PT1280404E - Modelo para doença neurodegenerativa - Google Patents

Description

ΕΡ1280404 1 DESCRIÇÃO "MODELO PARA DOENÇA NEURODEGENERATIVA" 0 presente invento relaciona-se com modelos animais para doença neurodegenerativa, em particular para a doença de Alzheimer.

FUNDAMENTOS DO INVENTO A doença de Alzheimer, (AD), constitui a doença neurodegenerativa mais comum em países desenvolvidos, e é caracterizada por uma perda progressiva da memória e compromissos na linguagem e comportamento que por último conduzem à morte (Alzheimer, 1911: Yankner, 1996). 0 declínio cognitivo em AD é acompanhado por atrofia neuronal e per-das principalmente no córtex, hipocampo, e amígdala (Gomez-Isla et al., 1997) . Para além de um padrão específico de morte de células neuronais, AD caracteriza-se por dois marcos neuropatológicos, placas senis e emaranhamentos de neurofibrilhas (NFTs).

As placas senis são depósitos extracelulares de fibrilas amilóides formadas por peptídeo de amino ácido β-amilóide 39-43 (AB) frequentemente rodeado por dendritos distróficos (Glenner and Wong, 1984; Masters et al., 1985; Selkoe, 1994) . 2 ΕΡ1280404 NFTS são agregados gerados no interior dos neurónios de filamentos helicoidais emparelhados (PHFs) que são reunidos a partir de formas hiperfosforiladas da proteína tau associada a microtúbulos (Greenberg et al., 1992; Grunke-Iqbal et al., 1986; Lee et al., 1991;

Morishima-Kawashima et al., 1995). NFTs podem ser encon trados em todas as regiões do cérebro que sofram de degenerescência em AD e o seu padrão espacio-temporal de aparecimento correlaciona-se bem com o da morte cerebral e a sintomatologia (Arriagada et al., 1992; Braak and Braak, 1991); Gomez-Isla et al., 1997). A compreensão molecular sobre a patogénese de AD deriva de estudos genéticos em famílias afectadas por formas herdadas de AD (FAD) . Isto refere-se apenas a uma pequena percentagem de casos de AD mas permitiu a identificação de mutações em três genes diferentes que são responsáveis pelo desencadeamento da doença. Estes genes são os presenilins-1 e -2 (PS-1 e PS-2) e a proteína pre cursora do amilóide (APP) (Hardy, 1996). Mutações em APP dão origem a um aumento na produção de Αβ (Price and Sisodia, 1998) enquanto que mutações de PS-1 e de PS-2 favorecem o processamento de APP na forma longa e mais amiloidogénica de Αβ (Αβ42) (Citron et al., 1997; Duff et al., Price and Sisodia, 1998; Scheuner et al., 1996) . Esta evidência genética juntamente com estudos in vitro e in vivo de ponto de neurotoxicidade induzida por Αβ para formação de Αβ e/ou agregação como um evento chave no desencadeamento de AD. 3 ΕΡ1280404

Pouco se sabe sobre efectores intracelulares de declínio que contribuam para disfunção neuronal, embora a activação de sintase kinase -3β de glicogénio (GSK-3 3β) tenha sido proposta. Θ3Κ-3β é uma serina dirigida a prolina/troenina kinase que foi originalmente identificada devido ao seu papel na regulação do metabolismo do glicogénio e que é muito abundante no SNC (Woodgett, 1990). Para além de ser implicada na transdução do sinal mediado pela insulina e IGF-1, GSK- 3β está também envolvido na via de sinalização wnt/áptero como o enzima chave que regula a estabilidade da β-catenina e, consequentemente, a sua trnaslocação para o núcleo e sua actividade transcripcional (Anderton, 1999; Earth et al., 1997) . 63Κ-3β é um dos melhores enzimas candidatos para a geração de tau hiperfosforilado que é característico de PHFs (Lovestone and Reynolds, 1997) . GSK- 3β pode ser purificado a partir de microtúbulos (Ishiguro et al., (1988) e verificou-se que fosforilava tau na maior parte dos sítios hiperfosforilados em PHFs tanto em células transfectadas (Lovestone et al., 1994) como in vivo (Hong et al., 1997; Munoz-Montano et al., 1997). Além disso, GSK-3β acumula-se no citoplasma de neurónios pré-emaranhamento e a sua distribuição em cérebros preparados para modificações neurofibrilares coincide com a sequência de desenvolvimento dessas modificações (Pei et al., 1999; Shiurba et al., 1996) . 4 ΕΡ1280404 A exposição de culturas neuronais primárias corticais e do hipocampo a Αβ revelou que induzia a acti-vação de GSK- 3β (Takashima et al., 1996); hiperfos-forilação de tau (Busciglio et ai., 1995; Ferreira et ai., 1997; Takashima et ai., 1998), e morte celular (Busciglio et ai., 1995; Estus et al., 1997); Forloni et al., 1993; Loo et al., 1993; Pike et ai., 1991); Takashima et ai., 1993). 0 bloqueamento da expressão ou actividade de GSK-3β, quer por oligonucleótidos antisense ou por litio, previnem neurodegenerescência induzida por Αβ de culturas primárias do córtex e do hipocampo (Alvarez et ai., 1999; Takashima et ai., 1993).

Verificou-se que PS-1 ligava directamente GSK- 3β e tau em experimentações de coimunoprecipitação a partir de amostras de cérebro humano (Takashima et ai., 1998). Assim, a capacidade de PS-1 para levar GSK- 3β e tau a uma proximidade intima sugere que PS-1 pode regular a fosforilação de tau por 63Κ-3β. Formas mutantes de PS-1 em experimentações de transfecção deram origem a um aumento da associação Ρ3-1/63Κ-3β e a fosforilação aumentada de tau (Takashima et ai., 1998). Além disso, verificou-se também que PS-1 forma um complexo com o substrato 63Κ-3β β-catenina em células transfectadas (Murayama et al., 1998; Yu et al., 1998) e In vivo (Yu et ai., 1998; Zhang et ai., 1998) e esta interacção aumenta a estabilidade da β-catenina (Zhang et ai., 1998). Mutações patogénicas de PS-1 reduzem a capacidade de PS-1 para estabilizar β-catenina o 5 ΕΡ1280404 que por seu lado dá origem a uma diminuição dos niveis de β-catenina em pacientes com AD com mutações de PS-1 (Zhang et ai., 1998) .

Brownlees et ai., (1997) descrevem ratinhos trans-génicos que expressam GSK-3P sob o controlo de promotores de NF-L ou de MSV. Observaram que a sobreexpressão de GSK-3β pode ser letal in vivo, e que não se encontra aumento da expressão de ΟΞΚ-3β nos seus ratinhos transgénicos.

Mayford et ai., (1996) descrevem a utilização do sistema transactivador de tetraciclina (tTA) sob o controlo do promotor de CamKIIa para expressar o gene CamKIIa em ratinhos após administração de doxiciclina.

OBJECTO DESTE INVENTO

Existe uma necessidade de modelos animais que imitem de um modo muito aproximado a patologia de doenças neurodegenerat ivas tais como AD, que são vitais para a compreensão da doença e para testar novas terapêuticas. O presente invento inicia uma aproximação a este problema de modelos animais.

SUMÁRIO DO INVENTO O invento proporciona um animal transgénico não humano, em que a proteína 03Κ-3β é sobreexpressada no 6 ΕΡ1280404 animal, em que expressão da proteína GSK-3P se encontra sob o controlo de um sistema de expressão condicionado tet-regulado tendo um transgene tTA sob o controlo do promotor CamKIIa, de modo a que níveis aumentados da fosforilação de tau se encontrem no hipocampo, mas não no córtex ou corpo estriado.

FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

De preferência GSK-3P é o único enzima que é sobreexpressado, e na realidade é mais preferido que GSK- 3β seja a única proteína a ser sobreexpressada. A sobre-expressão de apenas a proteína GSK-3P produz de um modo surpreendente uma patologia no animal transgénico que imita AD de um modo muito aproximado. De um modo específico, a sobreexpressão de GSK-3P dá origem a níveis mais baixos de β-catenina, fosforilação aumentada de proteína tau, morte da célula neuronal, astrocitose reactiva e microgliose. A patologia similar do modelo transgénico e o estado natural da doença torna o modelo do presente invento altamente valioso para análise da doença.

De preferência o animal usado nos estudos trans-génicos é um mamífero, tal como um ratinho, rato ou primata. Outros animais apropriados para utilização em estudos transgénicos são bem conhecidos nesta técnica. O invento também proporciona a utilização de um animal transgénico tal como foi descrito como um modelo para a doença de Alzheimer. 7 ΕΡ1280404 O modelo animal do invento é útil para testar novas drogas ou terapêuticas para o tratamento de doenças neurodegenerativas tais como a AD. Assim o invento estende-se a um método de identificação de uma terapêutica útil no tratamento de AD, compreendendo a administração da terapêutica ao animal transgénico do invento e monitorização quanto a um efeito sobre a patologia ou o comportamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Utilizamos um sistema tet-regulado em ratinhos. 0 sistema tet-regulado tem sido útil para expreeão genética condicional em sistemas de células eucariontes e ratinhos (Gingrich and Roder, 1998). Ao utilizar este sistema para conduzir expressão transgénica de uma forma de huntington que tenha sofrido mutação, alguns de nós criámos recentemente o primeiro modelo animal condicional de uma doença neurodegenerativa (Yamamoto et al., 2000). 0 sistema tet-regulado pode ser particularmente útil ao imitar condições patológicas visto poder ser usado para contornar a leta-lidade perinatal devida a toxicidade do transgene, desencadear expressão do transgene apenas na vida adulta, e fazer parar a expressão do transgene uma vez que tenham tido lugar modificações relevantes do fenótipo (Kelz et al., 1999; Yamamoto et al., 2000). A regulação do sistema é conseguida através do transactivador regulado por tetraciclina (tTA), uma pro- ΕΡ1280404 teína quimérica compreendida pelo campo de acção do tet-repressor da ligação ao DNA e pelo campo de acção da activação trans VP16 (Gossen and Bujard, 1992). Esta proteína liga-se de um modo específico à sequência operadora tetO e induz transcrição a partir de um promotor mínimo CMV adjacente. A combinação de ambos os elementos tTA e tetO permite assim uma transactivação contínua do transgene em questão. A tetraciclina e seus análogos podem ligar-se a tTA. Quando isto acontece, evita-se que tTA se ligue a tetO, e a transcrição é inibida.

Deste modo, produzimos ratinhos transgénicos condicionais com sobreexpressão de GSK- 3β no cérebro durante a vida adulta evitando-se entretanto letalidade perinatal devido a expressão do transgene embrionário. Estes ratinhos revelam destabilização de β-cateína e hiperfosforilação de tau nos neurónios do hipocampo, esta úiltima dando origem a uma localização somatodendrítica semelhante a um pré-emaranhamento de tau. Neurónios apresentando localização somatodendrítica de tau revelam frequentemente morfologias anormais e separação do neuropil circundante. A astrocitose e a microgliose reactivas foram indicativas de stress neuronal e morte. Este achado foi ainda confirmado por coloração TUNEL de células granulosas de giro dentado. A sobreexpressão de 6εκ-3β no córtex e no hipocampo leva a níveis mais baixos de β-catenina nuclear, forforilação aumentada de tau em epítopos relevantes, morte da célula neuronal, e astrocitose reactiva e microgliose. Assim os nossos resultados demonstram que a sobre expressão in vivo 9 ΕΡ1280404 de GSK-3P dá origem a neurodegenerescência e sugere que estes ratinhos podem ser usados como um modelo animal para o estudo da relevância da desregulação de GSK-3P em relação à patogénese da doença de Alzheimer.

EXEMPLO 0 presente invento é ainda ilustrado pelo exemplo que se segue do nosso trabalho experimental.

PRODUÇÃO DE FRAGMENTO PARA INJECÇÃO

Um fragmento 8.0 kb Ase I (BitetO) foi usado para microinjecção. Para a produção de BitetO, um fragmento de 1.5 kb Hind III correspondendo a Xenopus GSK-3B cDNA com um epitopo MYC foi excisado a partir de um plasmódio pcDNA3-GSK3 (Sanchez et al., 2000) . Este fragmento foi subclonado no vector de clonagem pCRII (Invitrogen) digerido com HindIII. A orientação correcta foi testada quanto a digestão Xho I. Um fragmento de 1,5 kb foi então excisado por digestão Nsi I-Not I e foi subclonado para os sítios Pst I-Not I de um plasmídeo contendo uma sequência teto bidi-reccional flanqueada por promotores mínimos de citomega-lovírus (CMV) com sequências repórter LacZ (pBI-3, (Baron et al., 1995)). Por último, o fragmento 8,0 kb Ase I BitetO foi microinjectado em embriões de células únicas CBAxC57BL/6. Ratinhos fundadores foram identificados por PCR e foram confirmados por análise Southern. Ratinhos fundadores foram então cruzados com ratinhos selvagens do 10 ΕΡ1280404 tipo CBAxC57BL/6 e análise Southern foi realizada em progenitura F1 para testar múltiplos eventos de inserção do fragmento para microinjecção. Todos os ratinhos aqui referidos resultaram de um único evento de integração (dados não apresentados).

TRANSFECÇÕES DE CÉLULAS COS Células COS-7 foram mantidas em meio essencial modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco BRL) suplementado com soro bovino fetal a 10% (v/v), glutamina 2 mM, 100 unidades de ml-1 de penicilina e 100 pg ml-1 de estreptomicina e foram incubadas em 95% de ar/5% de C02 num incubador humidificado a 37° C. Células com uma confluência de 50-70% em placas com 35 mm de diâmetro foram transfectadas de um modo transitório com LipofectAMINE (Gibco BRL)/5 pg de DNA de acordo com as recomendações dos fabricantes. As células foram recolhidas e analisadas 48 horas após a transfecção.

ANIMAIS

Ratinhos foram criados no campo animal Centro de Biologia Animal "Severo Ochoa". Os ratinhos foram alojados 4 por gaiola com alimento e água disponível ad libitum e foram mantidos num ambiente controlado pela temperatura num ciclo de luz-escuridão de 12/12 horas com início da luz às 07:00 horas. 11 ΕΡ1280404

ANTICORPOS

Foram usados os anticorpos anti-tau que se seguem: 7,51 (Novak et ai., 1991) (uma gentil oferta do Dr. C. Wischik, MRC, Cambridge, UK) , PHF-1 (Greenberg et ai., 1992; Otvos et ai., 1994; ) (uma gentil oferta do Dr . P. Davies, Albert Einstein Coll., Bronx, NY, USA) , 12ES (Seubert et ai., 1995) (uma gentil oferta do Dr . P. Seubert, Athena, San Francisco, CA, USA) , AD2 (Buee- Scherrer et al., 1996) (uma gentil oferta do Dr. C. Mourton- Gilles, Montpellier, France). De acordo com a numeração residual do isoform tau humano mais longo de 441 amino ácidos (Goedert et ai., 1989), anticorpo 12E8 reage com tau quando a serina 262 é fosforilada (Seubert et ai., 1995). Anticorpos PHF-1 e AD2 reconhecem tau quando serinas 396 e 404 são fosforilados (Bruce-Scherrer et ai.,, 1996; Otvos et ai.,, 1994). Outros anticorpos monoclonais foram: anti-GSK3-p (Transduction Laboratories), antί-β-catenina (Transduction Laboratories), antί-β-tubulina (Sigma), anti-β-galactosidase (Promega), anti-myc (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa, USA), anti-GFAP (PharMingen, CA, USA), 0X42 (uma gentil oferta da Dra. P. Bovolenta, Instituto Cajal, Spain), EDI (Serotec; UK) . O anticorpo criado contra a proteína nuclear U"snRNP foi gentilmente doada pelo Dr. J. Ortin (CNB, Madrid, Spain).

IMUNO-HISTOQUÍMICA

Ratinhos foram submetidos a uma anestesia profunda com pentotal e a perfusao transcardíaca com 4% de 12 ΕΡ1280404 paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M durante 10 minutos. Os cérebros foram posteriormente fixados em 4% de paraformaldeído durante duas horas à temperatura ambiente e colocados em 30% de sacarose em PBS durante 48 horas a 4o C. Cortes sagitais (30 pm) foram realizados num micrómetro de congelação e foram recolhidos em PBS. Cortes flutuando livremente foram previamente tratados com 0,3% de H2O2 em PBS e foram incubados durante a noite a 4o C com anticorpos primários: PHF-1 (1/150), AD-2 (1/2000), anti-myc (1/20), anti-GSK-3-β (1/500), anti-p-galactosidase (1/5000), anti-GFAP (1/250), 0X42 (1/1000) em PBS contendo 0,2% de Triton X-100, soro normal de cabra (GmCO) a 10% e 1% de BSA (Boehringer-Mannheim). A seguir a três lavagens com PBS, foram realizados cortes através de protocolos padrão imuno-histoquímicos avidin-biotin usando um estojo ("kit") Elite Vectastain (Vector Laboratories). A reacção com cromogénio foi realizada com diaminobenzidina (Sigma) e 0,003% de H2O2 durante dez minutos. Os cortes foram montados em lâminas revestidas com "chromalum" e cobertas com lamelas cobre-objecto com Aqua-PolyMount (Polysciences). A omissão do anticorpo primário deu origem a ausência de rotulagem. COLORAÇÃO LaCz

Mannheim) A coloração LacZ foi realizada como se segue. Cortes frescos congelados foram posteriormente fixados durante 10 minutos em 4% de paraformaldeído em tampão Soren. Lâminas foram então incubadas durante 1 hora a 30° C em solução de coloração lacZ (1 mg/ml X-gal (4-cloro-5-bromo-3-indolil-p-galactosidase, Boehringer 13 ΕΡ1280404 ferrrocianeto de potássio 5 mM, ferricianeto de potássio 5 mM e MgCÍ2 2 mM em PBS) . Após coloração, cortes foram lavados e montados a seco.

Ensaio TUNEL A fragmentação de DNA caracteristica da apoptose foi detectada pelo método TUNEL em cérebros posteriormente fixados em paraformaldeido. A coloração TUNEL de cortes vibratome foi realizada seguindo instruções dos fabricantes (In situ Cell Death Detection, POD; Boehringer Mannheim). Tratamento com Dnase foi usado como um controlo positivo.

FRACCIONAMENTO SUBCELULAR

Para preparar membrana e extractos citosólicos, tecidos foram lavados com solução salina fria tamponada com fosfato e homogeneizados num tampão hipotónico (sacarose 0,25 M, HEPES 20 mM pH 7,4, EGTA 2 mM, PMSF 1 mM, 10 yg/ml de aprotinin, 10 pg/ml de leupeptina e 10 pg/ml de pepsta-tina). O homogenato (Fracção celular total) foi clarificado por centrifugação a 850 x g durante 15 minutos a 4o C; o produto flutuante resultante foi então centrifugado a 100.000 x g durante 1 hora a 4o C para isolar a fracção membranar sob a forma de uma pílula e a fracção citoplas-mática sob a forma do produto flutuante.

Os núcleos do cérebro foram sedimentados através de uma almofada (camada) de sacarose 2 M. Áreas cerebrais a 14 ΕΡ1280404 partir de três animais foram homogeneizadas em sacarose 0,32 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,4, MgCl2 3 mM, DTT 1 mM, 0,1% Triton X-100, 10 pg/ml de aprotinina, 10 pg/ml de leupe-ptina e 10 yg/ml de pepstatina usando um homogeneizador Potter proporcionado com um pilão Teflon aplicado de uma forma folgada. O homogenato foi filtrado através de tala-garça e centrifugado durante 10 minutos a 1.000 x g. A pilula foi suspensa de novo em 3 ml de meio de homogeneização sem Triton e suplementado com sacarose 1,9 Μ. A preparação foi disposta em camada sobre uma almofada (camada) de sacarose 2M (10 ml) e foi centrifugada a 12.000 x g num rotor HB4 (Sorvall). A pilula foi suspensa de novo em 0,5 ml de sacarose 0,32 Μ. A pureza dos núcleos do cérebro foi avaliada por microscopia óptica após coloração com violeta cristal. Além disso, U2snRNP, uma proteína nuclear conhecida, foi usada como um marcador nuclear em análise de mancha Western.

ANÁLISE DE MANCHA WESTERN Cérebros foram rapidamente dissecados sobre uma placa arrefecida com gelo. Extractos para análise de mancha Western foram preparados por homogeneização de áreas cerebrais em tampão de extracção com arrefecimento com gelo de HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, NaP 20 mM, 1% Triton X-100, ortovanadato de sódio 1 mM, EDTA 5 mM, e inibidores da protease (PMSF 2 mM, 10 pg/ml de aprotinin, 10 pg/ml de leupeptin e 10 yg/ml de pepstatin). As amostras foram homogeneizadas e centrifugadas a 15.000 g durante 20 15 ΕΡ1280404 minutos a 4o C. O produto flutuante resultante foi recolhido, e o conteúdo proteico foi determinado por Bradford. Trinta microgramas de proteína total foram submetidos a electroforese sobre gel dodecil sulfato-poliacrilamida de sódio a 10% e trnsferidos para uma membrana de nitro-celulose (Schleicher and Schuell). As experimentações foram realizadas usando os anticorpos monoclonais primários que se seguem: anti- GSK3P (1/2000), PHF-1 (1/200), AD2 (1/2000), 12E8 (1/200), 7,51 (1/100), anti-MYC (1/100) anti-ptubulina (1/5000), anti-p-galactosidase (1/5000). Os filtros foram incubados com o anticorpo a 4o C durante a noite em leite seco não gordo a 5%. Um anticorpo secundário de cabra anti-ratinho (1/5000; Gmco) e reagentes de detecção ECL (Amersham) foram usados para imunodetecção. A quantificação da imunoreactividade foi realizada por avaliação densitométrica. A análise estatística foi realizada usando teste t de Student.

PROCESSAMENTO DE TECIDO PARA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Para microscopia electrónica, foram usados cortes vibratome. Uma vez imunocorados, os cortes foram posterior-mente fixados em 0s04 a 2% durante 1 hora, desidratados, embutidos em araldite e montados de uma forma plana em lâminas revestidas com Formvar, usando lamelas cobre-objecto de plástico. Após polimerização, áreas selecciona-das foram fotografadas, montadas, embutidas de novo em araldite e seccionadas de novo a 1 pm. Estes cortes semí-delgados foram fotografados de novo e reseccionados em 16 ΕΡ1280404 cortes ultradelgados. Os cortes ultradelgados foram observados num microscópio electrónico Jeol, sem coloração com metal pesado a fim de evitar precipitados artifactuais.

FIGURAS

Figura 1. Esquema de ratinho. A, representação esquemática da idealização BitetO. Isto consiste em sete cópias de sequência operadora tet palindrómica flanqueada por duas sequências promotoras de CMV em orientações divergentes. Este promotor bi-direccional é seguido por uma sequência GSK-3P cDNA (codificando um epitopoMYC na sua extremidade 5') em uma direcção e sequência β-galactosidase (LacZ) incluindo um sinal de localização nuclear (NLS) na outra. B, células COS foram co-transfectadas com o plasmídeo contendo a idealização BitetO e um vector de expressão codificando tau humano (veredas 1 a 6), um terceiro plasmideo que permite expressão de tTA foi adicionado (veredas 3 a 6) quer na ausência (veredas 3 e 4) ou na presença (veredas 5 e 6) de 1 pg/ml de tetraciclina no meio de cultura. Extractos proteicos foram explorados com anticorpos contra GSK-3P, tau fosforilado como-AD (PHF-1), tau total (7,51) e β-galactosidase (β-Gal). C, Ratinhos ΤεΡ/03Κ-3β são produzidos cruzando ratinhos que expressam tTA sob controlo do promotor CarnKIIa (tTA) com ratinhos que tenham incorporado a idealização BitetO no seu genoma (TetO). Espera-se que a progenitura transgénica dupla (Tet/ GSK^) expresse ΰ3Κ-3β de um modo constitutivo no cérebro a não ser que tetraciclina ou análogos sejam administrados 17 ΕΡ1280404 por via oral prevenindo desse modo a transactivação por tT A.

Figura 2. Padrão de expressão de transgene em ratinhos Tet/ GSK-3p. A-B, coloração X-gal de cortes sagitais do cérebro a partir de ratinhos PO Tet/ GSK-3P que eram ou naturais (sem terem recebido droga) (A) ou que tinham nascido depois de se ter administrado doxiciclina à mãe durante cinco dias imediatamente antes do nascimento (B),C-E, imuno-histoquimica com β-galactosidase em cortes sagitais de cérebro de ratinhos adultos (3 meses) Tet- GSK-3P revela expressão nas diferentes camadas neuronais do córtex (C), o hipocampo (D) , e no corpo estriado (E) . H, hipiocampo, Cx, córtex; St, corpo estriado; 11-VI, camadas corticais; cc, corpo caloso; DG, giro dentado; Hil, hillus; GP, globus pallidus. Haste na escala em B corresponde a 1 mm em A-B. A haste na escala em E corresponde a 200 pm em C-E.

Figura 3. Sobreexpressão de GSK-3B em córtex e hipocampo de ratinhos Tet/GSK-3B. A, mancha Western de extractos de proteína a partir de córtex (veredas 1 e 2), cerebelo (veredas 3 e 4), e hipocampo (veredas 5 e 6) do tipo selvagem (veredas 1, 3, e 5) ou ratinhos Tet- GSK-3P (veredas 2, 4, e 6). B, histograma revelando aumento percentual de níveis de GSK-3P em ratinhos Tet/GSK-3p. C-E, imuno-histoquímica em cortes corticais de ratinhos do tipo selvagem © ou de ratinhos Tet/GSK-3P (D e E); realizada com anticorpos contra GSK-3B (C e D) ou MYC (E) . F-H, imuno-histoquímica em cortes do hipocampo de ratinhos do tipo selvagem (F) ou 18 ΕΡ1280404 de ratinhos Tet/GSK-3P (G e H); realizada com um anticorpo contra GSK-3P (F e G) ou MYC (H) . I-K, ampliação elevada dos dentate gyri apresentada em F-H. A haste da escala corresponde a 100 pm em C-E, 200 pm em F-H, 60 pm em I-I, e 40 pm em K.

Figura 4. Efeito de sobreexpressão de GSK- 3β sobre níveis de β-carenina e de fosforilação de tau. A, mancha Western de preparações totais celulares, de membrana, citosólicas e nucleares a partir de córtex (Cx) e hipocampo (Hipp) de ratinhos do tipo selvagem (Wt) ou de ratinhos Τθ^63Κ-3β (TG) testados com anticorpo anti^-catenina. B, mancha Western de extractos de proteína a partir do córtex (Cx) , cerebelo (Cb), e hipocampo (Hipp) de ratinhos do tipo selvagem (Wt) ou de ratinhos Τοί/63Κ-3β (TG) testados com anticorpos PHF-I e β-Tubulin. C, mancha Western de extractos do hipocampo a partir de ratinhos do tipo selvagem (Wt), tTA, TetO, ou Τε0/03Κ-3β testados com os anticorpos indicados.

Figura 5. Localização somatodendrítica de tau em ratinhos Tet/ GSK- 3β · A-D, imuno-histoquímica PHF-1 no giro dentado de ratinhos do tipo selvagem (A e B) ou Tet/ GSK- 3β (C e D). E-F, imuno-histoquímica realizada com anticorpo 7.51 no giro dentado de ratinhos do tipo selvagem (E) ou Τβό/ΰ3Κ-3β (F) . Seta em B indica fibras musgosas fracamente coradas. Inserção em C revela uma maior amplificação de uma célula com grânulos imunocorada PHF-1. A haste da escala corresponde a 200 pm em A-D, e 60 pm em E-F. 19 ΕΡ1280404

Figura 6. Estudo com microscopia electrónica de neurónios positivos PHF-1. A, Micrografia electrónica de dois neurónios do giro dentado do hipocampo de ratinhos Tet/ GSK-3p. NI: Núcleo de um neurónio imunopositivo PHF-1 apresentando a maior parte do seu perímetro separado do neuropil envolvente (pontas de seta), além de imunoco-loração citoplásmica diffil se. N2: núcleo de um neurónio imunonegativo PHF-1. B, outro neurónio imunopositivo PHF-1 a partir de giro dentado do mesmo ratinho de 4A apresentando produto de reacção de PHF-1 em manchas e associado com retículo endoplásmico rugoso. N: núcleo não etiquetado. C, Ampliação elevada da porção enquadrada na figura 4B, revelando as manchas do produto da reacção (setas) e a marcação do retículo endoplásmico rugoso. Não foi realizada qualquer coloração com metal pesado. A haste de calibração corresponde a 0,5 pm em todos os painéis.

Figura 7. Morte neuronal e gliose reactiva em ratinhos Tet/ GSK-3p. A-B, coloração TUNEL do giro dentado de ratinhos do tipo selvagem (A) ou Tet/GSK-3P (B). Setas indicam núcleos TUNEL positivos. C-D, imuno-histoquímica GFAP no giro dentado de ratinhos do tipo selvagem (C) ou Tet/GSK-3P (D). E, micrografia electrónica do giro dentado de hipocampo de ratinhos Tet/GSK-3P revelando um processo astrocítico hipertrófico circundando um neurónio imunocorado. N: núcleo. Asterisco: imunocoloração citoplásmica difusa. Estrela preta: processo astrocítico hipertrófico. Inserção: ampliação elevada do processo astrocítico revelando feixes 20 ΕΡ1280404 característicos de filamentos intermediários gliais. F, imunocoloração OX-42 do giro dentado de um ratinho Tet/ GSK-3p. Setas indicam processos microgliais imunoreactivos finos. SM, stratum moleculare; SG stratum granulare; H, hillus. Hastes da escala correspondem a 50 pm em A-B, 60 pm em C-D, 0,5 pm em E, e 30 pm em F.

IDEALIZAÇÃO DE RATINHO

Gerámos um plasmideo (Biteto) transportando o promotor respondendo a tet bi-direccional (Baron et al., 1995) seguido por um GSK-3P cDNA (codificando um epitopo MYC no seu terminus 5') numa direcção e, na outra direcção, um cDNA codificando β-galactosidase (β-gal) reunido com um sinal de locaçização nuclear (Figura IA) . Este plasmideo foi ensaiado em experimentações de transfecção realizadas em células COS (Figura 1B) . Este plasmideo em si mesmo ou cotransfectado com um vector de expressão codificando para tau (Figura 1B, veredas 1 e 2) não teve efeito sobre níveis de 6εκ-3β tal como é evidenciado por mancha Western com um anticorpo contra ΰ3Κ-3β. Quando cotransfectado com um plasmideo que permita expressão de tTA (Figura 1B, veredas 3 e 4) foi evidente um aumento acentuado em níveis de GSK-3β. Isto originou um aumento da fosforilaçao de tau tal como é evidenciado por mancha Western com o anticorpo PHF-1 que reconhece um epitopo de fosforilação de tau PHF. Quando estava presente tetraciclina (Figura 1B, veredas 5 e 6), foi abolida trans activação de 03Κ-3β. Estas experimentações demonstram assim expressão condicional de ΰ3Κ-3β a partir da idealização BitetO (Figura IA). 21 ΕΡ1280404 A idealização BitetO foi então microinjectada em oocitos e as cinco linhagens resultantes de ratinho transgénico foram genericamente designadas TetO (figura 1C). Nas linhagens de ratinho tTA, o transgene tT A encontra-se sob o controlo do promotor lia de Calciumcalmodulin kinase (linhagens CamKIIa-tTA E e B) (Mayford et al., 1996). Estas linhagens tTA foram escolhidas para permitirem expressão condicional, restringida, no SNC, com expressão particularmente elevada no cérebro anterior (Mayford et al., 1996; Yamamoto et al., 2000) . Quando os ratinhos TetO são cruzados com ratinhos tTA, espera-se que a progenitura transgénica dupla (designada Tet/ GSK-3P) expresse de um modo constitutivo ambos os transgenes (Figura 1 C) . Esta expressão pode contudo ser abolida na presença de tetraciclina ou de seus análogos. A nossa experiência anterior na geração de ratinhos transgénicos condicionaios com o sistema tet-regulado indica que o sitio genómico de inserção e/ou número de cópia da idealização de teto influencia o padrão final e nivel de transactivação por tTA. A sequência repórter β-Gal na idealização BitetO permite uma análise rápida do padrão de expressão do transgene nos ratinhos transgénicos duplos quer por coloração X-Gal quer por imuno-histoquímica contra β-Gal, e além disso, permite testar a eficácia de reduzir ao silêncio o transgene por meio de tetraciclina. Tirámos vantagem deste facto para 22 ΕΡ1280404 decidir quais as linhagens de ratinhos TetO eram mais apropriadas para o nosso estudo. CARACTERIZAÇÃO DE DIFERENTES LINHAGENS DE RATINHOS TET/ GSK-3p

Quando as cinco linhagens TetO foram procriadas com linhagens tTA, três delas apresentaram expressão β-Gal apenas no corpo estriado (dados não apresentados). As duas linhagens TetO restantes (linhagens G6 e G7) foram especialmente apropriadas para o nosso estudo visto apresentarem níveis elevados de expressão de transgene em regiões do cérebro relevantes para AD tais como o córtex e o hipocampo e assim focámos o resto do estudo nas linhagens G6 e G7. Estas duas linhagens transactivam β-Gal num padrão espacial muito semelhante ao de CamKIIca, com expressão evidente no córtex, hipocampo, corpo estriado e amígdala (Figura 2) . A imuno-histoquímica em cortes de cérebro de ratinhos adultos Τθί/63Κ-3β revela expressão β-Gal nas diferentes camadas neuronais do córtex, nos diferentes campos do hipocampo (incluindo subículo, CAI, CA2, CA3, e giro dentado), e mo corpo estriado 1 .1 (figura 2C-E). Não se detectou qualquer expressão β-Gal noutras regiões do cérebro tais como globus pallidus, thalamus, tonco cerebral e cerebelo (Figura 2A, 2E, 3A, e não apresentadas) . Um padrão e nível semelhantes de expressão transgénica foram obtidos quando a linhagem CamKIIa-tTA (E ou B) foi combinada uma linhagem TetO (G6 ou G7). Neste estudo usámos cada combinação de um modo permutável e assim de aqui em 23 ΕΡ1280404 diante iremos usar os termos tTA e TetO para ratinhos transgénicos simples, e Tet/GSK-3B para os animais transgénicos duplos.

Ratinhos Tet/GSK-3B foram viáveis e férteis e pareceram normais sem intervenção farmacológica para suprimir expressão de transgene. Isto pareceu contradizer a toxicidade previamente postulada de expressão aumentada de GSK-3P no cérebro (Brownlees et al., 1997). Contudo, cruzamentos heterozigotos entre ratinhos tTA e TetO não produziram a frequência esperada de 25% para cada genotipo (tipo selvagem, tTA, TetO, e Tet/ GSK-3P). Os ratinhos Tet/ GSK-3P foram subrepresentados (14%, n = 401). Isto poderá ser indicativo de letalidade devida a sobreexpressão embrionária de GSK-3P em ratinhos Tet/GSK- 3β.

Observámos anteriormente expressão de transgene perinatal e letalidade no nosso modelo animal guiado por CamKIIa-tTA da doença de Huntington (HD94) (Yamamoto et al., 2000). No caso de ratinhos HD94, se os ratinhos grávidos receberem o análogo da tetraciclina doxiciclina (2 mg/ml) na água para beber ad libitum de E15 até ao nascimento, apenas tem lugar expressão transgénica pósnatal e a frequência dos quatro genotipos esperados é restaurada até 25%. Decidimos assim aplicar o mesmo programa de tratamento perinatal com doxiciclina aos ratinhos Tet/GSK-3B. Verificámos que em PO, ratinhos não tratados apresentam coloração X-gal no cérebro anterior enquanto que a coloração está ausente em ratinhos tratados (Fig. 2A e B) . 24 ΕΡ1280404

Isto demonstra que a expressão de transgene em ratinhos Tet/GSK-3P se inicia durante a vida embrionária e que pode ser inibida com doxiciclina. Como seria de esperar, o tratamento prenatal com doxiciclina normalizou até 25% a frequência dos ratinhos Tet/GSK-3P e assim, para maximizar a produção de ratinhos transgénicos duplos em ninhadas, o tratamento perinatal com doxiciclina foi utilizado de um modo rotineiro.

Ratinhos Tet/GSK-3P que sobreexpressam GSK-3P no córtex e hipocampo. Confirmámos então por análise com mancha Western que as regiões do cérebro que apresentam expressão p-Gal também apresentam niveis aumentados de GSK-3p. Extractos de proteína examinados com um anticorpo anti-MYC demonstraram que o nível mais elevado de expressão transgénica de GSK- 3P tem lugar no hipocampo, seguido pelo córtex (Figura 3A) enquanto que pouca expressão pode ser detectada no corpo estriado (não apresentado). Consequentemente, examinando extractos de ratinhos com 3 meses de idade com um anticorpo criado contra GSK-3P (Figura 3A e B) observámos um aumento significativo (p<0,02) 40 +/-12,4% em níveis de GSK-3P no hipocampo de ratinhos tet/ GSK-3P no que se refere aos ratinhos do tipo selvagem. Extractos corticais também revelaram níveis aumentados (17 +/ -5%) de GSK-3P em ratinhos Tet/GSK-3p. Não se verificaram diferenças nos níveis de GSK-3P no corpo estriado (não apresentado) ou em regiões não cérebro anterior tais como o cerebelo (Figura 3B) . Monitorizámos então em idades variando entre 1 e 12 meses o aumento em 25 ΕΡ1280404 GSK-3P que tem lugar no hipocampo e no córtex de ratinhos Tet/GSK- 3β. O nível de sobreexpressao foi semelhante em todas as idades testadas (não apresentado) e as restantes experimentações no presente estudo foram realizadas em ratinhos adultos com idades entre os 2,5 e os 6 meses.

Para tornar claro quais as populações de células que apresentam sobreexpressão de GSK-3P, realizámos imuno-histoquímica com anticorpos anti-MYC e anti- GSK-3P· No córtex, imunoreactividade (IR) para GSK-3P foi encontrada na camada II e III de neurónios do córtex piramidal (Fira 3C-E) e em neurónios da lâmina VI adjacente ao corpo caloso (não apresentado).

No hipocampo, a sobreexpressão de GSK- 3P foi evidente em todas as regiões (subículo, CAI, CA2, CA3, e giro dentado) com o giro dentado e CA2 apresentando o aumento mais prevalente (Figura 3F-H). O giro dentado de ratinhos do tipo selvagem revelou IR muito fraca em relação a GSK-3P (figura 3F e 31) enquanto que todos os neurónios no giro dentado de ratinhos Tet/ GSK-3P sobreexpressaram GSK-3P (Figura 3G e 31) . Alguns destes neurónios revelaram uma coloração notavelmente elevada com anticorpos tanto anti- GSK-3P como amti-MYC (Figura 31-K) e apresentaram frequentemente morfologias anormais tais como corpos celulares encolhidos (não apresentados). Em neurónios piramidais CA2, foi observada uma coloração proeminente tanto em corpos celulares como em dendritos em ratinhos Tet/GSK-3P (Figura 3G-H). 26 ΕΡ1280404

Em seguida analisámos por mancha Western, o efeito da sobreexpressão de GSK- 3β sobre os seus substratos relacionados com AD β-catenina e tau. β-catenina é um componente de junções que aderem célula-célula mas também se associa com factores de transcrição HMG-box da família Tcf/LEF e promove transcrição de genes alvo. 63Κ-3β é o enzima chave que regula a estabilização de β-catenina e subsequente translocação nuclear (Anderton, 1999; Barth et al., 1997).

Em primeiro lugar analisámos os níveis de β-catenina em extractos totais de córtex e de hipocampo (Figura 4A) . Não se verificaram diferenças entre ratinhos do tipo selvagem e Τε^63Κ-3β. Analisámos então níveis de β-catenina em diferentes compartimentos celulares. Como se pode observar na Figura 4A, não se observaram modificações nos níveis de β-catenina em extractos de membrana ou citosólicos tanto do córtex como do hipocampo. Quando foram analisados extractos nucleares, não foram observadas diferenças significativas nos níveis de β-catenina no córtex. Contudo, no hipocampo, observámos uma redução significativa (p<0,05, n=6) 35 +/- 8% nos níveis de β-catenina nuclear de ratinhos Tet/GSK-3~ em comparação com membros da ninhada do tipo selvagem. Esta diminuição na β-catenina nuclear foi também evidente por microscopia imuno-electrónica no giro dentado de ratinhos Τθ^Θ3Κ-3β (não apresentados). 27 ΕΡ1280404

Em seguida realizámos manchas Western com anticorpos tau nas regiões do cérebro que apresentam expressão MYC (córtex, corpo estriado, e hipocampo) assim como no cerebelo. Apenas o hipocampo revelou níveis aumentados de fosforilação de tau tal como foi detectado pelo anticorpo PHF-1 (Figura 4B e não apresentadas). 0 aumento em fosforilação semelhante à de AD de tau detectado com o anticorpo PHF-1 foi reproduzido usando o anticorpo AD2 criado contra o mesmo fosfoepitopo de tau (Figura 4C). 0 aumento em PHF-1 e AD2 IR em ratinhos Tet/GSK-3P não é devido a níveis alterados de tau total visto não se ter observado aumento com a fosforilação do anticorpo tau independente 7.51 que reconhece todas as isoformas de tau. Além disso, a fosforilação em serina 262 que não é adjacente a um resíduo prolina e que tenha revelado ser independente de GSK-3p in vivo (Munoz-Montano et al., 1997) não é afectada em ratinhos Tet/ GSK-3P tal como foi detectado pelo anticorpo 12E8 (Figura 4C).

Comparámos a fosforilação de tau e a expressão de proteína transgénica nos quatro genotipos possíveis (tipo selvagem, tTA, TetO, e Tet/GSK-3~) (Figura 4C) . Apenas ratinhos Tet/GSK-3P revelaram expressão P-Gal e níveis aumentados de GSK-3P, e PHF-1 e tau AD2, demonstrando assim que expressão transgénica e subsequentes efeitos em ratinhos Tet/GSK-3P foram devidos a transactivação por tTA da idealização BitetO e não foram devidos a dispersão do último nos ratinhos TetO. 28 ΕΡ1280404

LOCALIZAÇÃO SOMATODENDRÍTICA DE TAU HIPERFOSFORILADO AFIM DE AD

Analisámos por meio de imuno-histoquímica quais as populações neuronais do hipocampo exibem o aumento em PHF-1 IR observado por mancha Western. PHF-1 aumentado, a imunocoloração foi mais evidente no giro dentado (figura 5). Nos ratinhos do tipo selvagem, células com grânulos do giro dentado apresentam PHF-1 IR não detectáveis (Figura SA) , embora pudesse ser detectada alguma coloração nas fibras musgosas projectando-se para CA3 (Figura 5B). Ratinhos Tet/GSK-3B revelam um aumento acentuado na coloração de fibras musgosas (Figura 5D) e, de um modo interessante, a maior parte das células granulosas revelam imunocoloração forte de PHF-1 somatodendritico, assemelhando-se assim a um estádio anterior a emaranhamento de degenerescência neurofibrilar de AD (Figura 5C). A fosforilação de tau por Θ3Κ-3β diminui a afinidade de tau para microtubulos in vitro e em células transfectadas (Lovestone et al., 1996). Isto pode explicar em parte a coloração somatodendritica encontrada com o anticorpo PHF-1. Para testar isto, realizámos imuno-histoquímica com 7.51, um anticorpo criado contra o dominio de ligação de tubulina de tau e isso reconhece assim apenas tau quando não esteja ligado a microtubulos. De um modo interessante, os somas corados de anticorpo 7.51 de Tet/GSK-3P mas não células granulares do giro dentado do tipo selvagem (Figura 5F) . A morfologia de células coradas 29 ΕΡ1280404 7.51 foi muito semelhante ao observado com anticorpo PHF-1 (ver inserção na Figura 5C).

Imunocoloração somatodendrítica forte de tau hiperfosforilado pode também ser indicativo de formas agregadas aberrantes de tau tais como PHFs. Coloração com tioflavina-S em cérebros com AD revela tanto emaranhados neurofibrilares como placas amilóides. Realizámos assim coloração com Tioflavina-S em cortes de cérebro de ratinhos Tet/GSK-3p. Não se detectou fluorescência de Tioflavina-S, quer em células granulares do giro dentado quer em qualquer outra região do cérebro, indicando a ausência de emaranhados de PHF e de agregados de proteína de folhas β. A falta de fluorescência de Tioflavina-S poderia ainda ser compatível com a existência de alguns, PHFs curtos, representando assim passos iniciais de degenerescência neuro-fibrilar.

Para analisar esta possibilidade, estudámos então por microscopia electrónica células granulares Tet/GSK-3p visto elas revelarem imunomarcação somatodendrítica forte para PHF-1. Um produto de reacção difuso estava presente no pericário destes neurónios (Figura 6A-C), embora nalguns casos tenhamos também observado manchas de produto de reacção escuro (Figura 6C) . Contudo, PHFs não foram observados quer nas manchas de produto de reacção escuro quer noutra porção do citoplasma imunomarcado difuso. De um modo interessante, material imunomarcado foi frequentemente observado juntamente com a fase citoplásmica das cisternas 30 ΕΡ1280404 do retículo endoplásmico rugoso (RER), e as manchas coradas escuras acima mencionadas foram, nalgumas ocasiões, numa intima proximidade destas cisternas RER marcadas (Fig. 6C). De um modo interessante, neurónios Tet/GSK-3P com marcação citoplásmica PHF-1 difusa apareceram frequentemente separados do neuropil circundante, revelando um espaço extracelular alargado ao longo da maior parte da sua periferia (Fig. 6A) enquanto que neurónios não marcados não revelaram qualquer separação. Também não observámos qualquer separação de neurónios de células granulares de ratinhos do tipo selvagem.

MORTE DE CÉLULAS NEURONAIS E GLIOSE REACTIVA NO HIPOCAMPO

DE RATINHOS TET/GSK-3P

Estudos anteriores demonstraram que GSK-3B é inibido pela via de sobrevivência de PI 3-kinase/PKB que evita apoptose (Cross et al., 1995; Cross et al., 1994;

Hurel et al.,1996; Saito et al., 1994). Isto, juntamente com a observação de que a destabilização de β-catenina por mutações em PS-1 potenciam apoptose neuronal (Zhang et al., 1998), levaram-nos a explorar se a apoptose estava a ter lugar em ratinhos Tet/GSK-3P como uma consequência da sobreexpressão de GSK-3P.

Populações neuronais diferentes de ratinhos Tet/ GSK-3P revelaram marcação TUNEL que estava ausente em ratinhos do tipo selvagem. Isto foi observado principalmente nas células granulares do giro dentado (até 5 células 31 ΕΡ1280404 granulares marcadas por corte de 30 pm de giro dentado Tet/ GSK-3P versus nenhuma marcação em giro dentado do tipo selvagem. (Figura 4A e B) . Algumas células positivas TUNEL foram também observadas adjacentes ao corpo calosona lamina cortical VI de ratinhos Tet/GSK-3P (não apresentadas).

Em seguida testaram se as alterações neuronais e/ou morte desencadeadas por sobreexpressão de GSK-3P em ratinhos Tet/GSK- 3β eram acompanhadas por alterações gliais tais como astrocitose reactiva e microgliose. A imuno-histoquímica realizada com um anticorpo criado contra proteína acídica fibrilarmente glial (GF AP) revelou astrocitose reactiva em diferentes regiões do cérebro. Coincidente com marcação TUNEL, coloração GF AP foi mais prevalente no giro dentado e em camadas corticais profundas (Figura 7C e D, e não apresentadas). Estudos de microscopia electrónica confirmaram a presença de processos astro-cíticos altamente activados, cheios de filamentos intermediários gliais, no giro dentado dos ratinhos Tet/ GSK-3β.Estes foram frequentemente encontrados circundando neurónios PHF-1 IR (Fig. 7E).

Para testar se a microgliose estava a ter lugar no hipocampo de ratinhos Tet/GSK-3p realizámos imuno-histoquímica com 0X42, LN-3, e anticorpos EDI. Resultados semelhantes foram obtidos com todos estes três anticorpos (Figura 7F apresenta imuno-histoquímica OX-42). Quando comparados com os cortes do hipocampo do tipo selvagem, verificou-se um aumento em processos microgliais finos no 32 ΕΡ1280404 estrato granular de ratinhos Tet/GSK-3p. Além disso corpos celulares imunocorados correspondendo a microglia reactiva foram encontrados apenas em ratinhos Tet/GSK-3P, principalmente no estrato molecular do hipocampo (pontas de setas em 7F) .

DISCUSSÃO

Usando aqui uma abordagem transgénica condicional demonstramos que sobreexpressão in vivo de GSK-3P dá origem a neurodegenerescência. Ratinhos transgénicos condicionais que sobreexpressam GSK-3P também imitam diferentes aspectos bioquímicos e celulares de AD tais como destabilização de B-catenina e localização somatodendrítica semelhante à fase de préemaranhamento de tau hiperfosforilado. Os nossos resultados apoiam assim a hipótese de que a desregulação de GSK-3P possa constituir um evento crítico na patogénese de AD e levantam a possibilidade destes ratinhos poderem servir como um modelo animal útil para o estudo de alguns aspectos desta patologia. GSK-3P é activo durante o desenvolvimento animal como um componente do Wnt assinalando a via e desempenha um papel importante nas decisões sobre o destino celular e formção de padrão (Bourouis et al., 1990; Ruel et al.,1993; Siegfried et al.,1992; Siegfried et al.,1994). Consequentemente, foi sugerido que a capacidade do litio para inibir GSK-3P pudesse contribuir para os seus efeitos tera-togénicos (Klein and Melton, 1996; Stambolic et al., 1996). 33 ΕΡ1280404

Para além dos seus papeis bem estabelecidos no desenvolvimento precoce, verificou-se que a sinalização Wnt e GSK-3P participava na sinaptogénese pósnatal de células granulares de cerebelo (Hall et al., 2000; Lucas and Salinas, 1997). A toxicidade da sobreexpressão de GSK-3P durante o desenvolvimento embrionário e pósnatal do SNC pode explicar a razão pela qual Brownlees e colaboradores foram incapazes de produzir ratinhos transgénicos com sobreexpressão detectável de GSK-3P mesmo com promotores neuronais específicos. Isto induziu estes autores a sugerir a utilização de sistemas de expressão induzíveis firmemente controlados (Brownlees et al., 1997). No nosso caso, também verificámos que uma fracção de ratinhos transgénicos duplos morrem no período perinatal e que tal facto pode ser contornado ao silenciar-se a expressão do transgene durante a vida embrionária. Contudo, alguns ratinhos podem sobreviver sem intervenção farmacológica. Existem pelo menos duas razões pelas quais isso pode acontecer. Em primeiro lugar, o promotor que usamos (CamKIIa) apresenta um padrão mais restrito de expressão do que o que é utilizado por Brownlees e colaboradores (NF-L) . Em segundo lugar, no nosso sistema binário o transgene em si mesmo é silencioso. Isto evita a letalidade de fundadores devido à toxicidade do transgene. Criação (reprodução) subsequente com ratinhos tTA permite seleccionar estes descendentes transgénicos duplos com fundo agenético que permita sobreexpressão embrionária do transgene.

Acumulação somatodendrítica de tau hiperfos- 34 ΕΡ1280404 forilado constitui um evento precoce na evolução da degenerescência neurofibrilar da AD (Braak et al.,1994). A imunocoloração semelhante a pré-emaranhamento de tau é encontrado em ratinhos transgénicos que sobreexpressem diferentes isoformas de tau (Brion et al., 1999; Gotz et al., 1995; Ishihara et al., 1999; Spittaels et al., 1999). A localização somatodendritica de tau nestes ratinhos pode ser devida a saturação da capacidade de ligação de tau dos microtúbulos. 0 excesso de tau é então susceptível de se acumular no soma e sofrer ulterior modificação tal como fosforilação e modificações da conformação. Em ratinhos Tet/GSK-3p, a hiperfosforilação e a localização somatoden-drítica de tau tem lugar sem afectar o nível total de tau, e assim, numa maior semelhança com a situação encontrada em AD e outras taupatias. De acordo com o aumento na imunocoloração 7.51 encontrada em ratinhos Tet/GSK-3P e com estudos anteriores in vltro (Novak et al., 1991), a fosforilação tau aumentada em ratinhos Tet/GSK-3P leva muito provavelmente a uma diminuição da afinidade de tau em relação a microtubulos e subsequente acumulação da proteína no soma.

Verificamos que o tau somatodendrítico em ratinhos Tet/GSK-3P é frequentemente associado ao retículo endoplásmico. Verificaram-se resultados semelhantes em ratinhos transgénicos sobreexpressando o isoform de tau mais curto (Brion et al., 1999) e em carneiros (ovelhas) envelhecidos (Nelson et al., 1993). Em todos estes casos, a imunodetecção foi realizada com anticorpos que reconhecem 35 ΕΡ1280404 fosforilação ou epítopos de corformação emcontrados em PHF-tau. De um modo interessante, PHFs em cérebros de AD são frequentemente encontrados provenientes do reticulo endo-plásmico e de outras estruturas de membranas (Gray et al., 1987; Metuzales et al., 1988; Papasozomenos, 1989). É assim possível que, em modelos animais, a associação de tau com o retículo endoplásmico represente um estádio precoce na formação de lesões neurofobrilares. Uma explicação adcional e compatível para a associaçao de tau com o retículo endoplásmico poderá ser a sua interacção com PS-1. Veri- ficou-se que PS-1 se liga tanto a tau como a GSK-3P em experimentações de imunoprecipitação realizadas em extrac-tos de cérebro humano (Takashima et al.,1998), e PS-1 encontra-se localizado predominantemente no reticulo endoplásmico e no aparelho de Golgi (Selkoe, 1998). Vários mecanismos podem contribuir para o stress e morte neuronal (revelados por coloração de glia reactiva e TUNEL) detectados em ratinhos Tet/GSK-3p. Tendo em vista os efeitos da sobreexpressão de GSK-3P sobre a fosforilação e compartimentalização de tau, um mecanismo possível poderá ser a desorganização do citosqueleto do microtúbulo. Neste caso, como uma consequência de uma estabilização diminuída de microtúbulos por tau, uma diminuição no conteúdo em microtúbulos semelhante à encontrada em cérebros de AD (Terry, 1998) poderia ser esperada em ratinhos Tet/GSK-3p. Adicionalmente, GSK-3P é regulado de um modo negativo pela via de sobrevivência envolvendo PI-3 kinase (Cross et al., 1995; Cross et al., 1994; Hurel et al., 1996; Saito et al., 36 ΕΡ1280404 1994) e o desafio de neurónios corticais de cultura com retirada de factor trófico ou com inibidores da PI-3 kinase leva a estimulação de GSK- 3β o que leva a apoptose (Hetman et al., 2000; Pap and Cooper, 1998): Finalmente, transcrição mediada por β-catenina diminuída revelou potenciar apoptose neuronal em culturas neuronais primárias expostas a β-amilóide (Zhang et al., 1998) ou transfectadas com PS-1 mutante (Weihl et al1999). Pouco se sabe sobre os genes alvo transactivados pela β-catenina que são responsáveis pelo aumento de susceptibilidade à apoptose. Ratinhos Tet/GSK- 3β podem constituir um sistema útil para identificar esses genes por exposição diferencial ou por abordagens de micr-disposições de DNA.

Foram obtidos progressos substanciais durante alguns poucos anos anteriores em relação à produção de modelos de ratinho transgénico de AD, particularmente em relação à cascata tóxica de β-amilóide e formação de placa (Price and Sisodia, 1998) . Foram conseguidos aperfeiçoamentos sequenciais ao produzir ratinhos com níveis de expressão mais elevados de formas mutadas de APP e cruzando-os com ratinhos transgénicos PS-1 mutantes o que favorece o processamento de APP em Αβ42 (Guenette and Tanzi, 1999). Contudo, se a desregulação de 63Κ-3β constitui um evento chave na patogénese de AD, ratinhos Tet/GSK-3β podem constituir um modelo de AD alternativo e/ou complementar. A maior parte do esforço feito até à data em 37 ΕΡ1280404 modelos transgénicos de AD foi focado sobre a imitação dos pilares neuropatológicos de AD. Podem requerer modificações excessivamente artificiais para reproduzir durante o tempo de vida de um ratinho, algo que se forma durante muitos anos num ser humano. De um modo alternativo, pode simplesmente não ser possível imitar todos os aspectos da neuropa-tologia de AD em ratinhos visto tal requerer sequências humanas específicas (tal como acontece com toxicidade in vivo induzida por β-amilóide e por mutações de PS-1. Quando comparados com modelos de ratinho já existentes de AD, ratinhos Tet/GSK-3P são únicos pelo facto de reproduzirem disfunção intraneuronal a jusante (que vai decorrendo) a qual pode por último ser responsável por alguns aspectos de AD. Uma predição desta hipótese seria a de que níveis de GSK-3P (ou actividade) e substratos deveriam ser encontrados alterados em pacientes com AD. Já foi referida evidência a favor dela (Pei et al., 1999; Shiurba et al., 1996) . A neurodegenerescência em ratinhos Tet/GSK-3P está de acordo com o efeito neuroprotector de lítio, um inibidor de GSK-3P relativamente específico. Os efeitos neuroprotectores de lítio têm sido atribuídos à sua capacidade para inibir GSK-3P (Alvarez et al., 1999); Hetman et al., 2000) e para sobreregular Bcl-2 (Chen et al., 1999) e subregular proteínas Bax (Chen and Chuang, 1999) em neurónios (Revisto em Manji et al., 1999). Ratinhos Tet/GSK-3P constituem assim uma boa ferramenta para testar o efeito neuroprotector de inibidores específicos de GSK-3p prestes a aparecer. Além disso, a sua 38 ΕΡ1280404 eficácia pode ser comparada com o efeito de silenciamento de expressão transgénica por administração de análogos de tetraciclina.

BIBLIOGRAFIA

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Lisboa, 4 de Outubro de 2006

Claims (8)

1. ΕΡ1280404 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um animal transgénico não humano em que a proteína GSK- 3β é sobreexpressada no animal, em que a expressão da proteína GSK-3P se encontra sob o controlo de um sistema de expressão de GSK-3p condicional tet-regulado, tendo um transgene tTA sob o controlo do promotor Camklla, de modo que níveis aumentados de fosforilação de tau são encontrados no hipocampo, mas não no córtex ou no corpo estriado.
2. 2 . Um animal transgénico de acordo com a reivindicação 1, em que GSK-3P é o único enzima que é sobrexpressado
3. • 3. Um animal transgénico de acordo com a reivindicação 1, em que GSK-3P é a única proteína que é sobreexpressada.
4. 4. Um animal transgénico de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é um mamífero.
5. 5. Um animal transgénico de acordo com a reivindicação 4, onde o mamífero é um ratinho, rato ou primata.
6. 6. A utilização de um animal transgénico de acordo com qualquer reivindicação anterior como um modelo para a doença de Alzheimer. 2 ΕΡ1280404
7. 7. A utilização de um animal transgénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, no teste de uma droga ou terapêutica para o tratamento de doenças neurodegenerativas.
8. 8. Um método de identificação de uma terapêutica útil no tratamento da doença de Alzheimer, compreendendo a administração da terapêutica ao animal transgénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e monitorização quanto a um efeito sobre a patologia ou comportamento. Lisboa, 4 de Outubro de 2006