JP2003533227A - 神経変性疾患用モデル - Google Patents
神経変性疾患用モデルInfo
- Publication number
- JP2003533227A JP2003533227A JP2001585317A JP2001585317A JP2003533227A JP 2003533227 A JP2003533227 A JP 2003533227A JP 2001585317 A JP2001585317 A JP 2001585317A JP 2001585317 A JP2001585317 A JP 2001585317A JP 2003533227 A JP2003533227 A JP 2003533227A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gsk
- mice
- tet
- tau
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 claims abstract description 134
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 claims abstract description 134
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims abstract description 43
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000007170 pathology Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 92
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 61
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 61
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 27
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 26
- 101001071234 Arabidopsis thaliana SEC12-like protein 1 Proteins 0.000 description 25
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 25
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 25
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 24
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 24
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 21
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 20
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 20
- 102100022033 Presenilin-1 Human genes 0.000 description 19
- 108010036933 Presenilin-1 Proteins 0.000 description 19
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 18
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 17
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 17
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 17
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 16
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 14
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 12
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 12
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 12
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 10
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 10
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 9
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 8
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 8
- 229920001307 poly(hydroxymethylethylene hydroxymethyl formal) Polymers 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 102000002254 Glycogen Synthase Kinase 3 Human genes 0.000 description 7
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 7
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 7
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 7
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 7
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 7
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 7
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 6
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 6
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 6
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 6
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 6
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 6
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 6
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 6
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 5
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 5
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 5
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 5
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 5
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 4
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 4
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 4
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 3
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 3
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 3
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 3
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 3
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 3
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 210000000877 corpus callosum Anatomy 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 3
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 230000007387 gliosis Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 3
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 3
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 3
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000002025 microglial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 3
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 3
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 3
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 3
- -1 potassium ferricyanide Chemical compound 0.000 description 3
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 3
- 230000007342 reactive astrogliosis Effects 0.000 description 3
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 3
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 3
- 238000013042 tunel staining Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003319 Araldite® Polymers 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000016362 Catenins Human genes 0.000 description 2
- 108010067316 Catenins Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101000891579 Homo sapiens Microtubule-associated protein tau Proteins 0.000 description 2
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 2
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 2
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 2
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 2
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 2
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 2
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 2
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000004395 cytoplasmic granule Anatomy 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 2
- 102000057063 human MAPT Human genes 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000007388 microgliosis Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000002052 molecular layer Substances 0.000 description 2
- 230000009223 neuronal apoptosis Effects 0.000 description 2
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004654 survival pathway Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000011820 transgenic animal model Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 108010094108 Amyloid Proteins 0.000 description 1
- 102000001049 Amyloid Human genes 0.000 description 1
- 108010048112 Amyloidogenic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009091 Amyloidogenic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000006974 Aβ toxicity Effects 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010026870 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000019025 Calcium-Calmodulin-Dependent Protein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 101100321669 Fagopyrum esculentum FA02 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 1
- 108060006662 GSK3 Proteins 0.000 description 1
- 102000038624 GSKs Human genes 0.000 description 1
- 108091007911 GSKs Proteins 0.000 description 1
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 1
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102100036738 Guanine nucleotide-binding protein subunit alpha-11 Human genes 0.000 description 1
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100283445 Homo sapiens GNA11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001059454 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase MARK2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 101710115937 Microtubule-associated protein tau Proteins 0.000 description 1
- 102100040243 Microtubule-associated protein tau Human genes 0.000 description 1
- 206010029350 Neurotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000001300 Perinatal Death Diseases 0.000 description 1
- 102100022036 Presenilin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010036908 Presenilin-2 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241001466077 Salina Species 0.000 description 1
- 102100028904 Serine/threonine-protein kinase MARK2 Human genes 0.000 description 1
- 102000004598 Small Nuclear Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010003165 Small Nuclear Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000043043 TCF/LEF family Human genes 0.000 description 1
- 108091084789 TCF/LEF family Proteins 0.000 description 1
- 238000012288 TUNEL assay Methods 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 206010044221 Toxic encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 230000004156 Wnt signaling pathway Effects 0.000 description 1
- 101100176784 Xenopus laevis gsk3b gene Proteins 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001056 activated astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001642 activated microglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 1
- 230000006933 amyloid-beta aggregation Effects 0.000 description 1
- 230000003942 amyloidogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 108700000707 bcl-2-Associated X Proteins 0.000 description 1
- 102000055102 bcl-2-Associated X Human genes 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000006736 behavioral deficit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000782 cerebellar granule cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000003235 crystal violet staining Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 239000012135 ice-cold extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940043355 kinase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008449 language Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 1
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 102000021160 microtubule binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091011150 microtubule binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012106 negative regulation of microtubule depolymerization Effects 0.000 description 1
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006764 neuronal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 230000007135 neurotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000228 neurotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003757 phosphotransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000007542 postnatal development Effects 0.000 description 1
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001176 projection neuron Anatomy 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 210000003660 reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003355 serines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N sodium;5-ethyl-5-pentan-2-yl-1,3-diazinane-2,4,6-trione Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000002311 subsequent effect Effects 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000003390 teratogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N trisodium vanadate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][V]([O-])([O-])=O IHIXIJGXTJIKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
- A01K2267/0318—Animal model for neurodegenerative disease, e.g. non- Alzheimer's
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Toys (AREA)
- Endoscopes (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Catching Or Destruction (AREA)
- Housing For Livestock And Birds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明のGSK-3βタンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物は、神経変性疾患用モデルとして有用である。また、アルツハイマー病のモデルとしての、上記トランスジェニック動物の使用、神経変性疾患を治療するための薬物または療法の試験における上記トランスジェニック動物の使用、さらに、本発明のトランスジェニック動物に療法を実施すること、および病理または挙動に対する影響をモニタリングすることを含むアルツハイマー病の治療に有用な療法の同定方法も提供する。
Description
【０００１】
本発明は、神経変性疾患、特にアルツハイマー病の動物モデルに関する。
【０００２】
アルツハイマー病(AD)は、先進国において最も普通に見られる神経変性疾患で
あり、進行性の記憶喪失および言語・行動障害により特徴付けられ、究極的には
死へと導く(Alzheimer、1911年; Yankner、1996年)。ADにおける認識衰退には、
ニューロン性萎縮および主に皮質、海馬と小脳の損失が伴う(Gomez-Islaら、199
7年)。ニューロンの細胞死の特定のパターンに加えて、ADは、2つの神経病理学
的特徴である老人斑および神経原線維変化(NFT)により特徴付けられる。
あり、進行性の記憶喪失および言語・行動障害により特徴付けられ、究極的には
死へと導く(Alzheimer、1911年; Yankner、1996年)。ADにおける認識衰退には、
ニューロン性萎縮および主に皮質、海馬と小脳の損失が伴う(Gomez-Islaら、199
7年)。ニューロンの細胞死の特定のパターンに加えて、ADは、2つの神経病理学
的特徴である老人斑および神経原線維変化(NFT)により特徴付けられる。
【０００３】
老人斑は、しばしば異栄養性神経突起で囲まれている39〜43アミノ酸のβ-ア
ミロイドペプチド(AB)から作られるアミロイド原線維の細胞外沈着物である(Gle
nner and Wong、1984年; Mastersら、1985年; Selkoe、1994年)。
ミロイドペプチド(AB)から作られるアミロイド原線維の細胞外沈着物である(Gle
nner and Wong、1984年; Mastersら、1985年; Selkoe、1994年)。
【０００４】
NFTは、過剰にリン酸化された微小管結合タンパク質タウから組み立てられる
二重らせん状細線維(PHF)の神経内に発生した凝集物である(Greenbergら、1992
年; Grundke-Iqbalら、1986年; Leeら、1991年; Morishima-Kawashimaら、1995
年)。NFTは、ADにおいて変性を受けている脳領域全てに見られ、それらの出現の
空間時間的パターンは、細胞死および総体的症状の空間時間的パターンとよく相
関する(Arriagadaら、1992年; Braak and Braak、1991年; Gomez-Islaら、1997
年)。
二重らせん状細線維(PHF)の神経内に発生した凝集物である(Greenbergら、1992
年; Grundke-Iqbalら、1986年; Leeら、1991年; Morishima-Kawashimaら、1995
年)。NFTは、ADにおいて変性を受けている脳領域全てに見られ、それらの出現の
空間時間的パターンは、細胞死および総体的症状の空間時間的パターンとよく相
関する(Arriagadaら、1992年; Braak and Braak、1991年; Gomez-Islaら、1997
年)。
【０００５】
ADの病因に対する分子学的洞察は、遺伝形のAD(FAD)により罹患した家族の遺
伝的研究から為された。これらが原因となるのはAD症例の少ない割合だけである
が、この疾患を引き起こす原因となる3種の異なる遺伝子における変異が確認で
きた。これらの遺伝子は、プレセニリン-1(presenilin-1)および-2(PS-1およびP
S-2)並びにアミロイド前駆体タンパク質(APP)(Hardy、1996年)である。APPにお
ける変異は、Aβの産生を増加させる結果となり(Price and Sisodia、1998年)、
一方、PS-1およびPS-2の変異は、APPから長く、最もアミロイド産生性であるAβ
(Aβ42)形へのプロセシングを促進させる(Citronら、1997年; Duffら、1996年;
Price and Sisodia、1998年; Scheunerら、1996年)。Aβ誘導性神経毒性のイン
ビトロ研究およびインビボ研究と共にこの遺伝子的証拠から、ADを引き起こす重
要な事象として、Aβ形成および/またはAβ凝集が指摘されている。
伝的研究から為された。これらが原因となるのはAD症例の少ない割合だけである
が、この疾患を引き起こす原因となる3種の異なる遺伝子における変異が確認で
きた。これらの遺伝子は、プレセニリン-1(presenilin-1)および-2(PS-1およびP
S-2)並びにアミロイド前駆体タンパク質(APP)(Hardy、1996年)である。APPにお
ける変異は、Aβの産生を増加させる結果となり(Price and Sisodia、1998年)、
一方、PS-1およびPS-2の変異は、APPから長く、最もアミロイド産生性であるAβ
(Aβ42)形へのプロセシングを促進させる(Citronら、1997年; Duffら、1996年;
Price and Sisodia、1998年; Scheunerら、1996年)。Aβ誘導性神経毒性のイン
ビトロ研究およびインビボ研究と共にこの遺伝子的証拠から、ADを引き起こす重
要な事象として、Aβ形成および/またはAβ凝集が指摘されている。
【０００６】
グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β(GSK-3β)の活性化が提案されているが
、神経機能障害の原因となる下流の細胞内作動因子については殆ど知られていな
い。
、神経機能障害の原因となる下流の細胞内作動因子については殆ど知られていな
い。
【０００７】
GSK-3βは最初、グリコーゲン代謝調節の役割によって確認された、CNSに最も
豊富なプロリン指向性セリン/スレオニンキナーゼである。(Woodgett、1990年)
。インスリンおよびIGF-1を媒介としたシグナル伝達に関係することとは別に、G
SK-3βは、β-カテニンの安定性を調節する重要な酵素としてwnt/winglessシグ
ナリング経路にも関与し、その結果、核へのトランスロケーションおよびその転
写活性に関与する(Anderton、1999年; Earth、1997年)。
豊富なプロリン指向性セリン/スレオニンキナーゼである。(Woodgett、1990年)
。インスリンおよびIGF-1を媒介としたシグナル伝達に関係することとは別に、G
SK-3βは、β-カテニンの安定性を調節する重要な酵素としてwnt/winglessシグ
ナリング経路にも関与し、その結果、核へのトランスロケーションおよびその転
写活性に関与する(Anderton、1999年; Earth、1997年)。
【０００８】
GSK-3βは、PHFの特徴である過剰にリン酸化されたタウ産生の最適候補酵素の
1つである(Lovestone and Reynolds、1997年)。GSK-3βは、微小管から精製でき
(Ishiguroら、1988年)、トランスフェクションされた細胞においても(Lovestone
ら、1994年)およびインビボでも(Hongら、1997年; Munoz-Montanoら、1997年)PH
Fにおいても過剰にリン酸化された多くの部位のタウをリン酸化することが示さ
れている。さらに、GSK-3βは、変性前のニューロンの原形質に蓄積し、AD神経
原線維変化を発現した脳内でのその分布は、これらの変化の発現の順序と一致す
る(Peiら、1999年; Shiurbaら、1996年)。
1つである(Lovestone and Reynolds、1997年)。GSK-3βは、微小管から精製でき
(Ishiguroら、1988年)、トランスフェクションされた細胞においても(Lovestone
ら、1994年)およびインビボでも(Hongら、1997年; Munoz-Montanoら、1997年)PH
Fにおいても過剰にリン酸化された多くの部位のタウをリン酸化することが示さ
れている。さらに、GSK-3βは、変性前のニューロンの原形質に蓄積し、AD神経
原線維変化を発現した脳内でのその分布は、これらの変化の発現の順序と一致す
る(Peiら、1999年; Shiurbaら、1996年)。
【０００９】
皮質および海馬の一次ニューロン培養物をAβへさらすと、GSK-βの活性化(Ta
kashimaら、1996年)、タウの過剰リン酸化(Busciglioら、1995年; Ferreiraら、
1997年; Takashimaら、1998年)、および細胞死(Busciglioら、1995年; Estusら
、1997年; Forloniら、1993年; Looら、1993年; Pikeら、1991年; Takashimaら
、1993年)を誘導することが示された。アンチセンス・オリゴヌクレオチドまた
はリチウムのいずれかによってGSK-3βの発現または活性を阻止することによっ
て、皮質および海馬の一次培養におけるAβ誘導性神経変性が防止された(Alvare
zら、1999年; Takashimaら、1993年)。
kashimaら、1996年)、タウの過剰リン酸化(Busciglioら、1995年; Ferreiraら、
1997年; Takashimaら、1998年)、および細胞死(Busciglioら、1995年; Estusら
、1997年; Forloniら、1993年; Looら、1993年; Pikeら、1991年; Takashimaら
、1993年)を誘導することが示された。アンチセンス・オリゴヌクレオチドまた
はリチウムのいずれかによってGSK-3βの発現または活性を阻止することによっ
て、皮質および海馬の一次培養におけるAβ誘導性神経変性が防止された(Alvare
zら、1999年; Takashimaら、1993年)。
【００１０】
PS-1は、ヒト脳サンプルの共免疫沈降実験において、GSK-3βとタウに直接結
合することが示された(Takashimaら、1998年)。したがって、PS-1がGSK-3βとタ
ウを密に近接させることができることから、PS-1が、GSK-3βによりタウのリン
酸化を調節している可能性が示唆される。トランスフェクション実験におけるPS
-1の変異体は、PS-1/ GSK-3βの結合を増加させ、タウのリン酸化を増加させる
(Takashimaら、1998年)。さらに、PS-1はまた、トランスフェクションされた細
胞において(Murayamaら、1998年; Yuら、1998年)およびインビボで(Yuら、1998
年; Zhangら、1998年)、GSK-3βの基質であるβ-カテニンと複合体を形成するこ
とが示され、またこの相互作用はβ-カテニンの安定性を増加させる(Zhangら、1
998年)。病原性PS-1変異により、β-カテニンを安定化させるPS-1の能力が減少
し、これは次に、PS-1変異を有するAD患者におけるβ-カテニン濃度が減少する
結果となる(Zhangら、1998年)。
合することが示された(Takashimaら、1998年)。したがって、PS-1がGSK-3βとタ
ウを密に近接させることができることから、PS-1が、GSK-3βによりタウのリン
酸化を調節している可能性が示唆される。トランスフェクション実験におけるPS
-1の変異体は、PS-1/ GSK-3βの結合を増加させ、タウのリン酸化を増加させる
(Takashimaら、1998年)。さらに、PS-1はまた、トランスフェクションされた細
胞において(Murayamaら、1998年; Yuら、1998年)およびインビボで(Yuら、1998
年; Zhangら、1998年)、GSK-3βの基質であるβ-カテニンと複合体を形成するこ
とが示され、またこの相互作用はβ-カテニンの安定性を増加させる(Zhangら、1
998年)。病原性PS-1変異により、β-カテニンを安定化させるPS-1の能力が減少
し、これは次に、PS-1変異を有するAD患者におけるβ-カテニン濃度が減少する
結果となる(Zhangら、1998年)。
【００１１】
ADなどの神経変性疾患の病理とよく似た病理を有する動物モデルが必要であり
、これは、この疾患の理解と新規療法の試験にとって極めて重要である。
、これは、この疾患の理解と新規療法の試験にとって極めて重要である。
【００１２】
本発明は、この動物モデルの問題に取り組む。
【００１３】
本発明は、GSK-3βタンパク質が過剰発現しているアルツハイマー病のトラン
スジェニック動物モデルを提供する。
スジェニック動物モデルを提供する。
【００１４】
(好ましい実施形態)
特に、本発明は、GSK-3βタンパク質の発現が条件付きであるトランスジェニ
ック動物モデルを提供する。
ック動物モデルを提供する。
【００１５】
好ましくは、GSK-3βが過剰発現する唯一の酵素であり、実際、GSK-3βが過剰
発現する唯一のタンパク質であることがさらに好ましい。驚くべきことに、GSK-
3βタンパク質のみが過剰発現されると、ADとよく似た病理がトランスジェニッ
ク動物において生じる。具体的には、GSK-3βの過剰発現の結果、核のβ-カテニ
ン濃度の減少、タウタンパク質のリン酸化の増加、ニューロンの細胞死、反応性
星状細胞増加症、並びに小神経膠細胞症がもたらされる。トランスジェニック・
モデルの病理と自然の病態とが類似しているため、本発明のモデルは疾患分析に
とって価値が高い。
発現する唯一のタンパク質であることがさらに好ましい。驚くべきことに、GSK-
3βタンパク質のみが過剰発現されると、ADとよく似た病理がトランスジェニッ
ク動物において生じる。具体的には、GSK-3βの過剰発現の結果、核のβ-カテニ
ン濃度の減少、タウタンパク質のリン酸化の増加、ニューロンの細胞死、反応性
星状細胞増加症、並びに小神経膠細胞症がもたらされる。トランスジェニック・
モデルの病理と自然の病態とが類似しているため、本発明のモデルは疾患分析に
とって価値が高い。
【００１６】
好ましくは、トランスジェニック研究に用いられる動物は、マウス、ラットま
たは霊長類などの哺乳動物である。トランスジェニック研究に使用される他の好
適な動物は、当該分野でよく知られている。
たは霊長類などの哺乳動物である。トランスジェニック研究に使用される他の好
適な動物は、当該分野でよく知られている。
【００１７】
本発明はまた、トランスジェニック動物の生産に使用される方法にまでわたっ
ている。
ている。
【００１８】
本発明の動物モデルは、ADなどの神経変性疾患を治療するための新しい薬剤ま
たは療法の試験に有用である。したがって、本発明は、本発明のトランスジェニ
ック動物に療法を実施すること、および病理または挙動に対する影響をモニタリ
ングすることを含むADの治療に有用な療法の同定方法にまでわたっている。
たは療法の試験に有用である。したがって、本発明は、本発明のトランスジェニ
ック動物に療法を実施すること、および病理または挙動に対する影響をモニタリ
ングすることを含むADの治療に有用な療法の同定方法にまでわたっている。
【００１９】
好ましくは、マウスでtet調節系を使用する。tet調節系は、真核細胞系および
マウスにおいて条件付き遺伝子発現に用いられてきた(Gingrich and Roder、199
8年)。変異形のハンチンチンのトランスジェニックな発現を行うためにこの系を
用いることにより、我々の何人かは最近、神経変性疾患の最初の条件付き動物モ
デルを作製した(Yamamotoら、2000年)。tet調節系は、トランスジーンの毒性に
よる周産期の死亡を回避し、成体生物でのみトランスジーンの発現を引き起こし
、関連する表現型の変化が生じたときに、トランスジーンの発現を中止するよう
に用いることが可能であることから、病理条件を模倣する場合に特に有用であり
得る(Kelz、1999年; Yamamotoら、2000年)。
マウスにおいて条件付き遺伝子発現に用いられてきた(Gingrich and Roder、199
8年)。変異形のハンチンチンのトランスジェニックな発現を行うためにこの系を
用いることにより、我々の何人かは最近、神経変性疾患の最初の条件付き動物モ
デルを作製した(Yamamotoら、2000年)。tet調節系は、トランスジーンの毒性に
よる周産期の死亡を回避し、成体生物でのみトランスジーンの発現を引き起こし
、関連する表現型の変化が生じたときに、トランスジーンの発現を中止するよう
に用いることが可能であることから、病理条件を模倣する場合に特に有用であり
得る(Kelz、1999年; Yamamotoら、2000年)。
【００２０】
この系の調節は、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子(tTA)、すなわ
ちtetリプレッサーDNA結合ドメインおよびVP16トランス活性化ドメインから成る
キメラタンパク質を介して達成される(Gossen and Bujard、1992年)。このタン
パク質は、tetOオペレーター配列に特異的に結合し、隣接のCMV最小プロモータ
ーから転写を誘導する。したがって、tTA要素およびtetO要素双方の組み合わせ
により、所与のトランスジーンの連続的なトランス活性化が可能となる。テトラ
サイクリンとその類縁体はtTAに結合できる。これが生じると、tTAは、tetOへの
結合を妨げられ、転写が阻害される。
ちtetリプレッサーDNA結合ドメインおよびVP16トランス活性化ドメインから成る
キメラタンパク質を介して達成される(Gossen and Bujard、1992年)。このタン
パク質は、tetOオペレーター配列に特異的に結合し、隣接のCMV最小プロモータ
ーから転写を誘導する。したがって、tTA要素およびtetO要素双方の組み合わせ
により、所与のトランスジーンの連続的なトランス活性化が可能となる。テトラ
サイクリンとその類縁体はtTAに結合できる。これが生じると、tTAは、tetOへの
結合を妨げられ、転写が阻害される。
【００２１】
このようにして、我々は、胎仔でのトランスジーンの発現による周産期の死亡
を回避しながら、成体期に脳内でGSK-3βを過剰発現する条件付きのトランスジ
ェニック・マウスを作製した。これらのマウスは、海馬ニューロンにおけるβ-
カテニンの不安定化および、タウの過剰リン酸化を示し、後者は、タウのもつれ
前のような細胞体樹状突起の局在化をもたらす。タウの細胞体樹状突起の局在化
を示すニューロンは、異常形態並びに周囲の神経網からの剥離を示すことが多い
。反応性星状細胞増加および小神経膠細胞は、ニューロンのストレスおよび死を
暗示する。この知見は、さらに歯状回顆粒細胞のTUNEL着色により確認された。
皮質および海馬におけるGSK-3βの過剰発現は、核のβ-カテニン濃度の減少、AD
関連エピトープにおけるタウのリン酸化の増加、ニューロンの細胞死、反応性星
状細胞増加、並びに小神経膠細胞をもたらす。したがって、我々の結果は、GSK-
3βのインビボ過剰発現が神経変性をもたらすことを示し、これらのマウスは、
アルツハイマー病の病因に対するGSK-3β脱調節との関連性を研究する動物モデ
ルとして使用できることを示唆する。
を回避しながら、成体期に脳内でGSK-3βを過剰発現する条件付きのトランスジ
ェニック・マウスを作製した。これらのマウスは、海馬ニューロンにおけるβ-
カテニンの不安定化および、タウの過剰リン酸化を示し、後者は、タウのもつれ
前のような細胞体樹状突起の局在化をもたらす。タウの細胞体樹状突起の局在化
を示すニューロンは、異常形態並びに周囲の神経網からの剥離を示すことが多い
。反応性星状細胞増加および小神経膠細胞は、ニューロンのストレスおよび死を
暗示する。この知見は、さらに歯状回顆粒細胞のTUNEL着色により確認された。
皮質および海馬におけるGSK-3βの過剰発現は、核のβ-カテニン濃度の減少、AD
関連エピトープにおけるタウのリン酸化の増加、ニューロンの細胞死、反応性星
状細胞増加、並びに小神経膠細胞をもたらす。したがって、我々の結果は、GSK-
3βのインビボ過剰発現が神経変性をもたらすことを示し、これらのマウスは、
アルツハイマー病の病因に対するGSK-3β脱調節との関連性を研究する動物モデ
ルとして使用できることを示唆する。
【００２２】
本発明を、我々の実験的研究の以下の実施例によりさらに説明する。
【００２３】
注射用フラグメントの生成
8.0kbのAse Iフラグメント(BitetO)を顕微注入用に用いた。BitetOを生成する
ために、N-末端MYCエピトープを有するアフリカツメガエルのGSK-3B cDNAに対応
する1.5kbのHind IIIフラグメントをpcDNA3- GSK3プラスミドから切り取った(Sa
nchezら、2000年)。このフラグメントを、Hind IIIで消化したpCRIIクローニン
グ・ベクター(インビトロゲン)にサブクローニングした。正しい配向性を、Xho
I消化により試験した。次いで1.5kbフラグメントをNsi I-Not I消化により切り
取り、lacZレポーター配列を有するサイトメガロウイルス(CMV)最小プロモータ
ーに連結された2方向性tetO配列を含有するプラスミドのPst I-Not I部位にサブ
クローニングした(pBI-3、(Baronら、1995年)。最後に、8.0kbのAse I BitetOフ
ラグメントを、CBAxC57BL/6の単細胞の胚に顕微注入した。ファウンダーマウス
をPCRにより同定し、サザン分析法により確認した。次に、ファウンダーマウス
を、野生型CBAxC57BL/6マウスと交配し、サザン分析法をF1子孫に対して実施し
、顕微注入フラグメントの多回挿入事象を調べた。ここに報告された全マウスは
単回の組込み事象から得た(データは示さず)。
ために、N-末端MYCエピトープを有するアフリカツメガエルのGSK-3B cDNAに対応
する1.5kbのHind IIIフラグメントをpcDNA3- GSK3プラスミドから切り取った(Sa
nchezら、2000年)。このフラグメントを、Hind IIIで消化したpCRIIクローニン
グ・ベクター(インビトロゲン)にサブクローニングした。正しい配向性を、Xho
I消化により試験した。次いで1.5kbフラグメントをNsi I-Not I消化により切り
取り、lacZレポーター配列を有するサイトメガロウイルス(CMV)最小プロモータ
ーに連結された2方向性tetO配列を含有するプラスミドのPst I-Not I部位にサブ
クローニングした(pBI-3、(Baronら、1995年)。最後に、8.0kbのAse I BitetOフ
ラグメントを、CBAxC57BL/6の単細胞の胚に顕微注入した。ファウンダーマウス
をPCRにより同定し、サザン分析法により確認した。次に、ファウンダーマウス
を、野生型CBAxC57BL/6マウスと交配し、サザン分析法をF1子孫に対して実施し
、顕微注入フラグメントの多回挿入事象を調べた。ここに報告された全マウスは
単回の組込み事象から得た(データは示さず)。
【００２４】
COS細胞のトランスフェクション
COS-7細胞を、10%(v/v)ウシ胎仔血清、2mMグルタミン、100単位ml-1ペニシリ
ンおよび100μgml-1ストレプトマイシンを補った変法ダルベッコ必須培地(DMEM;
Gibco BRL)で維持し、加湿インキュベータ中95%空気/5% CO2、37℃でインキュ
ベートした。35mm直径のシャーレ中50〜70%集密性度の細胞を、製造元の推奨に
従って、LipofectAMINE(Gibco BRL)/DNA 5μgにより一時的にトランスフェクシ
ョンした。トランスフェクション48時間後に細胞を採集し、分析した。
ンおよび100μgml-1ストレプトマイシンを補った変法ダルベッコ必須培地(DMEM;
Gibco BRL)で維持し、加湿インキュベータ中95%空気/5% CO2、37℃でインキュ
ベートした。35mm直径のシャーレ中50〜70%集密性度の細胞を、製造元の推奨に
従って、LipofectAMINE(Gibco BRL)/DNA 5μgにより一時的にトランスフェクシ
ョンした。トランスフェクション48時間後に細胞を採集し、分析した。
【００２５】
動物
Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa"動物施設でマウスを飼育した
。マウスは、1ケージにつき4匹を収容し、飼料と水は随時摂取可能とし、7時に
点灯する12/12時間の明暗サイクルで温度制御環境下に維持した。
。マウスは、1ケージにつき4匹を収容し、飼料と水は随時摂取可能とし、7時に
点灯する12/12時間の明暗サイクルで温度制御環境下に維持した。
【００２６】
抗体
次の抗タウ抗体を用いた:7.51(Novakら、1991年)(英国ケンブリッジ、MRC、C.
Wischik博士より恵与)、PHF-1(Greenbergら、1992年; Otvosら、1994年)(米国
ニューヨーク州ブロンクス、アルバート・アインシュタイン大学P. Davies博士
より恵与)、12E8(Seubertら、1995年)(米国カリフォルニア州サンフランシスコ
、アテナ、P. Seubert博士より恵与)、AD2(Buee-Scherrerら、1996年)(仏国モン
ペリエ、C. Mourton-Gilles博士より恵与)。441個のアミノ酸である最長のヒト
タウのイソ体の残基ナンバリングによると(Goedertら、1989年)、抗体12E8は、2
62番目のセリンがリン酸化される際にタウと反応する(Seubertら、1995年)。抗
体PHF-1およびAD2は、セリン396および404がリン酸化される際にタウを認識する
(Buee-Scherrerら、1996年; Otvosら、1994年)。他のモノクローナル抗体は、抗
GSK3-β(Transduction Laboratories)、抗β-カテニン(Transduction Laborator
ies)、抗β-チューブリン(Sigma)、抗β-ガラクトシダーゼ(Promega)、抗myc(米
国アイオワ州、Developmental Studies Hybridoma Bank)、抗GFAP(米国カリフォ
ルニア州、PharMingen)、OX42(スペイン国、Instituto Cajal、P. Bovolenta博
士より恵与)、ED1(英国、Serotec)であった。核タンパク質U"snRNPに対して誘導
した抗体は、J. Ortin博士(スペイン国マドリッド、CNB)より恵与された。
Wischik博士より恵与)、PHF-1(Greenbergら、1992年; Otvosら、1994年)(米国
ニューヨーク州ブロンクス、アルバート・アインシュタイン大学P. Davies博士
より恵与)、12E8(Seubertら、1995年)(米国カリフォルニア州サンフランシスコ
、アテナ、P. Seubert博士より恵与)、AD2(Buee-Scherrerら、1996年)(仏国モン
ペリエ、C. Mourton-Gilles博士より恵与)。441個のアミノ酸である最長のヒト
タウのイソ体の残基ナンバリングによると(Goedertら、1989年)、抗体12E8は、2
62番目のセリンがリン酸化される際にタウと反応する(Seubertら、1995年)。抗
体PHF-1およびAD2は、セリン396および404がリン酸化される際にタウを認識する
(Buee-Scherrerら、1996年; Otvosら、1994年)。他のモノクローナル抗体は、抗
GSK3-β(Transduction Laboratories)、抗β-カテニン(Transduction Laborator
ies)、抗β-チューブリン(Sigma)、抗β-ガラクトシダーゼ(Promega)、抗myc(米
国アイオワ州、Developmental Studies Hybridoma Bank)、抗GFAP(米国カリフォ
ルニア州、PharMingen)、OX42(スペイン国、Instituto Cajal、P. Bovolenta博
士より恵与)、ED1(英国、Serotec)であった。核タンパク質U"snRNPに対して誘導
した抗体は、J. Ortin博士(スペイン国マドリッド、CNB)より恵与された。
【００２７】
免疫組織化学
マウスをペンタールで深麻酔し、0.1 Mリン酸緩衝液中4%パラホルムアルデヒ
ドで10分間経心的に灌流した。脳は、室温で2時間4%パラホルムアルデヒドで後
固定し、4℃で48時間PBS中の30%ショ糖に浸けた。矢状切片(30μm)を、凍結ミク
ロトーム中で切断し、PBS中に採取した。遊離浮遊切片をPBS中の0.3% H2O2で前
処理し、0.2%トリトンX-100、10%正常ヤギ血清(GmCO)および1% BSA(Boehringer
Mannheim)を含有するPBS中、一次抗体:PHF-1(1/150)、AD-2(1/2000)、抗myc(1/2
0)、抗GSK-3β(1/500)、抗β-ガラクトシダーゼ(1/5000)、抗GFAP(1/250)、OX42
(1/1000)と共に一晩4℃で培養した。PBSで3回洗浄後、切片は、Elite Vectastai
nキット(Vector Laboratories)を用いて標準アビジン-ビオチン免疫組織化学プ
ロトコルにより実施された。色素原反応を、ジアミノベンジジン(Sigma)および0
.003% H2O2により10分間実施した。切片をクロマラム(chromalum)で被覆したス
ライド上に載せ、Aqua-PolyMount(Polysciences)でカバーグラスをした。一次抗
体を除いたものは標識欠如となった。
ドで10分間経心的に灌流した。脳は、室温で2時間4%パラホルムアルデヒドで後
固定し、4℃で48時間PBS中の30%ショ糖に浸けた。矢状切片(30μm)を、凍結ミク
ロトーム中で切断し、PBS中に採取した。遊離浮遊切片をPBS中の0.3% H2O2で前
処理し、0.2%トリトンX-100、10%正常ヤギ血清(GmCO)および1% BSA(Boehringer
Mannheim)を含有するPBS中、一次抗体:PHF-1(1/150)、AD-2(1/2000)、抗myc(1/2
0)、抗GSK-3β(1/500)、抗β-ガラクトシダーゼ(1/5000)、抗GFAP(1/250)、OX42
(1/1000)と共に一晩4℃で培養した。PBSで3回洗浄後、切片は、Elite Vectastai
nキット(Vector Laboratories)を用いて標準アビジン-ビオチン免疫組織化学プ
ロトコルにより実施された。色素原反応を、ジアミノベンジジン(Sigma)および0
.003% H2O2により10分間実施した。切片をクロマラム(chromalum)で被覆したス
ライド上に載せ、Aqua-PolyMount(Polysciences)でカバーグラスをした。一次抗
体を除いたものは標識欠如となった。
【００２８】
LacZ染色
LacZ染色を次のとおり実施した。新鮮な凍結切片を4%パラホルムアルデヒドSo
ren緩衝液中10分間、後固定した。次いでスライドをLacZ染色溶液(PBS中1mg/ml
X-gal(4-クロロ-5-ブロモ-3-インドリル-β-ガラクトシダーゼ、Boehringer Man
nheim)、5mM フェロシアン化カリウム、5mMフェリシアン化カリウムおよび2mM M
gCl2)中30℃で1時間インキュベートした。染色後、切片をすすいで乾式マウント
した。
ren緩衝液中10分間、後固定した。次いでスライドをLacZ染色溶液(PBS中1mg/ml
X-gal(4-クロロ-5-ブロモ-3-インドリル-β-ガラクトシダーゼ、Boehringer Man
nheim)、5mM フェロシアン化カリウム、5mMフェリシアン化カリウムおよび2mM M
gCl2)中30℃で1時間インキュベートした。染色後、切片をすすいで乾式マウント
した。
【００２９】
TUNELアッセイ
アポトーシスの特徴を示すDNAフラグメントを、パラホルムアルデヒドで後固
定した脳においてTUNEL法により検出した。ビブラトーム切片のTUNEL染色を、製
造元の指示に従って実施した(インシトウ細胞死検出、POD; Boehringer Mannhei
m)。Dnase Iによる処理を陽性対照として用いた。
定した脳においてTUNEL法により検出した。ビブラトーム切片のTUNEL染色を、製
造元の指示に従って実施した(インシトウ細胞死検出、POD; Boehringer Mannhei
m)。Dnase Iによる処理を陽性対照として用いた。
【００３０】
細胞レベル下（サブセルラー）分画
膜および細胞質ゾルの抽出物を調製するために、組織を氷冷リン酸緩衝液生理
食塩水で洗浄し、低張緩衝液(0.25Mショ糖、20mM HEPES pH7.4、2mM EGTA、1mM
PMSF、10μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチンおよび10μg/mlペプスタチ
ン)にホモジナイズした。ホモジネート(全細胞フラクション)を、850 x gにて4
℃で15分間遠心分離で澄明にし、次に得られた上澄液を、100.000 x gにて4℃で
1時間遠心分離して、ペレットとして膜フラクションおよび上澄液として細胞質
フラクションを単離した。
食塩水で洗浄し、低張緩衝液(0.25Mショ糖、20mM HEPES pH7.4、2mM EGTA、1mM
PMSF、10μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチンおよび10μg/mlペプスタチ
ン)にホモジナイズした。ホモジネート(全細胞フラクション)を、850 x gにて4
℃で15分間遠心分離で澄明にし、次に得られた上澄液を、100.000 x gにて4℃で
1時間遠心分離して、ペレットとして膜フラクションおよび上澄液として細胞質
フラクションを単離した。
【００３１】
脳の核は、2Mショ糖クッションを通して沈降させた。3匹の動物の脳領域は、
緩く装着したテフロン（登録商標）乳棒付きのポッターホモジナイザを用いて、
0.32Mショ糖、10mMトリス-HCl pH7.4、3mM MgCl2、1mM DTT、0.1%トリトンX-100
、10μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチンおよび10μg/mlペプスタチン中
にホモジナイズした。ホモジネートは、チーズ布を通して濾過し1000 x gにて10
分間遠心分離した。ペレットを、トリトンを含まず1.9Mショ糖を補った3mlのホ
モジナイズ用媒体で再懸濁した。この調製液を、2Mショ糖(10ml)のクッションに
より層化し、HB4ロータ(Sorvall)中12,000 x gにて遠心分離した。ペレットを0.
5mlの0.32Mショ糖中に再懸濁した。脳の核の純度を、クリスタルバイオレット染
色後、光学顕微鏡により評価した。さらに、知られた核タンパク質であるU2snRN
Pを、ウェスタンブロット分析法における核マーカとして用いた。
緩く装着したテフロン（登録商標）乳棒付きのポッターホモジナイザを用いて、
0.32Mショ糖、10mMトリス-HCl pH7.4、3mM MgCl2、1mM DTT、0.1%トリトンX-100
、10μg/mlアプロチニン、10μg/mlロイペプチンおよび10μg/mlペプスタチン中
にホモジナイズした。ホモジネートは、チーズ布を通して濾過し1000 x gにて10
分間遠心分離した。ペレットを、トリトンを含まず1.9Mショ糖を補った3mlのホ
モジナイズ用媒体で再懸濁した。この調製液を、2Mショ糖(10ml)のクッションに
より層化し、HB4ロータ(Sorvall)中12,000 x gにて遠心分離した。ペレットを0.
5mlの0.32Mショ糖中に再懸濁した。脳の核の純度を、クリスタルバイオレット染
色後、光学顕微鏡により評価した。さらに、知られた核タンパク質であるU2snRN
Pを、ウェスタンブロット分析法における核マーカとして用いた。
【００３２】
ウェスタンブロット分析法
脳を、氷冷プレート上で素早く切断した。ウェスタンブロット分析用の抽出物
は、20mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、20mM NaP、1%トリトンX-100、1mMオルト
バナジン酸ナトリウム、5mM EDTAおよびプロテアーゼ阻害剤(2mM PMSF、10μg/m
lアプロチニン、10μg/mlロイペプチンおよび10μg/mlペプスタチン)から成る氷
冷抽出用緩衝液中で脳領域をホモジナイズすることにより調製した。このサンプ
ルをホモジナイズし、15,000ｇにて4℃で20分間遠心分離した。生じた上澄液を
採取し、タンパク質含有量をBradfordにより決定した。30μgの総タンパク質を
、10%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロ
セルロース膜(Schleicher and Schuell)に移した。次の一次モノクローナル抗体
:抗GSK3β(1/2000)、PHF-1(1/200)、AD2(1/2000)、12E8(1/200)、7.51(1/100)、
抗MYC(1/100)、抗β-チューブリン(1/5000)、抗β-ガラクトシダーゼ(1/5000)を
用いて実験を実施した。濾液を、5%脱脂乾燥乳中4℃で一晩抗体と共にインキュ
ベートした。二次的ヤギ抗マウス抗体(1/5000; Gmco)およびECL検出試薬(Amersh
am)を免疫検出のために用いた。免疫反応の定量は、比重走査により実施した。
統計解析は、ステューデントのt検定を用いて実施した。
は、20mM HEPES、pH7.4、100mM NaCl、20mM NaP、1%トリトンX-100、1mMオルト
バナジン酸ナトリウム、5mM EDTAおよびプロテアーゼ阻害剤(2mM PMSF、10μg/m
lアプロチニン、10μg/mlロイペプチンおよび10μg/mlペプスタチン)から成る氷
冷抽出用緩衝液中で脳領域をホモジナイズすることにより調製した。このサンプ
ルをホモジナイズし、15,000ｇにて4℃で20分間遠心分離した。生じた上澄液を
採取し、タンパク質含有量をBradfordにより決定した。30μgの総タンパク質を
、10%ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロ
セルロース膜(Schleicher and Schuell)に移した。次の一次モノクローナル抗体
:抗GSK3β(1/2000)、PHF-1(1/200)、AD2(1/2000)、12E8(1/200)、7.51(1/100)、
抗MYC(1/100)、抗β-チューブリン(1/5000)、抗β-ガラクトシダーゼ(1/5000)を
用いて実験を実施した。濾液を、5%脱脂乾燥乳中4℃で一晩抗体と共にインキュ
ベートした。二次的ヤギ抗マウス抗体(1/5000; Gmco)およびECL検出試薬(Amersh
am)を免疫検出のために用いた。免疫反応の定量は、比重走査により実施した。
統計解析は、ステューデントのt検定を用いて実施した。
【００３３】
電子顕微鏡用の組織プロセッシング
電子顕微鏡用に、ビブラトーム切片を用いた。免疫染色後、切片を2% OsO4中
で1時間後固定し、脱水し、アラルダイトに包埋し、プラスチックカバーグラス
を用いてFormvar被覆スライドに平らに載せた。重合後、選んだ領域を写真に撮
り、切り取り、アラルダイトに再包埋し、1μmに再切断した。これらの半分の薄
さの切片を再度写真に撮り、超薄型切片に再切断した。この超薄型切片を、人為
的な沈殿を避けるために重金属染色をすることなくJeol電子顕微鏡で観察した。
で1時間後固定し、脱水し、アラルダイトに包埋し、プラスチックカバーグラス
を用いてFormvar被覆スライドに平らに載せた。重合後、選んだ領域を写真に撮
り、切り取り、アラルダイトに再包埋し、1μmに再切断した。これらの半分の薄
さの切片を再度写真に撮り、超薄型切片に再切断した。この超薄型切片を、人為
的な沈殿を避けるために重金属染色をすることなくJeol電子顕微鏡で観察した。
【００３４】
図面
図１。これは、マウスの設計を示す図である。AはBitetO構築体を示す図であ
る。これは、分岐配向において2つのCMVプロモーター配列に連結された回帰性te
tオペレーター配列の7コピーから成る。この2方向性プロモーターには、1つの方
向ではGSK-3βcDNA配列(その5'末端にMYCエピトープをコード化)、他の方向では
、核局在化シグナル(NLS)を含むβ-ガラクトシダーゼ(LacZ)配列が続く。Bは、C
OS細胞を、BitetO構築体およびヒトタウに対してコードする発現ベクターを含有
するプラスミドとコトランスフェクションしたことを示す図であり(1レーンから
6レーン)、tTAの発現を可能にする第3のプラスミドを、培地中に1μg/mlテトラ
サイクリンの非存在下(3レーンおよび4レーン)または存在下(5レーンおよび6レ
ーン)のいずれかに加えた(3レーンおよび6レーン)。タンパク質抽出物を、GSK-3
β、AD様リン酸化タウ(PHF-1)、全タウ(7.51)およびβ-ガラクトシダーゼ(β-Ga
l)に対する抗体によりプローブした。Cは、Tet/GSK-3βマウスは、CarnKIIaプロ
モーター(tTA)の制御下tTAを発現するマウスと、ゲノム中にBitetO構築体を組み
入れたマウス(TetO)とを掛け合せることにより生じたことを示す図である。ダブ
ルトランスジェニック子孫(Tet/GSK-3β)は、テトラサイクリンまたはその類縁
体を経口投与しtTAによるトランス活性化を妨げない限り、脳内に構成的にGSK-3
βを発現することが期待される。
る。これは、分岐配向において2つのCMVプロモーター配列に連結された回帰性te
tオペレーター配列の7コピーから成る。この2方向性プロモーターには、1つの方
向ではGSK-3βcDNA配列(その5'末端にMYCエピトープをコード化)、他の方向では
、核局在化シグナル(NLS)を含むβ-ガラクトシダーゼ(LacZ)配列が続く。Bは、C
OS細胞を、BitetO構築体およびヒトタウに対してコードする発現ベクターを含有
するプラスミドとコトランスフェクションしたことを示す図であり(1レーンから
6レーン)、tTAの発現を可能にする第3のプラスミドを、培地中に1μg/mlテトラ
サイクリンの非存在下(3レーンおよび4レーン)または存在下(5レーンおよび6レ
ーン)のいずれかに加えた(3レーンおよび6レーン)。タンパク質抽出物を、GSK-3
β、AD様リン酸化タウ(PHF-1)、全タウ(7.51)およびβ-ガラクトシダーゼ(β-Ga
l)に対する抗体によりプローブした。Cは、Tet/GSK-3βマウスは、CarnKIIaプロ
モーター(tTA)の制御下tTAを発現するマウスと、ゲノム中にBitetO構築体を組み
入れたマウス(TetO)とを掛け合せることにより生じたことを示す図である。ダブ
ルトランスジェニック子孫(Tet/GSK-3β)は、テトラサイクリンまたはその類縁
体を経口投与しtTAによるトランス活性化を妨げない限り、脳内に構成的にGSK-3
βを発現することが期待される。
【００３５】
図２。これは、Tet/GSK-3βマウスにおけるトランスジーン発現のパターンを
示す図である。A〜Bは、薬物未経験(A)またはドキシサイクリンを出産直前に5日
間母体に投与後生まれた(B)PO Tet/GSK-3βマウスからの脳矢状切片のX-gal染色
を示す図である。C〜Eでは、成体(3カ月)Tet/GSK-3βマウス脳の矢状切片におけ
るβ-ガラクトシダーゼの免疫組織化学により、異なる神経層である皮質(C)、海
馬(D)および線条(E)における発現が明らかにされている図である。Hは、海馬; C
x、皮質; St、線条; 11-VI、皮質層; cc、脳梁; DG、歯状回; Hil; 門; GP、淡
蒼球を示す図である。Bの目盛り用バーは、A〜Bにおいて1mmに相当する。Eの目
盛り用バーは、C〜Eにおいて200μmに相当する。
示す図である。A〜Bは、薬物未経験(A)またはドキシサイクリンを出産直前に5日
間母体に投与後生まれた(B)PO Tet/GSK-3βマウスからの脳矢状切片のX-gal染色
を示す図である。C〜Eでは、成体(3カ月)Tet/GSK-3βマウス脳の矢状切片におけ
るβ-ガラクトシダーゼの免疫組織化学により、異なる神経層である皮質(C)、海
馬(D)および線条(E)における発現が明らかにされている図である。Hは、海馬; C
x、皮質; St、線条; 11-VI、皮質層; cc、脳梁; DG、歯状回; Hil; 門; GP、淡
蒼球を示す図である。Bの目盛り用バーは、A〜Bにおいて1mmに相当する。Eの目
盛り用バーは、C〜Eにおいて200μmに相当する。
【００３６】
図３。これは、Tet/GSK-3βマウスの皮質および海馬中のGSK-3βの過剰発現を
示す図である。Aは、皮質(1レーンおよび2レーン)、小脳(3レーンおよび4レーン
)、野生型(1レーン、3レーンおよび5レーン)またはTet/GSK-3β(2レーン、4レー
ンおよび6レーン)マウスの海馬(5レーンおよび6レーン)からのタンパク質抽出物
のウェスタンブロットを示す図である。Bは、Tet/GSK-3βマウスにおけるGSK-3
β濃度のパーセント増加を示すヒストグラムを表す図である。C〜Eは、GSK-3β(
CおよびD)またはMYC(E)に対する抗体により実施された野生型(C)またはTet/GSK-
3β(DおよびE)マウスの皮質切片の免疫組織化学を示す図である。F〜Hは、GSK-3
β(FおよびG)またはMYC(H)に対する抗体により実施された野生型(F)またはTet/G
SK-3β(GおよびH)マウスの海馬切片における免疫組織化学を示す図である。I〜K
は、F〜Hに示された歯状回を高倍率で示す図である。目盛り用バーは、C〜Eにお
いては100μm、F〜Hにおいては200μm、I〜Iにおいては60μm、Kにおいては40μ
mに相当する。
示す図である。Aは、皮質(1レーンおよび2レーン)、小脳(3レーンおよび4レーン
)、野生型(1レーン、3レーンおよび5レーン)またはTet/GSK-3β(2レーン、4レー
ンおよび6レーン)マウスの海馬(5レーンおよび6レーン)からのタンパク質抽出物
のウェスタンブロットを示す図である。Bは、Tet/GSK-3βマウスにおけるGSK-3
β濃度のパーセント増加を示すヒストグラムを表す図である。C〜Eは、GSK-3β(
CおよびD)またはMYC(E)に対する抗体により実施された野生型(C)またはTet/GSK-
3β(DおよびE)マウスの皮質切片の免疫組織化学を示す図である。F〜Hは、GSK-3
β(FおよびG)またはMYC(H)に対する抗体により実施された野生型(F)またはTet/G
SK-3β(GおよびH)マウスの海馬切片における免疫組織化学を示す図である。I〜K
は、F〜Hに示された歯状回を高倍率で示す図である。目盛り用バーは、C〜Eにお
いては100μm、F〜Hにおいては200μm、I〜Iにおいては60μm、Kにおいては40μ
mに相当する。
【００３７】
図４。これは、β-カテニン濃度およびタウのリン酸化に及ぼすGSK-3β過剰発
現の作用を示す図である。Aは、抗β-カテニン抗体でプローブされた野生型(Wt)
またはTet/GSK-3β(TG)マウスの皮質(Cx)および海馬(Hipp)からの総細胞、膜、
細胞質ゾルおよび核調製物のウェスタンブロットを示す図である。Bは、PHF-1抗
体およびβ-チューブリン抗体でプローブされた野生型(Wt)またはTet/GSK-3β(T
G)マウスの皮質(Cx)、小脳(Cb)および海馬(Hipp)からのタンパク質抽出物のウェ
スタンブロットを示す図である。Cは、示された抗体でプローブされた野生型(Wt
)、tTA、TetO、またはTet/GSK-3βマウスからの海馬抽出物のウェスタンブロッ
トを示す図である。
現の作用を示す図である。Aは、抗β-カテニン抗体でプローブされた野生型(Wt)
またはTet/GSK-3β(TG)マウスの皮質(Cx)および海馬(Hipp)からの総細胞、膜、
細胞質ゾルおよび核調製物のウェスタンブロットを示す図である。Bは、PHF-1抗
体およびβ-チューブリン抗体でプローブされた野生型(Wt)またはTet/GSK-3β(T
G)マウスの皮質(Cx)、小脳(Cb)および海馬(Hipp)からのタンパク質抽出物のウェ
スタンブロットを示す図である。Cは、示された抗体でプローブされた野生型(Wt
)、tTA、TetO、またはTet/GSK-3βマウスからの海馬抽出物のウェスタンブロッ
トを示す図である。
【００３８】
図５。これは、Tet/GSK-3βマウスにおけるタウの細胞体樹状突起局在化を示
す図である。A〜Dは、野生型(AおよびB)またはTet/GSK-3β(CおよびD)マウスの
歯状回における免疫組織化学を示す図である。E〜Fは、野生型(E)またはTet/GSK
-3β(F)マウスの歯状回における7.51抗体で実施された免疫組織化学を示す図で
ある。B図中の矢印は、薄く染色された苔状線維を示す。C図中の挿入図は、PHF-
1免疫染色顆粒細胞のより高い倍率を示す。目盛り用バーは、A〜D図においては2
00μm、E〜F図においては60μmに相当する。
す図である。A〜Dは、野生型(AおよびB)またはTet/GSK-3β(CおよびD)マウスの
歯状回における免疫組織化学を示す図である。E〜Fは、野生型(E)またはTet/GSK
-3β(F)マウスの歯状回における7.51抗体で実施された免疫組織化学を示す図で
ある。B図中の矢印は、薄く染色された苔状線維を示す。C図中の挿入図は、PHF-
1免疫染色顆粒細胞のより高い倍率を示す。目盛り用バーは、A〜D図においては2
00μm、E〜F図においては60μmに相当する。
【００３９】
図６。これは、PHF-1陽性ニューロンの電子顕微鏡調査を示す図である。Aは、
Tet/GSK-3βマウス海馬歯状回における2種のニューロンの電子顕微鏡写真を示す
図である。N1は、拡散細胞質顆粒免疫染色に加えて、周囲の神経網(矢じり印)か
ら周回の大部分が剥離していることを表しているPHF-1免疫陽性ニューロンの核
を示す。N2は、PHF-1免疫陰性ニューロンの核を示す。Bは、斑点状にPHF-1反応
生成物を示し、粗細胞質内網状構造と関連する図4Aの同一マウスの歯状回におけ
るもう1つのPHF-1免疫陽性ニューロンを示す図である。Nは未標識核を示す。Cは
、図4Bの枠部分の高倍率であり、反応生成物(矢印)のパッチおよび粗細胞質内網
状構造の標識化を示す図である。重金属染色は実施しなかった。目盛り用バーは
、全パネルにおいて0.5μmに相当する。
Tet/GSK-3βマウス海馬歯状回における2種のニューロンの電子顕微鏡写真を示す
図である。N1は、拡散細胞質顆粒免疫染色に加えて、周囲の神経網(矢じり印)か
ら周回の大部分が剥離していることを表しているPHF-1免疫陽性ニューロンの核
を示す。N2は、PHF-1免疫陰性ニューロンの核を示す。Bは、斑点状にPHF-1反応
生成物を示し、粗細胞質内網状構造と関連する図4Aの同一マウスの歯状回におけ
るもう1つのPHF-1免疫陽性ニューロンを示す図である。Nは未標識核を示す。Cは
、図4Bの枠部分の高倍率であり、反応生成物(矢印)のパッチおよび粗細胞質内網
状構造の標識化を示す図である。重金属染色は実施しなかった。目盛り用バーは
、全パネルにおいて0.5μmに相当する。
【００４０】
図７。これは、Tet/GSK-3βマウスのニューロンの細胞死および反応性神経膠
症を示す図である。A〜Bは、野生型(A)またはTet/GSK-3β(B)マウスの歯状回のT
UNEL染色を示す図である。矢印は、TUNEL陽性核を示す。C〜Dは、野生型(C)また
はTet/GSK-3β(D)マウスの歯状回におけるGFAP免疫組織化学を示す図である。E
は、PHF-1免疫染色のニューロンを囲む肥胖星状膠細胞突起を示すTet/GSK-3βマ
ウスの海馬歯状回の電子顕微鏡写真を示す図である。Nは核である。*印は拡散細
胞質顆粒免疫染色を示す。★印は、肥胖星状膠細胞突起を示す。挿入図は、膠中
間フィラメントの特徴的な束状構造を示す神経膠星状突起の高倍率である。Fは
、Tet/GSK-3βマウスの歯状回のOX-42免疫染色を示す図である。矢印は、微細な
免疫活性小神経膠細胞微小突起を示す。矢じり印は、免疫染色反応性細胞質体を
示す。SMは、分子層、SGは顆粒層、Hは門である。目盛り用バーは、A〜Bにおい
ては50μm、C〜Dにおいては60μm、Eにおいては0.5μm、およびFにおいては30μ
mに相当する。
症を示す図である。A〜Bは、野生型(A)またはTet/GSK-3β(B)マウスの歯状回のT
UNEL染色を示す図である。矢印は、TUNEL陽性核を示す。C〜Dは、野生型(C)また
はTet/GSK-3β(D)マウスの歯状回におけるGFAP免疫組織化学を示す図である。E
は、PHF-1免疫染色のニューロンを囲む肥胖星状膠細胞突起を示すTet/GSK-3βマ
ウスの海馬歯状回の電子顕微鏡写真を示す図である。Nは核である。*印は拡散細
胞質顆粒免疫染色を示す。★印は、肥胖星状膠細胞突起を示す。挿入図は、膠中
間フィラメントの特徴的な束状構造を示す神経膠星状突起の高倍率である。Fは
、Tet/GSK-3βマウスの歯状回のOX-42免疫染色を示す図である。矢印は、微細な
免疫活性小神経膠細胞微小突起を示す。矢じり印は、免疫染色反応性細胞質体を
示す。SMは、分子層、SGは顆粒層、Hは門である。目盛り用バーは、A〜Bにおい
ては50μm、C〜Dにおいては60μm、Eにおいては0.5μm、およびFにおいては30μ
mに相当する。
【００４１】
マウス構築体
2方向性tet応答性プロモーター(Baronら、1995年)を有するプラスミド(Biteto
)を生成してから、1方向においてGSK-3βcDNA(その5'末端のMYCエピトームをコ
ードする)、他方向において核局在化シグナルに融合したβ-ガラクトシダーゼ(
β-gal)をコードするcDNAの双方を生成した(図1A)。このプラスミドを、COS細胞
において実施したトランスフェクション実験で評価した(図1B)。このプラスミド
それ自体またはタウをコードする発現ベクターと共にコトランスフェクションさ
れたプラスミド(図1B、1レーンおよび2レーン)は、GSK-3βに対する抗体による
ウェスタンブロット法により証明されたようにGSK-3β濃度に何ら作用を及ぼさ
なかった。tTAの発現を可能にするプラスミド(図1B、3レーンおよび4レーン)と
共にコトランスフェクションされた場合、GSK-3β濃度の著しい増加が明白であ
った。このことは、PHFタウのリン酸化エピトームを認識するPHF-1抗体によるウ
ェスタンブロット法により証明されたように、タウのリン酸化を増加させる結果
となった。テトラサイクリンが存在した場合(図1B、5レーンおよび6レーン)、GS
K-3βのトランス活性化は失われた。したがって、これらの実験は、BitetO構築
体からGSK-3βが条件付きで発現をしていることを示している(図1A)。
)を生成してから、1方向においてGSK-3βcDNA(その5'末端のMYCエピトームをコ
ードする)、他方向において核局在化シグナルに融合したβ-ガラクトシダーゼ(
β-gal)をコードするcDNAの双方を生成した(図1A)。このプラスミドを、COS細胞
において実施したトランスフェクション実験で評価した(図1B)。このプラスミド
それ自体またはタウをコードする発現ベクターと共にコトランスフェクションさ
れたプラスミド(図1B、1レーンおよび2レーン)は、GSK-3βに対する抗体による
ウェスタンブロット法により証明されたようにGSK-3β濃度に何ら作用を及ぼさ
なかった。tTAの発現を可能にするプラスミド(図1B、3レーンおよび4レーン)と
共にコトランスフェクションされた場合、GSK-3β濃度の著しい増加が明白であ
った。このことは、PHFタウのリン酸化エピトームを認識するPHF-1抗体によるウ
ェスタンブロット法により証明されたように、タウのリン酸化を増加させる結果
となった。テトラサイクリンが存在した場合(図1B、5レーンおよび6レーン)、GS
K-3βのトランス活性化は失われた。したがって、これらの実験は、BitetO構築
体からGSK-3βが条件付きで発現をしていることを示している(図1A)。
【００４２】
次にBitetO構築体を卵母細胞に顕微注入し、生じた5系統のトランスジェニッ
ク・マウスを、包括的にTetOと名付けた(図1C)。tTAマウス系統において、tTAト
ランスジーンは、カルシウムカルモジュリンキナーゼIIaプロモーター(CamKIIa-
tTA系統EおよびB)の制御下にある(Mayfordら、1996年)。これらのtTA系統は、前
脳において特に高い発現を有し、CNSにおいて制限された条件付きの発現を可能
にするために選ばれた(Mayfordら、1996年; Yamamotoら、2000年)。TetOマウス
を、tTAマウスと掛け合せると、出生したダブルトランスジェニック子孫(Tet/GS
K-3βと名付けた)は、双方のトランスジーンを構成的に発現すると予想される(
図1C)。しかし、この発現は、テトラサクリンまたはその類縁体の存在下では排
除できる。
ク・マウスを、包括的にTetOと名付けた(図1C)。tTAマウス系統において、tTAト
ランスジーンは、カルシウムカルモジュリンキナーゼIIaプロモーター(CamKIIa-
tTA系統EおよびB)の制御下にある(Mayfordら、1996年)。これらのtTA系統は、前
脳において特に高い発現を有し、CNSにおいて制限された条件付きの発現を可能
にするために選ばれた(Mayfordら、1996年; Yamamotoら、2000年)。TetOマウス
を、tTAマウスと掛け合せると、出生したダブルトランスジェニック子孫(Tet/GS
K-3βと名付けた)は、双方のトランスジーンを構成的に発現すると予想される(
図1C)。しかし、この発現は、テトラサクリンまたはその類縁体の存在下では排
除できる。
【００４３】
tet調節系の条件付きトランスジェニック・マウスを作製する以前の実験では
、tetO構築体の挿入のゲノム部位および/またはコピー数は、tTAによるトランス
活性化の最終パターンおよびレベルに影響を与えることが示されている。BitetO
構築体におけるβ-Galレポーター配列は、X-Gal染色またはβ-Galに対する免疫
組織化学のいずれかによりダブルトランスジェニック・マウスにおけるトランス
ジーン発現パターンの迅速な分析を可能にし、さらにテトラサイクリンによるト
ランスジーン・サイレンジングの効果の試験を可能にする。我々は、どのTetOマ
ウス系統が我々の研究にとってより好適であるかを決めるためにこれを利用した
。
、tetO構築体の挿入のゲノム部位および/またはコピー数は、tTAによるトランス
活性化の最終パターンおよびレベルに影響を与えることが示されている。BitetO
構築体におけるβ-Galレポーター配列は、X-Gal染色またはβ-Galに対する免疫
組織化学のいずれかによりダブルトランスジェニック・マウスにおけるトランス
ジーン発現パターンの迅速な分析を可能にし、さらにテトラサイクリンによるト
ランスジーン・サイレンジングの効果の試験を可能にする。我々は、どのTetOマ
ウス系統が我々の研究にとってより好適であるかを決めるためにこれを利用した
。
【００４４】
各種TET/GSK-3βマウス系統の特性評価
5系統のTetOをtTA系統と交配した際、それらのうち3系統が、線条においての
みβ-Gal発現を示した(データは示さず)。残りの2系統のTetO(系統G6およびG7)
は、皮質および海馬などのADに関連する脳領域で高レベルのトランスジーン発現
を示し、我々の研究に特に好適であったため残りの系統G6およびG7に研究の焦点
を当てた。これら2系統は、内因性CamKIIcαと極めて類似した空間パターンでβ
-Galをトランス活性化し、皮質、海馬、線条および小脳扁桃において明白に発現
する(図2)。成体Tet/GSK-3βマウスの脳切片における免疫組織化学は、皮質の種
々のニューロン層において、海馬(海馬台、CA1、CA2、CA3および歯状回を含む)
の種々の領域、および1.1線条においてβGalの発現を示す(図2C〜E)。淡蒼球、
視床、聴覚脳幹および小脳などの他の脳領域にβ-Gal発現は検出されなかった(
図2A、2E、3A、図示せず)。同様のパターンおよびトランスジーン発現レベルが
、いずれかのCamKIIα-tTA系統(EまたはB)を1系統のTetO(G6またはG7)と組み合
わせた場合に得られた。本研究において、我々は、各々の組み合わせを相互に変
えて用いた。したがって今後、シングル・トランスジェニック・マウスには用語
tTAおよびTetO、ダブルトランスジェニック動物にはTet/GSK-3Bを用いることと
する。
みβ-Gal発現を示した(データは示さず)。残りの2系統のTetO(系統G6およびG7)
は、皮質および海馬などのADに関連する脳領域で高レベルのトランスジーン発現
を示し、我々の研究に特に好適であったため残りの系統G6およびG7に研究の焦点
を当てた。これら2系統は、内因性CamKIIcαと極めて類似した空間パターンでβ
-Galをトランス活性化し、皮質、海馬、線条および小脳扁桃において明白に発現
する(図2)。成体Tet/GSK-3βマウスの脳切片における免疫組織化学は、皮質の種
々のニューロン層において、海馬(海馬台、CA1、CA2、CA3および歯状回を含む)
の種々の領域、および1.1線条においてβGalの発現を示す(図2C〜E)。淡蒼球、
視床、聴覚脳幹および小脳などの他の脳領域にβ-Gal発現は検出されなかった(
図2A、2E、3A、図示せず)。同様のパターンおよびトランスジーン発現レベルが
、いずれかのCamKIIα-tTA系統(EまたはB)を1系統のTetO(G6またはG7)と組み合
わせた場合に得られた。本研究において、我々は、各々の組み合わせを相互に変
えて用いた。したがって今後、シングル・トランスジェニック・マウスには用語
tTAおよびTetO、ダブルトランスジェニック動物にはTet/GSK-3Bを用いることと
する。
【００４５】
Tet/GSK-3Bマウスは、生育可能で繁殖力があり、トランスジーン発現を抑制す
る薬理学的介入がなければ正常に見える。これは、脳内にGSK-3β発現が増加す
るという以前に前提とした毒性と矛盾するように思われる(Brownless、1997年)
。しかし、tTAマウスとTetOマウス間のヘテロ接合交配は、各遺伝子型(野生型、
tTA、TetO、およびTet/GSK-3β)について25%の予想頻度とはならなかった。Tet/
GSK-3βマウスでは表現が低下した(14%、n=401)。このことは、Tet/GSK-3βマウ
スにおけるGSK-3βの胎仔での過剰発現による致死性を示していると思われる。
る薬理学的介入がなければ正常に見える。これは、脳内にGSK-3β発現が増加す
るという以前に前提とした毒性と矛盾するように思われる(Brownless、1997年)
。しかし、tTAマウスとTetOマウス間のヘテロ接合交配は、各遺伝子型(野生型、
tTA、TetO、およびTet/GSK-3β)について25%の予想頻度とはならなかった。Tet/
GSK-3βマウスでは表現が低下した(14%、n=401)。このことは、Tet/GSK-3βマウ
スにおけるGSK-3βの胎仔での過剰発現による致死性を示していると思われる。
【００４６】
我々は以前、ハンチントン病のCamKIIα-tTA駆動動物モデル(HD94)において周
産期のトランスジーンの発現および致死性を観察した(Yamamotoら、2000年)。HD
94マウスの場合、妊娠マウスに、E15から誕生まで、任意の飲用水に入れたテト
ラサイクリン類縁体のドキシサイクリン(2mg/ml)を投与すると、生後のトランス
ジーン発現のみが生じ、4種の予想遺伝子型の頻度が25%まで回復する。したがっ
て、我々は、周産期のドキシサイクリン処理の同一プログラムをTet/GSK-3Bマウ
スに適用することにした。我々は、POでは非処理マウスが前脳においてX-gal染
色を示すが、処理マウスでは染色されないことを見つけた(図2AおよびB)。この
ことは、Tet/GSK-3βマウスにおけるトランスジーン発現が胎仔期に始まり、ド
キシサイクリンによって阻害できることを示している。予想どおり、周産期のド
キシサイクリン処理により、Tet/GSK-3βマウスの頻度は25%まで正常化し、した
がって、同腹仔のダブルトランスジーン・マウスの生産を最大にしたので、周産
期のドキシサイクリン処理を日常に使用した。
産期のトランスジーンの発現および致死性を観察した(Yamamotoら、2000年)。HD
94マウスの場合、妊娠マウスに、E15から誕生まで、任意の飲用水に入れたテト
ラサイクリン類縁体のドキシサイクリン(2mg/ml)を投与すると、生後のトランス
ジーン発現のみが生じ、4種の予想遺伝子型の頻度が25%まで回復する。したがっ
て、我々は、周産期のドキシサイクリン処理の同一プログラムをTet/GSK-3Bマウ
スに適用することにした。我々は、POでは非処理マウスが前脳においてX-gal染
色を示すが、処理マウスでは染色されないことを見つけた(図2AおよびB)。この
ことは、Tet/GSK-3βマウスにおけるトランスジーン発現が胎仔期に始まり、ド
キシサイクリンによって阻害できることを示している。予想どおり、周産期のド
キシサイクリン処理により、Tet/GSK-3βマウスの頻度は25%まで正常化し、した
がって、同腹仔のダブルトランスジーン・マウスの生産を最大にしたので、周産
期のドキシサイクリン処理を日常に使用した。
【００４７】
Tet/GSK-3βマウスは、皮質および海馬でGSK-3βを過剰発現する。次いで我々
は、ウェスタンブロット分析法により、β-Gal発現を示す脳領域がGSK-3βの濃
度増加を示すことも確認した。抗MYC抗体でタンパク質抽出物をプローブすると
、トランスジーンGSK-3βの最高レベルの発現は海馬で生じ、次が皮質であり(図
3A)、一方、線条では発現が殆ど検出されなかった(図示せず)。したがって、3月
齢マウスからの抽出物をGSK-3βに対して誘導した抗体でプローブすると(図3Aお
よびB)、野生型マウスに対して、Tet/GSK-3βマウスの海馬におけるGSK-3β濃度
の有意な(p<0.02)40+/-12.4%の増加が観察された。皮質抽出物もまた、Tet/GSK-
3βマウスにおいてGSK-3β濃度の増加(17+/-5%)を示した。線条(図示せず)また
は小脳などの非前脳領域(図3B)においてはGSK-3β濃度の差はなかった。次に我
々は、1月齢から12月齢の範囲で、Tet/GSK-3βマウスの海馬および皮質に生じる
GSK-3βの増加をモニタした。過剰発現のレベルは、試験した月齢の全てにおい
て同様であり(図示せず)、本研究における残りの実験は、2.5月齢と6月齢の間の
成体マウスに対し行われた。
は、ウェスタンブロット分析法により、β-Gal発現を示す脳領域がGSK-3βの濃
度増加を示すことも確認した。抗MYC抗体でタンパク質抽出物をプローブすると
、トランスジーンGSK-3βの最高レベルの発現は海馬で生じ、次が皮質であり(図
3A)、一方、線条では発現が殆ど検出されなかった(図示せず)。したがって、3月
齢マウスからの抽出物をGSK-3βに対して誘導した抗体でプローブすると(図3Aお
よびB)、野生型マウスに対して、Tet/GSK-3βマウスの海馬におけるGSK-3β濃度
の有意な(p<0.02)40+/-12.4%の増加が観察された。皮質抽出物もまた、Tet/GSK-
3βマウスにおいてGSK-3β濃度の増加(17+/-5%)を示した。線条(図示せず)また
は小脳などの非前脳領域(図3B)においてはGSK-3β濃度の差はなかった。次に我
々は、1月齢から12月齢の範囲で、Tet/GSK-3βマウスの海馬および皮質に生じる
GSK-3βの増加をモニタした。過剰発現のレベルは、試験した月齢の全てにおい
て同様であり(図示せず)、本研究における残りの実験は、2.5月齢と6月齢の間の
成体マウスに対し行われた。
【００４８】
どの細胞集団がGSK-3βを過剰発現するかの洞察を得るために、抗MYC抗体およ
び抗GSK-3β抗体の双方で免疫組織化学を実施した。皮質において、GSK-3βに関
する免疫活性の増加が、II層およびIII層の錐体皮質ニューロン(図3C〜E)および
脳梁に隣接した薄片VIニューロン(図示せず)に見られた。
び抗GSK-3β抗体の双方で免疫組織化学を実施した。皮質において、GSK-3βに関
する免疫活性の増加が、II層およびIII層の錐体皮質ニューロン(図3C〜E)および
脳梁に隣接した薄片VIニューロン(図示せず)に見られた。
【００４９】
海馬において、GSK-3βの過剰発現は全領域(海馬台、CA1、CA2、CA3、および
歯状回)において明らであり、歯状回およびCA2では最も広汎な増加を示した(図3
F〜H)。野生型マウスの歯状回は、GSK-3βに関して非常に弱いIRを示したが(図3
Fおよび3I)、一方、Tet/GSK-3βマウスの歯状回においては、各ニューロンがGSK
-3βを過剰発現した(図3Gおよび3I)。これらニューロンのあるものは、抗GSK-3
β抗体および抗MYC抗体の双方により、著しく高い染色性を示し(図3I〜K)、しば
しば収縮細胞体など(図示せず)の異常形態を示した。CA2錐体ニューロンでは、
細胞体および樹状突起の双方において顕著な染色が、Tet/GSK-3βマウスに見ら
れた(図3G〜H)。
歯状回)において明らであり、歯状回およびCA2では最も広汎な増加を示した(図3
F〜H)。野生型マウスの歯状回は、GSK-3βに関して非常に弱いIRを示したが(図3
Fおよび3I)、一方、Tet/GSK-3βマウスの歯状回においては、各ニューロンがGSK
-3βを過剰発現した(図3Gおよび3I)。これらニューロンのあるものは、抗GSK-3
β抗体および抗MYC抗体の双方により、著しく高い染色性を示し(図3I〜K)、しば
しば収縮細胞体など(図示せず)の異常形態を示した。CA2錐体ニューロンでは、
細胞体および樹状突起の双方において顕著な染色が、Tet/GSK-3βマウスに見ら
れた(図3G〜H)。
【００５０】
次に我々は、AD関連基質のβ-カテニンおよびタウに及ぼすGSK-3β過剰発現の
影響をウェスタンブロット法により分析した。β-カテニンは、細胞間接着結合
の成分であるが、またTcf/LEFファミリーのHMG-ボックス転写因子と関連してお
り、標的遺伝子の転写を促進する。GSK-3βは、β-カテニンの安定化および引き
続く核トランスロケーションを調節する重要な酵素である(Anderton、1999年; B
arthら、1997年)。
影響をウェスタンブロット法により分析した。β-カテニンは、細胞間接着結合
の成分であるが、またTcf/LEFファミリーのHMG-ボックス転写因子と関連してお
り、標的遺伝子の転写を促進する。GSK-3βは、β-カテニンの安定化および引き
続く核トランスロケーションを調節する重要な酵素である(Anderton、1999年; B
arthら、1997年)。
【００５１】
我々は、まず全皮質および海馬抽出物中のβ-カテニン濃度を分析した(図4A)
。野生型マウスとTet/GSK-3βマウスとの間に相違は見出せなかった。次に各種
細胞区画におけるβ-カテニン濃度を分析した。図4Aに見られるように、皮質ま
たは海馬からの膜または細胞質ゾル抽出物中のβ-カテニン濃度に変化はなかっ
た。核抽出物を分析すると、皮質中のβ-カテニン濃度に有意差は見られなかっ
た。しかし、我々は、海馬中において野生型の同腹仔つがいと比較して、Tet/GS
K-3〜マウスの核β-カテニン濃度において有意な(p<0.05、n=6)35+/-8%減少を観
察した。核β-カテニンのこの減少は、Tet/GSK-3βマウスの歯状回における免疫
電子顕微鏡法によっても明白であった(図示せず)。
。野生型マウスとTet/GSK-3βマウスとの間に相違は見出せなかった。次に各種
細胞区画におけるβ-カテニン濃度を分析した。図4Aに見られるように、皮質ま
たは海馬からの膜または細胞質ゾル抽出物中のβ-カテニン濃度に変化はなかっ
た。核抽出物を分析すると、皮質中のβ-カテニン濃度に有意差は見られなかっ
た。しかし、我々は、海馬中において野生型の同腹仔つがいと比較して、Tet/GS
K-3〜マウスの核β-カテニン濃度において有意な(p<0.05、n=6)35+/-8%減少を観
察した。核β-カテニンのこの減少は、Tet/GSK-3βマウスの歯状回における免疫
電子顕微鏡法によっても明白であった(図示せず)。
【００５２】
次に、小脳におけるのと同様にMYC発現を示すこれらの脳領域(皮質、線条およ
び海馬)においてタウ抗体によるウェスタンブロット法を実施した。PHF-1抗体に
より検出されたように、海馬のみがタウのリン酸化レベルの増加を示した(図4B
、および図示せず)。PHF-1抗体により検出されたタウのAD様リン酸化の増加は、
タウの同一のリン酸エピトープに対して誘導されたAD2抗体を用いて再現された(
図4C)。Tet/GSK-3βマウスのPHF-1およびAD2IRの増加は、全タウイソ体を認識す
るリン酸化非依存性タウ抗体7.51では増加が見られなかったため、全タウの濃度
変化によるものではない。さらに、プロリン残基に隣接しておらず、インビボで
GSK-3β非依存性であることが示されている(Munoz-Montanoら、1997年)セリン26
2におけるリン酸化は、12E8抗体により検出されたようにTet/GSK-3βマウスに影
響を与えない(図4C)。
び海馬)においてタウ抗体によるウェスタンブロット法を実施した。PHF-1抗体に
より検出されたように、海馬のみがタウのリン酸化レベルの増加を示した(図4B
、および図示せず)。PHF-1抗体により検出されたタウのAD様リン酸化の増加は、
タウの同一のリン酸エピトープに対して誘導されたAD2抗体を用いて再現された(
図4C)。Tet/GSK-3βマウスのPHF-1およびAD2IRの増加は、全タウイソ体を認識す
るリン酸化非依存性タウ抗体7.51では増加が見られなかったため、全タウの濃度
変化によるものではない。さらに、プロリン残基に隣接しておらず、インビボで
GSK-3β非依存性であることが示されている(Munoz-Montanoら、1997年)セリン26
2におけるリン酸化は、12E8抗体により検出されたようにTet/GSK-3βマウスに影
響を与えない(図4C)。
【００５３】
我々は、4種の可能な遺伝子型(野生型、tTA、TetO、およびTet/GSK-3〜)にお
けるタウのリン酸化およびトランスジェニックスタンパク質の発現を比較した(
図4C)。Tet/GSK-3βマウスのみが、β-Gal発現およびGSK-3β、PHF-1タウおよび
AD2タウの濃度増加を示し、したがってTet/GSK-3βマウスにおけるトランスジー
ン発現並びに引き続く効果は、BitetO構築体のtTAによるトランス活性化による
ものであり、TetOマウスにおける後者の漏出によるものではなかったことを示し
た。
けるタウのリン酸化およびトランスジェニックスタンパク質の発現を比較した(
図4C)。Tet/GSK-3βマウスのみが、β-Gal発現およびGSK-3β、PHF-1タウおよび
AD2タウの濃度増加を示し、したがってTet/GSK-3βマウスにおけるトランスジー
ン発現並びに引き続く効果は、BitetO構築体のtTAによるトランス活性化による
ものであり、TetOマウスにおける後者の漏出によるものではなかったことを示し
た。
【００５４】
AD様過剰リン酸化タウの細胞体樹状突起の局在化
我々は、海馬ニューロン集団が、ウェスタンブロット法により観察されたPHF-
1 IRの増加を示す免疫組織化学により分析した。PHF-1の増加、免疫染色は歯状
回において最も明白であった(図5)。野生型マウスにおいて、歯状回の顆粒細胞
は、検出可能なPHF-1 IRを示さない(図SA)、しかしCA3に投影する苔状線維にい
くらかの染色が検出できた(図5B)。Tet/GSK-3Bマウスは、苔状線維染色が著しく
増加し(図5D)、興味深いことに、たいていの顆粒細胞は、強い細胞体樹状突起の
PHF-1免疫染色を示し、したがって、AD神経原線維変性のもつれ前の段階に似て
いる(図5C)。
1 IRの増加を示す免疫組織化学により分析した。PHF-1の増加、免疫染色は歯状
回において最も明白であった(図5)。野生型マウスにおいて、歯状回の顆粒細胞
は、検出可能なPHF-1 IRを示さない(図SA)、しかしCA3に投影する苔状線維にい
くらかの染色が検出できた(図5B)。Tet/GSK-3Bマウスは、苔状線維染色が著しく
増加し(図5D)、興味深いことに、たいていの顆粒細胞は、強い細胞体樹状突起の
PHF-1免疫染色を示し、したがって、AD神経原線維変性のもつれ前の段階に似て
いる(図5C)。
【００５５】
GSK-3βによるタウのリン酸化は、インビトロおよびトランスフェクションさ
れた細胞で微小管に対するタウの親和性を減じる(Lovestoneら、1996年)。これ
は、PHF-1抗体により見出された細胞体樹状突起染色を部分的に説明できる。こ
れを試験するため、タウのチューブリン結合ドメインに対し誘導され、したがっ
て微小管に結合していない場合のみタウを認識する抗体、7.51により免疫組織化
学を実施した。興味深いことに、7.51抗体は、Tet/GSK-3βの細胞体を染色した
が、野生型歯状回顆粒細胞を染色しなかった(図5F)。7.51染色細胞の形態は、PH
F-1抗体で見られたものと極めて類似していた(図5Cの挿入図を参照)。
れた細胞で微小管に対するタウの親和性を減じる(Lovestoneら、1996年)。これ
は、PHF-1抗体により見出された細胞体樹状突起染色を部分的に説明できる。こ
れを試験するため、タウのチューブリン結合ドメインに対し誘導され、したがっ
て微小管に結合していない場合のみタウを認識する抗体、7.51により免疫組織化
学を実施した。興味深いことに、7.51抗体は、Tet/GSK-3βの細胞体を染色した
が、野生型歯状回顆粒細胞を染色しなかった(図5F)。7.51染色細胞の形態は、PH
F-1抗体で見られたものと極めて類似していた(図5Cの挿入図を参照)。
【００５６】
過剰リン酸化タウの強い細胞体樹状突起免疫染色はまた、PHFなどのタウの異
常集合体型を示している可能性がある。AD脳内のチオフラビン-S染色は、神経原
線維の変性並びにアミロイドプラークの双方を明らかにする。したがって、Tet/
GSK-3βマウスの脳切片においてチオフラビン-S染色を実施した。チオフラビン-
S蛍光は、歯状回の顆粒細胞、または他の脳領域のいずれにも検出されなかった
ので、PHF束状構造並びにβ-シートタンパク質集合体が無いことが示された。チ
オフラビン-S蛍光の欠如は、短いPHFの僅かな存在と両立し得るので、神経原線
維変性の最初のステップを表している可能性がある。
常集合体型を示している可能性がある。AD脳内のチオフラビン-S染色は、神経原
線維の変性並びにアミロイドプラークの双方を明らかにする。したがって、Tet/
GSK-3βマウスの脳切片においてチオフラビン-S染色を実施した。チオフラビン-
S蛍光は、歯状回の顆粒細胞、または他の脳領域のいずれにも検出されなかった
ので、PHF束状構造並びにβ-シートタンパク質集合体が無いことが示された。チ
オフラビン-S蛍光の欠如は、短いPHFの僅かな存在と両立し得るので、神経原線
維変性の最初のステップを表している可能性がある。
【００５７】
この可能性を分析するために、次に、Tet/GSK-3β顆粒細胞が、PHF-1に対して
強い細胞体樹状突起免疫標識化を示すことから、それらの電子顕微鏡検査を行っ
た。拡散反応生成物が、これらのニューロンの核周囲部に存在したが(図6A〜C)
、ある場合には、暗反応生成物の斑点も見られた(図6C)。しかし、PHFは、暗反
応生成物の斑点、または拡散免疫標識細胞質の他の部分においても見られなかっ
た。興味深いことに、免疫標識物質は、粗小胞体(RER)シスターネの細胞質面に
沿ってしばしば見られ、ある場合には上記暗染色斑点は、これら標識RER シスタ
ーネに密に近接している(図6C)。興味深いことに、拡散PHF-1細胞質標識を有す
るTet/GSK-3βニューロンは、周囲の神経網から剥離して現れることが非常に多
く、大部分の辺縁部に沿って広がった細胞外空間を示すが、一方、非標識ニュー
ロンは如何なる剥離も示さなかった。また、野生型マウスの顆粒ニューロンの剥
離も見られなかった。
強い細胞体樹状突起免疫標識化を示すことから、それらの電子顕微鏡検査を行っ
た。拡散反応生成物が、これらのニューロンの核周囲部に存在したが(図6A〜C)
、ある場合には、暗反応生成物の斑点も見られた(図6C)。しかし、PHFは、暗反
応生成物の斑点、または拡散免疫標識細胞質の他の部分においても見られなかっ
た。興味深いことに、免疫標識物質は、粗小胞体(RER)シスターネの細胞質面に
沿ってしばしば見られ、ある場合には上記暗染色斑点は、これら標識RER シスタ
ーネに密に近接している(図6C)。興味深いことに、拡散PHF-1細胞質標識を有す
るTet/GSK-3βニューロンは、周囲の神経網から剥離して現れることが非常に多
く、大部分の辺縁部に沿って広がった細胞外空間を示すが、一方、非標識ニュー
ロンは如何なる剥離も示さなかった。また、野生型マウスの顆粒ニューロンの剥
離も見られなかった。
【００５８】
ニューロンの細胞死およびTet/GSK-3βマウスの海馬における反応性神経膠症
前述の試験では、GSK-3Bがアポトーシスを防ぐPI 3-キナーゼ/PKB生存経路に
より阻害されることを示した(Crossら、1995年; Crossら、1994年; Hurelら、19
96年; Saitoら、1994年)。これは、PS-1における変異によるβ-カテニンの不安
定化が、ニューロンのアポトーシスを増加させるという(Zhangら、1998年)観察
と共に、GSK-3βの過剰発現の結果としてTet/GSK-3βマウスにアポトーシスが生
じるか否かを探索する促しとなった。
より阻害されることを示した(Crossら、1995年; Crossら、1994年; Hurelら、19
96年; Saitoら、1994年)。これは、PS-1における変異によるβ-カテニンの不安
定化が、ニューロンのアポトーシスを増加させるという(Zhangら、1998年)観察
と共に、GSK-3βの過剰発現の結果としてTet/GSK-3βマウスにアポトーシスが生
じるか否かを探索する促しとなった。
【００５９】
Tet/GSK-3βマウスの各種ニューロン集団は、野生型マウスに存在しないTUNEL
標識化を示した。これは、主に歯状回の顆粒細胞において観察された(野生型歯
状回の標識の無いものに対して、Tet/GSK-3β歯状回の30μm切片1個につき5個の
標識顆粒細胞まで)(図4AおよびB)。いくつかのTUNEL陽性細胞はまた、Tet/GSK-3
βマウスの皮質薄片VIでは脳梁に隣接して見られた(図示せず)。
標識化を示した。これは、主に歯状回の顆粒細胞において観察された(野生型歯
状回の標識の無いものに対して、Tet/GSK-3β歯状回の30μm切片1個につき5個の
標識顆粒細胞まで)(図4AおよびB)。いくつかのTUNEL陽性細胞はまた、Tet/GSK-3
βマウスの皮質薄片VIでは脳梁に隣接して見られた(図示せず)。
【００６０】
次に、Tet/GSK-3βマウスにおけるGSK-3βの過剰発現により引き起こされたニ
ューロン変性および/またはニューロンの細胞死が、反応性星状細胞増加や小神
経膠細胞などの神経膠細胞変性を伴うか否かを試験した。神経膠細胞原線維酸性
タンパク質(GF AP)に対し誘導した抗体により実施された免疫組織化学は、種々
の脳領域における反応性星状細胞増加症を明らかにした。TUNEL標識と一致して
、GF AP染色は、歯状回および深い皮質層に最も広がっていた(図7CおよびD、お
よび図示せず)。電子顕微鏡検査により、Tet/GSK-3βマウスの歯状回における高
度に活性化された神経膠星状細胞突起の存在、神経膠星状細胞中間体線維の全体
が確認された。これらは、しばしばPHF-1 IRニューロンの周囲に見られた(図7E)
。
ューロン変性および/またはニューロンの細胞死が、反応性星状細胞増加や小神
経膠細胞などの神経膠細胞変性を伴うか否かを試験した。神経膠細胞原線維酸性
タンパク質(GF AP)に対し誘導した抗体により実施された免疫組織化学は、種々
の脳領域における反応性星状細胞増加症を明らかにした。TUNEL標識と一致して
、GF AP染色は、歯状回および深い皮質層に最も広がっていた(図7CおよびD、お
よび図示せず)。電子顕微鏡検査により、Tet/GSK-3βマウスの歯状回における高
度に活性化された神経膠星状細胞突起の存在、神経膠星状細胞中間体線維の全体
が確認された。これらは、しばしばPHF-1 IRニューロンの周囲に見られた(図7E)
。
【００６１】
小神経膠細胞症が、Tet/GSK-3βマウスの海馬に生じたかどうかを試験するた
めに、OX42抗体、LN-3抗体およびED1抗体により免疫組織化学を実施した。これ
ら3種の抗体の全てに同様の結果が得られた(図7Fは、OX-42の免疫組織化学を示
す)。野生型海馬切片と比較すると、微細な神経膠星状細胞突起の増加が、Tet/G
SK-3βマウスの顆粒層に見られた。さらに、反応性小神経膠細胞に相当する免疫
染色細胞体は、Tet/GSK-3βマウスのみの主に海馬の分子層に見られた(7Fの矢じ
り印)。
めに、OX42抗体、LN-3抗体およびED1抗体により免疫組織化学を実施した。これ
ら3種の抗体の全てに同様の結果が得られた(図7Fは、OX-42の免疫組織化学を示
す)。野生型海馬切片と比較すると、微細な神経膠星状細胞突起の増加が、Tet/G
SK-3βマウスの顆粒層に見られた。さらに、反応性小神経膠細胞に相当する免疫
染色細胞体は、Tet/GSK-3βマウスのみの主に海馬の分子層に見られた(7Fの矢じ
り印)。
【００６２】
考察
条件付きのトランスジェニック法をここで用いることにより、我々は、GSK-3
βのインビボ過剰発現が神経変性をもたらすことを示す。GSK-3βを過剰発現す
る条件付きトランスジェニック・マウスはまた、B-カテニン不安定化および過剰
リン酸化タウのもつれ前のような細胞体樹状突起局在化などのADの各種生化学的
並びに細胞性の態様と類似している。したがって、我々の結果は、GSK-3βの脱
調節がADの病因における重要な事象であるという仮説を支持し、これらのマウス
が、この病理のいくつかの態様を研究するためも有用な動物モデルをとして役立
つ可能性を高める。
βのインビボ過剰発現が神経変性をもたらすことを示す。GSK-3βを過剰発現す
る条件付きトランスジェニック・マウスはまた、B-カテニン不安定化および過剰
リン酸化タウのもつれ前のような細胞体樹状突起局在化などのADの各種生化学的
並びに細胞性の態様と類似している。したがって、我々の結果は、GSK-3βの脱
調節がADの病因における重要な事象であるという仮説を支持し、これらのマウス
が、この病理のいくつかの態様を研究するためも有用な動物モデルをとして役立
つ可能性を高める。
【００６３】
GSK-3βは、Wntシグナル化経路の成分として動物の発育期に活性であり、細胞
死の決定およびパターン形成において重要な役割を果たす(Bourouisら、1990年;
Ruelら、1993年; Siegfriedら、1992年; Siegfriedら、1994年)。したがって、
GSK-3βを阻害するリチウム能力は、催奇形性作用の原因となることが示唆され
た(Klein and Melton、1996年; Stambolicら、1996年)。発育早期におけるそれ
らの十分に確立された役割とは別に、Wntシグナル化およびGSK-3βは、生後の小
脳顆粒細胞のシナプス形成に関与することが示されている(Hallら、2000年; Luc
as and Salinas、1997年)。Brownleesおよび共同研究者は、ニューロン特異的プ
ロモーターを用いてもGSK-3βの検出可能な過剰発現を有するトランスジェニッ
ク・マウスを生産できなかった理由が、CNSの胎仔期、および生後発育期のGSK-3
β過剰発現の毒性によって説明できる。これに促されて、これらの著者は厳密に
制御された誘導発現系の利用を示唆している(Brownleesら、1997年)。我々の場
合、ダブルトランスジェニック・マウスの一部が周産期に死ぬこと、そしてこの
ことが胎仔期にトランスジーン発現を沈黙させることにより救うことができるこ
とも見出している。しかし、何匹かのマウスは薬理学的介入なしで生存できる。
何故このことが起こり得るかには少なくとも2つの理由がある。第1に、我々が使
用するプロモーター(CamKIIα)は、Brownleesおよび共同研究者により使用され
たもの(NF-L)よりも制限された発現パターンを有すること。第2に、我々の2成分
系においては、トランスジーンそれ自体は沈黙していること。これによりトラン
スジーンの毒性によるファウンダー動物の致死性が避けられる。引き続くtTAと
の繁殖により、トランスジーンの胎仔の過剰発現に許容性の非遺伝的背景を有す
るこれらのダブルトランスジェニックの子孫を選ぶことができる。
死の決定およびパターン形成において重要な役割を果たす(Bourouisら、1990年;
Ruelら、1993年; Siegfriedら、1992年; Siegfriedら、1994年)。したがって、
GSK-3βを阻害するリチウム能力は、催奇形性作用の原因となることが示唆され
た(Klein and Melton、1996年; Stambolicら、1996年)。発育早期におけるそれ
らの十分に確立された役割とは別に、Wntシグナル化およびGSK-3βは、生後の小
脳顆粒細胞のシナプス形成に関与することが示されている(Hallら、2000年; Luc
as and Salinas、1997年)。Brownleesおよび共同研究者は、ニューロン特異的プ
ロモーターを用いてもGSK-3βの検出可能な過剰発現を有するトランスジェニッ
ク・マウスを生産できなかった理由が、CNSの胎仔期、および生後発育期のGSK-3
β過剰発現の毒性によって説明できる。これに促されて、これらの著者は厳密に
制御された誘導発現系の利用を示唆している(Brownleesら、1997年)。我々の場
合、ダブルトランスジェニック・マウスの一部が周産期に死ぬこと、そしてこの
ことが胎仔期にトランスジーン発現を沈黙させることにより救うことができるこ
とも見出している。しかし、何匹かのマウスは薬理学的介入なしで生存できる。
何故このことが起こり得るかには少なくとも2つの理由がある。第1に、我々が使
用するプロモーター(CamKIIα)は、Brownleesおよび共同研究者により使用され
たもの(NF-L)よりも制限された発現パターンを有すること。第2に、我々の2成分
系においては、トランスジーンそれ自体は沈黙していること。これによりトラン
スジーンの毒性によるファウンダー動物の致死性が避けられる。引き続くtTAと
の繁殖により、トランスジーンの胎仔の過剰発現に許容性の非遺伝的背景を有す
るこれらのダブルトランスジェニックの子孫を選ぶことができる。
【００６４】
過剰リン酸化タウの細胞体樹状突起の蓄積は、AD神経原線維変性の展開におけ
る早期の事象である(Braakら、1994年)。タウのもつれ前のような免疫染色が、
タウの種々のイソ体を過剰発現するトランスジェニック・マウスに見られる(Bri
onら、1999年; Gotzら、1995年; Ishiharaら、1999年; Spittaelsら、1999年)。
これらのマウスにおけるタウの細胞体樹状突起の局在化は、微小管のタウ結合能
の飽和によると思われる。次に、過剰のタウは、細胞体に蓄積し易く、リン酸化
やコンフォメーションの変化などの後の修飾を受け易い。Tet/GSK-3βマウスに
おいて、過剰リン酸化およびタウの細胞体樹状突起の局在化はタウの全濃度に影
響を与えることなく生じ、したがって、ADおよび他のタウパシーに見られる状態
に、より密に類似している。Tet/GSK-3βマウスに見られる7.51免疫染色の増加
および、以前のインビトロ研究(Novakら、1991年)によれば、Tet/GSK-3Bマウス
におけるタウのリン酸化増加は、微小管に対するタウの親和性減少に続いて、細
胞体内におけるタンパク質の蓄積を最も導き易い。
る早期の事象である(Braakら、1994年)。タウのもつれ前のような免疫染色が、
タウの種々のイソ体を過剰発現するトランスジェニック・マウスに見られる(Bri
onら、1999年; Gotzら、1995年; Ishiharaら、1999年; Spittaelsら、1999年)。
これらのマウスにおけるタウの細胞体樹状突起の局在化は、微小管のタウ結合能
の飽和によると思われる。次に、過剰のタウは、細胞体に蓄積し易く、リン酸化
やコンフォメーションの変化などの後の修飾を受け易い。Tet/GSK-3βマウスに
おいて、過剰リン酸化およびタウの細胞体樹状突起の局在化はタウの全濃度に影
響を与えることなく生じ、したがって、ADおよび他のタウパシーに見られる状態
に、より密に類似している。Tet/GSK-3βマウスに見られる7.51免疫染色の増加
および、以前のインビトロ研究(Novakら、1991年)によれば、Tet/GSK-3Bマウス
におけるタウのリン酸化増加は、微小管に対するタウの親和性減少に続いて、細
胞体内におけるタンパク質の蓄積を最も導き易い。
【００６５】
我々は、Tet/GSK-3βマウスにおける細胞体樹状突起タウが小胞体にしばしば
関連することを見出している。同様の結果が、タウの最短イソ体を過剰発現する
トランスジェニック・マウス(Brionら、1999年)および高齢ヒツジ(Nelsonら、19
93年)に見出された。これら全ての場合、免疫検出は、PHF-タウに見られるリン
酸化またはコンフォメーションエピトープを認識する抗体により実施された。興
味深いことに、AD脳中のPHFは、小胞体および他の膜構造からしばしば生じるこ
とが見出されている(Grayら、1987年; Metuzalsら、1988年; Papasozomenos、19
89年)。したがって、動物モデルにおいて、タウと小胞体との会合は、神経原線
維病変部形成の早期段階を表す。タウと小胞体との会合に対するその他の矛盾の
ない説明としては、PS-1との相互作用があり得る。PS-1は、ヒト脳抽出物に実施
された共免疫沈降実験におけるタウとGSK-3βとの双方に結合することが判って
おり(Takashimaら、1998年)、PS-1は、主として小胞体とゴルジ体に局在してい
る(Selkoe、1998年)。
関連することを見出している。同様の結果が、タウの最短イソ体を過剰発現する
トランスジェニック・マウス(Brionら、1999年)および高齢ヒツジ(Nelsonら、19
93年)に見出された。これら全ての場合、免疫検出は、PHF-タウに見られるリン
酸化またはコンフォメーションエピトープを認識する抗体により実施された。興
味深いことに、AD脳中のPHFは、小胞体および他の膜構造からしばしば生じるこ
とが見出されている(Grayら、1987年; Metuzalsら、1988年; Papasozomenos、19
89年)。したがって、動物モデルにおいて、タウと小胞体との会合は、神経原線
維病変部形成の早期段階を表す。タウと小胞体との会合に対するその他の矛盾の
ない説明としては、PS-1との相互作用があり得る。PS-1は、ヒト脳抽出物に実施
された共免疫沈降実験におけるタウとGSK-3βとの双方に結合することが判って
おり(Takashimaら、1998年)、PS-1は、主として小胞体とゴルジ体に局在してい
る(Selkoe、1998年)。
【００６６】
いくつかの機構が、Tet/GSK-3βマウスに検出されたニューロンのストレスお
よび死の原因となり得る(反応性膠細胞およびTUNELの染色により明らかとなった
)。タウのリン酸化および区画化に及ぼすGSK-3β過剰発現の効果に鑑みて、可能
な機構は微小管細胞骨格の解体である。この場合、タウによる微小管の安定化が
減少する結果、AD脳に見られたもの(Terry、1998年)と同様に微小管含量の減少
がTet/GSK-3βマウスに予想されるであろう。さらに、GSK-3βは、PI-3キナーゼ
を伴う生存経路により否定的に調節され(Crossら、1995年; Crossら、1994年; H
urelら、1996年; Saitoら、1994年)、皮質ニューロンを栄養因子の離脱またはPI
-3キナーゼ阻害剤とで培養した誘発は、アポトーシスを引き起こすGSK-3βを刺
激することとなる(Hetmanら、2000年; Pap and Cooper、1998年)。最後に、β-
カテニン媒介転写の減少により、β-アミロイドにさらされた(Zhangら、1998年)
、または変異株PS-1(Weihlら、1999年)によりトランスフェクションされた一次
ニューロン培養においてニューロンのアポトーシスを増加させることが示された
。アポトーシスに対する感受性増加の原因となるβ-カテニンによりトランス活
性化された標的遺伝子については殆ど知られていない。Tet/GSK-3βマウスは、
示差ディスプレイ法またはDNA-ミクロアレイ法によるこのような遺伝子を確認す
る有用な系であり得る。
よび死の原因となり得る(反応性膠細胞およびTUNELの染色により明らかとなった
)。タウのリン酸化および区画化に及ぼすGSK-3β過剰発現の効果に鑑みて、可能
な機構は微小管細胞骨格の解体である。この場合、タウによる微小管の安定化が
減少する結果、AD脳に見られたもの(Terry、1998年)と同様に微小管含量の減少
がTet/GSK-3βマウスに予想されるであろう。さらに、GSK-3βは、PI-3キナーゼ
を伴う生存経路により否定的に調節され(Crossら、1995年; Crossら、1994年; H
urelら、1996年; Saitoら、1994年)、皮質ニューロンを栄養因子の離脱またはPI
-3キナーゼ阻害剤とで培養した誘発は、アポトーシスを引き起こすGSK-3βを刺
激することとなる(Hetmanら、2000年; Pap and Cooper、1998年)。最後に、β-
カテニン媒介転写の減少により、β-アミロイドにさらされた(Zhangら、1998年)
、または変異株PS-1(Weihlら、1999年)によりトランスフェクションされた一次
ニューロン培養においてニューロンのアポトーシスを増加させることが示された
。アポトーシスに対する感受性増加の原因となるβ-カテニンによりトランス活
性化された標的遺伝子については殆ど知られていない。Tet/GSK-3βマウスは、
示差ディスプレイ法またはDNA-ミクロアレイ法によるこのような遺伝子を確認す
る有用な系であり得る。
【００６７】
特にβ-アミロイド毒性カスケードおよびプラーク形成(Price and Sisodia、1
998年)に関連して、ADのトランスジェニック・マウスモデルの生産に向けてこの
2、3年間は大きな進歩があった。APPの変異体のより高い発現レベルを有するマ
ウスを生産することにより、またそれらを、APPをAβ42へと都合よくプロセッシ
ングする変異PS-1トランスジェニック・マウスと繁殖させることにより、引き続
いて改善がなされた(Gueriette and Tanzi、1999年)。しかしながら、GSK-3βの
調節解除がADの病因における重要な事象である場合、Tet/GSK-3βマウスは、AD
の代わりのマウスモデル、および/または補足的マウスモデルを構成し得る。
998年)に関連して、ADのトランスジェニック・マウスモデルの生産に向けてこの
2、3年間は大きな進歩があった。APPの変異体のより高い発現レベルを有するマ
ウスを生産することにより、またそれらを、APPをAβ42へと都合よくプロセッシ
ングする変異PS-1トランスジェニック・マウスと繁殖させることにより、引き続
いて改善がなされた(Gueriette and Tanzi、1999年)。しかしながら、GSK-3βの
調節解除がADの病因における重要な事象である場合、Tet/GSK-3βマウスは、AD
の代わりのマウスモデル、および/または補足的マウスモデルを構成し得る。
【００６８】
ADの形質導入モデルについて、今までなされた努力の大部分は、ADの神経病理
学的特徴の類似化に焦点が当てられた。これは、ヒトにおいて長年にわたり形成
されるものを、マウスの寿命内に再現させるために、過度に人工的な修飾が必要
とすると思われる。別途に、ヒトに特異的な手がかり(インビボβ-アミロイド誘
導毒性(Geulaら、1998年)の場合のように)を必要とすることから、マウスにおけ
るAD神経病理学の全態様を類似化することが実際には可能ではないかもしれない
。GSK-3βは、AD様タウの過剰リン酸化、β-アミロイド誘導毒性およびPS-1変異
を伴う経路の近似現象において見出された酵素である。ADの既に存在するマウス
モデルと比較すると、Tet/GSK-3βマウスは、究極的にADのいくつかの態様が原
因となり得る下流の神経内機能不全を再現する点でユニークである。この仮説の
予知により、GSK-3β濃度(または活性)および基質が、AD患者間で変化している
ことが見出されるはずである。これを有利とする証拠が既に報告されている(Pei
ら、1999年; Shiurbaら、1996年)。
学的特徴の類似化に焦点が当てられた。これは、ヒトにおいて長年にわたり形成
されるものを、マウスの寿命内に再現させるために、過度に人工的な修飾が必要
とすると思われる。別途に、ヒトに特異的な手がかり(インビボβ-アミロイド誘
導毒性(Geulaら、1998年)の場合のように)を必要とすることから、マウスにおけ
るAD神経病理学の全態様を類似化することが実際には可能ではないかもしれない
。GSK-3βは、AD様タウの過剰リン酸化、β-アミロイド誘導毒性およびPS-1変異
を伴う経路の近似現象において見出された酵素である。ADの既に存在するマウス
モデルと比較すると、Tet/GSK-3βマウスは、究極的にADのいくつかの態様が原
因となり得る下流の神経内機能不全を再現する点でユニークである。この仮説の
予知により、GSK-3β濃度(または活性)および基質が、AD患者間で変化している
ことが見出されるはずである。これを有利とする証拠が既に報告されている(Pei
ら、1999年; Shiurbaら、1996年)。
【００６９】
Tet/GSK-3βマウスにおける神経変性は、リチウム、すなわち比較的特異的なG
SK-3β阻害剤の神経保護効果とよく一致する。リチウムの神経保護効果は、GSK-
3βを阻害する能力(Alvarezら、1999年; Hetmanら、2000年)、およびBcl-2(Chen
ら、1999年)をアップレギュレートする能力およびニューロン(Manjiらにより改
訂、1999年)におけるBaxタンパク質(Chen and Chuang、1999年)をダウンレギュ
レートする能力に帰せられる。斯様に、Tet/GSK-3βマウスは、来るべきGSK-3β
特異的阻害剤の神経保護効果を試験するのに良好な手段である。さらに、これら
の有効性を、テトラサクリン類縁体を投与することによりトランスジーン発現を
沈黙させる効果と比較することができる。
SK-3β阻害剤の神経保護効果とよく一致する。リチウムの神経保護効果は、GSK-
3βを阻害する能力(Alvarezら、1999年; Hetmanら、2000年)、およびBcl-2(Chen
ら、1999年)をアップレギュレートする能力およびニューロン(Manjiらにより改
訂、1999年)におけるBaxタンパク質(Chen and Chuang、1999年)をダウンレギュ
レートする能力に帰せられる。斯様に、Tet/GSK-3βマウスは、来るべきGSK-3β
特異的阻害剤の神経保護効果を試験するのに良好な手段である。さらに、これら
の有効性を、テトラサクリン類縁体を投与することによりトランスジーン発現を
沈黙させる効果と比較することができる。
【００７０】
【参考文献】
【図１】 マウスの設計を示す図である。
【図２】 Tet/GSK-3βマウスにおけるトランスジーン発現のパターンを示
す図である。
す図である。
【図３】 Tet/GSK-3βマウスの皮質および海馬中のGSK-3βの過剰発現を示
す図である。
す図である。
【図４】 β-カテニン濃度およびタウのリン酸化に及ぼすGSK-3β過剰発現
の作用を示す図である。
の作用を示す図である。
【図５】 Tet/GSK-3βマウスにおけるタウの細胞体樹状突起局在化を示す
図である。
図である。
【図６】 PHF-1陽性ニューロンの電子顕微鏡調査を示す図である。Aは、Te
t/GSK-3βマウス海馬歯状回における2種のニューロンの電子顕微鏡写真を示す図
である。
t/GSK-3βマウス海馬歯状回における2種のニューロンの電子顕微鏡写真を示す図
である。
【図７】 Tet/GSK-3βマウスのニューロンの細胞死および反応性神経膠症
を示す図である。
を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ
，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，
ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ
Ｎ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ
，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，
ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ
Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ
，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，
ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 フェリックス・ヘルナンデス・ペレス
スペイン・エ−28006・マドリード・カー
ジェ・セラノ・13・コンセホ・スペリオー
ル・デ・インベスティガシオネス・シエン
ティフィカス
(72)発明者 ヘスス・アヴィラ・デ・グラード
スペイン・エ−28006・マドリード・カー
ジェ・セラノ・13・コンセホ・スペリオー
ル・デ・インベスティガシオネス・シエン
ティフィカス
(72)発明者 ホセ・ハヴィエル・ルーカス・ロザーノ
スペイン・エ−28006・マドリード・カー
ジェ・セラノ・13・コンセホ・スペリオー
ル・デ・インベスティガシオネス・シエン
ティフィカス
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA10 CA04 DA02 EA04
FA02 GA11 HA01
Claims (9)
- 【請求項１】 GSK-3βタンパク質を過剰発現するトランスジェニック動物
。 - 【請求項２】 GSK-3βタンパク質の発現が条件付きである請求項1に記載の
トランスジェニック動物。 - 【請求項３】 GSK-3βが過剰発現する唯一の酵素である請求項1または2に
記載のトランスジェニック動物。 - 【請求項４】 GSK-3βが過剰発現する唯一のタンパク質である請求項1また
は2に記載のトランスジェニック動物。 - 【請求項５】 哺乳動物である請求項１乃至４のいずれかに記載のトランス
ジェニック動物。 - 【請求項６】 哺乳動物がマウス、ラットまたは霊長類である請求項5に記
載のトランスジェニック動物。 - 【請求項７】 アルツハイマー病のモデルとしての請求項１乃至６のいずれ
かに記載のトランスジェニック動物の使用。 - 【請求項８】 神経変性疾患を治療するための薬物または療法の試験におけ
る請求項1から6のいずれかに記載のトランスジェニック動物の使用。 - 【請求項９】 本発明のトランスジェニック動物に療法を実施すること、お
よび病理または挙動に対する影響をモニタリングすることを含むアルツハイマー
病の治療に有用な療法の同定方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB0012056.8 | 2000-05-18 | ||
| GBGB0012056.8A GB0012056D0 (en) | 2000-05-18 | 2000-05-18 | Model for neurodegenerative disease |
| PCT/GB2001/002218 WO2001088109A2 (en) | 2000-05-18 | 2001-05-18 | Model for neurodegenerative disease |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012001386A Division JP2012085653A (ja) | 2000-05-18 | 2012-01-06 | 神経変性疾患用モデル |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003533227A true JP2003533227A (ja) | 2003-11-11 |
Family
ID=9891881
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001585317A Pending JP2003533227A (ja) | 2000-05-18 | 2001-05-18 | 神経変性疾患用モデル |
| JP2012001386A Pending JP2012085653A (ja) | 2000-05-18 | 2012-01-06 | 神経変性疾患用モデル |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012001386A Pending JP2012085653A (ja) | 2000-05-18 | 2012-01-06 | 神経変性疾患用モデル |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7265259B2 (ja) |
| EP (1) | EP1280404B1 (ja) |
| JP (2) | JP2003533227A (ja) |
| KR (1) | KR100764889B1 (ja) |
| CN (1) | CN100352927C (ja) |
| AT (1) | ATE332078T1 (ja) |
| AU (2) | AU2001262482B2 (ja) |
| CA (1) | CA2409075A1 (ja) |
| CY (1) | CY1105641T1 (ja) |
| DE (1) | DE60121324T2 (ja) |
| DK (1) | DK1280404T3 (ja) |
| ES (1) | ES2267773T3 (ja) |
| GB (1) | GB0012056D0 (ja) |
| IL (2) | IL152844A0 (ja) |
| MX (1) | MXPA02011391A (ja) |
| PT (1) | PT1280404E (ja) |
| WO (1) | WO2001088109A2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE366238T1 (de) | 2000-05-11 | 2007-07-15 | Consejo Superior Investigacion | Heterocyclischen inhibitoren von glycogen synthase kinase gsk-3 |
| KR101040757B1 (ko) * | 2008-04-11 | 2011-06-10 | 임재주 | 안전모 |
| WO2016086197A1 (en) | 2014-11-25 | 2016-06-02 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Method of identifying and treating a person having a predisposition to or afflicted with a cardiometabolic disease |
| EP3224380A1 (en) | 2014-11-25 | 2017-10-04 | The Broad Institute Inc. | Clonal haematopoiesis |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995005466A1 (en) * | 1993-08-12 | 1995-02-23 | Institute Of Psychiatry | Models of alzheimer's disease |
| JP2003504015A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-02-04 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ | 神経変性疾患のモデルとしてのトランスジェニック動物 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2923279C2 (de) * | 1979-06-08 | 1987-07-09 | Kali-Chemie Pharma Gmbh, 3000 Hannover | Verfahren zur Herstellung von Pankreatin-Pellets und diese enthaltende Arzneimittel |
| ATE394481T1 (de) * | 1996-07-24 | 2008-05-15 | Novartis Pharma Gmbh | Transgentier-modell für die krankheit von alzheimer |
-
2000
- 2000-05-18 GB GBGB0012056.8A patent/GB0012056D0/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-05-18 WO PCT/GB2001/002218 patent/WO2001088109A2/en active IP Right Grant
- 2001-05-18 CN CNB01813047XA patent/CN100352927C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-18 MX MXPA02011391A patent/MXPA02011391A/es active IP Right Grant
- 2001-05-18 AU AU2001262482A patent/AU2001262482B2/en not_active Ceased
- 2001-05-18 ES ES01936609T patent/ES2267773T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-18 DE DE60121324T patent/DE60121324T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-18 IL IL15284401A patent/IL152844A0/xx active IP Right Grant
- 2001-05-18 EP EP01936609A patent/EP1280404B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-05-18 AT AT01936609T patent/ATE332078T1/de active
- 2001-05-18 CA CA002409075A patent/CA2409075A1/en not_active Abandoned
- 2001-05-18 JP JP2001585317A patent/JP2003533227A/ja active Pending
- 2001-05-18 PT PT01936609T patent/PT1280404E/pt unknown
- 2001-05-18 US US10/276,460 patent/US7265259B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-18 DK DK01936609T patent/DK1280404T3/da active
- 2001-05-18 AU AU6248201A patent/AU6248201A/xx active Pending
- 2001-05-18 KR KR1020027015569A patent/KR100764889B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-11-14 IL IL152844A patent/IL152844A/en not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-10-04 CY CY20061101422T patent/CY1105641T1/el unknown
-
2012
- 2012-01-06 JP JP2012001386A patent/JP2012085653A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995005466A1 (en) * | 1993-08-12 | 1995-02-23 | Institute Of Psychiatry | Models of alzheimer's disease |
| JP2003504015A (ja) * | 1999-07-02 | 2003-02-04 | ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ | 神経変性疾患のモデルとしてのトランスジェニック動物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7265259B2 (en) | 2007-09-04 |
| DE60121324D1 (de) | 2006-08-17 |
| CN1443038A (zh) | 2003-09-17 |
| ATE332078T1 (de) | 2006-07-15 |
| ES2267773T3 (es) | 2007-03-16 |
| WO2001088109A2 (en) | 2001-11-22 |
| AU2001262482B2 (en) | 2006-06-08 |
| KR20030027892A (ko) | 2003-04-07 |
| KR100764889B1 (ko) | 2007-10-09 |
| MXPA02011391A (es) | 2004-08-12 |
| JP2012085653A (ja) | 2012-05-10 |
| EP1280404A2 (en) | 2003-02-05 |
| IL152844A (en) | 2008-11-26 |
| DK1280404T3 (da) | 2006-10-30 |
| CN100352927C (zh) | 2007-12-05 |
| AU6248201A (en) | 2001-11-26 |
| WO2001088109A8 (en) | 2002-09-26 |
| US20030177510A1 (en) | 2003-09-18 |
| GB0012056D0 (en) | 2000-07-12 |
| IL152844A0 (en) | 2003-06-24 |
| DE60121324T2 (de) | 2007-07-05 |
| EP1280404B1 (en) | 2006-07-05 |
| CY1105641T1 (el) | 2010-12-22 |
| CA2409075A1 (en) | 2001-11-22 |
| PT1280404E (pt) | 2006-11-30 |
| WO2001088109A3 (en) | 2002-07-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Von Koch et al. | Generation of APLP2 KO mice and early postnatal lethality in APLP2/APP double KO mice | |
| Tsika et al. | Conditional expression of Parkinson's disease-related R1441C LRRK2 in midbrain dopaminergic neurons of mice causes nuclear abnormalities without neurodegeneration | |
| Barbagallo et al. | Tyr682 in the intracellular domain of APP regulates amyloidogenic APP processing in vivo | |
| JP2001517065A (ja) | トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法 | |
| Chen et al. | Loss of presenilin function causes Alzheimer's disease‐like neurodegeneration in the mouse | |
| Newman et al. | Animal models of Alzheimer’s disease | |
| JP2012085653A (ja) | 神経変性疾患用モデル | |
| JPH11507821A (ja) | トランスジェニック動物モデルを用いてアルツハイマー病治療薬を同定する方法 | |
| NZ515956A (en) | Transgenic animals as models for neurodegenerative disease | |
| US20130133090A1 (en) | Transgenic mammalls modified in bri protein expression | |
| ES2262662T3 (es) | Modelo de animal transgenico que presenta desordenes neurodegenerativos. | |
| US7166764B2 (en) | Noc2 knockout mouse | |
| AU2001262482A1 (en) | Model for neurodegenerative disease | |
| US20080120731A1 (en) | Transgenic Animal Models for Neurodevelopmental Disorders | |
| KR100699453B1 (ko) | 신경퇴행성 질환용 모델로서의 형질전환 동물 | |
| US8993833B2 (en) | Model of Alzheimer's Disease | |
| Hernández Pérez et al. | Model for neurodegenerative diseases | |
| Chen et al. | Models of Alzheimer’s disease | |
| Van Dorpe et al. | Neuropathobiology in Transgenic Mice | |
| ES2295283T3 (es) | Modelos animales transgenicos para la enfermedad de alzheimer. | |
| Martinez Hernandez | New genetic mouse models for neurodegenerative diseases: Contribution of noradrenaline to Alzheimer’s disease pathogenesis and creation of a new genetic model for Parkinson’s disease. | |
| Von Koch | Molecular analysis of a homologue of the mouse beta-amyloid precursor protein, APLP2: Isolation of APLP2cDNA, characterization of the APLP2 gene promoter and gene targeting of APLP2 | |
| US20040064844A1 (en) | Cysteine string protein and its role in neurodegenerative diseases | |
| WO2001095709A1 (fr) | Souris revelant des changements neurofibrilles causes par la demence senile | |
| Giesert | Pathogenic Mutation of Lrrk2: A Mouse Model for pre-motor Parkinson’s disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080508 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101214 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110308 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110315 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110412 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110419 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110511 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110518 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110610 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20110610 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110906 |