JP2003519123A

JP2003519123A - Ａｍｐ回路特殊燐酸ジエステラーゼ阻害剤

Info

Publication number: JP2003519123A
Application number: JP2001549353A
Authority: JP
Inventors: ティモシー，ジェイ．マーティンズ，; ケリー，ダブリュ．フォーラー，; アミーオリバー，; カーメン，シィー．ハーテル，
Original assignee: アイコスコーポレイション
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-10-13
Publication date: 2003-06-17
Also published as: US20030013754A1; EP1244620A1; US6372777B1; WO2001047880A1; CN1249033C; AU1087101A; US6569890B2; CN1434799A; CA2395543A1; AU781063B2

Abstract

(57)【要約】有効でＰＤＥ４の選択的阻害剤である構造式（Ｉ）および（II）【化７３】

Description

【発明の詳細な説明】

（関連出願に対する相互参照）この出願は、１９９９年１２月２３日に提出された暫定的出願通し番号６０／
１７１，９５４の利益を請求するものである。（発明の分野）本発明は、環状アデノシン３’，５’−一燐酸特異的ホスホジエステラーゼ（
ｃＡＭＰ−特異的ＰＤＥ）の効能のある、選択的阻害物質である一連の化合物に
関する。特に本発明は、ｃＡＭＰ−特異的ＰＤＥ、とりわけＰＤＥ４の機能を阻
害するのに効果的な一連の新規ピロール化合物、ならびに上記のものを製造する
方法、上記のものを含む医薬組成物、かつたとえば炎症性疾患および高レベルの
サイトカインや炎症誘発性介在物質を含むその他の疾患を治療する際の治療薬と
してのそれらの仕様に関する。（発明の背景）慢性的炎症は、多数の型の炎症細胞、特にリンパ系細胞（Ｔリンパ球を含む）
および骨髄系（顆粒球、マクロファージ、単球を含む）の活性化により特徴づけ
られる多因子性疾患合併症である。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインターロイ
キン（ＩＬ−１）のようなサイトカインを含む炎症誘発性介在物質はこれらの活
性化された細胞により生成される。したがって、これらの細胞またはその炎症誘
発性サイトカインの生成物の活性化を抑圧する薬剤、または、炎症性疾患および
高レベルのサイトカインを含むその他の疾患の治療において有効であろう。

【０００１】環状アデノシン一燐酸（ｃＡＭＰ）は、細胞の生物学的反応を広い範囲の細胞
外刺激物質に伝える第二次情報伝達物質である。適切な作用物質が特定の細胞表
面レセプターに結合すると、アデニル酸シクラーゼが活性化されて、アデノシン
三燐酸（ＡＴＰ）をｃＡＭＰに転換する。細胞内におけるｃＡＭＰの作用物質誘
発作用は、ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼの作用により優性的に媒介されている
。ｃＡＭＰの細胞内作用は、細胞の外側へのヌクレオチドの運搬、または３’−
ホスホジエステル結合を加水分解して５’−アデノシン一燐酸（５’−ＡＭＰ）
を形成する環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥｓ）による酵素開裂
のいずれかにより終結する。５’−ＡＭＰは不活性代謝生成物である。ｃＡＭＰ
および５’−ＡＭＰの構造は後に例証する。

【０００２】

【化１３】

【０００３】ヒトの骨髄系およびリンパ系細胞における高レベルｃＡＭＰは細胞活性化抑制
に関連している。それゆえＰＤＥｓの細胞内酵素系統群は細胞内のｃＡＭＰのレ
ベルを調整する。ＰＤＥ４はこれらの細胞の中において優勢なＰＤＥアイソタイ
プであり、ｃＡＭＰ分解に大きく寄与している。したがって、ＰＤＥ機能を阻害
することにより、ｃＡＭＰが不活性代謝生成物５’−ＡＭＰに転換されるのを阻
害するとともに、その結果、高ｃＡＭＰレベルを維持し、それにより、細胞活性
化を抑圧することになるだろう（Ｂｅａｖｏら，”ＣｙｃｌｉｃＮｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅＰｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，
ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄＤｒｕｇＡｃｔｉｏｎ，”Ｗｉｌｅｙａ
ｎｄＳｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ｐｐ．３−１４，（１９９０
））；Ｔｏｒｐｈｙら，ＤｒｕｇＮｅｗｓａｎｄＰｅｒｓｐｅｃ
ｔｉｖｅｓ，６，ｐｐ．２０３−２１４（１９９３）；Ｇｉｅｍｂ
ｙｃｚら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２２，ｐｐ．３
３７−３４４（１９９２）を参照）。

【０００４】特に、ロリプラムのようなＰＤＥ４阻害剤は、ＴＮＦαの生成を阻害し、部分
的に単球によるＩＬ−１β放出を阻害することが証明されている。（Ｓｅｍｍｌ
ｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１５，ｐｐ
．４０９−４１３，（１９９３）；Ｍｏｌｎａｒ−Ｋｉｍｂｅｒら，
Ｍｅｄｉ− ａｔｏｒｓｏｆＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，１，ｐｐ．
４１１−４１７，（１９９２）を参照）。ＰＤＥ４阻害剤はまた、ヒト多形核白血球から過酸化物遊離基が生成されるのを
阻害すること（Ｖｅｒｇｈｅｓｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉ
ｏ．，２１（Ｓｕｐｐｌ．２），Ｓ６１（１９８９）；Ｎｉｅｌ
ｓｏｎら，Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＩｍｍｕｎｏｌ．，８６，ｐｐ．
８０１８０８，（１９９０）を参照）、ヒト好塩基球からの血管作動性アミン
およびプロスタノイドの放出を阻害すること（Ｐｅａｃｈｅｌｌら，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１４８，ｐｐ．２５０３−２５１０，（１９９２）を
参照）、好塩球における呼吸性バーストを阻害すること（Ｄｅｎｔら，Ｊ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０３，ｐｐ．１３３９−１３４６，（１９
９１）を参照）、さらにヒトＴリンパ球の活性化を阻害する（Ｒｏｂｉｃｓｅｋ
ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４２，ｐｐ．８６９−８
７７，（１９９１）を参照）ことが証明されている。

【０００５】炎症細胞の活性化および過剰または無秩序性サイトカイン（たとえばＴＮＦα
およびＩＬ−１β）生成は、関節リウマチ、変形性関節炎、通風性関節炎、脊
椎炎、甲状腺関連眼障害、ベーチェット病、敗血症、敗血症ショック、内毒素シ
ョック、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、毒素ショック症候群、喘息、慢
性気管支炎、成人呼吸困難症候群のようなアレルギー性、自己免疫性、炎症性疾
患および障害、慢性閉塞性肺疾患、珪肺症、肺性多臓器肉芽腫性疾患のような慢
性肺炎症疾患、心筋・脳・四肢再灌流傷害、繊維症、嚢胞性線維症、ケロイド形
成、瘢痕形成、アテローム性動脈硬化症、移植片対宿主および同時移植拒絶反応
のような移植拒絶反応疾患、慢性糸球体腎炎、狼瘡、クローン病および潰瘍性大
腸炎のような炎症性腸疾患、白血病のような増殖性リンパ球疾患、アトピー性皮
膚炎、乾癬、蕁麻疹のような皮膚疾患等のアレルギー性、自己免疫性、炎症性疾
患にかかわりがある。

【０００６】高サイトカインレベルにより特徴づけられるその他の状態としては、中程度外
傷による脳障害（Ｄｈｉｌｌｏｎら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１２
，ｐｐ．１０３５−１０４３（１９９５）；Ｓｕｔｔｏｒｐら，Ｊ
．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９１，ｐｐ．１４２１−１４２８（
１９９３）を参照）、うっ血性心不全のような心筋症（Ｂｒｉｓｔｏｗら，Ｃ
ｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９７，ｐｐ．１３４０−１３４１（１９９８）
を参照）、悪液質、感染または悪性度に派生する悪液質、後天性免疫不全症候群
（エイズ）、ＡＲＣ（エイズ関連性複合体）、感染による発熱性筋肉痛、脳性マ
ラリア、骨粗鬆症および骨吸収疾患、ケロイド形成、瘢痕形成、発熱がある。

【０００７】特にＴＮＦαは、ヒト後天性免疫不全症候群（エイズ）に対して作用すること
が明らかになっている。エイズはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によるＴリン
パ球の感染から起こる。ＨＩＶも感染し、骨髄系細胞内に維持されるが、ＴＮＦ
はＴリンパ球および単球細胞内においてＨＩＶ感染を上方制御することが証明さ
れている（Ｐｏｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８７，ｐｐ．７８２−７８５，（１９９０）を参照）．コラゲナーゼ刺激、ｉｎｖｉｖｏにおける血管形成刺激、骨吸収刺激、内皮
への腫瘍細胞の付着を高める能力などのＴＮＦαのいくつかの特性は、宿主にお
ける癌の進行および転位性拡散におけるＴＮＦのための役割に一致している。Ｔ
ＮＦαは最近、腫瘍細胞の増殖および転位の促進に直接関連していることが明ら
かになった（Ｏｒｏｓｚら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７，ｐｐ．１３９１−１３９８，（１９９３）を参照）。

【０００８】ＰＤＥ４は広く組織分布を有している。ＰＤＥ４には少なくとも４つの遺伝子
が存在し、そのいずれかの遺伝子から多数の転写によりさまざまな蛋白質を産生
し、これらの蛋白質は同じ触媒作用部位を分担する。４つの考え得る触媒作用部
位の中でアミノ酸主体性が８５％以上である。それらの阻害に対する共同感受性
およびそれらの動態学的類似性はこのレベルのアミノ酸主体性の機能的側面を反
映している。これらの二者択一的に発現されるＰＤＥ４蛋白質により、細胞が特
異的にこれらの酵素を細胞内に分散させることができる、および／または翻訳修
飾後を経て触媒効率を調整することができると理論上想定されている。ＰＤＥ４
酵素を発現するどの細胞タイプも、これらの蛋白質をコード化する４つの可能性
遺伝子を１つ以上発現する。

【０００９】ＰＤＥ４阻害剤を抗炎症剤として使用することに大きな利益があることが研究
で証明されている。初期に行われた証明で、ＰＤＥ４阻害剤が、単球、マクロフ
ァージ、Ｔｈ−１系統のＴ細胞、顆粒球のような多種の炎症細胞に対して有利な
効果があることが示されている。サイトカイン、脂質介在物質、過酸化物のよう
な多くの炎症誘発性介在物質、およびヒスタミンのような生体アミンの合成およ
び／または放出はこれらの細胞内においてＰＤＥ４阻害剤の作用により弱められ
た。ＰＤＥ４阻害剤はまた、化学毒性物質に応じたＴ細胞増殖、顆粒球遊出、内
皮細胞接合部の脈管構造への統合性を含むその他の細胞機能に影響を及ぼす。

【００１０】種々のＰＤＥ４阻害剤の設計、合成、スクリーニングが報告されている。カフ
ェイン、テオフィリンのようなメチルキサンチンは最初に発見されたＰＤＥ阻害
剤であったが、これらの化合物はどのＰＤＥが阻害されるかについては非選択的
である。抗うつ剤である薬剤ロリプラムは最初に報告された特異的ＰＤＥ４阻害
剤の一つであった。ロリプラムは下記のような構造式を持っており、組換え型ヒ
トＰＤＥ４の阻害については、約２００ｎＭ（ナノモル）の５０％阻害濃度（Ｉ
Ｃ₅₀）が報告されている。

【００１１】

【化１４】

【００１２】ロリプラムよりも低いＩＣ₅₀を有し、むかつき、吐き気、鎮静のような、ロリ
プラムの投与に関連する好ましくない中枢神経系（ＣＮＳ）の副作用を回避でき
る、ＰＤＥ４を阻害するためのより選択的なＰＤＥ４阻害剤を研究が続けられた
。化合物の１つの分類がＦｅｌｄｍａｎら、米国特許第５６６５７５４号におい
て発表された。ここで明らかにされている化合物はロリプラムと類似の構造を有
する置換されたピロリジンである。特に以下の構造式を有する一つの化合物は、
ヒト組換え型ＰＤＥ４に対して約２ｎＭのＩＣ₅₀を有する。嘔吐の副作用がない
ことが観察されている限りにおいて、これらの化合物は望ましくないＣＮＳ副作
用における低下を示さなかった。

【００１３】

【化１５】

【００１４】さらに数社が現在その他のＰＤＥ４阻害剤の臨床治験を行っている。しかし、
嘔吐、中枢神経系障害などの副作用および有効性に関する問題は未解決である。

【００１５】したがって、選択的にＰＤＥ４を阻害し、先のＰＤＥ４阻害剤に関連した不利
なＣＮＳ副作用を低下させるまたは除去する化合物は、アレルギー疾患および炎
症性疾患、およびＴＮＦのような過剰または無秩序なサイトカインの生成に関連
するその他の疾患の治療に有効であろう。さらに、選択的ＰＤＥ４阻害剤は、特
定の標的組織における高ｃＡＭＰレベルまたはＰＤＥ４機能に関連した疾患の治
療に有効となるであろう。（発明の開示）本発明はＰＤＥ４活性の阻害が有益であると考えられる疾患および状態の治療
に有効な効能のある選択的ＰＤＥ４阻害剤を対象とする。このＰＤＥ４阻害剤は
、以前のＰＤＥ４阻害剤で生じたＣＮＳ副作用を予想外に低下または除去するも
のである。

【００１６】特に本発明は構造式（Ｉ）または（II）を有するピロール化合物を対象とする
。

【００１７】

【化１６】

【００１８】ここで、Ｒ¹は任意に置換されたアリール、アルキル、シクロアルキル、ヘテロアルキル
、アルカリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロアルカリールから成る
群から選択される、Ｒ²はアルキルまたは水素、Ｒ³はアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アリール、
ヘテロアリール、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ）
アルキル、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁵Ｒ⁶、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、ＣＯ₂Ｈ、
ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、ニトロ、ハロ、アルキルチオ、ＳＯ₂（アルキル）、Ｓ
Ｏ₃Ｈ、ハロアルキルから成る群から選択される、Ｒ⁴およびＲ⁵、それぞれ独立して、水素またはアルキル、またはＲ⁵またはＲ⁶ は共に５−または６−員炭素環式または複素環式環である、ｎは０〜３である。

【００１９】本発明はまた、構造式（Ｉ）または（II）の一つまたは複数を含む薬剤組成物
、疾患または症候群の治療における化合物および化合物を含む組成物の使用、さ
らに構造式（Ｉ）および（II）の化合物、この化合物の合成にかかわる中間体の
調製方法を対象とする。（好ましい実施形態の詳細な説明）本発明は構造式（Ｉ）または（II）を有する化合物を対象とする。

【００２０】

【化１７】

【００２１】

【化１８】

【００２２】ここで、Ｒ¹は、任意に置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリ
ール、アルカリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、ヘテロアルカリールから
成る群から選択される、Ｒ²はアルキルまたは水素、Ｒ³はアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アリール、
ヘテロアリール、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ）
アルキル、ＮＲ₄Ｒ⁵、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ５Ｒ６、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、ＣＯ₂Ｈ
、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、ニトロ、ハロ、アルキルチオ、ＳＯ₂（アルキル）、
ＳＯ₃Ｈ、ハロアルキルから成る群から選択される、Ｒ⁴およびＲ⁵、それぞれ独立して、水素またはアルキル、またはＲ⁵またはＲ⁶ は共に５−または６−員炭素環式または複素環式環である、ｎは０〜３である。

【００２３】本文で使用しているような、単独または組み合わされた「アルキル」と言う用
語は、炭素原子を１〜１６個含む、直鎖、分岐鎖および架橋された飽和炭化水素
基を含むと定義されている。用語「低級アルキル」は本文では、炭素原子を１〜
６（Ｃ₁−Ｃ₆）個有するアルキル基として定義されている。低級アルキル基の例
としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブ
チル、ネオペンチル、−ヘキシル等があるが、これらに限定されない。

【００２４】用語「架橋されたアルキル」は本文では、Ｃ₆−Ｃ₁₆二環式または多環式炭化
水素基、たとえば、ノルボリル、アダマンチル、ビシクロ［２．２．２］−オク
チル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［３．２．１］オクチルまた
はデカヒドロナフチルとして定義されている。

【００２５】用語「シクロアルキル」は本文では、環状Ｃ₃−Ｃ₇炭化水素基を含むと定義さ
れている。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シ
クロヘキシル、シクロペンチルがあるが、これらに限定されない。

【００２６】用語「ハロアルキル」は本文では、フルオロ、クロロ、ブロモ、イオドまたは
それらの組み合わせのいずれかの、一つまたは複数のハロ置換基で置換されたア
ルキル基として定義されている。同様に、「ハロシクロアルキル」は一つまたは
複数のハロ置換基を有するシクロアルキル基として定義されている。

【００２７】単独または組み合わされた「アリール」という用語は本文では、単環式または
多環式芳香基、好ましくは単環式または二環式芳香基、フェニルまたはナフチル
として定義されていて、これらは置換されていなくても、また、たとえば、ハロ
、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキ
ル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキル
チオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルから選択される一つまたは複
数の、特に１〜３個の置換基により置換されてもよい。代表的なアリール基には
、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、２−クロロフェニル、３−クロ
ロフェニル、４−クロロフェニル、２−メチルフェニル、４−メトキシフェニル
、３−トリフルオロメチル−フェニル、４−ニトロフェニル、等がある。

【００２８】用語「ヘテロアリール」は本文では、一つまたは二つの芳香環を含み、かつ少
なくとも一つの窒素、酸素、または硫黄原子を芳香環内に含む単環式または二環
式環状系として定義され、置換されていてもよく、あるいは、たとえば、ハロ、
アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル
、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチ
オ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルのような置換基により一つまた
は複数、特に１〜３個置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例としては、
チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、イソキノリル、インド
リル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、イミジゾリル、ベンゾ
チアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、チアジアゾリルがある。

【００２９】用語「アラルキル」は本文では、先で定義したアルキル基で定義され、ここで
は、水素原子の一つが本文で定義されているようなアリール基、たとえば、ハロ
、アルキル、アルコキシ等のような置換基を一つまたは複数任意に有するフェニ
ル基により置換されている。アラルキル基の一例はベンジル基である。

【００３０】用語「アルカリール」は本文では、先で定義したアリール基で定義され、ここ
では、水素原子の一つがアルキル基、シクロアルキル基、ハロアルキル基または
ハロシクロアルキル基により置換されている。

【００３１】用語「ヘテロアラルキル」および「ヘテロアルカリール」は用語「アラルキル
」および「アルカリール」と同様に定義されているが、アリール基は先に定義し
たようにヘテロアリール基により置換されている。

【００３２】用語「複素環」または「複素環式環」は、環内に存在する酸素、窒素、硫黄か
ら選択される一つまたは複数のヘテロ原子を有する５−または６−員非芳香族環
をとして定義されている。非限定例としては、テトラヒドロフラン、ピペリジン
、ピペラジン、スルホラン、モルホリン、テトラヒドロピラン、ジオキサン等が
含まれる。「炭素環式環」は同様に定義されるが、環は炭素原子だけを含む。

【００３３】用語「ハロゲン」または「ハロ」は本文では、フルオリン、クロリン、ブロミ
ン、イオジンを含むものとして定義されている。

【００３４】用語「アルコキシ」、「アリールオキシ」、「アラルコキシ」は−ＯＲとして
定義されており、ここでＲはそれぞれアルキル、アリール、アラルキルである。

【００３５】用語「アルコキシアルキル」は、アルキル基に付加されたアルコキシ基として
定義されている。用語「アリールオキシアルキル」および「アラルコキシアルキ
ル」は、アルキル基に付加されたアリールオキシ基またはアラルコキシ基として
同様に定義されている。

【００３６】用語「ヒドロキシ」は−ＯＨとして定義されている。

【００３７】用語「ヒドロキシアルキル」はアルキル基に付加されたヒドロキシ基として定
義されている。

【００３８】用語「アミノ」は−ＮＨ₂として定義されている。

【００３９】用語「アルキルアミノ」は−ＮＲ₂として定義されており、ここで少なくとも
一つのＲはアルキル基、第２のＲはアルキル基または水素である。

【００４０】用語「アシルアミノ」はＲＣ（＝Ｏ）ＮＨとして定義されており、ここでＲは
アルキル基またはアリール基である。

【００４１】用語「ニトロ」は−ＮＯ₂として定義されている。

【００４２】用語「アルキルチオ」は−ＳＲとして定義されており、ここでＲはアルキル基
である。

【００４３】用語「アルキルスルフィニル」はＲ−Ｓ（Ｏ）₂として定義されており、ここ
でＲはアルキル基である。

【００４４】用語「アルキルスルホニル」はＲ−Ｓ（Ｏ₃）として定義されており、ここで
Ｒはアルキル基である。

【００４５】好ましい実施態様において、Ｒ¹は、アリール、ヘテロアリール、アルカリー
ル、アラルキルおよびシクロアルキルから成る群より選択され、Ｒ²は、水素お
よび低級アルキルから成る群より選択される。

【００４６】もっとも好ましい実施態様において、Ｒ¹はアリール、ヘテロアリール、シク
ロアルキル、またはアラルキルであり、これらは、ＮＲ₄Ｒ₅、ハロ、アルキル、
Ｃ（＝Ｏ）アルキル、（ＳＯ₂）アルキル、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁴Ｒ⁵、ＳＯ₃Ｈ、ＮＯ ₂ 、ＣＯ₂Ｈ、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキルおよびトリフルオロメチルで一つまたは複数
任意に置換されてもよい。Ｒ²は水素またはＣ_1-2アルキルであり、Ｒ³は水素で
ある。Ｒ¹は通常はフェニルまたはピリジルであり任意に置換されていてもよく
、Ｒ²は水素またはエチルである。

【００４７】本発明は、構造式（Ｉ）および（II）の化合物のすべての可能な立体異性体、
幾何学異性体を含み、ラセミ化合物だけでなく光学的に活性な異性体も同様に含
む。構造式（Ｉ）および（II）の化合物が鏡像異性体として望ましいとき、最終
生成物の分離または、各々の異性体として純粋な出発物質からの立体異性体合成
またはキラル補助試薬の使用のいずれかにより得られても良い。たとえばＺ．Ｍ
ａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ，８（６），
ｐａｇｅｓ８８３−８８８（１９９７）を参照のこと。最終生成物の中間体
、または出発物質の分離は当業者に公知の適切な方法で達成されても良い。さら
に、構造式（Ｉ）および（II）の化合物の互変異性体が可能な状況においては、
本発明は化合物のすべての互変異性体を含むことを予定する。下記に証明されて
いるように、特定の立体異性体は、通常ＰＤＥ４阻害剤によるＣＮＳ副作用を起
こすことなく、ＰＤＥ４を阻害する特別な能力を示す。

【００４８】酸性成分を含む構造式（Ｉ）および（II）の化合物は、適切なカチオンと共に
、薬学上受容可能な塩を形成しても良い。薬学上受容可能なカチオンとしては、
アルカリ金属（たとえばナトリウムまたはカリウム）、およびアルカリ土類金属
（たとえばカルシウムまたはマグネシウム）カチオンがある。塩基性中心を含む
構造式（Ｉ）および（II）の化合物の薬学上受容可能な塩は、薬学上受容可能な
酸と共に形成された酸性付加塩である。例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫
酸塩または重硫酸塩、燐酸塩、またはリン酸水素塩、酢酸塩、安息香酸塩、琥珀
酸塩、フマル酸塩、マレイ酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩
、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩があ
る。上記を考慮して、本文に記載されている本発明の化合物に対するすべての言
及は、薬学上受容可能な塩およびそれの溶媒化合物と同様に、構造式（Ｉ）およ
び（II）の化合物を含むものとする。

【００４９】本発明の化合物は適切な化学薬品として治療用に投与されてもよいが、構造式
（Ｉ）および（II）の化合物を製剤組成物または製剤処方として投与するのが好
ましい。したがって、本発明はさらに、一つまたは複数の製剤上受容可能な担体
および任意のその他の治療上および／または病気予防のための成分とともに、構
造式（Ｉ）および（II）の化合物を含む製剤処方、または薬学上受容可能なそれ
の塩を提供する。担体は、処方の他の成分と相容れると言う意味で「受容可能」
であり、その受容者にとって有害ではない。

【００５０】特に本発明の選択的ＰＤＥ４阻害剤は、単独でまたは第２の抗炎症治療薬、た
とえば関節リューマチを治療するために有効なＥＮＢＲＥＬまたはＲＥＭＩＣＡ
ＤＥのような、ＴＮＦαを目標とする治療薬との組み合わせにおいて有効である
。同様に、ＩＬ−１拮抗作用の治療有効性もまた関節リューマチの動物モデルで
証明されている。このように、ＴＮＦαを弱めるＰＤＥ４阻害剤との組み合わせ
によるＩＬ−１拮抗作用は有効であることが想像される。

【００５１】本ＰＤＥ４阻害剤は種々のアレルギー性、自己免疫性、炎症性疾患の治療に有
効である。

【００５２】用語「治療」とは、取り扱われる状態または症状の過激な進行を予防する、低
下させる、止める、または元に戻すことを含む。このように、用語「治療」は適
切な医学的治療および／または予防投与のいずれをも含む。

【００５３】特に、炎症は、組織の損傷または破壊により誘発される局所的な保護反応であ
り、有害な作用剤および損傷を受けた組織のどちらをも破壊、滅殺する、または
隔てる（たとえば隔離する）のに役立つ。本文で使用されているような用語「炎
症性疾患」は、過剰または無秩序炎症反応が過剰炎症症状、宿主組織損傷、また
は組織機能の喪失に至るあらゆる疾患を意味する。さらに、本文で使用されてい
るような用語「自己免疫疾患」とは、組織損傷が、身体自体の構成要素への体液
性または細胞媒介反応と関連しているあらゆる疾患群を意味する。本文で使用さ
れているような用語「アレルギー性疾患」は、アレルギーに起因するあらゆる症
状、組織損傷または組織機能の喪失を意味する。本文で使用されているような用
語「関節疾患」とは、さまざまな原因に帰すことができる炎症性関節障害により
特徴づけられる広い範囲のあらゆる疾患を意味する。本文で使用されているよう
な用語「皮膚疾患」とは、さまざまな原因に帰すことができる広い範囲のあらゆ
る皮膚の炎症により特徴づけられる広い範囲のあらゆる皮膚疾患を意味する。本
文で使用されているような用語「移植拒絶反応」とは、移植されたおよび周囲の
組織の機能喪失、痛み、腫脹、白血球増加、血小板減少により特徴づけられる、
移植された組織（器官および細胞（たとえば骨髄）を含む）に対して向けられた
あらゆる免疫反応を意味する。

【００５４】本発明はまた、哺乳類におけるｃＡＭＰレベル調整方法、ならびに高サイトカ
インレベルにより特徴づけられる疾患の治療方法も提供する。

【００５５】本文で使用されているような用語「サイトカイン」とは、他の細胞の機能に影
響を与え、免疫または炎症反応における細胞間の相互作用を調製するあらゆる分
泌されたポリペプチドを意味する。サイトカインは、どの細胞がそれを生成する
かにかかわらず、モノカイン、リンフォカイン、ケモカインを含むが、これらに
限定されない。たとえば、モノカインは一般に単球で生成され分泌されると見な
されているが、ナチュラルキラー細胞、繊維芽細胞、好塩基球、好中球、内皮細
胞、脳星状細胞、骨髄ストロマ細胞、外皮ケラチン生成細胞、Ｂ−リンパ球など
のその他の多くの細胞がモノカインを生成する。リンフォカインは一般にリンパ
球細胞で生成されると見なされている。サイトカインの例としては、インターロ
イキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、腫瘍壊死因子ア
ルファ（ＴＮＦα）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦβ）があるが、これらに限定
されない。

【００５６】本発明はさらに哺乳類におけるＴＮＦレベルを減少させる方法も提供し、この
方法は哺乳類に構造式（II）の化合物の有効量を投与することから構成されてい
る。本文で使用されているような用語「ＴＮＦレベルを減少させる」とは、以下
のいずれかを意味する。

【００５７】ａ）哺乳類のｉｎｖｉｖｏでの過剰ＴＮＦレベルを、単球またはマクロファ
ージ等の、しかしこれらに限定されないすべての細胞によるＴＮＦのｉｎｖｉ
ｖｏでの放出を阻害することにより、正常レベルまたは正常レベル以下まで低下
させる、またはｂ）哺乳類の遺伝情報翻訳または転写レベルでの、ｉｎｖｉｖｏでのＴＮＦ
レベルの過剰を下方制御して正常レベルまたは正常レベル以下にする、またはｃ）翻訳後現象としてＴＮＦ直接合成を阻害することで下方制御を誘導する。

【００５８】さらに本発明の化合物は炎症細胞の活性化を抑制するのに有益である。本文で
使用されているような用語「炎症細胞の活性化」とは、増殖細胞反応の刺激物質
（サイトカイン、抗原または自己抗体を含むが、これらに限定されない）による
誘導、可溶性介在物質（サイトカイン、活性酸素、酵素、プロスタノイド、また
は血管作動性アミンを含むが、これらに限定されない）の生成、または炎症細胞
（単球、マクロファージ、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、顆粒球、多核白血球、マス
ト細胞、好塩基球、好酸球、樹状細胞、内皮細胞を含むが、これらに限定されな
い）における新規のまたは増加した介在物質（主要組織適合性抗原または細胞付
着分子を含むが、これらに限定されない）の細胞表面発現を意味する。これらの
細胞におけるこれらの表現型の一つまたは組み合わせの活性化が、炎症状態の開
始、永続化、または増悪に寄与しうることが当業者により認識されるであろう。

【００５９】本発明の化合物はまた気道平滑筋の弛緩、気管支拡張を起こすこと、および気
管支収縮を防止することにおいて有効である。

【００６０】したがって本発明の化合物は、（関節リューマチのような）関節疾患、骨関節
炎、通風性関節炎、脊椎炎、甲状腺関連眼障害、ベーチェット病、敗血症、敗血
症ショック、内毒素ショック、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、毒素ショ
ック症候群、喘息、慢性気管支炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、成
人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、（慢性閉塞性肺疾患のような）慢性肺炎症疾患
、珪肺症、肺性多臓器肉芽腫性疾患、心筋・脳・四肢再灌流障害、微量外傷によ
る脳または脊髄損傷、嚢胞性線維症を含む繊維症、ケロイド形成、瘢痕形成、ア
テローム性動脈硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および移植拒絶反応
障害（たとえば移植片対宿主（ＧｖＨ）拒絶および移植片拒絶）のような自己免
疫性疾患、慢性糸球体腎炎、クローン病および潰瘍性大腸炎のような炎症性腸疾
患、白血病（たとえば慢性リンパ性白血病、ＣＬＬ）のような増殖性リンパ球疾
患（Ｍｅｎｔｚら．，Ｂｌｏｏｄ８８，ｐｐ．２１７２−２１８２
（１９９６）を参照）、アトピー性皮膚炎、乾癬、蕁麻疹のような皮膚疾患のよ
うな病気の治療に有効である。

【００６１】このような疾患および関連する状態のその他の例としては、うっ血性心不全の
ような心筋症、発熱、悪液質、感染または悪性度に派生する悪液質、後天性免疫
不全症候群（エイズ）に派生する悪液質、ＡＲＣ（エイズ関連性複合体）、脳性
マラリア、骨粗鬆症および骨吸収疾患、感染による発熱性筋肉痛がある。さらに
本発明の化合物は、尿崩症および、うつ病および脳血管性痴呆のような中枢神経
系障害の治療に有効である。

【００６２】本発明の化合物はまた通常治療として既知であるもの以外でも有益である。た
とえば本化合物は器官移植組織保存剤としても機能しうる（Ｐｉｎｓｋｙら，
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９２，ｐｐ．２９９４−３００２
（１９９３）を参照）。

【００６３】選択的ＰＤＥ４阻害剤はまた尿崩症（ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．，３７，ｐ
．３６２，（１９９０）；ＫｉｄｎｅｙＩｎｔ．，３５，ｐ．
４９４，（１９８９））、脳血管性痴呆（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｐｓｙｃｈ
ｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１０１，ｐ．１４７（１９９０））中枢
神経系障害、うつ病（Ｅｃｋｍａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．，
４３，ｐ．２９１（１９８８））、不安およびストレス反応（Ｎｅｕｒ
ｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３８，ｐ．１８３１（１９９１））、脳
虚血（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２７２，ｐ．１０７（
１９９５））、遅発性ジスキネジア（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍｏｃｏｌ．
，１６，ｐ．３０４（１９７６））、パーキンソン病（Ｎｅｕｒｏｌｏ
ｇｙ，２５，ｐ．７２２（１９７５）；Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐ
ｈａｒｍａｃｏｌ，Ｐｈｙｓｉｏ．，２６，ｐ．４２１（１９９９）
を参照）、月経前症候群の治療にも有効でありうる。うつ病に対して、ＰＤＥ４
選択的阻害剤は、「行動性絶望」または「ポルソルトテスト」（Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，４７，ｐ．３７９（１９７８）；Ｅｕｒ
．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５７，ｐ．４３１（１９７９）；
Ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔｓ：ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ，ｂｅ
ｈａｖｉｏｒａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，
Ｅｎｎａ，Ｍａｌｉｃｋ，ａｎｄＲｉｃｈｅｌｓｏｎ，ｅｄｓ．，Ｒ
ａｖｅｎＰｒｅｓｓ，ｐ．１２１（１９８１））および「尾部懸吊テス
ト」（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８５，ｐ．３６７（１
９８５））のような種々の動物うつ病モデルにおいて有効性を示した。最近の研
究結果では、種々の抗うつ剤による長期ｉｎｖｉｖｏ治療によりＰＤＥ４の脳
由来発現が増加することが示された（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９
，ｐ．６１０（１９９９））。したがって、選択的ＰＤＥ４阻害剤は、抗
うつ剤の４大分類、すなわち電撃方法、モノアミン酸化酵素阻害剤、セロトニン
またはノルエピネフリンの選択的再取り込み阻害剤に対する治療において、単独
でまたは二次的治療薬との組み合わせて使用することが可能である。選択的ＰＤ
Ｅ４阻害剤はまた、喘息の治療のための気管支平滑筋に対する直接作用によって
気管支拡張性活動を調整する応用においても有効であり得る。

【００６４】本発明における使用に適切な化合物および製剤組成物は、活性成分が、その意
図された目的を達成するための有効量で投与されるような成分である。より明確
には、「治療上有効量」は、治療を受けている患者の現在の症状の進行を予防す
るまたは緩和するために有効な量を意味する。有効量の決定は、本文で提供され
ている詳細な明細の観点からすれば、当業者の能力の範囲内で十分である。

【００６５】「治療上有効用量」は、望ましい効果を達成するに至る化合物の量である。こ
のような化合物の毒性および治療有効性は、たとえばＬＤ₅₀（人口の５０％に対
して致命的用量）およびＥＤ₅₀（人口の５０％において治療上有効な用量）を決
定するための細胞培養または実験動物における標準調剤方法により決定されても
良い。毒性および治療有効性の間の用量比率は治療係数であり、ＬＤ₅₀およびＥ
Ｄ₅₀の間の比率として表現される。高治療指数を示す化合物が好ましい。このよ
うなデータから得られたデータはヒトへの使用のために用量範囲を公式化するた
めに使用されてもよい。このような化合物の投薬量は、ほんの僅かな毒性または
まったく毒性が無いＥＤ₅₀を含めて考えられた循環濃度の範囲内に入る。投薬量
は使用適量、および投与経路によりこの範囲内で変動する。

【００６６】正確な処方、投与経路、投薬量は患者の状態を考慮して、個々の医師が選択し
てもよい。投薬量および投薬間隔は、治療効果を維持するために十分な活性成分
の血漿レベルを供給するために個々に調節してもよい。

【００６７】当業者に認識されているように、本文で言及した治療とは、確定した疾患また
は症状の治療と同様に、予防法にも及ぶ。さらに治療での使用に要求される本発
明の化合物の量は、治療条件、患者の年齢及び状態により変動し、究極的には付
き添いの医師または獣医により決定されるものとする。しかし一般に、ヒトの成
人の治療に用いる用量は通常一日当たり０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／
ｋｇである。望ましい用量は、一回量でまたは適切な間隔で、たとえば一日当た
り２回、３回、４回またはそれ以上複数回投与されてもよい。実際には、医師は
個々の患者にもっとも合った現在の投薬法を決定し、投薬量は年齢、体重、個々
の患者の反応により変化する。上記の投薬量は平均的な場合の規範例であるが、
より多くのまたはより少ない投薬量がふさわしい個々の事例があり、そのような
事例も本発明の範囲内に入る。

【００６８】本発明の製剤は明らかになった疾患の治療に対して、経口、非経口、経粘膜（
たとえば、舌下または頬側投与）、局所投与、経皮投与、直腸投与、吸入（たと
えば、経鼻または深肺吸入）のような標準的な方法で投与されてもよい。非経口
投与には、静脈内、動脈内、腹膜内、皮下内、筋肉内、髄腔内、関節内があるが
、これらに限定されない。非経口投与はまた、ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（商標）の
ような高圧技術を用いて行われても良い。

【００６９】頬側投与については、組成物は従来の方法で処方される錠剤またはひし形の形
態であってもよい。たとえば、経口投与用の錠剤およびカプセルは結合剤（たと
えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビット、トラガカントゴム、スター
チまたはポリビニルピロリドンの粘液）、充填剤（たとえばラクトース、砂糖、
微晶質、セルロース、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウムまたはソルビット）
、滑剤（たとえば、マグネシウム、ステアリン酸塩、ステアリン酸、滑石、ポリ
エチレングリコール、またはシリカ）、錠剤分解物質（たとえば、サツマイモ澱
粉または澱粉グリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（たとえば、ラウリル硫
酸ナトリウム）のような従来の賦形剤を含んでいても良い。錠剤は当業者に公知
の方法によってコーティングされていてもよい。

【００７０】あるいは、本発明の化合物は、たとえば水性または油性懸濁液、溶液、乳液、
シロップ、またはエリキシル剤のような経口液体製剤に組み込まれていても良い
。さらに、これらの化合物を含む剤形が、使用前に水またはその他の適切な媒介
物と共に構成されるために乾燥製品であってもよい。そのような液体製剤は、ソ
ルビットシロップ、メチルセルロース、グルコース／砂糖シロップ、ゼラチン、
ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、バルボキ
シメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、水素添加食用脂肪のよう
な懸濁剤、レシチン、ソルビタンモノオレイン酸またはアカシアのような乳剤、
アーモンドオイル、細分化ココナッツオイル、油性エステル、プロピレングリコ
ール、エチルアルコールのような非水性媒介物、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル
またはプロピル、ソルビン酸のような防腐剤などの従来の添加剤を含んでいても
良い。

【００７１】そのような製剤はまた、たとえば、ココナッツバターまたはその他のグリセリ
ドのような従来の座薬基剤を含む座薬として処方されても良い。吸入組成物は通
常、乾燥粉末として投与されてもよい溶液、懸濁液または乳液の形態で、または
ジクロロジフルオロメタンまたはトリクロロフルオロメタンのような従来の噴霧
剤を用いたエアゾールの形態で提供されても良い。通常の局所および経皮処方に
は、点眼、クリーム、軟膏、ローション、ペーストのような従来の水性または非
水性媒介物を含む、または薬用膏剤、膏薬、薄膜の形態である。

【００７２】さらに本発明の組成物は、注射または連続点滴による非経口投与のために処方
されても良い。注射用の処方は、油性または水性媒介物中の懸濁液、溶液、また
は乳液の形態であっても良く、また懸濁剤、安定剤、および／または分散剤のよ
うな調剤を含んでいても良い。または活性成分は、使用前に、適切な媒介物（た
とえば無菌の、発熱物質を含まない水分）との構成のための粉末形態であっても
よい。

【００７３】本発明による組成物はまた、持効性製剤として処方されても良い。そのような
長期作用処方は、埋めこみ（たとえば、皮下または筋肉内投与）、または筋肉内
注射により投与されてもよい。したがって、本発明の化合物は適切な重合体また
は疎水性材料（たとえば、受容可能なオイル中の乳剤）、イオン交換樹脂、また
は節約可溶性誘導体（たとえ節約可溶性塩）により製剤されてもよい。

【００７４】獣医学用途では、式（Ｉ）または（II）の化合物、またはその非毒性塩が、通
常の獣医学慣例に一致した適切な、受容可能な処方により投与される。獣医は、
個々の動物にもっとも適切である投薬法および投与方法を容易に決めることがで
きる。

【００７５】このように本発明は、もう一つの面において、製薬上受容可能な希釈剤または
担体とともに式（Ｉ）または（II）の化合物からなる製剤組成物を提供する。本
発明によりさらに、式（Ｉ）または（II）の化合物を含む製剤組成物の調製方法
が提供され、この方法には、式（Ｉ）または（II）の化合物を製薬上受容可能な
希釈剤または担体と混合する工程が含まれる。

【００７６】構造式（Ｉ）または（II）の化合物の特殊な、非制限例が下記に示されており
、その合成は下記に明らかにされている手順に従って行われる。

【００７７】一般に、構造式（Ｉ）または（II）の化合物は以下の合成概要に従って調製さ
れてもよい。下記に記載された概要において、合成化学の一般原理に従って必要
であるならば、保護基が使用されてもよいことが当業者には明白であろう。これ
らの保護基は、当業者には容易に分かるように塩基性、酸性、または加水分解条
件下の合成最終段階で取り除かれる。適切な取扱いおよびあらゆる化学機能性の
保護を用いることで、本文で特に明らかにされていない構造式（Ｉ）または（II
）の化合物の合成は下記に示されている概略に類似の方法で行われても良い。

【００７８】他の指示がなければ、すべての出発物質は市販品を用い、それ以上精製するこ
となく使用した。すべての反応物およびクロマトグラフィーフラクションは、Ｕ
Ｖ（紫外線）光およびＩ₂（ヨウ素）染色により明視化された２５０−ｍｍシリ
カゲルプレート上薄層クロマトグラフィーにより分析を行った。フラッシュカラ
ムクロマトグラフィーは、Ｂｉｏｔａｇｅ４０Ｍシリカゲル（２３０−４００
メッシュ）を用いて実施した。生成物および中間体はフラッシュクロマトグラフ
ィーまたは逆相ＨＰＬＣにより精製を行った。

【００７９】下記に例証するように、一般構造式（Ｉ）化合物は、式

【００８０】

【化１９】

【００８１】を有する化合物を、カルバニオンを生成するために金属ナトリウムと反応させ、
次いでカルバニオンを以下の式、

【００８２】

【化２０】

【００８３】（式中、Ｈａｌはハロ、通常は臭素であり、以下の式

【００８４】

【化２１】

【００８５】を有する中間化合物を生成する）を有する化合物と反応させることにより調製する。

【００８６】この中間化合物は、式Ｒ¹ＮＨ₂を有する一級アミンと反応に付され、構造式（
Ｉ）の化合物を産生する。

【００８７】構造式（II）の化合物は式

【００８８】

【化２２】

【００８９】を有する化合物を、クロロアセトンと反応させ、式

【００９０】

【化２３】

【００９１】を有する中間化合物を生成することで調製する。

【００９２】この中間化合物を次に、式Ｒ¹ＮＨ₂を有する一級アミンと反応させて構造式（
II）の化合物を産生する。中間体１３−オクソ−２−（２−オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル

【００９３】

【化２４】

【００９４】金属ナトリウム（６０ｍｍｏｌ、１．４ｇ）を窒素下でトルエン８０ｍＬ（ミ
リリットル）内に懸濁した。アセト酢酸エチル（８８ｍｍｏｌ（ミリモル）、１
１．４ｇ）を一滴ずつ添加し、その混合物をすべてのナトリウムが使い尽くされ
るまで撹拌する。次に反応混合物を氷を入れた容器の中で（０〜５℃）冷却し、
トルエン１４０ｍＬ中２−ブロモアセトフェノン（６０ｍｍｏｌ、１２ｇ）を一
滴ずつ添加した。室温になるまで徐々に暖めて反応混合物を一晩撹拌した。ＧＣ
およびＴＬＣによる反応混合物の分析で、反応が完了したことが示された。次に
反応混合物を２００ｍＬの水で洗浄し、有機層と水性層を分離した。有機層をＭ
ｇＳＯ₄（硫酸マグネシウム）上で乾燥した。トルエンを真空下で有機層から取
り除いて、黄色のオイルを生成し、Ｋｕｇｅｌｒｏｈｒ蒸留液で精製した（０．
３５Ｔｏｒｒでｂ．ｐ．１３５〜１４５℃）中間体２２−ベンゾイル−４−オクソ−吉草酸エチルエステル

【００９５】

【化２５】

【００９６】炭酸カリウム（２００ｍｍｏｌ、２７．６ｇ）を、乾燥アセトン（１００ｍＬ
）中ベンゾイル酢酸エチル（１００ｍｍｏｌ、１９．２ｇ）とヨウ化カリウム（
２０ｍｍｏｌ、３．３ｇ）との溶液に加えた。この溶液を還流に付し、クロロア
セトン（１１０ｍｍｏｌ、１０．７ｇ）を一滴ずつ加えた。ＧＣ／ＭＳによる反
応混合物の分析で、中間体２の存在が示された。固体物質を反応混合物から濾過
し、アセトン２００ｍＬで洗浄した。この濾過物を真空下で濃縮し、エーテル中
に再び溶解し、水（１００ｍＬ）で３回洗浄した。有機層を水性層から分離し、
ＭｇＳＯ₄上で乾燥した。固体を分離し、有機溶媒を真空下で取り除き、黄橙の
オイルを産生した。粗オイルをＫｕｇｅｌｒｏｈｒ蒸留液で精製した（０．６５
Ｔｏｒｒでｂ．ｐ１７５〜１８５）。実施例１１−（３−ジメチルアミノフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロ
ール−３−カルボキシル酸エチルエステルの調製

【００９７】

【化２６】

【００９８】Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−フェニレンジアミン二塩酸塩（５ｍｍｏｌ、１．
０ｇ）、トリエチルアミン（１０ｍｍｏｌ、１．４ｍＬ）、３−オクソ−２−（
２−オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．
２ｇ）、トシル酸（０．１ｇ）をエタノール（２５ｍＬ）中で化合させ、次いで
還流下で加熱する（１２時間）。溶媒を真空下で取り除き、その結果生じたオイ
ルを塩化メチレン中に再溶解し、シリカコラムに適用した。精製された生成物を
半透明オイルとして収集した。指示された化合物が¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃、ｐ
ｐｍ）により識別された：１．２８ｔ（３Ｈ），２．３５ｓ（３
Ｈ），２．７７ｓ（６Ｈ），４．２ｑ（２Ｈ），６．３−
６．７ｍ（４Ｈ），７．０〜７．３ｍ（５Ｈ）．実施例２１−（３−クロロフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【００９９】

【化２７】

【０１００】ｍ−クロロアニリン（５ｍｍｏｌ、０．６ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オク
ソ−吉草酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸とをエタノー
ル中で化合し、還流下で加熱した。反応が完了した時点で、粗固体をエタノール
から再結晶化して、指示された生成物を生成した（ｍ．ｐ．９３．２℃〜９４．
６℃）。実施例３１−（３−クロロフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１０１】

【化２８】

【０１０２】ｍ−クロロアニリン（５ｍｍｏｌ、０．６ｇ）と、３−オクソ−２−（２−オク
ソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と
、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール下で化合した。反応が完了した時点で、
粗固体をエタノールから再結晶化して、所望の生成物を産生した（ｍ．ｐ．９９
．６℃〜１００．５℃）。実施例４

【０１０３】

【化２９】

【０１０４】５−メチル−２−フェニル−１−ｍ−トリル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸
エチルエステルの調製ｍ−トルイジン（５ｍｍｏｌ、０．５ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オクソ−
ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）
とをエタノール内で化合し、還流下で加熱した。その結果生じたオイルを塩化メ
チレン中に懸濁し、水、５％炭化水素ナトリウム、塩水で洗浄した。有機層をＮ
ａＳＯ₄（硫酸ナトリウム）上で乾燥し、固体を分離して、真空下で溶媒を気化
した。粗生成物をエタノールから再結晶化して指示された生成物を産生した（ｍ
．ｐ．９２．５℃〜９４．０℃）。実施例５２−メチル−５−フェニル−１−ｍ−トリル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸
エチルエステルの調製

【０１０５】

【化３０】

【０１０６】ｍ−トルイジン（５ｍｍｏｌ、０．５ｇ）と、３−オクソ−２−（２−オクソ
−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、
トシル酸（０．１ｇ）をエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その結果生
じたオイルを塩化メチレン中に懸濁して、水、５％炭化水素ナトリウム、塩水に
より洗浄した。有機層をＮａＳＯ₄上で乾燥し、固体を分離して、溶媒を真空下
で気化した。粗生成物をエタノールから再結晶化して、指示された生成物を産生
した（ｍ．ｐ．１０３℃〜１０４．５℃）。実施例６１−（３−ブロモフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１０７】

【化３１】

【０１０８】ｍ−ブロモアニリン（５ｍｍｏｌ、０．９ｇ）、２−ベンゾイル−４−オクソ
−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸とをエタノ
ール中で化合し、還流下で加熱した。その結果生じたオイルを塩化メチレン中に
懸濁して、水、５％炭化水素ナトリウム、塩水により洗浄した。有機層をＭｇＳ
Ｏ₄上で乾燥し、固体を分離して、溶媒を真空下で気化した。粗生成物をエタノ
ールから再結晶化して、指示された生成物を産生した（ｍ．ｐ．１１７．５℃〜
１１９．２℃）。実施例７１−（３−アセチルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１０９】

【化３２】

【０１１０】３’−アミノ−セトフェノン（５ｍｍｏｌ、０．７ｇ）と、２−ベンゾイル−
４−オクソ−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸
（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。残留オイルをシリ
カ上で精製し、指定された生成物を産生した（ｍ．ｐ．１００℃〜１０２℃）。
実施例８１−（３−アセトフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１１１】

【化３３】

【０１１２】３’−アミノ−セトフェノン（５ｍｍｏｌ、０．７ｇ）、３−オクソ−２−（
２−オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．
２ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した
。その結果生じたオイルをシリカ上で精製し、指定された生成物を固体として産
生した（ｍ．ｐ．１０２℃〜１０４℃）。実施例９１−（３−メタンスルホニルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピ
ロール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１１３】

【化３４】

【０１１４】３−メチルスルホニルアニリン塩酸塩（５．８ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、２−
ベンゾイル−４−オクソ−ペンタン酸エチルエステル（５．８ｍｍｏｌ、１．４
４ｇ）と、トリエチルアミン（５．８ｍｍｏｌ、０．６ｇ）と、トシル酸（０．
１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その結果生じたオイルを
クロロホルム中で再び懸濁し、水、５％炭化水素ナトリウム、塩水により洗浄し
た。有機層をＮａＳＯ₄上で乾燥し、固体を分離して、溶媒を真空下で除去した
。粗物質をシリカ上で精製して、指定された生成物を産生した（ｍ．ｐ．１３１
℃〜１３３℃）。実施例１０１−（３−メタンスルホニルフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピ
ロール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１１５】

【化３５】

【０１１６】３−メチルスルホニルアニリン（１．４ｍｍｏｌ、０．３ｇ）と、３−オクソ
−２−（２−メチル−５−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（１．４ｍ
ｍｏｌ、０．３５ｇ）と、トリエチルアミン（１．４ｍｍｏｌ、０．１４ｇ）と
、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その結
果生じたオイルをクロロホルム中で再び懸濁し、水、５％炭化水素ナトリウム、
塩水により洗浄した。有機層をＮａＳＯ₄上で乾燥し、固体を分離して、溶媒を
真空下で除去した。粗物質をシリカゲル上で精製して、指定された生成物をオイ
ルとして産生した。化合物の構造を¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ）で確認し
た：１．３６ｔ（３Ｈ），２．４５ｓ（３Ｈ），２．８２
ｓ（３Ｈ），４．３ｑ（２Ｈ），６．８７．２ｍ（９Ｈ
）。実施例１１１−（３−カルバモイルフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロー
ル−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１１７】

【化３６】

【０１１８】３−アミノベンザミド（５ｍｍｏｌ、１．０ｇ）と、３−オクソ−２−（２−
オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ
）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。そ
の結果生じた沈殿物を混合物から濾過し、エタノールで洗浄した。白色の固体生
成物を、それ以上精製することなく使用した（ｍ．ｐ．２３７．８℃〜２３８．
８℃）。

【０１１９】実施例１２１−（３−カルバモイルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロー
ル−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１２０】

【化３７】

【０１２１】３−アミノベンザミド（５ｍｍｏｌ、１．０ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オ
クソ−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸（０．
１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その結果生じた沈殿物を
混合物から濾過し、エタノールで洗浄した。黄褐色の固体生成物を、それ以上精
製することなく使用した（ｍ．ｐ．２０８．９℃〜２１０．３℃）。実施例１３１−（３−ジメチルアミノフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロ
ール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１２２】

【化３８】

【０１２３】Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−フェニルレンジアミン二塩酸塩（５ｍｍｏｌ、１
．０ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オクソ−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍ
ｏｌ、１．２ｇ）と、トリエチルアミン（１０ｍｍｏｌ、１．０ｇ）、トシル酸
（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その結果生じたオ
イルを塩酸メチレン中で再び懸濁し、水、５％炭化水素ナトリウム、塩水により
洗浄した。有機層をＮａＳＯ₄上で乾燥し、固体を分離して、溶媒を真空下で除
去した。粗物質をシリカゲル上で精製して、指定された生成物を産生した（ｍ．
ｐ．１１１．７℃〜１１４℃）。実施例１４１−（３−インドフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１２４】

【化３９】

【０１２５】ｍ−インドアニリン（５ｍｍｏｌ、１．１ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オク
ソ−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸（０．１
ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。残留オイルを塩酸メチレン
中で再び懸濁し、水、５％炭化水素ナトリウム、塩水により洗浄した。固体を分
離して、溶媒を真空下で除去した。その結果生じた固体をエタノール中で再結晶
化した。物質の一部は溶解せず、濾過により分離した。再結晶化物質および濾過
物質から指定された生成物を産生した（ｍ．ｐ．１４２．６℃〜１４４℃）。実施例１５２−メチル−５−フェニル−１−（３−スルホフェニル）−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１２６】

【化４０】

【０１２７】メタニル酸（５ｍｍｏｌ、０．９ｇ）と、３−オクソ−２−（２−オクソ−２
−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、水酸
化ナトリウム（５ｍｍｏｌ、０．２ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノー
ル中で化合し、還流下で加熱した。未反応メタニル酸を氷の上で沈殿させ、反応
混合物から濾過した。濾過物を気化して、オイルを産生し、これをシリカゲル上
で精製した。静止させた後、紫色の凝固した指定生成物を産生した（ｍ．ｐ．９
４℃〜９６℃）。実施例１６５−メチル−２−フェニル−１−（３−スルホフェニル）−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１２８】

【化４１】

【０１２９】メタニル酸（５ｍｍｏｌ、０．２ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オクソ−ペン
タン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、水酸化ナトリウム（５ｍｍ
ｏｌ、０．２ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下
で加熱した。その結果生じたオイルをＨＣｌ（塩酸）で０℃〜５℃で処理し、未
反応メタニル酸を沈殿させた。残った物質を真空下で濃縮し、シリカゲル上で精
製した。指定された生成物を褐色のクリスタルとして産生した（ｍ．ｐ．９１℃
〜９２．５℃）。実施例１７１−（３−フルオロフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１３０】

【化４２】

【０１３１】ｍ−フルオロアニリン（５ｍｍｏｌ、０．６ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オ
クソ−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸（０．
１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その結果生じたオイルを
クロロホルム中で再び懸濁し、水、５％炭化水素ナトリウム、塩水により洗浄し
た。有機層をＮａＳＯ₄上で乾燥し、固体を濾過して取り除き、溶媒を真空下で
除去した。指定された生成物をエタノールから再結晶化した（ｍ．ｐ．１００℃
〜１０１℃）。実施例１８１−（３−フルオロフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１３２】

【化４３】

【０１３３】ｍ−フルオロアニリン（５ｍｍｏｌ、０．６ｇ）と、３−オクソ−２−（２−
オクソ−２−フェニル−エチル）酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）
と、トシル酸とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その結果生じた固
体をクロロホルム中で再び懸濁し、水、５％炭化水素ナトリウム、塩水により洗
浄した。有機層をＮａＳＯ₄上で乾燥し、固体を分離して、溶媒を真空下で除去
した。指定された生成物をエタノールから再結晶化した（ｍ．ｐ．９６．３℃〜
９８．０℃）。実施例１９２−メチル−５−フェニル−１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−ピロール−３−カ
ルボン酸エチルエステルの調製

【０１３４】

【化４４】

【０１３５】３−アミノピリジン（５ｍｍｏｌ、０．５ｇ）と、３−オクソ−２−（２−オ
クソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）
と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その
結果生じたオイルをエーテル中で再懸濁し、水、５％炭化水素ナトリウム、塩水
により洗浄した。有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、固体を分離して、溶媒を真空
下で除去した。指定された生成物をシリカゲル上で精製し、¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ
ＣＬ₃、ｐｐｍ）により分析した：１．３５ｔ（３Ｈ），２．４０ｓ（３Ｈ），
４．３ｑ（２Ｈ），６．７８ｓ（１Ｈ），７．０３〜７．３９ｍ
（７Ｈ），８．４ｓｄ（１Ｈ），約８．６ｄｄ（１Ｈ）．実施例２０１−シクロヘキシル−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボ
ン酸エチルエステルの調製

【０１３６】

【化４５】

【０１３７】シクロヘキシルアミン（５ｍｍｏｌ、０．５ｇ）と、３−オクソ−２−（２−
オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ
）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。そ
の結果生じた残留物をエーテル中で再懸濁し、水、塩水により洗浄した。有機層
をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、固体を分離して、溶媒を真空下で除去した。オイルを
精製して指定された生成物を産生した、¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ）：１
．０ｂｍ（２Ｈ），１．２３ｔ（３Ｈ），１．６−１．７ｂｍ
（８Ｈ），２．６６ｓ（３Ｈ），４．１６ｑ（２Ｈ），６．３９
ｓ（１Ｈ），７．２５ｂｍ（５Ｈ）。実施例２１５−メチル−１，２−ジフェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエス
テルの調製

【０１３８】

【化４６】

【０１３９】アニリン（１０ｍｍｏｌ、０．９ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オクソ−ペン
タン酸エチルエステル（１０ｍｍｏｌ、２．５ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）と
をエタノール中で化合し、還流下で加熱した。指定された生成物をエタノールか
ら再結晶化した（ｍ．ｐ．１３０℃〜１３１．７℃）。実施例２２２−メチル−１−（３−ニトロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１４０】

【化４７】

【０１４１】ｍ−ニトロアニリン（１０ｍｍｏｌ、１．４ｇ）と、３−オクソ−２−（２−
オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（１０ｍｍｏｌ、２．５
ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。
指定された生成物をエタノールから再結晶化した（ｍ．ｐ．１４３℃〜１４５℃
）。実施例２３５−メチル−１−（５−ニトロピリジン−２−イル）−２−フェニル−１Ｈ−ピ
ロール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１４２】

【化４８】

【０１４３】５−ニトロ−２−アミノピリジン（５ｍｍｏｌ、０．７ｇ）と、２−ベンゾイ
ル−４−オクソ−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシ
ル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その結果生じ
た固体をクロロホルムにより粉砕し、不可溶物質を反応混合物から濾過した。濾
過物をシリカゲル上で精製し、指定された生成物を産生した（ｍ．ｐ．１４６．
６℃〜１４８．６℃）。実施例２４１−（３−カルボキシフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール
−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１４４】

【化４９】

【０１４５】３−アミノ安息香酸（１０ｍｍｏｌ、１．４ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オ
クソ−ペンタン酸エチルエステル（１０ｍｍｏｌ、２．５ｇ）と、トシル酸（０
．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。その結果生じたオイル
をクロロホルム−エーテル中で再び懸濁し、不可溶物質を反応混合物から濾過し
た。可溶物質をシリカゲル上で精製し、指定された生成物を産生した（ｍ．ｐ．
１６１．０℃〜１６２．７℃）。実施例２５１−（３−メトキシカルボニルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−
ピロール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１４６】

【化５０】

【０１４７】３−アミノ安息香酸メチル（１０ｍｍｏｌ、１．４ｇ）と、２−ベンゾイル−
４−オクソ−ペンタン酸エチルエステル（１０ｍｍｏｌ、２．５ｇ）と、トシル
酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。指定された生成
物をシリカゲル状で精製して再結晶化した。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ）
：１．１５ｂｍ（３Ｈ），２．０８ｓ（３Ｈ），３．８８ｓ（３Ｈ
），４．０５ｑ（２Ｈ），６．５６ｓ（１Ｈ），７．１５−７．３３
ｂｍ（７Ｈ），および７．７９−７．９７ｂｍ（２Ｈ）実施例２６１−（３−ブロモフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１４８】

【化５１】

【０１４９】ｍ−ブロモアニリン（５ｍｍｏｌ、０．９ｇ）と、３−オクソ−２−（２−オ
クソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）
と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。指定
された生成物をエタノールから再結晶化した（ｍ．ｐ．１１１℃〜１１２．７℃
）。実施例２７１−（３−インドフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１５０】

【化５２】

【０１５１】ｍ−インドアニリン（５ｍｍｏｌ、１．１ｇ）と、３−オクソ−２−（２−オ
クソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）
と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。指定
された生成物をエタノールから再結晶化した（ｍ．ｐ．１１１℃〜１１２．９℃
）。実施例２８２−メチル−５−フェニル−１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−１Ｈ−
ピロール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１５２】

【化５３】

【０１５３】ｍ−トリフルオロメチルアニリン（５ｍｍｏｌ、０．８ｇ）と、３−オクソ−
２−（２−オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ
、１．２ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加
熱した。粗物質をクロロホルム中で再懸濁し、水、次に塩水により洗浄した。有
機層をＮａＳＯ₄上で乾燥した。固体を分離して、溶媒を真空下で除去した。そ
の結果生じたオイルをシリカゲル上で精製して、指定された生成物を産生した。 ¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ）：１．３７ｔ（３Ｈ），２．４２
ｓ（３Ｈ），４．３２ｑ（２Ｈ），６．８０ｓ（１Ｈ），
７．０−７．６ｂｍ（９Ｈ）。実施例２９５−メチル−２−フェニル−１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−１Ｈ−
ピロール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１５４】

【化５４】

【０１５５】ｍ−トリフルオロメチルアニリン（５ｍｍｏｌ、０．８ｇ）と、２−ベンゾイ
ル−４−オクソ−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシ
ル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。粗物質をクロ
ロホルム中で再懸濁し、水で洗浄し、次いで塩水により洗浄した。有機層をＮａ
ＳＯ₄上で乾燥した。固体を分離して、溶媒を真空下で除去した。その結果生じ
たオイルをシリカゲル上で精製して、指定された生成物を産生した。¹Ｈ−ＮＭ
Ｒ（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ）：１．０１ｔ（３Ｈ），１．９８ｂ
（３Ｈ），４．００ｑ（２Ｈ），６．４８ｓ（１Ｈ），７．
００−７．３３ｂｍ（９Ｈ）。実施例３０２−メチル−１−（３−ニトロベンジル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１５６】

【化５５】

【０１５７】ｍ−ニトロベンジルアミン塩酸塩（３ｇ）を、飽和炭酸水素ナトリウムの水性
溶液（３０ｍＬ）中に懸濁し、クロロホルムにより抽出した。有機層をＭｇＳＯ ₄ 上で乾燥し、固体を分離して、溶媒を真空下で除去して、遊離塩基を生成した
。上記で調製したｍ−ニトロベンジルアミン（５ｍｍｏｌ、０．８ｇ）と、３−
オクソ−２−（２−オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５
ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還
流下で加熱した。残留物をエチルエーテル中で再び懸濁して、ベンジルアミント
シル酸塩を混合物から濾過した。濾過物を真空下で濃縮し、その結果生じたオイ
ルをシリカ上で精製して、指定された生成物を産生した。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ
Ｌ₃、ｐｐｍ）：１．２４ｔ（３Ｈ），２．３６ｓ（３Ｈ），
４．０７−４．３０ｑ（２Ｈ），５．１１ｓ（２Ｈ），６．
５８ｓ（１Ｈ），６．９８−７．４４ｂｍ（７Ｈ），７．
６９ｂｓ（１Ｈ），７．９７ｂｄ（１Ｈ）。実施例３１５−メチル−１−（３−ニトロベンジル）−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１５８】

【化５６】

【０１５９】ｍ−ニトロベンジルアミン塩酸塩（３ｇ）を、飽和炭酸水素ナトリウムの水性
溶液（３０ｍＬ）中に懸濁し、クロロホルムにより抽出した。有機層をＭｇＳＯ ₄ 上で乾燥し、固体を飽和させて、溶媒を真空下で除去して、遊離塩基を生成し
た。上記で調製したｍ−ニトロベンジルアミン（５ｍｍｏｌ、０．８ｇ）と、２
−ベンゾイル−４−オクソ−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ
）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、還流下で加熱した。そ
の結果生じた残留物をシリカゲル上で精製して、指定された生成物を産生した。 ¹ Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ）：１．１０ｔ（３Ｈ），３．１６
ｓ（３Ｈ），４．０８ｑ（２Ｈ），５．０４ｓ（２Ｈ），
６．５５ｓ（１Ｈ），７．０７−７．５３ｂｍ（７Ｈ），
７．７２ｂｓ（１Ｈ），８．０４ｂｄ（１Ｈ）。実施例３２５−メチル−２−フェニル−１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−ピロール−３−カ
ルボン酸エチルエステルの調製

【０１６０】

【化５７】

【０１６１】３−アミノピリジン（５ｍｍｏｌ、０．５ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オク
ソ−ペンタン酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸（０．１
ｇ）とをエタノール中で化合し、次いで還流下で加熱した。その結果生じたオイ
ルをシリカ上で精製したが、まだ汚染物質を含んでいた。この物質をヘキサン内
で粉砕し、固体を濾過により分離した。固体をベンゼンで２回洗浄して、指定さ
れた生成物を産生した（ｍ．ｐ．１０２℃〜１０３℃）。実施例３３２−メチル−１−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１６２】

【化５８】

【０１６３】ｐ−ニトロアニリン（５ｍｍｏｌ、０．７ｇ）と、３−オクソ−２−（２−オ
クソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍｍｏｌ、１．２５ｇ
）と、トシル酸とをエタノール中で化合し、次いで還流下で加熱した。反応混合
物を氷で冷却し（０〜５℃）、反応混合物から沈殿物を濾過した。１Ｈ−ＮＭＲ
分析により沈殿物が指定された生成物であることを確認した。（ＣＤＣＬ３、ｐ
ｐｍ）：１．３８ｔ（３Ｈ），２．４５ｓ（３Ｈ），４．
２０ｑ（２Ｈ），６．８０ｓ（１Ｈ），６．９７−７．３５
ｂｍ（７Ｈ），８．２５ｄ（２Ｈ）。実施例３４２−メチル−１−（２−ニトロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１６４】

【化５９】

【０１６５】ｏ−ニトロアニリン（１５ｍｍｏｌ、２．１ｇ）と、３−オクソ−２−（２−
オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（１５ｍｍｏｌ、３．７
ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、次いで還流下で加熱
した。その結果生じたオイルを３つのシリカゲルカラムで精製し、指定された生
成物を産生した。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ）：１．３６ｔ（３Ｈ
），２．３６ｓ（３Ｈ），４．３１ｑ（２Ｈ），６．８０
ｓ（１Ｈ），７．０３−７．６６ｂｍ（６Ｈ），７．６８
ｄｔ（２Ｈ），７．９７ｄｄ（１Ｈ）。実施例３５２−メチル−１−（５−ニトロピリジン−２−イル）−５−フェニル−１Ｈ−ピ
ロール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１６６】

【化６０】

【０１６７】５−ニトロ−ピリジン−２−イルアミン（５ｍｍｏｌ、０．７ｇ）と、３−オ
クソ−２−（２−オクソ−２−フェニル−エチル）−酪酸エチルエステル（５ｍ
ｍｏｌ、１．２ｇ）と、トシル酸（０．１ｇ）とをエタノール中で化合し、次い
で還流下で加熱した。その結果生じた固体をクロロホルムで粉砕し、濾過物をさ
らにシリカゲル上で精製し、指定された生成物を産生した。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ
ＣＬ₃、ｐｐｍ）：１．３５ｔ（３Ｈ），２．５４ｓ（３Ｈ）
，４．３０ｑ（２Ｈ），６．７８ｓ（１Ｈ），６．９６−
７．２５ｂｍ（６Ｈ），８．３３ｄｄ（１Ｈ），９．３９
ｓｄ（１Ｈ）。実施例３６５−メチル−１−（４−ニトロフェニル）−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１６８】

【化６１】

【０１６９】ｐ−ニトロアニリン（１０ｍｍｏｌ、１．４ｇ）と、２−ベンゾイル−４−オ
クソ−ペンタン酸エチルエステル（１０ｍｍｏｌ、２．５ｇ）と、トシル酸（０
．１ｇ）とをエタノール中で化合し、次いで還流下で加熱した。反応混合物濾過
し、固体をエタノールで洗浄した。収集した物質が指定された生成物であること
が確定された（ｍ．ｐ．１９０℃〜１９２℃）。実施例３７１−（４−アミノフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１７０】

【化６２】

【０１７１】実施例３６の５−メチル−１−（４−ニトロフェニル）−２−フェニル−１Ｈ
−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（４ｍｍｏｌ、１．５ｇ）をエタノ
ール中に溶解し、５％Ｐｄ／Ｃ（０．１５ｇ）により処理した。混合物を４５ｐ
ｓｉでＨ₂（ｇ）により水素化した。反応が完了した時に、混合物をセライトに
より濾過し、溶媒を真空下で除去した。その結果生じた固体を分析すると、指定
された生成物であることが証明された。（ｍ．ｐ．１８１℃〜１８３℃）。実施例３８１−（４−アミノフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１７２】

【化６３】

【０１７３】実施例３３の２−メチル−１−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ
−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル（２ｍｍｏｌ、０．８ｇ）をエタノ
ール中に溶解し、５％Ｐｄ／Ｃ（０．１５ｇ）により処理した。混合物を４５ｐ
ｓｉでＨ₂（ｇ）により水素化した。反応が完了した時に、混合物をセライトに
より濾過し、溶媒を真空下で除去した。その結果生じた固体を分析すると、指定
された生成物であることが証明された。実施例３９１−（３−ニトロフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１７４】

【化６４】

【０１７５】指定された生成物をＭａｙｂｒｉｄｇｅＣｈｅｍｉｃａｌ社（コーンウォー
ル、イギリス）から購入し、さらに精製することなく使用した。実施例４０１−（３−アミノフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１７６】

【化６５】

【０１７７】実施例３９の化合物（０．８６ｍｍｏｌ、０．３ｇ）をメタノール中に溶解し
、塩化ニッケル（ＮｉＣｌ₂）および水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ₄）（１
７．２ｍｍｏｌ）で実施例４０に記載した手順に従って処理した。指定された生
成物をシリカ上で精製した。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ）：１．３７
ｔ（３Ｈ），２．４１ｓ（３Ｈ），３．７３ｓ（２Ｈ），
４．３１ｑ（２Ｈ），６．４３ｓ（１Ｈ），６．５４ｄ
（１Ｈ），６．６７ｄｄ（１Ｈ），６．７８ｓ（１Ｈ），
７．１１−７．１８ｍ（５Ｈ）。実施例４１１−（３−アミノフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１７８】

【化６６】

【０１７９】実施例２２の化合物（０．８６ｍｍｏｌ、０．３ｇ）をメタノール中に溶解し
、ＮｉＣｌ₂および水素化ホウ素ナトリウムで処理した。メタノールを除去し、
次に反応混合物を水中に懸濁して、酢酸エチルで抽出した。反応混合物をＭｇＳ
Ｏ₄上で乾燥し、濾過、濃縮を行った。指定された生成物をシリカ上で精製した
（ｍ．ｐ．１４２℃〜１４３℃）。実施例４２１−（２，３−ジクロロフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロー
ル−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１８０】

【化６７】

【０１８１】指定された生成物をＭａｙｂｒｉｄｇｅＣｈｅｍｉｃａｌ社（コーンウォー
ル、イギリス）から購入し、さらに精製することなく使用した。実施例４３５−メチル−１−（３−ニトロフェニル）−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−３
−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１８２】

【化６８】

【０１８３】実施例３９の化合物（０．２９ｍｍｏｌ、０．１ｇ）を５０％ジオキサンおよ
び水中に溶解し水酸化リチウム（ＬｉＯＨ、０．８７ｍｍｏｌ、０．０３６３ｇ
）で処理して、少なくとも５０℃まで加熱した。溶媒を除去し、主成分を酢酸エ
チルで抽出した。水性層をｐＨ＜２まで酸性化し、酢酸エチルで抽出した。有機
層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、固体を濾過して、溶媒を真空下で除去した。指定さ
れた生成物さらに精製することなく使用した。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ
）：２．４８ｓ（３Ｈ），６．８８ｓ（１Ｈ），７．０３
ｄｄ（２Ｈ），７．１８ｍ（３Ｈ），７．４７ｄｄ（１Ｈ
），７．６ｔ（１Ｈ），８．０８ｓｔ（１Ｈ），８．２７
ｄｄ（１Ｈ）。実施例４４５−メチル−１，２−ジフェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエス
テルの調製

【０１８４】

【化６９】

【０１８５】実施例２１の化合物（０．３３ｍｍｏｌ、０．１ｇ）を実施例４３に記載され
たのと同一の方法で加水分解して、指定された生成物を産生した。¹Ｈ−ＮＭＲ
（ＣＤＣＬ₃、ｐｐｍ）：２．４４ｓ（３Ｈ），６．８７ｓ（
１Ｈ），７．０６ｍ（２Ｈ），７．１５ｍ（５Ｈ），７．
４０ｍ（３Ｈ）。実施例４５１−（３，５−ビス−トリフルオロメチルフェニル）−５−メチル−２−フェニ
ル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１８６】

【化７０】

【０１８７】指定された生成物をＭａｙｂｒｉｄｇｅＣｈｅｍｉｃａｌ社（コーンウォー
ル，イギリス）から購入し、さらに精製することなく使用した。実施例４６１−（３−エトキシカルボニルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−
ピロール−３−カルボン酸エチルエステルの調製

【０１８８】

【化７１】

【０１８９】この化合物は、３−アミノ安息香酸エチルを出発物質として使用した以外は、
実施例２５の化合物と同じ方法で形成された。指定された生成物は１０８℃〜１
１０℃のｍ．ｐ．を有していた。

【０１９０】構造式（Ｉ）および（II）の化合物をＰＤＥ４阻害の能力について試験した。
ＰＤＥ４活性を阻害する化合物の能力は化合物に対するＩＣ₅₀値、すなわち酵素
活性を５０％阻害するために要求される阻害剤の濃度に関係する。構造式（Ｉ）
および（II）の化合物に対するＩＣ₅₀値はヒト組換え型ＰＤＥ４を使って測定さ
れた。

【０１９１】本発明の化合物は通常、組換え型ヒトＰＤＥ４に対して約１００μＭ未満、好
ましくは約５０μＭ未満、より好ましくは約２５μＭ未満のＩＣ₅₀値を示す。本
発明の化合物は通常、組換え型ヒトＰＤＥ４に対して約１０μＭ未満、往々にし
て１μＭ未満のＩＣ₅₀値を示す。本発明の利点を十分に活用するために、本ＰＤ
Ｅ４阻害剤は約０．００５μＭ〜約２５μＭのＩＣ₅₀を有する。

【０１９２】化合物に対するＩＣ₅₀値は、通常０．１ｐＭ〜５００μＭの範囲の濃度を用い
た濃度反応グラフから決定する。Ｌｏｕｇｈｎｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２７１，ｐｐ．７９６−８０６（１９９６）に記載されたような標準方法を
用いたその他のＰＤＥ酵素に対する試験でもまた、本発明の化合物がｃＡＭＰ−
特異的ＰＤＥ４酵素に対して高度に選択的であることが証明された。

【０１９３】特に、本発明の化合物、すなわち実施例２２、は、ヒト組換え型ＰＤＥ４Ｂに
対して０．１５μＭのＩＣ₅₀を有するが、ＰＤＥ１Ａに対して３５．５μＭ、Ｐ
ＤＥ１Ｂに対して２１．０μＭ、ＰＤＥ１Ｃに対して２１．８μＭ、ＰＤＥ２に
対して４．５μＭ、ＰＤＥ３Ａに対して８９μＭ、ＰＤＥ５に対して１２．５μ
Ｍ、ＰＤＥ７に対して１０．６μＭのＩＣ₅₀を有する。これはＰＤＥ４阻害に対
する本化合物の選択性を例証するものである。

【０１９４】構造式（Ｉ）および（II）の化合物を、ヒト末梢血リンパ球におけるＴＮＦα
を減少させる能力についても試験した。ＴＮＦαを減少させる能力はＥＣ₅₀値（
すなわち、全ＴＮＦαの５０％を阻害することができる化合物の実際濃度）に関
係する。

【０１９５】本発明の化合物は通常、約１００μＭ未満の、好ましくは約５０μＭ未満、よ
り好ましくは１５μＭ未満のＥＣ₅₀値を示す。本発明の化合物は約１０μＭ未満
、多くの場合約７μＭ未満のＰＢＬ／ＴＮＦαＥＣ₅₀値を示すことが好ましい。
本発明の利点を十分に活用するために、本ＰＤＥ４阻害剤は約１μＭ〜約２０μ
ＭのＥＣ₅₀値を有する。

【０１９６】各組換え型ヒトＰＤＥの産生およびＩＣ₅₀およびＥＣ₅₀の測定は当業において
公知の方法により行われても良い。代表的な方法を以下に記載した。各ヒトＰＤＥの発現バキュロウイルス感染Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｕｑｉｐｅｒｄａ（ｓｆ９）（
ビバ、ヨトウガ）細胞における発現バキュロウイルス転写プラスミドを、ｐＢｌｕｅＢａｃIII（インビトロゲン
社）またはｐＦａｓｔＢａｃ（ＢＲＬ−Ｇｉｂｃｏ社）のいずれかを用いて作成
した。すべてのプラスミドの構造はベクター結合部を配列決定（シーケンス）し
、ＰＣＲにより生成されたすべての領域を完全にシーケンスすることで確認した
。プラスミドｐＢＢ−ＰＤＥ１Ａ３／６は、ｐＢｌｕｅＢａｃIII内にＰＤＥ１
Ａ３の完全翻訳領域（Ｌｏｕｇｈｎｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１
，ｐｐ．７９６−８０６（１９９６））を含んでいる。プラスミドｐＢＢ−ＰＤ
Ｅ３Ａは、ｐＢｌｕｅＢａｃIII内にＰＤＥ３Ａの完全翻訳領域（Ｍｅａｃｃｉ
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９，ｐｐ．３７２１
−３７２５（１９９２））を含んでいる。

【０１９７】組換え型ウイルス系統は、ＭａｘＢａｃシステム（インビトロゲン社）または
ＦａｓｔＢａｃシステム（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）のいずれかを用いて、メーカ
ーの実施要領に従って産生された。いずれの場合においても、その結果生じるウ
イルスにおける各組換え型ヒトＰＤＥの発現により、ウイルス多面体プロモータ
ーが追い払われた。ＭａｘＢａｃシステムを使用した場合、ウイルスは、野生タ
イプ（ｏｃｃ＋）ウイルスが調製を汚染しないように、２回プラーク洗浄された
。蛋白質発現は以下のように行われた。１０％ウシ胎児血清、０．３３％ＴＣ酵
母菌、０．３３％ラクトアルブミン水解物、４．２ｍＭのＮａＨＣＯ₃、１０μ
ｇ／ｍＬゲンタマイシン、１００単位／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬステ
レプトマイシンが追加されたＧｒａｃｅの昆虫培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）内
において、ｓｆ９細胞を２７℃で成長させた。指数関数的に成長する細胞を、細
胞当たり約２〜３個の多数のウイルス粒子で感染させ、４８時間インキュベート
を行った。細胞を遠心分離により採集し、非追加Ｇｒａｃｅ培地で洗浄して、急
速冷凍して保存した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（酵母）における発現ヒトＰＤＥ１Ｂ、ＰＤＥ２、ＰＤＥ４Ａ、ＰＤＥ４Ｂ、ＰＤＥ４Ｃ、ＰＤＥ４
Ｄ、ＰＤＥ５、ＰＤＥ７組換え型産生が、米国特許第５，７０２，９３６号の実
施例７に記載された方法に類似した方法で行われた。この特許については、Ｐｒ
ｉｃｅら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，ｐｐ
．３０８−３１８（１９９０）に記載された塩基性ＡＤＨ２プラスミドから
誘導され、酵母ＡＤＨ２プロモーターおよびターミネータシーケンスを組み込み
、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主が、１９９８年８月
３１日に、承認番号ＡＴＣＣ７４４６５で、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕ
ｌｔｕｒｅ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州により登録されたプロテアーゼ欠
陥系統ＢＪ２−５４であった酵母形質転換ベクターが用いられたことを除いて、
本文に採用されている。形質転換させた宿主細胞は、金属痕およびビタミン類を
加えた２ＸＳＣ−１ｅｕ培地、ｐＨ６．２内で成長させた。２４時間後、グリ
セロールを含むＹＥＰ培地を２ＸＹＥＴ／３％グリセロールの最終濃度まで加
えた。約２４時間後、細胞を採取して洗浄し、−７０℃で保存した。

【０１９８】カルモジュリン精製ＰＤＥ１酵素の活性化のために用いるカルモジュリンを、主にＤｅｄｍａｎら
，Ｍｅｔｈｏｄｓ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０２，ｐｐ．１
−８（１９８３）に記載されているようなファルマシア・フェニル・セファロ
ース方法を用いたウシ試験から精製した。アガロース上へのカルモジュリンの固定カルモジュリンをＢｉｏＲａｄＡｆｆｉＧｅｌ１５上に、メーカーに指示に
従って固定した。

【０１９９】ヒトホスホジエステラーゼ調製ホスホジエステラーゼ活性測定調製物のホスホジエステラーゼ活性は以下のように測定した。木炭分離技術を
用いるＰＤＥ評価を、主にＬｏｕｇｈｎｅｙら（１９９６）により記載されたよ
うに行った。この評価では、ＰＤＥ活性は［３２Ｐ］ｃＡＭＰまたは［３２Ｐ］
ｃＧＭＰから対応する［３２Ｐ］５’−ＡＭＰまたは［３２Ｐ］５’ＧＭＰに、
存在する全ＰＤＥ活性の割合で転換する。次に［３２Ｐ］５’−ＡＭＰまたは［
３２Ｐ］５’−ＧＭＰを量的に遊離［３２Ｐ］リン酸塩および非標識アデノシン
またはグアノシンに、ヘビ毒５’−ヌクレオチダーゼの作用によりに転換する。
したがって遊離された全［３２Ｐ］リン酸塩量は酵素活性に比例する。評価は、
（最終濃度）４０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１μＭＺｎＳＯ₄、５ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂、０．１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１０
０μＬの反応混合物中で、３０℃で行われた。また、ＰＤＥ１−特異的活性の評
価では、さらにインキュベーション混合物に０．１ｍＭのＣａＣｌ₂および１０
μｇ／ｍＬカルモジュリンの使用を組み入れた。ＰＤＥ酵素は、基質の全加水分
解の３０％未満をもたらす量存在する（一次評価条件）。評価は基質（１ｍＭの
［３２Ｐ］ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰ）を加えることで開始され、混合物は１２分
インキュベートされた。次にＣｒｏｔａｌｕｓａｔｒｏｘ毒液を７５μｇ添加
し、インキュベーションを３分間継続した（合計１５分）。活性化させた木炭２
００μＬ（２５ｍｇ／ｍＬの０．１ＭのＮａＨ₂ＰＯ₄懸濁液、ｐＨ４）を添加す
ることで反応を停止させた。木炭を沈降させるために遠心分離器にかけた後（３
分間、７５０Ｘｇ）、上澄み液のサンプルを採取して、シンチレーションカウン
ター内で放射能測定を行い、ＰＤＥ活性を計算した。

【０２００】阻害剤分析は、ｃＧＭＰおよびｃＡＭＰを共に用いるとともに、試験したＰＤ
Ｅ５のＫｍをかなり下回る基質濃度を３２ｎＭ以下に維持したことを除いて、Ｌ
ｏｕｇｈｎｅｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，ｐｐ．７
９６−８０６（１９９６）に記載された方法に類似して行われた。ＳＦ９細胞からのＰＤＥ１Ａ３の精製細胞ペレット（５ｇ）を１０ｍＬのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭＭ
ＯＰＳｐＨ７．５、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭベンザミ
ジンＨＣｌ、５μＭＺｎＳＯ₄、０．１ｍＭＣａＣｌ₂、２０μｇ／ｍＬカルパイ
ン阻害剤ＩおよびII、さらにロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニンをそれ
ぞれ５μｇ／ｍＬ）と、室温で混合した。細胞をＦｒｅｎｃｈ（登録商標）ｐ
ｒｅｓｓｕｒｅｃｅｌｌ（ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ（登録商標）、Ｓｐｅｃｔｒ
ｏｎｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、ロチェスター、ニューヨーク）にかけて溶
解した。その結果生じた溶解物を、タイプＴ１８０ロータを用いたＢｅｃｋｍａ
ｎｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ内で、１時間４５，０００ｒｐｍで遠心分
離した。上澄みを取り０．２μｍフィルターで濾過した。この濾過物を、Ｃｏｌ
ｕｍｎＢｕｆｆｅｒＡ（１００ｍＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＭｇＣｌ₂を含
む溶解緩衝剤）で平衡にしたＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ−３００の２
．６Ｘ９０ｃｍカラムにかけた。カラムフロー速度は１ｍＬ／分に調節され、７
ｍＬのフラクションが採取された。活性フラクションを集めてカルモジュリン０
．１６ｍｇを追加した。Ｈａｎｓｅｎら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ１５９，ｐｐ．４５３−５５７（１９８８）に記載されてい
るように、酵素を、流速度０．２ｍＬ／分で一晩かけてＡＣＣ−１アガロース免
疫親和性カラムにかけた。カラムを、５容積のカラム緩衝剤Ｂ（ＮａＣｌのない
カラム緩衝剤Ａ）で洗浄し、さらに５容積のカラム緩衝剤Ｃ（２５０ｍＭのＮａ
Ｃｌを含むカラム緩衝剤Ａ）で洗浄した。カラムをカラム緩衝剤Ｄ（５０ｍＭＭ
ＯＰＳｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、１
ｍＭのベンザミジンＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０μｇ／ｍＬのカルパイ
ン阻害剤ＩおよびII、さらにロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニンをそれ
ぞれ５μｇ／ｍＬ）により、０．１ｍＬ／分の割合で１カラム容積を用いて溶出
を行い、１時間流れを停止し、さらに同流出速度で溶出を継続した。フラクショ
ンを０．５ｍＬ採取した。活性を示すフラクションを集め、まず２５ｍＭのＭＯ
ＰＳｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＺｎＳ０₄、１ｍＭのＣ
ａＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ、さらに１ｍＭベンザミジンＨＣｌを含む透析緩衝剤
に対して透析を行った。５０％グリセロールを含む透析緩衝剤に対して次の透析
を行い、サンプルをドライアイスで急冷凍して、−７０℃で保存した。この結果
生じた調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度は１０〜１５％であった。これらの
調製物は、１分間に蛋白質１ミリグラム当たり約５〜２０μｍｏｌｃＡＭＰの加
水分解を示す特殊活性を有していた。

【０２０１】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからＰＤＥ１Ｂの精製酵母細胞（５０ｇ）をガラスビーズ（０．５ｍＭ、酸洗浄）および２００ｍＬ
の緩衝液Ａと共に室温で混合して溶解した。緩衝液Ａは５０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐ
Ｈ７．５、１ｍＭのＤＤＴ、２ｍＭのベンザミジンＨＣｌ、０．０１ｍＭのＺｎ
ＳＯ₄、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２０μｇ／ｍＬのカルパイン阻害剤ＩおよびII、さ
らにロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニンがそれぞれ５μｇ／ｍＬからな
る。混合物を４℃まで冷却し、Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ（登録商標）に移し、細
胞をそれぞれ３０秒間の６サイクルの高速混合で溶解した。ホモジェネートを、
ＪＡ−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＪ２−２１Ｍ遠心分離器で、９０００
ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。上澄み液を取り出し、ＴＩ４５ロータを
用いたＢｅｃｋｍａｎＸＬ−８０超遠心分離器で、３６，０００ｒｐｍ、４℃で
４５分間遠心分離した。上澄み液を取り出し、ＰＤＥ１Ｂを、固体硫酸アンモニ
ウム（０．３３ｇ／ｍＬ上澄み液）を添加することで沈殿させ、その間氷を入れ
た槽内で撹拌を行ってｐＨを７．０〜７．５に維持した。次にこの混合物を、Ｊ
Ａ−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＪ２遠心分離器で、９０００ｒｐｍ（１
２，０００Ｘｇ）で２２分間遠心分離した。上澄み液を捨てて、ペレットを１０
０ｍＬの緩衝液Ｂ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．５，１ｍＭのＤＴＴ，１ｍＭ
ベンザミジンＨＣ１，０．０１ｍＭのＺｎＳ０₄，２ｍＭのＭｇＣｌ₂，２ｍＭの
ＣａＣｌ₂，さらにロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニンがそれぞれ５μ
ｇ／ｍＬ）内で溶解した。ｐＨおよび電導性をそれぞれ７．５および１５〜２０
ミリシーメンス（ｍＳ）に修正した。この溶液を、１ｍＬ／分の速度で１０カラ
ム容積の緩衝液Ｂと平衡化させたカルモジュリン−アガロースの２０ｍＬカラム
上に充填した。フロースルーを少なくとも５回カラムにかけた。カラムを５容積
緩衝液Ｂ、２５０ｍＭのＮａＣｌを含む５容積緩衝液Ｂ、ＮａＣｌを含まない２
容積の緩衝液Ｂで再び洗浄した。溶出を、１容積の緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＭＯＰ
ＳｐＨ７．５，１ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＥＧＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ，１ｍ
ＭベンザミジンＨＣｌ）を０．３３ｍＬ／分で適用することにより完了し、次い
でフローを１時間停止した後、再び溶出を継続する。約４ｍＬのフラクションを
収集し、ＰＤＥ活性を評価した。活性フラクションを集め、Ａｍｉｃｏｎ限外濾
過システムを用いて５ｍＬの容積まで濃縮した。濃縮物を、少なくとも２容積の
緩衝液Ｄ（２５ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．５，１ｍＭのＤＴＴ，１ｍＭベンザミ
ジンＨＣｌ，０．０１ｍＭのＺｎＳＯ₄，２ｍＭのＣａＣｌ₂，および１００ｍＭ
のＮａＣｌ）で平衡化させた３２０ｍＬＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−
３００カラム（１．６Ｘ１５０ｃｍ）にかけた。カラムを１ｍＬ／分（１１ｃｍ
／時）のフロー速度で展開させ、５ｍＬフラクションを収集した。活性ピークを
プールして、５０％グリセロールを含む緩衝液Ｄに対して一晩かけて透析した。
精製した酵素をドライアイス上で冷凍し、−７０℃で貯蔵した。その結果生じた
調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度が約９０％よりも高かった。これらの調製
物は、毎分蛋白質１ミリグラム当たり約１０〜３０μｍｏｌｃＧＭＰの加水分解
を行う特異的活性を有していた。Ｓｆ９細胞からのＰＤＥＬＣ３の精製細胞ペレット（５ｇ）を２０ｍＬのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＭ
ＯＰＳｐＨ７．４，１０μＭのＺｎＳＯ₄，０．１ｍＭのＣａＣｌ₂，１ｍＭの
ＤＴＴ，２ｍＭのベンザミジンＨＣｌ、さらにロイペプチン、ペプスタチン、ア
プロチニンがそれぞれ５μｇ／ｍＬ）と共に氷上で溶かした。細胞をＦｒｅｎｃ
ｈ（登録商標）ｐｒｅｓｓｕｒｅｃｅｌｌ（ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ（登録
商標），ＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を通過させて溶解
させその間温度を１０℃未満に維持した。この結果生じた細胞ホモジェネートを
、ＴｙｐｅＴＩ４５ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎ超遠心分離器で３６，０００
ｒｐｍ、４℃で４５分間遠心分離した。上澄み液を捨てて、その結果生じたペレ
ットを４０ｍＬの可溶性緩衝液（１ＭのＮａＣｌ，０．１ＭのＭｇＣｌ₂，１ｍ
ＭのＣａＣｌ₂，２０μｇ／ｍＬのカルモジュリン、１％のスルホベタインＳＢ
１２（Ｚ３−１２）を含むＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ）に再懸濁し、マイクロチッ
プと共にＶｉｂｒａＣｅｌｌチューナーを使用して３０秒間Ｘ３回超音波分解す
る。これは冷却のための砕いた氷／塩混合物内で行う。超音波分解に続いて、混
合物を４℃で３０分かけてゆっくりと混合し、メンブラン結合蛋白質をついに溶
解する。この混合物を、タイプＴＩ４５ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎ超遠心分
離器で、３６，０００ｒｐｍで４５分間遠心分離した。上澄み液を、１０μｇ／
ｍＬカルパイン阻害剤ＩおよびIIを含むＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒにより希釈する
。沈殿した蛋白質を、ＢｅｃｋｍａｎＪＡ−１０ロータ内で、９０００ｒｐｍで
、２０分間遠心分離した。次に取り出した上澄み液をＭｉｍｅｔｉｃＢｌｕｅ
（登録商標）ＡＰアガロースクロマトグラフィーにかける。

【０２０２】ＭｉｍｅｔｉｃＢｌｕｅ（登録商標）ＡＰアガロースカラムを作動させるた
めに、最初に樹脂で、１０総容積の１％ポリビニルピロリドン（すなわちＭＷ４
０，０００）をかけることにより保護し、非特異的結合部位を塞ぐ。ゆるく結合
したＰＶＰ−４０を２ＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．
４を１０総容積用いて洗浄して除去した。可溶度を高めたＰＤＥ１Ｃ３サンプル
を加える直前に、カラムを５総容積のカラム緩衝液Ａ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐ
Ｈ７．４、１０μＭのＺｎＳ０₄、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭのＣａＣｌ₂
、１ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭベンザミジンＨＣｌ）で平衡化した。

【０２０３】可溶度を高めたサンプルをリサイクルを行いながらフロー速度２ｍＬ／分でカ
ラムにかけ、全サンプルが１２時間で４〜５回繰り返しかけた。充填が完了した
後、カラムを１０カラム容積のカラム緩衝液Ａで洗浄し、さらに５カラム容積の
カラム緩衝液Ｂ（２０ｍＭ５’−ＡＭＰを含むカラム緩衝液Ａ）で、またさらに
は５カラム容積のカラム緩衝液Ｃ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．４，１０μＭ
のＺｎＳＯ₄，０．１ｍＭのＣａＣｌ₂，１ｍＭのＤＴＴ，２ｍＭベンザミジンＨ
Ｃｌ）により洗浄した。酵素を３つの連続プールに溶出した。第１プールは、１
ｍＭのｃＡＭＰを含むカラム緩衝液Ｃによる５総容積洗浄からの酵素から成る。
第２プールは、１ＭのＮａＣｌを含むカラム緩衝液Ｃによる１０総容積洗浄から
の酵素から成る。最後の酵素プールは１ＭＮａＣｌおよび２０ｍＭのｃＡＭＰを
含むカラム緩衝液Ｃによる５総容積洗浄から成る。

【０２０４】酵素の活性プールを集めて、環状ヌクレオチドを従来のゲル濾過クロマトグラ
フィーまたはヒドロキシアパタイト樹脂クロマトグラフィーにより除去する。環
状ヌクレオチドの除去の後、酵素プールを２５ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．４，１
０μＭのＺｎＳＯ₄，５００ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのＣａＣｌ₂，１ｍＭのＤＴ
Ｔ，１ｍＭベンザミジンＨＣ１を含む透析緩衝液に対して透析し、さらに５０％
グリセロールを含む透析緩衝液に対する透析を続けた。酵素をドライアイスで急
速冷凍して、−７０℃で貯蔵した。

【０２０５】この結果生じた調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度が９０％より大きかった
。これらの調製物は、毎分蛋白質１ミリグラム当たりｃＡＭＰ約０．１〜１．０
μｍｏｌの加水分解を示す特異的活性を有していた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＰＤＥ２の精製系統ＹＩ３４からの冷凍酵母細胞ペレット（１０ｇ、−７０℃で貯蔵）を、２５
ｍＬのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＭＯＰＳ，ｐＨ７．２，１ｍＭのＥ
ＤＴＡ，１ｍＭのＥＧＴＡ，０．１ｍＭのＤＴＴ，０．１ｍＭの４−（２−アミ
ノエチル）フッ化ベンゼンスルホニル（ＡＥＢＳＦ），ペプスタチン、ロイペプ
チン、アプロチニン、カルパイン阻害剤ＩおよびIIが１μｇ／ｍＬ、２ｍＭのベ
ンザミジン）中の氷上で溶解することができた。細胞をＦｒｅｎｃｈ（登録商標
）ｐｒｅｓｓｕｒｅｃｅｌｌ（ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ（登録商標），Ｓｐｅｃ
ｔｒｏｎｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に3回通すことで溶解させた。溶解物
をロータタイプＴｉ４５のＢｅｃｋｍａｎ超遠心分離器で、４℃で３６，０００
ｒｐｍで６０分間遠心分離した。上澄み液を沈殿物から分離して、１５ｍＬエポ
キシ−ｃＧＭＰセファロース（登録商標）樹脂に、４℃で、約０．５ｍＬ／分で
２回通した。その後、カラムを４５ｍＬの洗浄緩衝液１（５０ｍＭのＭＯＰＳ，
ｐＨ７．２，０．１ｍＭのＥＤＴＡ，０．１ｍＭのＤＴＴ）で洗浄した。この洗
浄に続いて、カラムを４５ｍＬの洗浄緩衝液２（０．５ＭのＮａＣｌを含む洗浄
緩衝液１）により洗浄した。この塩洗浄につづいて、カラム１５ｍＬの洗浄緩衝
液３（０．２５のＮａＣｌを含む洗浄緩衝液１）により洗浄した。カラムを室温
にして、暖めてた。約２５ｍＬの溶出緩衝液（１０ｍＭのｃＧＭＰを含み、室温
に維持されている洗浄緩衝液３）をカラムにかけて溶出物を２ｍＬフラクション
内に集めた。フラクションの各小一定分量を、５ｍＭのＭｇＣｌ₂を含むＰＢＳ
内で２０倍に希釈して、衝突リガンドの加水分解を可能にし、ＰＤＥ２活性の検
出を助けた。活性フラクションをＰｈａｒｍａｃｉａＰＤ−１０（登録商標）
ゲル濾過カラムに通して、洗浄緩衝液３に交換した。この交換されたプールを、
殺菌８０％グリセロールで５０％ｖ／ｖに希釈して、−２０℃で貯蔵した。この
結果生じた調製物は、その後のクーマシーＲ−２５０による蛋白質染色によるＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥで評価されたように８５％以上純粋であった。これらの調製物は
、毎分蛋白質１ミリグラム当たりｃＧＭＰ約１５０〜２５０μｍｏｌの加水分解
を示す特異性を有している。Ｓｆ９細胞からのＰＤＥ３Ａの調製細胞（２Ｘ１０１０）を、５０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．５，２ｍＭのＤＴＴ
，２ｍＭベンザミジンＨＣｌ，５μＭのＺｎＳＯ₄，０．１ｍＭのＣａＣｌ₂，２
０μｇ／ｍＬカルパイン阻害剤ＩおよびII，さらにロイペプチン、ペプスタチン
、アプロチニンをそれぞれ５μｇ／ｍＬを含むＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ中で懸濁
した。混合物を３０秒間２回超音波分解し、細胞をＦｒｅｎｃｈ（登録商標）ｐ
ｒｅｓｓｕｒｅｃｅｌｌ（ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ（登録商標），Ｓｐｅｃｔｒ
ｏｎｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内で、４℃で溶解した。溶解物を４５分間
１００，０００Ｘｇで遠心分離した。ペレットをひとたびＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅ
ｒ中で一度洗浄した後、４６ｍＬのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ内で、Ｄｏｕｎｃｅ
破砕機で懸濁した。一定分量を−７０℃で貯蔵した。これらの調製物は、毎分蛋
白質１ミリグラム当たりｃＡＭＰ約１〜２ｎｍｏｌの加水分解を示す特異的活性
を有していた。ヒトＰＤＥ４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄ調製物Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＰＤＥ４Ａの調製酵母細胞（ＨＤＵＮ１．４６を加えた酵母系統ＹＩ２６が５０ｇ）を、５０ｍ
ＬのＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．５，１０μＭのＺ
ｎＳＯ₄，２ｍＭのＭｇＣｌ₂，１４．２ｍＭの２−メルカプトエタノール，ペプ
スタチン、ロイペプチン、アプロチニンがそれぞれ５μｇ／ｍＬ、カルパイン阻
害剤ＩおよびIIおよび２ｍＭベンザミジンＨＣ１がそれぞれ２０ｇ／ｍＬ）と共
に混合しながら室温で溶解した。細胞をＦｒｅｎｃｈ（登録商標）ｐｒｅｓｓｕ
ｒｅｃｅｌｌ（ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ（登録商標），Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）内で、１０℃で溶解した。抽出物をＢｅｃｋｍａｎＪ
Ａ−１０ロータ内で、９０００ｒｐｍで２２分間遠心分離した。上澄み液を取り
除き、ＢｅｃｋｍａｎＴＩ４５ロータ内で、３６，０００ｒｐｍ、４℃で４５分
間遠心分離にかけた。

【０２０６】ＰＤＥ４Ａを、固体硫酸アンモニウムを添加して高速上澄み液から沈殿させ（
上澄み液０．２６ｇ／ｍＬ）、その間氷を入れた容器内で撹拌しながら、ｐＨを
７．０〜７．５に維持する。ＰＤＥ４Ａを含む沈殿した蛋白質を、Ｂｅｃｋｍａ
ｎＪＡ−１０ロータ内で、９０００ｒｐｍで２２分間の遠心分離で収集する。沈
殿物を５０ｍＬの緩衝液Ｇ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．５，１０μＭのＺｎ
ＳＯ₄，５ｍＭのＭｇＣｌ₂，１００ｍＭのＮａＣｌ，１４．２ｍＭの２メルカプ
トエタノール，２ｍＭベンザミジンＨＣ１，ロイペプチン、ペプスタチン、アプ
ロチニンがそれぞれ５μｇ／ｍＬ、さらにカルパイン阻害剤ＩおよびIIがそれぞ
れ２０μｇ／ｍＬ）内で再懸濁して、０．４５μｍフィルターに通した。

【０２０７】再懸濁したサンプル（５０〜１００ｍＬ）を、緩衝液Ｇ内で平衡させたＰｈａ
ｒｍａｃｉａＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ−３００の５Ｘ１００ｃｍ上
に充填した。酵素活性をフロー速度２ｍＬ／分で抽出し、後の分別のためにプー
ルした。

【０２０８】ゲル濾過クロマトグラフィーから分離したＰＤＥ４Ａを、緩衝液Ａ（５０ｍＭ
のＭＯＰＳｐＨ７．５，１０μＭのＺｎＳＯ₄，５ｍＭのＭｇＣｌ₂，１４．２
ｍＭの２−メルカプトエタノール，１００ｍＭベンザミジンＨＣ１）で平衡化さ
せたｉｇｍａＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＡｇａｒｏｓｅ−ｔｙｐｅ３０
０（１０ｍＬ）の１．６Ｘ２０ｃｍカラムにかけた。カラムを、５０〜１００
ｍＬの緩衝液Ａ、２０ｍＭの５’−ＡＭＰを含む２０〜３０ｍＬの緩衝液Ａ、１
．５ＭのＮａＣｌを含む緩衝液Ａ、１０〜２０ｍＬの緩衝液Ｃ（５０ｍＭ３倍Ｈ
Ｃ１ｐＨ８，１０μＭＺｎＳＯ₄，１４．２ｍＭの２−メルカプトエタノール
，２ｍＭベンザミジンＨＣ１）により連続して洗浄を行った。酵素を、２０ｍＭ
のｃＡＭＰを含む２０〜３０ｍＬの緩衝液Ｃにより溶出した。

【０２０９】ＰＤＥ活性ピークを集め、硫酸アンモニウム（０．３３ｇ／ｍＬ酵素プール）
により沈殿させて、過剰環状ヌクレオチドを除去した。沈殿させた蛋白質を緩衝
液Ｘ（５ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．５，５μＭのＺｎＳＯ₄，５０ｍＭのＮａＣ
ｌ，１ｍＭのＤＴＴ，および１ｍＭベンザミジンＨＣｌ）内で再懸濁して、Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＰＤ−１０（登録商標）カラム上でメーカーの指示通りにゲル
濾過により脱塩した。酵素をドライアイス／エタノール槽内で急速冷凍して、−
７０℃で貯蔵した。この結果生じた調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度が約８０％であった。これ
らの調製物は、毎分蛋白質１ミリグラム当たりｃＡＭＰ約１０〜４０μｍｏｌの
加水分解を示す特異的活性を有していた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＰＤＥ４Ｂの調製酵母細胞（ＨＤＵＮ２．３２を有する１５０ｇの酵母系統ＹＩ２３）を１００
ｍＬのガラスビーズ（０．５ｍＭ、酸洗浄）および１５０ｍＬのＬｙｓｉｓＢｕ
ｆｆｅｒ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．２，２ｍＭのＥＤＴＡ，２ｍＭのＥＧ
ＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ，２ｍＭのベンザミジンＨＣｌ，ペプスタチン、ロイペプ
チン、アプロチニン、カルパイン阻害剤ＩおよびIIがそれぞれ５μｇ／ｍＬ）と
共に室温で混合することにより溶解した。混合物を４℃に冷却し、Ｂｅａｄ−Ｂ
ｅａｔｅｒ（登録商標）に移して、細胞をそれぞれ３０秒間の６サイクルで急速
混合により分解した。ホモジェネートを、ＪＡ−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍ
ａｎＪ２−２１Ｍ遠心分離器で、９０００ｒｐｍ、４℃で、２２分間遠心分離し
た。上澄み液を取り出し、ＴＩ４５ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＸＬ−８０超
遠心分離器で、３６，０００ｒｐｍ、４℃で４５分間遠心分離した。上澄み液を
取り出し、固体硫酸アンモニウムを加えることでＰＤＥ４Ｂを沈殿させ（０．２
６ｇ／ｍＬ上澄み液）、この間氷槽内で撹拌をしながらｐＨを７．０〜７．５に
維持する。次にこの混合物を、ＪＡ−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＪ２Ｍ
遠心分離器で、９０００ｒｐｍ（１２，０００Ｘｇ）で２２分間遠心分離した。
上澄み液を捨てて、ペレットを２００ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐ
Ｈ７．５，５ｍＭのＭｇＣｌ₂，１ｍＭのＤＴＴ，１ｍＭベンザミジンＨＣｌ，
さらにロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニンがそれぞれ５μｇ／ｍＬ）内
で溶解した。ｐＨおよび伝導率をそれぞれ７．５および１５〜２０ｍＳに修正し
た。

【０２１０】再懸濁したサンプルを、緩衝液Ａで平衡化させたＳｉｇｍａＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＡｇａｒｏｓｅ−タイプ３００の１．６Ｘ２００ｃｍカラム（２５ｍＬ）に充填した。サンプルをカラムを通して１２時間で４〜６回循環させた。カラムを１２５〜２５０ｍＬの緩衝液Ａ、１．５ＭのＮａＣｌを含む１２５〜２５０ｍＬの緩衝液Ａ、２５〜５０ｍＬの緩衝液Ａにより連続して洗浄した。酵素を５０〜７５ｍＬの緩衝液Ｅ（５０ｍＭのトリスＨＣｌｐＨ８，２ｍＭのＥＤＴＡ，２ｍＭのＥＧＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ，２ｍＭベンザミジンＨＣ１，および２０ｍＭのｃＡＭＰ）および１ＭのＮａＣｌを含む５０〜７５ｍＬの緩衝液Ｅにより溶出した。ＰＤＥ活性ピークのものを集め、硫酸アンモニウムにより沈殿させて（０．４ｇ／ｍＬ酵素プール）、過剰環状ヌクレオチドを除去する。沈殿した蛋白質を、緩衝液Ｘ（２５ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．５、５μＭのＺｎＳＯ₄、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのベンザミジンＨＣｌ）内で再懸濁して、ＰｈａｒｍａｃｉａＰＤ−１０（登録商標）カラム上で、メーカーの指示に従ってゲル濾過により脱塩した。酵素プールを、５０％グリセロールを含む緩衝液Ｘに対して一晩かけて透析を行った。この酵素はドライアイス／エタノール槽内で急速冷凍して、−７０℃で貯蔵した。

【０２１１】この結果生じた調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度が約９０％より大きかっ
た。これらの調製物は、毎分蛋白質１ミリグラム当たりｃＡＭＰ約１０〜５０μ
ｍｏｌの加水分解を示す特異的活性を有していた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＰＤＥ４Ｃの調製酵母細胞（ＨＤＵＮ３．４８を含む酵母系統ＹＩ３０が１５０ｇ）を、１００
ｍＬのガラスビーズ（０．５ｍＭ、酸洗浄）および１５０ｍＬのＬｙｓｉｓＢｕ
ｆｆｅｒ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．２，２ｍＭのＥＤＴＡ，２ｍＭのＥＧ
ＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ，２ｍＭのベンザミジンＨＣｌ，ペプスタチン、ロイペプ
チン、アプロチニン、カルパイン阻害剤ＩおよびIIがそれぞれ５μｇ／ｍＬ）と
共に室温で混合することにより溶解した。混合物を４℃に冷却し、Ｂｅａｄ−Ｂ
ｅａｔｅｒ（登録商標）に移して、細胞をそれぞれ３０秒間の６サイクルで急速
混合により分解した。ホモジェネートを、ＪＡ−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍ
ａｎＪ２−２１Ｍ遠心分離器で、９０００ｒｐｍ、４℃で、２２分間遠心分離し
た。上澄み液を取り出し、ＴＩ４５ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＸＬ−８０超
遠心分離器で、３６，０００ｒｐｍ、４℃で４５分間遠心分離した。ホモジェネ
ートを、ＪＡ−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＪ２−２１Ｍ遠心分離器で、
９０００ｒｐｍ、４℃で、２２分間遠心分離した。上澄み液を取り出し、固体硫
酸アンモニウムを加えることでＰＤＥ４Ｂを沈殿させ（０．２６ｇ／ｍＬ上澄み
液）、この間氷槽内で撹拌をしながらｐＨを７．０〜７．５に維持する。３０分
後この混合物をＪＡ−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＪ２Ｍ遠心分離器で、
９０００ｒｐｍ（１２，０００Ｘｇ）で２２分間遠心分離した。上澄み液を捨て
て、ペレットを２００ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．５，５ｍ
ＭのＭｇＣｌ₂，１ｍＭのＤＴＴ，２ｍＭベンザミジンＨＣｌ，さらにロイペプ
チン、ペプスタチン、アプロチニンがそれぞれ５μｇ／ｍＬ）内で溶解した。ｐ
Ｈおよび伝導率をそれぞれ７．５および１５〜２０ｍＳに修正した。

【０２１２】再懸濁したサンプルを、緩衝液Ａで平衡化させたＳｉｇｍａＣｉｂａｃｒｏ
ｎＢｌｕｅＡｇａｒｏｓｅ−タイプ３００の１．６Ｘ２００ｃｍカラム（
２５ｍＬ）に充填した。サンプルをカラムを通して１２時間に４〜６回以上循環
させた。カラムを１２５〜２５０ｍＬの緩衝液Ａ、１．５ＭのＮａＣｌを含む１
２５〜２５０ｍＬの緩衝液Ａ、次いで２５〜５０ｍＬの緩衝液Ａにより連続して
洗浄した。酵素を５０〜７５ｍＬの緩衝液Ｅ（５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８，
２ｍＭのＥＤＴＡ，２ｍＭのＥＧＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ，２ｍＭのベンザミジン
ＨＣ１，および２０ｍＭのｃＡＭＰ）および１ＭのＮａＣｌを含む５０〜７５ｍ
Ｌの緩衝液Ｅにより溶出した。ＰＤＥ４Ｃ活性ピークのものを集め、硫酸アンモ
ニウムにより沈殿させて（０．４ｇ／ｍＬ酵素プール）、過剰環状ヌクレオチド
を除去する。沈殿した蛋白質を、緩衝液Ｘ（２５ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．２、
５μＭのＺｎＳＯ₄、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのベンザミ
ジンＨＣｌ）内で再懸濁して、ＰｈａｒｍａｃｉａＰＤ−１０（登録商標）カ
ラム上で、メーカーの指示に従ってゲル濾過により脱塩した。酵素プールを、５
０％グリセロールを含む緩衝液Ｘに対して一晩かけて透析を行った。この酵素は
ドライアイス／エタノール槽内で急速冷凍して、−７０℃で貯蔵した。

【０２１３】この結果生じた調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度が約８０％より高かった
。これらの調製物は、毎分蛋白質１ミリグラム当たりｃＡＭＰ約１０〜２０μｍ
ｏｌの加水分解を示す特異的活性を有していた。

【０２１４】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＰＤＥ４Ｄの調製酵母細胞（ＨＤＵＮ４．１１を含む酵母系統ＹＩ２９が１００ｇ）を、１５
０ｍＬのガラスビーズ（０．５ｍＭ、酸洗浄）および１５０ｍＬのＬｙｓｉｓＢ
ｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．２，１０μＭのＺｎＳＯ₄，２ｍＭ
のＭｇＣｌ₂，１４．２ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭベンザミジン
ＨＣｌ，ペプスタチン、ロイペプチン、アプロチニン、カルパイン阻害剤Ｉおよ
びIIがそれぞれ５μｇ／ｍＬ）と共に室温で混合することにより溶解した。混合
物を４℃に冷却し、Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ（登録商標）に移して、細胞をそれ
ぞれ３０秒間の６サイクルで急速混合により分解した。ホモジェネートを、ＪＡ
−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＪ２−２１Ｍ遠心分離器で、９０００ｒｐ
ｍ、４℃で、２２分間遠心分離した。上澄み液を取り出し、ＴＩ４５ロータを用
いたＢｅｃｋｍａｎＸＬ−８０超遠心分離器で、３６，０００ｒｐｍ、４℃で４
５分間遠心分離した。ホモジェネートを、ＪＡ−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍ
ａｎＪ２−２１Ｍ遠心分離器で、９０００ｒｐｍ、４℃で、２２分間遠心分離し
た。上澄み液を取り出し、ＴＩ４５ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＸＬ−８０超
遠心分離器で、３６，０００ｒｐｍ、４℃で４５分間遠心分離した。上澄み液を
取り出し、固体硫酸アンモニウムを加えることでＰＤＥ４Ｄを沈殿させ（０．３
３ｇ／ｍＬ上澄み液）、この間氷槽内で撹拌をしながらｐＨを７．０〜７．５に
維持する。３０分後この混合物をＪＡ−１０ロータを用いたＢｅｃｋｍａｎＪ２
Ｍ遠心分離器で、９０００ｒｐｍ（１２，０００Ｘｇ）で２２分間遠心分離した
。上澄み液を捨てて、ペレットを１００ｍＬの緩衝液Ａ（５０ｍＭのＭＯＰＳ
ｐＨ７．５，１０μＭのＺｎＳＯ₄、５ｍＭのＭｇＣｌ₂，１４．２ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール，１００ｍＭベンザミジンＨＣｌ，さらにロイペプチン、ペ
プスタチン、アプロチニン、カルパイン阻害剤ＩおよびIIがそれぞれ５μｇ／ｍ
Ｌ）内で溶解した。ｐＨおよび伝導率をそれぞれ７．５および１５〜２０ｍＳに
修正した。

【０２１５】０．６７ｍＬ／分のフロー速度で、再懸濁したサンプルを、緩衝液Ａで平衡化
させたＳｉｇｍａＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅＡｇａｒｏｓｅ−タイプ３０
０の１．６Ｘ２００ｃｍカラム（１０ｍＬ）に充填した。カラムを５０〜１００
ｍＬの緩衝液Ａ、２０ｍＭの５’−ＡＭＰを含む２０〜３０ｍＬの緩衝液Ａ、１
．５ＭのＮａＣｌを含む５０〜１００ｍＬの緩衝液Ａ、次いで１０〜２０ｍＬの
緩衝液Ｃ（５０ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８，１０μＭのＺｎＳ０₄，１４．２ｍ
Ｍの２−メルカプトエタノール，２ｍＭベンザミジンＨＣｌ）により連続して洗
浄した。酵素を２０ｍＭのｃＡＭＰを含む２０〜３０ｍＬの緩衝液Ｃにより溶出
した。

【０２１６】ＰＤＥ４Ｄ活性ピークのものを集め、硫酸アンモニウムにより沈殿させて（０
．４ｇ／ｍＬ酵素プール）、過剰環状ヌクレオチドを除去する。沈殿した蛋白質
を、緩衝液Ｘ（２５ｍＭのＭＯＰＳｐＨ７．２、５μＭのＺｎＳＯ₄、５０ｍ
ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのベンザミジンＨＣｌ）内で再懸濁して
、ＰｈａｒｍａｃｉａＰＤ−１０（登録商標）カラム上で、メーカーの指示に従
ってゲル濾過により脱塩した。酵素プールを、５０％グリセロールを含む緩衝液
Ｘに対して一晩かけて透析を行った。この酵素調製物をドライアイス／エタノー
ル槽内で急速冷凍して、−７０℃で貯蔵した。

【０２１７】この結果生じた調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度が約８０％であった。こ
れらの調製物は、毎分蛋白質１ミリグラム当たりｃＡＭＰ約２０〜５０μｍｏｌ
の加水分解を示す特異的活性を有していた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＰＤＥ５の調製細胞ペレット（２９ｇ）を、等しい体積のＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（２５ｍＭの
トリスＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．２５ｍＭのＤＤＴ、１ｍＭベ
ンザミジン、１０μＭのＺｎＳＯ₄）により氷上で溶解した。細胞を、２０，０
００ｐｓｉの窒素を用いてのＭｉｃｒｏ−ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）（Ｍ
ｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓコーポレーション）内で溶解した。溶解物を遠心分離
器にかけ、０．４５μｍの使い捨てフィルターにより濾過した。濾過物をＱＳ
ＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）
の１５０ｍＬカラムにかけた。カラムを１．５容積の緩衝液Ａ（２０ｍＭビ
ス−トリスプロパン，ｐＨ６．８，１ｍＭのＭｇＣｌ₂，０．２５ｍＭのＤＴ
Ｔ，１０μＭＺｎＳＯ₄）により洗浄し、緩衝液Ａの１２５ｍＭのＮａＣｌの段
状勾配により、続いて緩衝液Ａの１２５〜１０００ｍＭのＮａＣｌの直線勾配に
より溶出した。直線勾配からの活性フラクションを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのビス
−トリスプロパン（ｐＨ６．８），１ｍＭのＭｇＣｌ₂，０．２５ｍＭのＤＴＴ
，１０μＭのＺｎＳＯ₄，２５０ｍＭのＫＣｌ）を含む１８０ｍＬヒドロキシア
パタイトカラムにかけた。充填後、カラムを２容積の緩衝液Ｂで洗浄し、緩衝液
Ｂの０〜１２５ｍＭのリン酸カリウムの直線勾配により溶出した。活性フラクシ
ョンを集め、６０％の硫酸アンモニウムにより沈殿させて、緩衝液Ｃ（２０ｍＭ
ビス−トリスプロパン，ｐＨ６．８，１２５ｍＭのＮａＣｌ，０．５ｍＭのＤ
ＴＴ，１０μＭＺｎＳＯ₄）内で再懸濁した。プールをＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（
登録商標）Ｓ−３００ＨＲの１４０ｍＬカラムにかけて、緩衝液Ｃにより溶
出した。活性フラクションを５０％グリセロールにより希釈して、−２０℃で貯
蔵した。

【０２１８】この結果生じた調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度が約８５％であった。こ
れらの調製物は、毎分蛋白質１ミリグラム当たりｃＧＭＰ約３μｍｏｌの加水分
解を示す特異的活性を有していた。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＰＤＥ７の調製細胞ペレット（１２６ｇ）を溶解し、同容積のＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（５０
ｍＭトリスＨＣ１，ｐＨ８，１ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ，５０ｍＭのＮ
ａＣｌ，２ｍＭのベンザミジンＨＣ１，さらにペプスタチン、ロイペプチン、ア
プロチニンがそれぞれ５μｇ／ｍＬ）により室温で約３０分間かけて懸濁した。
細胞を、Ｂｅａｄ−Ｂｅａｔｅｒ（登録商標）内でガラスビーズ（１２５ｍＬ）
により０〜４℃で、６Ｘ３０秒サイクルで溶解した。溶解物を遠心分離器にかけ
、０．４５μｍの使い捨てフィルターにより濾過した。濾過抽出物（１７８ｍＬ
）を４ｍＬの小部分に分け、ドライアイスで急速冷凍し、−７０の冷凍室で保存
した。これらの調製物は数サイクルの冷凍および解凍に安定であり、毎分蛋白質
１ミリグラム当たりｃＡＭＰ約５０〜１００μｍｏｌの加水分解を示す特異的活
性を有していた。ヒト末梢血液リンパ球からのリポ多糖刺激ＴＮＦαｍｐ遊離ヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）におけるＴＮＦαを減少させる化合物の能力
を評価するために、下記の試験を行った。先行した研究で、プロスタグランジン
Ｅ２１フォルスコリン、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、またはジブチル−ｃＡＭＰのよ
うなｃＡＭＰ−増加因子によりヒトＰＢＬをインキュベートすることで、リポ多
糖（ＬＰＳ、内毒素）により刺激された場合の細胞からのＴＮＦαの分泌を阻害
することが示されていた。これに応じて、ロリプラムのような選択的ＰＤＥ４が
、ヒトリンパ球からのＬＰＳ誘導ＴＮＦα分泌を阻害することを証明するために
、用量依存方法において予備実験を行った。したがって、ヒトＰＢＬからのＴＮ
Ｆα分泌を、細胞内ｃＡＭＰ濃度を高めるおよび／または細胞内におけるＰＤＥ
４活性を阻害する化合物の能力に対する基準として使用した。

【０２１９】ヒト応募者から採取し、ヘパリン処理した血液（約３０ｍＬ）を、ダルベッコ
変法リン酸緩衝生理食塩水と共に１：１の割合で混合した。この混合物をＨＩＳ
ＴＯＰＡＱＵＥ（登録商標）と共に１：１の割合で混合し、Ｂｅｃｋｍａｎモデ
ルＴＪ６遠心分離器の揺動槽内で停止なしに、１５００ｒｐｍ、室温で遠心分離
した。赤血球がチューブの底に分離され、血清はチューブの表面に残存した。リ
ンパ球を含む層を血清とＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ層（登録商標）との間に沈降させ
、新しいチューブへの吸込みにより除去した。細胞の量をはかり、３Ｘ１０⁶細
胞／ｍＬに調整し、１００μＬ分を９６井戸プレートの井戸に配置した。各化合
物およびＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬライフサイエンス）を各井戸に１５
分間加え、次に細菌性ＬＰＳ（２５ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を湿らせた
容器内で３７℃で２０分間インキュベートさせておいた。次に細胞を、８００ｒ
ｐｍ、５分間、室温での遠心分離により分離した。上澄み液１８０μＬ量を新し
いプレートに移し、ＴＮＦα濃度を測定した。細胞上澄み液中のＴＮＦα蛋白質
を、市販されている酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）（ＢｉｏｓｏｕｒｃｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社から出ているＣＴＯＳＣＲＥＥＮ（登録商標）免疫測定キット）を使って測定した。

【０２２０】細胞ベース検定により、本発明の各化合物に対して下記の結果が出た。ＥＣ₅₀ 値（すなわち、全ＴＮＦαの５０％を阻害することのできる化合物の有効濃度）
は、ヒトＰＢＬからのＬＰＳ刺激ＴＮＦα遊離を阻害する本化合物の能力を例証
している。

【０２２１】以下は、ヒト組換え型ＰＤＥ４に対する構造式（Ｉ）および（II）の化合物に
ついて測定されたＩＣ₅₀をまとめている。下記の表で、特に注意がなければ、Ｒ ³ は水素、ｎは１である。

【０２２２】

【化７２】

【０２２３】

【表１】

【０２２４】

【表２】

【０２２５】

【表３】

【０２２６】

【表４】

【０２２７】

【表５】

【０２２８】

【表６】

【０２２９】

【表７】

【０２３０】

【表８】

【０２３１】

【表９】

【０２３２】

【表１０】

【０２３３】

【表１１】

【０２３４】上記に示したデータは、構造式（Ｉ）および（II）の化合物が効能があり、Ｐ
ＤＥ４の選択的阻害剤であること、すなわち各化合物は、約０．１５〜１９５μ
ｍのヒト組換え型ＰＤＥ４に対するＩＣ₅₀を有していることを示している。さら
なる利点として、構造式（Ｉ）および（II）の化合物は、ＣＮＳ（中枢神経系）
効果のような、従来のＰＤＥ４阻害剤に関連する副作用を減ずるまたは除去する
。特に構造式（Ｉ）および（II）の化合物を、細胞ベース分析および動物モデル
において試験したところ、ｉｎｖｉｔｒｏ（生体外）およびｉｎｖｉｖｏ（
生体内）共にＰＤＥ４の阻害に関して化合物の有効性が例証された。

【０２３５】細胞ベース分析により、本発明の種々のピロール化合物について次の結果が得
られた。ＥＣ₅₀値（すなわち、全ＴＮＦαの５０％を阻害することができる化合
物の有効濃度）により、ヒト末梢血液リンパ球からのＬＰＳ刺激ＴＮＦαの遊離
を阻害する本化合物の能力が例証されている。

【０２３６】

【表１２】

【０２３７】上記の表および図１は、ＰＤＥ４活性およびＴＮＦα遊離を阻害する構造式（Ｉ
）および（II）の化合物の能力を例証している。好ましい化合物は、約５００ｎ
Ｍまたはそれ以下の、好ましくは約２００ｎＭまたはそれ以下のＰＢＬ／ＴＮＦ
αＥＣ₅₀を有している。さらに好ましい化合物は、約１００ｎＭまたはそれ以下
のＰＢＬ／ＴＮＦαＥＣ₅₀を有している。

【０２３８】本発明の十分な有利点を達成するためには、化合物は、１００ｎＭまたはそれ
以下のヒト組換え型ＰＤＥ４に対するＩＣ₅₀、および約５００ｎＭまたはそれ以
下のＰＢＬ／ＴＮＦαＥＣ₅₀を有する。より好ましくは、化合物は、約５０ｎＭ
またはそれ以下のＩＣ₅₀および約１００ｎＭまたはそれ以下のＰＢＬ／ＴＮＦα
ＥＣ₅₀を有している。動物モデル哺乳類における血清ＴＮＦαレベルの阻害分析（マウス/ＴＮＦα ＥＤ₅₀ （ｍｇ/ｋｇ））哺乳類における血清ＴＮＦαレベルを減ずる化合物の能力を評価するために、
次の実施要領を用いた。当業者は、先の研究で、ＬＰＳ活性ヒト単球を、ＰＧＥ
２、フォルスコリン、ｄｂｃＡＭＰのようなｃＡＭＰを高めることができる因子
と共にインキュベートすることで、ＴＮＦαの分泌を阻害することが証明された
ことが認識されるだろう。ロリプラムのようなＰＤＥ４阻害剤は、ｃＡＭＰもま
た高め、血清ＴＮＦαも同様に阻害することが発見された。ロリプラムはまた、
ＬＰＳ活性マウスマクロファージからのＴＮＦαの分泌を阻害することも発見さ
れた。したがって、ＰＤＥ４減退化合物のｉｎｖｉｖｏ有効性が、化合物を投
薬することで、かつＬＰＳ注入マウス内の血清ＴＮＦαレベルの減少を測定する
ことで証明された。体重２０〜２５ｇｍの雌Ｃ３Ｈマウスに一晩餌をやらず、腹
膜内投与で試験化合物を適切な媒介物により、ＬＰＳの注射６０分前に投薬した
。次に、５μｇのＬＰＳをマウスの腹腔内に注射した。ＬＰＳ注射の９０分後に
マウスの心臓から血液を採取した。血液を４℃一晩中凝固させておいた。サンプ
ルを微量遠心分離器内で１０分間遠心分離し、血清を除去して、分析に回すまで
−２０℃で貯蔵した。次に、市販されているＥＬＩＳＡキット（ジェンザイム社
）を使って、キットに同封されている実施要領に従ってＴＮＦαの血清レベルを
測定した。媒介物のみを投与したコントロールマウスでの血清ＴＮＦαレベルと
関連させて、化合物による血清ＴＮＦαレベルの阻害を測定した。結果を図１に
まとめた。

【０２３９】化合したマウス内毒素刺激ＴＮＦαの遊離および運動活性評価この研究の目的は、自発的移動性の低下により示される中枢神経系（ＣＮＳ）
副作用に関する測定を伴う、ＬＰＳマウスモデルにおけるｉｎｖｉｖｏでのＰ
ＤＥ４阻害剤の有効性を測定することである。

【０２４０】試験動物は、約２０ｇの平均体重を有する雌のＢaｌｂ／ｃマウスであった。
３０％Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ内で調剤したＰＤＥ４阻害剤を、０
．１、１．０、１０．０、１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射に
より投与した。個々の投与量（約１５０μＬ）は、測定した体重を基に調節した
。１時間後、最終量２００μＬ中の５ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを尾静脈から各動物に
注射した。ＬＰＳ処置後９０分、動物から血液を採取し、血清サンプルを集めて
、−７０℃で分析まで保存した。

【０２４１】有効性測定のために、血清サンプルを２倍に希釈し、ＴＮＦαレベルを、ＣＹ
ＴＯＳＣＲＥＥＮ（登録商標）免疫検定キット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ社）を用いて測定した。データを、試験を行った化合物のそ
れぞれに対する３つのサンプル間で平均した。

【０２４２】副作用を明らかにするために、被験物視覚得点システムを、ＰＤＥ４阻害剤の
投与後５分および２０分後に用いた。媒介物コントロール動物をただ一つの”＋
”と評価し、有効に動きを止め、ほとんど動きが探知できず檻の底部に横たわっ
た動物を”＋＋＋＋”と評価した。あるいは、行動監視のための半自動化「ｏｐ
ｅｎｆｉｅｌｄ」システム（すなわち、ＳａｎＤｉｅｇｏＩｎｓｒｕｍｅ
ｎｔｓ社から販売されているようなＰｈｏｔｏｂｅａｍ活性測定システム）を、
各マウスおよび／またはラットにおけるＰＤＥ４阻害剤の効果を評価するために
使用した。この事例において、被験物を予備設定間隔により監視し続けることが
できた。

【０２４３】Ｘ−Ｙ面の動き、または後ろ足立ちを、単位時間毎に「ライトビーム」を計数
することで量を測った。活動数の減少は動物の機動性または不動性に直接比例す
る。量得点は、上記の被験物測定と見事に相互に関連した。

【０２４４】

【表１３】

【０２４５】¹⁾ トランス−３−（３−シクロペントキシ−４−メトキシフェニル）−１−メト
キシカルボニル−４−メチル−４−（メチルカルボニル）ピロリジン、すなわち
本文に参照として引用されているＦｅｌｄｍａｎら、米国特許第５，６６５，７
５４号の実施例１２。

【０２４６】

【表１４】

【０２４７】上記に示したデータは、構造式構造式（Ｉ）および（II）の化合物が有効であ
り、ＰＤＥ４の選択的阻害剤であることを示している。さらに重要な利点として
、式（Ｉ）および（II）の化合物はまた従来のＰＤＥ４阻害剤に関連したＣＮＳ
副作用を減ずるまたは除去した。式（Ｉ）および（II）の化合物の有効性をさら
に動物モデルにおけるｅｍｅｔｏｇｅｎｉｃ（嘔吐）特性について試験すると、
化合物のさらなる有効性が例証された。ｅｍｅｔｏｇｅｎｉｃ試験の方法および
結果は下記に示している。

【０２４８】本発明の化合物は哺乳類においてＰＤＥ４活性を選択的に阻害するのに有効で
あり、従来のＰＤＥ４阻害剤に関連したＣＮＳおよび嘔吐副作用は認められなか
った。

【０２４９】明らかに、上記した本発明の多くの修正および変形は、その精神および範囲を
逸脱しない限り可能である。したがって、このような限定は付属特許請求により
示されているように課せられるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、血清中のＴＮＦα濃度（ｐｇ／ｍＬ）対ＰＤＥ４阻害剤
濃度のプロットを含む。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 5/14 Ａ６１Ｐ 5/14 9/00 9/00 9/04 9/04 9/10 １０１ 9/10 １０１ 11/00 11/00 11/06 11/06 13/12 13/12 17/00 17/00 17/06 17/06 19/02 19/02 19/10 19/10 25/00 25/00 25/16 25/16 25/22 25/22 25/24 25/24 27/02 27/02 27/16 27/16 29/00 29/00 １０１１０１ 31/04 31/04 33/06 33/06 35/02 35/02 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｄ 401/04 Ｃ０７Ｄ 401/04 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者オリバー，アミーアメリカ合衆国 98021 ワシントンボウゼルエスイー 189番プレイス 3312 (72)発明者ハーテル，カーメン，シィー．アメリカ合衆国 98290 ワシントンスノホミッシュエスイー 176番プレイス 14120 Ｆターム(参考） 4C063 AA01 BB02 CC12 DD04 EE01 4C069 AC06 4C086 AA01 AA02 AA03 BC05 BC17 GA07 GA08 MA01 MA04 NA14 ZA02 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA34 ZA36 ZA40 ZA45 ZA59 ZA66 ZA81 ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB11 ZB13 ZB15 ZB35 ZC20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】【化１】（式中、Ｒ¹は、都合により置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、
ヘテロアリール、アルカリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびヘテロア
ルカリルから構成される群から選択される；Ｒ²は、アルキルまたは水素である；Ｒ³は、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アリール
、ヘテロアリール、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ
）アルキル、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁵Ｒ⁶、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、ＣＯ₂Ｈ
、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、ニトロ、ハロ、アルキルチオ、ＳＯ₂（アルキル）、
ＳＯ₃Ｈおよびハロアルキルから構成される群から選択される；Ｒ⁴およびＲ⁵は、独立に、水素またはアルキルであるか、またはＲ⁵またはＲ⁶ は、一緒になって、５−または６−員炭素環またはヘテロ環を形成する；およびｎは、０から３までであり、ただしＲ²が、エチルである場合、Ｒ¹は、３−ニトロフェニル、２，３−ジク
ロロフェニル、および３，５−ビス−トリフルオロメチルフェニルと異なる）を示す化合物。
【請求項２】Ｒ¹は、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルカリル、ア
ルカリルおよびシクロアルキルから構成される群から選択される請求項１に記載
の化合物。
【請求項３】Ｒ¹は、都合によりＮＲ⁴Ｒ⁵、ハロ、アルキル、Ｃ（＝Ｏ）
アルキル、ＳＯ₂（アルキル）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁵Ｒ⁶、ＳＯ₃Ｈ、ＮＯ₂、ＣＯ₂Ｈ
、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、およびＣＦ₃の１つまたはそれ以上で置換された、ア
リール、ヘテロアリール、シクロアルキル、およびアルカリルから構成される群
から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項４】Ｒ¹は、【化２】【化３】【化４】【化５】【化６】から構成される群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項５】Ｒ²は、水素および低級アルキルから構成される群から選択
される請求項１に記載の組成物。
【請求項６】Ｒ¹は、都合により置換された、フェニル、ピリジル、また
はシクロヘキシルである；Ｒ²は、水素またはＣ₁₂アルキルである；およびｎは
、０である請求項１に記載の組成物。
【請求項７】１−（３−ジメチルアミノフェニル）−２−メチル−５−フ
ェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−クロロフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−クロロフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；５−メチル−２−フェニル−１−ｍ−トリル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン
酸エチルエステル；２−メチル−５−フェニル−１−ｍ−トリル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン
酸エチルエステル；１−（３−ブロモフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−アセチルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール
−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−アセチルフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール
−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−メタンスルホニルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−
ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−メタンスルホニルフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−
ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−カルバモイルフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロ
ール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−カルバモイルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロ
ール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−ジメチルアミノフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピ
ーロル−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−ヨードフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；２−メチル−５−フェニル−１−（３−スルホフェニル）−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；５−メチル−２−フェニル−１−（３−スルホフェニル）−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−フルオロフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール
−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−フルオロフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール
−３−カルボン酸エチルエステル；２−メチル−５−フェニル−１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−ピロール−３−
カルボン酸エチルエステル；１−シクロヘキシル−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カル
ボン酸エチルエステル；５−メチル−１，２−ジフェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエ
ステル；２−メチル−１−（３−ニトロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；５−メチル−１−（５−ニトロピリジン−２−イル）−２−フェニル−１Ｈ−
ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−カルボキシフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロー
ル−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−メトキシカルボニルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ
−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−ブロモフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−ヨードフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；２−メチル−５−フェニル−１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−１Ｈ
−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；５−メチル−２−フェニル−１−（３−トリフルオロメチルフェニル）−１Ｈ
−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；２−メチル−１−（３−ニトロベンジル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；５−メチル−１−（３−ニトロベンジル）−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；５−メチル−２−フェニル−１−ピリジン−３−イル−１Ｈ−ピロール−３−
カルボン酸エチルエステル；２−メチル−１−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；２−メチル−１−（２−ニトロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；２−メチル−１−（５−ニトロピリジン−２−イル）−５−フェニル−１Ｈ−
ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；５−メチル−１−（４−ニトロフェニル）−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；１−（４−アミノフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；１−（４−アミノフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−アミノフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−アミノフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；５−メチル−１−（３−ニトロフェニル）−２−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステル；５−メチル−１，２−ジフェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸；および１−（３−エトキシカルボニルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ
−ピロール−３−カルボン酸エチルエステルから構成される群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項８】１−（３−クロロフェニル）−２−メチル−５−フェニル−
１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−アセチルフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール
−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−カルバモイルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロ
ール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−ジメチルアミノフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピ
ロール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−フルオロフェニル）−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール
−３−カルボン酸エチルエステル；１−シクロヘキシル−２−メチル−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カル
ボン酸エチルエステル；５−メチル−１，２−ジフェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエ
ステル；および２−メチル−１−（３−ニトロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステルから構成される群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項９】１−（３−クロロフェニル）−２−メチル−５−フェニル−
１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−カルバモイルフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロ
ール−３−カルボン酸エチルエステル；１−（３−ジメチルアミノフェニル）−５−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピ
ロール−３−カルボン酸エチルエステル；および２−メチル−１−（３−ニトロフェニル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−
３−カルボン酸エチルエステルから構成される群から選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】約０．５μＭから約２５μＭまでのヒト組換えＰＤＥ４に
対するＩＣ₅₀を示す請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】約１μＭから約２０μＭまでのＰＢＬ／ＴＮＦαＥＣ₅₀を
示す請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】約０．５μＭから約２５μＭまでのヒト組換えＰＤＥ４に
対するＩＣ₅₀、および約１μＭから約２０μＭまでのＰＢＬ／ＴＮＦαＥＣ₅₀を
示す請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】約１００μＭまたはそれ以下のヒト組換えＰＤＥ４に対す
るＩＣ₅₀を示す請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】約５０μＭまたはそれ以下のヒト組換えＰＤＥ４に対する
ＩＣ₅₀を示す請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】約５００μＭまたはそれ以下のＰＢＬ／ＴＮＦαＥＣ₅₀を
示す請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】約１００μＭまたはそれ以下のＰＢＬ／ＴＮＦαＥＣ₅₀を
示す請求項１に記載の化合物。
【請求項１７】約１００μＭまたはそれ以下のヒト組換えＰＤＥ４に対す
るＩＣ₅₀、および約５００μＭまたはそれ以下のＰＢＬ／ＴＮＦαＥＣ₅₀を示す
請求項１に記載の化合物。
【請求項１８】請求項１の化合物および医薬上許容しうる担体を含む医薬
組成物。
【請求項１９】【化７】（式中、Ｒ¹は、都合により置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、
ヘテロアリール、アルカリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびヘテロア
ルカリルから構成される群から選択される；Ｒ²は、アルキルまたは水素である；Ｒ³は、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アリール
、ヘテロアリール、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ
）アルキル、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁵Ｒ⁶、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、ＣＯ₂Ｈ
、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、ニトロ、ハロ、アルキルチオ、ＳＯ₂（アルキル）、
ＳＯ₃Ｈおよびハロアルキルから構成される群から選択される；Ｒ⁴およびＲ⁵は、独立に、水素またはアルキルであるか、またはＲ⁵またはＲ⁶ は、一緒になって、５−または６−員炭素環またはヘテロ環を形成する；およびｎは、０から３までである）を示す化合物の治療上有効な量を、該哺乳類に投与することを特徴とする、ｃＡ
ＭＰ−特異的ＰＤＥの阻害が、治療上の利益のものである症状を示す哺乳類を治
療する方法。
【請求項２０】【化８】（式中、Ｒ¹は、都合により置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、
ヘテロアリール、アルカリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびヘテロア
ルカリルから構成される群から選択される；Ｒ²は、アルキルまたは水素である；Ｒ³は、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アリール
、ヘテロアリール、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ
）アルキル、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁵Ｒ⁶、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、ＣＯ₂Ｈ
、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、ニトロ、ハロ、アルキルチオ、ＳＯ₂（アルキル）、
ＳＯ₃Ｈおよびハロアルキルから構成される群から選択される；Ｒ⁴およびＲ⁵は、独立に、水素またはアルキルであるか、またはＲ⁵またはＲ⁶ は、一緒になって、５−または６−員炭素環またはヘテロ環を形成する；およびｎは、０から３までである）を示す化合物の治療上有効な量を、該哺乳類に投与することを特徴とする、哺乳
類でのｃＡＭＰレベルを調節する方法。
【請求項２１】【化９】（式中、Ｒ¹は、都合により置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、
ヘテロアリール、アルカリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびヘテロア
ルカリルから構成される群から選択される；Ｒ²は、アルキルまたは水素である；Ｒ³は、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アリール
、ヘテロアリール、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ
）アルキル、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁵Ｒ⁶、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、ＣＯ₂Ｈ
、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、ニトロ、ハロ、アルキルチオ、ＳＯ₂（アルキル）、
ＳＯ₃Ｈおよびハロアルキルから構成される群から選択される；Ｒ⁴およびＲ⁵は、独立に、水素またはアルキルであるか、またはＲ⁵またはＲ⁶ は、一緒になって、５−または６−員炭素環またはヘテロ環を形成する；およびｎは、０から３までである）を示す化合物医薬上許容しうる担体；および都合により、二次抗−炎症治療剤を包含する、医薬組成物の治療上有効な量を
、該哺乳類に投与することを特徴とする、ｃＡＭＰ−特異的ＰＤＥの阻害が、治
療上の利益のものである症状を示す哺乳類を治療する方法。
【請求項２２】症状が、アレルギー性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、
関節炎疾患、または皮膚炎である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】症状が、リューマチ様関節炎、変形性関節症、痛風関節炎
、または脊椎炎である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】症状が、甲状関連眼障害、ベーチェット病、敗血症、敗血
症性ショック、内毒性ショック、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、毒性シ
ョック症候群、アレルギー性結膜炎、春季結膜炎、または好酸球肉芽腫である請
求項２１に記載の方法。
【請求項２５】症状が、喘息、慢性気管支炎、アレルギー性鼻炎、成人呼
吸促進症候群、慢性肺炎症性疾患、慢性閉塞性肺疾患、珪肺症、または肺性類肉
腫症である請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】症状が、軽傷の外傷による脳または脊椎外傷としての心筋
層、脳または四肢の再灌流傷害である請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】症状が、腺維症、ケロイド形成、または瘢痕組織形成であ
る請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】症状が、全身性紅斑性狼瘡、移殖拒絶障害、移殖片対宿主
反応、または移殖片拒絶である請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】症状が、慢性糸球体腎炎、炎症性腸炎、クーロン病または
潰瘍性大腸炎である請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】症状が、増殖性リンパ球疾患または白血病である請求項２
１に記載の方法。
【請求項３１】症状が、炎症性皮膚病、アトピー性皮膚炎、乾癬、または
蕁麻疹である請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】症状が、心筋症、うっ血性心不全、アテローム性動脈硬化
症、発熱、悪液質、悪性疾患の感染に対する二次悪液質、後天性免疫不全症候群
に対する二次悪液質、ＡＲＣ、大脳マラリア、骨粗鬆症、骨再吸収疾患、感染に
よる発熱および筋肉痛、尿崩症、中枢神経系障害、うつ病、多発脳梗塞性痴呆、
不安またはストレス反応、大脳虚血、遅発性ジスキネジー、パーキンソン病、お
よび月経前症候群である請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】哺乳類が、最小限の催吐反応を示す請求項２１に記載の方
法。
【請求項３４】哺乳類が、催吐反応から解放されている請求項２１に記載
の方法。
【請求項３５】哺乳類が、最小限の有害な中枢神経系副作用を示す請求項
２１に記載の方法。
【請求項３６】哺乳類が、有害な中枢神経系副作用から解放されている請
求項２１に記載の方法。
【請求項３７】二次抗−炎症性治療剤が、ＴＮＦαを標的にする能力があ
る請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】【化１０】（式中、Ｒ¹は、都合により置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、
ヘテロアリール、アルカリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびヘテロア
ルカリルから構成される群から選択される；Ｒ²は、アルキルまたは水素である；Ｒ³は、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アリール
、ヘテロアリール、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ
）アルキル、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁵Ｒ⁶、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、ＣＯ₂Ｈ
、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、ニトロ、ハロ、アルキルチオ、ＳＯ₂（アルキル）、
ＳＯ₃Ｈおよびハロアルキルから構成される群から選択される；Ｒ⁴およびＲ⁵は、独立に、水素またはアルキルであるか、またはＲ⁵またはＲ⁶ は、一緒になって、５−または６−員炭素環またはヘテロ環を形成する；およびｎは、０から３までである）を示す化合物の治療上有効な量を、該哺乳類に投与することを特徴とする、哺乳
類でのＴＮＦレベルを減少させる方法。
【請求項３９】【化１１】（式中、Ｒ¹は、都合により置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、
ヘテロアリール、アルカリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびヘテロア
ルカリルから構成される群から選択される；Ｒ²は、アルキルまたは水素である；Ｒ³は、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アリール
、ヘテロアリール、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ
）アルキル、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁵Ｒ⁶、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、ＣＯ₂Ｈ
、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、ニトロ、ハロ、アルキルチオ、ＳＯ₂（アルキル）、
ＳＯ₃Ｈおよびハロアルキルから構成される群から選択される；Ｒ⁴およびＲ⁵は、独立に、水素またはアルキルであるか、またはＲ⁵またはＲ⁶ は、一緒になって、５−または６−員炭素環またはヘテロ環を形成する；およびｎは、０から３までである）を示す化合物の治療上有効な量を、該哺乳類に投与することを特徴とする、哺乳
類での炎症性細胞活性化を抑制する方法。
【請求項４０】【化１２】（式中、Ｒ¹は、都合により置換されたアルキル、シクロアルキル、アリール、
ヘテロアリール、アルカリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびヘテロア
ルカリルから構成される群から選択される；Ｒ²は、アルキルまたは水素である；Ｒ³は、アルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ヒドロキシ、アリール
、ヘテロアリール、アリールオキシアルキル、アラルコキシアルキル、Ｃ（＝Ｏ
）アルキル、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ⁵Ｒ⁶、Ｃ（＝Ｏ）Ｏアルキル、ＣＯ₂Ｈ
、ＯＣ（＝Ｏ）アルキル、ニトロ、ハロ、アルキルチオ、ＳＯ₂（アルキル）、
ＳＯ₃Ｈおよびハロアルキルから構成される群から選択される；Ｒ⁴およびＲ⁵は、独立に、水素またはアルキルであるか、またはＲ⁵またはＲ⁶ は、一緒になって、５−または６−員炭素環またはヘテロ環を形成する；およびｎは、０から３までである）を示す化合物の治療上有効な量を、該哺乳類に投与することを特徴とする、哺乳
類でのＰＤＥ４機能を阻害する方法。