、ｐｒｅ−Ｓ領域の全アミノ酸配列のうち、Ｎ末端から６１番目〜１６４番目のアミノ酸を欠失するように改変されていることを特徴とする請求項２０に記載の中空ナノ粒子。
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