CN1434799A - 环腺苷酸－特异性磷酸二酯酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

公开具有结构式(I)或(II)的吡咯化合物以及制备相同化合物的方法，所述化合物是有效的和选择性PDE4抑制剂。也公开了所述化合物在治疗炎性疾病和其它与细胞因子水平升高有关的疾病，以及中枢神经系统(CNS)疾病中的用途。

Description

环腺苷酸-特异性磷酸二酯酶抑制剂
                 相关申请的相互参考
本申请要求1999年12月23日提出的临时申请序号60/171,954的权益。
本发明的领域
本发明涉及一系列为有效和选择性环腺苷酸特异性磷酸二酯酶(cAMP特异性PDE)抑制剂的化合物。本发明尤其涉及一系列用于抑制(cAMP特异性PDE)功能，尤其是PDE4功能的新的吲唑化合物以及制备它们的方法、含有它们的药用组合物和它们作为例如治疗炎性疾病和其它涉及细胞因子和促炎介质水平升高的疾病的治疗药的用途。
                 本发明背景
慢性炎症为一种多因素并发症，其特征为激活多种类型的炎性细胞，尤其是淋巴系细胞(包括T淋巴细胞)和骨髓系细胞(包括有粒白细胞、巨噬细胞和单核细胞)。包括细胞因子例如肿瘤坏死因子(TNF)和白介素-1(IL-1)的促炎介质由这些激活的细胞产生。因此，抑制这些细胞的激活或抑制它们产生促炎细胞因子的药物将用于治疗性治疗炎性疾病和其它涉及细胞因子水平升高的疾病。
环腺苷酸(cAMP)为一种介导细胞对于广泛的胞外刺激的生物应答的第二信使。当合适的激动剂与特异性细胞表面受体结合时，激活腺苷酸环化酶，使腺苷三磷酸(ATP)转化为cAMP。理论上在细胞内诱导cAMP作用的所述激动剂主要由cAMP-依赖性蛋白激酶的作用介导。cAMP的细胞内作用由该核苷酸转运到细胞的外部或由环核苷酸磷酸二酯酶(PDEs)的酶促裂解作用所中止，PDEs水解3’-磷酸二酯键以形成5’-腺苷酸(5’-AMP)。5’-AMP为一种失活的代谢物。以下说明cAMP和5’-AMP的结构。
Figure A0081910900191
在人骨髓系细胞和淋巴系细胞中cAMP水平的升高与抑制细胞激活有关。因此，细胞内PDEs酶家族调节细胞内cAMP的水平。PDE4为这些细胞中的主要的PDE同种型并且主要影响cAMP降解。因此，抑制PDE的功能将防止cAMP转化为失活的代谢物5’-AMP，从而维持较高的cAMP水平，因而抑制细胞激活(参见Beavo等，“CyclicNucleotide Phosphodiesterases：Structure，Regulation and Drug Action，”Wiley and Sons，Chichester，第3-14页(1990))；Torphy等，Drug News andPerspectives，6，第203-214页(1993)；Giembycz等，Clin.Exp.Allergy，22，第337-344页(1992))。
尤其是，已证明PDE4抑制剂例如咯利普兰抑制TNFα的产生并且部分抑制单核细胞释放IL-1β(参见Semmler等，Int.J.Immunopharmacol.，15，第409-413页(1993)；Molnar-Kimber等，Mediators of Inflammation，1，第411-417页(1992))。还证明了PDE4抑制剂抑制由人多形核白细胞产生超氧化物自由基(参见Verghese等，J.Mol.Cell.Cardiol.，21(增补2)，S61(1989)；Nielson等，J.AllergyImmunol.，86，第801-808页(1990))；抑制血管活性胺和前列腺素类由人嗜碱性粒细胞的释放(参见Peachell等，J.Immunol.，148，第2503-2510页(1992))；抑制嗜酸性粒细胞的呼吸爆发(参见Dent等，J.Pharmacol.，103，第1339-1346页(1991))；以及抑制人T-淋巴细胞的激活(参见Robicsek等，Biochem.Pharmacol.，42，第869-877页(1991))。
炎性细胞的激活和过量的或非调节性细胞因子(例如TNFα和IL-1β)的产生与以下变应性、自身免疫和炎性疾病有关：如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、脊椎炎、与甲状腺有关的眼病、贝赫切特病、脓毒病、败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、中毒性休克综合征、哮喘、慢性支气管炎、成人呼吸窘迫综合征、慢性肺炎例如慢性阻塞性肺炎、硅肺、肺结节病、心肌、脑和肢端再灌注损伤、纤维变性、胰囊性纤维变性、瘢痕疙瘩形成、疤痕形成、动脉粥样硬化、移植排斥反应例如移植物抗宿主的反应和同种移植排斥反应、慢性肾小球性肾炎、红斑狼疮、炎性肠疾病例如局限性回肠炎和溃疡性结肠炎、增生性淋巴细胞疾病例如白血病以及炎性皮肤疾病例如特应性皮炎、牛皮癣和荨麻疹。
特征在于细胞因子水平升高的其它疾病包括由于中度的外伤引起的脑损伤(参见Dhillon等，J.Neurotrauma，12，第1035-1043页(1995)；Suttorp等，J.Clin.Invest.，91，第1421-1428页(1993))、心肌病例如充血性心力衰竭(参见Bristow等，Circulation，97，第1340-1341页(1998))、恶病质、感染或恶性肿瘤继发的恶病质、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)继发恶病质、ARC(AIDS相关复症)继发的恶病质、由于感染引起的发烧和肌痛、脑型疟、骨质疏松和骨吸收疾病、瘢痕疙瘩形成、疤痕形成和发热。
尤其是，已经证实TNFα对于人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)具有作用。AIDS是由于T-淋巴细胞感染人免疫缺陷病毒(HIV)引起的。尽管HIV也感染并存在于骨髓系细胞中，已经证实TNF上调T-淋巴细胞和单核细胞中的HIV感染(参见Poli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，第782-785页(1990))。
TNFα的几种性质例如刺激胶原酶、刺激体内血管生成、刺激骨吸收和能够增加肿瘤细胞与内皮的附着的性质与TNF对肿瘤在宿主体内形成和转移扩散的作用是一致的。最近报道，TNFα直接参与促进肿瘤细胞的生长和转移(参见Orosz等，J.Exp.Med.，177，第1391-1398(1993))。
PDE4具有广泛的组织分布。对于PDE4具有至少4种基因，来自任一给定基因的PDE4的多种转录物能够产生共有相同催化位点的几种不同的蛋白。在4种可能的催化位点之间氨基酸的同一性大于85％。它们对抑制剂的同样敏感性和它们的动力学相似性反映了这个水平的氨基酸的同一性的功能方面作用。推测这些可变表达的PDE4蛋白的作用在于细胞通过这种作用可以区别性细胞内定位这些酶和/或通过翻译后修饰调节所述催化效率。表达PDE4酶的任一给定的细胞类型通常表达编码这些蛋白的4种可能的基因中的至少一种。
研究者已经表现出对使用PDE4抑制剂作为抗炎药物的极大兴趣。早期的证据显示抑制PDE4对于各种炎性细胞例如单核细胞、巨噬细胞、所述Th-1系的T-细胞和有粒白细胞具有有益的作用。许多促炎介质例如细胞因子、脂质介质、超氧化物和生物胺例如组胺的合成和/或释放通过PDE4抑制剂的作用在这些细胞中已经减弱。PDE4抑制剂也影响其它细胞功能包括T-细胞增殖、有粒白细胞对于化学毒性物质反应的移行和微管结构内内皮细胞连接的完整性。
已经报告了各种PDE4抑制剂的设计、合成和筛选。甲基黄嘌呤例如咖啡因、茶碱是最初被发现的PDE抑制剂，但是，这些化合物对于被抑制的PDE是非特异性的。药物咯利普兰(抗抑郁药)是最初报道的特异性PDE4抑制剂之一。已经报道，具有以下结构式的咯利普兰具有对于抑制重组人PDE4的约200nM(纳摩尔)的50％抑制浓度(IC50)。
                    咯利普兰
研究者一直在继续寻找PDE4抑制剂，它们对于抑制PDE4更有效，它们具有比咯利普兰更低的IC50值，它们避免了与给予咯利普兰有关的不需要中枢神经系统(CNS)的副作用例如干呕、呕吐和镇静作用。在Feldman等的美国专利号5,665,754中公开了一类化合物。其中所公开的化合物为具有与咯利普兰结构类似的取代的吡咯烷。一种具有下面结构式的具体的化合物具有对于人重组PDE4的IC50为约2nM。由于观察到可有利地将催吐副作用与效果分开，这些化合物没有显示降低不需要的中枢神经系统作用。
此外，有几家公司正在进行其它PDE4抑制剂的临床试验。然而，涉及效果和不利的副作用例如呕吐和中枢神经系统紊乱的问题仍未解决。
因此，选择性抑制PDE4并降低或消除与在先的PDE4抑制剂有关的不利的中枢神经系统副作用的化合物将用于治疗变应性和炎性疾病以及其它与细胞因子例如TNF过度或未控制产生有关的疾病。此外，选择性PDE4抑制剂将用于治疗与在具体靶组织中升高的cAMP水平或PDE4功能有关的疾病。
                    本发明概述
本发明涉及用于治疗其中抑制PDE4活性是非常有益的疾病和病症的有效和选择性PDE4抑制剂。本发明的PDE4抑制剂出人意料地降低或消除与在先的PDE4抑制剂有关的不利的中枢神经系统副作用。
本发明尤其涉及具有结构式(I)或(II)的吡咯化合物：
Figure A0081910900231
其中R1选自任选取代的芳基、烷基、环烷基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；
R2为烷基或氢；
R3选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、芳基、杂芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、卤代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和卤代烷基；
R4和R5独立为氢或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳环或杂环；和
n为0到3。
本发明也涉及含有一个或多个结构式(I)或(II)的化合物的药用组合物，涉及所述化合物和含有所述化合物的组合物在治疗疾病或紊乱中的用途，并涉及制备所述化合物以及与合成结构式(I)和(II)的化合物有关的中间体的方法。
                         附图简述
图1为血清中TNFα浓度(pg/ml)对PDE4抑制剂浓度所绘制的图。
                      优选的实施方案详述
本发明涉及具有结构式(I)或(II)的化合物：
Figure A0081910900241
其中
R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；
R2为烷基或氢；
R3选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、芳基、杂芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、卤代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和卤代烷基；
R4和R5独立为氢或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳环或杂环；和
n为0到3。
如在此所使用的，术语“烷基”，单独或者结合，定义为包括直链和支链、以及桥连的、含1-16个碳原子的饱和烃基。术语“低级烷基”此处定义为具有1-6个碳原子的烷基(C1-C6)。低级烷基的实例包括，但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、异丁基、正丁基、新戊基、正己基等。
术语“桥连的烷基”此处定义为C6-C16的双环或多环烃基，例如降冰片基、金刚烷基、双环[2.2.2]辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基或十氢萘基。
术语“环烷基”此处定义为包括环C3-C7烃基。环烷基的实例包括，但不限于环丙基、环丁基、环己基和环戊基。
术语“卤代烷基”此处定义为被一个或更多个卤代取代基例如氟代基、氯代基、溴代基、碘代基或者其组合取代的烷基。类似地，“卤代环烷基”定义为具有一个或更多个卤代取代基的环烷基。
术语“芳基”，单独或结合，此处定义为单环或多环的芳族基团，优选单环或双环的芳族基团，例如苯基或萘基，它们可以为未取代的或者例如被一个或更多个，尤其一个或三个选自以下的取代基取代：卤代基、烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、烷硫基、烷基亚磺酰基和烷基磺酰基。实例性的芳基包括苯基、萘基、四氢萘基、2-氯代苯基、3-氯代苯基、4-氯代苯基、2-甲基苯基、4-甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、4-硝基苯基等。
术语“杂芳基”此处定义为含有一个或者两个芳族环并且在芳环上含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或双环系，该环系可以为未取代的或者例如被一个或更多个，尤其1-3个如下的取代基取代：卤代基、烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、烷硫基、烷基亚磺酰基和烷基磺酰基。杂芳基的实例包括噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、三唑基、异噻唑基、异噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
术语“芳基烷基”此处定义为在先定义的烷基，其中所述烷基的氢原子之一被如此处定义的芳基例如任选具有一个或更多个取代基例如卤代基、烷基、烷氧基等的苯基置换。芳基烷基的实例是苄基。
术语“烷基芳基”此处定义为在先定义的芳基，其中所述芳基的氢原子之一被烷基、环烷基、卤代烷基或卤代环烷基置换。
术语“杂芳基烷基”和“杂烷基芳基”类似如术语“芳基烷基”和“烷基芳基”所定义，然而，所述芳基被如在先定义的杂芳基置换。
术语“杂环基”或“杂环基环”定义为具有一个或更多个存在于环中的选自氧、氮和硫原子的杂原子的5-或6-元非芳族环。非限制性的实例包括四氢呋喃、哌啶、哌嗪、环丁砜、吗啉、四氢吡喃、二氧六环等。“碳环基环”具有类似的定义，但所述环上只含有碳原子。
术语“卤素”或“卤代基”此处定义为包括氟、氯、溴和碘。
术语“烷氧基”、“芳基氧基”和“芳基烷氧基”分别定义为-OR，其中R为烷基、芳基和芳基烷基。
术语“烷氧基烷基”定义为连接烷基的烷氧基。术语“芳基氧基烷基”和“芳基烷氧基烷基”类似地定义为连接烷基的芳基氧基或芳基烷氧基。
术语“羟基”定义为-OH。
术语“羟基烷基”定义为连接烷基的羟基。
术语“氨基”定义为-NH2。
术语“烷基氨基”定义为-NR2，其中至少一个R为烷基，第二个R为烷基或氢。
术语“酰基氨基”定义为RC(＝O)NH，其中R为烷基或芳基。
术语“硝基”定义为-NO2。
术语“烷硫基”定义为-SR，其中R为烷基。
术语“烷基亚磺酰基”定义为R-S(O)2，其中R为烷基。
术语“烷基磺酰基”定义为R-S(O)3，其中R为烷基。
在优选的实施方案中，R1选自芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基和环烷基；R2选自氢和低级烷基。
在最优选的实施方案中，R1为芳基、杂芳基、环烷基或芳烷基，所述基团任选由一个或多个以下基团取代：NR4R5、卤代基、烷基、C(＝O)烷基、SO2(烷基)、C(＝O)NR4R5、SO3H、NO2、CO2H、C(＝O)O烷基和三氟甲基；R2为氢或C1-2烷基，而R3为氢。R1典型为任选取代的苯基或吡啶基，而R2为氢或乙基。
本发明包括结构式(I)和(II)化合物的所有可能的立体异构体和几何异构体，并且不仅包括外消旋化合物而且也包括光学活性异构体。当需要结构式(I)和(II)化合物的单一的对映体时，通过拆分终产物或者通过由异构体纯的原料或者使用手性辅助剂(例如参见Z.Ma等，Tetrahedron：Asymmetry，8(6)，第883-888页(1997))立体有择合成可以得到该单一的对映体。终产物、中间体或者原料的拆分可以通过本领域已知的任何合适的方法完成。此外，在其中结构式(I)和(II)化合物的互变异构体可能存在的情况下，本发明意欲包括所述化合物的所有互变异构形式。如此后所证明的，特定的立体异构体显示抑制PDE4的优越的能力，并且不显示通常与PDE4抑制剂有关的不利的中枢神经系统副作用。
含有酸性基团的结构式(I)和(II)化合物可以与合适的阳离子形成药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的阳离子包括碱金属(例如钠或钾)和碱土金属(例如钙或镁)阳离子。含有碱性中心的结构式(I)和(II)化合物的药学上可接受的盐为与药学上可接受的酸形成的酸加成盐。实例为盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐、乙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。根据前文所述，任何本文中提到的本发明化合物意欲包括结构式(I)和(II)化合物以及其药学上可接受的盐和溶剂合物。
本发明的化合物可以作为纯的化学品在治疗上给药，但是优选作为药用组合物或制剂给予结构式(I)和(II)化合物。因此，本发明还提供含有结构式(I)和/或(II)化合物或其药学上可接受的盐以及一种或更多种药学上可接受的载体并任选其它治疗和/或预防成分的药用制剂。所述载体在与所述制剂中的其它成分相容并且不损害其接受者的意义上为“可接受的”。
尤其是，本发明的选择性PDE4抑制剂可以单独使用或与第二种抗炎治疗药联合使用，例如所述第二种抗炎治疗药为用于治疗类风湿性关节炎的靶向TNFα的治疗药如ENBREL或REMICADE。同样，IL-1的拮抗作用的治疗用途在类风湿性关节炎的动物模型中也已经得到证明。因此，想象IL-1的拮抗作用与减弱TNFα的PDE4抑制作用结合将是有效的。
本发明的PDE4抑制剂用于治疗各种变应性、自身免疫和炎性疾病。
术语“治疗”包括预防、降低、阻止或逆转所治疗疾病或症状严重的进程。如此，术语“治疗”包括适当地医学治疗和/或预防给药。
炎症尤其是一种局部、保护性反应，它是由组织的损伤或破坏引起的，它可以破坏、稀释或隔绝(即隔离)有害物质和受损的组织。如此处所用的术语“炎性疾病”，指任何其中过量或非调节性炎性反应导致过量的炎性症状、宿主组织损伤或丧失组织功能的疾病。此外，如此处所用的术语“自身免疫疾病”指任何种类的其中组织损伤与对于身体自身成分的体液或细胞调节反应有关的疾病。如此处所用的术语“变应性疾病”指由变态反应产生的任何症状、组织损伤或组织功能丧失。如此处所用的术语“关节疾病”指特征在于各种病因引起的关节炎性损伤的一大类疾病。如此处所用的术语“皮炎”指特征在于各种病因引起的皮肤炎症的一大类皮肤疾病。如此处所用的术语“移植排斥”指特征在于移植组织和周围的组织功能丧失、疼痛、肿胀、白细胞增多和血小板减少的直接针对移植组织(包括器官和细胞(例如骨髓))的任何免疫反应。
本发明也提供调节哺乳动物体内cAMP水平的方法以及治疗特征为细胞因子水平升高的疾病的方法。
如此处所用的术语“细胞因子”指任何分泌的多肽，该多肽影响其它细胞的功能并调节所述免疫或炎性反应中细胞之间的相互作用。细胞因子包括，但不限于单核因子、淋巴因子和趋化因子而不管是那些细胞产生它们。例如，单核因子通常指由单核细胞产生和分泌的因子，然而，许多其它细胞产生单核因子例如天然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、内皮细胞、脑星形胶质细胞、骨髓基质细胞、表皮角质细胞和B-淋巴细胞。淋巴因子通常指由淋巴细胞产生的因子。细胞因子的实例包括，但不限于白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和肿瘤坏死因子β(TNFβ)。
本发明还提供降低哺乳动物体内TNF水平的方法，该方法包括给予所述哺乳动物有效量的结构式(II)的化合物。如此处所用的术语“降低TNF水平”指以下情况之一：
a)通过抑制所有细胞包括，但不限于单核细胞或巨噬细胞体内释放TNF，降低哺乳动物体内过量的TNF水平到正常水平或者低于正常水平；或
b)在翻译或转录水平诱导哺乳动物体内过量TNF水平下调到正常水平或者低于正常水平；或
c)通过抑制作为翻译后事件的直接合成TNF诱导下调。
此外，本发明化合物用于抑制炎性细胞激活。如此处所用的术语“炎性细胞激活”指由刺激(包括，但不限于细胞因子、抗原或自身抗体)诱导的增殖性细胞反应，产生可溶性的介质(包括，但不限于细胞因子、氧自由基、酶、前列腺素类或血管活性胺)或者在炎性细胞(包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、有粒白细胞、多形核白细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞和内皮细胞)中，新的或增加数量的介质(包括，但不限于主要组织相容性抗原或细胞粘着分子)的细胞表面表达。本领域技术人员可以理解这些细胞的这类表型中的一种或其组合的激活可引起炎症的发生、延长或恶化。
本发明化合物也用于引起气道平滑肌松弛、支气管扩张和防止支气管收缩。
因此，本发明化合物用于治疗以下疾病例如关节疾病(类风湿性关节炎)、骨关节炎、痛风性关节炎、脊椎炎、与甲状腺有关的眼病、贝赫切特病、脓毒病、败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、中毒性休克综合征、哮喘、慢性支气管炎、变应性鼻炎、过敏性结膜炎、春季结膜炎、朗格斯细胞肉芽肿病、成人(急性)呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性肺炎(例如慢性阻塞性肺炎)、硅肺、肺结节病、心肌、脑或肢端再灌注损伤、由于轻度外伤引起的脑或脊柱损伤、包括胰囊性纤维变性的纤维变性、瘢痕疙瘩形成、疤痕形成、动脉粥样硬化、自身免疫疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)和移植排斥反应(例如移植物抗宿主(GvH)的反应和同种移植排斥反应)、慢性肾小球性肾炎、炎性肠疾病例如局限性回肠炎和溃疡性结肠炎、增生性淋巴细胞疾病如白血病(例如慢性淋巴细胞白血病；CLL)(参见Mentz等，Blood 88，第2172-2182(1996))以及炎性皮肤疾病例如特应性皮炎、牛皮癣或荨麻疹。
这类疾病或有关症状的其它实例包括心肌病例如充血生心力衰竭、发热、恶病质、感染或恶性肿瘤继发的恶病质、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)继发恶病质、ARC(AIDS相关复症)、脑型疟、骨质疏松和骨吸收疾病以及由于感染引起的发烧和肌痛。此外本发明化合物用于治疗尿崩症和中枢神经系统疾病例如抑郁症和多梗死性痴呆。
本发明化合物也具有通常称作治疗药以外的用途。例如，本发明化合物也可以用作器官移植的保存剂(参见Pinsky等，J.Clin.Invest.，92，第2994-3002页(1993))。
选择性PDE4抑制剂也可以用于治疗尿崩症(Kidney Int.，37，第362页，(1990)；Kidney Int.，35，第494页，(1989))和中枢神经系统疾病例如多梗死性痴呆(Nicholson，Psychopharmacology，101，第147页(1990))、抑郁症(Eckman等，Curr.Ther.Res.，43，第291页(1988))、焦虑症和应激反应(Neuropharmacology，38，第1831页(1991))、脑局部缺血(Eur.J.Pharmacol.，272，第107页(1995))、迟发性运动障碍(J.Clin.Pharmocol.，16，第304页(1976))、帕金森氏病(参见Neurology，25，第722页(1975)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，26，第421页(1999))和经前综合征。对于抑郁症而言，PDE4选择性抑制剂在各种抑郁症的动物模型例如“行为绝望”或Porsolt试验(Eur.J.Pharmacol.，47，第379页(1978)；Eur.J.Pharmacol.，57，第431页(1979)；Antidepressants：neurochemical，behavioral and clinical prospectives，Enna，Malick，andRichelson，eds.，Raven Press，第121页(1981))和“尾悬浮试验”(Psychopharmacology，85，第367页(1985))中显示有效。最新的研究成果显示通过各种抗抑郁药长期体内治疗增加PDE4的脑性表达(J.Neuroscience，19，第610页(1999))。因此，选择性PDE4抑制剂可以单独使用或者与第二种治疗结合使用，四种主要的抗抑郁治疗为电惊厥方法、单胺氧化酶抑制剂和5-羟色胺或去甲肾上腺素的选择性重摄取抑制剂。选择性PDE4抑制剂也可以用于借助直接作用于支气管平滑肌细胞来调节支气管扩张活性用于治疗哮喘。
适用于本发明中的化合物和药用组合物包括其中所述活性成分以有效量给予，以便达到其预定治疗目的的化合物和药用组合物。更准确地说，“治疗有效量”指有效防止所治疗患者已有症状发展或者缓解该症状的量。该有效量的确定完全在本领域技术人员的知识范围内(特别是参照本发明所公开的细节)。
“治疗有效剂量”指达到所需的作用的所述化合物的量。这类化合物的毒性和治疗效果可以在细胞培养中或者实验动物中通过标准药学方法确定，例如确定LD50(群体的50％致死的剂量)和ED50(群体的50％治疗有效剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比例为治疗指数，它表示为LD50和ED50间的比值。优选显示高的治疗指数的化合物。由这类数据得出的资料可以用于计算用于人的剂量范围。这类化合物的剂量优选在包括几乎没有或者没有毒性的ED50的循环浓度范围内。根据所使用的剂型和所用的给药途径，所述剂量可以在该范围内变化。
精确的处方、给药途径和剂量可以由每个医生根据患者的病情来选择。可以个别调整剂量和间隔时间以便提供足以维持治疗效果的活性部分的血药浓度。
如本领域技术人员可以理解的，此处所述的治疗可以延伸到预防以及治疗已确诊的疾病或者症状。还可以理解，所需用于治疗的本发明的化合物的量根据所治疗疾病的性质、患者的年龄和状况而变化，并且最终由主治医生或兽医决定。然而，一般来说用于成人治疗的常用剂量在每日0.001mg/kg至约100mg/kg。所需剂量可以方便地以单一剂量给予或以合适的间隔时间，以多剂量给予，例如每日两个、三个、四个或更多个亚剂量给予。在实践当中，医生决定最适合于每个患者的实际给药方案，所述剂量根据具体患者的年龄、体重和反应而改变。以上剂量为平均情况下的实例，但可能有个别情况，其中需要较高或较低的剂量，这也在本发明的范围内。
本发明的制剂可以以用于治疗所指定疾病的标准方式给予，例如口服、非肠道、经粘膜(例如舌下或者口含给药)、局部、经皮、直肠、经吸入(例如鼻或者肺深部吸入)。非肠道给药包括，但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鞘内和关节内。胃肠外给药也可以使用高压技术象POWDERJECTTM完成。
对于口含给药而言，所述组合物可以是以常规方式配制的片剂或者锭剂形式。例如，用于口服给予的片剂和胶囊可以含有常规的赋形剂例如粘合剂(例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、淀粉浆或者聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(例如乳糖、蔗糖、微晶纤维素、纤维素、玉米淀粉、磷酸钙或者山梨糖醇)、润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、聚乙二醇或者二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或者羟基乙酸淀粉钠)或者润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。可以根据本领域熟知的方法将所述片剂包糖衣。
或者，本发明的化合物可以掺入口服液体制剂例如水性或者油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或者酏剂中。而且，含有这些化合物的制剂可以作为用水或者其它合适的溶媒在使用前构成的干燥产品提供。这类液体制剂可以含有常规的添加剂例如悬浮剂，如山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或者阿拉伯胶；非水性溶媒(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分级椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇；和防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或者丙酯和山梨酸。
这类制剂也可以配制为栓剂，例如含有常规的栓剂基质如可可脂或者其它甘油酯。用于吸入的组合物一般可以以溶液、悬浮液或者乳液的形式提供，它们可以以干粉或者以使用常规抛射剂(例如二氯二氟甲烷或者三氯氟甲烷)的气溶胶的形式给予。典型的局部和经皮制剂含有常规含水或者非水介质，例如为滴眼剂、霜剂、软膏、洗剂和糊剂或者为加药的膏药、贴剂或者膜剂的形式。
此外，本发明的组合物可以配制用于经注射或者连续输注非肠道给予。注射剂可以是在油性或者水性溶媒中的悬浮剂、溶液剂或者乳剂形式并且可以含有组方剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述活性成分可以是在使用前用合适的溶媒(例如无菌、无热源水)构成的粉末形式。
本发明的组合物也可以配制为储库型制剂。这类长效制剂可以植入给予(例如皮下或者经粘膜)或者通过肌内注射给予。因此，本发明的化合物可以与合适的聚合物或者疏水性物质(例如在可接受的油中的乳剂)、离子交换树脂一起或者作为微溶的衍生物(例如微溶的盐)配制。
对于兽医使用而言，式(I)或(II)化合物或其非毒性盐作为根据常规兽医实践的可合适接受的制剂给予。兽医可以容易地确定最适合具体动物的给药方案和给药途径。
因此，本发明另一方面提供含有式(I)或(II)化合物以及药学上可接受的稀释剂或者载体的药用组合物。本发明进一步提供制备含有式(I)或(II)化合物的药用组合物的方法，该方法包括将式(I)或(II)化合物与药学上可接受的稀释剂或者载体混合。
以下提供结构式(I)和(II)化合物的具体的、非限制性实施例，其合成根据以下给出的方法进行。
一般而言，结构式(I)和(II)的化合物可以根据以下合成方案制备。在下述方案中，本领域内可以理解，当需要时，根据合成化学的一般原理可以使用保护基团。这些保护基团在合成的最终步骤中可以在碱性、酸性或者本领域技术人员显而易见的氢解条件下除去。通过使用合适地处理和保护任何化学官能团，未在本文中专门提到的结构式(I)和(II)的化合物的合成可以通过与以下提出的方案类似的方法完成。
除非另外指出，所有的原料均从供应商处获得并且未经进一步纯化而使用。所有反应物和层析流分通过薄层层析，在250mm硅胶板上分析，用UV(紫外)光或者I2(碘)染色目测观察。用Biotage 40M硅胶(230-400目)进行快速柱层析。产物和中间体经快速层析或者反相HPLC纯化。
按照以下阐述，结构通式(I)的化合物通过下述方法制备，使具有下式的化合物
Figure A0081910900351
与金属钠反应产生一种负碳离子，然后该负碳离子与一种具有下式的化合物反应
Figure A0081910900352
其中Hal为一个卤代基、典型的为溴，产生一种具有下式的中间体化合物
Figure A0081910900353
然后使该中间体化合物与一种具有式R1NH2的伯胺反应，以提供一种结构式(I)的化合物。
结构式(II)化合物通过下述方法制备，使具有下式的化合物与氯丙酮反应产生一种具有下式的中间体化合物。
Figure A0081910900362
然后使该中间体化合物与一种具有式R1NH2的伯胺反应，以提供一种结构式(II)的化合物。中间体1 制备3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯
Figure A0081910900363
在氮气下，将金属钠(60mmol，1.4g)悬浮在80ml(毫升)甲苯中。滴加乙酸乙酯(88mmol(毫摩尔)，11.4g)，并搅拌所产生的混合物直到所有的钠消耗。然后在冰浴(0-5℃)中冷却该反应混合物并滴加在140ml甲苯中的2-溴苯乙酮(60mmol，12g)。搅拌该反应物过夜同时逐渐地温热至室温。通过GC和TLC分析该反应混合物，显示该反应完成。然后用200ml水洗涤该反应混合物，然后分离有机层和水层。用MgSO4(硫酸镁)干燥该有机层。在真空下从该有机层中除去甲苯，以便提供一种黄色的油状物，用Kugelrohr蒸馏纯化该油状物(在0.35Torr.b.p.135-145℃)。中间体2 制备2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯
Figure A0081910900371
将碳酸钾(200mmol，27.6g)加入到苯甲酰基乙酸乙酯(100mmol，19.2g)和碘化钾(20mmol，3.3g)的无水丙酮(100ml)溶液中。回流所产生的溶液并滴加氯丙酮(110mmol，10.7g)。通过GC/MS分析该反应混合物，表明存在中间体2。从该反应混合物中过滤固体物质，然后用200ml丙酮洗涤。在真空下浓缩所产生的滤液、在乙醚中再溶解，然后用水(100ml)洗涤3次。使有机层与水层分离，并用MgSO4干燥。分离固体并在真空下除去有机溶剂，产生一种黄色/橙色的油状物。用Kugelrohr蒸馏纯化该粗油状物(在0.65Torr.b.p.175-185℃)。实施例1 制备1-(3-二甲基氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900372
在乙醇(25ml)中混合N，N-二甲基-1，3-苯二胺二盐酸盐(5mmol，1.0g)、三乙基胺(10mmol，1.4ml)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)，然后在回流下加热(12小时)。在真空下除去溶剂，将所产生的油状物再溶解于二氯甲烷中，然后上硅胶柱。收集该纯化的产物，为一种半透明的油状物。该题述的化合物通过1H-NMR(CDCl3，ppm)鉴别：1.28t(3H)、2.35s(3H)、2.77s(6H)、4.2q(2H)、6.3-6.7m(4H)和7.0-7.3m(5H)。实施例2 制备1-(3-氯苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900381
将间氯苯胺(5mmol，0.6g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混合，然后在回流下加热。一俟反应完成，使该粗制固体在乙醇中重结晶，提供题述的产物(m.p.93.2℃-94.6℃)。实施例3 制备1-(3-氯苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900382
将间氯苯胺(5mmol，0.6g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混合，然后在回流下加热。一俟反应完成，使该粗制固体在乙醇中重结晶，得到所需产物(m.p.99.6℃-100.5℃)。实施例4 制备5-甲基-2-苯基-1-间甲苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900391
将间甲苯胺(5mmol，0.5g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物重新悬浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氢钠和盐水洗涤。用Na2SO4(硫酸钠)干燥有机层，分离该固体，并在真空下蒸发溶剂。从乙醇中重结晶该粗产物，得到题述的产物(m.p.92.5℃-94.0℃)。实施例5 制备2-甲基-5-苯基-1-间甲苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900392
将间甲苯胺(5mmol，0.5g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物重新悬浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氢钠和盐水洗涤。用Na2SO4干燥该有机层，分离该固体，并在真空下蒸发溶剂。用乙醇重结晶该粗产物，得到标题产物(m.p.103℃-104.5℃)。实施例6 制备1-(3-溴苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900401
将间溴苯胺(5mmol，0.9g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物重新悬浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氢钠和盐水洗涤。用MgSO4干燥该有机层，然后分离所述固体并在真空下蒸发溶剂。用乙醇重结晶该粗产物，得到标题产物(m.p.117.5℃-119.2℃)。实施例7 制备1-(3-乙酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将3′-氨基-苯乙酮(5mmol，0.7g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。在硅胶上纯化残余的油状物，得到标题产物(m.p.100℃-102℃)。实施例8 制备1-(3-乙酰基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将3′-氨基-苯乙酮(5mmol，0.7g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。在硅胶上纯化生成的油状物，得到标题产物，为一种固体(m.p.102℃-104℃)。实施例9 制备1-(3-甲磺酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900412
将3-甲磺酰基苯胺盐酸盐(5.8mmol，1.2g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5.8mmol，1.44g)、三乙胺(5.8mmol，0.61g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物重新悬浮在氯仿中，然后用水、5％碳酸氢钠和盐水洗涤。用Na2SO4干燥该有机层，分离所述固体，并在真空下蒸发溶剂。在硅胶上纯化粗品物质，得到标题产物(m.p.131℃-133℃)。实施例10 制备1-(3-甲磺酰基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900421
将3-甲磺酰基苯胺(1.4mmol，0.3g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(1.4mmol，0.35g)、三乙胺(1.4mmol，0.14g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物重新悬浮在氯仿中，然后用水、5％碳酸氢钠和盐水洗涤。用Na2SO4干燥该有机层，分离所述固体，并在真空下蒸发溶剂。在硅胶上化该粗品物质，得到标题产物，为一种油状物。该化合物的结构用1H-NMR(CDCl3，ppm)验证：1.36t(3H)、2.45s(3H)、2.82s(3H)、4.3q(2H)和6.8-7.2m(9H)。实施例11 制备1-(3-氨基甲酰基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900422
将3-氨基苯甲酰胺(5mmol，1.0g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。从该混合物中过滤所产生的沉淀物，然后用乙醇洗涤。该白色的固体产物无须进一步纯化而直接使用(m.p.237.8℃-238.8℃)。实施例12 制备1-(3-氨基甲酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将3-氨基苯甲酰胺(5mmol，1.0g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。从该反应混合物中过滤所产生的沉淀物，然后用乙醇洗涤。该棕褐色的固体产物无须进一步纯化而直接使用(m.p.208.9℃-210.3℃)。实施例13 制备1-(3-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将N，N-二甲基-1，3-苯二胺二盐酸盐(5mmol，1.0g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)、三乙胺(10mmol，1.0g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物重新悬浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氢钠和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，然后分离该固体，并在真空下移去溶剂。在硅胶上纯化该粗产物，得到标题产物(m.p.111.7℃-114℃)。实施例14 制备1-(3-碘苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将间碘苯胺(5mmol，1.1g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将残留的油状物重新悬浮在二氯甲烷中，然后用水、5％碳酸氢钠和盐水洗涤。分离该固体，并在真空下除去溶剂。使所产生的固体在乙醇中重结晶。一部分物质未溶解，并通过过滤分离。重结晶和过滤物质，得到标题产物(m.p.142.6℃-144℃)。实施例15 制备2-甲基-5-苯基-1-(3-磺苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将间胺酸(5mmol，0.9g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)、氢氧化钠(5mmol，0.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。在冰上沉淀未反应的间胺酸并从反应混合物中过滤。蒸发该滤液，得到一种油，在硅胶上纯化该油状物。放置后，指定的产物固化为紫色结晶(m.p.94℃-96℃)。实施例16 制备5-甲基-2-苯基-1-(3-磺苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900451
将间胺酸(5mmol，0.2g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)、氢氧化钠(5mmol，0.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。在0℃到5℃用HCl(盐酸)处理所产生的油状物，使未反应的间胺酸沉淀。在真空下浓缩残留的物质并在硅胶上纯化。收集指定的产物，为棕色的结晶(m.p.91℃-92.5℃)。实施例17 制备1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将间氟苯胺(5mmol，0.6g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物重新悬浮在氯仿中，然后用水、5％碳酸氢钠和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，然后过滤出该固体，并在真空下除去溶剂。在乙醇中重结晶指定的产物。(m.p.100℃-101℃)。实施例18 制备1-(3-氟苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将间氟苯胺(5mmol，0.6g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的固体重新悬浮在氯仿中，然后用水、5％碳酸氢钠和盐水洗涤。用Na2SO4干燥有机层，然后分离该固体，并在真空下除去溶剂。在乙醇中重结晶指定的产物(m.p.96.3℃-98.0℃)。实施例19 制备2-甲基-5-苯基-1-吡啶-3-基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900462
将3-氨基吡啶(5mmol，0.5g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物重新悬浮在乙醚中，然后用水和盐水洗涤。用MgSO4干燥有机层，然后分离该固体并在真空下除去溶剂。在硅胶上纯化该指定的产物并用1H-NMR(CDCl3，ppm)分析：1.35t(3H)、2.40s(3H)、4.3q(2H)、6.78s(1H)、7.03-7.39m(7H)、8.4sd(1H)和约8.6dd(1H)。实施例20 制备1-环己基-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将环己基胺(5mmol，0.5g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的残余物重新悬浮在乙醚中，然后用水和盐水洗涤。用MgSO4干燥有机层，然后分离该固体并在真空下除去溶剂。纯化该油状物得到标题产物，1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.0bm(2H)、1.23t(3H)、1.6-1.7bm(8H)、2.66s(3H)、4.16q(2H)、6.39s(1H)、和7.25bm(5H).实施例21 制备5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将苯胺(10mmol，0.9g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。从乙醇中重结晶指定的产物(m.p.130℃-131.7℃)。实施例22 制备2-甲基-1-(3-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将间硝基苯胺(10mmol，1.4g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。从乙醇中重结晶指定的产物(m.p.143℃-145℃)。实施例23 制备5-甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将5-硝基-2-氨基吡啶(5mmol，0.7g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。用氯仿研磨所产生的固体，并从该反应混合物中过滤出不溶物。在硅胶上纯化该滤液，得到标题产物(m.p.146.6℃-148.6℃)。实施例24 制备1-(3-羧基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900492
将3-氨基苯甲酸(10mmol，1.4g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物重新悬浮在氯仿-乙醚中，然后从该反应产物中过滤出不溶物。在硅胶上纯化该可溶物，得到标题产物(m.p.161.0℃-162.7℃)。实施例25 制备1-(3-甲氧基羧基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900501
将3-氨基苯甲酸甲酯(10mmol，1.4g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。在硅胶上纯化该指定的产物并放置结晶，1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.15t(3H)、2.08s(3H)、3.88s(3H)、4.05q(2H)、6.56s(1H)、7.15-7.33bm(7H)、7.79-7.97bm(2H)。实施例26 制备1-(3-溴苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将间溴苯胺(5mmol，0.9g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。从乙醇中重结晶指定的产物(m.p.111℃-112.7℃)。实施例27 制备1-(3-碘苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900511
将间碘苯胺(5mmol，1.1g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。从乙醇中重结晶指定的产物(m.p.111℃-112.9℃)。实施例28 制备2-甲基-5-苯基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将间三氟甲基苯胺(5mmol，0.8g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将该粗制物重新悬浮在氯仿中并用水和盐水先后洗涤。用Na2SO4干燥该有机层。分离该固体并在真空下除去溶剂。在硅胶上纯化所产生的油状物，得到标题产物，1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.37t(3H)、2.42s(3H)、4.32q(2H)、6.80s(1H)、7.0-7.6bm(9H)。实施例29 制备5-甲基-2-苯基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900521
将间三氟甲基苯胺(5mmol，0.8g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将该粗制物重新悬浮在氯仿中，用水和盐水先后洗涤。用Na2SO4干燥该有机层。分离该固体并在真空下除去溶剂。在硅胶上纯化所产生的油状物，得到标题产物，1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.01t(3H)、1.98b(3H)、4.00q(2H)、6.48s(1H)、7.00-7.33bm(9H)。实施例30 制备2-甲基-1-(3-硝基苄基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900522
将间硝基苄基胺盐酸盐(3g)悬浮在饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)中，然后用氯仿提取。用MgSO4干燥该有机层，然后分离该固体并在真空下移去溶剂，得到该游离碱。将如上制备的间硝基苄基胺(5mmol，0.8g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosicacid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将该残余物重新悬浮在乙醚中并从该混合物中过滤苄胺tosic acid盐。在真空下浓缩该滤液并在硅胶上纯化所产生的油状物，得到标题产物，1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.24t(3H)、2.36s(3H)、4.07-4.30q(2H)、5.11s(2H)、6.58s(1H)、6.98-7.44bm(7H)、7.69bs(1H)、7.97bd(1H).实施例31 制备5-甲基-1-(3-硝基苄基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将间硝基苄基胺盐酸盐(3g)悬浮在饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)中，然后用氯仿提取。用MgSO4干燥该有机层，然后分离该固体并在真空下移去溶剂，得到游离碱。将如上制备的间硝基苄基胺(5mmol，0.8g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid在乙醇中混和，然后在回流下加热。在硅胶上纯化所产生的残余物，得到标题产物，1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.10t(3H)、3.16s(3H)、4.08q(2H)、5.04s(2H)、6.55s(1H)、7.07-7.53bm(7H)、7.72bs(1H)、8.04bd(1H).实施例32 制备5-甲基-2-苯基-1-吡啶-3-基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900541
将3-氨基吡啶(5mmol，0.5g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。将所产生的油状物在硅胶上纯化，但还含有污染物。在己烷中研磨该物质，通过过滤分离该固体。用苯洗涤该固体两次，得到标题产物(m.p.102℃-103℃)。实施例33 制备2-甲基-1-(4-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将对硝基苯胺(5mmol，0.7g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.25g)和tosic acid在乙醇中混和，然后在回流下加热。在冰(0-5℃)上冷却该反应混合物，从反应化合物中过滤沉淀物。1H-NMR分析证实该沉淀物为指定的产物，(CDCl3，ppm)：1.38t(3H)、2.45s(3H)、4.20q(2H)、6.80s(1H)、6.97-7.35bm(7H)、8.25d(2H)。实施例34 制备2-甲基-1-(2-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将邻硝基苯胺(15mmol，2.1g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(15mmol，3.7g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。在三根硅胶柱上纯化所产生的油状物，得到标题产物。1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.36t(3H)、2.36s(3H)、4.31q(2H)、6.80s(1H)、7.03-7.66bm(6H)、7.68dt(2H)、7.97dd(1H)。实施例35 制备2-甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900552
将5-硝基-吡啶-2-基胺(5mmol，0.7g)、3-氧代-2-(2-氧代-2-苯基-乙基)-丁酸乙酯(5mmol，1.2g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。用氯仿研磨所产生的固体，在硅胶上进一步纯化该滤液，得到标题产物。1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.35t(3H)、2.54s(3H)、4.30q(2H)、6.78s(1H)、6.96-7.25bm(6H)、8.33dd(1H)、9.39sd(1H)。实施例36 制备5-甲基-1-(4-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将对-硝基苯胺(10mmol，1.4g)、2-苯甲酰基-4-氧代-戊酸乙酯(10mmol，2.5g)和tosic acid(0.1g)在乙醇中混和，然后在回流下加热。过滤该反应混合物并用乙醇洗涤该固体。测定该收集的固体为所指定的产物(m.p.190℃-192℃)。实施例37 制备1-(4-氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将实施例36的5-甲基-1-(4-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(4mmol，1.5g)溶解于乙醇中并用5％pd/C(0.15g)处理。在45psi下用H2(g)氢化该混合物。一俟反应完成，通过硅藻土过滤该混合物，并在真空下除去溶剂。分析产生的固体，显示其为指定产物(m.p.181℃-183℃)。实施例38 制备1-(4-氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将实施例33的2-甲基-1-(4-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯(2mmol，0.8g)溶解于50％乙酸乙酯的乙醇溶液中并用pd/C(0.088g)处理。在45psi下用H2(g)氢化该混合物。一俟反应完成，通过硅藻土过滤该混合物，并在真空下移去溶剂。在硅胶上纯化该物质，得到标题产物。实施例39 制备1-(3-硝基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
从Maybridge Chemical Co.，Ltd.，Cornwall，UK购得指定的产物，无须进一步纯化而使用。实施例40 制备1-(3-氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
将实施例39的化合物(0.86mmol，0.3g)溶解于甲醇中并用氯化镍(NiCl2)和氢硼化钠(NaBH4)(17.2mmol)处理。除去甲醇，然后将该反应混合物重新悬浮在水中，接着用乙酸乙酯提取。用MgSO4干燥该反应混合物、过滤并浓缩。在硅胶上纯化指定的产物。1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.37t(3H)、2.41s(3H)、3.73s(2H)、4.31q(2H)、6.43s(1H)、6.54d(1H)、6.67dd(1H)、6.78s(1H)、7.11-7.18m(5H)。实施例41 制备1-(3-氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900582
采用实施例40阐述的步骤，将实施例22的化合物(0.86mmol，0.3g)溶解于甲醇中并用NiCl2和NaBH4(17.2mmol)处理。在硅胶上纯化指定的产物(m.p.142℃-143℃)。实施例42 制备1-(2，3-二氯苯其)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900591
从Maybrige Chemical Co.，Ltd.，购得指定的产物，无须进一步纯化而使用。实施例43 制备5-甲基-1-(3-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸
Figure A0081910900592
将实施例39的化合物(0.29mmol，0.1g)溶解于50％二噁烷和水中，然后用氢氧化锂(LiOH，0.87mmol，0.0363g)处理并加热到至少50℃。除去溶剂并用乙酸乙酯提取所述碱。酸化该水层到pH＜2并用乙酸乙酯提取。用MgSO4干燥该有机层，过滤该固体并在真空下除去溶剂。无须一步纯化而使用该指定的产物。1H-NMR(CDCl3，ppm)：2.48s(3H)、6.88s(1H)、7.03dd(2H)、7.18m(3H)、7.47dd(1H)、7.6t(1H)、8.08st(1H)、8.27dd(1H)。实施例44 制备5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸
用与实施例43所述相同的方法水解实施例21的化合物(0.33mmol，0.1g)，得到指定产物，1H-NMR(CDCl3，ppm)：2.44s(3H)、6.87s(1H)、7.06m(2H)、7.15m(5H)、7.40m(3H)。实施例45 1-(3，5-双三氟甲基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900602
从Maybridge Chemical Co.，Ltd.，购得指定的产物，无须进一步纯化而使用。实施例46 制备1-(3-乙氧基羰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯
Figure A0081910900611
除了用3-氨基苯甲酸乙酯作为原料外，用与实施例25化合物相同的方法形成所述化合物。该指定产物具有108℃-l10℃的熔点。
测试了结构式式(I)和(II)化合物抑制PDE4的能力。一种化合物抑制PDE4活性的能力与该化合物的IC50值即抑制50％的酶活性所需抑制剂的浓度有关。使用重组人PDE4测定结构式式(I)和(II)化合物的IC50值。
本发明化合物一般显示抑制重组人PDE4的IC50值为低于约100μM，优选低于约50μM，更优选低于约约25μM。本发明化合物一般显示抑制重组人PDE4的IC50值为低于约10μM，优选低于约1μM。为充分体现本发明的优点，本发明的PDE4抑制剂具有的IC50值为约0.005μM-约25μM。
由一般使用在0.1pM-500μM范围内的浓度的浓度-反应曲线，确定所述化合物的IC50值。使用如Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806页(1996)中所述的标准方法的针对其它PDE酶的试验也表明本发明的化合物对于cAMP特异性PDE4酶具有高度选择性。
具体地说，本发明的一种化合物，即实施例22，对人重组PDE4B具有0.15μM的IC50值，对PDE1A具有35.5μM的IC50值，对PDE1B具有21.0μM的IC50值，对PDE1C具有21.8μM的IC50值，对PDE2具有4.5μM的IC50值，对PDE3A具有89μM的IC50值，对PDE5具有12.5μM的IC50值，而对PDE7具有10.6μM的IC50值。这阐明了本发明化合物对于抑制PDE4的选择性。
也测试了结构式(I)或(II)化合物在人外周血液淋巴细胞中减少TNFα分泌的能力。减少TNFα分泌的能力与EC50值有关(即能够抑制50％的总TNFα的该化合物的有效浓度)。
本发明化合物一般显示低于约100μM的EC50值，优选低于约50μM，更优选低于约15μM。本发明的化合物优选显示低于约10μM的PBL/TNFαEC50值，而经常低于约7μM。为了充分体现本发明的优势，一种本发明的PDE4抑制剂具有大约1μM到20μM的EC50值。
人重组PDEs的制备和IC50与EC50的测定可以通过本领域众所周知的方法完成。例证性方法描述如下：人P人PDEs的表达在杆状病毒感染的草地贪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf9)细胞中的表达
使用pBlueBacIII(Invitrogen)或者pFastBac(BRL-Gibco)构建杆状病毒转移质粒。通过跨越所述载体接点进行测序并且通过对由PCR产生的所有区进行完全测序，证实所有质粒的结构。质粒pBB-PDE1A3/6在pBlueBacIII中含有PDE1A3的完整的可读框(Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806页(1996))。质粒Hcam3aBB在pBlueBacIII中含有PDE1C3的完整的可读框(Loughney等(1996))。质粒pBB-PDE3A在pBlueBacIII中含有PDE3A的完整的可读框(Meacci等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89，第3721-3725页(1992))。
根据制造商的方案，使用MaxBac系统(Invitrogen)或者FastBac系统(Gibco-BRL)产生重组病毒原液。在这两种情况下，在所得到的病毒中重组人PDEs的表达由病毒多角体启动子驱动。当使用MaxBac系统时，为了确保在制剂中不污染有野生型(occ+)病毒，将病毒噬斑纯化两次。如下进行蛋白表达。使Sf9细胞于27℃下在补充如下成分的Grace’s昆虫培养基(Gibco-BRL)中生长：10％胎牛血清、0.33％TCyeastolate、0.33％水解乳白蛋白、4.2mM的碳酸氢钠、10μg/ml庆大霉素、100单位/ml的青霉素和100μg/ml链霉素。以每个细胞大约2-3病毒颗粒的感染复数感染指数生长的细胞并且孵育48小时。通过离心收集所述细胞，用未经补充的Grace’s培养基洗涤并且快速冷冻保存。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(酵母)中的表达
人PDE1B、PDE2、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE5和PDE7的重组产生类似于美国专利第5,702,936号(在此结合到本发明中作为参考)的实施例7中所述进行，除了使用酵母转化载体，该酵母转化载体衍生自Price等Methods in Enzymology，185，第308-318页(1990)介绍的基本ADH2质粒，该质粒中加入酵母ADH2启动子和终止子序列，所述酿酒酵母宿主为蛋白酶缺陷性菌株BJ2-54，BJ2-54于1998年8月31日保藏在美国典型培养物中心(Manassas，Virginia)，保藏号为ATCC74465。使转化宿主细胞在2X SC-leu培养基(pH6.2，含有微量金属和维生素)中生长。24小时后，加入含有甘油的YEP培养基到终浓度为2x YET/3％甘油。大约24小时后，收获细胞，洗涤并且于-70℃下保存。钙调蛋白纯化
基本按照Dedman等，Methods.in Enzymology，102，1-8页(1983)所述，采用Pharmacia Phenyl-Sepharose方法从牛睾丸中纯化用于激活PDE1酶的钙调蛋白。钙调蛋白在琼脂糖上的固定
按照生产商的使用说明书将钙调蛋白固定在BioRad AffiGel15上。人磷酸二酯酶制剂磷酸二酯酶活性的测定
如下测定所述制剂的磷酸二酯酶活性。利用活性炭分离技术的PDE测试基本如Loughney等(1996)所述进行。在该测试中，按照存在的PDE活性的量的比例，PDE活性将[32P]cAMP或者[32P]cGMP转化为相应的[32P]5’-AMP或者[32P]5’GMP。然后，[32P]5’-AMP或者[32P]5’-GMP通过蛇毒5’-核苷酸酶的作用被定量地转化为游离的[32P]磷酸和未标记的腺苷或者鸟苷。因此，释放的[32P]磷酸的量与酶活性成正比。该测试于30℃下，在含有(终浓度)40mM Tris HCl(pH8.0)、1μM硫酸锌、5mM氯化镁和0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的100μl反应混合物中进行。或者，在评估PDE1-比活性的测试中，孵育混合物还包括使用0.1mM氯化钙和10μg/ml钙调蛋白。PDE酶以产生＜30％总的底物水解的量存在(线性测试条件)。通过加入底物(1mM[32P]cAMP或者cGMP)引发所述测试，将该混合物孵育12分钟。然后，加入75μg大响尾蛇(Crotalus atrox)毒素，继续孵育3分钟(总共15分钟)。通过加入200μl活性炭(在每毫升0.1M磷酸二氢钠的悬浮液(pH4)中25毫克)终止反应。离心(750Xg3分钟)沉淀所述活性炭后，取出上清液样品用于在闪烁计数器中的放射活性的测定并且计算PDE活性。
类似于Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806页(1996)所述的方法进行抑制剂的分析，只是同时使用cGMP和cAMP，底物浓度保持在低于32nM，该值远低于所测试PDE5的Km。从SF9细胞中纯化PDE1A3
在室温下将细胞沉淀(5g)与10ml裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.5、2mM二硫苏糖醇(DTT)、2mM苄脒盐酸盐、5μM硫酸锌、0.1mM氯化钙、20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)混合。通过一个French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments，Inc.，Rochester NY)使所述细胞溶解。在一个采用T180型转子的Beckman超高速离心机中以45,000rpm离心产生的溶胞产物1小时。回收上清液并通过一个0.2μm滤器过滤。将该滤液上样到一根在柱缓冲液A(含有100mM NaCl和2mM MgCl2的裂解缓冲液)中平衡后的2.6×90cm的SEPHACRYLS-300柱上。调节该柱流速到1ml/分钟并收集7ml的流分。合并活性流分并用0.16mg的钙调蛋白补充。按照Hansen等，Methods in Enzymology 159，453-557页(1988)所述，以0.2ml/min的流速将所述酶上样到一根ACC-1琼脂糖免疫亲和力柱上过夜。用5个体积的柱缓冲液B(没有NaCl的柱缓冲液A)，随后用5个体积的柱缓冲液C(含有250mM NaCl的柱缓冲液A)洗涤该柱。通过采用一个柱体积的柱缓冲液D(50mMMOPS pH7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM苄脒HCl，100mM NaCl，20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)，以0.1ml/min洗脱该柱，停止流动1小时，然后以同样的流速继续洗脱。收集0.5ml的流分。合并呈现活性的流分，首先针对含有25mM MOPS pH7.5、100mM NaCl、10μM ZnSO4、1mM CaCl2、1mM DTT、1mM苄脒HCl的透析缓冲液透析。随后针对含有50％甘油的透析缓冲液进行透析，然后用干冰迅速冷冻该样品并于-70℃下保存。所产生的制品纯度大约为10到15％(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约5到20μmol cAMP的比活性。从酿酒酵母(S.cerevisiae)中纯化PDE1B
在室温下通过与100ml玻璃珠(0.5mM酸洗涤的)和200ml缓冲液A混合解冻酵母细胞(50g)。缓冲液A由50mM MOPS pH7.5、1mMDTT、2mM苄脒HCl、0.01mM ZnSO4、5mM MgCl2、20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽组成。将该混合物冷却到4℃，转移到一个Bead-Beater中并通过迅速混合6个周期使细胞溶解，每周期30秒。在一个采用JA-10转子的Beckman J2-21M离心机中以9,000rpm在4℃离心该匀浆15分钟。回收该上清液并在一个采用T145转子的Beckman XL-80超高速离心机中于4℃以36,000rpm离心45分钟。回收上清液并通过加入固体硫酸铵(0.33g/ml上清液)使PDE1B沉淀，同时在一个冰浴中搅拌并维持pH在7.0和7.5之间。然后用一个JA-10转子的Beckman J2离心机中以9,000rpm(12,000Xg)离心该混合物22分钟。弃去该上清液并将该沉淀溶解于100ml缓冲液B(50mM MOPS pH7.5、1mM DTT、1mM苄脒HCl、0.01mM ZnSO4、2mM MgCl2、2mM CaCl2，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。将其分别校正pH和电导率为7.5和15-20毫西门子(mS)。将该溶液上样到一根20ml的调钙蛋白-琼脂糖柱上，所述柱已经用10个柱体积的缓冲液B以1ml/min的速率平衡。将流过的溶液(flow-through)反复上样到所述柱上至少5次。用5个体积的缓冲液B、5个体积含250mM NaCl的缓冲液B洗涤所述柱，并再用2个体积的不含NaCl的缓冲液B洗涤。以0.33ml/min的速率用一个体积的缓冲液C(50mM MOPS pH7.5、1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM苄脒HCl)完成洗脱，然后在继续洗脱前停止流动1小时。收集大约4ml的流分并测试PDE活性。合并活性流分并浓缩到5ml体积，用一个Amicon超滤系统。将该浓缩物上样到一根320ml SephacrylS-300柱(1.6×150cm)上，所述柱已经用至少2个体积的缓冲液D(25mM MOPS pH7.5，1mM DTT，1mM苄脒HCl，0.01mM ZnSO4，2mM CaCl2和100mM NaCl)平衡。以1ml/min的速率(11cm/小时)洗柱，收集5ml的流分。合并活性峰并对含又50％甘油的缓冲液D透析过夜。在干冰上冷冻纯化的酶并于-70℃下保存。该产生的制品具有大约＞90％的纯度(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约10到30μmol cGMP的比活性。从SF9细胞中纯化PDE1C3
在冰上用20ml裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.4、10μM硫酸锌、0.1mM氯化钙、1mM DTT、2mM苄脒盐酸盐和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)将细胞沉淀(5g)解冻。通过一个French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)使所述细胞溶解，同时维持温度在10℃以下。于4℃，在一个采用TI45型转子的Beckman超高速离心机中以36,000rpm离心产生的细胞匀浆45分钟。弃去上清液并使用一个带有小管的VibraCell调谐器，通过超声3×30秒用40ml增溶缓冲液(含有1M NaCl、0.1M MgCl2、1mM CaCl2、20μg/ml钙调蛋白和1％Sulfobetaine SB12(Z3-12)的裂解缓冲液)将产生的沉淀重新悬浮。为了冷却，在碎冰/盐混合物中进行该过程。在超声后，在4℃缓慢地混合该混合物30分钟使膜结合蛋白完全溶解。在一个采用TI45型转子的Beckman超高速离心机中以36,000rpm离心该混合物45分钟。用含有10μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II的裂解缓冲液稀释该上清液。在一个Beckman JA-10转子中以9,000rpm离心该沉淀的蛋白质20分钟。然后将该回收的上清液经Mimetic BlueAP琼脂糖色谱层析。
为了通过(run)Mimetic BlueAP琼脂糖柱，首先用10个床体积的1％聚乙烯吡咯酮(即40000的MW)阻断非特异性结合位点保护(shielded)该树脂。通过用10个床体积的2M NaCl和10mM pH34的柠檬酸钠洗涤移去松散地结合的PVP-40。在临加入溶解的PCE1C3样品前，用5个床体积的柱缓冲液A(50mM MOPS pH7.4，10μM硫酸锌、5mM MgCl2、0.1mM CaCl2、1mM DTT、2mM苄脒盐酸盐)平衡该柱。
以2ml/min的流速将该溶解的样品上样到该柱上，如此循环以使总样品在12小时内上样4到5次。在完成载样后，用10个柱体积的柱缓冲液A，随后用5个柱体积的缓冲液B(含有20mM 5′-AMP的柱缓冲液A)和5个柱体积的柱缓冲液C(50mM MOPS pH7.4，10μM硫酸锌、0.1mM CaCl2、1mM DTT和2mM苄脒盐酸盐)先后洗涤所述柱。所述酶被洗脱到三份连续合并液(pool)中。第一份合并液含有来自于用含有1mM cAMP的柱缓冲液C洗脱的5个-床体积洗液的酶。第二份合并液含有来自于用含有1M NaCl的柱缓冲液C洗脱的10个-床体积洗液的酶。最后一份合并液含有来自于用含有1M NaCl和20mM cAMP的柱缓冲液C洗脱的5个-床体积洗液的酶。
收集酶的活性合并液并经常规的凝胶过滤色谱法或在羟基磷灰石树脂上的色谱法移去环核苷酸。在移去环核苷酸后，将该酶的合并液对含有25mM MOPS pH7.4，10μM硫酸锌、500mM NaCl、1mMCaCl2、1mM DTT和1mM苄脒盐酸盐的透析缓冲液透析，随后对含有50％甘油的透析缓冲液透析。借助于干冰迅速冷冻所述酶并于-70℃保存。
该产生的制品具有大约＞90％的纯度(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约0.1到1.0μmol cAMP的比活性。从酿酒酵母中纯化PDE2
在冰上、在25ml裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.2、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1mM DTT、0.1mM 4-(2-氨基-乙基)苯磺酰基氟(AEBSF)、各1μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II、和2mM苄脒)中，让来自于YI34菌株的冷冻酵母细胞沉淀(10g，在-70℃下保存)解冻。使细胞通过过一个French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)三次使之溶解。于4℃在一个45Ti型的Beckman超高速离心机转子中以36,000rpm离心溶解产物60分钟。使上清液与沉淀分离并在4℃使上清液以约0.5ml/min的速率通过15ml Epoxy-cGMP Sepharos树脂2次。随后用45ml洗涤缓冲液1(50mM MOPS pH7.2、0.1mM EDTA、0.1mM DTT)洗涤该柱。在这次洗涤后，用45ml洗涤缓冲液2(含有0.5M NaCl的洗涤缓冲液1)洗涤该柱。在洗涤所述盐后，用15ml洗涤缓冲液3(含有0.25M NaCl的洗涤缓冲液1)洗涤该柱。将所述柱转移至室温环境下并让其温热。将约25ml的洗脱缓冲液(含有10mM cGMP的洗涤缓冲液3)上到该柱上并按照每份2ml流分收集流出液。用含有5mM MgCl2的PBS将每个流分的少量等份样品稀释20倍，使竞争性配体水解并有助于检测PDE2活性。使活性流分通过一个Pharmacia PD-10凝胶体滤柱以便交换到洗涤缓冲液3中。该交换的合并液用80％无菌甘油稀释50％v/v并在-20℃下保存。经SDS-PAGE判定所产生的制品纯度大于85％，随后通过Coomassie R-250使蛋白染色。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约150到250μmol cGMP的比活性。由Sf9细胞制备PDE3A
将细胞(2×1010)悬浮在裂解缓冲液中，该裂解缓冲液含有50mMMOPS pH7.5、2mM DTT、2mM苄脒盐酸盐、5μM硫酸锌、0.1mM氯化钙、20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽。超声处理该混合物两次(30秒钟)并于4℃，在一个French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)中使所述细胞溶解。该溶胞产物经100,000xg离心45分钟。用裂解缓冲液洗涤该沉淀一次并用Dounce均浆器将其悬浮在46ml裂解缓冲液中。将等分试样在-70℃下保存。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约1到2nmol cAMP的比活性。人PDE4A、4B、4C、4D制剂由酿酒酵母制备PDE4A
通过与50ml的裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸锌，2mM氯化镁，14.2mM 2-巯基乙醇，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽，各20μg/ml的钙蛋白酶抑制剂I和II，以及2mM苄脒盐酸盐)混合，于室温下，解冻酵母细胞(50g带有HDUN1.46的酵母菌株YI26)。于10℃，将细胞在French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)中溶解。于4℃，在Beckman JA-10转子中，以9000rpm将所述提取物离心22分钟。转移上清液并且在Beckman TI45转子中，以36000rpm，于4℃，离心45分钟。
通过加入固体硫酸铵(0.26g/ml上清液)，同时在冰浴中搅拌并且维持pH在7.0-7.5之间，由高速上清液沉淀PDE4A。经在BeckmanJA-10转子中，以9000rpm离心22分钟，收集沉淀的含有PDE4A的蛋白。将所述沉淀再次悬浮在50ml缓冲液G(50mM MOPS pH7.5，10μM硫酸锌，5mM氯化镁，100mM氯化钠，14.2mM 2-巯基乙醇，2mM苄脒盐酸盐，各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、抑蛋白酶肽，以及各20μg/ml的钙蛋白酶抑制剂I和II)中并且通过0.45μm滤膜。
将所述悬浮样品(50-100ml)上样到在缓冲液G中平衡后的5×100cm的Pharmacia SEPHACRYLS-300柱中。以2ml/min的流速洗脱酶活性并且收集以供以后分离。
将经凝胶过滤层析分离的PDE4A上样到在缓冲液A(50mMMOPS pH7.5，10μM硫酸锌，5mM氯化镁，14.2mM 2-巯基乙醇以及100mM苄脒盐酸盐)中平衡后的1.6×20cm的Sigma Cibacron BlueAgarose-300型(10ml)柱中。连续用50-100ml缓冲液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的缓冲液A、50-100ml含有1.5M氯化钠的缓冲液A和10-20ml缓冲液C(50mM Tris HCl pH8，10μM硫酸锌，14.2mM 2-巯基乙醇以及2mM苄脒盐酸盐)洗涤柱。用20-30ml含有20mM cAMP的缓冲液C洗脱所述酶。
收集PDE活性峰并且用硫酸铵沉淀(0.33g/ml酶收集液)以便除去过量的环核苷酸。将沉淀的蛋白再悬浮在缓冲液X(25mM MOPS pH7.5，5μM硫酸锌，50mM氯化钠，1mM DTT以及1mM苄脒盐酸盐)中，并且按照制造商的指示，经在Pharmacia PD-10柱上凝胶过滤脱盐。将所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷冻并且于-70℃保存。
所得的制剂为约＞80％纯度(经SDS-PAGE)。这些制剂具有每分钟每毫克蛋白水解的约10-40μmol cAMP的比活性。由酿酒酵母制备PDE4B
于室温下，通过与100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM苄脒盐酸盐，以及各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II)混合，解冻酵母细胞(150g带有HDUN2.32的酵母菌株YI23)。将所述混合物冷却到4℃，转移至Bead-Beater中并且快速混合6个周期(每个周期30秒)溶解所述细胞。于4℃，在BeckmanJ2-21M离心机中，使用JA-10转子，以9000rpm将所述匀浆离心22分钟。回收上清液并且于4℃，在Beckman XL-80超速离心机中，使用TI45转子，以36000rpm离心45分钟。回收上清液并且通过加入固体硫酸铵(0.26g/ml上清液)，同时在冰浴中搅拌并且维持pH在7.0-7.5的范围内，沉淀PDE4B。然后，在Beckman J2离心机中，使用JA-10转子，以9000rpm(12000Xg)将该混合物离心22分钟。弃去上清液，将沉淀溶于200ml缓冲液A(50mM MOPS pH7.5，5mM氯化镁，1mMDTT，2mM苄脒盐酸盐，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。将其pH和电导率分别校正为7.5和15-20mS。
将所述再悬浮的样品上样到在缓冲液A中平衡后的1.6×200cmSigma Cibacron Blue Agarose-300型(25ml)柱中。将所述样品在12个小时内，循环通过所述柱4-6次。将所述柱连续用125-250ml缓冲液A、125-250ml含有1.5M氯化钠的缓冲液A和25-50ml缓冲液A洗涤。用50-75ml缓冲液E(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，1mM苄脒盐酸盐，以及20mM cAMP)和50-75ml含有1M氯化钠的缓冲液E洗脱所述酶。收集PDE活性峰并且用硫酸铵(0.4g/ml酶收集液)沉淀以便除去过量的环核苷酸。将沉淀的蛋白再悬浮在缓冲液X(25mM MOPS pH7.5，5μM硫酸锌，50mM氯化钠，1mM DTT以及1mM苄脒盐酸盐)中，并且按照制造商的指示，经在PharmaciaPD-10柱上凝胶过滤脱盐。将该酶收集液对含有50％甘油的缓冲液X透析过夜。将所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷冻并且于-70℃保存。
所得的制剂为约＞90％纯度(经SDS-PAGE)。这些制剂具有每分钟每毫克蛋白水解的约10-50μmol cAMP的比活性。由酿酒酵母制备PDE4C
于室温下，通过与100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM苄脒盐酸盐，以及各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II)混合，解冻酵母细胞(150g带有HDUN3.48的酵母菌株YI30)。将所述混合物冷却到4℃，转移至BEAD-BEATER中并且快速混合6个周期(每个周期30秒)溶解所述细胞。于4℃，在Beckman J2-21M离心机中，使用JA-10转子，以9000rpm将所述匀浆离心22分钟。回收上清液并且于4℃，在Beckman XL-80超速离心机中，使用TI45转子，以36000rpm离心45分钟。
回收上清液并且通过加入固体硫酸铵(0.26g/ml上清液)，同时在冰浴中搅拌并且维持pH在7.0-7.5的范围内，沉淀PDE4C。30分钟后，在Beckman J2离心机中，使用JA-10转子，以9000rpm(12000Xg)将该混合物离心22分钟。弃去上清液，将沉淀溶于200ml缓冲液A(50mM MOPS pH7.5，5mM氯化镁，1mM DTT，2mM苄脒盐酸盐，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。将其pH和电导率分别校正为7.5和15-20mS。
将所述再悬浮的样品上样到在缓冲液A中平衡后的1.6×20cmSigma Cibacron Blue Agarose-300型(25ml)柱中。将所述样品在12个小时内，循环通过所述柱4-6次。将所述柱连续用125-250ml缓冲液A、125-250ml含有1.5M氯化钠的缓冲液A和25-50ml缓冲液A洗涤。用50-75ml缓冲液E(50mM Tris HCl pH8，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM苄脒盐酸盐，以及20mM cAMP)和50-75ml含有1M氯化钠的缓冲液E洗脱所述酶。收集PDE4C活性峰并且用硫酸铵(0.4g/ml酶收集液)沉淀以便除去过量的环核苷酸。将沉淀的蛋白再悬浮在缓冲液X(25mM MOPS pH7.2，5μM硫酸锌，50mM氯化钠，1mMDTT以及1mM苄脒盐酸盐)中，并且按照制造商的指示，经在Pharmacia PD-10柱上凝胶过滤脱盐。将该酶收集液对含有50％甘油的缓冲液X透析过夜。将所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷冻并且于-70℃保存。
所得的制剂为约＞80％纯度(经SDS-PAGE)。这些制剂具有每分钟每毫克蛋白水解的约10-20μmol cAMP的比活性。由酿酒酵母制备PDE4D
于室温下，通过与150ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.2，10μM硫酸锌，2mM氯化镁，14.2mM 2-巯基乙醇，2mM苄脒盐酸盐，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II)混合，解冻酵母细胞(100g带有HDUN4.11的酵母菌株YI29)。将所述混合物冷却到4℃，转移至Bead-Beater中并且快速混合6个周期(每个周期30秒)溶解所述细胞。于4℃，在Beckman J2-21M离心机中，使用JA-10转子，以9000rpm将所述匀浆离心22分钟。回收上清液并且于4℃，在Beckman XL-80超速离心机中，使用TI45转子，以36000rpm离心45分钟。回收上清液并且通过加入固体硫酸铵(0.33g/ml上清液)，同时在冰浴中搅拌并且维持pH在7.0-7.5的范围内，沉淀PDE4D。30分钟后，在Beckman J2离心机中，使用JA-10转子，以9000rpm(12000Xg)将该混合物离心22分钟。弃去上清液，将沉淀溶于100ml缓冲液A(50mMMOPS pH7.5，10μM硫酸锌，5mM氯化镁，14.2mM 2-巯基乙醇，100mM苄脒盐酸盐，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II)中。将其pH和电导率分别校正为7.5和15-20mS。
以0.67ml/min的流速，将所述再悬浮的样品上样到在缓冲液A中平衡后的1.6×20cm Sigma Cibacron Blue Agarose-300型(10ml)柱中。将所述柱连续用50-100ml缓冲液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的缓冲液A、50-100ml含有1.5M氯化钠的缓冲液A和10-20ml缓冲液C(50mM Tris HCl pH8，10μM硫酸锌，14.2mM 2-巯基乙醇，2mM苄脒盐酸盐)洗涤。用20-30ml含有20mM cAMP的缓冲液C洗脱所述酶。
收集PDE4D活性峰并且用硫酸铵(0.4g/ml酶收集液)沉淀以便除去过量的环核苷酸。将沉淀的蛋白再悬浮在缓冲液X(25mM MOPS pH7.2，5μM硫酸锌，50mM氯化钠，1mM DTT以及1mM苄脒盐酸盐)中，并且按照制造商的指示，经在Pharmacia PD-10柱上凝胶过滤脱盐。将该酶收集液对含有50％甘油的缓冲液X透析过夜。将所述酶的制剂在干冰/乙醇浴中快速冷冻并且于-70℃保存。
所得的制剂为约＞80％纯度(经SDS-PAGE)。这些制剂具有每分钟每毫克蛋白水解的约20-50μmol cAMP的比活性。得自酿酒酵母的PDE5的纯化
在冰上用等体积的裂解缓冲液(25mM Tris HCl pH8，5mM氯化镁，0.25mM DTT，1mM苄脒和10μM硫酸锌)解冻细胞沉淀(29g)。在Microfluidizer(Microfluidics Corp)中，用20000psi氮气下溶解细胞。离心溶胞产物并通过一个一次性使用的0.45μm滤器过滤。将该滤液上样到一根Q SEPHAROSEFastFlow (Pharmacia)的150ml柱上。用1.5个体积的缓冲液A(20mM Bis-Tris Propane，pH6.8，1mM氯化镁，0.25mM DTT，10μM硫酸锌)洗涤所述柱并用在缓冲液A中的125mM氯化钠进行阶梯式梯度洗脱，随后用在缓冲液A中的125-1000mM氯化钠进行线性梯度洗脱。将来自于线性梯度的活性流分上样到在缓冲液B(20mM Bis-Tris Propane(pH6.8)，1mM氯化镁，0.25mM DTT，10μM硫酸锌和250mM氯化钾)中的180ml羟基磷灰石柱上。上样后，用2个体积的缓冲液B洗涤所述柱并用在缓冲液B中的0-125mM磷酸钾的线性梯度液洗脱。合并活性流分，用60％硫酸铵沉淀，并再悬浮在缓冲液C(20mM Bis-Tris Propane，pH6.8，125mM氯化钠，0.5mMDTT和10μM硫酸锌)中。将合并的液体上样到140ml SEPHACRYLS-300 HR柱上并用缓冲液C洗脱。将活性流分稀释到50％甘油中并在-20℃保存。
所得的制剂具有约＞85％纯度(经SDS-PAGE)。这些制剂具有每分钟每毫克蛋白水解约3μmol cGMP的比活性。由酿酒酵母制备PDE7
在室温下，约30分钟，用等体积的裂解缓冲液(50mM Tris HCl pH8，1mM EDTA，1mM DTT，50mM氯化钠，2mM苄脒盐酸盐和各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)解冻细胞沉淀(126g)并使之再悬浮。于0-4℃、在一个Bead-Beater(6×30秒周期)，借助于玻璃珠(125ml)溶解所述细胞。离心该溶胞产物并通过一个一次性使用的0.45μm滤器过滤。将过滤的提取液(178ml)分为4ml等份试样，用干冰迅速冷冻并在一个冰箱中于-70℃保存。这些制剂对于几个冷冻和解冻周期是稳定的并具有每分钟每毫克蛋白水解约50到100pmolcAMP的比活性。脂多糖-刺激的TNFα从人外周血液淋巴细胞中的释放
为了评价一种化合物减少人外周血液淋巴细胞(PBL)中TNFα分泌的能力，进行以下试验。先前的研究已经证明，将人PBL与升高cAMP的试剂，如前列腺素E21毛喉素、8-溴-cAMP或二丁基-cAMP一起孵育，当用脂多糖(LPS，内毒素)刺激时，可抑制细胞分泌TNFα。因此，初步试验已经完成，证明选择性PDE4抑制剂如咯利普兰以剂量依赖方式抑制LPS诱导的人淋巴细胞分泌TNFα。因此，将人PBL分泌的TNFα用作化合物升高细胞内cAMP浓度和/或抑制细胞内PDE4活性的能力的标准。
抽自自愿者的肝素化血液(约30ml)与Dulbecco’s改良磷酸盐缓冲盐水以1∶1混合。该混合物与HISTOPAQUE1∶1混合并于室温下，在Beckman型TJ6离心机的旋转斗(swinging bucket)中以1500rpm不减速地离心。红细胞被离心到试管的低部，血清仍在试管的表面。含有淋巴细胞的层沉降在血清和HISTOPAQUE层之间，并通过抽吸移到一个新试管中。对细胞定量并调节到3×106个细胞/ml，并将100ul等份试样放置到96孔板的孔中。在加入细菌LPS(25mg/ml)前15分钟，将试验化合物和RPMI媒介物(Gibco/BRL生命科学)加入到每个孔中。于37℃，在一个潮湿的箱中孵育该混合物20小时。然后，在室温下，通过以800rpm离心5分钟分离该细胞。为了测定TNFα的浓度，将一等份180ul上清液转移到一个新的平板中。用一种商业上可获得的酶-联免疫吸附试验试剂(ELISA)(来自Biosource International的CYTOSCREENImmunoassay Kit)测量在细胞上清液中的TNFα蛋白。
对于本发明的各种化合物，所述细胞-基础测试提供了以下结果。EC50值(即化合物能够抑制总TNFα的50％的有效浓度)说明本发明化合物抑制LPS-刺激的人PBL释放TNFα的能力。
以下总结了对结构式(I)和(II)化合物抑制人重组PDE4所测定的IC50值。在下表中，除非另外说明，否则R3为氢和n为1。
Figure A0081910900771
Figure A0081910900781
Figure A0081910900801
Figure A0081910900851
Figure A0081910900861
Figure A0081910900871
Figure A0081910900881
以上所列数据显示，式(I)和(II)化合物是有效的和选择性PDE4抑制剂，如所述化合物对人重组PDE4具有大约0.15到大约195μM的IC50值。作为一个另外的优点，式(I)和(II)化合物减少或消除与先前的PDE4抑制剂有关的不利副作用，如中枢神经系统作用。详细地说，在细胞-基础测试中和动物模型中测试式(I)和(II)化合物，以便阐述所述化合物在体外和体内抑制PDE4的功效。
对本发明的各种吡咯化合物，所述细胞-基础测试提供以下结果。所述EC50值(即化合物能够抑制总TNFα50％的有效浓度)说明本发明化合物抑制LPS-刺激的人外周血液淋巴细胞释放TNFα的能力。
  化合物   PDE4 IC50(μm) PBL/TNFαEC50(μM)
  实施例22     .15     .87
  实施例3     .20     1.50
  实施例21     .40     10.00
  实施例40     1.29     6.72
  实施例42     1.49     100.0
上表和图1说明式(I)和(II)化合物抑制PDE4活性和TNFα释放的能力。优选的化合物具有大约500nM或更低的PBL/TNFαEC50值，而优选约200nM或更低。更优选的化合物具有大约100nM或更低的PBL/TNFαEC50值。
为了体现本发明的全部优点，所述化合物对人重组PDE4具有大约100nM或更低的IC50值和大约500nM或更低的PBL/TNFαEC50值。所述化合物更优选具有大约50nM或更低的IC50值和大约100nM或更低的PBL/TNFαEC50值。动物模型 哺乳动物的血清TNFα水平(小鼠/TNFαED50(mg/kg))抑制的测定
为了评估一种化合物在哺乳动物中降低血清TNFα水平的能力，采用以下方案。本领域的那些技术人员可以理解，从前的研究已经证明，将LPS-激活的人单核细胞与可以升高cAMP的试剂，如PGE2、毛喉素和dbcAMP一起孵育会抑制TNFα的分泌。PDE4抑制剂如也可以升高cAMP的咯利普兰已被发现可抑制血清TNFα。也发现咯利普兰抑制LPS-激活的小鼠巨噬细胞分泌TNFα。因此，通过对注射LPS的小鼠给予化合物并测量降低的血清TNFα水平显示一种降低PDE4的化合物在体内的功效。雌性C3H小鼠，20-25g体重，禁食过夜并在LPS注射前60分钟腹膜内给予在适宜溶媒中的试验化合物。然后将5μg LPS腹膜内注射到小鼠中。LPS注射后90分钟，使小鼠心脏流血。在4℃下让血液凝结过夜。在一个小离心机中离心样品10分钟，移去血清并在-20℃下保存直到分析。随后用商业上可获得的ELISA试剂盒(Genzyme)，按照在试剂盒所附的方案测量TNFα的血清水平。相对于仅接受溶媒的对照小鼠的血清TNFα水平，确定由所述化合物引起的血清TNFα水平的抑制。该结果总结在图1的绘图中。组合的小鼠内毒素刺激的TNFα释放和运动活性测试
本研究的目的是在一个LPC小鼠模型中测定PDE4抑制剂在体内的功效与测定与中枢神经系统(CNS)有关的表现为自发性运动减少的副作用。
该试验动物为平均体重约20g的雌性Balb/c小鼠。用30％CremophorEL配制的PDE4抑制剂以0.1、1.0、10.0和100mg/kg的剂量经腹膜内(i.p.)注射给药。以测量的体重为基础调节个体的剂量体积(约150ul)。一小时后，将5mg/kg的LPS以200ul的终体积经尾部静脉注射给每只动物。在LPS处理后90分钟，使所述动物出血并且在于-70℃保存前收集样品，直到分析。
为了功效测定，该血清样品被稀释两倍并且用CYTOSCREEN免疫分析试剂盒(Biosource International)测定TNFα水平。对于每种试验化合物，该数据为在三份样品间的平均值。
对于副作用简述，在给予PDE4抑制剂后5分钟和20分钟采用一种主观目测评分体系。将溶媒对照组动物定为一个“+”并且将基本上不能移动的和几乎觉察不到伸展而接触该笼子底部的动物定为“++++”。或者，为了评估PDE4抑制剂对小鼠和/或大鼠的作用，使用了监测运动的一种半自动“开放区域”体系(如一个由San DiegoInstruments出售的光束活性测量系统(Photobeam Activity MeasurementSystem))。在这种情况下，可以在预先设置的时间间隔连续监测受试者。
通过计算每单位时间“光束”穿过的次数对X-Y平面运动或抬起后腿进行量化。活动事件次数的减少直接与所述动物的移动或不能移动成比例。定量的分数与上述的主观测量密切有关。
化合物 溶媒对照组 1mg/kg  10mg/kg  100mg/kg
比较实施例1) 3  3  3  3
实施例22  3  3  3
1)反式-3-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-1-甲氧基羰基-4-甲基-4-(甲基羰基)吡咯烷，即Feldman等的美国专利号5,665,754的实施例12，通过引用结合到本文中。
化合物号  剂量(mg/kg) 镇静作用 ％TNFα抑制
比较实施例1)  1 --  43
 10 +  100
 100 +++  100
实施例22  1 --  13
 10 --  84
 100 --  100
以上所列数据显示式(I)和(II)化合物是有效的和选择性PDE4抑制剂。作为一个另外的重要的优点，式(I)和(II)化合物也减少或消除与先前的PDE4抑制剂有关的不良CNS副作用。为了进一步阐述所述化合物的功效，对式(I)和(II)化合物在动物模型中的催吐(emetogenic)特性进行进一步的试验。所述催吐试验的方法和结果阐述如下。
本发明的化合物用于选择性地抑制哺乳动物体内PDE4的活性，而不显示与在先PDE4抑制剂有关的不利的中枢神经系统作用和催吐作用。
显而易见，在不背离本发明的精神和范围的条件下，可以对此前提出的本发明内容作各种修饰和改进，因此，只有所附带的权利要求书才是对本发明的唯一的限定。

Claims (40)

1.一种具有下式的化合物
Figure A0081910900021
或
其中R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；
R2为烷基或氢；
R3选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、芳基、杂芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、卤代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和卤代烷基；
R4和R5独立为氢或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳环或杂环；和
n为0到3，
前提是当R2为乙基，R1不同于3-硝基苯基、2，3-二氯苯基和3，5-双三氟甲基苯基。
2.权利要求1的化合物，其中R1选自芳基、杂芳基、杂烷芳基、烷芳基和环烷基。
3.权利要求1的组合物，其中R1选自芳基、杂芳基、环烷基和烷芳基，所述基团任选由一个或多个如下基团取代：NR4R5、卤代基、烷基、C(＝O)烷基、SO2(烷基)、C(＝O)NR5R6、SO3H、NO2、CO2H、C(＝O)O烷基和CF3。
4.权利要求1的化合物，其中R1选自：
Figure A0081910900051
和
Figure A0081910900072
5.权利要求1的组合物，其中R2选自氢和低级烷基。
6.权利要求1的组合物，其中R1为任选取代的苯基、吡啶基或环己基；R2为氢或C1-2烷基；而n为0。
7.权利要求1的化合物，它选自：1-(3-二甲基氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氯苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氯苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-2-苯基-1-间甲苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-5-苯基-1-间甲苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-溴苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-乙酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-乙酰基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-甲磺酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-甲磺酰基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基甲酰基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基甲酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-碘苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-5-苯基-1-(3-磺苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-2-苯基-1-(3-磺苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氟苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-5-苯基-1-吡啶-3-基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-环己基-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(3-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-羧基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-甲氧基羰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-溴苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-碘苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-5-苯基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-2-苯基-1-(3-三氟甲基苯基)-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(3-硝基苄基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1-(3-硝基苄基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-2-苯基-1-吡啶-3-基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(4-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(2-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；2-甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1-(4-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(4-氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(4-氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1-(3-硝基苯基)-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸；5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸；和1-(3-乙氧基羰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯。
8.权利要求1的化合物，它选自：1-(3-氯苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-乙酰基苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基甲酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氟苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-环己基-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；5-甲基-1，2-二苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；和2-甲基-1-(3-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯。
9.权利要求1的化合物，它选自：1-(3-氯苯基)-2-甲基-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-氨基甲酰基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；1-(3-二甲基氨基苯基)-5-甲基-2-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯；和2-甲基-1-(3-硝基苯基)-5-苯基-1H-吡咯-3-羧酸乙酯。
10.权利要求1的化合物，它具有对人重组PDE4约0.5μM-约25μM的IC50值。
11.权利要求1的化合物，它具有约1μM-约20μM的PBL/TNFαEC50值。
12.权利要求1的化合物，它具有对人重组PDE4约0.5μM-约25μM的IC50值，以及约1μM-约20μM的PBL/TNFαEC50值。
13.权利要求1的化合物，它具有对人重组PDE4约100μM或更低的IC50值。
14.权利要求1的化合物，它具有对人重组PDE4约50μM或更低的IC50值。
15.权利要求1的化合物，它具有约500μM或更低的PBL/TNFαEC50值。
16.权利要求1的化合物，它具有约100μM或更低的PBL/TNFαEC50值。
17.权利要求1的化合物，它具有对人重组PDE4约100μM或更低的IC50值和约500μM或更低的PBL/TNFαEC50值。
18.一种药用组合物，该组合物含有权利要求1的化合物和药学上可接受的载体。
19.一种治疗患有其中抑制cAMP-特异性PDE具有治疗益处的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的具有下式的化合物
Figure A0081910900111
或
Figure A0081910900112
其中R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；
R2为烷基或氢；
R3选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、芳基、杂芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、卤代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和卤代烷基；
R4和R5独立为氢或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳环或杂环；和
n为0到3。
20.一种在哺乳动物中调节cAMP水平的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下式化合物或
其中R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；
R2为烷基或氢；
R3选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、芳基、杂芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、卤代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和卤代烷基；
R4和R5独立为氢或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳环或杂环；和
n为0到3。
21.一种治疗患有其中抑制cAMP-特异性PDE具有治疗益处的疾病的哺乳动物的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的的药用组合物，所述药用组合物包含具有下式的化合物、药学上可接受的载体和任选的第二种抗炎治疗剂
Figure A0081910900131
或
其中R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；
R2为烷基或氢；
R3选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、芳基、杂芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、卤代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和卤代烷基；
R4和R5独立为氢或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳环或杂环；和
n为0到3。
22.权利要求21的方法，其中所述疾病为过敏性疾病、自体免疫性疾病、炎性疾病、关节炎疾病或皮炎。
23.权利要求21的方法，其中所述疾病为类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎或脊椎炎。
24.权利要求21的方法，其中所述疾病为与甲状腺有关的眼病、贝赫切特病、脓毒病、败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、中毒性休克综合征、过敏性结膜炎、春季结膜炎或朗格斯细胞肉芽肿病。
25.权利要求21的方法，其中所述疾病为哮喘、慢性支气管炎、变应性鼻炎、成人呼吸窘迫综合征、慢性肺炎、慢性阻塞性肺炎、硅肺或肺结节病哮喘、。
26.权利要求21的方法，其中所述疾病为由于脑或脊髓的轻微创伤引起的心肌、脑或肢端再灌注损伤。
27.权利要求21的方法，其中所述疾病为纤维变性、瘢痕疙瘩形成或疤痕形成。
28.权利要求21的方法，其中所述疾病为系统性红斑狼疮、移植排斥反应疾病、移植物抗宿主反应或同种移植排斥反应。
29.权利要求21的方法，其中所述疾病为慢性肾小球性肾炎、炎性肠疾病、局限性回肠炎或溃疡性结肠炎。
30.权利要求21的方法，其中所述疾病为增生性淋巴细胞疾病或白血病。
31.权利要求21的方法，其中所述疾病为炎性皮肤病、特应性皮炎、牛皮癣或荨麻疹。
32.权利要求21的方法，其中所述疾病为心肌病、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、发热、恶病质、感染或恶性肿瘤继发的恶病质、获得性免疫缺陷综合征继发的恶病质、ARC、脑型疟、骨质疏松、骨吸收疾病、由于感染引起的发烧和肌痛、尿崩症、中枢神经系统疾病、抑郁症、多梗死性痴呆、焦虑症或应激反应、脑局部缺血、迟发性运动障碍、帕金森氏病和经前期综合征。
33.权利要求21的方法，其中所述哺乳动物表现出最小的催吐反应。
34.权利要求21的方法，其中所述哺乳动物没有催吐反应。
35.权利要求21的方法，其中所述哺乳动物显示最低的不利的中枢神经系统副作用。
36.权利要求21的方法，其中所述哺乳动物没有不利的中枢神经系统副作用。
37.权利要求21的方法，其中所述第二种抗炎治疗剂能够针对TNFα。
38.一种在哺乳动物中降低TNF水平的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的具有下式的化合物或
Figure A0081910900152
其中R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；
R2为烷基或氢；
R3选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、芳基、杂芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、卤代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和卤代烷基；
R4和R5独立为氢或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳环或杂环；和
n为0到3。
39.一种抑制哺乳动物炎性细胞激活的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的具有下式的化合物
Figure A0081910900161
或
其中R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；
R2为烷基或氢；
R3选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、芳基、杂芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、卤代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和卤代烷基；
R4和R5独立为氢或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳环或杂环；和
n为0到3。
40.一种抑制哺乳动物PDE4功能的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的下式化合物或
其中R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；
R2为烷基或氢；
R3选自烷基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基、芳基、杂芳基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、C(＝O)烷基、NR4R5、C(＝O)NR5R6、C(＝O)O烷基、CO2H、OC(＝O)烷基、硝基、卤代基、烷硫基、SO2(烷基)、SO3H和卤代烷基；
R4和R5独立为氢或烷基，或R5或R6一起形成5元或6元碳环或杂环；而
n为0到3。
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