KR20030027892A - 신경퇴행성 질병의 모델 - Google Patents
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Abstract
GSK-3β 단백질이 과발현되는 트렌스제닉 동물은 신경퇴행성 질병의 모델로서 유용하다.
Description
알쯔하이머 병(AD)은 선진국들에서 가장 흔한 신경퇴행성 질병이며, 점진적인 기억 상실과 언어 장애 및 종국에는 사망하는 양상을 특징으로 한다(Alzheimer, 1911; Yankner, 1996). AD에서의 인식 감퇴는 신경세포의 퇴행, 및 주로 대뇌피질, 해마 및 편도선의 상실에 의해 수반된다(Gomez-Isla et al., 1997). 특정 패턴의 신경세포 사멸 이외에, AD는 2 개의 신경병리학적 확인표시인 노인성 반과 신경섬유 얽힘(NFT)을 특징으로 한다.
노인성 반은 종종 이영양성 신경돌기로 둘러싸인 39 내지 43 아미노산 β-아밀로이드 펩티드(AB)로 구성된 아밀로이드 피브릴의 세포 외 침착물이다(Glenner and Wong, 1984; Masters et al., 1985; Selkoe, 1994).
NFT는 미소관-회합된 단백질 tau의 과인산화된 형태로부터 조립된 짝을 이룬 나선형 필라멘트(PHF)의 신경세포내 생성 응집물이다(Greenberg et al., 1992;Grundke-Iqbal et al., 1986; Lee et al., 1991; Morishima-Kawashima et al., 1995). NFT는 AD에서 퇴행중인 모든 뇌 영역들에서 발견될 수 있으며 이의 시공적인 외형 패턴은 세포 사멸 및 징후학의 패턴과 매우 상관성이 있다(Arriagada et al., 1992; Braak and Braak, 1991; Gomez-Isla et al., 1997).
AD 발병에 대한 분자적 식견은 유전형 AD(FAD)에 걸린 가계의 유전적 연구로부터 비롯되었다. 상기는 AD 사례 중 단지 작은 퍼센트에 해당되지만, 상기 질병을 촉발시키는 원인이 되는 3 개의 상이한 유전자의 돌연변이를 확인시켰다. 이들 유전자는 프레세닐린-1 및 -2(PS-1 및 PS-2)와 아밀로이드 전구 단백질(APP)이다(Hardy, 1996). APP의 돌연변이로 인해 Aβ의 생산이 증가되는 반면(Price and Sisodia, 1998) PS-1 및 PS-2 돌연변이는 APP를 길고 가장 아밀로이드생산적인 형태의 Aβ(Aβ42)로 가공하는데 유리하다(Citron et al., 1997; Duff et al., 1996; Price and Sisodia, 1998; Scheuner et al., 1996). 이러한 유전학적 증거는 Aβ의 생체 외 및 생체 내 연구와 함께 AD를 촉발시키는 주요 사건으로서 Aβ 형성 및/또는 응집에 대한 신경독성 점을 유도하였다.
글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β)의 활성화가 제시되었지만, 신경세포 장애의 원인이 되는 하부 세포내 효과기에 대해서는 거의 알려져 있지 않다.
GSK-3β는 처음에 글리코겐 대사 조절에서의 역할로 인해 동정된, CNS에서 가장 풍부한 프롤린 지배 세린/쓰레오닌 키나제이다(Woodgett, 1990). 인슐린 및 IGF-1 매개된 신호 전달에 관련되는 것과 별도로, GSK-3β는 또한 β-카테닌 안정성을 조절하는 주요 효소로서 wnt/무 날개 신호화 경로와 관련있으며, 결과적으로 그의 핵으로의 이동 및 그의 전사적 활성과 관련된다(Anderton, 1999; Earth et al., 1997).
GSK-3β는 PHF의 특징인 과인산화된 tau를 생성시키는 최선의 후보 효소들 중 하나이다(Lovestone and Reynolds, 1997). GSK-3β를 미소관으로부터 정제할 수 있으며(Ishiguro et al., 1988), 상기는 형질감염된 세포(Lovestone et al., 1994)와 생체 내(Hong et al., 1997; Munoz-Montano et al., 1997) 모두에서 PHF 중의 과인산화된 대부분의 부위들에서 tau를 인산화시키는 것으로 나타났다. 더욱 또한, GSK-3β는 미리얽힌 신경세포의 세포질에 축적되며, AD 신경섬유 변화가 실시된 뇌에서의 그의 분포는 이들 변화의 발달 순서와 일치한다(Pei et al., 1999; Shiurba et al., 1996).
Aβ에의 피질 및 해마의 1 차 신경세포 배양액의 노출은 GSK-3β의 활성화(Takashima et al., 1996), tau 과인산화(Busciglio et al., 1995; Ferreira et al., 1997; Takashima et al., 1998), 및 세포 사멸(Busciglio et al., 1995; Estus et al., 1997; Forloni et al., 1993; Loo et al., 1993; Pike et al., 1991; Takashima et al., 1993)을 유도함을 입증하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리튬에 의한 GSK-3β 발현 또는 활성의 봉쇄는 피질 및 해마의 1 차 배양액의 Aβ 유도된 신경퇴행을 방지한다(Alvarez et al., 1999; Takashima et al., 1993).
PS-1은 인간 뇌 샘플로부터의 공동 면역침강 실험에서 GSK-3β와 tau에 직접결합하는 것으로 나타났다(Takashima et al., 1998). 따라서, PS-1이 GSK-3β와 tau를 아주 가까워지게 하는 능력은 PS-1이 GSK-3β에 의해 tau의 인산화를 조절할 수 있음을 시사한다. 형질감염 실험에서 PS-1의 돌연변이형은 PS-1/GSK-3β 회합을 증가시키고 tau의 인산화를 증가시킨다(Takashima et al., 1998). 더욱 또한, PS-1은 또한 형질감염된 세포(Murayama et al., 1998; Yu et al., 1998) 및 생체 내(Yu et al., 1998; Zhang et al., 1998)에서 GSK-3β 기질인 β-카테닌과의 복합체를 형성하며 이러한 상호작용은 β-카테닌의 안정성을 증가시는 것으로 나타났다(Zhang et al., 1998). 병적인 PS-1 돌연변이는 β-카테닌을 안정화시키는 PS-1의 능력을 감소시키고, 이는 차례로 PS-1 돌연변이를 갖는 AD 환자의 β-카테닌 수준을 감소시킨다(Zhang et al., 1998).
AD와 같은 신경퇴행성 질병을 이해하고 새로운 요법을 시험하는데 대단히 중요한, 상기 질병의 병리를 근접하게 모방하는 동물 모델이 필요하다.
본 발명은 동물 모델의 이러한 문제의 접근에서 출발한다.
발명의 요약
본 발명은 GSK-3β 단백질이 과 발현된, 알쯔하이머 병에 대한 트랜스제닉 동물 모델을 제공한다.
특히, 본 발명은 GSK-3β 단백질의 발현을 조건으로 하는, 트랜스제닉 동물 모델을 제공한다.
바람직하게는 GSK-3β는 과 발현되는 유일한 효소이며, 실제로 GSK-3β가 과발현되는 유일한 단백질인 것이 보다 바람직하다. GSK-3β 단백질 단독의 과 발현은 놀랍게도 AD를 근접하게 모방하는 트랜스제닉 동물에서 병을 발생시킨다. 구체적으로 GSK-3β 과 발현은 핵 β-케테닌의 수준을 감소시키고, tau 단백질의 인산화를 증가시키며, 신경세포 사멸, 반응성 아스트로사이토시스(astrocytosis) 및 마이크로글리오시스(microgliosis)를 발생시킨다. 상기 트랜스제닉 모델의 유사한 병리학 및 천연 질병 상태는 본 발명의 모델을 질병 분석에 대단히 귀중하게 만든다.
바람직하게는, 트랜스제닉 연구에 사용되는 모델은 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트 또는 영장류 동물이다. 트랜스제닉 연구에 사용하기 적합한 다른 동물들은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명은 또한 트랜스제닉 동물의 제조에 사용되는 방법으로 확장된다.
본 발명의 동물 모델은 AD와 같은 신경퇴행성 질병의 치료를 위한 신규 약물 또는 요법의 시험에 유용하다. 따라서, 본 발명은 AD의 치료에 유용한 요법의 확인 방법으로 확장되며, 상기 방법은 상기 요법을 본 발명의 트랜스제닉 동물에 투여하고 병의 경과 또는 양상에 대한 효과를 감시함을 포함한다.
본 발명은 신경퇴행성 질병, 특히 알쯔하이머 병의 동물 모델에 관한 것이다.
바람직하게는 본 출원인들은 마우스에서 tet-조절된 시스템을 사용한다. 상기 tet-조절된 시스템은 진핵세포계 및 마우스에서 조건부 유전자 발현에 사용되었다(Gingrich and Roder, 1998). 본 출원인들 중 일부는 최근에 돌연변이된 형태의 헌팅틴의 트랜스제닉 발현을 구동시키기 위해 상기 시스템을 사용함으로써, 신경퇴행성 질병의 첫 번째 조건부 동물 모델을 제조하였다(Yamamoto et al., 2000). tet-조절된 시스템은 상기 트랜스유전자의 독성으로 인한 주산기의 치명성을 우회하고, 오직 성인기에서만 상기 트랜스유전자의 발현을 촉발시키며, 일단 적당한 표현형 변화가 일어났으면 트랜스유전자 발현을 정지시키는데 사용될 수 있으므로 병리 상태를 모방하는 경우 특히 유용할 수 있다(Kelz et al., 1999; Yamamoto et al., 2000).
상기 시스템의 조절은 테트라사이클린-조절된 트랜스 활성인자(tTA)(tet-억제인자 DNA-결합 영역 및 VP16 트랜스 활성화 영역으로 구성된 키메릭 단백질)를 통해서 달성된다. 상기 단백질은 tetO 작동인자 서열에 특이적으로 결합하여 인접한 CMV 최소 프로모터로부터의 전사를 유도한다. 따라서 tTA와 tetO 요소 모두의 조합에 의해 소정의 트랜스유전자의 연속적인 트랜스 활성화가 허용된다. 테트라사이클린 및 그의 동족체는 tTA에 결합할 수 있다. 상기 반응이 일어나면, tTA는 tetO에의 결합이 방지되고 전사가 억제된다.
이러한 방식으로, 본 출원인들은 태아기 트랜스유전자 발현으로 인한 주산기의 치명성을 피하면서 성인기 동안 뇌에서 GSK-3β를 과 발현하는 조건부 트랜스제닉 마우스를 제조하였다. 이들 마우스는 해마상 신경세포에서 β-카테닌의 탈안정화와 과인산화를 나타내며, 상기 과인산화로 인해 tau의 미리 얽힘과 같은 세포체 가지 편재화가 일어난다. tau의 세포체 가지 편재화를 나타내는 신경세포는 종종 비정상적인 형태 및 주변 신경망으로부터 탈착을 보인다. 반응성 아스트로사이토시스 및 마이크로글리오시스는 신경세포 스트레스와 사멸의 지표였다. 이러한 발견은 치상회 과립세포의 TUNEL 염색에 의해 추가로 확인되었다. 대뇌 피질 및 해마에서의 GSK-3β의 과 발현에 의해 핵 β-카테닌의 수준이 감소하고 AD 관련 에피토프에서 tau의 인산화가 증가되며, 신경 세포 사멸과 반응성 아스트로사이토시스 및 마이크로글리오시스가 일어난다. 따라서, 본 발명의 결과는 GSK-3β의 생체 내 과 발현이 신경퇴행을 발생시킴을 입증하며, 상기 마우스를 알쯔하이머 병의 발병에 대한 GSK-3β 조절 해제의 관련성을 연구하기 위한 동물 모델로서 사용할 수 있음을 제시한다.
본 발명을 하기의 실시예에 의해 추가로 예시한다.
주입 단편에 대한 일반적인 설명
8.0 kb Ase I 단편(BitetO)을 미세주입에 사용하였다. BitetO를 제조하기 위해서, N-말단 MYC 에피토프를 갖는 제노퍼스(Xenopus) GSK-3B cDNA에 상응하는 1.5 kb Hind III 단편을 pcDNA3-GSK3 플라스미드로부터 절제하였다(Sanchez et al., 2000). 상기 단편을 Hind III로 절단한 pCRII 클로닝 벡터(Invitrogen) 내로 서브클로닝하였다. 정확한 배향을 Xho I 절단에 의해 시험하였다. 이어서 1.5 kb 단편을 Nsi I-Not I 절단에 의해 절제하고 lacZ 정보제공 서열을 갖는 거대세포바이러스(CMV) 최소 프로모터가 측면에 인접한 양방향성 tetO 서열을 함유하는 플라스미드(pBI-3, Baron et al., 1995)의 Pst I-Not I 부위 내로 서브클로닝하였다. 마지막으로, 상기 8.0 kb Ase I BitetO 단편을 단일 세포 CBAxC57BL/6 태아 내로 미세주입하였다. 원(founder) 마우스를 PCR에 의해 동정하고 서던 분석에 의해 확인하였다. 이어서 원 마우스를 야생형 CBAxC57BL/6 마우스와 교배시키고 서던 분석을 F1 자손 상에서 수행하여 상기 미세주입 단편의 다중 삽입 사건을 시험하였다. 본 발명에 보고된 모든 마우스들은 단일 융합 사건으로부터 생성되었다(데이터 도시 안됨).
COS 세포 형질감염
COS-7세포를 10%(v/v) 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민, 100 단위/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신이 보충된 둘베코의 변형된 필수 배지에서 유지시키고 37 ℃에서 가습된 배양기에서 95% 공기/5% CO2 중에서 배양하였다. 35 ㎜ 직경의 접시에서 50 내지 70% 융합률의 세포를 제조사의 권장에 따라 LipofectAMINE(Gibco BRL)/5 ㎍의 DNA로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 수확하고 형질감염 후 48 시간째에 분석하였다.
동물
마우스를 더 센트로 드 바이올로지아 몰레큘라 "세베로 오코아"(the Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa" 동물 시설에서 사육하였다. 마우스를 우리 당 4 마리씩 먹이와 물을 자유롭게 공급하면서 수용하고 07:00시에 빛을 쪼이기 시작하여 12/12 시간의 명암 주기로 온도-조절된 환경 하에서 유지시켰다.
항체
하기의 항-tau 항체들을 사용하였다: 7.51(Novak et al., 1991)(Dr. C. Wischik 제공, MRC, Cambridge, UK), PHF-1(Greenberg et al., 1992; Otvos et al., 1994)(Dr. P. Davies 제공, Albert Einstein Coll., Bronx, NY, USA), 12E8(Seubert et., 1995)(Dr. P. Seubert 제공, Athena, San Francisco, CA, USA), AD2(Buee-Scherrer et al., 1996)(Dr. C. Mourton-Gilles 제공, Montpellier, France). 441 개 아미노산의 최장의 인간 tau 동형에 대한 잔기 넘버링(Goedert et al., 1989)에 따라, 항체 12E8은 세린 262가 인산화된 경우 tau와 반응한다(Seubert et al., 1995). 항체 PHF-1 및 AD2는 세린 396 및 404가 인산화된 경우 tau를 인식한다(Buee-Scherrer et al., 1996; Otvos et al., 1994). 다른 단클론 항체들은 하기와 같다: 항-GSK3-β(Transduction Laboratories), 항-β-카테닌(Transduction Laboratories), 항-β-투불린(Sigma), 항-β-갈락토시다제(Promega), 항-myc(Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, USA), 항-GFAP(PharMingen, CA, USA), OX42(Dra. P. Bovolenta 제공, Instituto Gajal, Spain), ED1(Serotec; UK). 핵 단백질 U"snRNP에 대해 생성된 항체를 제이 오틴 박사(Dr. J. Ortin, CNB, Madrid, Spain)로부터 친절하게 기증 받았다.
면역조직화학
마우스를 펜토탈로 깊이 마취시키고 10 분간 0.1 M 인산염 완충액 중의 4% 파라포름알데히드로 심장을 관통하여 관류시켰다. 뇌를 실온에서 2 시간 동안 4% 파라포름알데히드 중에 후 고정시키고 4 ℃에서 48 시간 동안 PBS 중의 30% 슈크로즈에 넣었다. 시상봉합 부분(30 ㎛)을 냉동 마이크로톰으로 절개하고 PBS에 수거하였다. 자유롭게 부유하는 부분들을 PBS 중의 0.3% H2O2로 예비 처리하고 4 ℃에서 0.2% 트리톤 X-100, 10% 규정 염소 혈청(GmCO) 및 1% BSA(Boehringer-Mannheim)를 함유하는 PBS 중의 1 차 항체들, 즉 PHF-1(1/150), AD-2(1/2000), 항-myc(1/20), 항-GSK-3β(1/500), 항-β-갈락토시다제(1/5000), 항-GFAP(1/250), OX42(1/1000)와 함께 밤새 배양시켰다. 3 회의 PBS 세척에 이어서, 상기 부분들에 대해 엘리트 벡타스테인(Elite Vectastain) 키트(Vector Laboratories)를 사용하여 표준 아비딘-비오틴 면역조직화학적 프로토콜을 수행하였다. 색원체 반응을 디아미노벤지딘(Sigma) 및 0.003% H2O2를 사용하여 10 분간 수행하였다. 상기 부분들을 크로말룸 코팅된 슬라이드 상에 올려놓고 아쿠아-폴리마운트(Aqua-Polymount, Polysciences)로 덮었다. 상기 1 차 항체가 없는 것은 표지되지 않았다.
LacZ 염색
LacZ 염색을 하기와 같이 수행하였다. 새로운 동결 부분들을 소렌 완충액 중의 4% 파라포름알데히드 중에서 10 분간 후 고정시켰다. 이어서 슬라이드들을lacZ 염색 용액(PBS 중의 1 ㎎/㎖의 X-gal(4-클로로-5-브로모-3-인돌릴-β-갈락토시다제, Boehringer Mannheim), 5 mM 칼륨 페로시아나이드, 5 mM 칼륨 페리시아나이드 및 2 mM MgCl2) 중에서 30 ℃에서 1 시간 동안 배양시켰다. 염색 후에, 상기 부분들을 세정하고 건조시켰다.
TUNEL 분석
세포소멸의 DNA 단편화 특징을 파라포름알데히드 후-고정시킨 뇌에서 TUNEL 방법에 의해 검사하였다. 비브라톰 부분들에 대한 TUNEL 염색을 제조자의 지시(In situ Cell Death Detection, POD; Boehringer Mannheim)에 따라 수행하였다. Dnase I에 의한 처리를 양성 대조군으로서 사용하였다.
세포이하 단편화
세포막과 시토졸 추출물을 제조하기 위해서, 조직을 빙냉 포스페이트-완충된 염수로 세척하고 저장성 완충액(0.25 M 슈크로즈, 20 mM HEPES pH 7.4, 2 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10 ㎍/㎖의 아프로티닌, 10 ㎍/㎖의 류펩틴 및 10 ㎍/㎖의 펩스타틴)에서 균질화시켰다. 상기 균질물(전체 세포 분획)을 850 x g, 4 ℃에서 15 분간 원심분리에 의해 등명화시키고; 이어서 생성된 상등액을 100,000 x g, 4 ℃에서 1 시간 동안 원심분리시켜 펠릿으로서 세포막 분획과 상등액으로서 세포질 분획을 단리시켰다.
뇌의 핵을 2 M 슈크로즈 완충물을 통해 침강시켰다. 3 마리 동물로부터의 뇌 영역을 테플론 막자가 느슨하게 장치된 포터 균질화기를 사용하여 0.32 M 슈크로즈, 10 mM 트리스-HCl(pH 7.4), 3 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1% 트리톤 X-100, 10 ㎍/㎖의 아프로티닌, 10 ㎍/㎖의 류펩틴 및 10 ㎍/㎖의 펩스타틴 중에서 균질화시켰다. 상기 균질물을 치즈 클로쓰를 통해 여과시키고 1000 x g에서 10 분간 원심분리시켰다. 펠릿을 트리톤 없이 1.9 M 슈크로즈가 보충된 균질화 배지 3 ㎖ 중에 재 현탁시켰다. 상기 제제를 2 M 슈크로즈(10 ㎖)의 완충물 상에 층상화시키고 HB4 로터(Sorvall)에서 12,000 x g로 원심분리시켰다. 펠릿을 0.32 M 슈크로즈 0.5 ㎖에 재 현탁시켰다. 뇌 핵의 순도를 크리스탈 바이올렛 염색 후에 광 현미경으로 평가하였다. 또한, 공지된 핵 단백질인 U2snRNP를 웨스턴 블럿 분석에서 핵 마커로서 사용하였다.
웨스턴 블럿 분석
뇌를 빙냉 플레이트 상에서 신속히 해부하였다. 웨스턴 블럿 분석용 추출물을, 상기 뇌 영역을 20 mM HEPES(pH 7.4), 100 mM NaCl, 20 mM NaP, 1% 트리톤 X-100, 1 mM 나트륨 오르토바나데이트, 5 mM EDTA, 및 프로테아제 억제제(2 mM PMSF, 10 ㎍/㎖의 아프로티닌, 10 ㎍/㎖의 류펩틴 및 10 ㎍/㎖의 펩스타틴)로 이루어진 빙냉 추출 완충액 중에서 균질화시킴으로써 제조하였다. 상기 샘플들을 균질화시키고 4 ℃에서 20 분간 15,000 g로 원심분리시켰다. 생성된 상등액을 모으고, 단백질 함량을 브래드포드에 의해 측정하였다. 총 30 ㎍의 단백질을 10% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시키고 니트로셀룰로즈 멤브레인(Schleicher and Schuell)으로 옮겼다. 실험을 하기의 1 차 단클론 항체들을 사용하여 수행하였다: 항-GSK3β(1/2000), PHF-1(1/200), AD2(1/2000), 12E8(1/200), 7.51(1/100), 항-MYC(1/100), 항-β-투불린(1/5000), 항-β-갈락토시다제(1/5000). 필터를 5% 탈지유 중에서 4 ℃에서 밤새 항체와 함께 배양시켰다. 2 차 염소 항-마우스 항체(1/5000; Gmco) 및 ECL 검출 시약(Amersham)을 면역검출에 사용하였다. 면역반응성에 대한 정량분석을 농도측정 스캐닝에 의해 수행하였다. 통계학적 분석을 스튜던츠 t 시험을 사용하여 수행하였다.
전자 현미경 검사용 조직 가공
전자 현미경 검사를 위해서, 비브라톰 부분을 사용하였다. 일단 면역염색되었으면, 상기 부분들을 2% OsO4로 1 시간 동안 후 고정시키고, 탈수시키고, 애럴다이트에 묻고 플라스틱 커버 슬립을 사용하여 포름바 코팅된 슬라이드에 편평하게 올려 놓았다. 중합시킨 후에, 선택된 영역들을 촬영하고, 정돈하고, 애럴다이트에 다시 묻고, 1 ㎛로 다시 분할하였다. 이들 반정도 얇은 부분들을 재 촬영하고 초박형 부분들로 다시 분할하였다. 상기 초박형 부분들을 인공 침전물을 피하기 위해서 중금속 염색이 없는 조엘 전자 현미경으로 관찰하였다.
도면 설명
도 1은 마우스 디자인이다. A는 BitetO 구조물을 개략적으로 나타낸다. 상기는 상이한 배향의 2 개의 CMV 프로모터 서열이 측면에 인접해 있는 7 개의 회문 상 tet 오퍼레이터 서열 사본으로 이루어진다. 상기 2 방향 프로모터에 이어서 한쪽 방향으로 GSK-3β cDNA 서열(그의 5' 단부에서 MYC 에피토프를 암호화한다) 및 다른쪽 방향으로 핵 편재화 신호(NLS)를 포함한 β-갈락토시다제(LacZ) 서열이 있다. B에서, COS 세포가 상기 BitetO 구조물을 함유하는 플라스미드 및 인간 tau(레인 1 내지 6)를 암호화하는 발현 벡터로 동시 형질감염되었고, tTA의 발현을 허용하는 세 번째 플라스미드가 배양 배지 중의 1 ㎍/㎖의 테트라사이클린의 부재(레인 3 및 4) 또는 존재(레인 5 및 6) 하에서 첨가되었다(레인 3 내지 6). 단백질 추출물을 GSK-3β, AD-유형 인산화된 tau(PHF-1), 전체 tau(7.51) 및 β-갈락토시다제(β-Gal)에 대한 항체로 탐침 처리하였다. C에서, CarnKIIa 프로모터(tTA)의 조절 하에서 tTA를 발현하는 마우스를 BitetO 구조물이 게놈(TetO)에 통합된 마우스와 교배시켜 Tet/GSK-3β 마우스를 제조하였다. 상기 이중 트랜스제닉 자손(Tet/GSK-3β)은 테트라사이클린 또는 동족체를 경구 제공하여 tTA에 의한 트랜스 활성화를 방지하지 않는 한 뇌에서 GSK-3β를 구성적으로 발현할 것으로 예상된다.
도 2는 Tet/GSK-3β 마우스에서 트랜스 유전자 발현 패턴을 나타낸다. A-B에서, 약물이 없거나(A) 또는 태어나기 직전에 5 일간 어미에게 독시사이클린을 투여한 후에 태어난(B) PO Tet/GSK-3β 마우스로부터의 뇌 시상 봉합 부분의 X-gal염색을 나타낸다. C-E에서, 성인(3 개월) Tet/GSK-3β 마우스의 시상 봉합 부분에서의 β-갈락토시다제 면역조직화학은 대뇌 피질(C), 해마(D) 및 선조체(E)의 상이한 신경세포 층에서의 발현을 밝힌다. H, 해마; Cx, 대뇌 피질; St, 선조체; 11-VI, 피질 층; cc, 뇌량; DG, 치상회; Hil; 힐루스; GP, 창백핵. B의 축척 봉은 A-B에서 1 ㎜에 해당한다. E에서 축척 봉은 C-E에서 200 ㎛에 상응한다.
도 3은 Tet/GSK-3B 마우스의 대뇌 피질 및 해마에서의 GSK-3B의 과 발현을 나타낸다. A에서, 야생형(레인 1, 3 및 5) 또는 Tet/GSK-3β(레인 2, 4 및 6) 마우스의 대뇌 피질(레인 1 및 2), 소뇌(레인 3 및 4), 및 해마(레인 5 및 6)로부터의 단백질 추출물에 대한 웨스턴 블럿. B에서, Tet/GSK-3β 마우스에서 GSK-3β 수준의 증가율을 나타내는 막대그래프. C-E에서, 야생형(C) 또는 Tet/GSK-3β(D 및 E) 마우스의 피질 부분에서; GSK-3B(C 및 D) 또는 MYC(E)에 대한 항체를 사용하여 수행된 면역조직화학. F-H에서, 야생형(F) 또는 Tet/GSK-3β(G 및 H) 마우스의 해마 부분에서; GSK-3B(F 및 G) 또는 MYC(H)에 대한 항체를 사용하여 수행된 면역조직화학. I-K에서, F-H에 나타낸 치상회의 고 전력 크기. 축척 봉은 C-E에서 100 ㎛, F-H에서 200 ㎛, I-I에서 60 ㎛ 및 K에서 40 ㎛에 해당한다.
도 4는 β-카테닌 수준 및 tau 인산화에 대한 GSK-3β의 과 발현 효과를 나타낸다. A에서, 항-β-카테닌 항체로 탐침 처리한 야생형(Wt) 또는 Tet/GSK-3β(TG) 마우스의 대뇌 피질(Cx) 및 해마(Hipp)로부터의 전체 세포, 세포막, 시토졸 및 핵 제제에 대한 웨스턴 블럿. B에서, PHF-1 및 β-투불린 항체로 탐침 처리한 야생형(Wt) 또는 Tet/GSK-3β(TG) 마우스의 대뇌 피질(Cx), 소뇌(Cb)및 해마(Hipp)로부터의 단백질 추출물에 대한 웨스턴 블럿. C에서, 지시된 항체로 탐침 처리한 야생형(Wt), tTA, TetO 또는 Tet/GSK-3β 마우스로부터의 해마 추출물에 대한 웨스턴 블럿.
도 5는 Tet/GSK-3β 마우스에서 tau의 세포체가지 편재화를 나타낸다. A-D에서, 야생형(A 및 B) 또는 Tet/GSK-3β(C 및 D) 마우스의 치상회에서의 PHF-1 면역조직화학. E-F에서, 야생형(E) 또는 Tet/GSK-3β(F) 마우스의 치상회에서 7.51 항체를 사용하여 수행한 면역조직화학. B에서 화살표는 희미하게 염색된 이끼 섬유를 가리킨다. C에서 삽입부는 PHF-1 면역염색된 과립구의 보다 큰 확대도를 나타낸다. 축척 봉은 A-D에서 200 ㎛, E-F에서 60 ㎛에 해당한다.
도 6은 PHF-1 양성 신경세포에 대한 전자 현미경 연구를 나타낸다. A에서, Tet/GSK-3β 마우스 해마의 치상회로부터의 2 개의 신경세포에 대한 전자 현미경 사진. N1: 세포질 면역염색 확산 이외에, 대부분의 경계선이 주변 호중구(화살표 머리 부분)로부터 탈착된 것을 나타내는 PHF-I 면역양성 신경세포의 핵. N2: PHF-1 면역 음성 신경세포의 핵. B에서, 미 가공 소포체와 관련된, 패치에서의 PHF-1 반응 생성물을 나타내는 4A의 동일한 마우스의 치상회로부터의 또 다른 PHF-1 면역양성 신경세포. N: 표지되지 않은 핵. C에서, 반응 생성물(화살표)의 패치 및 미 가공 소포체의 표지화를 나타내는, 도 4B의 틀에 놓인 부분의 고배율 확대도. 중금속 염색이 수행되지 않았다. 축척 봉은 모든 패널에서 0.5 ㎛에 해당한다.
도 7에서, Tet/GSK-3β 마우스의 신경세포 사멸 및 반응성 신경교증을 나타낸다. A-B에서, 야생형(A) 또는 Tet/GSK-3β(B) 마우스의 치상회에 대한 TUNEL 염색. 화살표는 TUNEL 양성 핵을 가리킨다. C-D에서, 야생형(A) 또는 Tet/GSK-3β(B) 마우스의 치상회에서 GFAP 면역조직화학. E에서, PHF-1 면역염색된 신경세포를 둘러싸고 있는 비대성 성상세포 과정을 나타내는 Tet/GSK-3β 마우스 해마의 치상회에 대한 전자 현미경사진. N: 핵. 별표: 확산 세포질 면역 염색. 검은색 별: 비대성 성상세포 과정. 삽입부: 신경교 중재 필라멘트의 특징적인 관속을 나타내는 성상세포 과정의 고배율 확대도. F에서, Tet/GSK-3β 마우스의 치상 회에 대한 OX-42 면역 염색. 화살표는 면역반응성 미세신경교 과정을 가리킨다. 화살표 머리 부분은 면역염색된 반응성 세포체들을 가리킨다. SM, 분자층; SG 과립층; H, 힐루스. 축척 봉은 A-B에서 50 ㎛, C-D에서 60 ㎛, E에서 0.5 ㎛ 및 F에서 30 ㎛에 해당한다.
마우스 제작
2 방향성 tet 반응성 프로모터(Baron et al., 1995)에 이어서 한쪽 방향으로 GSK-3β cDNA(그의 5' 말단에서 MYC 에피토프를 암호화한다)와 다른쪽 방향으로 핵 편재화 신호에 융합된 β-갈락토시다제(β-gal)를 암호화하는 cDNA가 모두 있는 플라스미드(Biteto)를 제조하였다(도 1A 참조). 상기 플라스미드를 COS 세포에서 수행된 형질감염 실험에서 분석하였다(도 1B). 상기 플라스미드 단독 또는 tau를 암호화하는 발현 벡터와 동시 형질감염된 상기 플라스미드(도 1B, 레인 1 및 2)는 GSK-3β에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 의해 입증된 바와 같이 GSK-3β 수준에 대해 효과가 없었다. tTA의 발현을 허용하는 플라스미드로 동시 형질감염 시(도 1B, 레인 3 및 4), GSK-3β 수준의 현저한 증가가 분명하였다. 이에 의해 PHF tau 인산화 에피토프를 인식하는 PHF-1 항체를 사용한 웨스턴 블럿에 의해 입증된 바와 같이 tau의 인산화가 증가되었다. 테트라사이클린이 존재하는 경우(도 1B, 레인 5 및 6), GSK-3β의 트랜스 활성화는 제거되었다. 따라서 상기 실험들은 상기 BitetO 구조물(도 1A)로부터의 GSK-3β의 조건부 발현을 입증한다.
이어서 상기 BitetO 구조물을 난모세포에 미세 주입하였으며, 5 개의 생성된 트랜스제닉 마우스 주는 일반적으로 구상된 TetO(도 1C)였다. tTA 마우스 주에서, tTA 트랜스 유전자는 칼슘칼모둘린 키나제 IIa 프로모터(CamKIIa-tTA 주 E 및 B)의 통제 하에 있다(Mayford et al., 1996). 상기 tTA 주들을 CNS에서 제한된 조건부 발현, 특히 전뇌에서 고 발현을 허용하는 것으로 선택하였다(Mayford et al., 1996; Yamamoto et al., 2000). TetO 마우스를 tTA 마우스와 교배시키는 경우, 생성되는 이중 트랜스제닉 자손(Tet/GSK-3β로 표시)은 2 개의 트랜스유전자를 모두 구성적으로 발현하는 것으로 예상된다(도 1C). 그러나, 상기 발현은 테트라사이클린 또는 그의 동족체의 부재 하에서는 제거될 수 있다.
tet-조절된 시스템을 갖는 조건부 트랜스제닉 마우스를 제조함에 있어서 본 출원인들의 선행적인 경험은 상기 tetO 구조물의 삽입 게놈 부위 및/또는 사본 수가 tTA에 의한 트랜스활성화의 최종 패턴과 수준에 영향을 미침을 지적한다. 상기 BitetO 구조물에서 β-Gal 정보제공 인자 서열은 X-Gal 염색 또는 β-Gal에 대한 면역조직화학에 의해 상기 이중 트랜스제닉 마우스에서의 트랜스유전자 발현 패턴을 신속하게 분석할 수 있게 하며, 더욱 또한 테트라사이클린에 의한 트랜스유전자 침묵 효능을 시험할 수 있게 한다. 본 출원인들은 상기를 이용하여 TetO 마우스 주들이 본 발명의 연구에 보다 적합하다는 결론을 내렸다.
다양한 Tet/GSK-3β 마우스 주들의 특성화
5 개의 TetO 주들을 tTA 주들과 사육하는 경우, 이들 중 3 개는 오직 선조체에서만 β-Gal 발현을 나타내었다(데이터 도시 안됨). 2 개의 나머지 TetO 주(주 G6 및 G7)는 대뇌 피질 및 해마와 같이 AD와 관련된 뇌 부분에서 높은 수준의 트랜스 유전자 발현을 나타내기 때문에 본 발명의 연구에 특히 적합하였으며, 따라서 본 출원인들은 본 연구의 나머지를 주 G6 및 G7에 초점을 맞추었다. 이들 2 개의 주는 내생성 CamKIIcα와 매우 유사한 공간 패턴으로 β-Gal을 트랜스 활성화시키며, 이때 발현은 대뇌 피질, 해마, 선조체 및 편도선에서 분명하다(도 2). 성인 Tet/GSK-3β 마우스의 뇌 부분에서의 면역조직화학은 대뇌 피질의 상이한 신경세포 층, 해마의 다양한 장들(구상회, CA1, CA2, CA3 및 치상회 포함) 및 1.1 선조체에서 β-Gal 발현을 나타낸다(도 2C-E). 다른 뇌 부분들, 예를 들어 창백핵, 시상, 뇌간 및 소뇌(도 2A, 2E, 3A 및 도시 안됨)에서 어떠한 β-Gal 발현도 검출되지 않았다. CamKIIα-tTA 주(E 또는 B)를 하나의 TetO 주(G6 또는 G7)와 함께 사용하는 경우 유사한 패턴과 수준의 트렌스제닉 발현을 얻었다. 이 연구에서, 본 출원인들은 각각의 조합을 호환적으로 사용하였으며, 따라서 이제부터는 단일 트랜스제닉 마우스에 대해서 용어 tTA 및 TetO를, 이중 트랜스제닉 동물에 대해서는Tet/GSK-3B를 사용할 것이다.
Tet/GSK-3B 마우스는 생육 및 임신 가능하였으며 트랜스유전자 발현을 억제하는 약리학적 개입 없이 정상적인 것으로 보였다. 이는 뇌에서 증가된 GSK-3β 발현에 대한 선행의 가정된 독성(Brownlees et al., 1997)을 반박하는 것으로 보였다. 그러나, tTA와 TetO 마우스 간의 이형 접합자 교배는 각각의 유전자형(야생형, tTA, TetO, 및 Tet/GSK-3β)에 대해 25%의 예상 빈도를 생성시키지 않았다. Tet/GSK-3β 마우스는 이하로 나타났다(14%, n=401). 이는 Tet/GSK-3β 마우스에서 GSK-3β의 태아기 과 발현으로 인한 치명성을 가리킬 수 있다.
본 출원인들은 앞서 헌팅톤 병에 대한 본 발명의 CamKIIα-tTA 구동 동물 모델(HD94)에서 주산기의 트랜스 유전자 발현과 치명성을 관찰하였다(Yamamoto et al., 2000). HD94 마우스의 경우에, 임신한 마우스에게 E15에서 출산까지 음료수 중의 테트라사이클린 동족체 독시사이클린(2 ㎎/㎖)을 자유롭게 제공하는 경우, 오직 출생 후의 트랜스제닉 발현만이 일어나며 4 개의 예상된 유전자형에 대한 빈도는 25%로 복원된다. 따라서, 본 출원인들은 Tet/GSK-3B 마우스에게 동일한 프로그램의 주산기 독시사이클린 처리를 적용할 것을 결정하였다. PO에서 처리되지 않은 마우스는 전뇌에서 X-gal 염색을 나타내는 반면, 처리된 마우스에서는 염색이 존재하지 않은 것으로 밝혀졌다(도 2A 및 B). 이는 Tet/GSK-3β 마우스에서의 트랜스 유전자 발현이 태아기 중에 시작하며, 독시사이클린에 의해 억제될 수 있음을 입증한다. 예상되는 바와 같이, 태아기 독시사이클린 처리는 Tet/GSK-3β 마우스의 빈도를 25%로 정상화시키며, 따라서 새끼를 밴 이중 트랜스제닉 마우스의 수율을 최대화시키기 위해서, 주산기 독시사이클린 처리를 통상적으로 사용하였다.
Tet/GSK-3β 마우스는 대뇌 피질 및 해마에서 GSK-3β를 과 발현한다. β-Gal 발현을 나타내는 뇌 부분들이 또한 증가된 수준의 GSK-3β를 나타냄을 웨스턴 블럿 분석에 의해 확인하였다. 단백질 추출물을 항-MYC 항체로 탐침 처리하여 최고 수준의 트랜스제닉 GSK-3β 발현이 해마에 이어 대뇌 피질(도 3A)에서 일어나는 반면, 선조체(도시 안됨)에서는 적은 발현이 검출될 수 있음을 입증하였다. 따라서, 3 개월된 마우스로부터의 추출물을 GSK-3β에 대해 생성된 항체를 사용하여 탐침 처리하는 경우(도 3A 및 B), 야생형 마우스에 비해 Tet/GSK-3β 마우스의 해마에서 상당한(p<0.02) 40 +/- 12.4%의 GSK-3β 수준의 증가가 관찰되었다. 피질 추출물이 또한 Tet/GSK-3β 마우스에서 증가된(17 +/- 5%) GSK-3β 수준을 나타내었다. 선조체(도시 안됨) 또는 비 전뇌 부분들, 예를 들어 소뇌(도 3B)에서는 GSK-3β수준의 차이가 발견되지 않았다. 이어서, 1 내지 12 개월 범위의 나이에서 Tet/GSK-3β 마우스의 해마 및 대뇌 피질에서 일어나는 GSK-3β의 상승을 감시하였다. 과 발현의 수준은 모든 시험 나이(도시 안됨)에서 유사하였으며, 본 연구의 나머지 실험을 2.5 내지 6 개월 된 성인 마우스에서 수행하였다.
세포 집단이 GSK-3β를 과발현하는 것을 간파하기 위해서, 항-MYC 및 항-GSK-3β 항체 모두에 대해 면역조직화학을 수행하였다. 대뇌 피질에서, GSK-3β에 대해 증가된 면역반응성(IR)이 II 및 III 층 피라미드 피질 신경세포(도 3C-E) 및 뇌량에 인접한 VI 박층 신경세포(도시 안됨)에서 발견되었다.
해마에서, GSK-3β의 과 발현은 모든 부분들(구상회, CA1, CA2, CA3 및 치상회 포함)에서 분명했으며, 이때 상기 치상회 및 CA2는 가장 우세한 증가를 나타내었다(도 3F-H). 야생형 마우스의 치상회는 GSK-3β에 대해 매우 약한 IR을 나타낸 반면(도 3F 및 3I), Tet/GSK-3β 마우스의 치상회의 모든 신경세포는 GSK-3β를 과 발현하였다(도 3G 및 3I). 이들 신경세포 중 일부는 항-GSK-3β 및 항-MYC 항체 모두에 의해 현저히 높게 염색된 것으로 나타났으며(도 3I-K) 종종 수축된 세포체와 같이 비 정상적인 형태를 나타내었다(도시 안됨). CA2 피라미드 신경세포에서, 세포체와 가지 모두의 현저한 염색이 Tet/GSK-3β 마우스에서 나타났다(도 3G-H).
이어서 AD 관련된 기질인 β-카테닌과 tau에 대한 GSK-3β 과 발현의 효과를 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. β-카테닌은 세포-세포 결합부의 성분이나, 또한 Tcf/LEF 계열의 HMG-박스 전사 인자와 관련이 있고 표적 유전자의 전사를 촉진시킨다. GSK-3β는 β-카테닌 안정화 및 후속적인 핵 전좌를 조절하는 중요한 효소이다(Anderton, 1999; Barth et al., 1997).
먼저, 전체 피질 및 해마 추출물 중의 β-카테닌 수준을 분석하였다(도 4A). 야생형과 Tet/GSK-3β 마우스 간에 차이가 발견되지 않았다. 이어서, 상이한 세포 구획들 중의 β-카테닌 수준을 분석하였다. 도 4A에서 볼 수 있는 바와 같이, 대뇌 피질 또는 해마로부터의 세포막 또는 시토졸 추출물에서 β-카테닌 수준의 변화는 관찰되지 않았다. 핵 추출물을 분석한 경우, 대뇌 피질에서 β-카테닌 수준의 현저한 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 해마에서, 야생형 한배 새끼에 비해 Tet/GSK-3∼ 마우스에서 핵 β-카테닌 수준이 현저하게(p<0.05, n=6) 35 +/- 8% 감소됨을 관찰하였다. 이러한 핵 β-카테닌의 감소는 또한 Tet/GSK-3β 마우스의 치상회의 면역-전자 현미경 분석에 의해 분명했다(도시 안됨).
이어서, MYC 발현을 나타내는 뇌 부분들(대뇌 피질, 선조체 및 해마)뿐만 아니라 소뇌에서 tau 항체를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 오직 해마만이 PHF-1 항체에 의해 검출되는 바와 같이 증가된 수준의 tau 인산화를 보였다(도 4B 및 도시 안됨). PHF-1 항체에 의해 검출된 tau의 AD-유형 인산화의 증가를 tau의 동일한 포스포에피토프에 대해 생성된 AD2 항체를 사용하여 재현하였다(도 4C). Tet/GSK-3β에서 PHF-1 및 AD2 IR의 증가는 전체 tau의 변경된 수준에 기인하지 않는데, 그 이유는 모든 tau 동형들을 인식하는 인산화 독립적인 tau 항체 7.51의 증가가 관찰되지 않았기 때문이다. 더욱 또한, 프롤린 잔기에 인접하지 않고 생체 내에서 GSK-3β와 무관한 것으로 나타난 세린 262에서의 인산화는 12E8 항체에 의해 검출된 바와 같이 Tet/GSK-3β 마우스에서 영향이 없었다(도 4C).
4 개의 가능한 유전자형(야생형, tTA, TetO 및 Tet/GSK-3∼)에서 tau 인산화와 트랜스제닉 단백질 발현을 비교하였다(도 4C). 오직 Tet/GSK-3β 마우스만이 β-Gal 발현 및 증가된 수준의 GSK-3β 및 PHF-1 및 AD2 tau를 나타내었으며, 따라서 이는 Tet/GSK-3β 마우스의 트랜스제닉 발현 및 후속적인 영향들이 BitetO 구조물의 tTA에 의한 트랜스 활성화에 기인한 것이지 TetO 마우스의 상기의 누락에 기인한 것은 아님을 입증한다.
AD-유형 과인산화된 TAU의 세포체 가지 편재화
해마 신경세포 집단이 웨스턴 블럿에 의해 관찰된 PHF-1 IR의 증가를 나타내는 면역조직화학에 의해 분석하였다. 증가된 PHF-1, 면역염색은 치상회에서 가장 분명하였다(도 5). 야생형 마우스에서, 상기 치상회의 과립구는 검출할 수 있는 PHF-1 IR을 나타내지 않지만(도 SA), 일부 염색은 CA3로 돌출되는 이끼 섬유에서 검출될 수 있었다(도 5B). Tet/GSK-3B 마우스는 이끼 섬유 염색의 현저한 증가를 나타내며(도 5D), 흥미롭게는, 대부분의 과립구들은 강한 세포체 가지 PHF-1 면역 염색을 나타내고, 따라서 이는 AD 신경섬유 퇴행의 미리 얽힌 단계를 닮았다(도 5C).
GSK-3β에 의한 tau의 인산화는 생체 외 및 형질감염된 세포에서 미소관에 대한 tau의 친화성을 감소시킨다(Lovestone et al., 1996). 이는 부분적으로 PHF-1 항체에 의해 발견된 세포체가지 염색을 설명할 수 있다. 이를 시험하기 위해서, tau의 투불린 결합 영역에 대해 생성되고 따라서 미소관에 결합하지 않은 경우에만 tau를 인식하는 항체인 7.51을 사용하여 면역조직화학을 수행하였다. 흥미롭게도, 상기 7.51 항체는 Tet/GSK-3β의 체세포를 염색하지만, 야생형 치상회 과립구는 염색하지 않았다(도 5F). 7.51 염색된 세포의 형태는 PHF-1 항체의 경우 관찰된 것과 매우 유사하였다(도 5C에서 삽입부 참조).
과인산화된 tau의 강한 세포체 가지 면역염색은 또한 PHF와 같은 tau의 이상 응집된 형태를 가리킬 수 있다. AD 뇌에서 티오플라빈-S 염색은 신경섬유 얽힘과 아밀로이드 반 모두를 밝힌다. 따라서, Tet/GSK-3β 마우스의 뇌 부분에서 티오플라빈-S 염색을 수행하였다. 티오플라빈-S 형광성은 치상회 또는 임의의 다른뇌 부분의 과립구에서 검출되지 않았으며, 이는 PHF 꾸러미와 β-시트 단백질 응집체의 부재를 지시한다. 상기 티오플라빈-S 형광성의 결여는 여전히 보다 적고 짧은 PHF의 존재와 양립될 수 있으며, 따라서 이는 신경섬유 퇴행의 초기 단계를 나타낸다.
상기 가능성을 분석하기 위해서, Tet/GSK-3β 과립구를 전자 현미경 분석에 의해 연구하였는데 그 이유는 상기가 PHF-1에 대해 강한 세포체 가지 면역표지를 나타내기 때문이다. 확산 반응 생성물이 이들 신경세포의 핵주위질에 존재하였지만(도 6A-C), 일부의 경우에 또한 짙은 반응 생성물의 패치가 관찰되었다(도 6C). 그러나, PHF는 상기 짙은 반응 생성물 패치나, 또는 상기 확산 면역 표지된 세포질의 다른 부분에서 관찰되지 않았다. 흥미롭게도, 면역표지된 물질이 종종 비 가공 소포체(RER) 조의 세포질 면을 따라 나타났으며, 상기 언급한 짙게 염색된 패치는 몇몇 이유로 이들 표지된 RER 조에 아주 근접하게 존재하였다(도 6C). 흥미롭게도, 주변 호중구로부터의 탈착이 매우 빈번히 나타나는 확산 PHF-1 세포질 표지화된 Tet/GSK-3β 신경세포는 대부분의 그의 주변부를 따라 확장된 세포 외 공간을 보이는 반면(도 6A), 표지되지 않은 신경세포는 어떠한 탈착도 보이지 않았다. 또한, 야생형 마우스의 과립구 신경세포의 탈착도 관찰되지 않았다.
Tet/GSK-3β 마우스의 해마에서 신경 세포사멸 및 반응성 신경교증
선행의 연구들은 GSK-3B가 세포소멸을 방지하는 PI 3-키나제/PKB 생존 경로에 의해 억제됨을 입증하였다(Cross et al., 1995; Cross et al., 1994; Hurel etal., 1996; Saito et al., 1994). 이는, PS-1의 돌연변이에 의한 β-카테닌의 탈안정화가 신경세포 소멸을 가능하게 한다는 발견(Zhang et al., 1998)과 함께, 세포소멸이 GSK-3β의 과 발현의 결과로서 Tet/GSK-3β 마우스에서 일어나는지의 여부를 조사할 것을 촉구한다.
Tet/GSK-3β 마우스의 상이한 신경세포 집단들은 야생형 마우스에는 존재하지 않는 TUNEL 표지화를 나타내었다. 이는 주로 치상회의 과립구에서 관찰되었다(Tet/GSK-3β 치상회 30 ㎛ 부분 당 5 개 이하의 표지된 과립구 대 야생형 치상회의 비 표지, 도 4A 및 B). 일부 TUNEL 양성 세포가 또한 Tet/GSK-3β 마우스의 피질 VI 박층 중의 뇌량에 인접하여 관찰되었다.
이어서, Tet/GSK-3β 마우스에서 GSK-3β의 과 발현에 의해 촉발된 신경세포 변경 및/또는 세포 사멸이 반응성 아스트로사이토시스 및 마이크로글리오시스와 같은 신경교 변경을 수반하는 지의 여부를 시험하였다. 신경교 섬유 산성 단백질(GF AP)에 대해 생성된 항체를 사용하여 수행된 면역조직화학은 상이한 뇌 부분에서의 반응성 아스트로사이토시스를 밝혔다. TUNEL 표지화와 일치되게, GF AP 염색이 치상회 및 깊은 피질 층에서 가장 현저하였다(도 7C 및 D, 및 도시 안됨). 전자 현미경 연구는 Tet/GSK-3β 마우스의 치상회에서 신경교 중재 필라멘트로 가득찬 고도로 활성화된 아스트로사이트 과정의 존재를 입증하였다. 이는 종종 PHF-1 IR 신경세포 주변에서 발견되었다(도 7E).
마이크로글리오시스가 Tet/GSK-3β 마우스의 해마에서 일어나는지의 여부를 시험하기 위해서, OX42, LN-3 및 ED1 항체를 사용하여 면역조직화학을 수행하였다.이들 3 개의 항체 모두에 대해 유사한 결과가 수득되었다(도 7F는 OX-42 면역조직화학을 나타낸다). 야생형 해마 부분과 비교 시, 미세한 미세신경교 과정의 증가가 Tet/GSK-3β 마우스의 과립 층에서 발견되었다. 더욱 또한, 반응성 미세신경교에 상응하는 면역염색된 세포체들이 오직 Tet/GSK-3β 마우스에서만, 주로 해마의 분자층에서 발견되었다(7F에서 화살표 머리).
논의
본 발명의 조건부 트랜스제닉 접근법을 사용함으로써, GSK-3β의 생체 내 과 발현에 의해 신경퇴행이 일어남을 밝혔다. GSK-3β를 과 발현하는 조건부 트랜스제닉 마우스는 또한 AD의 상이한 생화학적 및 세포적 태양들, 예를 들어 β-카테닌 탈안정화 및 과인산화된 tau의 미리얽힘과 같은 세포체 가지 편재화를 모방한다. 따라서, 본 발명의 결과는 GSK-3β의 조절 해제가 AD의 발병에 중요한 사건일 수 있다는 가설을 지지하며 상기 마우스가 상기 병의 일부 태양들을 연구하는데 유용한 동물 모델로서 작용할 수 있을 가능성을 제기한다.
GSK-3β는 Wnt 신호화 경로의 성분으로서 동물이 발육하는 동안 활성이며 세포 운명의 결정과 패턴 형성에 중요한 역할을 한다(Bourouis et al., 1990; Ruel et al., 1993; Siegfried et al., 1992; Siegfried et al., 1994). 따라서, GSK-3B를 억제하는 리튬의 능력이 그의 기형발생 효과에 원인이 됨이 제시되었다(Klein and Melton, 1996; Stambolic et al., 1996). Wnt 신호화 및 GSK-3β는 조기 발생에서의 그의 잘 확립된 역할과 별도로, 출생 후 소뇌 과립구 합사기 형성에 관여하는 것으로 나타났다(Hall et al., 2000; Lucas and Salinas, 1997). CNS의 태아기 및 출생 후 발달 중의 GSK-3β 과 발현의 독성은 왜 브라운리스(Brownlees)와 공동연구자들이 신경세포 특이적인 프로모터를 사용함에도 불구하고 GSK-3β의 검출 가능한 과 발현을 갖는 트랜스제닉 마우스를 제조할 수 없었는가를 설명할 수 있다. 이는 상기 저자들이 치밀하게 조절되는 유도성 발현 시스템의 사용을 제안하도록 촉구하였다(Brownlees et al., 1997). 본 발명의 경우에, 이중 트랜스제닉 마우스의 일부가 주산기에 죽으며 태아기 중에 트랜스유전자 발현을 침묵시킴으로써 구제될 수 있음을 발견하였다. 그러나, 일부 마우스는 약리학적 개입 없이 생존할 수 있다. 여기에는 적어도 2 가지의 이유가 존재한다. 첫째로, 우리가 사용하는 프로모터(CamKIIα)는 브라운리스와 공동연구자들이 사용한 것(NF-L)보다 더 제한된 패턴의 발현을 갖는다. 둘째로, 우리의 2 상 시스템에서는 트랜스유전자가 단독으로 침묵한다. 이는 상기 트랜스유전자의 독성으로 인해 원 유전자의 치명성을 피한다. 후속적인 tTA 마우스에 의한 번식으로 상기 트랜스유전자의 태아기 과 발현에 허용적인 연령적 배경을 갖는 이중 트랜스제닉 자손들을 선택할 수 있다.
과인산화된 tau의 체세포 가지 축적은 AD 신경섬유 퇴행의 발생에서 초기의 사건이다(Braak et al., 1994). tau의 미리얽힘과 같은 면역염색이 tau의 상이한 동형태들을 과 발현하는 트랜스제닉 마우스에서 발견된다(Brion et al., 1999; Gotz et al., 1995; Ishihara et al., 1999; Spittaels et al., 1999). 상기 마우스에서 tau의 체세포 가지 편재화는 미소관의 tau 결합 능력의 포화로 인해 발생할 수 있다. 이어서 과잉의 tau는 체세포에서 축적되기 쉬우며 인산화 및 배좌 변화와 같은 장래의 변경을 겪기 쉽다. Tet/GSK-3α 마우스에서, tau의 과인산화 및 체세포 가지 편재화는 전체 tau의 수준에 영향을 미치지 않고 발생하며, 따라서 AD 및 다른 tau요법에서 발견되는 상황과 보다 유사하게 발생한다. Tet/GSK-3β 마우스에서 발견되는 7.51 면역염색의 증가 및 선행의 생체 외 연구에 따라(Novak et al., 1991), Tet/GSK-3B 마우스에서의 증가된 tau 인산화가 가장 미소관에 대한 tau의 친화성을 감소시키고 후속적으로 체세포에서 단백질을 축적시키는 듯 하다.
Tet/GSK-3α 마우스에서 체세포 가지 tau는 종종 소포체와 회합됨을 발견하였다. 유사한 결과가 tau의 가장 짧은 동형을 과 발현하는 트랜스제닉 마우스(Brion et al., 1999) 및 성숙한 양(Nelson et al., 1993)에서 발견되었다. 이들 모든 경우에서, 면역검출을 인산화를 인식하는 항체 또는 PHF-tau에서 발견되는 일치 에피토프를 사용하여 수행하였다. 흥미롭게도, AD 뇌의 PHF는 종종 소포체 및 다른 세포막 구조로부터 발생함을 발견하였다(Gray et al., 1987; Metuzals et al., 1988; Papasozomenos, 1989). 따라서, 동물 모델에서 소포체와 tau의 회합은 신경섬유 병변의 형성에서 초기 단계를 나타낼 수 있다. tau와 소포체의 회합에 대한 추가적이고 적합한 설명은 PS-1과의 상호작용일 수 있다. PS-1은 인간 뇌 추출물에서 수행된 공동 면역침강 실험에서 tau 및 GSK-3β 모두와 결합하는 것으로 밝혀졌으며(Takashima et al., 1988), PS-1은 소포체 및 골지체에 우세하게 위치한다(Selkoe, 1998).
다수의 기전들이 Tet/GSK-3β 마우스에서 검출된 신경세포 스트레스 및사멸(반응성 신경교 및 TUNEL의 염색에 의해 밝혀짐)에 기여할 수 있다. tau 인산화 및 구획화에 대한 GSK-3β 과 발현의 효과에 비추어, 가능한 기전은 미소관 세포골격의 해체일 수 있다. 이 경우에, tau에 의한 미소관의 감소된 안정화의 결과로서 AD 뇌에서 발견되는 것(Terry, 1998)과 유사한 미소관 함량의 감소가 Tet/GSK-3β 마우스에서 예상될 수 있다. 또한, GSK-3β는 PI-3 키나제를 수반하는 생존 경로에 의해 소극적으로 조절되며(Cross et al., 1995; Cross et al., 1994; Hurel et al., 1996; Saito et al., 1994), PI-3 키나제 억제제에 의해서 또는 영양 인자 회수에 의해 배양된 피질 신경세포를 공격하면 세포소멸을 일으키는 GSK-3β를 자극하게 된다(Hetman et al., 2000; Pap and Cooper, 1998). 마지막으로, 감소된 β-카테닌 매개된 전사는 β-아밀로이드에 노출되거나(Zhang et al., 1998) 또는 변이체 PS-1으로 형질감염된(Weihl et al., 1999) 1 차 신경세포 배양물에서 신경세포 소멸을 촉진시키는 것으로 나타났다. 세포소멸에 대한 증가된 감수성에 기여하는 β-카테닌에 의해 트랜스 활성화된 표적 유전자에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. Tet/GSK-3β 마우스는 상이한 디스플레이 또는 DNA-마이크로 배열 접근법에 의해 상기와 같은 유전자를 동정하기에 유용한 시스템일 수 있다.
최근 수년동안 특히 β-아밀로이드 독성의 단계적 감소 및 반 형성과 관련하여, AD의 트랜스제닉 마우스 모델의 제조에 대해서 상당한 진보가 이루어졌다(Price and Sisodia, 1998). APP의 변이된 형태의 보다 높은 발현 수준을 갖는 마우스를 제조하고 상기 마우스를 Aβ42로의 APP 가공을 촉진하는 변이체 PS-1 트랜스제닉 마우스와 함께 사육함으로써 연속적인 개선이 이루어졌다(Guenette and Tanzi, 1999). 그러나, GSK-3β 조절 해제가 AD의 발병에 중요한 사건인 경우, Tet/GSK-3β 마우스는 AD에 대한 대안적이고/이거나 보완적인 마우스 모델을 구성할 수 있다.
AD의 트랜스제닉 모델에서 지금까지 수행되어온 대부분의 노력은 AD의 신경병리학적 확인표시를 모방하는데 초점을 두었다. 이는 마우스의 수명 안에서 재현하기 위해 과도하게 인공적인 변경(인간에서 많은 세월에 걸쳐 형성되는 어떤 것)을 요할 수 있다. 한편으로, 마우스에서 AD 신경병의 모든 태양을 모방하는 것은 상기가 인간의 특정한 실마리들(생체 내에서 β-아밀로이드 유발된 독성의 경우에서와 같이, Geula et al., 1998)을 요하기 때문에 간단하지만은 않다. GSK-3β는 AD 형 tau 과인산화, β-아밀로이드 유발된 독성 및 PS-1 돌연변이와 관련된 경로들의 수렴점에서 발견된 효소이다. AD의 기존 마우스 모델에 비해, Tet/GSK-3β 마우스는 AD의 일부 태양에 궁극적인 원인일 수 있는 하부 신경세포 내 장애를 재현한다는 의미에서 독특하다. 이러한 가설에 대한 예견은 GSK-3β 수준(또는 활성) 및 기질이 AD 환자에서 변경되었다는 것이다. 이에 유리한 증거가 이미 보고되어 있다(Pei et al., 1999; Shiurba et al., 1996).
Tet/GSK-3β 마우스의 신경퇴행은 비교적 특이적인 GSK-3β 억제제인 리튬의 신경보호 효과와 잘 일치한다. 상기 리튬의 신경보호 효과는 신경세포에서 GSK-3β를 억제하고(Alvarez et al., 1999; Hetman et al., 2000), Bcl-2를 상향 조절하고(Chen et al., 1999), Bax 단백질을 하향 조절하는(Chen and Chuang, 1999) 그의능력에 기인하였다(개정판 Manji et al., 1999). 따라서 Tet/GSK-3β 마우스는 곧 닥쳐올 GSK-3β 특이적인 억제제의 신경보호 효과를 시험하는데 훌륭한 도구이다. 더욱 또한, 그의 효능을 테트라사이클린 동족체를 투여함으로써 트랜스유전자 발현을 침묵시키는 효과와 비교할 수 있다.
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Claims (9)
- GSK(글리코겐 신타제 키나제)-3β 단백질이 과 발현되는 트랜스제닉 동물.
- 제 1 항에 있어서, GSK-3β 단백질의 발현이 조건인 트랜스제닉 동물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, GSK-3β가 과 발현되는 유일한 효소인 트랜스제닉 동물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, GSK-3β가 과 발현되는 유일한 단백질인 트랜스제닉 동물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물인 트랜스제닉 동물.
- 제 5 항에 있어서, 포유동물이 마우스, 래트 또는 영장류인 트랜스제닉 동물.
- 알쯔하이머 병에 대한 모델로서 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 트랜스제닉 동물의 용도.
- 신경퇴행성 질병을 시험하기 위한 약물 또는 요법의 시험에서 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 트랜스제닉 동물의 용도.
- 알쯔하이머 병의 치료에 유용한 요법을 본 발명의 트랜스제닉 동물에게 투여하고 병의 경과 또는 양상에 대한 효과를 감시함을 포함하는, 상기 요법의 확인 방법.
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