JP2003523182A - 哺乳動物遺伝子発現を調節するための分子スイッチ - Google Patents
哺乳動物遺伝子発現を調節するための分子スイッチInfo
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Abstract
(57)【要約】
(a) サイレンサー誘導領域を形成する、１以上のサイレンサーエレメントと条件誘導エレメント、および(b) １以上の発現される領域の上流にある、機能的に連結されたプロモーター、を含む発現ベクターを開示する。この発現ベクターは１以上の下流領域の発現を条件的サイレンシングにより調節し、そこでは、発現される遺伝子のDNA領域が転写されてRNA転写物を生成し、該転写物はポリペプチドを生成するように翻訳されても、されなくてもよい。かかる発現ベクターを用いて、トランスフェクションや遺伝子導入技法により遺伝子操作された哺乳動物細胞および非ヒト哺乳動物を作製することができる。さらに、上記産物の製造方法ならびに使用方法も開示する（例えば、発現ベクターは診断、治療もしくは予防に使用される）。
Description
【０００１】発明の背景 １．発明の分野
本発明は、哺乳動物遺伝子発現を調節することに関するものである。
【０００２】２．関連技術の説明
遺伝子導入は、外来遺伝物質が発現されるように細胞に外来遺伝物質を導入す
ることを含む。このプロセスは、例えば、遺伝子治療、組換え産物の生産、遺伝
子診断、薬物スクリーニングのような用途において利用される。しかし近年、こ
うした分野の最大の挑戦であるヒト疾患のin vivo遺伝子治療が成功したと報じ
られている（Kayら, 2000; Cavazzano-Calvoら, 2000）にもかかわらず、新しい
発現ベクターの構築は、調節された方法で高レベルの遺伝子発現を達成すること
に熱心な、多数の研究者の注目を集めている（Agha-MohammadiおよびLotze, 200
0に概説）。
ることを含む。このプロセスは、例えば、遺伝子治療、組換え産物の生産、遺伝
子診断、薬物スクリーニングのような用途において利用される。しかし近年、こ
うした分野の最大の挑戦であるヒト疾患のin vivo遺伝子治療が成功したと報じ
られている（Kayら, 2000; Cavazzano-Calvoら, 2000）にもかかわらず、新しい
発現ベクターの構築は、調節された方法で高レベルの遺伝子発現を達成すること
に熱心な、多数の研究者の注目を集めている（Agha-MohammadiおよびLotze, 200
0に概説）。
【０００３】
たいていの場合、遺伝子導入の最終目標は、治療または予防効果を奏するのに
十分な期間にわたり遺伝子産物の産生をもたらす発現ベクターを導入することで
ある。その期間は比較的短いかもしれないし（例えば、数時間ないし数日間）、
長期間であるかもしれない（例えば、数週間から１年以上）。遺伝子に基づいた
治療の一つの重要な面は、疾病により影響される細胞または組織に遺伝子発現を
空間的および時間的に制限するようなやり方で、発現を調節することであろう。
そのような調節には、遺伝子が実質的に潜伏した状態で標的細胞または組織に送
り込まれ、その結果として疾病の不在下では標的の表現型を変化させたり、表現
型に顕著な影響を及ぼしたりしないことが必要である。疾病が進行中である場合
は、潜伏遺伝子が病気の症状を消失させるように誘導され（例えば、空間的、時
間的、またはその両方）、逆に、症状がおさまっているときには発現を中止する
ことが望ましいと考えられる。単純化するために、それには、内因性の疾病関連
刺激に応答することができる厳格なオン／オフスイッチによって遺伝子を調節す
る必要がある。
十分な期間にわたり遺伝子産物の産生をもたらす発現ベクターを導入することで
ある。その期間は比較的短いかもしれないし（例えば、数時間ないし数日間）、
長期間であるかもしれない（例えば、数週間から１年以上）。遺伝子に基づいた
治療の一つの重要な面は、疾病により影響される細胞または組織に遺伝子発現を
空間的および時間的に制限するようなやり方で、発現を調節することであろう。
そのような調節には、遺伝子が実質的に潜伏した状態で標的細胞または組織に送
り込まれ、その結果として疾病の不在下では標的の表現型を変化させたり、表現
型に顕著な影響を及ぼしたりしないことが必要である。疾病が進行中である場合
は、潜伏遺伝子が病気の症状を消失させるように誘導され（例えば、空間的、時
間的、またはその両方）、逆に、症状がおさまっているときには発現を中止する
ことが望ましいと考えられる。単純化するために、それには、内因性の疾病関連
刺激に応答することができる厳格なオン／オフスイッチによって遺伝子を調節す
る必要がある。
【０００４】
そのような調節された遺伝子発現の重要な特性は、サイレンサー-インデュー
サー比と呼ばれており、すなわち、この比率は誘導条件下で測定した外来遺伝子
の発現を、誘導なしの発現（つまり、基礎発現）の量で割った値である。この比
率は高くなければならず（例えば、約25〜1000倍以上）、また、誘導条件の適切
な制御によって十分に調節可能であるべきである。もう一つの重要な特性は、誘
導されない、疾病のない状態で遺伝子発現を実質的に沈黙させる（または抑制す
る）ことである。
サー比と呼ばれており、すなわち、この比率は誘導条件下で測定した外来遺伝子
の発現を、誘導なしの発現（つまり、基礎発現）の量で割った値である。この比
率は高くなければならず（例えば、約25〜1000倍以上）、また、誘導条件の適切
な制御によって十分に調節可能であるべきである。もう一つの重要な特性は、誘
導されない、疾病のない状態で遺伝子発現を実質的に沈黙させる（または抑制す
る）ことである。
【０００５】
外来遺伝子の発現を調節するうえでの厳格なオン−オフスイッチの必要性は広
く認められており、そのような調節が存在しないことは、多くの遺伝子導入用途
において重大な制限の一つであると見なされる。調節された外来遺伝子発現は、
正の調節および負の調節のいずれも、原核生物（例えば、Lacオペロン）および
哺乳動物（例えば、Tetリプレッサーおよびアクチベーター、プロゲステロンま
たはエクジソン受容体）においてすでに記載されている（Agha-Mohammadiおよび
Lotze, 2000に概説）。こうした系のそれぞれが、転写に関与するタンパク質へ
の外因性モジュレーターの結合を必要とし、Tet調節系におけるテトラサイクリ
ンまたはドキシサイクリン、プロゲステロン調節系およびFKBP調節系におけるそ
れぞれRU486またはラパマイシンがそうである。後者の２つの系は、標的遺伝子
および異なる調節成分を送達するために複数のベクターを必要とする。これらの
系の全てにおいては、アロステリック変化が正および負に作用する転写因子のDN
A結合親和力を決定し、それによりオン−オフスイッチを制御している(Freundli
ebら, 1999)。しかしながら、本発明と相違して、これらの系では、内在性の転
写因子（例えば、低酸素誘導因子またはNF-κB転写因子）に作用する内因性の要
因（例えば、それぞれ、低酸素またはストレス）による組織内の空間的調節また
は疾病状態に対する応答性が得られない。調節された発現系は酵母においてすで
に作製されており、そこでは正または負に作用する因子のアロステリック活性化
（すなわち、リン酸化）が転写を活性化または抑制する(LeeおよびGross, 1993)
。こうした系は、アロステリック結合およびプロモーターの活性を制御する外因
性モジュレーターを使用することによって、調節された発現に厳格なオン−オフ
スイッチを提供するという問題を解決している。本明細書に記載する本発明と比
較すると、これらの系はすべてが作用機構の点で相違している。なぜならば、本
発明は、空間的および時間的な可逆的抑制を媒介するために疾病応答性の内因性
要因を使用するもので、アロステリック結合によるものでないからである。した
がって、アロステリック調節系は本発明を教示も示唆もしていない。
く認められており、そのような調節が存在しないことは、多くの遺伝子導入用途
において重大な制限の一つであると見なされる。調節された外来遺伝子発現は、
正の調節および負の調節のいずれも、原核生物（例えば、Lacオペロン）および
哺乳動物（例えば、Tetリプレッサーおよびアクチベーター、プロゲステロンま
たはエクジソン受容体）においてすでに記載されている（Agha-Mohammadiおよび
Lotze, 2000に概説）。こうした系のそれぞれが、転写に関与するタンパク質へ
の外因性モジュレーターの結合を必要とし、Tet調節系におけるテトラサイクリ
ンまたはドキシサイクリン、プロゲステロン調節系およびFKBP調節系におけるそ
れぞれRU486またはラパマイシンがそうである。後者の２つの系は、標的遺伝子
および異なる調節成分を送達するために複数のベクターを必要とする。これらの
系の全てにおいては、アロステリック変化が正および負に作用する転写因子のDN
A結合親和力を決定し、それによりオン−オフスイッチを制御している(Freundli
ebら, 1999)。しかしながら、本発明と相違して、これらの系では、内在性の転
写因子（例えば、低酸素誘導因子またはNF-κB転写因子）に作用する内因性の要
因（例えば、それぞれ、低酸素またはストレス）による組織内の空間的調節また
は疾病状態に対する応答性が得られない。調節された発現系は酵母においてすで
に作製されており、そこでは正または負に作用する因子のアロステリック活性化
（すなわち、リン酸化）が転写を活性化または抑制する(LeeおよびGross, 1993)
。こうした系は、アロステリック結合およびプロモーターの活性を制御する外因
性モジュレーターを使用することによって、調節された発現に厳格なオン−オフ
スイッチを提供するという問題を解決している。本明細書に記載する本発明と比
較すると、これらの系はすべてが作用機構の点で相違している。なぜならば、本
発明は、空間的および時間的な可逆的抑制を媒介するために疾病応答性の内因性
要因を使用するもので、アロステリック結合によるものでないからである。した
がって、アロステリック調節系は本発明を教示も示唆もしていない。
【０００６】発明の概要
本発明は、細胞における哺乳動物遺伝子発現を、少なくとも、(a) １以上のサ
イレンサーエレメント、および(b) 疾病と関連した１以上の内在性転写因子に応
答する１以上の条件誘導エレメント、を使用して、サイレンサー誘導領域（この
領域は、適切な条件下で、発現領域の上流にあるプロモーターの転写活性を改変
する）を形成させることにより調節することに関する。こうして、サイレンサー
誘導領域、プロモーター、および少なくとも１つの発現領域を含む発現ベクター
は、発現（すなわち、遺伝子の発現領域から転写された産物に対応するRNA、ま
たは遺伝子の発現領域によりコードされる産物に対応するポリペプチドの生物学
的活性）を条件的サイレンシングにより調節することができ、また、そのような
発現を疾病状態により影響される細胞または組織の部分に制限することができる
。
イレンサーエレメント、および(b) 疾病と関連した１以上の内在性転写因子に応
答する１以上の条件誘導エレメント、を使用して、サイレンサー誘導領域（この
領域は、適切な条件下で、発現領域の上流にあるプロモーターの転写活性を改変
する）を形成させることにより調節することに関する。こうして、サイレンサー
誘導領域、プロモーター、および少なくとも１つの発現領域を含む発現ベクター
は、発現（すなわち、遺伝子の発現領域から転写された産物に対応するRNA、ま
たは遺伝子の発現領域によりコードされる産物に対応するポリペプチドの生物学
的活性）を条件的サイレンシングにより調節することができ、また、そのような
発現を疾病状態により影響される細胞または組織の部分に制限することができる
。
【０００７】
本発明の目的は、哺乳動物遺伝子発現（すなわち、遺伝子の発現領域から転写
された産物に対応するRNA、または遺伝子の発現領域によりコードされる産物に
対応するポリペプチドの生物学的活性）を条件的サイレンシングにより厳格に調
節することである。好ましくは、遺伝子発現は疾病に関連した内因性の要因（例
えば、虚血や他の低酸素状態、炎症およびその他のストレス状態）により調節さ
れる。
された産物に対応するRNA、または遺伝子の発現領域によりコードされる産物に
対応するポリペプチドの生物学的活性）を条件的サイレンシングにより厳格に調
節することである。好ましくは、遺伝子発現は疾病に関連した内因性の要因（例
えば、虚血や他の低酸素状態、炎症およびその他のストレス状態）により調節さ
れる。
【０００８】
１以上のサイレンサーエレメントと、１以上の条件誘導エレメントと（これら
はサイレンサー誘導領域へと形成される）、少なくとも１つの発現領域の上流に
あって該領域と機能的に連結されたプロモーターと、を含むポリペプチドからな
る発現ベクターが開示される。サイレンサーエレメントと条件誘導エレメントの
数は独立して選択され、通常はそれぞれ10未満であって、ホモ多量体（すなわち
、同一のサイレンサーまたは条件誘導エレメントの反復）またはヘテロ多量体（
すなわち、異なるサイレンサーもしくは条件誘導エレメント、またはその変異体
の混合物）として形成される。こうして、かかる発現ベクターは１以上の下流領
域の転写を条件的サイレンシングにより調節し、そこでは、発現される遺伝子の
DNA領域が転写されて、RNA転写物やポリペプチドなどの遺伝子産物を生成する。
はサイレンサー誘導領域へと形成される）、少なくとも１つの発現領域の上流に
あって該領域と機能的に連結されたプロモーターと、を含むポリペプチドからな
る発現ベクターが開示される。サイレンサーエレメントと条件誘導エレメントの
数は独立して選択され、通常はそれぞれ10未満であって、ホモ多量体（すなわち
、同一のサイレンサーまたは条件誘導エレメントの反復）またはヘテロ多量体（
すなわち、異なるサイレンサーもしくは条件誘導エレメント、またはその変異体
の混合物）として形成される。こうして、かかる発現ベクターは１以上の下流領
域の転写を条件的サイレンシングにより調節し、そこでは、発現される遺伝子の
DNA領域が転写されて、RNA転写物やポリペプチドなどの遺伝子産物を生成する。
【０００９】
発現は、プロモーターによる転写に正の影響を与える条件誘導エレメントへの
転写因子の結合、および下流の発現領域を転写させるプロモーターの基礎活性が
条件的にサイレンシングされるように該条件誘導エレメントと並列しているサイ
レンサーエレメントの存在を介して誘導され得る。転写因子は疾病と関連した内
因性の要因に対して応答性であることが好ましい。誘導条件下で測定した遺伝子
発現を、誘導なしで測定した遺伝子発現で割った比率（すなわち、サイレンサー
-インデューサー比）を高くする。好ましくは、サイレンサー-インデューサー比
は少なくとも約25または50、より好ましくは少なくとも100または500、より一層
好ましくは少なくとも1000である。
転写因子の結合、および下流の発現領域を転写させるプロモーターの基礎活性が
条件的にサイレンシングされるように該条件誘導エレメントと並列しているサイ
レンサーエレメントの存在を介して誘導され得る。転写因子は疾病と関連した内
因性の要因に対して応答性であることが好ましい。誘導条件下で測定した遺伝子
発現を、誘導なしで測定した遺伝子発現で割った比率（すなわち、サイレンサー
-インデューサー比）を高くする。好ましくは、サイレンサー-インデューサー比
は少なくとも約25または50、より好ましくは少なくとも100または500、より一層
好ましくは少なくとも1000である。
【００１０】
遺伝子操作された哺乳動物細胞および非ヒト哺乳動物は、そのような発現ベク
ターを用いてトランスフェクション、感染、および遺伝子導入技法により作製す
ることができる。
ターを用いてトランスフェクション、感染、および遺伝子導入技法により作製す
ることができる。
【００１１】
さらに、上記産物の製造方法ならびに使用方法も開示される（例えば、発現ベ
クターは診断、治療もしくは予防に、またはヒト疾病のモデルを作るために使用
される）。
クターは診断、治療もしくは予防に、またはヒト疾病のモデルを作るために使用
される）。
【００１２】
本発明のこれらおよび他の態様は、当業者には以下の説明から明らかになるで
あろう。
あろう。
【００１３】本発明の説明 定義
「組換え」ポリヌクレオチドは異種領域の連結またはその他の結合の結果とし
て生成する。組換えは、少なくとも部分的に精製した酵素によってin vitroで遺
伝子操作（例えば増幅、転写もしくは複製）するか、手動もしくは自動化学的手
法（例えばホスホジエステルもしくはホスホトリエステル化学）によって合成す
るか、あるいは酵素により触媒される、部位特異的組換え（例えばインテグラー
ゼもしくはRAGリコンビナーゼシステム）または相同的組換えによってin vivoで
実施することができる。「異種」の意味は、もちろんその背景情況に応じて変わ
ることとなる。例えば、キメラ体を形成するための異種領域の連結とは、それら
の領域が同一の生物体内で同一直線上には存在しないことを意味する。少なくと
も１つがヒト由来でもう１つが非ヒト種由来の領域同士の連結は、それらが別種
に由来するから、異種性である。別の例において、発現ベクターの異種宿主細胞
中へのトランスフェクションまたは異種非ヒト生物体のトランスジェネシスは、
その発現ベクターが天然ではその細胞もしくは生物体のゲノム中に存在しないこ
とを意味する。
て生成する。組換えは、少なくとも部分的に精製した酵素によってin vitroで遺
伝子操作（例えば増幅、転写もしくは複製）するか、手動もしくは自動化学的手
法（例えばホスホジエステルもしくはホスホトリエステル化学）によって合成す
るか、あるいは酵素により触媒される、部位特異的組換え（例えばインテグラー
ゼもしくはRAGリコンビナーゼシステム）または相同的組換えによってin vivoで
実施することができる。「異種」の意味は、もちろんその背景情況に応じて変わ
ることとなる。例えば、キメラ体を形成するための異種領域の連結とは、それら
の領域が同一の生物体内で同一直線上には存在しないことを意味する。少なくと
も１つがヒト由来でもう１つが非ヒト種由来の領域同士の連結は、それらが別種
に由来するから、異種性である。別の例において、発現ベクターの異種宿主細胞
中へのトランスフェクションまたは異種非ヒト生物体のトランスジェネシスは、
その発現ベクターが天然ではその細胞もしくは生物体のゲノム中に存在しないこ
とを意味する。
【００１４】
「単離された」産物とは、人工的に合成されたヌクレオチドもしくはアミノ酸
のポリマーについては化学反応物から、天然のポリマーもしくは遺伝子工学的に
製造したポリマーについては起源（例えばヒト、非ヒト哺乳動物、もしくはその
他の真核生物；昆虫もしくはその他の非脊椎動物；植物；酵母、かびもしくはそ
の他の真菌；細菌もしくはその他の原核生物）の細胞から、少なくとも部分的に
精製されたものである。例えば、起源細胞の溶解物に比較して、単離された産物
はその他の化学的に同類の溶質（例えばポリヌクレオチドの場合は核酸、ポリペ
プチドの場合はタンパク質）から、少なくとも50％、75％、90％、95％もしくは
98％精製される。化学合成されたヌクレオチドもしくはアミノ酸のポリマーにつ
いては、純度は早期に停止またはブロックした産物と比較することにより決定さ
れ、実際的には、高忠実度の合成により精製なしで単離されたものとみなすこと
ができる。精製は、例えば細胞分画、遠心分離、クロマトグラフィー、および電
気泳動などの生化学的技術によって達成することができる。一般的に、溶媒（例
えば水）およびバッファーや塩などの化学物質は純度を算出する際には無視され
る。細胞産物は、ポジティブもしくはネガティブ選択、限界希釈、または発現ベ
クターが宿主細胞中に導入されたかどうかの選別によって単離することができる
。所望の産物を単離するためには、細胞もしくは遺伝子クローニングを使用する
ことが多い。こうして、ポリヌクレオチドは、クローニングによって得られた実
質的に均一な集団としてのウイルス粒子もしくはトランスフェクトされた細胞中
に含まれる場合に、「単離された」ものとみなすことができる。
のポリマーについては化学反応物から、天然のポリマーもしくは遺伝子工学的に
製造したポリマーについては起源（例えばヒト、非ヒト哺乳動物、もしくはその
他の真核生物；昆虫もしくはその他の非脊椎動物；植物；酵母、かびもしくはそ
の他の真菌；細菌もしくはその他の原核生物）の細胞から、少なくとも部分的に
精製されたものである。例えば、起源細胞の溶解物に比較して、単離された産物
はその他の化学的に同類の溶質（例えばポリヌクレオチドの場合は核酸、ポリペ
プチドの場合はタンパク質）から、少なくとも50％、75％、90％、95％もしくは
98％精製される。化学合成されたヌクレオチドもしくはアミノ酸のポリマーにつ
いては、純度は早期に停止またはブロックした産物と比較することにより決定さ
れ、実際的には、高忠実度の合成により精製なしで単離されたものとみなすこと
ができる。精製は、例えば細胞分画、遠心分離、クロマトグラフィー、および電
気泳動などの生化学的技術によって達成することができる。一般的に、溶媒（例
えば水）およびバッファーや塩などの化学物質は純度を算出する際には無視され
る。細胞産物は、ポジティブもしくはネガティブ選択、限界希釈、または発現ベ
クターが宿主細胞中に導入されたかどうかの選別によって単離することができる
。所望の産物を単離するためには、細胞もしくは遺伝子クローニングを使用する
ことが多い。こうして、ポリヌクレオチドは、クローニングによって得られた実
質的に均一な集団としてのウイルス粒子もしくはトランスフェクトされた細胞中
に含まれる場合に、「単離された」ものとみなすことができる。
【００１５】
「発現ベクター」とは、化学的形態としてはデオキシリボ核酸（DNA）もしく
はリボ核酸（RNA）のいずれかの組換えポリヌクレオチドである。発現ベクター
の物理的形態も鎖の型（例えば一本鎖もしくは二本鎖）およびトポロジー（例え
ば直鎖状もしくは環状）において差異がある。しかし、発現ベクターは二本鎖デ
オキシリボ核酸（dsDNA）であるか、または細胞中に導入された後（例えばプロ
ウイルスとしての宿主ゲノム中へのレトロウイルスの挿入後）dsDNAに変換され
るものが好ましいと認識すべきである。発現ベクターはタンパク質もしくはキャ
リアー（例えばウイルス粒子中にパッケージングされる）中の他の核酸と結合さ
せてもよく、または修飾ヌクレオチド（例えばメチル化ヌクレオチド）を含んで
いてもよい。発現ベクターには例えばファージミド、プラスミド、バクテリオフ
ァージもしくはウイルス、コスミド、細菌人工染色体（BAC）または酵母人工染
色体（YAC）などのシャトルベクターに基づくものがある。本発明の実施形態を
限定するものではないが、発現ベクターの長さは、宿主ゲノム中に組み込まれて
も組み込まれなくても、100〜1,000,000ヌクレオチド長、より好ましくは1000〜
100,000ヌクレオチド長、さらに好ましくは5,000〜50,000ヌクレオチド長とする
のが好都合である。
はリボ核酸（RNA）のいずれかの組換えポリヌクレオチドである。発現ベクター
の物理的形態も鎖の型（例えば一本鎖もしくは二本鎖）およびトポロジー（例え
ば直鎖状もしくは環状）において差異がある。しかし、発現ベクターは二本鎖デ
オキシリボ核酸（dsDNA）であるか、または細胞中に導入された後（例えばプロ
ウイルスとしての宿主ゲノム中へのレトロウイルスの挿入後）dsDNAに変換され
るものが好ましいと認識すべきである。発現ベクターはタンパク質もしくはキャ
リアー（例えばウイルス粒子中にパッケージングされる）中の他の核酸と結合さ
せてもよく、または修飾ヌクレオチド（例えばメチル化ヌクレオチド）を含んで
いてもよい。発現ベクターには例えばファージミド、プラスミド、バクテリオフ
ァージもしくはウイルス、コスミド、細菌人工染色体（BAC）または酵母人工染
色体（YAC）などのシャトルベクターに基づくものがある。本発明の実施形態を
限定するものではないが、発現ベクターの長さは、宿主ゲノム中に組み込まれて
も組み込まれなくても、100〜1,000,000ヌクレオチド長、より好ましくは1000〜
100,000ヌクレオチド長、さらに好ましくは5,000〜50,000ヌクレオチド長とする
のが好都合である。
【００１６】
本発明にしたがう発現ベクターは、少なくとも１箇所の発現領域の調節を提供
するように機能的に連結された、１以上のサイレンサーエレメント、１以上の条
件誘導エレメント、および１以上のプロモーターを含んで構成される。好ましく
は、１以上のサイレンサーエレメントおよび１以上の条件誘導エレメントは互い
に異種性であり；サイレンサーおよび条件誘導エレメントから形成されるサイレ
ンサー誘導領域は、哺乳動物細胞もしくは組織における発現の条件的サイレンシ
ングを行ない、かつこうした発現を空間的および時間的に制限されたパターンで
調節するように作用し；また発現を調節するために、アロステリック機構によっ
て作用する外因性の因子（例えば、薬物、組換えポリペプチドなどの組換えトラ
ンス作用性因子等）の代わりに、疾病に関連する内因性の要因（例えば虚血およ
びその他の低酸素状態、炎症ならびにその他のストレス状態）を使用する。
するように機能的に連結された、１以上のサイレンサーエレメント、１以上の条
件誘導エレメント、および１以上のプロモーターを含んで構成される。好ましく
は、１以上のサイレンサーエレメントおよび１以上の条件誘導エレメントは互い
に異種性であり；サイレンサーおよび条件誘導エレメントから形成されるサイレ
ンサー誘導領域は、哺乳動物細胞もしくは組織における発現の条件的サイレンシ
ングを行ない、かつこうした発現を空間的および時間的に制限されたパターンで
調節するように作用し；また発現を調節するために、アロステリック機構によっ
て作用する外因性の因子（例えば、薬物、組換えポリペプチドなどの組換えトラ
ンス作用性因子等）の代わりに、疾病に関連する内因性の要因（例えば虚血およ
びその他の低酸素状態、炎症ならびにその他のストレス状態）を使用する。
【００１７】
このようにこの発現ベクターは、非アロステリック機構、すなわち、サイレン
サーエレメントへのネガティブ作用性転写因子および条件誘導エレメントへのポ
ジティブ作用性転写因子の可逆的で相互に排他的な結合、による「条件的サイレ
ンシング」によって遺伝子発現を調節する。哺乳動物細胞もしくは組織において
、目的とする結果は、発現される遺伝子のDNA領域が転写されて単一クラスもし
くは複数の異なるクラスのRNA転写物を産生し、その後これが単一クラスもしく
は複数の異なるクラスのポリペプチドを産生するように翻訳されてもされなくて
もよい、該発現される領域の厳格な調節である。例えば、遺伝子の生物学的活性
は転写物それ自体（すなわち誘導可能なRNA活性）および／またはポリペプチド
（すなわち誘導可能なタンパク質活性）のレベルで調節される。dsRNAおよびリ
ボザイム分子がRNA活性をもつ転写物の例である。タンパク質活性の例として、
アフィニティー結合、酵素活性、受容体とそのコグネイトリガンド間の結合の結
果であるシグナル伝達、ならびにその他の生理学的応答が含まれる。
サーエレメントへのネガティブ作用性転写因子および条件誘導エレメントへのポ
ジティブ作用性転写因子の可逆的で相互に排他的な結合、による「条件的サイレ
ンシング」によって遺伝子発現を調節する。哺乳動物細胞もしくは組織において
、目的とする結果は、発現される遺伝子のDNA領域が転写されて単一クラスもし
くは複数の異なるクラスのRNA転写物を産生し、その後これが単一クラスもしく
は複数の異なるクラスのポリペプチドを産生するように翻訳されてもされなくて
もよい、該発現される領域の厳格な調節である。例えば、遺伝子の生物学的活性
は転写物それ自体（すなわち誘導可能なRNA活性）および／またはポリペプチド
（すなわち誘導可能なタンパク質活性）のレベルで調節される。dsRNAおよびリ
ボザイム分子がRNA活性をもつ転写物の例である。タンパク質活性の例として、
アフィニティー結合、酵素活性、受容体とそのコグネイトリガンド間の結合の結
果であるシグナル伝達、ならびにその他の生理学的応答が含まれる。
【００１８】
サイレンサーエレメントおよび条件誘導エレメントの数は独立してホモ多量体
（すなわち同一のサイレンサーもしくは条件誘導エレメントの反復）またはヘテ
ロ多量体（すなわち異なるサイレンサーもしくは条件誘導エレメント、またはそ
の変異体の混合物）として少なくとも2、3、4、5、6またはそれ以上である。発
現ベクター中のサイレンサーエレメントおよび条件誘導エレメントのタイプおよ
び数は変更され得る。しかし、サイレンサー-インデューサー比は一般的に、す
べてではないにしても大部分のタイプのエレメントについて、エレメントの数と
直接関係して増加し、最終的には平坦になると予測される。１エレメントの配列
が２個組の対称形でない場合、発現ベクターの残りの部分（例えばプロモーター
）に対して好ましいエレメントの方向性があるはずであるが、これによって発生
するサイレンサー-インデューサー比の差異はおそらく大したことではないと見
られる。サイレンサー誘導領域が「エンハンサー」として機能する場合は、その
プロモーターに対するエンハンサーの方向性および距離は本発明の操作上重大な
決定因子とはならない。
（すなわち同一のサイレンサーもしくは条件誘導エレメントの反復）またはヘテ
ロ多量体（すなわち異なるサイレンサーもしくは条件誘導エレメント、またはそ
の変異体の混合物）として少なくとも2、3、4、5、6またはそれ以上である。発
現ベクター中のサイレンサーエレメントおよび条件誘導エレメントのタイプおよ
び数は変更され得る。しかし、サイレンサー-インデューサー比は一般的に、す
べてではないにしても大部分のタイプのエレメントについて、エレメントの数と
直接関係して増加し、最終的には平坦になると予測される。１エレメントの配列
が２個組の対称形でない場合、発現ベクターの残りの部分（例えばプロモーター
）に対して好ましいエレメントの方向性があるはずであるが、これによって発生
するサイレンサー-インデューサー比の差異はおそらく大したことではないと見
られる。サイレンサー誘導領域が「エンハンサー」として機能する場合は、その
プロモーターに対するエンハンサーの方向性および距離は本発明の操作上重大な
決定因子とはならない。
【００１９】
プロモーターの転写開始部位と最も近傍にあるサイレンサー誘導領域の最も近
い配列間の距離は多くとも500、1000、1500、2000もしくは2500ヌクレオチドと
する。しかし、上述したように、実施例に示す発現ベクターについてはこの距離
は約100から約300ヌクレオチドであるが、これは本発明の有利な効果を得るため
に決定的に重要であるとは考えられない。ある種のプロモーター、特にTATAおよ
びCAAT共通配列を欠損しているもの、は完全な転写開始の少なくとも10％に関係
する複数の転写部位を持ち得ることに注目されたい。この距離はサイレンサー-
インデューサー比を最大にするように変更することができる。ここで、プロモー
ターとサイレンサー誘導領域の間のスペーサー配列のサイレンサー-インデュー
サー比に及ぼす影響は通常スペーサー配列内のヌクレオチドの数に依存し、それ
らのヌクレオチド塩基の正体には依存しないだろう。スペーサー配列の突然変異
分析によって、プロモーターとサイレンサー誘導領域の境界が確認されるものと
予想される。なぜならば、スペーサー配列の塩基の変更の結果はサイレンサー-
インデューサー比について重大な差異とはならないはずだからである。そうでな
い場合は、（最も近いいずれかの）プロモーターもしくはサイレンサー誘導領域
の長さをより長いものと、そしてその分だけスペーサー配列をより短いものとみ
なさなければならない。
い配列間の距離は多くとも500、1000、1500、2000もしくは2500ヌクレオチドと
する。しかし、上述したように、実施例に示す発現ベクターについてはこの距離
は約100から約300ヌクレオチドであるが、これは本発明の有利な効果を得るため
に決定的に重要であるとは考えられない。ある種のプロモーター、特にTATAおよ
びCAAT共通配列を欠損しているもの、は完全な転写開始の少なくとも10％に関係
する複数の転写部位を持ち得ることに注目されたい。この距離はサイレンサー-
インデューサー比を最大にするように変更することができる。ここで、プロモー
ターとサイレンサー誘導領域の間のスペーサー配列のサイレンサー-インデュー
サー比に及ぼす影響は通常スペーサー配列内のヌクレオチドの数に依存し、それ
らのヌクレオチド塩基の正体には依存しないだろう。スペーサー配列の突然変異
分析によって、プロモーターとサイレンサー誘導領域の境界が確認されるものと
予想される。なぜならば、スペーサー配列の塩基の変更の結果はサイレンサー-
インデューサー比について重大な差異とはならないはずだからである。そうでな
い場合は、（最も近いいずれかの）プロモーターもしくはサイレンサー誘導領域
の長さをより長いものと、そしてその分だけスペーサー配列をより短いものとみ
なさなければならない。
【００２０】
サイレンサーエレメントと条件誘導エレメントを隔てる距離の方が、条件的サ
イレンシングのためにはより重要である可能性がある。好ましくは、その距離は
、サイレンサーエレメントへのネガティブ作用性転写因子の結合と条件誘導エレ
メントへのポジティブ作用性転写因子の結合間に干渉が存在するように制限され
る。サイレンサーエレメントと条件誘導エレメント間の500塩基を超える距離は
条件的サイレンシングを排除した（実施例１）が、条件的サイレンシングはサイ
レンサーエレメントに結合するタンパク質の、わずかに約50塩基の距離での条件
誘導エレメントに結合する別のタンパク質による置換に直接相関した（実施例3
）。より距離が大きいその他の配置でも、サイレンサーおよび条件誘導エレメン
ト中のDNA部位への結合に影響を与えるDNAの屈曲または長距離相互作用がある状
況下では、本発明の範囲内となる可能性がある。
イレンシングのためにはより重要である可能性がある。好ましくは、その距離は
、サイレンサーエレメントへのネガティブ作用性転写因子の結合と条件誘導エレ
メントへのポジティブ作用性転写因子の結合間に干渉が存在するように制限され
る。サイレンサーエレメントと条件誘導エレメント間の500塩基を超える距離は
条件的サイレンシングを排除した（実施例１）が、条件的サイレンシングはサイ
レンサーエレメントに結合するタンパク質の、わずかに約50塩基の距離での条件
誘導エレメントに結合する別のタンパク質による置換に直接相関した（実施例3
）。より距離が大きいその他の配置でも、サイレンサーおよび条件誘導エレメン
ト中のDNA部位への結合に影響を与えるDNAの屈曲または長距離相互作用がある状
況下では、本発明の範囲内となる可能性がある。
【００２１】
サイレンサー誘導領域中のサイレンサーおよび条件誘導エレメントを、発現ベ
クター中でサイレンサーエレメントと条件誘導エレメントが約50もしくは75塩基
またはそれ以下の距離にあるように、配置することができる。また、約100もし
くは150塩基から約200もしくは300塩基の距離とし、あるいは約500もしくは1000
塩基またはそれ以上の距離としてもよい。上で考察したように、突然変異分析を
使用して、サイレンサー誘導領域の長さを確認することができる。例えば、サイ
レンサーエレメントおよび条件誘導エレメントの転写因子結合部位における少な
くともいくつかの突然変異はサイレンサー-インデューサー比を変更させるもの
と予想されるが、結合部位もしくはエレメントの間に位置する塩基においてはこ
の比の変化はないものと予想される。
クター中でサイレンサーエレメントと条件誘導エレメントが約50もしくは75塩基
またはそれ以下の距離にあるように、配置することができる。また、約100もし
くは150塩基から約200もしくは300塩基の距離とし、あるいは約500もしくは1000
塩基またはそれ以上の距離としてもよい。上で考察したように、突然変異分析を
使用して、サイレンサー誘導領域の長さを確認することができる。例えば、サイ
レンサーエレメントおよび条件誘導エレメントの転写因子結合部位における少な
くともいくつかの突然変異はサイレンサー-インデューサー比を変更させるもの
と予想されるが、結合部位もしくはエレメントの間に位置する塩基においてはこ
の比の変化はないものと予想される。
【００２２】
発現はいくつかの条件誘導エレメントへの単一クラスもしくは複数の異なるク
ラスの転写因子の結合を介して誘導され、こうした結合は１以上のプロモーター
による転写にポジティブな影響を与える。いくつかの条件誘導エレメントに近接
して並置されたいくつかのサイレンサーエレメントの存在は、発現ベクター内の
少なくとも１つのプロモーターの転写活性を、サイレンサーエレメントが存在し
ない場合のそのプロモーターの基礎転写活性に比較して、抑制する。これによっ
てその遺伝子の発現される少なくとも１つの下流領域の転写が条件的サイレンシ
ングを受ける。
ラスの転写因子の結合を介して誘導され、こうした結合は１以上のプロモーター
による転写にポジティブな影響を与える。いくつかの条件誘導エレメントに近接
して並置されたいくつかのサイレンサーエレメントの存在は、発現ベクター内の
少なくとも１つのプロモーターの転写活性を、サイレンサーエレメントが存在し
ない場合のそのプロモーターの基礎転写活性に比較して、抑制する。これによっ
てその遺伝子の発現される少なくとも１つの下流領域の転写が条件的サイレンシ
ングを受ける。
【００２３】
一般的に、サイレンサーエレメントのタイプおよび数、条件誘導エレメントの
タイプおよび数、サイレンサー誘導領域におけるそれらの相対的順序および距離
、プロモーターのタイプ、ならびにサイレンサー誘導領域とそれによって条件的
サイレンシングを受ける１プロモーターとの最も近い距離を変更することによっ
て、発現ベクターについてサイレンサー-インデューサー比を増加することがで
きる。同一の発現ベクターについてのこの比率は、おそらく誘導条件および連結
されるプロモーターに応じて変化するであろう。
タイプおよび数、サイレンサー誘導領域におけるそれらの相対的順序および距離
、プロモーターのタイプ、ならびにサイレンサー誘導領域とそれによって条件的
サイレンシングを受ける１プロモーターとの最も近い距離を変更することによっ
て、発現ベクターについてサイレンサー-インデューサー比を増加することがで
きる。同一の発現ベクターについてのこの比率は、おそらく誘導条件および連結
されるプロモーターに応じて変化するであろう。
【００２４】
組織特異的遺伝子発現の抑制のためのサイレンサーエレメントの役割が概説さ
れている（Ogbourne and Antalis,1998）が、そうしたエレメントに関する条件
的機能はこれまで記載されていない。本明細書に開示するように、条件的サイレ
ンシングは本発明にしたがって構築された発現ベクターの１特性であり、機構と
して新規である。この目的のために、機能的に可逆的なサイレンシングは、サイ
レンサーエレメント内に位置するそのコグネイト部位の少なくとも１つに結合す
る少なくとも１つのネガティブ作用性転写因子と、条件誘導エレメント内に位置
するそのコグネイト部位の少なくとも１つに結合する少なくとも１つのポジティ
ブ作用性転写因子間の競合の結果として、定義される。こうした競合的結合は共
通するハイブリッドDNA結合部位で発生し得る（実施例１〜3）。競合はまた、ク
ロマチン構造などの転写に影響を与える下流部位、または転写開始複合体が結合
し、かつポジティブ作用性もしくはネガティブ作用性因子が転写に対してそれぞ
れが独立して制御作用をするTATAボックスでも作動しうる。
れている（Ogbourne and Antalis,1998）が、そうしたエレメントに関する条件
的機能はこれまで記載されていない。本明細書に開示するように、条件的サイレ
ンシングは本発明にしたがって構築された発現ベクターの１特性であり、機構と
して新規である。この目的のために、機能的に可逆的なサイレンシングは、サイ
レンサーエレメント内に位置するそのコグネイト部位の少なくとも１つに結合す
る少なくとも１つのネガティブ作用性転写因子と、条件誘導エレメント内に位置
するそのコグネイト部位の少なくとも１つに結合する少なくとも１つのポジティ
ブ作用性転写因子間の競合の結果として、定義される。こうした競合的結合は共
通するハイブリッドDNA結合部位で発生し得る（実施例１〜3）。競合はまた、ク
ロマチン構造などの転写に影響を与える下流部位、または転写開始複合体が結合
し、かつポジティブ作用性もしくはネガティブ作用性因子が転写に対してそれぞ
れが独立して制御作用をするTATAボックスでも作動しうる。
【００２５】
発現ベクターはさらに、発現領域内に１以上のスプライスドナーおよびアクセ
プター部位；発現領域の上流に翻訳開始のためのKozak共通配列、発現領域の下
流に翻訳の停止を確実にするための３つのフォワードリーディングフレーム内の
複数の停止コドン、１以上のmRNA分解シグナル、転写停止シグナル、ポリアデニ
ル化シグナル、および3'切断シグナルを含んでいてもよい。イントロンを含まな
い発現領域（例えばcDNAからのコード領域）については、１対のスプライスドナ
ーおよびアクセプター部位が好ましい場合と好ましくない場合がある。しかし、
誘導条件下のみで１以上の下流領域を発現させることを所望するならば、mRNA分
解シグナルを含ませるのが有用であろう。宿主ゲノム中に組み込まれる発現ベク
ターの複製を可能にするため、または自律複製エピソームとして、複製起点を１
つ含ませることができる。それぞれ染色体の分離および短縮化からの染色体末端
の保護を目的として、セントロメアおよびテロメア配列をも含ませることができ
る。宿主ゲノム中へのランダムもしくは標的組込みは、発現ベクターの維持をよ
り確実にすると見られるが、エピソームは選択圧によって維持することもでき、
あるいはまた、発現ベクターが単に一過性で存在する適用例においては好ましい
かもしれない。
プター部位；発現領域の上流に翻訳開始のためのKozak共通配列、発現領域の下
流に翻訳の停止を確実にするための３つのフォワードリーディングフレーム内の
複数の停止コドン、１以上のmRNA分解シグナル、転写停止シグナル、ポリアデニ
ル化シグナル、および3'切断シグナルを含んでいてもよい。イントロンを含まな
い発現領域（例えばcDNAからのコード領域）については、１対のスプライスドナ
ーおよびアクセプター部位が好ましい場合と好ましくない場合がある。しかし、
誘導条件下のみで１以上の下流領域を発現させることを所望するならば、mRNA分
解シグナルを含ませるのが有用であろう。宿主ゲノム中に組み込まれる発現ベク
ターの複製を可能にするため、または自律複製エピソームとして、複製起点を１
つ含ませることができる。それぞれ染色体の分離および短縮化からの染色体末端
の保護を目的として、セントロメアおよびテロメア配列をも含ませることができ
る。宿主ゲノム中へのランダムもしくは標的組込みは、発現ベクターの維持をよ
り確実にすると見られるが、エピソームは選択圧によって維持することもでき、
あるいはまた、発現ベクターが単に一過性で存在する適用例においては好ましい
かもしれない。
【００２６】
発現ベクターは遺伝子操作のために作製することもできる。例えば、抗生物質
耐性遺伝子（例えばampr、kanr、tetr）、レポーターもしくは選択マーカー（例
えばcat、DHFR、HSV-tk、lacZ、luc）、制限エンドヌクレアーゼのための複数の
認識部位を持つポリリンカー（例えばBamHI、EcoRI、HindIII、NotI、SfiI）、i
n vitro転写のための（例えばSP6、T3もしくはT7バクテリオファージポリメラー
ゼに関係する）プロモーター、およびin vitro複製のためのプライマーアニーリ
ング部位などの遺伝子操作である。
耐性遺伝子（例えばampr、kanr、tetr）、レポーターもしくは選択マーカー（例
えばcat、DHFR、HSV-tk、lacZ、luc）、制限エンドヌクレアーゼのための複数の
認識部位を持つポリリンカー（例えばBamHI、EcoRI、HindIII、NotI、SfiI）、i
n vitro転写のための（例えばSP6、T3もしくはT7バクテリオファージポリメラー
ゼに関係する）プロモーター、およびin vitro複製のためのプライマーアニーリ
ング部位などの遺伝子操作である。
【００２７】
「サイレンサーエレメント」は、下流の発現領域の転写に負の調節を与える発
現ベクターのエレメントである。発現ベクターからのサイレンサーエレメントの
除去は下流領域の基礎発現を増加させるものと予想される。上記のように、これ
はサイレンサー誘導領域中にホモ多量体（すなわち同一のサイレンサーエレメン
トの反復）またはヘテロ多量体（すなわち異なるサイレンサーエレメントもしく
はその変異体の混合物）として、少なくとも１、2、3、4、5、6もしくはそれ以
上で存在しうる。サイレンサーエレメント（例えば当分野で知られている共通配
列）は通常長さが約8から約200ヌクレオチドの間である。サイレンサーエレメン
トは大部分の細胞中で働く場合と働かない場合がある（すなわち、サイレンサー
は大部分の細胞中、かつ大部分の条件下で、細胞特異的に遺伝子発現を減少させ
る活性がある）が、好ましくは発現ベクター中に存在する条件誘導エレメントの
非誘導条件下でも遺伝子発現を減少させる活性があるものである。
現ベクターのエレメントである。発現ベクターからのサイレンサーエレメントの
除去は下流領域の基礎発現を増加させるものと予想される。上記のように、これ
はサイレンサー誘導領域中にホモ多量体（すなわち同一のサイレンサーエレメン
トの反復）またはヘテロ多量体（すなわち異なるサイレンサーエレメントもしく
はその変異体の混合物）として、少なくとも１、2、3、4、5、6もしくはそれ以
上で存在しうる。サイレンサーエレメント（例えば当分野で知られている共通配
列）は通常長さが約8から約200ヌクレオチドの間である。サイレンサーエレメン
トは大部分の細胞中で働く場合と働かない場合がある（すなわち、サイレンサー
は大部分の細胞中、かつ大部分の条件下で、細胞特異的に遺伝子発現を減少させ
る活性がある）が、好ましくは発現ベクター中に存在する条件誘導エレメントの
非誘導条件下でも遺伝子発現を減少させる活性があるものである。
【００２８】
「条件誘導エレメント」は、誘導条件下で下流の発現領域の転写に正の調節を
与える発現ベクターのエレメントである。これはやはり条件的に誘導されるエン
ハンサー領域から得ることができるが、大部分のもしくはあらゆる条件下で基礎
転写を増加させる構成的に活性なエンハンサーは条件誘導エレメントのための好
ましい起源ではない。発現ベクターからの条件誘導エレメントの除去は誘導条件
下で下流領域の発現を減少させるものと予想される。上記のように、これはホモ
多量体（すなわち同一の条件誘導エレメントの反復）またはヘテロ多量体（すな
わち異なる条件誘導エレメントもしくはその変異体の混合物）として、少なくと
も１、2、3、4、5、6もしくはそれ以上で存在しうる。条件誘導エレメント（例
えば当分野で知られている共通配列）は通常長さが約4から約100ヌクレオチドの
間である。条件誘導エレメントは大部分の細胞中で働く場合と働かない場合があ
るが、非誘導条件下では後者の場合が好ましい。
与える発現ベクターのエレメントである。これはやはり条件的に誘導されるエン
ハンサー領域から得ることができるが、大部分のもしくはあらゆる条件下で基礎
転写を増加させる構成的に活性なエンハンサーは条件誘導エレメントのための好
ましい起源ではない。発現ベクターからの条件誘導エレメントの除去は誘導条件
下で下流領域の発現を減少させるものと予想される。上記のように、これはホモ
多量体（すなわち同一の条件誘導エレメントの反復）またはヘテロ多量体（すな
わち異なる条件誘導エレメントもしくはその変異体の混合物）として、少なくと
も１、2、3、4、5、6もしくはそれ以上で存在しうる。条件誘導エレメント（例
えば当分野で知られている共通配列）は通常長さが約4から約100ヌクレオチドの
間である。条件誘導エレメントは大部分の細胞中で働く場合と働かない場合があ
るが、非誘導条件下では後者の場合が好ましい。
【００２９】
「転写因子」はサイレンサーエレメントもしくは条件誘導エレメント中にある
コグネイト配列に特異的に結合するタンパク質である。ポジティブ作用性転写因
子の条件誘導エレメント内のコグネイト部位への結合は発現を増加させ、ネガテ
ィブ作用性転写因子のサイレンサーエレメント内のコグネイト部位への結合は発
現を減少させることとなる。こうした増加もしくは減少は、制御された反応条件
下で、発現ベクター中の転写因子の有無、またはエレメントの有無に関して測定
することができる。転写因子の存在もしくは活性は、宿主細胞もしくは生物のタ
イプまたはその宿主を維持する条件に左右される。
コグネイト配列に特異的に結合するタンパク質である。ポジティブ作用性転写因
子の条件誘導エレメント内のコグネイト部位への結合は発現を増加させ、ネガテ
ィブ作用性転写因子のサイレンサーエレメント内のコグネイト部位への結合は発
現を減少させることとなる。こうした増加もしくは減少は、制御された反応条件
下で、発現ベクター中の転写因子の有無、またはエレメントの有無に関して測定
することができる。転写因子の存在もしくは活性は、宿主細胞もしくは生物のタ
イプまたはその宿主を維持する条件に左右される。
【００３０】
「プロモーター」は、発現ベクター中の下流領域の基礎発現に関係する。プロ
モーターは大部分の細胞中で働く場合と働かない場合がある（例えば遺伝子発現
は細胞特異的である）が、発現ベクター内に含まれるサイレンサー誘導領域の誘
導条件下では働かなければならない。プロモーターからの転写の開始は（例えば
RACEもしくはS1ヌクレアーゼプロテクション法によって）測定することができ、
こうした開始またはさらには安定な転写物の定常状態レベルもプロモーター活性
の尺度である。突然変異分析からプロモーターの境界および必須のヌクレオチド
が確認されるものと予想される（例えば、基礎転写因子もしくはRNAポリメラー
ゼサブユニットによる結合、ゲル遅延化、またはプロテクションは、プロモータ
ー内の特定のヌクレオチドの存在もしくは正体に依存する）。プロモーターはウ
イルス（例えば前初期遺伝子もしくは長末端反復）、組織特異的真核生物遺伝子
、または非組織特異的真核生物遺伝子（例えばハウスキーピング遺伝子）から取
得することができる。プロモーターは１以上のサイレンサーおよび条件誘導エレ
メントに対して異種であってもなくてもよい。サイレンサー誘導領域の機能に寄
与するプロモーターの部分が存在してもよい。
モーターは大部分の細胞中で働く場合と働かない場合がある（例えば遺伝子発現
は細胞特異的である）が、発現ベクター内に含まれるサイレンサー誘導領域の誘
導条件下では働かなければならない。プロモーターからの転写の開始は（例えば
RACEもしくはS1ヌクレアーゼプロテクション法によって）測定することができ、
こうした開始またはさらには安定な転写物の定常状態レベルもプロモーター活性
の尺度である。突然変異分析からプロモーターの境界および必須のヌクレオチド
が確認されるものと予想される（例えば、基礎転写因子もしくはRNAポリメラー
ゼサブユニットによる結合、ゲル遅延化、またはプロテクションは、プロモータ
ー内の特定のヌクレオチドの存在もしくは正体に依存する）。プロモーターはウ
イルス（例えば前初期遺伝子もしくは長末端反復）、組織特異的真核生物遺伝子
、または非組織特異的真核生物遺伝子（例えばハウスキーピング遺伝子）から取
得することができる。プロモーターは１以上のサイレンサーおよび条件誘導エレ
メントに対して異種であってもなくてもよい。サイレンサー誘導領域の機能に寄
与するプロモーターの部分が存在してもよい。
【００３１】
遺伝子発現が特定の発生段階もしくは組織にターゲッティングされるいくつか
の適用例においては、それぞれ空間的もしくは時間的に制限された発現が望まし
い。例えば、こうしたプロモーターは、血管形成増殖因子を虚血筋肉に、または
有害遺伝子を固形腫瘍に送達する発現ベクター中で使用することができる（Pren
tice and Webster 1995；Webster,1999ab；Alexanderら、1999）。組織特異的プ
ロモーター中の調節エレメントは通常ポジティブ作用性転写因子により結合され
るので、発現ベクター内にそれを含めることは標的組織における基礎（すなわち
非誘導）遺伝子発現を増加させると予想されていた。この問題はトランスジーン
の調節および遺伝子ターゲッティング法における組織特異的調節の使用を妨げる
制限要因となっていた。しかし、本発明は、この制限を排除するものである。な
んとなれば、発現ベクター内にサイレンサーエレメントを含ませることで、非誘
導状態において組織特異的プロモーターエレメントの活性を条件的にサイレンシ
ングし、誘導されたときにそれらを活動させることができるからである。
の適用例においては、それぞれ空間的もしくは時間的に制限された発現が望まし
い。例えば、こうしたプロモーターは、血管形成増殖因子を虚血筋肉に、または
有害遺伝子を固形腫瘍に送達する発現ベクター中で使用することができる（Pren
tice and Webster 1995；Webster,1999ab；Alexanderら、1999）。組織特異的プ
ロモーター中の調節エレメントは通常ポジティブ作用性転写因子により結合され
るので、発現ベクター内にそれを含めることは標的組織における基礎（すなわち
非誘導）遺伝子発現を増加させると予想されていた。この問題はトランスジーン
の調節および遺伝子ターゲッティング法における組織特異的調節の使用を妨げる
制限要因となっていた。しかし、本発明は、この制限を排除するものである。な
んとなれば、発現ベクター内にサイレンサーエレメントを含ませることで、非誘
導状態において組織特異的プロモーターエレメントの活性を条件的にサイレンシ
ングし、誘導されたときにそれらを活動させることができるからである。
【００３２】
発現ベクターの成分は哺乳動物遺伝子（例えば、アデニンヌクレオチド輸送体
-2、アルブミン、アルデヒドデヒドロゲナーゼ-3、B29/Ig-β、心臓アクチンも
しくはミオシン重鎖、CD95/Fas/APO1、クリスタリン、ドーパミンβヒドロキシ
ラーゼ、エラスターゼ、エンドセリン、エノラーゼ、エリトロポエチン、αフェ
トプロテイン、グロビン、グルココルチコイド受容体、グルタチオンＰトランス
フェラーゼ、成長ホルモン、熱ショックタンパク質、ヘムオキシゲナーゼ、ヒス
トン、インスリン、ソマトメジン、インターフェロン、腸管三葉型因子、メタロ
チオネイン、核ホルモン受容体、フェニルエタノールアミンN-メチルトランスフ
ェラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、前立腺特異的抗原、プロタミン、ピル
ビン酸キナーゼ、レニン、SCG10、骨格アクチンもしくはトロポニン、ナトリウ
ムチャネルタイプII、シナプシン、精巣特異的ヒストンH1t、甲状腺受容体-β1
、トランスフェリン、チロシンヒドロキシラーゼ、血管細胞接着分子-1、フォン
ビルブラント因子）；ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス
、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバールウイルスおよびその他の単純
ヘルペスウイルス、レンチウイルス、モロニー白血病もしくは肉腫ウイルス、マ
ウス乳癌ウイルス、ポリオーマもしくはSV40ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ワ
クシニアウイルス）、あまり好ましくはないが、植物、昆虫、かび、真菌および
細菌遺伝子から誘導することができる。サイレンサーおよび条件誘導エレメント
、プロモーター、転写因子、ならびにそれらの結合部位の詳細については、引用
した参考文献を参照されたい。
-2、アルブミン、アルデヒドデヒドロゲナーゼ-3、B29/Ig-β、心臓アクチンも
しくはミオシン重鎖、CD95/Fas/APO1、クリスタリン、ドーパミンβヒドロキシ
ラーゼ、エラスターゼ、エンドセリン、エノラーゼ、エリトロポエチン、αフェ
トプロテイン、グロビン、グルココルチコイド受容体、グルタチオンＰトランス
フェラーゼ、成長ホルモン、熱ショックタンパク質、ヘムオキシゲナーゼ、ヒス
トン、インスリン、ソマトメジン、インターフェロン、腸管三葉型因子、メタロ
チオネイン、核ホルモン受容体、フェニルエタノールアミンN-メチルトランスフ
ェラーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、前立腺特異的抗原、プロタミン、ピル
ビン酸キナーゼ、レニン、SCG10、骨格アクチンもしくはトロポニン、ナトリウ
ムチャネルタイプII、シナプシン、精巣特異的ヒストンH1t、甲状腺受容体-β1
、トランスフェリン、チロシンヒドロキシラーゼ、血管細胞接着分子-1、フォン
ビルブラント因子）；ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス
、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバールウイルスおよびその他の単純
ヘルペスウイルス、レンチウイルス、モロニー白血病もしくは肉腫ウイルス、マ
ウス乳癌ウイルス、ポリオーマもしくはSV40ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ワ
クシニアウイルス）、あまり好ましくはないが、植物、昆虫、かび、真菌および
細菌遺伝子から誘導することができる。サイレンサーおよび条件誘導エレメント
、プロモーター、転写因子、ならびにそれらの結合部位の詳細については、引用
した参考文献を参照されたい。
【００３３】
下流領域の発現は、例えば高温（例えば約39℃よりも高い温度）、低酸素（例
えば約10％よりも低い酸素濃度）、炎症（例えばLPSもしくは炎症サイトカイン
による処置）、虚血（例えばPrenticeら、1997に示されるような冠動脈結紮；Ta
keshitaら、1994にあるような大腿動脈結紮）、酸化的ストレス（例えばWebster
、1999bに示されるような心筋細胞の低酸素後の再酸素添加）、増殖刺激、収縮
機能、抗酸化剤、および筋繊維ストレッチなどの１以上の条件刺激によって誘導
することができる。
えば約10％よりも低い酸素濃度）、炎症（例えばLPSもしくは炎症サイトカイン
による処置）、虚血（例えばPrenticeら、1997に示されるような冠動脈結紮；Ta
keshitaら、1994にあるような大腿動脈結紮）、酸化的ストレス（例えばWebster
、1999bに示されるような心筋細胞の低酸素後の再酸素添加）、増殖刺激、収縮
機能、抗酸化剤、および筋繊維ストレッチなどの１以上の条件刺激によって誘導
することができる。
【００３４】
遺伝子発現のモジュレーションは、転写開始、転写物の安定性、転写物のタン
パク質産物への翻訳、タンパク質の安定性、またはそれらの組合せに影響を与え
ることによって行なわれる。量的な効果は以下のような技法によって測定するこ
とができる：in vitro転写、in vitro翻訳、ノーザンハイブリダイゼーション、
核酸ハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、ランオ
ン（run-on）転写、サザンハイブリダイゼーション、細胞表面タンパク質ラベリ
ング、代謝タンパク質ラベリング、抗体結合、免疫沈降（IP）、酵素結合イムノ
ソルベントアッセイ（ELISA）、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、ラジ
オイムノアッセイ（RIA）、蛍光もしくは組織化学的染色、顕微鏡およびデジタ
ル画像解析、ならびに蛍光活性化細胞分析もしくはソーティング（FACS）。
パク質産物への翻訳、タンパク質の安定性、またはそれらの組合せに影響を与え
ることによって行なわれる。量的な効果は以下のような技法によって測定するこ
とができる：in vitro転写、in vitro翻訳、ノーザンハイブリダイゼーション、
核酸ハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、ランオ
ン（run-on）転写、サザンハイブリダイゼーション、細胞表面タンパク質ラベリ
ング、代謝タンパク質ラベリング、抗体結合、免疫沈降（IP）、酵素結合イムノ
ソルベントアッセイ（ELISA）、電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）、ラジ
オイムノアッセイ（RIA）、蛍光もしくは組織化学的染色、顕微鏡およびデジタ
ル画像解析、ならびに蛍光活性化細胞分析もしくはソーティング（FACS）。
【００３５】
レポーターもしくは選択マーカー遺伝子であってそのタンパク質産物を容易に
アッセイすることができるものの使用によって、遺伝子発現をアッセイすること
ができる。レポーター遺伝子として例えば以下のものが含まれる：アルカリホス
ファターゼ、βガラクトシダーゼ（lacZ）、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（CAT）、βグルクロニダーゼ（GUS）、細菌／昆虫／海洋性無脊
椎動物ルシフェラーゼ（LUC）、グリーンおよびレッド蛍光タンパク質（それぞ
れGFPおよびRFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、βラクタマーゼ、な
らびにそれらの誘導体（例えばブルーEBFP、シアンECFP、イエローグリーンEYFP
、脱安定化GFP変異体、安定化GFP変異体、またはClontechからLIVING COLORS蛍
光タンパク質として販売されている融合変異体）。こうしたレポーター遺伝子は
色素原、蛍光もしくはルミネセンスシグナルによって都合よくアッセイされるコ
グネイト基質を使用することとなる。あるいは、アッセイ産物を異種エピトープ
であってそのためのコグネイト抗体もしくはアフィニティー樹脂が入手し得るも
の（例えば、FLAG、MYC、SV40 T抗原、グルタチオントランスフェラーゼ、ヘキ
サヒスチジン、マルトース結合タンパク質）でタグ付けすることができる。選択
マーカー遺伝子が存在する薬物の例は、アンピシリン、ゲネチシン（G418）／カ
ナマイシン／ネオマイシン、ヒグロマイシン、プロマイシン、およびテトラサイ
クリンである。感受性宿主細胞もしくは栄養要求体における選択マーカーとして
酵素（例えばジフテリアトキシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、HSV-1チミジン
キナーゼ）を使用することができる。例えば、ジフテリアトキシンは系統マッピ
ングにおいて細胞を除去するために使用することができ、段階的に濃度を増大さ
せたメトトレキセートは遺伝子増幅によりDHFR選択マーカーに連結した発現ベク
ターのコピー数を増加させることができ、ガンシクロビルはウイルスチミジンキ
ナーゼ選択マーカーについてネガティブ選択することができる。
アッセイすることができるものの使用によって、遺伝子発現をアッセイすること
ができる。レポーター遺伝子として例えば以下のものが含まれる：アルカリホス
ファターゼ、βガラクトシダーゼ（lacZ）、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（CAT）、βグルクロニダーゼ（GUS）、細菌／昆虫／海洋性無脊
椎動物ルシフェラーゼ（LUC）、グリーンおよびレッド蛍光タンパク質（それぞ
れGFPおよびRFP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、βラクタマーゼ、な
らびにそれらの誘導体（例えばブルーEBFP、シアンECFP、イエローグリーンEYFP
、脱安定化GFP変異体、安定化GFP変異体、またはClontechからLIVING COLORS蛍
光タンパク質として販売されている融合変異体）。こうしたレポーター遺伝子は
色素原、蛍光もしくはルミネセンスシグナルによって都合よくアッセイされるコ
グネイト基質を使用することとなる。あるいは、アッセイ産物を異種エピトープ
であってそのためのコグネイト抗体もしくはアフィニティー樹脂が入手し得るも
の（例えば、FLAG、MYC、SV40 T抗原、グルタチオントランスフェラーゼ、ヘキ
サヒスチジン、マルトース結合タンパク質）でタグ付けすることができる。選択
マーカー遺伝子が存在する薬物の例は、アンピシリン、ゲネチシン（G418）／カ
ナマイシン／ネオマイシン、ヒグロマイシン、プロマイシン、およびテトラサイ
クリンである。感受性宿主細胞もしくは栄養要求体における選択マーカーとして
酵素（例えばジフテリアトキシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、HSV-1チミジン
キナーゼ）を使用することができる。例えば、ジフテリアトキシンは系統マッピ
ングにおいて細胞を除去するために使用することができ、段階的に濃度を増大さ
せたメトトレキセートは遺伝子増幅によりDHFR選択マーカーに連結した発現ベク
ターのコピー数を増加させることができ、ガンシクロビルはウイルスチミジンキ
ナーゼ選択マーカーについてネガティブ選択することができる。
【００３６】
in vivoで転写もしくは翻訳活性を測定する技術は当分野で知られている。例
えば、核ランオンアッセイを利用して、レポーター遺伝子の転写を測定すること
ができる。レポーター遺伝子の翻訳は翻訳産物の活性を調べることによって測定
することができる。レポーター遺伝子の活性は、ポリヌクレオチド産物の転写（
例えば、GFP転写物のRT-PCR）、ポリペプチド産物の翻訳（例えば、GFPタンパク
質のイムノアッセイ）、およびレポータータンパク質自体の酵素活性（例えば、
GFPの蛍光もしくはそのエネルギー転移）の存在量の１つ以上を調べることによ
って測定することができる。
えば、核ランオンアッセイを利用して、レポーター遺伝子の転写を測定すること
ができる。レポーター遺伝子の翻訳は翻訳産物の活性を調べることによって測定
することができる。レポーター遺伝子の活性は、ポリヌクレオチド産物の転写（
例えば、GFP転写物のRT-PCR）、ポリペプチド産物の翻訳（例えば、GFPタンパク
質のイムノアッセイ）、およびレポータータンパク質自体の酵素活性（例えば、
GFPの蛍光もしくはそのエネルギー転移）の存在量の１つ以上を調べることによ
って測定することができる。
【００３７】
「発現される領域」または「発現領域」は、どんな遺伝子に由来するものでも
よく、またプロモーターに対してどちらの方向でも設定することができる。cRNA
、アンチセンスおよびRNA干渉を作製するためには、アンチセンス方向の発現領
域が有用となる。遺伝子は、その宿主細胞もしくは生物、その同一の種から誘導
されるか、またはde novo設計することができるが、古細菌、細菌、真菌、植物
もしくは動物起源のものが好ましい。遺伝子は限定するわけではないが以下のク
ラスの１以上の生理学的機能を持つものとする：アルブミン、アミロイド、アポ
リポタンパク質、グロビン、サルコメア成分およびトランスフェリンなどの構造
タンパク質；サイトカイン、ホルモンならびに細胞増殖、有糸分裂、減数分裂、
分化および発生を調節するその他の可溶性因子；こうした因子のための可溶性お
よび膜受容体；接着分子；細胞表面受容体およびそのリガンド；クラスター分化
（CD）抗原、抗体およびT細胞抗原受容体鎖、組織適合性抗原、ならびにその他
の免疫メディエーター；ケモカイン、その受容体、およびその他の炎症に関与す
る因子；炎症の脂質メディエーターを産生する酵素およびその調節因子；凝固お
よび補体因子；イオンチャネルおよびポンプ；神経伝達物質；好中性(neutrophi
c)因子およびその受容体；腫瘍遺伝子、腫瘍サプレッサーおよびその他のシグナ
ル伝達物質；プロテアーゼおよびそのインヒビター；異化もしくは代謝酵素、な
らびにその調節物質。一部の遺伝子は、選択的転写物を産生するか、ホモポリマ
ーもしくはヘテロポリマーとして組み立てられるサブユニットをコードするか、
プロテアーゼ切断によって活性化されるプロペプチドを産生する。
よく、またプロモーターに対してどちらの方向でも設定することができる。cRNA
、アンチセンスおよびRNA干渉を作製するためには、アンチセンス方向の発現領
域が有用となる。遺伝子は、その宿主細胞もしくは生物、その同一の種から誘導
されるか、またはde novo設計することができるが、古細菌、細菌、真菌、植物
もしくは動物起源のものが好ましい。遺伝子は限定するわけではないが以下のク
ラスの１以上の生理学的機能を持つものとする：アルブミン、アミロイド、アポ
リポタンパク質、グロビン、サルコメア成分およびトランスフェリンなどの構造
タンパク質；サイトカイン、ホルモンならびに細胞増殖、有糸分裂、減数分裂、
分化および発生を調節するその他の可溶性因子；こうした因子のための可溶性お
よび膜受容体；接着分子；細胞表面受容体およびそのリガンド；クラスター分化
（CD）抗原、抗体およびT細胞抗原受容体鎖、組織適合性抗原、ならびにその他
の免疫メディエーター；ケモカイン、その受容体、およびその他の炎症に関与す
る因子；炎症の脂質メディエーターを産生する酵素およびその調節因子；凝固お
よび補体因子；イオンチャネルおよびポンプ；神経伝達物質；好中性(neutrophi
c)因子およびその受容体；腫瘍遺伝子、腫瘍サプレッサーおよびその他のシグナ
ル伝達物質；プロテアーゼおよびそのインヒビター；異化もしくは代謝酵素、な
らびにその調節物質。一部の遺伝子は、選択的転写物を産生するか、ホモポリマ
ーもしくはヘテロポリマーとして組み立てられるサブユニットをコードするか、
プロテアーゼ切断によって活性化されるプロペプチドを産生する。
【００３８】
１例として、サイトカインのクラスには以下のものが含まれる：4-1BBリガン
ド、アンフィレギュリン(amphiregulin)、アンギオポエチン１〜アンギオポエチ
ン4、APO3リガンド、BMP-2〜BMP-15、BDNF、ベータセルリン(betacellulin)、カ
ルジオトロフィン(cardiotrophin)-1、CD27リガンド、CD30リガンド、CD40リガ
ンド、CNTF、EGF、エピレグリン、エリトロポエチン、Fasリガンド、FGF-1〜FGF
-19、Flt-3リガンド、G-CSF、GDF-1、GDF-3、GDF-8〜GDF-10、GITRリガンド、GM
-CSF、ヘパリン結合EGF、肝細胞増殖因子、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IGF-I、IG
F-II、インヒビンA、インヒビンB、IL-1α、IL-1β、IL-2〜IL-7、IL-9〜IL-11
、IL-12 p35、IL-12 p40、IL-13〜IL-19、レプチン、LIF、LIGHT、LT-β、リン
ホタクチン(lymphotactin)、M-CSF、ミドカイン(midkine)、MIS、マクロファー
ジ刺激性タンパク質、ニューレグリン(neuregulin)、NGF、NT-3、NT-4、NT-6、
オンコスタチンM、OX40リガンド、PDGF-A、PDGF-B、胎盤成長因子、プレイオト
ロフィン(pleiotrophin)、SMDF、SCF、TALL-1、TALL-2、TGF-α、TNF-β1〜β3
、チモポエチン、TNF-α、TNF-β、TRAIL、TRANCE、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、V
EGF-DおよびVEGI。これらのサイトカインの大部分は高もしくは低親和性の１種
以上の既知の受容体のリガンドである。対照的に、HER2受容体のリガンドはまだ
知られていない。これらのサイトカインのさらなる情報は以下の文献に含まれて
いる記事および参照リストから取得することができる：Nicola（Guidebook to C
ytokines and Their Receptors, Oxford Press, 1997）；Thomson（The Cytokin
e Handbook, Academic Press, 1988）；R&D Systems catalogs and its web sit
e；ならびに米国特許第5,773,252号および第5,985,614号。
ド、アンフィレギュリン(amphiregulin)、アンギオポエチン１〜アンギオポエチ
ン4、APO3リガンド、BMP-2〜BMP-15、BDNF、ベータセルリン(betacellulin)、カ
ルジオトロフィン(cardiotrophin)-1、CD27リガンド、CD30リガンド、CD40リガ
ンド、CNTF、EGF、エピレグリン、エリトロポエチン、Fasリガンド、FGF-1〜FGF
-19、Flt-3リガンド、G-CSF、GDF-1、GDF-3、GDF-8〜GDF-10、GITRリガンド、GM
-CSF、ヘパリン結合EGF、肝細胞増殖因子、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IGF-I、IG
F-II、インヒビンA、インヒビンB、IL-1α、IL-1β、IL-2〜IL-7、IL-9〜IL-11
、IL-12 p35、IL-12 p40、IL-13〜IL-19、レプチン、LIF、LIGHT、LT-β、リン
ホタクチン(lymphotactin)、M-CSF、ミドカイン(midkine)、MIS、マクロファー
ジ刺激性タンパク質、ニューレグリン(neuregulin)、NGF、NT-3、NT-4、NT-6、
オンコスタチンM、OX40リガンド、PDGF-A、PDGF-B、胎盤成長因子、プレイオト
ロフィン(pleiotrophin)、SMDF、SCF、TALL-1、TALL-2、TGF-α、TNF-β1〜β3
、チモポエチン、TNF-α、TNF-β、TRAIL、TRANCE、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、V
EGF-DおよびVEGI。これらのサイトカインの大部分は高もしくは低親和性の１種
以上の既知の受容体のリガンドである。対照的に、HER2受容体のリガンドはまだ
知られていない。これらのサイトカインのさらなる情報は以下の文献に含まれて
いる記事および参照リストから取得することができる：Nicola（Guidebook to C
ytokines and Their Receptors, Oxford Press, 1997）；Thomson（The Cytokin
e Handbook, Academic Press, 1988）；R&D Systems catalogs and its web sit
e；ならびに米国特許第5,773,252号および第5,985,614号。
【００３９】
その他の酵素および細胞タンパク質として以下のものが含まれる：アデノシン
デアミナーゼ、アンギオスタチン、アポトーシスインヒビタータンパク質（AIP1
もしくはAIP2）、BCL2およびMYCファミリーメンバー、カタラーゼ、シャペロニ
ンおよび熱ショックタンパク質、サイクリン、デオキシリボヌクレアーゼ、DMD2
、DT-およびNADPH-ジアホラーゼ、エンドスタチン、エンドセリン、フマジリン
、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、成長ホル
モン、熱ショック因子、インスリン、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ、キナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP-1、MMP
-2、MMP-9、MT-1-MMP）およびそのインヒビター（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIM
P-4）、一酸化窒素シンターゼ（iNOSもしくはnNOS）、ホスファターゼ、プロリ
フェリン、リボヌクレアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、サーバイビン(s
urvivin)、チミジンキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ならびにウロ
キナーゼ。
デアミナーゼ、アンギオスタチン、アポトーシスインヒビタータンパク質（AIP1
もしくはAIP2）、BCL2およびMYCファミリーメンバー、カタラーゼ、シャペロニ
ンおよび熱ショックタンパク質、サイクリン、デオキシリボヌクレアーゼ、DMD2
、DT-およびNADPH-ジアホラーゼ、エンドスタチン、エンドセリン、フマジリン
、グルタチオンペルオキシダーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、成長ホル
モン、熱ショック因子、インスリン、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ、キナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP-1、MMP
-2、MMP-9、MT-1-MMP）およびそのインヒビター（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIM
P-4）、一酸化窒素シンターゼ（iNOSもしくはnNOS）、ホスファターゼ、プロリ
フェリン、リボヌクレアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、サーバイビン(s
urvivin)、チミジンキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ならびにウロ
キナーゼ。
【００４０】
下流の発現領域は翻訳融合物をコードすることもある。ポリペプチドをコード
する領域のオープンリーディングフレームと異種ドメイン少なくとも１つを効果
的に連結することができる。異種ドメインとしてレポーターもしくは選択マーカ
ーを使用する場合は、融合タンパク質の発現を容易にアッセイまたは所在決定す
ることができる。異種ドメインはアフィニティーもしくはエピトープタグでもよ
い。
する領域のオープンリーディングフレームと異種ドメイン少なくとも１つを効果
的に連結することができる。異種ドメインとしてレポーターもしくは選択マーカ
ーを使用する場合は、融合タンパク質の発現を容易にアッセイまたは所在決定す
ることができる。異種ドメインはアフィニティーもしくはエピトープタグでもよ
い。
【００４１】
ポリヌクレオチドをリンカーオリゴヌクレオチドに連結するか、特異的結合相
手の１メンバーとのコンジュゲートとしてもよい（例えば抗体／ジゴキシゲニン
／ハプテン／ペプチドエピトープ、ビオチン-アビジン／ストレプトアビジン、
グルタチオントランスフェラーゼもしくはGST-グルタチオン、マルトース結合性
タンパク質-マルトース、ポリヒスチジン-ニッケル、タンパク質A／G-イムノグ
ロブリン）。ポリヌクレオチドを、結合するメンバーをコードするヌクレオチド
配列の連結によってコンジュゲート化することができる。こうして連結もしくは
コンジュゲート化したポリヌクレオチドがコードされた融合体を製造するか、あ
るいは化学的架橋形成によって結合メンバー上の反応性分子に直接化学的に連結
することによって、ポリペプチドを特異的結合相手の１メンバーと結合させるこ
ともできる。こうしたポリヌクレオチドおよびポリペプチドをアフィニティー試
薬として使用して、発現ベクターの転写物もしくはタンパク質産物を同定し、単
離し、またその特異的結合に関与する相互作用を検出することができる。転写物
もしくはタンパク質産物のアフィニティー結合の前もしくは後に、ポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチドに結合させたメンバーをそのコグネイト結合メンバー
に結合させてもよい。これによって、溶液中または支持体に固定した複合体を作
製することができる。（例えば、エンテロキナーゼ、第Ｘa因子、ICE、トロンビ
ンのための）プロテアーゼ認識部位を隣接するドメインの間に含ませることによ
って、部位特異的タンパク質分解を可能にし、これらのドメインを分離し、かつ
／またはタンパク質活性を不活性化することができる。
手の１メンバーとのコンジュゲートとしてもよい（例えば抗体／ジゴキシゲニン
／ハプテン／ペプチドエピトープ、ビオチン-アビジン／ストレプトアビジン、
グルタチオントランスフェラーゼもしくはGST-グルタチオン、マルトース結合性
タンパク質-マルトース、ポリヒスチジン-ニッケル、タンパク質A／G-イムノグ
ロブリン）。ポリヌクレオチドを、結合するメンバーをコードするヌクレオチド
配列の連結によってコンジュゲート化することができる。こうして連結もしくは
コンジュゲート化したポリヌクレオチドがコードされた融合体を製造するか、あ
るいは化学的架橋形成によって結合メンバー上の反応性分子に直接化学的に連結
することによって、ポリペプチドを特異的結合相手の１メンバーと結合させるこ
ともできる。こうしたポリヌクレオチドおよびポリペプチドをアフィニティー試
薬として使用して、発現ベクターの転写物もしくはタンパク質産物を同定し、単
離し、またその特異的結合に関与する相互作用を検出することができる。転写物
もしくはタンパク質産物のアフィニティー結合の前もしくは後に、ポリヌクレオ
チドもしくはポリペプチドに結合させたメンバーをそのコグネイト結合メンバー
に結合させてもよい。これによって、溶液中または支持体に固定した複合体を作
製することができる。（例えば、エンテロキナーゼ、第Ｘa因子、ICE、トロンビ
ンのための）プロテアーゼ認識部位を隣接するドメインの間に含ませることによ
って、部位特異的タンパク質分解を可能にし、これらのドメインを分離し、かつ
／またはタンパク質活性を不活性化することができる。
【００４２】
本発明にしたがってそれぞれトランスフェクションもしくはトランスジェネシ
ス技法によって哺乳動物細胞もしくは非ヒト哺乳動物に適用する発現ベクターの
量は、その発現ベクターを宿主細胞もしくは非生殖系組織に一過性もしくは安定
的な基準（例えば投与停止後少なくとも１週間はその細胞もしくは組織内に発現
ベクターを検出することができる）で導入するのに有効な量である。ベクターを
エピソームとして維持するか、または宿主染色体中に組み込むことができる。し
たがって、用語「有効な量」とは、指示された効果を達成するために必要な組成
物の量を意味する。
ス技法によって哺乳動物細胞もしくは非ヒト哺乳動物に適用する発現ベクターの
量は、その発現ベクターを宿主細胞もしくは非生殖系組織に一過性もしくは安定
的な基準（例えば投与停止後少なくとも１週間はその細胞もしくは組織内に発現
ベクターを検出することができる）で導入するのに有効な量である。ベクターを
エピソームとして維持するか、または宿主染色体中に組み込むことができる。し
たがって、用語「有効な量」とは、指示された効果を達成するために必要な組成
物の量を意味する。
【００４３】
本発明の方法において有用な医薬組成物を固形剤もしくは液剤（特に保存およ
び輸送用に核酸を安定化させるため）、点眼剤、坐剤、エアロゾル剤、持続性放
出剤、またはその他の製剤として投与することができる。発現ベクターの他に、
こうした組成物は、薬学上許容される担体およびビヒクル、バッファー、賦形剤
、塩、安定化剤、保存剤、ならびに薬物投与を促進および容易にするその他の成
分を含んでいてもよい。該組成物には例えば、以下のような成分を含ませること
ができる：ナノスフェア、ミクロスフェア、リポソーム、複製欠損もしくは複製
可能ウイルス粒子、核酸を濃縮する化学的トランスフェクト剤、ならびに抗体／
抗原、受容体／リガンド（例えば、トランスフェリン、ガラクトシル化ペプチド
）、またはその他の細胞もしくは組織よりも優先的な標的細胞もしくは組織への
発現ベクターの導入を指令するその他の特異的な結合相手の１メンバー。
び輸送用に核酸を安定化させるため）、点眼剤、坐剤、エアロゾル剤、持続性放
出剤、またはその他の製剤として投与することができる。発現ベクターの他に、
こうした組成物は、薬学上許容される担体およびビヒクル、バッファー、賦形剤
、塩、安定化剤、保存剤、ならびに薬物投与を促進および容易にするその他の成
分を含んでいてもよい。該組成物には例えば、以下のような成分を含ませること
ができる：ナノスフェア、ミクロスフェア、リポソーム、複製欠損もしくは複製
可能ウイルス粒子、核酸を濃縮する化学的トランスフェクト剤、ならびに抗体／
抗原、受容体／リガンド（例えば、トランスフェリン、ガラクトシル化ペプチド
）、またはその他の細胞もしくは組織よりも優先的な標的細胞もしくは組織への
発現ベクターの導入を指令するその他の特異的な結合相手の１メンバー。
【００４４】
現行の規制にしたがう遺伝子および細胞産物の製造は政府機関（例えば、米国
食品医薬品局）によって適正実験室実施規範（GLP）および適正製造規範（GMP）
の規制を受けることとなる。これには正確で完全な記録の保存ならびにQA/QCの
モニターが要求される。さらに、インフォームドコンセントが得られること；生
成物の安全性、生物活性、適切な投与量ならびに有効性がフェーズ毎に研究され
ること；結果が統計的に有意であること；ならびに倫理上のガイドラインに従う
こと、を確認するため、当局および学会審議会による患者のプロトコルの監視が
想定される。動物モデルの使用のプロトコル、ならびに毒性化学物質の使用およ
び規制への適合性についての同様の監視が要求される。
食品医薬品局）によって適正実験室実施規範（GLP）および適正製造規範（GMP）
の規制を受けることとなる。これには正確で完全な記録の保存ならびにQA/QCの
モニターが要求される。さらに、インフォームドコンセントが得られること；生
成物の安全性、生物活性、適切な投与量ならびに有効性がフェーズ毎に研究され
ること；結果が統計的に有意であること；ならびに倫理上のガイドラインに従う
こと、を確認するため、当局および学会審議会による患者のプロトコルの監視が
想定される。動物モデルの使用のプロトコル、ならびに毒性化学物質の使用およ
び規制への適合性についての同様の監視が要求される。
【００４５】
本発明の別の態様は、例えば、遺伝子治療（例えば、治療もしくは予防用）、
組換え生物学的製剤の製造、遺伝子診断、薬物スクリーニング、ならびに遺伝子
研究（例えば、ゲノミクス、プロテオミクス、ヒト疾患のin vivoおよびin vitr
oモデル）などの用途における発現ベクターの使用である。
組換え生物学的製剤の製造、遺伝子診断、薬物スクリーニング、ならびに遺伝子
研究（例えば、ゲノミクス、プロテオミクス、ヒト疾患のin vivoおよびin vitr
oモデル）などの用途における発現ベクターの使用である。
【００４６】
本発明を単独で使用してよく、または標準的な医療もしくは手術による治療に
加えて使用してもよい。本明細書で使用する「治療」とは以下の意味である：哺
乳動物の症状の重篤度を低下もしくは軽減すること；症状の数を減少させること
；症状の悪化もしくは進行を防止すること；感染性因子、自己免疫細胞および癌
性細胞を抑制もしくは排除すること；罹患していない患者の感染もしくは疾患を
予防すること；またはそれらの組合せ。例えば、心臓疾患の治療には、虚血性損
傷の低下もしくは予防、再狭窄の抑制、心臓もしくは血管系疾患のその他の病理
的影響の緩和、低酸素症の診断、またはそれらの組合せが含まれる。
加えて使用してもよい。本明細書で使用する「治療」とは以下の意味である：哺
乳動物の症状の重篤度を低下もしくは軽減すること；症状の数を減少させること
；症状の悪化もしくは進行を防止すること；感染性因子、自己免疫細胞および癌
性細胞を抑制もしくは排除すること；罹患していない患者の感染もしくは疾患を
予防すること；またはそれらの組合せ。例えば、心臓疾患の治療には、虚血性損
傷の低下もしくは予防、再狭窄の抑制、心臓もしくは血管系疾患のその他の病理
的影響の緩和、低酸素症の診断、またはそれらの組合せが含まれる。
【００４７】
特に、虚血性心疾患および重篤な四肢虚血がある患者に、プラスミドベクター
およびアデノウイルスベクターによって、VEGFおよびFGF遺伝子を含む血管形成
因子を送達する、少なくとも6例の臨床試験を現在実施中である（Genetic Engin
eering News Vol.18, Number 17, October 1998；Cardiology Today, Vol 3, Nu
mber 1, January 2000、参照）。最終目的は、虚血を治療するために血管形成お
よび副行血管成長を刺激することである。しかし、これらの治験では、標的組織
内で遺伝子発現を厳密に調節するという問題に対して本発明が提供する解決法が
開示されていない（Prentice and Webster, 1995；Webster, 1999ab；Alexander
ら、1999）。代わりに、構成的に活性な（CMV）プロモーターを使用したので、
別の組織でのこの増殖因子の発現があるため、この操作は十分効果的ではない。
しかし、本発明においては、条件によってサイレント化される低酸素誘導性発現
ベクターを使用して、VEGFを虚血状態の心筋もしくは四肢筋肉に送達することが
できる。本発明を使用すると、VEGFが、健全に潅流された組織では低レベルの基
底活性で、また低酸素状態である虚血組織では高レベルの誘導された活性で発現
することになる（Leeら、2000）ので、血管形成を標的組織に限定し、安全でよ
り効果的な治療法が提供される。
およびアデノウイルスベクターによって、VEGFおよびFGF遺伝子を含む血管形成
因子を送達する、少なくとも6例の臨床試験を現在実施中である（Genetic Engin
eering News Vol.18, Number 17, October 1998；Cardiology Today, Vol 3, Nu
mber 1, January 2000、参照）。最終目的は、虚血を治療するために血管形成お
よび副行血管成長を刺激することである。しかし、これらの治験では、標的組織
内で遺伝子発現を厳密に調節するという問題に対して本発明が提供する解決法が
開示されていない（Prentice and Webster, 1995；Webster, 1999ab；Alexander
ら、1999）。代わりに、構成的に活性な（CMV）プロモーターを使用したので、
別の組織でのこの増殖因子の発現があるため、この操作は十分効果的ではない。
しかし、本発明においては、条件によってサイレント化される低酸素誘導性発現
ベクターを使用して、VEGFを虚血状態の心筋もしくは四肢筋肉に送達することが
できる。本発明を使用すると、VEGFが、健全に潅流された組織では低レベルの基
底活性で、また低酸素状態である虚血組織では高レベルの誘導された活性で発現
することになる（Leeら、2000）ので、血管形成を標的組織に限定し、安全でよ
り効果的な治療法が提供される。
【００４８】
患者に投与される組成物の量は、好ましくはその投与にともなう利点を上回る
有害効果を誘発することがない量が好ましい。したがって、治療は訓練された医
師の管理、または獣医による注意深い監視のもとで実施するのが好ましい。
有害効果を誘発することがない量が好ましい。したがって、治療は訓練された医
師の管理、または獣医による注意深い監視のもとで実施するのが好ましい。
【００４９】
本発明の組成物を任意の既知の経路（例えば、経腸、非経口、局所）によって
投与することができる。非経口経路として、限定するわけではないが、動脈内、
気管支内、筋内、クモ膜下、静脈内、皮下もしくは皮内、経粘膜、およびその他
の注射もしくは注入技法が含まれる。例えば、組成物を経口、非経口、局所、部
位限定もしくは全身的に投与することができる。
投与することができる。非経口経路として、限定するわけではないが、動脈内、
気管支内、筋内、クモ膜下、静脈内、皮下もしくは皮内、経粘膜、およびその他
の注射もしくは注入技法が含まれる。例えば、組成物を経口、非経口、局所、部
位限定もしくは全身的に投与することができる。
【００５０】
組成物中の活性成分の現実の投与レベルは、特定の１患者において所望の治療
もしくは予防効果を達成するのに効果的な発現ベクターの量を投与するように変
更することができる。したがって、選択される用量は、サイレンサー-インデュ
ーサー比、下流の発現される領域およびその機能、発現ベクターのサイズ、投与
経路、治療する症状の重篤度、ならびに治療する患者の容態および既往歴に依存
することになる。
もしくは予防効果を達成するのに効果的な発現ベクターの量を投与するように変
更することができる。したがって、選択される用量は、サイレンサー-インデュ
ーサー比、下流の発現される領域およびその機能、発現ベクターのサイズ、投与
経路、治療する症状の重篤度、ならびに治療する患者の容態および既往歴に依存
することになる。
【００５１】
しかし、所望の治療もしくは予防効果を達成するのに必要なものよりも低いレ
ベルの用量で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させるこ
とも、当分野の技術範囲である。これらの組成物を本発明の方法にしたがって（
例えば、急性疾患の治療のため、または安定トランスフェクションのために）単
回用量で、あるいは（例えば、慢性疾患の治療のため、または一過性トランスフ
ェクションのために）異なる時間に投与する複数回用量で投与することができる
。１用量の組成物を患者に（例えば、2、3日毎から2、3年毎まで）反復して投与
し、これによって初回処置後に遺伝子発現が条件によってサイレント化および誘
導され、その後続く処置によって効果を補強する。
ベルの用量で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させるこ
とも、当分野の技術範囲である。これらの組成物を本発明の方法にしたがって（
例えば、急性疾患の治療のため、または安定トランスフェクションのために）単
回用量で、あるいは（例えば、慢性疾患の治療のため、または一過性トランスフ
ェクションのために）異なる時間に投与する複数回用量で投与することができる
。１用量の組成物を患者に（例えば、2、3日毎から2、3年毎まで）反復して投与
し、これによって初回処置後に遺伝子発現が条件によってサイレント化および誘
導され、その後続く処置によって効果を補強する。
【００５２】
しかし、いずれかの特定の患者についての特定の用量は、体重、性別、年令、
全身的健康状態、食事、投与の時間および経路、別の薬剤および患者の治療との
組合せ、ならびに治療する疾患の重篤度を含む、各種の要因に依存することも同
様に理解されるであろう。医薬組成物の大部分の活性成分とは異なって、発現ベ
クターが残存する場合の発現ベクターの効果的な量の範囲は低いはずである。な
ぜならば、これは細胞分裂中に複製されるか、または細胞中に維持されるからで
ある。もちろん、投与される発現ベクターの量は組成物のその他の成分ならびに
当業者が理解している多数の要因に依存する。
全身的健康状態、食事、投与の時間および経路、別の薬剤および患者の治療との
組合せ、ならびに治療する疾患の重篤度を含む、各種の要因に依存することも同
様に理解されるであろう。医薬組成物の大部分の活性成分とは異なって、発現ベ
クターが残存する場合の発現ベクターの効果的な量の範囲は低いはずである。な
ぜならば、これは細胞分裂中に複製されるか、または細胞中に維持されるからで
ある。もちろん、投与される発現ベクターの量は組成物のその他の成分ならびに
当業者が理解している多数の要因に依存する。
【００５３】
DNAは転写されて、そのDNAに対応するRNA転写物が生成し、そのRNAが翻訳され
て新生鎖を産生し、翻訳後プロセス（例えば、アセチル化、アシル化、アミド化
、ジスルフィド結合、グリコシル化、リン酸化、γカルボキシグルタミン酸のヒ
ドロキシル化、メチル化、リン酸エステル化、タンパク質分解、スルフェート化
）を受け、折り畳まれる。新生鎖、折り畳まれたタンパク質、および翻訳後プロ
セスを受けたタンパク質のすべてを総括してポリペプチドと称する。
て新生鎖を産生し、翻訳後プロセス（例えば、アセチル化、アシル化、アミド化
、ジスルフィド結合、グリコシル化、リン酸化、γカルボキシグルタミン酸のヒ
ドロキシル化、メチル化、リン酸エステル化、タンパク質分解、スルフェート化
）を受け、折り畳まれる。新生鎖、折り畳まれたタンパク質、および翻訳後プロ
セスを受けたタンパク質のすべてを総括してポリペプチドと称する。
【００５４】
遺伝子の活性化は、遺伝子の活性化の抑制を緩和する（例えば、可溶性サイト
カイン受容体などの宿主遺伝子の負の調節因子の発現を少なくとも部分的に抑制
する）ように作用する、宿主遺伝子に関連する（例えば、宿主遺伝子の完全コー
ド領域もしくは機能性部分、そのハイパーモルフ突然変異体）か、宿主遺伝子に
関連しない下流領域を含有する発現ベクターを誘導することによって、達成する
ことができる。転写もしくは翻訳の過剰発現、ならびにタンパク質機能の過剰発
現は遺伝子活性化のためのより直接的な手法である。あるいは、下流の発現され
る領域がゲノム中の１遺伝子座への直接の相同組換えを導き、それによって宿主
遺伝子の内在性転写調節領域を発現ベクターのサイレンサー誘導性領域と置換す
ることができる。
カイン受容体などの宿主遺伝子の負の調節因子の発現を少なくとも部分的に抑制
する）ように作用する、宿主遺伝子に関連する（例えば、宿主遺伝子の完全コー
ド領域もしくは機能性部分、そのハイパーモルフ突然変異体）か、宿主遺伝子に
関連しない下流領域を含有する発現ベクターを誘導することによって、達成する
ことができる。転写もしくは翻訳の過剰発現、ならびにタンパク質機能の過剰発
現は遺伝子活性化のためのより直接的な手法である。あるいは、下流の発現され
る領域がゲノム中の１遺伝子座への直接の相同組換えを導き、それによって宿主
遺伝子の内在性転写調節領域を発現ベクターのサイレンサー誘導性領域と置換す
ることができる。
【００５５】
発現ベクターは、例えば化学物質（例えばリン酸カルシウム、DEAEデキストラ
ン、脂質、ポリマー）、エレクトロポレーション、ネイキッド(naked)DNA技法、
マイクロインジェクション、またはウイルス感染を使用し、トランスフェクショ
ンもしくはトランスジェネシス技法によって、宿主哺乳動物細胞もしくは非ヒト
哺乳動物中に導入することができる。好ましくは、導入される発現ベクターを哺
乳動物細胞もしくは非ヒト哺乳動物の宿主ゲノム中に組み込む。脂質担体ビヒク
ルを作製するための多くの中性および荷電脂質、ステロール、およびその他のリ
ン脂質が知られている。例えば、中性脂質はジオレオイルホスファチジルコリン
（DOPC）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）；アニオ
ン性脂質はジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）；ならびにカチオン性脂
質はジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、ジオクタデシル
ジアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジオレオイルトリメチルアンモニウム（
DOTMA）、および1,3-ジオレオイルオキシ-2-(6-カルボキシスペルミル)-プロピ
ルアミドテトラアセテート（DOSPER）である。送達の効力および／または安定性
を改善するために、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）を組み込むこ
とができる。FUGENE6、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTIN、DMRIE-C、TRANSFECTAM、CE
LLFECTIN、PFX-1、PFX-2、PFX-3、PFX-4、PFX-5、PFX-6、PFX-7、PFX-8、TRANSF
AST、TFX-10、TFX-20、TFX-50およびLIPOTAXI脂質は特許製剤である。ポリマー
としてはポリエチレングリコール（PEG）もしくはポリエチレンイミン（PEI）が
ある。あるいは、ポリマー材料をナノスフェアもしくはミクロスフェアに成型す
ることができる。ネイキッドDNA技法では、細胞中に導入する前に発現ベクター
を濃縮するための化学的トランスフェクト剤（例えば、脂質、ポリマー）を使用
することなく、プラスミド形態の発現ベクターを細胞に送達する。ここでプラス
ミドは宿主ゲノム中に組み込まれる場合と組み込まれない場合がある。
ン、脂質、ポリマー）、エレクトロポレーション、ネイキッド(naked)DNA技法、
マイクロインジェクション、またはウイルス感染を使用し、トランスフェクショ
ンもしくはトランスジェネシス技法によって、宿主哺乳動物細胞もしくは非ヒト
哺乳動物中に導入することができる。好ましくは、導入される発現ベクターを哺
乳動物細胞もしくは非ヒト哺乳動物の宿主ゲノム中に組み込む。脂質担体ビヒク
ルを作製するための多くの中性および荷電脂質、ステロール、およびその他のリ
ン脂質が知られている。例えば、中性脂質はジオレオイルホスファチジルコリン
（DOPC）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）；アニオ
ン性脂質はジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）；ならびにカチオン性脂
質はジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、ジオクタデシル
ジアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジオレオイルトリメチルアンモニウム（
DOTMA）、および1,3-ジオレオイルオキシ-2-(6-カルボキシスペルミル)-プロピ
ルアミドテトラアセテート（DOSPER）である。送達の効力および／または安定性
を改善するために、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）を組み込むこ
とができる。FUGENE6、LIPOFECTAMINE、LIPOFECTIN、DMRIE-C、TRANSFECTAM、CE
LLFECTIN、PFX-1、PFX-2、PFX-3、PFX-4、PFX-5、PFX-6、PFX-7、PFX-8、TRANSF
AST、TFX-10、TFX-20、TFX-50およびLIPOTAXI脂質は特許製剤である。ポリマー
としてはポリエチレングリコール（PEG）もしくはポリエチレンイミン（PEI）が
ある。あるいは、ポリマー材料をナノスフェアもしくはミクロスフェアに成型す
ることができる。ネイキッドDNA技法では、細胞中に導入する前に発現ベクター
を濃縮するための化学的トランスフェクト剤（例えば、脂質、ポリマー）を使用
することなく、プラスミド形態の発現ベクターを細胞に送達する。ここでプラス
ミドは宿主ゲノム中に組み込まれる場合と組み込まれない場合がある。
【００５６】
このように、哺乳動物細胞を発現ベクターでトランスフェクトすることができ
るが、トランスジェニック非ヒト哺乳動物も提供される。前記の変法において、
宿主遺伝子からの相同領域を使用して、サイレンサー誘導性領域の宿主ゲノム中
の特定の遺伝子座への組み込みを導き、それによってその遺伝子座での宿主遺伝
子の発現を調節することができる。トランスフェクトした細胞の培養によってin
vitroで；トランスジェネシスによってin vivoで；ならびに発現ベクターの同
種異系、オートロガス、組織適合性もしくは異種細胞中への導入、ならびにその
後のトランスフェクトした細胞の宿主生物への移植によってex vivoで、ポリペ
プチドを産生させることができる。トランスフェクションおよびその後の宿主幹
細胞の宿主哺乳動物内への移植のためには、特別の回収および培養プロトコルが
必要となる。拒絶反応を防止するために、移植後の宿主哺乳動物の免疫抑制およ
び宿主細胞の被包形成が必要となる場合がある。
るが、トランスジェニック非ヒト哺乳動物も提供される。前記の変法において、
宿主遺伝子からの相同領域を使用して、サイレンサー誘導性領域の宿主ゲノム中
の特定の遺伝子座への組み込みを導き、それによってその遺伝子座での宿主遺伝
子の発現を調節することができる。トランスフェクトした細胞の培養によってin
vitroで；トランスジェネシスによってin vivoで；ならびに発現ベクターの同
種異系、オートロガス、組織適合性もしくは異種細胞中への導入、ならびにその
後のトランスフェクトした細胞の宿主生物への移植によってex vivoで、ポリペ
プチドを産生させることができる。トランスフェクションおよびその後の宿主幹
細胞の宿主哺乳動物内への移植のためには、特別の回収および培養プロトコルが
必要となる。拒絶反応を防止するために、移植後の宿主哺乳動物の免疫抑制およ
び宿主細胞の被包形成が必要となる場合がある。
【００５７】
発現ベクターを使用して、不在もしくは全体として欠陥がある宿主遺伝子の機
能に代替させるか、部分的に欠陥がある宿主遺伝子の機能を補充するか、または
宿主遺伝子の活性と競合させることができる。したがって、この宿主の内因性の
因子遺伝子はネオモルフ、ハイポモルフ、ハイパーモルフもしくは正常な場合が
ある。機能の代替もしくは補充は上記の方法によって達成することができ、（例
えば、転写もしくは翻訳された産物の量、またはいずれかの産物の生理学的機能
を評価することによって）下流領域の高度発現性について、トランスフェクトさ
れた哺乳動物細胞もしくはトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択することが
できる。しかし、発現された下流領域とネオモルフ、ハイポモルフ、ハイパーモ
ルフもしくは正常宿主遺伝子間の競合は、コードされるポリペプチドが複数サブ
ユニットであってこれらがポリマータンパク質複合体を形成するものでないかぎ
り、成功させるのはさらに難しい。あるいは、ネガティブ調節因子もしくは細胞
内で機能を阻害する一本鎖抗体を発現ベクターの下流領域にコードさせてもよい
。したがって、それぞれ非改変アンチセンス転写物、dsRNAのいずれか一方もし
くは両方の鎖、またはリボザイムに対応する下流領域を発現ベクターが含有して
いる、アンチセンス、RNA干渉技法またはリボザイム技法を使用して、機能性宿
主遺伝子の少なくとも部分的な抑制が必要となる。
能に代替させるか、部分的に欠陥がある宿主遺伝子の機能を補充するか、または
宿主遺伝子の活性と競合させることができる。したがって、この宿主の内因性の
因子遺伝子はネオモルフ、ハイポモルフ、ハイパーモルフもしくは正常な場合が
ある。機能の代替もしくは補充は上記の方法によって達成することができ、（例
えば、転写もしくは翻訳された産物の量、またはいずれかの産物の生理学的機能
を評価することによって）下流領域の高度発現性について、トランスフェクトさ
れた哺乳動物細胞もしくはトランスジェニック非ヒト哺乳動物を選択することが
できる。しかし、発現された下流領域とネオモルフ、ハイポモルフ、ハイパーモ
ルフもしくは正常宿主遺伝子間の競合は、コードされるポリペプチドが複数サブ
ユニットであってこれらがポリマータンパク質複合体を形成するものでないかぎ
り、成功させるのはさらに難しい。あるいは、ネガティブ調節因子もしくは細胞
内で機能を阻害する一本鎖抗体を発現ベクターの下流領域にコードさせてもよい
。したがって、それぞれ非改変アンチセンス転写物、dsRNAのいずれか一方もし
くは両方の鎖、またはリボザイムに対応する下流領域を発現ベクターが含有して
いる、アンチセンス、RNA干渉技法またはリボザイム技法を使用して、機能性宿
主遺伝子の少なくとも部分的な抑制が必要となる。
【００５８】
アンチセンスポリヌクレオチドは当初、mRNA転写物とハイブリダイズすること
によって、翻訳を直接妨害すると信じられていたが、現在ではウイルスもしくは
細胞遺伝子のmRNA転写物の分解に関与するものと考えられている。アンチセンス
分子は、発現ベクター内の下流発現領域とアンチセンス方向にある１遺伝子の少
なくとも１機能性部分を使用して、作製することができる。
によって、翻訳を直接妨害すると信じられていたが、現在ではウイルスもしくは
細胞遺伝子のmRNA転写物の分解に関与するものと考えられている。アンチセンス
分子は、発現ベクター内の下流発現領域とアンチセンス方向にある１遺伝子の少
なくとも１機能性部分を使用して、作製することができる。
【００５９】
dsRNAによるRNA干渉には酵素による切断が関与しているものとみられる。なぜ
ならばmRNA転写物はアンチセンス阻害とは異なるプロセス（おそらくリボヌクレ
アーゼDでの分解による）によって約20〜25リボヌクレオチドの断片に転換され
るからである。後者の方が、より大きい効率と設計の容易性のため好ましい（例
えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはその半減期を増加させるために改変さ
れたヌクレオチドによって化学的に合成する必要があることが多い）。dsRNAは
、同一または別種の発現ベクターによって産生されたssRNA鎖2つであって、少な
くともその一方がアンチセンス方向の下流領域を含んでいる、少なくとも25ヌク
レオチドの細胞もしくはウイルス遺伝子のコード領域の一部から作製することが
できる。
ならばmRNA転写物はアンチセンス阻害とは異なるプロセス（おそらくリボヌクレ
アーゼDでの分解による）によって約20〜25リボヌクレオチドの断片に転換され
るからである。後者の方が、より大きい効率と設計の容易性のため好ましい（例
えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはその半減期を増加させるために改変さ
れたヌクレオチドによって化学的に合成する必要があることが多い）。dsRNAは
、同一または別種の発現ベクターによって産生されたssRNA鎖2つであって、少な
くともその一方がアンチセンス方向の下流領域を含んでいる、少なくとも25ヌク
レオチドの細胞もしくはウイルス遺伝子のコード領域の一部から作製することが
できる。
【００６０】
リボザイムはRNA転写物もしくはゲノムの特異的切断を触媒する。その作用の
機序には、相補的な細胞もしくはウイルスRNAへの配列特異的ハイブリダイゼー
ションとその後のエンドヌクレオチド切断が関与する。リボザイムは目的のRNA
に相補的な１以上の配列とともにRNA切断に関係する触媒性配列（例えば、ハン
マーヘッド、ヘアピン、アックスヘッドモチーフ）を含んでいる。例えば、以下
のトリヌクレオチド配列：GUA、GUUおよびGUC、を含むリボザイム切断部位につ
いて、目的のRNAをスキャンすることによって、目的のRNA内の可能なリボザイム
切断部位を最初に同定する。同定後、この切断部位を含む目的のRNAの領域に対
応する約15〜約20リボヌクレオチド間のオリゴヌクレオチドの１つを、２次構造
などの予測される構造特性について評価し、それによって候補オリゴヌクレオチ
ド配列を不適当なものと決定することが可能である。次に候補配列の適合性につ
いて、細胞もしくはウイルスRNAとハイブリダイズし、これを切断する能力によ
って評価することができる。
機序には、相補的な細胞もしくはウイルスRNAへの配列特異的ハイブリダイゼー
ションとその後のエンドヌクレオチド切断が関与する。リボザイムは目的のRNA
に相補的な１以上の配列とともにRNA切断に関係する触媒性配列（例えば、ハン
マーヘッド、ヘアピン、アックスヘッドモチーフ）を含んでいる。例えば、以下
のトリヌクレオチド配列：GUA、GUUおよびGUC、を含むリボザイム切断部位につ
いて、目的のRNAをスキャンすることによって、目的のRNA内の可能なリボザイム
切断部位を最初に同定する。同定後、この切断部位を含む目的のRNAの領域に対
応する約15〜約20リボヌクレオチド間のオリゴヌクレオチドの１つを、２次構造
などの予測される構造特性について評価し、それによって候補オリゴヌクレオチ
ド配列を不適当なものと決定することが可能である。次に候補配列の適合性につ
いて、細胞もしくはウイルスRNAとハイブリダイズし、これを切断する能力によ
って評価することができる。
【００６１】
どんな疾患でも、その疾患に関係する遺伝子根拠およびインデューサーが知ら
れているならば、本発明によって治療することができる（例えば炎症およびその
他のストレス症状、虚血およびその他の低酸素症状、グルコース濃度の変動また
はその他の代謝性疾患）。
れているならば、本発明によって治療することができる（例えば炎症およびその
他のストレス症状、虚血およびその他の低酸素症状、グルコース濃度の変動また
はその他の代謝性疾患）。
【００６２】
遺伝子接種を使用して、アレルゲン、自己抗原、感染性因子の抗原（例えば、
細胞表面もしくはウイルスキャプシド／コート抗原）および腫瘍抗原を発現させ
るか発現を抑制することによって、ヒト疾患のモデルを提供するか、または罹患
した患者を免疫モジュレートすることができる。米国特許第5,580,859号、5,589
,466号、5,697,901号、5,804,566号、5,830,877号、5,849,719号、5,985,847号
および国際公開公報第98/20734号を参照されたい。抗原に対して特異的な抗体も
、診断、治療、もしくは予防用途のために製造することができる。したがって、
下流領域に単価もしくは多価エピトープとして１種以上のこうした抗原の免疫原
性部分をコードさせることができる。抗原をアジュバントとして作用するサイト
カイン（例えば、IFN-γ、GM-CSF）との融合タンパク質として発現させるのが好
ましい。
細胞表面もしくはウイルスキャプシド／コート抗原）および腫瘍抗原を発現させ
るか発現を抑制することによって、ヒト疾患のモデルを提供するか、または罹患
した患者を免疫モジュレートすることができる。米国特許第5,580,859号、5,589
,466号、5,697,901号、5,804,566号、5,830,877号、5,849,719号、5,985,847号
および国際公開公報第98/20734号を参照されたい。抗原に対して特異的な抗体も
、診断、治療、もしくは予防用途のために製造することができる。したがって、
下流領域に単価もしくは多価エピトープとして１種以上のこうした抗原の免疫原
性部分をコードさせることができる。抗原をアジュバントとして作用するサイト
カイン（例えば、IFN-γ、GM-CSF）との融合タンパク質として発現させるのが好
ましい。
【００６３】
標的とすることができる組織として、以下のものが含まれる：神経系（例えば
、脳、眼、グリア、中枢および末梢神経）；網内系（例えば、血液、骨髄、樹状
細胞、赤血球細胞、顆粒球、リンパ管内皮、リンパ球、巨核球および血小板、単
球およびマクロファージ、骨髄細胞、好中球、脾臓、胸腺）；内分泌、生殖、お
よび泌尿器系（例えば、副腎、乳房、腎臓、卵巣、下垂体、前立腺、精巣、甲状
腺、子宮内皮）；心肺系（例えば心臓、肺、動脈および静脈内皮）；消化器系（
例えば、結腸、胆嚢、大腸および小腸、肝臓、膵臓、直腸、胃）；骨、軟骨、結
合組織、皮膚、平滑筋および横紋筋；外胚葉、内胚葉、もしくは中胚葉組織；間
葉および実質組織。
、脳、眼、グリア、中枢および末梢神経）；網内系（例えば、血液、骨髄、樹状
細胞、赤血球細胞、顆粒球、リンパ管内皮、リンパ球、巨核球および血小板、単
球およびマクロファージ、骨髄細胞、好中球、脾臓、胸腺）；内分泌、生殖、お
よび泌尿器系（例えば、副腎、乳房、腎臓、卵巣、下垂体、前立腺、精巣、甲状
腺、子宮内皮）；心肺系（例えば心臓、肺、動脈および静脈内皮）；消化器系（
例えば、結腸、胆嚢、大腸および小腸、肝臓、膵臓、直腸、胃）；骨、軟骨、結
合組織、皮膚、平滑筋および横紋筋；外胚葉、内胚葉、もしくは中胚葉組織；間
葉および実質組織。
【００６４】
この発現ベクターの各種の正常細胞および組織中への導入能力は、良性および
悪性癌（例えば、腹水癌および固形腫瘍、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色種、肉
腫）の治療が可能であることを示唆している。興味深いいくつかの腫瘍のタイプ
は、乳房、結腸直腸(colorectal)、肺、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓および精巣癌
である。
悪性癌（例えば、腹水癌および固形腫瘍、癌腫、白血病、リンパ腫、黒色種、肉
腫）の治療が可能であることを示唆している。興味深いいくつかの腫瘍のタイプ
は、乳房、結腸直腸(colorectal)、肺、卵巣、膵臓、前立腺、腎臓および精巣癌
である。
【００６５】
ここで、適切なコード領域、アンチセンス方向の転写領域、dsRNA、もしくは
リボザイムの調節された遺伝子発現によって治療することができると考えられる
疾患の例、またはそれらの疾患のモデルを提供し得る例には以下のものがある：
後天性もしくは先天性免疫不全、アレルギーおよびその他の免疫過敏症、貧血お
よびサラセミア、自己免疫疾患、溶血性もしくは敗血症性ショック、血友病、炎
症およびその他のストレス症状、虚血およびその他の低酸素症状、癌腫（例えば
、基底層細胞、基底扁平細胞、Brown-Pearce、管、Ehrlich腫瘍、発生部内非浸
潤性 、Krebs、Merkel細胞、小もしくは非小細胞肺、えんばく細胞、乳頭、細気
管支、扁平細胞、移行細胞、Walker）、白血病（例えば、B細胞、T細胞、HTLV、
急性および慢性リンパ球、マスト細胞、骨髄）、組織球腫、組織球増加症、Hodg
kin病、非Hodgkinリンパ腫、プラスマ細胞腫、網内症、腺腫、腺癌、腺線維腫、
腺様リンパ腫、エナメル上皮腫、角化血管腫、好酸球増加を伴う血管リンパ球増
加症、硬化性血管腫、血管腫症、APUD細胞腫(apudoma)、えら腫、悪性カルチノ
イド症候群、カルチノイド心疾患、癌肉腫、セメント腫、胆管腫、コレステリン
腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、軟骨肉腫、脊索腫、分離腫、頭蓋咽頭腫、chrond
roma、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腫、葉状嚢胞肉腫、未分化胚細胞腫(dysgerminom
a)、上衣細胞腫、Ewing肉腫、線維腫、線維肉腫 、巨細胞腫、節神経腫、グリア
芽細胞腫、グロムス血管腫、顆粒膜細胞腫、卵巣男性胚細胞腫、過誤腫、血管内
皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、肝癌、膵島細胞腫、Kaposi肉腫、平
滑筋腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、Leydig細胞腫、脂肪腫、脂肪肉腫、リンパ管腫
、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、髄芽腫、髄膜腫、間葉腫、中腎腫、中皮腫、筋
芽腫、筋腫、筋肉腫、粘液腫、粘液肉腫、神経鞘腫、神経腫、神経芽腫、神経上
皮腫、神経線維腫、神経線維腫症、歯牙腫、骨腫、骨肉腫、乳頭腫、パラガング
リオーマ、非クロム親和性パラガングリオーマ、松果体腫、横紋筋腫、横紋筋肉
腫、Sertoli細胞腫、奇形腫、卵胞膜細胞腫、および細胞が形成異常、永久増殖
もしくはトランスフォームされているその他の疾患。
リボザイムの調節された遺伝子発現によって治療することができると考えられる
疾患の例、またはそれらの疾患のモデルを提供し得る例には以下のものがある：
後天性もしくは先天性免疫不全、アレルギーおよびその他の免疫過敏症、貧血お
よびサラセミア、自己免疫疾患、溶血性もしくは敗血症性ショック、血友病、炎
症およびその他のストレス症状、虚血およびその他の低酸素症状、癌腫（例えば
、基底層細胞、基底扁平細胞、Brown-Pearce、管、Ehrlich腫瘍、発生部内非浸
潤性 、Krebs、Merkel細胞、小もしくは非小細胞肺、えんばく細胞、乳頭、細気
管支、扁平細胞、移行細胞、Walker）、白血病（例えば、B細胞、T細胞、HTLV、
急性および慢性リンパ球、マスト細胞、骨髄）、組織球腫、組織球増加症、Hodg
kin病、非Hodgkinリンパ腫、プラスマ細胞腫、網内症、腺腫、腺癌、腺線維腫、
腺様リンパ腫、エナメル上皮腫、角化血管腫、好酸球増加を伴う血管リンパ球増
加症、硬化性血管腫、血管腫症、APUD細胞腫(apudoma)、えら腫、悪性カルチノ
イド症候群、カルチノイド心疾患、癌肉腫、セメント腫、胆管腫、コレステリン
腫、軟骨肉腫、軟骨芽細胞腫、軟骨肉腫、脊索腫、分離腫、頭蓋咽頭腫、chrond
roma、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腫、葉状嚢胞肉腫、未分化胚細胞腫(dysgerminom
a)、上衣細胞腫、Ewing肉腫、線維腫、線維肉腫 、巨細胞腫、節神経腫、グリア
芽細胞腫、グロムス血管腫、顆粒膜細胞腫、卵巣男性胚細胞腫、過誤腫、血管内
皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、肝癌、膵島細胞腫、Kaposi肉腫、平
滑筋腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、Leydig細胞腫、脂肪腫、脂肪肉腫、リンパ管腫
、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、髄芽腫、髄膜腫、間葉腫、中腎腫、中皮腫、筋
芽腫、筋腫、筋肉腫、粘液腫、粘液肉腫、神経鞘腫、神経腫、神経芽腫、神経上
皮腫、神経線維腫、神経線維腫症、歯牙腫、骨腫、骨肉腫、乳頭腫、パラガング
リオーマ、非クロム親和性パラガングリオーマ、松果体腫、横紋筋腫、横紋筋肉
腫、Sertoli細胞腫、奇形腫、卵胞膜細胞腫、および細胞が形成異常、永久増殖
もしくはトランスフォームされているその他の疾患。
【００６６】
以下の実施例は本発明を説明することを意図している。しかしこれらによって
本発明の実施が何ら限定もしくは制限されるものではない。
本発明の実施が何ら限定もしくは制限されるものではない。
【００６７】実施例
公知の技法が、下記のような文献およびマニュアルに記載されている：Ausube
lら（Current Protocls in Molecular Biology, Wiley, 1998）；Birrenら（Gen
ome Analysis Series, CSHL, 1997-1999）；Bonifacinoら（Current Protocols
in Cell Biology, Wiley, 1999）；CareyおよびSmale（Transcriptional Regula
tion in Eukaryotes, CSHL, 2000）；Coliganら（Current Protocols in Immuno
logy, Wiley, 1999）；Coliganら（Current Protocols in Protein Science, Wi
ley, 1999）；Dracopoliら（Current Protocols in Human Genetics, Wiley, 19
99）；HarlowおよびLane（Using Antibodies, CSHL, 1999）；Hoganら（Manipul
ating the Mouse Embryo, CSHL, 1994）；Marshakら（Strategies for Protein
Purification and Characterization, CSHL,1996）；MurphyおよびCarter（Tran
genesis Techniques, Humana, 1993）；Murray（Gene Transfer and Expression
Protocols, Humana Press, 1991）；Pinkert（Transgenic Animal Technology,
Academic, 1994）；Robbins（Gene Therapy Protocols, Humana, 1996）；Samb
rookら（Molecular Cloning, CSHL, 1989）；Spectorら（Cell, CSHL, 1998）；
Tuan（Recombinant Gene Expression Protocols, Humana, 1997）；ならびに、W
altherおよびStein（Gene Therapy of Cancer, Humana, 2000）。
lら（Current Protocls in Molecular Biology, Wiley, 1998）；Birrenら（Gen
ome Analysis Series, CSHL, 1997-1999）；Bonifacinoら（Current Protocols
in Cell Biology, Wiley, 1999）；CareyおよびSmale（Transcriptional Regula
tion in Eukaryotes, CSHL, 2000）；Coliganら（Current Protocols in Immuno
logy, Wiley, 1999）；Coliganら（Current Protocols in Protein Science, Wi
ley, 1999）；Dracopoliら（Current Protocols in Human Genetics, Wiley, 19
99）；HarlowおよびLane（Using Antibodies, CSHL, 1999）；Hoganら（Manipul
ating the Mouse Embryo, CSHL, 1994）；Marshakら（Strategies for Protein
Purification and Characterization, CSHL,1996）；MurphyおよびCarter（Tran
genesis Techniques, Humana, 1993）；Murray（Gene Transfer and Expression
Protocols, Humana Press, 1991）；Pinkert（Transgenic Animal Technology,
Academic, 1994）；Robbins（Gene Therapy Protocols, Humana, 1996）；Samb
rookら（Molecular Cloning, CSHL, 1989）；Spectorら（Cell, CSHL, 1998）；
Tuan（Recombinant Gene Expression Protocols, Humana, 1997）；ならびに、W
altherおよびStein（Gene Therapy of Cancer, Humana, 2000）。
【００６８】
発現ベクターの構築、細胞の培養およびトランスフェクション、遺伝子発現の
決定、ならびに、結合試験のための試薬供給源、技法については、下記に記載さ
れている：Websterら（1993）、Bodiら（1995）、Wuら（1996）、Prenticeら（1
997）、Huら（1998）、Discherら（1998）、Discherら（1999）、Websterら（19
99）。
決定、ならびに、結合試験のための試薬供給源、技法については、下記に記載さ
れている：Websterら（1993）、Bodiら（1995）、Wuら（1996）、Prenticeら（1
997）、Huら（1998）、Discherら（1998）、Discherら（1999）、Websterら（19
99）。
【００６９】
ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の検出により、サイレンサーエレメン
ト、条件誘導エレメント、ならびに、プロモーターの単独の、もしくは組み合わ
せた転写活性を評価するのに適したプラスミドは、Promegaから入手可能である
。このようなベクターとしては、転写休止部位、ルシフェラーゼのコード領域上
流のポリリンカー、ルシフェラーゼコード領域が続くSV40からのポリアデニル化
シグナル、大腸菌およびf1複製起点、ならびに、選択マーカーamprが挙げられる
。pGL3基本ベクター（pGL3BV）には、真核生物プロモーター、サイレンサー、お
よびエンハンサー配列が欠失している。基本ベクターと比較して、pGL3エンハン
サーベクターも真核生物プロモーターが欠失しているが、ルシフェラーゼコード
領域下流のSV40エンハンサーと、ポリアデニル化シグナルを含む。また、pGL3プ
ロモーターベクター（pGL3PV）は、ルシフェラーゼコード領域上流にSV40初期プ
ロモーターを含むため、図に示すように、１以上のサイレンサー誘導領域をKpnl
制限酵素部位に挿入することができる。pGL3制御ベクターは、コード領域上流の
SV40プロモーターと、コード領域下流のSV40エンハンサーを含む。
ト、条件誘導エレメント、ならびに、プロモーターの単独の、もしくは組み合わ
せた転写活性を評価するのに適したプラスミドは、Promegaから入手可能である
。このようなベクターとしては、転写休止部位、ルシフェラーゼのコード領域上
流のポリリンカー、ルシフェラーゼコード領域が続くSV40からのポリアデニル化
シグナル、大腸菌およびf1複製起点、ならびに、選択マーカーamprが挙げられる
。pGL3基本ベクター（pGL3BV）には、真核生物プロモーター、サイレンサー、お
よびエンハンサー配列が欠失している。基本ベクターと比較して、pGL3エンハン
サーベクターも真核生物プロモーターが欠失しているが、ルシフェラーゼコード
領域下流のSV40エンハンサーと、ポリアデニル化シグナルを含む。また、pGL3プ
ロモーターベクター（pGL3PV）は、ルシフェラーゼコード領域上流にSV40初期プ
ロモーターを含むため、図に示すように、１以上のサイレンサー誘導領域をKpnl
制限酵素部位に挿入することができる。pGL3制御ベクターは、コード領域上流の
SV40プロモーターと、コード領域下流のSV40エンハンサーを含む。
【００７０】
サイレンサー誘導領域は、pGL3PV、pMHC164（Molkentinら、1996）、pMCH86（
Prenticeら、1997）、pMHC1.2、およびpHSA150にクローニングした。図１に示す
ように、pMHC164は、ラット心臓αミオシン重鎖（αMHC）プロモーター（すなわ
ち、−164〜＋16断片）を、SmaIおよびHindIIIで切断したpGL3BVに結合すること
により、作製した。同様に、SmaI-HindIII断片（すなわち、−86〜＋16αMHCプ
ロモーター）をpGL3BVに挿入することにより、pMHC86を作製し、SmaI-HindIII断
片（すなわち、−1200〜＋16αMHCプロモーター）をpGL3BVに挿入することによ
り、pMHC1.2を作製し、SmaI-HindIII断片（すなわち、−150〜＋239ヒト骨格ア
クチンプロモーター）をpGL3BVに挿入することにより、pHSA150を作製した。
Prenticeら、1997）、pMHC1.2、およびpHSA150にクローニングした。図１に示す
ように、pMHC164は、ラット心臓αミオシン重鎖（αMHC）プロモーター（すなわ
ち、−164〜＋16断片）を、SmaIおよびHindIIIで切断したpGL3BVに結合すること
により、作製した。同様に、SmaI-HindIII断片（すなわち、−86〜＋16αMHCプ
ロモーター）をpGL3BVに挿入することにより、pMHC86を作製し、SmaI-HindIII断
片（すなわち、−1200〜＋16αMHCプロモーター）をpGL3BVに挿入することによ
り、pMHC1.2を作製し、SmaI-HindIII断片（すなわち、−150〜＋239ヒト骨格ア
クチンプロモーター）をpGL3BVに挿入することにより、pHSA150を作製した。
【００７１】配列の簡単な説明
配列番号１
は、センス方向のヒトホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子由来の低酸素応答エン
ハンサーエレメント（HRE）を含むオリゴヌクレオチドの配列である（HREは、HR
Epgkとも呼ばれる）。
ハンサーエレメント（HRE）を含むオリゴヌクレオチドの配列である（HREは、HR
Epgkとも呼ばれる）。
【００７２】
配列番号２
は、センス方向のヒトシナプシン遺伝子由来のサイレンサー（SIL）エレメント
を含むオリゴヌクレオチドの配列である。
を含むオリゴヌクレオチドの配列である。
【００７３】
配列番号３
は、センス方向の突然変異HREpgkエレメントを含むオリゴヌクレオチドの配列で
ある。
ある。
【００７４】
配列番号４
は、センス方向の突然変異SILエレメントを含むオリゴヌクレオチドの配列であ
る。
る。
【００７５】
配列番号５
配列番号６
配列番号７
（連続的だが、重複はない）
配列番号８
（５塩基重複を含む）
配列番号９
（サイレンサーエレメントがこのオリゴヌクレオチドでは突然変異を起こしてい
る） 配列番号10 配列番号11 配列番号12 配列番号13 配列番号15 配列番号16 は、エンドセリン（ET-1）遺伝子由来の低酸素応答エンハンサー（HRE）エレメ
ントを含むオリゴヌクレオチドの配列である。
る） 配列番号10 配列番号11 配列番号12 配列番号13 配列番号15 配列番号16 は、エンドセリン（ET-1）遺伝子由来の低酸素応答エンハンサー（HRE）エレメ
ントを含むオリゴヌクレオチドの配列である。
【００７６】
上記配列の各々において、第１サイレンサーエレメントを太字で示す。各配列
について、センス鎖だけを示すが、アンチセンス鎖も合成されたことを理解すべ
きである。次に、センスおよびアンチセンス鎖をアニーリングした後、適した付
着末端を含む構築物にクローニングした。
について、センス鎖だけを示すが、アンチセンス鎖も合成されたことを理解すべ
きである。次に、センスおよびアンチセンス鎖をアニーリングした後、適した付
着末端を含む構築物にクローニングした。
【００７７】実施例１−条件的サイレンシングと位置依存性
ヒトシナプシン遺伝子由来のサイレンサー（SIL）エレメントおよびホスホグ
リセリン酸キナーゼ遺伝子由来の条件誘導エレメント（HRE）（配列番号５〜７
に記載）各々の１、２または３コピーを含むサイレンサー−インデューサー領域
を、図２Ａに示すように、pGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングした。これ
らの構築物は、pGL3-[SIL/HRE]1、pGL3-[SIL/HRE]2、およびpGL3-[SIL/HRE]3と
称する。さらに、図２Ｂに示すように、オリゴヌクレオチド（配列番号８）の３
コピーをpGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングすることにより、pGL3-[SIL/
HRE]3（重複を含む）を構築した。pGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングし
たオリゴヌクレオチド（配列番号９）を用いて、pGL3-[SIL0/HRE3]を構築した。
その際、上記オリゴヌクレオチドが依然として３つのHREエレメントを含むよう
に、SILエレメントに対する転写因子の結合に不可欠な塩基を突然変異させた。
この構築物は、SILエレメントの対照として用いた。
リセリン酸キナーゼ遺伝子由来の条件誘導エレメント（HRE）（配列番号５〜７
に記載）各々の１、２または３コピーを含むサイレンサー−インデューサー領域
を、図２Ａに示すように、pGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングした。これ
らの構築物は、pGL3-[SIL/HRE]1、pGL3-[SIL/HRE]2、およびpGL3-[SIL/HRE]3と
称する。さらに、図２Ｂに示すように、オリゴヌクレオチド（配列番号８）の３
コピーをpGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングすることにより、pGL3-[SIL/
HRE]3（重複を含む）を構築した。pGL3PVのKpnI制限酵素部位にクローニングし
たオリゴヌクレオチド（配列番号９）を用いて、pGL3-[SIL0/HRE3]を構築した。
その際、上記オリゴヌクレオチドが依然として３つのHREエレメントを含むよう
に、SILエレメントに対する転写因子の結合に不可欠な塩基を突然変異させた。
この構築物は、SILエレメントの対照として用いた。
【００７８】
これらプラスミド構築物はすべて、5’から3’（S）および3’から5’（AS）
方向の両方に位置する挿入オリゴヌクレオチドを用いて作製した後、配列決定に
より確認した（Discherら、1999）。以下に示す結果は、（S）配置（配列番号５
〜７）における非重複pGL3-[SIL/HRE]シリーズについてのものである。SおよびA
S挿入方向の間に相違はなく、また、非重複および重複サイレンサー−インデュ
ーサー領域（配列番号８の３コピー）の間にも有意な相違はなかった。
方向の両方に位置する挿入オリゴヌクレオチドを用いて作製した後、配列決定に
より確認した（Discherら、1999）。以下に示す結果は、（S）配置（配列番号５
〜７）における非重複pGL3-[SIL/HRE]シリーズについてのものである。SおよびA
S挿入方向の間に相違はなく、また、非重複および重複サイレンサー−インデュ
ーサー領域（配列番号８の３コピー）の間にも有意な相違はなかった。
【００７９】
表に示すように、精製発現ベクター（Discherら、1998）は、リン酸カルシウ
ムまたは脂質トランスフェクション（Websterら、1993；Discherら、1998）によ
り、細胞系（例えば、骨格筋C2C12、Hela、および心筋細胞）にトランスフェク
ションした。全ケースにおいて、内部対照（Promegaから入手したレニラルシフ
ェラーゼ）を用いて、トランスフェクション効率を正規化し、レポーターアッセ
イには、等量のタンパク質抽出物を用いた。トランスフェクションから３〜４日
後、細胞を維持し、好気性条件（21％、O2／５％CO2空気）または低酸素条件（
１％、O2／５％CO2／平衡N2）に24時間暴露した。細胞を低酸素に暴露するその
他の条件は、すでに記載されている（WebsterおよびBishopric 1992；Websterら
、1993；Discherら、1998；Websterら、1999）。簡単に説明すると、細胞を気密
環境のチャンバーに入れるが、該チャンバーは、１％O2／５％CO2／平衡N2の標
準的気体混合物を充填し、その温度、湿度および気体を制御した環境とする。該
装置は、連続記録酸素電極、pHメーター、ならびに、細胞運動および形状の変化
を記録するCELL-TRAK運動分析装置を備える。細胞の操作はすべて、再酸素添加
を防止するため、チャンバー内で行う。細胞は、処理後、回収して溶解し、レポ
ーター（luc）遺伝子の発現について分析した（Discherら、1998；Websterら、1
999）。表１は、それぞれ、低酸素に20時間暴露したC2C12骨格筋細胞を用いて、
同じサンプルについて２回行った試験の結果を示す。タンパク質濃度について正
規化したルシフェラーゼ活性を示す。
ムまたは脂質トランスフェクション（Websterら、1993；Discherら、1998）によ
り、細胞系（例えば、骨格筋C2C12、Hela、および心筋細胞）にトランスフェク
ションした。全ケースにおいて、内部対照（Promegaから入手したレニラルシフ
ェラーゼ）を用いて、トランスフェクション効率を正規化し、レポーターアッセ
イには、等量のタンパク質抽出物を用いた。トランスフェクションから３〜４日
後、細胞を維持し、好気性条件（21％、O2／５％CO2空気）または低酸素条件（
１％、O2／５％CO2／平衡N2）に24時間暴露した。細胞を低酸素に暴露するその
他の条件は、すでに記載されている（WebsterおよびBishopric 1992；Websterら
、1993；Discherら、1998；Websterら、1999）。簡単に説明すると、細胞を気密
環境のチャンバーに入れるが、該チャンバーは、１％O2／５％CO2／平衡N2の標
準的気体混合物を充填し、その温度、湿度および気体を制御した環境とする。該
装置は、連続記録酸素電極、pHメーター、ならびに、細胞運動および形状の変化
を記録するCELL-TRAK運動分析装置を備える。細胞の操作はすべて、再酸素添加
を防止するため、チャンバー内で行う。細胞は、処理後、回収して溶解し、レポ
ーター（luc）遺伝子の発現について分析した（Discherら、1998；Websterら、1
999）。表１は、それぞれ、低酸素に20時間暴露したC2C12骨格筋細胞を用いて、
同じサンプルについて２回行った試験の結果を示す。タンパク質濃度について正
規化したルシフェラーゼ活性を示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
サイレンサー−インデューサー比（silencer-inducer ratio）は、低酸素条件
下で線状に上昇するのがわかり、SILおよびHREエレメントの数は、各々１コピー
から３コピーに増加している。この実施例から、配列番号５〜８を用いたインサ
ートシリーズの両方が、低酸素可逆的サイレンシング（hypoxia-reversible sil
encing）を媒介すると結論付けられる。この作用の大きさは、SIL／HREエレメン
トの数に直接比例し、個々のSILとHREエレメント間の重複は、条件サイレンシン
グに必要ではない。
下で線状に上昇するのがわかり、SILおよびHREエレメントの数は、各々１コピー
から３コピーに増加している。この実施例から、配列番号５〜８を用いたインサ
ートシリーズの両方が、低酸素可逆的サイレンシング（hypoxia-reversible sil
encing）を媒介すると結論付けられる。この作用の大きさは、SIL／HREエレメン
トの数に直接比例し、個々のSILとHREエレメント間の重複は、条件サイレンシン
グに必要ではない。
【００８２】
さらに行った試験は、pGL3-[SIL/HRE]3発現ベクターに焦点をあてて行ったが
、そのために、C2C12骨格筋細胞（ｎ＝12）、心筋細胞（ｎ＝16）、ならびに、H
ela細胞（ｎ＝８）について、ルシフェラーゼレポーターの発現を詳細に試験し
た。表２にサイレンサー−インデューサー比を示す。サイレンサー−インデュー
サー比は、C2C12骨格筋細胞で最高であった。
、そのために、C2C12骨格筋細胞（ｎ＝12）、心筋細胞（ｎ＝16）、ならびに、H
ela細胞（ｎ＝８）について、ルシフェラーゼレポーターの発現を詳細に試験し
た。表２にサイレンサー−インデューサー比を示す。サイレンサー−インデュー
サー比は、C2C12骨格筋細胞で最高であった。
【００８３】
【表２】
【００８４】
条件的サイレンシングでは、遺伝子発現の抑制が、非誘導状態（例えば、好気
性条件下での基底発現）について選択的であることが必要である。非誘導（好気
性）または誘導（低酸素）条件下で培養されたトランスフェクトC2C12細胞中のp
GLV-[SIL/HRE]3由来のレポーター遺伝子発現に対するサイレンシングの影響は、
pGLPV-[SIL/HRE]3：pGLPV-[SIL0/HRE3]の比として表３に示す。
性条件下での基底発現）について選択的であることが必要である。非誘導（好気
性）または誘導（低酸素）条件下で培養されたトランスフェクトC2C12細胞中のp
GLV-[SIL/HRE]3由来のレポーター遺伝子発現に対するサイレンシングの影響は、
pGLPV-[SIL/HRE]3：pGLPV-[SIL0/HRE3]の比として表３に示す。
【００８５】
【表３】
【００８６】
3×SILエレメントを用いたサイレンシングにより、好気性条件下の発現が、対
応する非サイレンシング構築物と比較して、2.8％に低下したが、低酸素下の発
現は、62％にとどまり、低酸素が、このサイレンシングを有意に逆転したことを
示している。低酸素下におけるサイレンシングの逆転の範囲は、生成されるHIF-
1転写因子の量と、HRE結合部位のアフィニティーに関係する（以下を参照）。
応する非サイレンシング構築物と比較して、2.8％に低下したが、低酸素下の発
現は、62％にとどまり、低酸素が、このサイレンシングを有意に逆転したことを
示している。低酸素下におけるサイレンシングの逆転の範囲は、生成されるHIF-
1転写因子の量と、HRE結合部位のアフィニティーに関係する（以下を参照）。
【００８７】
これらの結果から、C2C12細胞中の配列番号５〜８を含むオリゴヌクレオチド
インサートを含む構築物の条件的サイレンシングが明らかである。これらの構築
物はすべて、互いの50 bp内にSILおよびHREエレメントの対を含む。エレメント
の近接性が重要であるか否かを調べるために、HRE（配列番号10）のない３つのS
ILエレメントを、pGL3PVのマルチクローニング部位の約500 bp上流に位置するDr
aIII制限酵素部位へとクローニングし、SIL（配列番号９）のない３つのHREエレ
メントを同じベクターのKpnI制限酵素部位にクローニングした。両方とも、セン
ス5’-3’方向に挿入した。こうして得られた構築物をpGL3PV3XSIL///3XHREと呼
ぶ。好気性条件または低酸素条件のいずれかでの発現を測定し、pGLPV[SIL/HRE]
3と比較した。得られた結果を表４に示す。
インサートを含む構築物の条件的サイレンシングが明らかである。これらの構築
物はすべて、互いの50 bp内にSILおよびHREエレメントの対を含む。エレメント
の近接性が重要であるか否かを調べるために、HRE（配列番号10）のない３つのS
ILエレメントを、pGL3PVのマルチクローニング部位の約500 bp上流に位置するDr
aIII制限酵素部位へとクローニングし、SIL（配列番号９）のない３つのHREエレ
メントを同じベクターのKpnI制限酵素部位にクローニングした。両方とも、セン
ス5’-3’方向に挿入した。こうして得られた構築物をpGL3PV3XSIL///3XHREと呼
ぶ。好気性条件または低酸素条件のいずれかでの発現を測定し、pGLPV[SIL/HRE]
3と比較した。得られた結果を表４に示す。
【００８８】
【表４】
【００８９】
表４に示した結果から、SILエレメントが誘導HREから非常に離れた位置にある
場合には、低酸素によるサイレンシングの逆転が小さくなることがわかる。これ
によって、サイレンシング−誘導比が有意に低下した（SIL/HRE結合構築物につ
いては357、SIL/HRE分離構築物については27.6）。しかし、pGL3PV3XSIL///3XHR
Eでもやはり条件的サイレンシングが明らかであることから、インデューサーの
活性化により、該因子が非常に離れた結合部位を有している場合でも、サイレン
シングを低下できることに留意すべきである。このことから、１つ以上の条件的
サイレンシング機構が明らかであり；第１の機構は、ハイブリッドDNA結合部位
への競合的結合と関連し、第２の機構（例えば、より弱い作用）は、SILおよびH
REエレメントの相対位置とは独立に作用する。ハイブリッドDNA結合部位への転
写因子の競合の関与は、直接結合アッセイにより支持される。
場合には、低酸素によるサイレンシングの逆転が小さくなることがわかる。これ
によって、サイレンシング−誘導比が有意に低下した（SIL/HRE結合構築物につ
いては357、SIL/HRE分離構築物については27.6）。しかし、pGL3PV3XSIL///3XHR
Eでもやはり条件的サイレンシングが明らかであることから、インデューサーの
活性化により、該因子が非常に離れた結合部位を有している場合でも、サイレン
シングを低下できることに留意すべきである。このことから、１つ以上の条件的
サイレンシング機構が明らかであり；第１の機構は、ハイブリッドDNA結合部位
への競合的結合と関連し、第２の機構（例えば、より弱い作用）は、SILおよびH
REエレメントの相対位置とは独立に作用する。ハイブリッドDNA結合部位への転
写因子の競合の関与は、直接結合アッセイにより支持される。
【００９０】実施例２−組織特異的プロモーターを用いた条件的サイレンシング
表１〜４に示した結果から、SILおよびHREエレメントをpGLPVベクターに組み
込むと、条件的サイレンシングが起こることが確認される。このベクターは、組
織特異的ではないSV40初期プロモーターを利用するものである。組織特異的プロ
モーターを用いて同じ作用が認められるか否かを調べるため、図１に記載したよ
うな心臓選択的α-MHCプロモーターのプロモーターを含む-164 bp配列で、pGL3P
V のSV40プロモーター領域を置換した。SIL0/HRE3、[SIL/HRE]2、および[SIL/HR
E]3を含む構築物を作製した。これらを各々心筋細胞にトランスフェクトし、好
気性条件下で、かつ、前述の低酸素での処理から24時間後に、ルシフェラーゼの
発現を測定した。
込むと、条件的サイレンシングが起こることが確認される。このベクターは、組
織特異的ではないSV40初期プロモーターを利用するものである。組織特異的プロ
モーターを用いて同じ作用が認められるか否かを調べるため、図１に記載したよ
うな心臓選択的α-MHCプロモーターのプロモーターを含む-164 bp配列で、pGL3P
V のSV40プロモーター領域を置換した。SIL0/HRE3、[SIL/HRE]2、および[SIL/HR
E]3を含む構築物を作製した。これらを各々心筋細胞にトランスフェクトし、好
気性条件下で、かつ、前述の低酸素での処理から24時間後に、ルシフェラーゼの
発現を測定した。
【００９１】
C2C12細胞と比べて、心筋細胞の方がサイレンサー−インデューサー比は低い
が、α-MHCプロモーターによるSV40初期プロモーターの置換により、増強は変化
しなかったため、条件的サイレンシングは、非組織特異的または組織特異的プロ
モーターのいずれかを用いた場合に有効であることがわかった。表５に示すよう
に、SILエレメントの存在により、サイレンサー−インデューサー比が約10倍増
加した。
が、α-MHCプロモーターによるSV40初期プロモーターの置換により、増強は変化
しなかったため、条件的サイレンシングは、非組織特異的または組織特異的プロ
モーターのいずれかを用いた場合に有効であることがわかった。表５に示すよう
に、SILエレメントの存在により、サイレンサー−インデューサー比が約10倍増
加した。
【００９２】
【表５】
【００９３】実施例３−複数のインデューサーを用いた条件的サイレンシング
これらの実験により、条件的サイレンシングが３つの異なる細胞タイプで起こ
ったが、これは、使用するプロモーターの種類とは関係なく、少なくとも２つの
異なる機構が関与することが明らかにされた。その１つは、ハイブリッド／結合
DNAの結合部位に対するサイレンサーおよびインデューサーの競合に関与し、も
う１つは、エレメントの相対位置とは独立のものである。これら実験のすべてで
、内因性の因子に結合する条件誘導エレメントとして、HREエレメントを使用し
た。上記作用を他の誘導条件の推定に使用できるか否かを調べるため、HREエレ
メントをNFκBエレメントで置換した類似構築物を作製した。NFκB因子は、リポ
多糖（LPS）を含む炎症媒介物質によって誘導される。これらの構築物を作製す
るため、NFκB-SILエレメント（配列番号11）とNFκB-SIL突然変異体エレメント
（配列番号12）を含むオリゴヌクレオチドをpGL3PVのKpnI制限酵素部位にクロー
ニングすることにより、それぞれpGL3-[SIL/NFκB]3およびpGL3-[SIL0/NFκB3]
を作製した。条件的サイレンシングを評価するため、これら構築物を、RAW 264.
7と呼ばれるマクロファージ細胞系にトランスフェクトした。尚、該細胞系は、A
merican Type Culture Collection（ATCC、メリーランド州ベセスダ）から入手
し、ATCCが推奨するように、ウシ胎児血清を含むMEMで培養した。細胞を前記の
ように、リン酸カルシウムを用いて各ベクターでトランスフェクトした。トラン
スフェクション後、集密培養物を３日間血清飢餓状態にした後、処理しないまま
１日放置するか、内因性の因子NFκBを活性化することがわかっている３μg／ml
（最終濃度）のLPS（Sigma）で処理した。前記とまったく同様に、誘導（LPS処
理）および非誘導培養物からの抽出物において、ルシフェラーゼの発現を測定し
た。サイレンサー−インデューサー比（LPS含有：LPS非含有）を表６に示すが、
条件的サイレンシングが明らかである。
ったが、これは、使用するプロモーターの種類とは関係なく、少なくとも２つの
異なる機構が関与することが明らかにされた。その１つは、ハイブリッド／結合
DNAの結合部位に対するサイレンサーおよびインデューサーの競合に関与し、も
う１つは、エレメントの相対位置とは独立のものである。これら実験のすべてで
、内因性の因子に結合する条件誘導エレメントとして、HREエレメントを使用し
た。上記作用を他の誘導条件の推定に使用できるか否かを調べるため、HREエレ
メントをNFκBエレメントで置換した類似構築物を作製した。NFκB因子は、リポ
多糖（LPS）を含む炎症媒介物質によって誘導される。これらの構築物を作製す
るため、NFκB-SILエレメント（配列番号11）とNFκB-SIL突然変異体エレメント
（配列番号12）を含むオリゴヌクレオチドをpGL3PVのKpnI制限酵素部位にクロー
ニングすることにより、それぞれpGL3-[SIL/NFκB]3およびpGL3-[SIL0/NFκB3]
を作製した。条件的サイレンシングを評価するため、これら構築物を、RAW 264.
7と呼ばれるマクロファージ細胞系にトランスフェクトした。尚、該細胞系は、A
merican Type Culture Collection（ATCC、メリーランド州ベセスダ）から入手
し、ATCCが推奨するように、ウシ胎児血清を含むMEMで培養した。細胞を前記の
ように、リン酸カルシウムを用いて各ベクターでトランスフェクトした。トラン
スフェクション後、集密培養物を３日間血清飢餓状態にした後、処理しないまま
１日放置するか、内因性の因子NFκBを活性化することがわかっている３μg／ml
（最終濃度）のLPS（Sigma）で処理した。前記とまったく同様に、誘導（LPS処
理）および非誘導培養物からの抽出物において、ルシフェラーゼの発現を測定し
た。サイレンサー−インデューサー比（LPS含有：LPS非含有）を表６に示すが、
条件的サイレンシングが明らかである。
【００９４】
【表６】
【００９５】
表６から、NFκBエレメントによる発現の誘導が、サイレンサーエレメントの
含有により、4.3から24.3に増加しているのがわかる。これは、90％を超える非
誘導発現の抑制と、LPS活性によるこの抑制の45％までの逆転によって達成され
たものである。この系におけるサイレンシングの逆転は、前記HRE/SIL系におけ
る低酸素による処理ほど有効ではなかった。それでも、上記系は、明らかに、類
似した条件的サイレンシング作用を示している。
含有により、4.3から24.3に増加しているのがわかる。これは、90％を超える非
誘導発現の抑制と、LPS活性によるこの抑制の45％までの逆転によって達成され
たものである。この系におけるサイレンシングの逆転は、前記HRE/SIL系におけ
る低酸素による処理ほど有効ではなかった。それでも、上記系は、明らかに、類
似した条件的サイレンシング作用を示している。
【００９６】
上記結果から、誘導刺激としての低酸素またはLPSと、互いに50 bp以内に位置
するHRE/SILおよびNFκB/SILエレメントを用いた条件的サイレンシングが明らか
である。立体障害および結合部位競合がこの作用に何らかの役割を果たす可能性
を直接調べるために、電気泳動移動度シフトアッセイ（GEMSA）を用いて、SIL/H
RE（配列番号５）およびSIL/NFκB（配列番号13）二本鎖オリゴヌクレオチドと
タンパク質との結合を測定した。核抽出物の調製、オリゴヌクレオチドの標識、
結合条件および電気泳動については、すでに記載されている（Wuら、1998）。こ
れらの条件を、本明細書で実施したすべての結合アッセイで使用した。ただし、
結合用カクテルに0.2％ NP40を添加し、電気泳動には４％ポリアクリルアミドゲ
ルを用いた。SIL/HREアッセイにはC2C12細胞を、また、SIL/NFκBアッセイにはR
AW 264.7をそれぞれ用いた。
するHRE/SILおよびNFκB/SILエレメントを用いた条件的サイレンシングが明らか
である。立体障害および結合部位競合がこの作用に何らかの役割を果たす可能性
を直接調べるために、電気泳動移動度シフトアッセイ（GEMSA）を用いて、SIL/H
RE（配列番号５）およびSIL/NFκB（配列番号13）二本鎖オリゴヌクレオチドと
タンパク質との結合を測定した。核抽出物の調製、オリゴヌクレオチドの標識、
結合条件および電気泳動については、すでに記載されている（Wuら、1998）。こ
れらの条件を、本明細書で実施したすべての結合アッセイで使用した。ただし、
結合用カクテルに0.2％ NP40を添加し、電気泳動には４％ポリアクリルアミドゲ
ルを用いた。SIL/HREアッセイにはC2C12細胞を、また、SIL/NFκBアッセイにはR
AW 264.7をそれぞれ用いた。
【００９７】
簡単に説明すると、プロトコルは下記の通りである。10％血清を含むMEM中で
、C2C12およびRAWマクロファージの培養物を集密的になるまで増殖させた。培養
物を２日間血清飢餓状態にし、核抽出物を調製した（非誘導）。低酸素で24時間
（C2C12）、または３μg／ml LPSで40分処理した（RAW）類似プレートを作製し
た。これらのプレートを回収し、核抽出物（誘導）の調製に使用した。等量のタ
ンパク質を等量の32P標識オリゴヌクレオチドプローブと混合し、21℃で40分間
かけて結合させた。200V／室温で、４％PAGEにより複合体を分離した。得られた
結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。図３Ａの矢印は、内因性の因子：サイレンサー
およびHIF-1転写因子の結合の位置を示している。すでに記載されている競合ア
ッセイ（Wuら、1997；Huら、1998；Murphyら、1999）により、これらシフトした
バンドの特異性を確認した。
、C2C12およびRAWマクロファージの培養物を集密的になるまで増殖させた。培養
物を２日間血清飢餓状態にし、核抽出物を調製した（非誘導）。低酸素で24時間
（C2C12）、または３μg／ml LPSで40分処理した（RAW）類似プレートを作製し
た。これらのプレートを回収し、核抽出物（誘導）の調製に使用した。等量のタ
ンパク質を等量の32P標識オリゴヌクレオチドプローブと混合し、21℃で40分間
かけて結合させた。200V／室温で、４％PAGEにより複合体を分離した。得られた
結果を図３Ａおよび３Ｂに示す。図３Ａの矢印は、内因性の因子：サイレンサー
およびHIF-1転写因子の結合の位置を示している。すでに記載されている競合ア
ッセイ（Wuら、1997；Huら、1998；Murphyら、1999）により、これらシフトした
バンドの特異性を確認した。
【００９８】
上記in vitro反応でのHREとサイレンサー結合因子との結合は、最適ではなか
った。というのは、効率的結合のために、サイレンサーには0.1％NP40が必要で
あるが、このNP40濃度では、HIF-1結合が阻害されるからである。従って、妥協
して、0.05％ NP40を用いなければならなかった。サイレンサーおよびHRE因子両
方の特異的結合が弱くても、HIF-1を含む低酸素活性化細胞からの核抽出物を用
いた反応では、サイレンサーエレメントの結合が、低下することは明らかである
（レーン２をレーン３と比較）。SIL/NFκBハイブリッドオリゴヌクレオチドお
よびRAW±LPS抽出物を用いれば、作用はさらに顕著になった。この場合、未処理
細胞からの抽出物を用いると、SIL結合タンパク質の結合が明らかに認められる
。しかし、LPSで処理した細胞からの抽出物は、NFκB結合の強力な活性化を示し
、SILエレメントの結合がほぼ完全に排除されているのがわかる。これらの結果
から、HRE結合因子およびNFκBは、50 bp以内の間隔に位置する結合エレメント
を含むオリゴヌクレオチドからSIL結合因子にとってかわることが明らかである
。この結果は、本明細書に記載したように、条件的サイレンシング機構の１つと
して、立体障害および共通のハイブリッド結合の競合が役割を果たすことを支持
している。
った。というのは、効率的結合のために、サイレンサーには0.1％NP40が必要で
あるが、このNP40濃度では、HIF-1結合が阻害されるからである。従って、妥協
して、0.05％ NP40を用いなければならなかった。サイレンサーおよびHRE因子両
方の特異的結合が弱くても、HIF-1を含む低酸素活性化細胞からの核抽出物を用
いた反応では、サイレンサーエレメントの結合が、低下することは明らかである
（レーン２をレーン３と比較）。SIL/NFκBハイブリッドオリゴヌクレオチドお
よびRAW±LPS抽出物を用いれば、作用はさらに顕著になった。この場合、未処理
細胞からの抽出物を用いると、SIL結合タンパク質の結合が明らかに認められる
。しかし、LPSで処理した細胞からの抽出物は、NFκB結合の強力な活性化を示し
、SILエレメントの結合がほぼ完全に排除されているのがわかる。これらの結果
から、HRE結合因子およびNFκBは、50 bp以内の間隔に位置する結合エレメント
を含むオリゴヌクレオチドからSIL結合因子にとってかわることが明らかである
。この結果は、本明細書に記載したように、条件的サイレンシング機構の１つと
して、立体障害および共通のハイブリッド結合の競合が役割を果たすことを支持
している。
【００９９】実施例４−in vivoでの条件的サイレンシング
in vivoで組織中にこれら構築物のサイレンシングが存在するか否かを調べる
ため、ラットの心臓に、pGLPV-[SIL/HRE]3またはpGLPV-[SIL0/HRE3]を注射し、
５日後発現を測定した。外科手術の手順、左心室へのDNA注射、組織の調製、レ
ポーターアッセイは、以前記載されている通りに実施した（Prenticeら、1997）
。表７に示すように、２つの実験結果を非サイレンシング構築物について100に
正規化した。
ため、ラットの心臓に、pGLPV-[SIL/HRE]3またはpGLPV-[SIL0/HRE3]を注射し、
５日後発現を測定した。外科手術の手順、左心室へのDNA注射、組織の調製、レ
ポーターアッセイは、以前記載されている通りに実施した（Prenticeら、1997）
。表７に示すように、２つの実験結果を非サイレンシング構築物について100に
正規化した。
【０１００】
【表７】
【０１０１】
これら構築物における唯一の相違は、機能的サイレンサーエレメントが存在す
るかしないかであり、従って、得られた結果は、in vivoでのサイレンシングの
存在を強く支持するものである。現在進行中の実験により、このサイレンシング
の虚血可逆性（ischemia-reversibility）を測定中である。
るかしないかであり、従って、得られた結果は、in vivoでのサイレンシングの
存在を強く支持するものである。現在進行中の実験により、このサイレンシング
の虚血可逆性（ischemia-reversibility）を測定中である。
【０１０２】
条件的サイレンシングがin vivoで起こったか否かを調べるため、ラット虚血
後肢モデルを用いた（Takeshitaら、1994）。このモデルでは、大腿およびそれ
に連結する動脈を結紮および除去することにより、ラット後肢筋肉を虚血にした
後、ベクターDNAを筋肉に直接注射した。適当な期間の後、筋肉を採取し、レポ
ーター遺伝子発現を前記と同様に測定した。簡単に説明すると、プロトコルは次
の通りである。ラットを麻酔し、右肢の皮膚を切開することにより、大腿動脈を
露出させた。動脈を静脈から分離した後、大腿の近位端と、伏在動脈の遠位端と
を結紮した。結紮間の約２cmの動脈（すべての側枝を含む）を切開し、切除した
。レーザードップラー表面分析装置（Lisca）を用いて、ふくらはぎへの血流を
モニターした。模擬対照として、左肢に同じ手順を施したが、動脈はインタクト
のままとした。結紮間の筋肉領域に、塩化セシウム精製DNA（１μg／μl）を直
接注射し、各25μlを4回注射した。同様の注射を模擬操作の肢筋肉にも実施した
。筋肉を覆う皮膚を外科ステープラーで吻合し、動物を回復させた。１〜２日後
、致死量のナトリウムペントバルビタールで、ラットを死亡させ、注射した筋肉
を切開して取り出し、氷冷PBSに移した。１セットの実験（ｎ＝２）の結果を表
９に示す。大腿動脈の除去前、足への血流は、77 ml／分（ｎ＝２）であった。
除去後、血流は＜５ml／分に低下し、95％を超す低下を示した。
後肢モデルを用いた（Takeshitaら、1994）。このモデルでは、大腿およびそれ
に連結する動脈を結紮および除去することにより、ラット後肢筋肉を虚血にした
後、ベクターDNAを筋肉に直接注射した。適当な期間の後、筋肉を採取し、レポ
ーター遺伝子発現を前記と同様に測定した。簡単に説明すると、プロトコルは次
の通りである。ラットを麻酔し、右肢の皮膚を切開することにより、大腿動脈を
露出させた。動脈を静脈から分離した後、大腿の近位端と、伏在動脈の遠位端と
を結紮した。結紮間の約２cmの動脈（すべての側枝を含む）を切開し、切除した
。レーザードップラー表面分析装置（Lisca）を用いて、ふくらはぎへの血流を
モニターした。模擬対照として、左肢に同じ手順を施したが、動脈はインタクト
のままとした。結紮間の筋肉領域に、塩化セシウム精製DNA（１μg／μl）を直
接注射し、各25μlを4回注射した。同様の注射を模擬操作の肢筋肉にも実施した
。筋肉を覆う皮膚を外科ステープラーで吻合し、動物を回復させた。１〜２日後
、致死量のナトリウムペントバルビタールで、ラットを死亡させ、注射した筋肉
を切開して取り出し、氷冷PBSに移した。１セットの実験（ｎ＝２）の結果を表
９に示す。大腿動脈の除去前、足への血流は、77 ml／分（ｎ＝２）であった。
除去後、血流は＜５ml／分に低下し、95％を超す低下を示した。
【０１０３】
【表９】
【０１０４】
これらの実験で、虚血による対照構築物（非サイレンシング）の誘導は低かっ
た。というのは、ラットの後肢が、副行循環を急速に発達させ、筋肉が再灌流（
そして再酸素添加）した状態になるからである。しかし、サイレンサーの存在が
、サイレンサー−インデューサー比の20倍増加を媒介することがわかり、これに
よって、これらの構築物により、条件的サイレンシングがin vivoで起こること
が確認される。
た。というのは、ラットの後肢が、副行循環を急速に発達させ、筋肉が再灌流（
そして再酸素添加）した状態になるからである。しかし、サイレンサーの存在が
、サイレンサー−インデューサー比の20倍増加を媒介することがわかり、これに
よって、これらの構築物により、条件的サイレンシングがin vivoで起こること
が確認される。
【０１０５】実施例５−低酸素／サイレンサー活性化遺伝子の治療上の影響
心筋細胞を低酸素に24時間、次に再酸素添加に20時間暴露する（心筋の虚血−
再灌流をシミュレートする条件）と、心筋の30％を超えるアポトーシスにより死
亡に到る（Websterら、1999）。このモデルを用いて、好気性条件下でサイレン
シングをうけた低酸素活性化遺伝子（例えば、DT-ジアホラーゼ）が、低酸素−
再酸素添加による酸化ストレスから心筋細胞を保護できるかどうかを調べた。DT
-ジアホラーゼは、ミトコンドリア電子輸送中のキノン循環により発生する遊離
基のクエンチングを媒介する抗酸化剤である。DT-ジアホラーゼをコードするcDN
Aインサートを、HindIIIで、pcDNAベクターから取り出した。ルシフェラーゼcDN
Aインサートを取り出した後、pGLPV-[HRE/SIL]3のHindIII-Xbal制限酵素部位に
、この約1.3 Kbのインサートをクローニングした。これには、２段階の工程を必
要とした。すなわち、第１に、HindIII制限酵素部位で結合させ、第２に、残り
の付着末端および平滑末端に充填し、環状にする。配列決定により方向を調べた
。こうして得られた構築物をpPV[SIL/HRE]3-DT-dと呼ぶ。２μgのCMV-緑色蛍光
タンパク質（GFP、Clontech）および８μｇのpPV[SIL/HRE]3-DT-d、または対照
としてエンプティーベクターで心筋細胞をトランスフェクトした。GFPを用いて
、トランスフェクト細胞を追跡した。トランスフェクト培養物を低酸素−再酸素
添加に暴露することにより、以前の記載（Websterら、1999）と同様に30％細胞
アポトーシスを発生させた。類似した培養物を１％H2O2で処理し、低酸素のない
酸化ストレスを誘導した。処理後、ヘキスト染色法で培養物を処理することによ
り、以前の記載（Websterら、1999；Doughertyら、2000）と同様に、アポトーシ
ス細胞を同定し、同じ細胞を蛍光顕微鏡で検査することにより、トランスフェク
トGFP陽性細胞を同定した。GFP陽性のアポトーシスおよび非アポトーシス細胞を
計数し、pPV[SIL/HRE]3-DT-dの共トランスフェクション（低酸素下で誘導される
）が、再酸素添加によって起こるアポトーシスを防御できるかどうかを調べた。
これらの実験結果（ｎ＝２）を表10に示す。
再灌流をシミュレートする条件）と、心筋の30％を超えるアポトーシスにより死
亡に到る（Websterら、1999）。このモデルを用いて、好気性条件下でサイレン
シングをうけた低酸素活性化遺伝子（例えば、DT-ジアホラーゼ）が、低酸素−
再酸素添加による酸化ストレスから心筋細胞を保護できるかどうかを調べた。DT
-ジアホラーゼは、ミトコンドリア電子輸送中のキノン循環により発生する遊離
基のクエンチングを媒介する抗酸化剤である。DT-ジアホラーゼをコードするcDN
Aインサートを、HindIIIで、pcDNAベクターから取り出した。ルシフェラーゼcDN
Aインサートを取り出した後、pGLPV-[HRE/SIL]3のHindIII-Xbal制限酵素部位に
、この約1.3 Kbのインサートをクローニングした。これには、２段階の工程を必
要とした。すなわち、第１に、HindIII制限酵素部位で結合させ、第２に、残り
の付着末端および平滑末端に充填し、環状にする。配列決定により方向を調べた
。こうして得られた構築物をpPV[SIL/HRE]3-DT-dと呼ぶ。２μgのCMV-緑色蛍光
タンパク質（GFP、Clontech）および８μｇのpPV[SIL/HRE]3-DT-d、または対照
としてエンプティーベクターで心筋細胞をトランスフェクトした。GFPを用いて
、トランスフェクト細胞を追跡した。トランスフェクト培養物を低酸素−再酸素
添加に暴露することにより、以前の記載（Websterら、1999）と同様に30％細胞
アポトーシスを発生させた。類似した培養物を１％H2O2で処理し、低酸素のない
酸化ストレスを誘導した。処理後、ヘキスト染色法で培養物を処理することによ
り、以前の記載（Websterら、1999；Doughertyら、2000）と同様に、アポトーシ
ス細胞を同定し、同じ細胞を蛍光顕微鏡で検査することにより、トランスフェク
トGFP陽性細胞を同定した。GFP陽性のアポトーシスおよび非アポトーシス細胞を
計数し、pPV[SIL/HRE]3-DT-dの共トランスフェクション（低酸素下で誘導される
）が、再酸素添加によって起こるアポトーシスを防御できるかどうかを調べた。
これらの実験結果（ｎ＝２）を表10に示す。
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】
pPV[SIL/HRE]3-DT-dでトランスフェクトした細胞は、24時間の低酸素および20
時間の再酸素添加によって起こるアポトーシスから強力に保護された。エンプテ
ィーベクターでトランスフェクトした対照培養物は、再酸素添加後、GFP陽性細
胞の24％アポトーシスを呈示し、以前の結果（Websterら、1999）と類似してい
た。pPV[SIL/HRE]3-DT-dで共トランスフェクトした培養物は、８％のGFP陽性ア
ポトーシス陽性細胞を呈示したに過ぎず、これは、＞60％の保護を意味する（ｐ
＜0.05）。H2O2で処理した細胞は、共トランスフェクトしたプラスミドとは無関
係に、同じアポトーシス率（約９％）を示した。従って、DT-ジアホラーゼ発現
の活性化、ならびに、低酸素下で条件的サイレンシングを受けたベクターの逆転
は、後の再酸素添加中の心臓保護に影響を与えることができる。これにより、条
件的サイレンシングを受けた遺伝子は、疾病表現型（低酸素）により活性化する
ことができ、疾病（再灌流傷害）を被った標的宿主細胞に治療効果を及ぼし得る
ことがわかる。
時間の再酸素添加によって起こるアポトーシスから強力に保護された。エンプテ
ィーベクターでトランスフェクトした対照培養物は、再酸素添加後、GFP陽性細
胞の24％アポトーシスを呈示し、以前の結果（Websterら、1999）と類似してい
た。pPV[SIL/HRE]3-DT-dで共トランスフェクトした培養物は、８％のGFP陽性ア
ポトーシス陽性細胞を呈示したに過ぎず、これは、＞60％の保護を意味する（ｐ
＜0.05）。H2O2で処理した細胞は、共トランスフェクトしたプラスミドとは無関
係に、同じアポトーシス率（約９％）を示した。従って、DT-ジアホラーゼ発現
の活性化、ならびに、低酸素下で条件的サイレンシングを受けたベクターの逆転
は、後の再酸素添加中の心臓保護に影響を与えることができる。これにより、条
件的サイレンシングを受けた遺伝子は、疾病表現型（低酸素）により活性化する
ことができ、疾病（再灌流傷害）を被った標的宿主細胞に治療効果を及ぼし得る
ことがわかる。
【０１０８】
配列番号７を用いた条件的サイレンシングにより、他の遺伝子をpGL3PV-[SIL/
HRE]3にクローニングして発現させ、その後配列決定した。血球凝集素（HA）エ
ピトープタグを有するβ-gal cDNAを、HindIIIおよびXbaIを用いてpcDNA3.1/His
B/lacZ（Invitrogen）から切り取った。ルシフェラーゼcDNAインサートを除去し
た後、pGL3PV-[SIL/HRE]3のHindIII-XbaI制限酵素部位に、約４Kbインサートを
クローニングした。この構築物は、pβ-gal[SIL/HRE]3と呼ぶ。ヒト平滑筋細胞
のcDNAから、ヒトVEGF121 cDNAをPCRによりクローニングした。末端にHindIIIお
よびXbaI制限酵素部位を有するプライマーを用いて、精製産物を、以前の記載と
同様に、pGL3PV[SIL/HRE]3のHindIII-XbaI制限酵素部位にクローニングした。こ
の構築物をpVEGF121[SIL/HRE]3と呼ぶ。pBluescript（Stratagene）から切り取
った全長ヒトHIF-1αcDNAを切断し、pGL3PV-[SIL/HRE]3のXbaI-NcoI制限酵素部
位にクローニングした。この構築物をpHIF-1α[SIL/HRE]3と呼ぶ。
HRE]3にクローニングして発現させ、その後配列決定した。血球凝集素（HA）エ
ピトープタグを有するβ-gal cDNAを、HindIIIおよびXbaIを用いてpcDNA3.1/His
B/lacZ（Invitrogen）から切り取った。ルシフェラーゼcDNAインサートを除去し
た後、pGL3PV-[SIL/HRE]3のHindIII-XbaI制限酵素部位に、約４Kbインサートを
クローニングした。この構築物は、pβ-gal[SIL/HRE]3と呼ぶ。ヒト平滑筋細胞
のcDNAから、ヒトVEGF121 cDNAをPCRによりクローニングした。末端にHindIIIお
よびXbaI制限酵素部位を有するプライマーを用いて、精製産物を、以前の記載と
同様に、pGL3PV[SIL/HRE]3のHindIII-XbaI制限酵素部位にクローニングした。こ
の構築物をpVEGF121[SIL/HRE]3と呼ぶ。pBluescript（Stratagene）から切り取
った全長ヒトHIF-1αcDNAを切断し、pGL3PV-[SIL/HRE]3のXbaI-NcoI制限酵素部
位にクローニングした。この構築物をpHIF-1α[SIL/HRE]3と呼ぶ。
【０１０９】
β-gal、IGF-1、VEGF、およびHIF-1αの低酸素活性化発現が証明された。p HI
F-1α[SIL/HRE]3の場合には、pGLPV-[SIL/HRE]3を有するこの構築物をC2C12細胞
に共トランスフェクトすることにより、低酸素媒介条件的サイレンシングを約10
倍増強することが明らかにされた。これは、このベクターを用いることにより、
別の状況でも条件的サイレンシングを増強できることを示している。この作用は
、HIF-1α生産が低い細胞および組織において、特に有用であると考えられる。
F-1α[SIL/HRE]3の場合には、pGLPV-[SIL/HRE]3を有するこの構築物をC2C12細胞
に共トランスフェクトすることにより、低酸素媒介条件的サイレンシングを約10
倍増強することが明らかにされた。これは、このベクターを用いることにより、
別の状況でも条件的サイレンシングを増強できることを示している。この作用は
、HIF-1α生産が低い細胞および組織において、特に有用であると考えられる。
【０１１０】
TRE/SIL（配列番号17）
以下の配列は、チオキシン遺伝子由来の条件誘導エレメントである：
【０１１１】
抗酸化剤応答エレメントは、NAD(P)Hキノンレダクターゼ遺伝子に含まれ（Jai
swal, 1994）、コンセンサス配列5’-TGACNNNGC-3’を有する。また、金属応答
エレメントは、メタロチオネイン遺伝子に含まれ（Murphyら、1999）、熱応答エ
レメントは、HSP70およびHSP82のようなヒートショック遺伝子に含まれる。ホル
モン応答エレメントは、アンドロゲン応答エレメント（ARE）、グルコ−コルチ
コイド応答エレメント（GRE）、ならびに、エストロゲン応答エレメント（ERE）
などのクラスである。NFκB応答エレメントは、インターフェロンおよびその他
のサイトカイン遺伝子に含まれ、配列番号11および13に示すコンセンサス配列を
有する。
swal, 1994）、コンセンサス配列5’-TGACNNNGC-3’を有する。また、金属応答
エレメントは、メタロチオネイン遺伝子に含まれ（Murphyら、1999）、熱応答エ
レメントは、HSP70およびHSP82のようなヒートショック遺伝子に含まれる。ホル
モン応答エレメントは、アンドロゲン応答エレメント（ARE）、グルコ−コルチ
コイド応答エレメント（GRE）、ならびに、エストロゲン応答エレメント（ERE）
などのクラスである。NFκB応答エレメントは、インターフェロンおよびその他
のサイトカイン遺伝子に含まれ、配列番号11および13に示すコンセンサス配列を
有する。
【０１１２】参考文献
【０１１３】
本明細書に引用した出版物、特許出願、および特許はすべて、それらが引用さ
れる全文を参照として本明細書に組み込まれる。このような参照文献はまた、当
該技術の例示としても引用した。
れる全文を参照として本明細書に組み込まれる。このような参照文献はまた、当
該技術の例示としても引用した。
【０１１４】
本発明は、現時点で、実用的かつ好ましい実施形態であると考えられるものに
ついて説明してきたが、本発明は、開示した実施形態に限定または制限されるわ
けではなく、反対に、特許請求の範囲内にある様々な変更、代替物、および組合
せを包含することを理解すべきである。これに関して、特許請求の範囲によって
もたらされる保護が、後の技術的進歩を見込んでそれらの発行後に決定され、す
べての合法的均等物まで拡大されることにも留意すべきである。
ついて説明してきたが、本発明は、開示した実施形態に限定または制限されるわ
けではなく、反対に、特許請求の範囲内にある様々な変更、代替物、および組合
せを包含することを理解すべきである。これに関して、特許請求の範囲によって
もたらされる保護が、後の技術的進歩を見込んでそれらの発行後に決定され、す
べての合法的均等物まで拡大されることにも留意すべきである。
【０１１５】
従って、本明細書に記載されていない本発明の改変は、当業者には明らかであ
り、従来技術を除き、本発明の新規でかつ自明ではない構成要素から逸脱するこ
となく、実施が可能であることを理解しなければならない。例えば、当業者には
公知のサイレンサーエレメント、条件誘導エレメント、プロモーター、発現ベク
ターにより転写される遺伝子、発現ベクターのその他の成分、内因性の因子、ト
ランスフェクション方法、感染方法、突然変異誘発方法、ならびに、発現ベクタ
ーを作製または使用するその他の方法に代わって、本明細書に記載したものを用
いることができる。同様に、発現ベクターのヌクレオチド配列、方向および成分
の分離、ならびに、該成分の選択を改変してもよく、改変の有用性は、基底発現
、サイレンサー−インデューサー比、調節された発現の空間的または時間的パタ
ーン、あるいは、それらの組合せに対する影響を比較することにより、決定され
る。
り、従来技術を除き、本発明の新規でかつ自明ではない構成要素から逸脱するこ
となく、実施が可能であることを理解しなければならない。例えば、当業者には
公知のサイレンサーエレメント、条件誘導エレメント、プロモーター、発現ベク
ターにより転写される遺伝子、発現ベクターのその他の成分、内因性の因子、ト
ランスフェクション方法、感染方法、突然変異誘発方法、ならびに、発現ベクタ
ーを作製または使用するその他の方法に代わって、本明細書に記載したものを用
いることができる。同様に、発現ベクターのヌクレオチド配列、方向および成分
の分離、ならびに、該成分の選択を改変してもよく、改変の有用性は、基底発現
、サイレンサー−インデューサー比、調節された発現の空間的または時間的パタ
ーン、あるいは、それらの組合せに対する影響を比較することにより、決定され
る。
【図１】
pMHC164の構築を示した図である。
【図２】
サイレンサーエレメントと条件誘導エレメントの間に重複がない（配列番号５
〜７）または５塩基の重複がある（配列番号８）発現ベクターのpGL3PV HRE/SIL
シリーズの構築を示した図である。
〜７）または５塩基の重複がある（配列番号８）発現ベクターのpGL3PV HRE/SIL
シリーズの構築を示した図である。
【図３】
誘導条件の存在下または不在下でのHIF-1およびNFκB転写因子のコグネイト部
位への結合のGEMSA分析を示した図である。
位への結合のGEMSA分析を示した図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｐ 37/02 Ｃ１２Ｎ 1/15
Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19
1/19 1/21
1/21 Ａ６１Ｋ 35/76
5/10 48/00
// Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
48/00 5/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＣＡ，Ｊ
Ｐ
Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA21 CA04 EA02
EA04 FA02 FA06 GA11 GA12
GA14 HA01 HA17
4B065 AA90X AA99Y AB01 BA03
BA04 CA24 CA44
4C084 AA13 NA14 ZA362 ZA452
ZB072 ZB262 ZB312
4C087 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA36
ZA45 ZB07 ZB08 ZB09 ZB26
ZB31
Claims (41)
- 【請求項１】 (a) サイレンサー誘導領域を形成する、１以上のサイレンサ
ーエレメントと１以上の条件誘導エレメント、および(b) １以上の該サイレンサ
ー誘導領域と機能的に連結されていて１以上の該サイレンサー誘導領域により調
節され、１以上の発現領域の上流にあるプロモーター、を含む単離された発現ベ
クターであって、誘導条件下にあっては、該誘導条件の不在下での１以上の下流
領域の発現を上回る量で該下流領域を発現する、上記発現ベクター。 - 【請求項２】 前記プロモーターがウイルスプロモーターである、請求項１
に記載の発現ベクター。 - 【請求項３】 前記プロモーターがいくつかの異なる組織で働く哺乳動物プ
ロモーターである、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項４】 哺乳動物プロモーターが、心筋、骨格筋、血管内皮、脳、網
膜、腎臓、肝臓、肺、骨髄、および脾臓からなる群より選択される１以上の異な
る組織で働くものである、請求項３に記載の発現ベクター。 - 【請求項５】 前記プロモーターが細胞タイプに特異的なプロモーターであ
る、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項６】 細胞タイプに特異的なプロモーターが、心筋特異的プロモー
ター、骨格筋特異的プロモーター、内皮細胞特異的プロモーター、ニューロン特
異的プロモーター、グリア特異的プロモーター、網膜特異的プロモーター、腎臓
特異的プロモーター、肝臓特異的プロモーター、肺特異的プロモーター、リンパ
球特異的プロモーター、骨髄特異的プロモーター、および腫瘍特異的プロモータ
ーからなる群より選択される、請求項５に記載の発現ベクター。 - 【請求項７】 サイレンサーエレメントの少なくとも１つが、ニューロン限
定的サイレンサー(NRS)転写因子により結合されるニューロン限定的サイレンサ
ー(NRS)エレメントである、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項８】 サイレンサーエレメントの少なくとも１つが、負の調節エレ
メント(NRE)またはリプレッサーである、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項９】 サイレンサーエレメントの少なくとも２つが、アデニンヌク
レオチド輸送体-2、B29 (Ig-β)、CD95 (Fas/APO1)、グルタチオントランスフェ
ラーゼＰ(GST-P)、インターフェロンβ(IFN-β)、腸管三葉型因子(ITF)、リゾチ
ーム、メタロチオネインIII (MT-III)、精巣特異的ヒストンH1t、甲状腺ホルモ
ン受容体β1 (TR-β1)、血管細胞接着分子-1 (VCAM-1)、およびフォンビルブラ
ント因子(vWF)と称する遺伝子からなる群より選択される遺伝子中に存在する、
請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１０】 サイレンサーエレメントの少なくとも２つが、CCTC結合因
子(CTCF)、杯状細胞サイレンサーインヒビター(SI)、核因子１(NF1)タンパク質
、オクタマー結合タンパク質(Oct-1およびOct-2)、サイレンサー因子Ａ、および
サイレンサー因子Ｂからなる群より選択される転写因子により結合される、請求
項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１１】 条件誘導エレメントの少なくとも１つが、低酸素誘導因子
-1(HIF-1)転写因子により結合される低酸素応答エンハンサー(HRE)エレメントで
ある、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１２】 HREエレメントが、エンドセリン-1、エノラーゼ-1、エリ
トロポエチン、ヘムオキシゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ピルビン酸
キナーゼ、およびVEGF/Flt-1受容体と称する遺伝子からなる群より選択される遺
伝子中に存在する、請求項１１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１３】 HREエレメントが、例えばメタロチオネイン転写因子-1(MT
F-1)により結合されるメタロチオネインＩ(MT-I)およびメタロチオネインII(MT-
II)を含めて、HIF-1αにより結合されない、請求項１１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１４】 条件誘導エレメントの少なくとも１つが、酸化的ストレス
応答エレメントである、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１５】 条件誘導エレメントの少なくとも１つが、抗酸化剤応答エ
レメントである、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１６】 条件誘導エレメントの少なくとも１つが、金属応答エレメ
ント(MRE)、熱応答エレメント、ホルモン応答エレメント、および増殖因子応答
エレメントからなる群より選択される、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１７】 条件誘導エレメントの少なくとも１つが、NF-κB転写因子
により結合されるNF-κB応答エレメントである、請求項１に記載の発現ベクター
。 - 【請求項１８】 １以上の発現領域が、アデノシンデアミナーゼ、アンギオ
ポエチン、アポトーシスインヒビタータンパク質、アンギオスタチン、Ｂ細胞CL
L／リンパ腫(BCL2)、カタラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、DT-ジアホラーゼ
、エンドスタチン、エリトロポエチン、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、フマジリン
、β-グロビン、グルタチオンペルオキシダーゼ、顆粒球コロニー刺激因子(G-CS
F)、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、熱ショック転写因子、
肝細胞増殖因子(HGF)、インターフェロン、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、
一酸化窒素シンターゼ、血小板由来増殖因子(PDGF)、プロリフェリン、ソマトメ
ジンＣ(IGF-1)、スーパーオキシドジスムターゼ、サーバイビン(survivin)、チ
ミジンキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍タンパク質p53 (TP53)
、ウロキナーゼ、および血管内皮増殖因子(VEGF)と称する遺伝子の機能性コード
領域からなる群より選択される、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項１９】 １以上の発現領域が、クロラムフェニコールトランスフェ
ラーゼ、グリーン蛍光タンパク質、レッド蛍光タンパク質、β-ガラクトシダー
ゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ラクタマーゼ、およびルシフェラーゼと称するレ
ポーター遺伝子の機能性コード領域からなる群より選択される、請求項１に記載
の発現ベクター。 - 【請求項２０】 １以上の発現領域が、前記プロモーターに対してアンチセ
ンス方向にある、MDM2、腫瘍タンパク質p53 (TP53)、エンドセリン-1、腫瘍壊死
因子(TNF)、インターロイキン、インターフェロン(IFN)、血管内皮増殖因子(VEG
F)、およびその他のサイトカインと称する遺伝子の機能性部分からなる群より選
択される、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項２１】 １以上のサイレンサーエレメントと１以上の条件誘導エレ
メントが、前記サイレンサー誘導領域において互いに対して異種である、請求項
１に記載の発現ベクター。 - 【請求項２２】 １以上のサイレンサーエレメントと１以上の条件誘導エレ
メントが、前記サイレンサー誘導領域において互いから500ヌクレオチド以内に
配置される、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項２３】 エレクトロポレーション、ネイキッドDNA送達、マイクロ
インジェクション、および注入からなる群より選択される技法を用いて細胞に導
入するように製剤化されたプラスミドである、請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項２４】 複製欠損アデノウイルスとしてパッケージングされる、請
求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項２５】 アデノ随伴ウイルスとしてパッケージングされる、請求項
１に記載の発現ベクター。 - 【請求項２６】 レトロウイルスとしてパッケージングされる、請求項１に
記載の発現ベクター。 - 【請求項２７】 長さが1000〜50,000ヌクレオチドである、請求項１に記載
の発現ベクター。 - 【請求項２８】 宿主細胞またはヒト以外の宿主生物に導入された請求項１
に記載の発現ベクターを含有する、遺伝子操作された細胞または非ヒト生物。 - 【請求項２９】 宿主細胞が哺乳動物細胞であり、宿主生物がヒト以外の哺
乳動物である、請求項２８に記載の遺伝子操作された細胞または非ヒト生物。 - 【請求項３０】 請求項１に記載の発現ベクターを製造する方法。
- 【請求項３１】 請求項１に記載の発現ベクターを使用する方法であって、
該ベクターを細胞に導入した後該ベクターに前記誘導条件を付与するか、または
すでに付与してあることにより、１以上の前記下流領域を発現させることを含ん
でなる、上記方法。 - 【請求項３２】 サイレンサーエレメントと条件誘導エレメントを含むサイ
レンサー誘導領域を含んでなる単離されたポリヌクレオチドであって、該条件誘
導エレメントは該サイレンサーエレメントと機能的に連結されており、かつ該サ
イレンサーエレメントに対して異種であり、該サイレンサー誘導領域をプロモー
ターに機能的に連結させると、該プロモーターからの転写の条件的サイレンシン
グがもたらされる、上記単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項３３】 サイレンサー誘導領域がプロモーターに機能的に連結され
ている、請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項３４】 前記プロモーターが組織特異的プロモーターである、請求
項３３に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項３５】 前記プロモーターが、サイレンサー誘導領域のサイレンサ
ーエレメントまたは条件誘導エレメントの少なくとも一方に対して異種である、
請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項３６】 １以上のサイレンサーエレメントおよび１以上の条件誘導
エレメントが約500塩基以下で分離されている、請求項３２に記載の単離された
ポリヌクレオチド。 - 【請求項３７】 サイレンサーエレメントが、ニューロン限定的サイレンサ
ー(NRS)エレメントおよび負の調節エレメント(NRE)からなる群より選択される、
請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項３８】 条件誘導エレメントが、低酸素応答エンハンサー(HRE)エ
レメント、酸化的ストレス応答エレメント、抗酸化剤応答エレメント、金属応答
エレメント(MRE)、熱応答エレメント、ホルモン応答エレメント、NF-κB応答エ
レメント、および増殖応答エレメント（例えば、SRF）からなる群より選択され
る、請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項３９】 サイレンサー誘導領域が２以上のサイレンサーエレメント
を含む、請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項４０】 サイレンサー誘導領域が３以上のサイレンサーエレメント
を含む、請求項３２に記載の単離されたポリヌクレオチド。 - 【請求項４１】 請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター
。
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| US60/171,597 | 1999-12-23 | ||
| US09/723,326 US6893867B1 (en) | 1999-12-23 | 2000-11-28 | Molecular switch for regulating mammalian gene expression |
| US09/723,326 | 2000-11-28 | ||
| PCT/US2000/033269 WO2001048187A2 (en) | 1999-12-23 | 2000-12-15 | A molecular switch for regulating mammalian gene expression |
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|---|---|
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