CN1434817A - 吡唑环腺苷酸－特异性磷酸二酯酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开为有效和选择性的PDE4抑制剂的吡唑化合物(I)以及制备它们的方法。也公开了所述化合物在治疗炎性疾病和其它涉及升高的细胞因子水平的疾病以及中枢神经系统(CNS)疾病中的用途，在式(I)化合物中，Y是O或NOH；Z是O或NH；R1－R4如说明书中所定义。

Description

吡唑环腺苷酸-特异性磷酸二酯酶抑制剂
                 相关申请的相互参考
本申请要求于1999年12月23日递交的美国临时申请顺序号60/172,067的优先权益。
                 本发明的领域
本发明涉及一系列为有效和选择性的环腺苷酸特异性磷酸二酯酶(cAMP特异性PDE)抑制剂的化合物。本发明尤其涉及一系列用于抑制cAMP特异性PDE功能，尤其是PDE4功能的新的吡唑化合物以及制备它们的方法、含有它们的药用组合物和它们作为例如治疗炎性疾病和其它涉及细胞因子和促炎介质水平升高的疾病的治疗药的用途。
                 本发明背景
慢性炎症为一种多因素并发症，其特征为激活多种炎性细胞，尤其是淋巴谱系细胞(包括T淋巴细胞)和骨髓谱系细胞(包括有粒白细胞、巨噬细胞和单核细胞)。包括细胞因子例如肿瘤坏死因子(TNF)和白介素-1(IL-1)的促炎介质由这些激活的细胞产生。因此，抑制激活这些细胞或抑制它们产生促炎细胞因子的药物将用于治疗性治疗炎性疾病和其它涉及细胞因子水平升高的疾病。
环腺苷酸(cAMP)为一种介导细胞对于各种各样的胞外刺激的生物应答的第二信使。当合适的激动剂与特异性细胞表面受体结合时，激活腺苷酸环化酶以便将腺苷三磷酸(ATP)转化为cAMP。推理得出诱导细胞内cAMP作用的所述激动剂主要由cAMP-依赖性蛋白激酶的作用介导。所述cAMP的胞内作用由所述核苷酸转运到细胞的外部或由环核苷酸磷酸二酯酶(PDEs)的酶裂解作用所中止，PDEs水解3’-磷酸二酯键以便形成5’-腺苷酸(5’-AMP)。5’-AMP为一种失活的代谢物。以下说明cAMP和5’-AMP的结构。
Figure A0081909000141
在人骨髓系细胞和淋巴系细胞中cAMP水平的升高与抑制细胞激活有关。因此，PDEs的细胞内酶家族调节细胞内cAMP的水平。PDE4为这些细胞内主要的PDE同种型并且是对于cAMP降解的主要贡献者。因此，抑制PDE的功能将防止cAMP转化为失活的代谢物5’-AMP，从而维持较高的cAMP水平，因而抑制细胞激活(参见Beavo等，“Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases：Structure，Regulationand Drug Action，”Wiley and Sons，Chichester，第3-14页(1990))；Torphy等，Drug News and Perspectives，6，第203-214页(1993)；Giembycz等，Clin.Exp.Allergy，22，第337-344页(1992))。
尤其是，PDE4抑制剂例如咯利普兰已被证明抑制TNFα的产生并且部分抑制单核细胞释放IL-1β(参见Semmler等，Iht.J.Immunopharmacol.，15，第409-413页(1993)；Molnar-Kimber等，Mediators of Inflammation，1，第411-417页(1992))。也已经证明PDE4抑制剂抑制由人多形核白细胞产生超氧化物自由基(参见Verghese等，J.Mol.Cell.Cardiol.，21(增补2)，S61(1989)；Nielson等，J.AllergyImmunol.，86，第801-808页(1990))；抑制人嗜碱性粒细胞的血管活性胺和前列腺素的释放(参见Peachell等，J.Immunol.，148，第2503-2510页(1992))；抑制嗜酸性粒细胞的呼吸爆发(参见Dent等，J.Pharmacol.，103，第1339-1346页(1991))；以及抑制人T-淋巴细胞的激活(参见Robicsek等，Biochem.Pharmacol.，42，第869-877页(1991))。
炎性细胞的激活和过量的或不受调节(unregulated)的细胞因子(例如TNFα和IL-1β)的产生与以下变应性、自身免疫和炎性疾病有关：例如类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎、脊椎炎、与甲状腺有关的眼病、贝赫切特病、脓毒病、败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、中毒性休克综合征、哮喘、慢性支气管炎、成人呼吸窘迫综合征、慢性肺炎例如慢性阻塞性肺炎、硅肺、肺结节病、心肌、脑和肢端再灌注损伤、纤维变性、胰囊性纤维变性、疤痕疙瘩形成、疤痕形成、动脉粥样硬化、移植排斥反应例如移植物抗宿主反应和同种移植排斥反应、慢性肾小球性肾炎、红斑狼疮、炎性肠疾病例如局限性回肠炎和溃疡性结肠炎、增殖性淋巴细胞疾病例如白血病以及炎性皮肤疾病例如特应性皮炎、牛皮癣和荨麻疹。
特征在于细胞因子水平升高的其它疾病包括由于中度的外伤引起的脑损伤(参见Dhillon等，J.Neurotrauma，12，第1035-1043页(1995)；Suttorp等，J.Clin.Invest.，91，第1421-1428页(1993))、心肌病例如充血性心力衰竭(参见Bristow等，Circulation，97，第1340-1341页(1998))、恶病质、感染或恶性肿瘤继发恶病质、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)继发恶病质、ARC(AIDS相关复症)、由于感染引起的发烧和肌痛、脑型疟、骨质疏松和骨吸收疾病、疤痕疙瘩形成、疤痕组织形成和发热。
尤其是，已经证实TNFα对于人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)具有作用。AIDS是由于T-淋巴细胞感染人免疫缺陷病毒(HIV)引起的。尽管HIV也感染并存在于骨髓细胞谱系中，已经证实TNF可以正调节HIV在T-淋巴细胞和单核细胞中的感染(参见Poli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87，第782-785页(1990))。
TNFα的几种特性，例如刺激胶原酶、刺激体内血管生成、刺激骨吸收和能够增加肿瘤细胞与内皮的附着的特性与TNF对癌在宿主体内形成和转移扩散的作用是一致的。最近，已经直接显示TNFα促进肿瘤细胞的生长和转移(参见Orosz等，J.Exp.Med.，177，第1391-1398(1993))。
PDE4具有广泛的组织分布。对于PDE4具有至少4种基因，来自任一给定基因的PDE4的多种转录物能够产生共享相同催化位点的几种不同的蛋白。在4种可能的催化位点之间氨基酸的同一性大于85％。它们共享的对抑制剂的敏感性和它们的动力学相似性反映了这个水平的氨基酸同一性的功能方面。推理出这些可变表达的PDE4蛋白的作用提供了一种机制，通过该机制，一种细胞借助翻译后修饰，可以区别地在细胞内定域这些酶和/或调节所述催化效率。任一给定的表达PDE4酶的细胞类型通常表达编码这些蛋白的4种可能的基因中的一种以上的基因。
研究者已经表现出对于使用PDE4抑制剂作为抗炎药物的极大兴趣。早期的证据显示抑制PDE4对于各种炎性细胞例如单核细胞、巨噬细胞、所述Th-1谱系的T-细胞和有粒白细胞具有有益的作用。许多促炎介质例如细胞因子、脂质介质、超氧化物和生物胺例如组胺的合成和/或释放，通过PDE4抑制剂的作用在这些细胞中已经减弱。PDE4抑制剂也影响其它细胞功能包括T-细胞增殖、有粒白细胞对于化学毒性物质反应的移行和微管结构内内皮细胞连接的完整性。
已经报道设计、合成和筛选了各种PDE4抑制剂。甲基黄嘌呤例如咖啡因、茶碱是最初被发现的PDE抑制剂，但是，这些化合物对于被抑制的PDE是非特异性的。药物咯利普兰(抗抑郁药)是最初报道的特异性PDE4抑制剂之一。已经报道，具有以下结构式的咯利普兰具有对于抑制重组人PDE4的约200nM(纳摩尔)的50％抑制浓度(IC50)。
                   咯利普兰
研究者一直在继续寻找PDE4抑制剂，它们对于抑制PDE4更有效，它们具有比咯利普兰更低的IC50值，它们避免了与给予咯利普兰有关的、不需要的中枢神经系统(CNS)的副作用例如恶心、呕吐和镇静作用。在Feldman等的美国专利号5,665,754中公开了一类化合物。其中所公开的化合物为具有与咯利普兰结构类似的取代的吡咯烷。一种具有以下结构式的具体的化合物具有对于人重组PDE4的IC50为约2nM。由于观察到良好的催吐副作用与功效的分离，这些化合物没有显示降低不需要的中枢神经系统作用。
Figure A0081909000172
此外，有几家公司正在进行其它PDE4抑制剂的临床试验。然而，涉及疗效和不利的副作用例如呕吐和中枢神经系统紊乱的问题仍未解决。
因此，选择性抑制PDE4的化合物，其降低或消除与先前的PDE4抑制剂有关的不利的中枢神经系统副作用，将用于治疗变应性和炎性疾病以及其它与细胞因子例如TNF过度或不受调节产生有关的疾病。此外，选择性PDE4抑制剂将用于治疗与在特定靶组织中升高的cAMP水平或PDE4功能有关的疾病。
                    本发明概述
本发明涉及用于治疗其中认为抑制PDE4活性是益的疾病和病症的有效和选择性的PDE4抑制剂。本发明的PDE4抑制剂出人意料地降低或消除与先前的PDE4抑制剂有关的不利的中枢神经系统的副作用。
本发明尤其涉及具有结构式(I)的吡唑化合物：
Figure A0081909000181
其中Y是O或NOH；Z是O或NH；P是0或1；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；和R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元的环。
本发明也涉及含有一种或更多种结构式(I)的化合物的药用组合物，涉及所述化合物和含有所述化合物的组合物在治疗疾病或症状中的用途以及涉及制备所述化合物和合成结构式(I)的化合物中的中间体的方法。
                   附图的简述
图1为血清中TNFα的浓度(pg/mL)相对于PDE4抑制剂浓度的图形。
                优选实施方案的详述
本发明涉及具有以下结构式的化合物：其中Y是O或NOH；Z是O或NH；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、甲基、C3-16烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基和芳基；条件是当R1是未取代的苯基时，R2不是未取代的苯基、未取代的吡啶基或对-甲苯基。
本发明也涉及具有以下结构式的化合物：
Figure A0081909000201
其中Y是O或NOH；Z是O或NH；p是0或1；R1选自烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2是乙基；R3和R4独立选自氢、烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元的环；条件是R1不是硝基取代的吡啶基、氨基-取代的苯基、硝基-取代的苯基、三氯代苯基和氯代三氟苯基。
本发明还涉及具有以下结构式的化合物：和
本发明的一个重要特征是治疗其中抑制PDE活性是有益的疾病或症状的方法。该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的结构式(I)的化合物。其中Y是O或NOH；Z是O或NH；p是0或1；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；和R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元的环。
结构式(I)的化合物可以单独使用，可以以纯的或以其中还含有药学上可接受的载体的组合物形式使用。结构式(I)的化合物也可以以与第二种活性治疗药物如可以针对TNFα的第二种抗炎治疗药物联合给药。
结构式(I)的化合物可以用于调节哺乳动物体内cAMP水平，降低哺乳动物体内TNFα水平，抑制哺乳动物体内炎性细胞的激活，抑制PDE4在哺乳动物体内的功能并治疗哺乳动物的抑制PDE4是有益的疾病。如在本文中所使用，术语“哺乳动物”包括雄性和雌性，并且包括人、家养动物(例如猫、狗)、家畜(例如牛、马、猪)和野生生物(例如灵长类、大型猫科动物、哺乳动物的动物园标本)。
如在本文中所使用，术语“烷基”，单独或者结合，定义为包括直链和支链以及桥连的、含1-16个碳原子的饱和烃基。“Cm-n烷基”指含有m-n个碳原子的烷基。术语“低级烷基”此处定义为具有1-6个碳原子的烷基(C1-C6)。低级烷基的实例包括，但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、异丁基、正丁基、新戊基、正己基等。
术语“桥连的烷基”此处定义为C6-C16的双环或多环烃基，例如降冰片基、金刚烷基、双环[2.2.2]辛基、双环[2.2.1]庚基、双环[3.2.1]辛基或十氢萘基。
术语“环烷基”此处定义为包括环C3-C7烃基。环烷基的实例包括，但不限于环丙基、环丁基、环己基和环戊基。
术语“卤代烷基”此处定义为被一个或更多个卤代基：氟代基、氯代基、溴代基、碘代基或者其组合取代的烷基。类似地，“卤代环烷基”定义为具有一个或更多个卤代基的环烷基。
术语“芳基”，单独或结合，此处定义为单环或多环的芳族基团，优选单环或双环的芳族基团，例如苯基或萘基，所述芳基可以为未取代的或者例如被一个或更多个、尤其1-3个选自以下的取代基取代：卤代基、烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、苯磺酰基氨基、烷硫基、烷基亚磺酰基和烷基磺酰基。实例性的芳基包括苯基、萘基、四氢萘基、2-氯代苯基、3-氯代苯基、4-氯代苯基、2-甲基苯基、4-甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、4-硝基苯基等。
术语“杂芳基”此处定义为含有一个或者两个芳族环并且在芳环上含有至少一个氮、氧或硫原子的单环或双环系，该环系可以为未取代的或者例如被一个或更多个、尤其1-3个如下的取代基取代：像卤代基、烷基、羟基、羟基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、卤代烷基、硝基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、苯磺酰基氨基、烷硫基、烷基亚磺酰基和烷基磺酰基。杂芳基的实例包括噻吩基、呋喃基、吡啶基、噁唑基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、三唑基、异噻唑基、异噁唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基。
术语“芳烷基”此处定义为在先定义的烷基，其中所述烷基的氢原子之一由如此处定义的芳基例如苯基置换，所述芳烷基任选具有一个或更多个取代基例如卤代基、烷基、烷氧基等。芳基烷基的实例是苄基。
术语“烷芳基”此处定义为在先定义的芳基，其中所述芳基的氢原子之一被烷基、环烷基、卤代烷基或卤代环烷基置换。
术语“杂芳烷基”和“杂烷芳基”类似如术语“芳烷基”和“烷芳基”所定义，然而，所述芳基被如在先定义的杂芳基置换。
术语“杂环基”或“杂环”定义为具有一个或更多个存在于环中的选自氧、氮和硫原子的杂原子的5-或6-元非芳族环。非限制性的实例包括四氢呋喃、哌啶、哌嗪、环丁砜、吗啉、四氢吡喃、二噁烷等。“碳环”类似定义，但所述环中仅含有碳原子。
术语“卤素”或“卤代基”此处定义为包括氟、氯、溴和碘。
术语“烷氧基”、“芳氧基”和“芳烷氧基”定义为-OR，其中R分别为烷基、芳基和芳烷基。
术语“烷氧基烷基”定义为连接烷基的烷氧基。术语“芳氧基烷基”和“芳烷氧基烷基”类似地定义为连接烷基的芳氧基或芳烷氧基。术语“(烷硫基)烷基”、“(芳硫基)烷基”和“(芳烷硫基)烷基”类似定义为三个以上定义的基团，只是存在硫原子，而不存在氧原子。
术语“羟基”定义为-OH。
术语“羟基烷基”定义为连接烷基的羟基。
术语“氨基”定义为-NH2。
术语“烷基氨基”定义为-NR2，其中至少一个R为烷基，第二个R为烷基或氢。
术语“酰基氨基”定义为RC(＝O)NH，其中R为烷基或芳基。
术语“硝基”定义为-NO2。
术语“烷硫基”“芳硫基”和“芳烷硫基”定义为-SR，其中R分别为烷基、芳基和芳烷基。
术语“烷基亚磺酰基”定义为R-S(O)2，其中R为烷基。
术语“烷基磺酰基”定义为R-S(O)3，其中R为烷基。
在优选的实施方案中，R1选自任选取代的烷基、芳基、烷芳基和杂芳基；R2选自任选取代的氢、烷基和芳基；及R3和R4独立选自任选取代的烷基、芳基、氢、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6。
在最优选的实施方案中，R1是芳基、环烷基或杂芳基，任选由一个或更多个下列基团取代：硝基、氨基、低级烷基、烷氧基、卤代基、三氟代甲基、
Figure A0081909000251
和R1通常是任选取代的苯基、吡啶基或环己基。
在最优选的实施方案中，R2是烷基、氢、
Figure A0081909000271
或R2通常是乙基、甲基或氢，p是1，及Y和Z是O。
在最优选的实施方案中，R3和R4独立是烷基、氢、三氟代甲基、-C(＝O)CH＝CHN(CH3)2、-C(＝O)CH3或-CH2OCH3。R3和R4通常是甲基或氢。
本发明包括结构式(I)化合物的所有可能的立体异构体和几何异构体，并且不仅包括外消旋化合物而且也包括光学活性异构体。当需要结构式(I)化合物的单一的对映体时，通过拆分终产物或者通过由异构体纯的原料或者使用手性助剂(例如参见Z.Ma等，Tetrahedron：Asymmetry，8(6)，第883-888页(1997))立体有择合成可以得到该单一的对映体。终产物、中间体或者原料的拆分可以通过本领域已知的任何合适的方法完成。此外，在其中结构式(I)化合物的互变异构体可能存在的情况下，本发明意欲包括所述化合物的所有互变异构形式。如此后所证明的，特定的立体异构体显示抑制PDE4的优越的能力，并且没有常见与PDE4抑制剂有关的不利的中枢神经系统副作用。
含有酸性基团的结构式(I)的化合物可以与合适的阳离子形成药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的阳离子包括碱金属(例如钠或钾)和碱土金属(例如钙或镁)阳离子。含有碱性中心的结构式(I)化合物的药学上可接受的盐为与药学上可接受的酸形成的酸加成盐。实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或硫酸氢盐、磷酸盐或磷酸氢盐、乙酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、葡糖酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐。根据前文所述，任何本文中提到的本发明化合物意欲包括结构式(I)化合物以及其药学上可接受的盐和溶剂合物。
本发明的化合物可以作为纯的化学品在治疗上给药，但是优选作为药用组合物或制剂给予结构式(I)化合物。因此，本发明还提供含有结构式(I)化合物或其药学上可接受的盐以及一种或更多种药学上可接受的载体和任选其它治疗和/或预防成分的药用制剂。所述载体在与所述制剂中的其它成分相容并且不损害其接受者的意义上为“可接受的”。
尤其是，本发明的选择性PDE4抑制剂单独或与第二种抗炎治疗药例如针对TNFα的治疗药如具有治疗类风湿性关节炎用途的ENBREL或REMICADE联合是有效的。同样，IL-1的拮抗作用的治疗用途在类风湿性关节炎的动物模型中也已经得到证明。因此，想象IL-1的拮抗作用与减弱TNFα的PDE4抑制作用结合将是有效的。
本发明的PDE4抑制剂用于治疗各种变应性、自身免疫和炎性疾病。
术语“治疗”包括预防、降低、阻止或逆转所治疗疾病或症状的发展或严重。如此，术语“治疗”包括适当的医学治疗和/或预防给药。
尤其是，炎症为一种局部、保护性反应，它是由组织的损伤或破坏引起的，它可以破坏、稀释或隔绝(即隔离)有害物质和受损的组织。如此处所用的术语“炎性疾病”，指任何其中过度或不受调节的炎性反应导致过度的炎性症状、宿主组织损伤或丧失组织功能的疾病。此外，如此处所用的术语“自身免疫疾病”指任何种类的其中组织损伤与对于身体自身成分的体液或细胞调节反应有关的疾病。如此处所用的术语“变应性疾病”指由变态反应产生的任何症状、组织损伤或组织功能丧失。如此处所用的术语“关节疾病”指特征在于归因于各种病因的关节炎性损伤的一大类疾病中的任何一种。如此处所用的术语“皮炎性疾病”指特征在于归因于各种病因的皮肤炎症的一大类皮肤疾病中的任何一种。如此处所用的术语“移植排斥”指特征在于移植的组织和周围的组织功能丧失、疼痛、肿胀、白细胞增多和血小板减少的直接针对移植组织(包括器官和细胞(例如骨髓))的任何免疫反应。
本发明也提供调节哺乳动物体内cAMP水平的方法以及治疗特征为细胞因子水平升高的疾病的方法。
如此处所用的术语“细胞因子”指任何分泌的多肽，该多肽影响其它细胞的功能并调节所述免疫或炎性反应中细胞之间的相互作用。细胞因子包括，但不限于单核因子、淋巴因子和趋化因子而不管是那些细胞产生。例如，单核因子通常指由单核细胞产生和分泌的，然而，许多其它细胞产生单核因子例如天然杀伤细胞、成纤维细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、内皮细胞、脑星形胶质细胞、骨髓基质细胞、表皮角质细胞和B-淋巴细胞。淋巴因子通常指由淋巴细胞产生的。细胞因子的实例包括，但不限于白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和肿瘤坏死因子β(TNFβ)。
本发明还提供降低哺乳动物体内TNF水平的方法，该方法包括给予所述哺乳动物有效量的结构式(II)的化合物。如此处所用的术语“降低TNF水平”指以下情况之一：
a)通过抑制所有细胞包括，但不限于单核细胞或巨噬细胞体内释放TNF，降低哺乳动物体内的过高TNF水平到正常水平或者低于正常水平；或
b)在翻译或转录水平诱导哺乳动物体内的过高TNF水平下调到正常水平或者低于正常水平；或
c)通过抑制作为翻译后事件的直接合成TNF诱导下调。
此外，本发明化合物用于抑制炎性细胞激活。如此处所用的术语“炎性细胞激活”指由刺激(包括，但不限于细胞因子、抗原或自身抗体)诱导的增殖性细胞反应，产生可溶性的介质(包括，但不限于细胞因子、氧自由基、酶、前列腺素类或血管活性胺)或者在炎性细胞(包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、有粒白细胞、多形核白细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞和内皮细胞)中，新的或增加数量的介质(包括，但不限于主要组织相容性抗原或细胞粘着分子)的细胞表面表达。本领域技术人员可以理解这些细胞的这类表型中的一种或其组合的激活可引起炎症的起始、延长或恶化。
本发明化合物也用于引起气道平滑肌松弛、支气管扩张和防止支气管缩小。
因此，本发明化合物用于治疗以下疾病例如关节疾病(如类风湿性关节炎)、骨关节炎、痛风性关节炎、脊椎炎、与甲状腺有关的眼病、贝赫切特病、脓毒病、败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、中毒性休克综合征、哮喘、慢性支气管炎、变应性鼻炎、变应性结膜炎、春季结膜炎、朗格斯细胞肉芽肿病、成人(急性)呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性肺炎(例如慢性阻塞性肺炎)、硅肺、肺结节病、心肌、脑或肢端再灌注损伤、由于轻度外伤引起的脑或脊髓损伤、包括胰囊性纤维变性的纤维变性、疤痕疙瘩形成、疤痕组织形成、动脉粥样硬化、自身免疫疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)和移植排斥反应(例如移植物抗宿主(GvH)反应和同种移植排斥反应)、慢性肾小球性肾炎、炎性肠疾病例如局限性回肠炎和溃疡性结肠炎、增殖性淋巴细胞疾病如白血病(例如慢性淋巴细胞白血病；CLL)(参见Mentz等，Blood 88，第2172-2182(1996))以及炎性皮肤疾病例如特应性皮炎、牛皮癣或荨麻疹。
这类疾病或有关症状的其它实例包括心肌病例如充血性心力衰竭、发热、恶病质、感染或恶性肿瘤继发恶病质、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)继发恶病质、ARC(AIDS相关复症)、脑型疟、骨质疏松和骨吸收疾病以及由于感染引起的发烧和肌痛。此外，本发明化合物用于治疗尿崩症和中枢神经系统疾病例如抑郁症和多梗死性痴呆。
本发明化合物也具有通常称作治疗药以外的用途。例如，本发明化合物也可以用作器官移植的保存剂(参见Pinsky等，J.Clin.Invest.，92，第2994-3002页(1993))。
选择性的PDE4抑制剂也可以用于治疗尿崩症(Kidney Int.，37，第362页(1990)；Kidney Int.，35，第494页，(1989))和中枢神经系统疾病例如多梗死性痴呆(Nicholson，Psychopharmacology，101，第147页(1990))、抑郁症(Eckman等，Curr.Ther.Res.，43，第291页(1988))、焦虑症和应激反应(Neuropharmacology，38，第1831页(1991))、脑局部缺血(Eur.J.Pharmacol.，272，第107页(1995))、迟发性运动障碍(J.Clin.Pharmocol.，16，第304页(1976))、帕金森病(参见Neurology，25，第722页(1975)；Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.，26，第421页(1999))和经前综合征。对于抑郁症而言，PDE4选择性抑制剂显示在各种抑郁症的动物模型例如“行为绝望”或Porsolt试验(Eur.J.Pharmacol.，47，第379页(1978)；Eur.J.Pharmacol.，57，第431页(1979)；Antidepressants：neurochemical，behavioral and clinical prospectives，Enna，Malick，and Richelson，eds.，Raven Press，第121页(1981))和“尾悬浮试验”(Psychopharmacology，85，第367页(1985))中有效。最新的研究成果显示通过各种抗抑郁药长期体内治疗增加PDE4的脑性表达(J.Neuroscience，19，第610页(1999))。因此，选择性的PDE4抑制剂可以单独使用或者与第二种治疗结合使用，四种主要的抗抑郁治疗为电惊厥方法、单胺氧化酶抑制剂和5-羟色胺或去甲肾上腺素的选择性重摄取抑制剂。选择性的PDE4抑制剂也可以用于借助直接作用于支气管平滑肌细胞来调节支气管扩张活性用于治疗哮喘。
适用于本发明中的化合物和药用组合物包括其中以有效量给予所述活性成分以便达到治疗目的的化合物和药用组合物。更准确地说，“治疗有效量”指有效防止所治疗患者已有症状发展或者缓解该症状的量。该有效量的确定完全在本领域技术人员的知识范围内(特别是参照本发明所公开的细节)。
“治疗有效剂量”指达到所需的作用的所述化合物的量。这类化合物的毒性和治疗效果可以在细胞培养基中或者实验动物中通过标准药学方法确定，例如确定LD50(群体的50％致死的剂量)和ED50(群体的50％治疗有效剂量)。毒性和有效作用之间的剂量比例为治疗指数，它表示为LD50和ED50间的比值。优选显示高的治疗指数的化合物。由这类数据得出的资料可以用于计算用于人的剂量范围。这类化合物的剂量优选在包括几乎没有或者没有毒性的ED50的循环浓度范围内。根据所使用的剂型和所用的给药途径所述剂量可以在该范围内变化。
精确的处方、给药途径和剂量可以由每个医生根据患者的病情来选择。可以个别调整剂量和间隔时间以便提供足以维持治疗效果的活性部分的血药浓度。
正如本领域技术人员可以理解的，此处所述的治疗可以延伸到预防以及治疗已确诊的疾病或者症状。进一步可以理解，所需用于治疗的本发明的化合物的量根据所治疗疾病的性质、患者的年龄和状况而变化并且最终由主治医生或兽医决定。然而，一般来说用于成人治疗的常用剂量在每日0.001mg/kg至约100mg/kg。所需剂量可以方便地以单一剂量给予或以合适的间隔时间，以多剂量给予，例如每日两个、三个、四个或更多个亚剂量给予。在实践当中，医生决定最适合于每个患者的实际给药方案，所述剂量根据具体患者的年龄、体重和反应而改变。以上剂量为平均情况下的实例，但可能有个别情况，其中需要较高或较低的剂量，这也在本发明的范围内。
本发明的制剂可以以用于治疗所指定疾病的标准方式给予，例如口服、非肠道、经粘膜(例如舌下或者口含给药)、局部、经皮、直肠、经吸入(例如鼻或者肺深部吸入)。非肠道给药包括，但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鞘内和关节内。胃肠外给药也可以使用高压技术像POWDERJECTTM完成。
对于口含给药而言，所述组合物可以是以常规方式配制的片剂或者锭剂形式。例如，用于口服给予的片剂和胶囊可以含有常规的赋形剂例如粘合剂(例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、淀粉浆或者聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(例如乳糖、蔗糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙或者山梨糖醇)、润滑剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸、滑石、聚乙二醇或者二氧化硅)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或者羟基乙酸淀粉钠)或者润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。可以根据本领域熟知的方法将所述片剂包衣。
或者，本发明的化合物可以掺入口服液体制剂例如水性或者油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆或者酏剂中。因此，含有这些化合物的制剂可以作为用水或者其它合适的溶媒在使用前复制的干燥产品提供。这类液体制剂可以含有常规的添加剂例如悬浮剂，如山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨糖醇单油酸酯或者阿拉伯胶；非水性溶媒(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分级椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇；和防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯或者丙酯和山梨酸。
这类制剂也可以配制为栓剂，例如含有常规的栓剂基质如可可脂或者其它甘油酯。用于吸入的组合物一般可以以溶液、悬浮液或者乳液的形式提供，它们可以以干粉或者以使用常规抛射剂(例如二氯二氟甲烷或者三氯氟甲烷)的气溶胶的形式给予。典型的局部和经皮制剂含有常规含水或者非水介质，例如为滴眼剂、乳膏、软膏、洗剂和糊剂或者为加药的膏药、贴剂或者膜剂。
此外，本发明的组合物可以配制用于经注射或者连续输注非肠道给予。注射剂可以是在油性或者水性溶媒中的悬浮剂、溶液剂或者乳剂形式并且可以含有组方剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，所述活性成分可以是在使用前用合适的溶媒(例如无菌、无致热源水)复制的粉末形式。
根据本发明的组合物也可以配制为储库型制剂。这类长效制剂可以植入给予(例如皮下或者经粘膜)或者通过肌内注射给予。因此，本发明的化合物可以与合适的聚合物或者疏水性物质(例如在可接受的油中的乳剂)、离子交换树脂一起或者作为微溶的衍生物(例如微溶的盐)配制。
对于兽医使用而言，式(I)化合物或其非毒性盐作为根据常规兽医实践的可合适接受的制剂给予。兽医可以容易地确定最适合具体动物的给药方案和给药途径。
因此，本发明另一方面提供含有式(I)化合物以及药学上可接受的稀释剂或者载体的药用组合物。本发明进一步提供制备含有式(I)化合物的药用组合物的方法，该方法包括将式(I)化合物与药学上可接受的稀释剂或者载体混合。
以下提供结构式(I)化合物的具体的、非限制性实施例，其合成根据以下给出的方法进行。
一般而言，结构式(I)的化合物可以根据以下合成方案制备。在下述方案中，本领域内可以理解，当需要时，根据合成化学的一般原理可以使用保护基团。这些保护基团在合成的最终步骤中可以在本领域技术人员显而易见的碱性、酸性或者氢解条件下除去。通过使用合适地处理和保护任何化学官能团，未在本文中专门提到的结构式(I)的化合物的合成可以通过与以下提出的方案类似的方法完成。
除非另外指出，所有的原料均从供应商处获得并且未经进一步纯化而使用。所有反应物和层析流分通过薄层层析，在250mm硅胶板上分析，用UV(紫外)光和I2(碘)显色目测观察。用Biotage 40M硅胶(230-400目)进行快速柱层析。产物和中间体经快速层析和反相HPLC纯化。
如以下说明，通过在吡啶存在下，在如下所示环化反应中，结构式(II)的肼与结构式(III)的丁酸衍生物反应制备通用结构式(I)的化合物。
Figure A0081909000351
中间体1(5-硝基吡啶-2-基)肼的制备
用注射泵向溶于无水乙醇中的2-氯代-5-硝基吡啶(30mmol，5.0g)溶液中加入溶于乙醇中的水合肼(320mmol，15.8g)的溶液。在加入结束后，将该反应物冷却。所指定的产物从反应物介质中沉淀，经过滤收集并从乙醇中重结晶。实施例11-(4-溴代苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
将对溴代苯肼盐酸盐(10mmol，2.5g)加入到2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯(10mmol，1.7g)的乙醇(10mL)和吡啶(10mL)溶液中。将该混合物在室温下搅拌过夜。使用氯仿的薄层层析(TLC)分析指示所述反应已完成。在真空下除去溶剂。将残余物溶于150mL乙醚中，然后用50mL水洗涤以除去吡啶。经硫酸钠(Na2SO4)干燥乙醚液，滤出固体，然后在真空下除去溶剂。将得到的油状物在硅胶柱上纯化。在柱流出液放置过程中所指定的产物结晶，m.p.71℃-73℃。经1H-NMR和13C-NMR分析验证所合成的指定产物。
实施例23，5-二甲基-1-(3-硝基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
与实施例1类似，将间硝基苯肼盐酸盐(10mmol，1.9g)和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯(10mmol，1.7g)在50％吡啶的乙醇溶液中混合。在反应介质中形成沉淀物并经过滤收集。分析验证所合成的指定产物，m.p.107.7℃-109.2℃。
实施例33，5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
与实施例1类似，将苯肼(7.5mmol，0.8g)和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯(7.5mmol，1.3g)在50％吡啶的乙醇溶液中混合。在真空下除去溶剂并将该油状物重悬浮在氯仿中。将得到的悬浮液用5％碳酸氢钠、5％盐酸、然后用盐水洗涤。经Na2SO4干燥有机层，滤出固体并在真空下除去溶剂。在硅胶上纯化粗制产物得到所指定的产物，为油状物。1H-NMR(CDCl3，ppm)：1.37t(3H)；2.51s(6H)；4.32q(2H)；7.42bs(5H)。实施例43，5-二甲基-1-对-甲苯基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000381
与实施例1类似，将对甲基苯肼(10mmol，1.8g)和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯(10mmol，1.7g)在50％吡啶的乙醇溶液中混合。在真空下除去溶剂。经硅胶纯化所指定的产物(m.p.47℃-49℃)。
实施例53，5-二甲基-1-(2-硝基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000382
与实施例1类似，将间硝基苯肼(20mmol，3.4g)和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯(20mmol，3.4g)在50％吡啶的乙醇溶液中混合并在回流下加热。然后，在真空下除去溶剂并将残余物重悬浮在氯仿中。将得到的混合物用水洗涤并经Na2SO4干燥。然后，滤出固体并在真空下除去溶剂。当将该油状固体溶于20％己烷的氯仿溶液中时形成沉淀物。收集固体并弃去，在硅胶上纯化滤液。所指定的产物含有杂质，然后经从乙醇中重结晶进一步纯化，得到熔点为128℃-130℃的固体。
实施例63，5-二甲基-1-(2-氨基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
向3，5-二甲基-1-(2-硝基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(0.4g)的等比例的乙醇和乙酸乙酯溶液中的溶液当中加入5％Pd/C(37mg)。将该溶液在45psi下用氢气处理。当反应完成后，将该混合物经硅藻土过滤，然后在真空下浓缩滤液。收集所指定的为油状的产物，然后经快速层析纯化，得到熔点为59℃-61℃的固体产物。
实施例73，5-二甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000392
从Maybridge Chemical Co.，Ltd.，Cornwall，UK购买得到所指定的产物，没有进一步纯化而使用。实施例83，5-二甲基-1-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000401
与实施例1类似，将2-吡啶基肼(7.5mmol，0.8g)和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯(7.5mmol，1.3g)在50％吡啶的乙醇溶液中混合，然后在回流下加热。在真空下除去溶剂并将残余物在硅胶上纯化。所指定的产物放置中结晶(m.p.49℃-50℃)。
实施例91-(3-氨基苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000402
将实施例2的化合物(1.8g)溶于乙醇中，然后将0.2g 5％Pd/C加入到该溶液中。将该混合物在45psi下用氢气处理。当反应完成后，通过硅藻土过滤该溶液并在真空下浓缩滤液。所指定的产物放置当中缓慢结晶(m.p.93℃-95℃)。实施例103，5-二甲基-1-(3-硝基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000411
从Maybridge Chemical Co.购买得到所指定的产物，其没有进一步纯化而使用。
实施例113，5-二甲基-1-(4-氨基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000412
从Maybridge Chemical Co.购买得到所指定的产物，其没有进一步纯化而使用。实施例121-(3-氨基吡啶-2-基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
将实施例10的化合物用硼氢化钠(NaBH4)(17.2mmol)的甲醇(15mL)溶液还原。常规处理后，经硅胶纯化所述产物。经1H＝NMR(CDCl3，ppm)分析所指定的产物：1.38t(3H)；2.50s(3H)；2.60s(3H)；4.33q(2H)；4.44s(2H)；7.16m(2H)；7.93dd(1H)。
实施例131-[4-(4-甲氧基苯磺酰基氨基)-苯基]-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
从Maybridge Chemical Co.购买得到所指定的化合物，其没有进一步纯化而使用。实施例141-[4-(2，2-二甲基丙酰基氨基)-苯基]-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
从Maybridge Chemical Co.购买得到所指定的化合物，其没有进一步纯化而使用。
实施例153，5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酸对甲苯酯的制备
从Maybridge Chemical Co.购买得到所指定的化合物，其没有进一步纯化而使用。实施例163，5-二甲基-1-(3-硝基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸的制备
在80℃下，将实施例10的化合物(0.34mmol，0.1g)用50％甲醇水溶液中的氢氧化锂(LiOH.H2O)(0.51mmol，0.021g)处理。在真空下除去甲醇，将得到的溶液酸化至pH2-3，将所述产物用乙酸乙酯萃取并经硫酸钠(Na2SO4)干燥。经过滤除去固体并在真空下除去溶剂。得到的固体没有进一步纯化而使用，经1H-NMR分析确定所述固体是所指定的化合物：1H-NMR(CDCl3，ppm)：2.48s(3H)；2.76s(3H)；7.58dd(1H)；7.32dd(1H)；8.76dd(1H)。
实施例173，5-二甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
与实施例1类似，将等摩尔量的(5-硝基吡啶-2-基)肼和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯在50％吡啶的乙醇溶液中混合。分析确证合成所指定的产物(m.p.117℃-119℃)。
实施例181-(4-氨基苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸的制备
Figure A0081909000451
与实施例16类似，将实施例11的化合物(0.38mmol，0.1g)用50％甲醇水溶液中的LiOH.H2O(0.57mmol，0.024g)处理。经1H-NMR(CDCl3，ppm)确证得到的固体为所指定的化合物：2.46sd(3H)；2.57s(2H)；2.75sd(3H)；7.85dd(2H)；8.42dd(2H)。
实施例191-环己基-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000452
与实施例1类似，将等摩尔量的环己基肼盐酸盐和2-乙酰基-3-氧代丁酸乙酯在50％吡啶的乙醇溶液中混合。分析确证合成所指定的产物(m.p.66℃-67℃)。实施例201-苄基-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000461
与实施例1类似，将等摩尔量的苄肼二盐酸盐和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯在50％吡啶的乙醇溶液中混合。经1H-NMR(CDCl3，ppm)确证得到的油状物为所指定的产物：1.35t(3H)；2.44s(3H)；2.45s(3H)；4.38a(2H)；5.25s(2H)；7.08d(2H)；7.29m(3H)。
实施例211-(3-氯代苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000462
与实施例1类似，将等摩尔量的3-氯代苯肼盐酸盐和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯在50％吡啶的乙醇溶液中混合。分析确证得到的固体为所指定的产物(m.p.56℃-57℃)。实施例223，5-二甲基-1-间-甲苯基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
与实施例1类似，将等摩尔量的间-甲基苯肼盐酸盐和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯在50％吡啶的乙醇溶液中混合。经快速层析纯化得到的油状物，得到所指定的产物，为固体(m.p.46.5℃-47.5℃)。
实施例231-(3-氟代苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000472
与实施例1类似，将等摩尔量的3-氟代苯肼盐酸盐和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯在50％吡啶的乙醇溶液中混合。分析显示得到的固体为所指定的产物(m.p.55℃-56.1℃)。实施例241-(3-甲氧基苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000481
与实施例1类似，将等摩尔量的3-甲氧基苯肼盐酸盐和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯在50％吡啶的乙醇溶液中混合。经1H-NMR(CDCl3，ppm)确证得到的固体为所指定的产物：1.38t(3H)；2.50s(3H)；2.52s(3H)；3.84s(3H)；4.32q(2H)；6.96m(3H)；7.3st(1H)。
实施例251-(3-溴代苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000482
与实施例1类似，将等摩尔量的3-溴代苯肼盐酸盐和2-乙酰基-3-氧代-丁酸乙酯在50％吡啶的乙醇溶液中混合。分析显示得到的固体为所指定的产物(m.p.34℃-35℃)。实施例263-甲基-1-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000491
与实施例1类似，将等摩尔量的2-吡啶基肼和2-甲酰基-3-氧代-丁酸乙酯在50％吡啶的乙醇溶液中混合。分析显示得到的固体为所指定的产物(m.p.49℃-50℃)。
实施例271-(4-氨基苯基)-5-三氟代甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯的制备
Figure A0081909000492
向溶于甲醇(4mL)中的1-(4-硝基苯基)-5-三氟代甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(0.5g，1.5mmol)中加入披钯碳和甲酸铵(0.428g，6.8mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜。在真空下除去溶剂，然后将该物质重悬浮在氯仿中并用水(两次)和饱和碳酸氢钠(一次)洗涤，经硫酸镁(MgSO4)干燥有机层。滤出固体并在真空下除去溶剂。经硅胶纯化反应产物得到所指定的产物(m.p.102℃-103℃)。
以下实施例28-37的化合物从Maybridge Chemical Co.，Ltd.(实施例29、30、32-37)、ACROS Organics，Pittsburgh，PA(实施例28)或BionetResearch Ltd.，Cornwall，UK(实施例31)购买得到，并没有进一步纯化而使用。
实施例283，5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲醛
Figure A0081909000501
实施例295-(3-二甲基氨基丙烯酰基)-1-(6-甲基-4-三氟代甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸甲酯
Figure A0081909000502
实施例301-(4-硝基苯基)-5-三氟代甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
Figure A0081909000511
实施例311-(3-氯代-5-三氟代甲基吡啶-2-基)-5-甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
实施例321-[5-甲基-1-(6-甲基-4-三氟代甲基-吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-乙酮肟实施例335-乙酰基-1-(6-甲基-4-三氟代甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸甲酯
实施例343，5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酸吡啶-4-基酰胺
Figure A0081909000522
实施例355-甲氧基甲基-1-(2，4，6-三氯代苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯
Figure A0081909000523
实施例363，5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酸苯基酰胺
Figure A0081909000531
实施例375-乙酰基-1-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-甲酸甲酯
测试了结构式(I)化合物抑制PDE4的能力。一种化合物抑制PDE4活性的能力与该化合物的IC50值即抑制50％的酶活性所需抑制剂的浓度有关。使用人重组PDE4确定结构式(I)化合物的IC50值。
本发明的化合物一般显示对于重组人PDE4的IC50值为低于约100μM，优选低于约50μM，更优选低于约25μM。本发明化合物一般显示对于重组人PDE4的IC50值为低于约10μM并常常低于约1μM。为充分体现本发明的优点，本发明的PDE4抑制剂具有的IC50值为约0.05μM-约25μM。
由一般使用在0.1pM-500μM范围内的浓度的浓度-反应曲线，确定所述化合物的IC50值。使用如Loughney等在J.Biol.Chem.，271，第796-806页(1996)中所述的标准方法的针对其它PDE酶的试验也表明本发明的化合物对于cAMP特异性PDE4酶具有高度选择性。
尤其是，本发明的化合物即实施例2具有对于人重组PDE4B的IC50值为0.1μM，但是对于PDE1A的IC50值为25.1μM，对于PDE1B为25.7μM，对于PDE1C为30.2μM，对于PDE2为21.8μM，对于PDE3A为137μM，对于PDE5为25.6μM和对于PDE7为39μM。这说明本发明化合物对于抑制PDE4的选择性。
测试了结构式(I)和(II)的化合物减少在人外周血淋巴细胞中TNFα分泌的能力。一种化合物减少TNFα分泌的能力与该化合物的EC50值(即能抑制50％的总的TNFα的化合物的有效浓度)有关。
本发明化合物一般显示EC50值为低于约50μM，优选低于约20μM，更优选低于约15μM。本发明化合物优选显示PBL/TNFα的EC50值为低于约10μM并常常低于约5μM。为充分体现本发明的优点，本发明的PDE4抑制剂具有的EC50值为约0.01μM-约15μM。
通过本领域众所周知的方法可以完成重组人PDEs的产生和IC50和EC50值的测定。以下介绍典型的方法：人PDEs的表达在杆状病毒感染的草地贪夜蛾(Spodoptera fugiperda)(Sf9)细胞中的表达
使用pBlueBacIII(Invitrogen)或者pFastBac(BRL-Gibco)构建杆状病毒转移质粒。通过跨越所述载体接点进行测序并且通过对由PCR产生的所有区进行完全测序，证实所有质粒的结构。质粒pBB-PDE1A3/6在pBlueBacIII中含有PDE1A3的完整的可读框(Loughney等，J.Biol.Chem.，271，第796-806页(1996))。质粒Hcam3aBB在pBlueBacIII中含有PDE1C3的完整的可读框(Loughney等(1996))。质粒pBB-PDE3A在pBlueBacIII中含有PDE3A的完整的可读框(Meacci等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89，第3721-3725页(1992))。
根据制造商的方案，使用MaxBac系统(Invitrogen)或者FastBac系统(Gibco-BRL)产生重组病毒原液。在这两种情况下，在所生成病毒中重组人PDEs的表达由病毒多角体启动子驱动。当使用MaxBac系统时，为了确保在制品中不污染有野生型(occ+)病毒，将病毒噬斑纯化两次。如下进行蛋白表达。使Sf9细胞于27℃下在补充如下成分的Grace’s昆虫培养基(Gibro-BRL)中生长：10％胎牛血清、0.33％TCyeastolate、0.33％水解乳白蛋白、4.2mM的碳酸氢钠、10μg/ml庆大霉素、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素。以每个细胞大约2-3个病毒颗粒的感染复数感染指数生长的细胞并且孵育48小时。通过离心收集所述细胞，用未经补充的Grace’s培养基洗涤并且快速冷冻保存。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(酵母)中的表达
人PDE1B、PDE2、PDE4A、DDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE5和PDE7的重组产生以类似于美国专利第5,702,936(在此结合到本发明中作为参考)的实施例7中所述进行，除了使用酵母转化载体，该酵母转化载体衍生自Price等，Methods in Enzymology，185，第308-318页(1990)介绍的基本ADH2质粒，该质粒中加入酵母ADH2启动子和终止子序列，所述酿酒酵母宿主为蛋白酶缺陷型菌株BJ2-54，BJ2-54于1998年8月31日保藏在美国典型培养物保藏中心(Manassas，Virginia)，保藏号为ATCC 74465。使转化宿主细胞在2x SC-leu培养基(pH6.2，含有微量金属和维生素)中生长。24小时后，加入含有甘油的YEP培养基到终浓度为2x YET/3％甘油。大约24小时后，收获细胞，洗涤并且于-70℃下保存。钙调蛋白纯化
基本按照Dedman等，Methods in Enzymology，102，第1-8页(1983)所述，采用Pharmacia Phenyl-Sepharose方法从牛睾丸中纯化用于激活PDE1酶的钙调蛋白。钙调蛋白在琼脂糖上的固定
按照生产商的使用说明书将钙调蛋白固定在BioRad AffiGel15上。人磷酸二酯酶制品磷酸二酯酶活性的测定
如下测定所述制品的磷酸二酯酶活性。利用活性炭分离技术的PDE测试基本如Loughney等(1996)所述进行。在该测试中，按照存在的PDE活性量的比例，PDE活性将[32P]cAMP或者[32P]cGMP转化为相应的[32P]5’-AMP或者[32P]5’GMP。然后，[32P]5’-AMP或者[32P]5’-GMP通过蛇毒5’-核苷酸酶的作用被定量地转化为游离的[32P]磷酸和未标记的腺苷或者鸟苷。因此，释放的[32P]磷酸的量与酶活性成正比。该测试于30℃下，在含有(终浓度)40mM Tris HCl(pH8.0)、1μM硫酸锌、5mM氯化镁和0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的100μl反应混合物中进行。或者，在评估PDE1-比活的测试中，孵育混合物还包括使用0.1mM氯化钙和10μg/ml钙调蛋白。PDE酶以产生＜30％总的底物水解的量存在(线性测试条件)。通过加入底物(1mM[32P]cAMP或者cGMP)引发所述测试，将该混合物孵育12分钟。然后，加入75μg大响尾蛇(Crotalus atrox)毒素，继续孵育3分钟(总共15分钟)。通过加入200μl活性炭(在每毫升0.1M磷酸二氢钠的悬浮液(pH4)中25毫克)终止反应。离心(750×g 3分钟)沉淀所述活性炭后，取出上清液样品用于在闪烁计数器中的放射活性的测定并且计算PDE活性。
类似于Loughney等在J.Biol.Chem.，271，第796-806页(1996)中所述的方法进行抑制剂的分析，只是同时使用cGMP和cAMP，底物浓度保持在低于32nM，该值远低于所测试PDE5的Km。从SF9细胞纯化PDE1A3
在室温下，将细胞沉淀(5g)与10ml裂解缓冲液(50mM MOPSpH7.5、2mM二硫苏糖醇(DTT)、2mM苄脒盐酸盐、5μM硫酸锌、0.1mM氯化钙、20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)混合。通过一个French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments，Inc.，Rochester NY)使所述细胞裂解。在一个采用T180型转子的Beckman超速离心机中以45,000rpm离心产生的裂解产物1小时。回收上清液并通过0.2μM滤膜过滤。将该滤液上样到一根在柱缓冲液A(含有100mM NaCl和2mM MgCl2的裂解缓冲液)中平衡后的2.6×90cm的SEPHACRYLS-300柱上。调节该柱流速到1ml/分钟并收集每份7ml的流分。合并活性流分并用0.16mg的钙调蛋白补充。按照Hansen等，Methods in Enzymology159，453-557页(1988)所述，以0.2ml/min的流速将所述酶上样到一根ACC-1琼脂糖免疫亲和柱上过夜。用5个体积的柱缓冲液B(没有NaCl的柱缓冲液A)，随后用5个体积的柱缓冲液C(含有250mM NaCl的柱缓冲液A)洗涤该柱。通过采用一个柱体积的柱缓冲液D(50mMMOPS pH7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM苄脒HCl，100mM NaCl，20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II，和各5μM/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)，以0.1ml/min洗脱该柱，停止流动1小时，然后以同样的流速继续洗脱。收集每份0.5ml的流分。合并呈现活性的流分，首先向含有25mM MOPS pH7.5、100mMNaCl、10μM ZnSO4、1mM CaCl2、1mM DTT和1mM苄脒HCl的透析缓冲液中透析。随后向含有50％甘油的透析缓冲液中进行透析，然后用干冰迅速冷冻该样品并于-70℃下保存。所产生的制品纯度大约为10到15％(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约5到20μmol cAMP的比活。从酿酒酵母纯化PDE1B
在室温下，通过与100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗涤的)和200ml缓冲液A混合解冻酵母细胞(50g)。缓冲液A由50mM MOPS pH7.5、1mM DTT、2mM苄脒HCl、0.01mM ZnSO4、5mM MgCl2、20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽组成。将该混合物冷却到4℃，转移到一个Bead-Beater中并通过迅速混合6个周期使细胞裂解，每个周期30秒。在一个采用JA-10转子的Beckman J2-21M离心机中以9,000rpm在4℃离心该匀浆15分钟。回收该上清液并在一个采用TI45转子的Beckman XL-80超速离心机中于4℃以36,000rpm离心45分钟。回收上清液并通过加入固体硫酸铵(0.33g/ml上清液)使PDE1B沉淀，同时在冰浴中搅拌并维持pH在7.0和7.5之间。然后在用一个JA-10转子的BeckmanJ2离心机中以9,000rpm(12,000×g)离心该混合物22分钟。弃去该上清液并将该沉淀溶解于100ml缓冲液B(50mM MOPS pH7.5、1mMDTT、1mM苄脒HCl、0.01mM ZnSO4、2mM MgCl2、2mM CaCl2，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。将其pH和电导率分别校正为7.5和15-20毫西门子(mS)。将该溶液上样到一根20ml的钙调蛋白-琼脂糖柱上，所述柱已经用10个柱体积的缓冲液B以1ml/min的速率平衡。将流过的溶液(flow-through)反复上样到所述柱上至少5次。用5个体积的缓冲液B、5个体积含250mM NaCl的缓冲液B洗涤所述柱，并再用2个体积的不含NaCl的缓冲液B洗涤。以0.33ml/min的速率用一个体积的缓冲液C(50mM MOPSpH7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM苄脒HCl)完成洗脱，然后在继续洗脱前停止流动1小时。收集每份大约4ml的流分并测试PDE活性。合并活性流分并用Amicon超滤系统浓缩到5ml体积。将该浓缩物上样到一根320ml SephacrylS-300柱(1.6×150cm)上，所述柱已经用至少2个体积的缓冲液D(25mM MOPS pH7.5，1mM DTT，1mM苄脒HCl，0.01mM ZnSO4，2mM CaCl2和100mMNaCl)平衡。以1ml/min的流速(11cm/小时)展开柱，收集每份5ml的流分。合并活性峰并向含有50％甘油的缓冲液D中透析过夜。在干冰上冷冻纯化的酶并于-70℃下保存。该产生的制品具有大约＞90％的纯度(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约10到30μmol cGMP的比活。从SF9细胞纯化PDE1C3
在冰上，用20ml裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.4、10μM硫酸锌、0.1mM氯化钙、1mM DTT、2mM苄脒盐酸盐和各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)将细胞沉淀(5g)解冻。通过一个French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)使所述细胞裂解，同时维持温度在10℃以下。于4℃，在一个采用TI45型转子的Beckman超速离心机中以36,000rpm离心产生的细胞匀浆45分钟。弃去上清液并使用一个带有微电极头(microtip)的VibraCell旋转器(turner)，通过超声处理3×30秒，用40ml增溶缓冲液(含有1MNaCl、0.1M MgCl2、1mM CaCl2、20μg/ml钙调蛋白和1％磺基甜菜碱SB12(Z3-12)的裂解缓冲液)将产生的沉淀重新悬浮。为了冷却，在碎冰/盐混合物中进行该过程。在超声后，在4℃缓慢地混合该混合物30分钟以完成对膜结合蛋白的增溶过程。在一个采用TI45型转子的Beckman超速离心机中以36,000rpm离心该混合物45分钟。用含有10μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II的裂解缓冲液稀释该上清液。在一个Beckman JA-10转子中以9,000rpm离心该沉淀的蛋白质20分钟。然后将该回收的上清液经Mimetic BlueAP琼脂糖层析。
为了运转Mimetic BlueAP琼脂糖柱，首先使用10个床体积的1％聚乙烯吡咯烷酮(即MW 40000)以阻断非特异性结合位点屏蔽该树脂。通过用10个床体积的2M NaCl和10mM pH3.4的柠檬酸钠洗涤移去松散结合的PVP-40。在临加入增溶的PCElC3样品前，用5个床体积的柱缓冲液A(50mM MOPS pH7.4，10μM硫酸锌、5mMMgCl2、0.1mM CaCl2、1mM DTT、2mM苄脒盐酸盐)平衡该柱。
以2ml/min的流速将该增溶的样品上样到该柱上，如此循环以使总样品在12小时内上样4到5次。在完成上样后，用10个柱体积的柱缓冲液A，随后用5个柱体积的柱缓冲液B(含有20mM 5′-AMP的柱缓冲液A)和5个柱体积的柱缓冲液C(50mM MOPS pH7.4，10μM硫酸锌、0.1mM CaCl2、1mM DTT和2mM苄脒盐酸盐)先后洗涤所述柱。所述酶被洗脱到三份连续的合并液(pool)中。第一份合并液由来自用含有1mM cAMP的柱缓冲液C洗脱的5个-床体积洗液的酶组成。第二份合并液由来自用含有1M NaCl的柱缓冲液C洗脱的10个-床体积洗液的酶组成。最后一份酶合并液由来自用含有1MNaCl和20mM cAMP的柱缓冲液C洗脱的5个-床体积洗液组成。
收集酶的活性合并液并经常规的凝胶过滤层析或在羟基磷灰石树脂上的层析转移环核苷酸。在转移环核苷酸后，将该酶的合并液向含有25mM MOPS pH7.4，10μM硫酸锌、500mM NaCl、1mMCaCl2、1mM DTT和1mM苄脒盐酸盐的透析缓冲液中透析，随后向含有50％甘油的透析缓冲液中透析。借助于干冰迅速冷冻所述酶并于-70℃保存。
该产生的制品具有大约＞90％的纯度(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约0.1到1.0μmol cAMP的比活。从酿酒酵母纯化PDE2
在冰上、在25ml裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.2、1mMEDTA、1mM EGTA、0.1mM DTT、0.1mM 4-(2-氨基-乙基)苯磺酰氟(AEBSF)、各1μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II、和2mM苄脒)中，使来自于YI34菌株的冷冻酵母细胞沉淀(10g，在-70℃下保存)解冻。使细胞通过一个French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)三次使之裂解。于4℃，在一个45Ti型的Beckman超速离心机转子中以36,000rpm离心裂解产物60分钟。使上清液与沉淀分离并在4℃使上清液以约0.5ml/min的速率通过15ml Epoxy-cGMP Sepharos树脂2次。随后用45ml洗涤缓冲液1(50mM MOPS pH7.2、0.1mM EDTA、0.1mM DTT)洗涤该柱。在这次洗涤后，用45ml洗涤缓冲液2(含有0.5M NaCl的洗涤缓冲液1)洗涤该柱。在所述盐洗涤后，用15ml洗涤缓冲液3(含有0.25M NaCl的洗涤缓冲液1)洗涤该柱。将所述柱转移至室温环境下并让其温热。将约25ml的洗脱缓冲液(含有10mM cGMP的洗涤缓冲液3，维持在室温下)加到该柱上并按照每份2ml流分收集流出液。用含有5mM MgCl2的PBS将每个流分的少量等份样品稀释20倍，以使竞争性配体水解并有助于检测PDE2活性。使活性流分通过一个Pharmacia PD-10凝胶过滤柱以便交换到洗涤缓冲液3中。该交换的合并液用80％无菌甘油稀释50％v/v并在-20℃下保存。经SDS-PAGE，随后通过Coomassie R-250使蛋白染色判定所产生的制品纯度大于85％。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约150到250μmol cGMP的比活。从Sf9细胞制备PDE3A
将细胞(2×1010)悬浮在裂解缓冲液中，该裂解缓冲液含有50mMMOPS pH7.5、2mM DTT、2mM苄脒盐酸盐、5μM硫酸锌、0.1mM氯化钙、20μg/ml钙蛋白酶抑制剂I和II，和各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽。超声处理该混合物两次(30秒钟)并于4℃，在一个French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)中使所述细胞裂解。该裂解产物经100,000×g离心45分钟。用裂解缓冲液洗涤该沉淀一次并用Dounce均浆器将其悬浮在46ml裂解缓冲液中。将等分试样在-70℃下保存。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解大约1到2nmol cAMP的比活。人PDE4A、4B、4C、4D制品从由酿酒酵母制备PDE4A
通过与50ml的裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.5，10μM ZnSO4，2mM MgCl2，14.2mM 2-巯基乙醇，各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽，各20μg/ml的钙蛋白酶抑制剂I和II，以及2mM苄脒盐酸盐)混合，于室温下，解冻酵母细胞(50g带有HDUN1.46的酵母菌株YI26)。于10℃，将细胞在French压碎器(SLM-Aminco，Spectronic Instruments)中裂解。于4℃，在Beckman JA-10转子中，以9000rpm将所述提取液离心22分钟。转移上清液并且在BeckmanTI45转子中，以36000rpm，于4℃，离心45分钟。
通过加入固体硫酸铵(0.26g/ml上清液)，同时在冰浴中搅拌并且维持pH在7.0-7.5之间，由高速上清液中沉淀PDE4A。经在BeckmanJA-10转子中，以9000rpm离心22分钟，收集沉淀的含有PDE4A的蛋白。将所述沉淀重悬浮在50ml缓冲液G(50mM MOPS pH7.5，10μM ZnSO4，5mM MgCl2，100mM NaCl2，14.2mM 2-巯基乙醇，2mM苄脒盐酸盐，各5μg/ml的亮抑酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽，以及各20μg/ml的钙蛋白酶抑制剂I和II)中并且通过0.45μm滤膜。
将所述重悬浮样品(50-100ml)上样到在缓冲液G中平衡后的5×100cm的Pharmacia SEPHACRYLS-300柱中。以2ml/min的流速洗脱酶活性并且收集以供以后分级分离。
将经凝胶过滤层析分离的PDE4A上样到在缓冲液A(50mMMOPS pH7.5，10μM硫酸锌，5mM氯化镁，14.2mM 2-巯基乙醇以及100mM苄脒盐酸盐)中平衡后的1.6×20cm的Sigma Cibacron BlueAgarose-300型(10ml)柱中。连续用50-100ml缓冲液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的缓冲液A、50-100mL含有1.5M氯化钠的缓冲液A和10-20ml缓冲液C(50mM Tris HCl pH8，10μM硫酸锌，14.2mM2-巯基乙醇以及2mM苄脒盐酸盐)洗涤该柱。用20-30ml含有20mMcAMP的缓冲液C洗脱所述酶。
合并PDE活性峰并且用硫酸铵(0.33g/ml酶合并液)沉淀以便除去过量的环核苷酸。将沉淀的蛋白重悬浮在缓冲液X(25mM MOPSpH7.5，5μM硫酸锌，50mM氯化钠，1mM DTT以及1mM苄脒盐酸盐)中，并且按照制造商的指示，经在Pharmacia PD-10柱上凝胶过滤脱盐。将所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷冻并且于-70℃保存。
所得的制品为约＞80％纯度(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解约10-40μmol cAMP的比活。从酿酒酵母中制备PDE4B
于室温下，通过与100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM苄脒盐酸盐，以及各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II)混合，解冻酵母细胞(150g带有HDUN2.32的酵母菌株YI23)。将所述混合物冷却到4℃，转移至Bead-Beater中并且快速混合6个周期(每个周期30秒)裂解所述细胞。于4℃，在Beckman J2-21M离心机中，使用JA-10转子，以9,000rpm将所述匀浆离心22分钟。回收上清液并且于4℃，在BeckmanXL-80超速离心机中，使用TI45转子，以36000rpm离心45分钟。回收上清液并且通过加入固体硫酸铵(0.26g/ml上清液)，同时在冰浴中搅拌并且维持pH在7.0-7.5的范围内，沉淀PDE4B。然后，在Beckman J2离心机中，使用JA-10转子，以9,000rpm(12,000×g)将该混合物离心22分钟。弃去上清液，将沉淀溶于200ml缓冲液A(50mM MOPS pH7.5、5mM氯化镁、1mM DTT、1mM苄脒盐酸盐以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。将其pH和电导率分别校正为7.5和15-20mS。
将所述重悬浮样品上样到用缓冲液A平衡的Sigma Cibacron BlueAgarose 300型的1.6×200cm柱(25mL)中。在12个小时内，将所述样品循环通过所述柱4-6次。将所述柱连续用125-250ml缓冲液A、125-250ml含有1.5M氯化钠的缓冲液A和25-50ml缓冲液A洗涤。用50-75ml缓冲液E(50mM Tris HCl pH8、2mM EDTA、2mMEGTA、1mM DTT、2mM苄脒盐酸盐以及20mM cAMP)和50-75mL含有1M氯化钠的缓冲液E洗脱所述酶。合并PDE活性峰并且用硫酸铵(0.4g/mL酶合并液)沉淀以便除去过量的环核苷酸。将沉淀的蛋白重悬浮在缓冲液X(25mM MOPS pH7.5、5μM硫酸锌、50mM氯化钠、1mM DTT以及1mM苄脒盐酸盐)中，并且按照制造商的指示，经在Pharmacia PD-10柱上凝胶过滤脱盐。将该酶合并液向含有50％甘油的缓冲液X中透析过夜。将所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷冻并且于-70℃保存。
所得的制品为约＞90％纯度(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解约10-50μmol cAMP的比活。从酿酒酵母中制备PDE4C
于室温下，通过与100ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.2，2mM EDTA，2mM EGTA，1mM DTT，2mM苄脒盐酸盐，以及各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II)混合，解冻酵母细胞(150g带有HDUN3.48的酵母菌株YI30)。将所述混合物冷却到4℃，转移至BEAD-BEATER中并且快速混合6个周期(每个周期30秒)裂解所述细胞。于4℃，在Beckman J2-21M离心机中，使用JA-10转子，以9000rpm将所述匀浆离心22分钟。回收上清液并且于4℃，在BeckmanXL-80超速离心机中，使用TI45转子，以36000rpm离心45分钟。
回收上清液并且通过加入固体硫酸铵(0.26g/ml上清液)，同时在冰浴中搅拌并且维持pH在7.0-7.5的范围内，沉淀PDE4C。30分钟后，在Beckman J2离心机中，使用JA-10转子，以9000rpm(12000×g)将该混合物离心22分钟。弃去上清液，将沉淀溶于200ml缓冲液A(50mM MOPS pH7.5，5mM氯化镁，1mM DTT，2mM苄脒盐酸盐，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和抑蛋白酶肽)中。将其pH和电导率分别校正为7.5和15-20mS。
将所述重悬浮的样品上样到在缓冲液A中平衡后的1.6×20cmSigma Cibacron Blue Agarose-300型(25mL)柱中。将所述样品在12个小时内，循环通过所述柱4-6次。将所述柱连续用125-250ml缓冲液A、125-250ml含有1.5M氯化钠的缓冲液A和25-50ml缓冲液A洗涤。用50-75ml缓冲液E(50mM Tris HCl pH8、2mM EDTA、2mMEGTA、1mM DTT、2mM苄脒盐酸盐以及20mM cAMP)和50-75ml含有1M氯化钠的缓冲液E洗脱所述酶。合并PDE4C活性峰并且用硫酸铵(0.4g/ml酶合并液)沉淀以便除去过量的环核苷酸。将沉淀的蛋白重悬浮在缓冲液X(25mM MOPS pH 7.2，5μM硫酸锌，50mM氯化钠，1mM DTT以及1mM苄脒盐酸盐)中，并且按照制造商的指示，经在Pharmacia PD-10柱上凝胶过滤脱盐。将该酶合并液向含有50％甘油的缓冲液X中透析过夜。将所述酶在干冰/乙醇浴中快速冷冻并且于-70℃保存。
所得的制品为约＞80％纯度(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解约10-20μmol cAMP的比活。从酿酒酵母中制备PDE4D
于室温下，通过与150ml玻璃珠(0.5mM，酸洗)和150ml的裂解缓冲液(50mM MOPS pH7.2、10μM硫酸锌、2mM氯化镁、14.2mM2-巯基乙醇、2mM苄脒盐酸盐、各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽、抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II)混合，解冻酵母细胞(100g带有HDUN4.11的酵母菌株YI29)。将所述混合物冷却到4℃，转移至Bead-Beater中并且快速混合6个周期(每个周期30秒)裂解所述细胞。于4℃，在Beckman J2-21M离心机中，使用JA-10转子，以9,000rpm将所述匀浆离心22分钟。回收上清液并且于4℃，在BeckmanXL-80超速离心机中，使用TI45转子，以36,000rpm离心45分钟。回收上清液并且通过加入固体硫酸铵(0.33g/ml上清液)，同时在冰浴中搅拌并且维持pH在7.0-7.5的范围内，沉淀PDE4D。30分钟后，在Beckman J2离心机中，使用JA-10转子，以9,000rpm(12,000×g)将该混合物离心22分钟。弃去上清液，将沉淀溶于100ml缓冲液A(50mM MOPS pH7.5、10μM硫酸锌、5mM氯化镁、14.2mM 2-巯基乙醇、100mM苄脒盐酸盐，以及各5μg/ml的亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽、抑蛋白酶肽、钙蛋白酶抑制剂I和II)中。将其pH和电导率分别校正为7.5和15-20mS。
以0.67ml/min的流速，将所述重悬浮的样品上样到在缓冲液A中平衡后的1.6×20cm Sigma Cibacron Blue Agarose-300型(10ml)柱中。将所述柱连续用50-100ml缓冲液A、20-30ml含有20mM 5’-AMP的缓冲液A、50-100ml含有1.5M氯化钠的缓冲液A和10-20ml缓冲液C(50mM Tris HCl pH8，10μM硫酸锌，14.2mM 2-巯基乙醇，2mM苄脒盐酸盐)洗涤。用20-30ml含有20mM cAMP的缓冲液C洗脱所述酶。
合并PDE4D活性峰并且用硫酸铵(0.4g/ml酶合并液)沉淀以便除去过量的环核苷酸。将沉淀的蛋白重悬浮在缓冲液X(25mM MOPSpH7.2，5μM硫酸锌、50mM氯化钠、1mM DTT以及1mM苄脒盐酸盐)中，并且按照制造商的指示，经在Pharmacia PD-10柱上凝胶过滤脱盐。将该酶合并液向含有50％甘油的缓冲液X中透析过夜。将所述酶制品在干冰/乙醇浴中快速冷冻并且于-70℃保存。
所得的制品为约＞80％纯度(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解约20-50μmol cAMP的比活。从酿酒酵母纯化PDE5
在冰上用等体积的裂解缓冲液(25mM Tris HCl pH8，5mM氯化镁，0.25mM DTT，1mM苄脒和10μM硫酸锌)解冻细胞沉淀(29g)。在Microfluidizer(Microfluidics Corp.)中，用20000psi下氮气裂解细胞。离心裂解产物并通过一次性使用的0.45μm滤膜过滤。将该滤液上样到一根Q SEPHAROSEFastFlow(Pharmacia)的150ml柱上。用1.5个体积的缓冲液A(20mM Bis-Tris Propane，pH6.8，1mM氯化镁，0.25mM DTT，10μM硫酸锌)洗涤所述柱并用在缓冲液A中的125mM氯化钠进行分级梯度洗脱，随后用在缓冲液A中的125-1000mM氯化钠进行线性梯度洗脱。将来自于线性梯度的活性流分上样到在缓冲液B(20mM Bis-Tris Propane(pH6.8)，1mM氯化镁，0.25mMDTT，10μM硫酸锌和250mM氯化钾)中的180ml羟基磷灰石柱上。上样后，用2个体积的缓冲液B洗涤所述柱并用在缓冲液B中的0-125mM磷酸钾的线性梯度液洗脱。合并活性流分，用60％硫酸铵沉淀，并重悬浮在缓冲液C(20mM Bis-Tris Propane，pH6.8，125mM氯化钠，0.5mM DTT和10μM硫酸锌)中。将合并液上样到140mlSEPHACRYLS-300 HR柱上并用缓冲液C洗脱。将活性流分稀释到50％甘油并在-20℃下保存。
所得的制品具有约85％纯度(经SDS-PAGE)。这些制品具有每毫克蛋白每分钟水解约3μmol cGMP的比活。从酿酒酵母制备PDE7
在室温下，用等体积的裂解缓冲液(50mM Tris HCl pH8，1mMEDTA，1mM DTT，50mM氯化钠，2mM苄脒盐酸盐和各5μg/ml的抑胃酶肽、亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)解冻细胞沉淀(126g)并使之重悬浮约30分钟。于0-4℃，在一个Bead-Beater中，借助于玻璃珠(125ml)裂解所述细胞6×30秒周期。离心该裂解产物并通过一次性使用的0.45μm滤膜过滤。将过滤的提取液(178ml)分为4ml的等份试样，用干冰迅速冷冻并在一个冷冻箱中于-70℃保存。这些制品对于几个冷冻和解冻周期是稳定的并具有每毫克蛋白每分钟水解约50-100pmol cAMP的比活。脂多糖-刺激的TNFα从人外周血淋巴细胞中的释放
为了评价一种化合物降低人外周血淋巴细胞(PBL)中TNFα分泌的能力，进行以下试验。先前的研究已经证明，将人PBL与升高cAMP的药物，如前列腺素E21、毛喉素、8-溴-cAMP或二丁基-cAMP一起孵育，当用脂多糖(LPS，内毒素)刺激时，可抑制细胞分泌TNFα。因此，初步试验已经完成，证明选择性PDE4抑制剂如咯利普兰以剂量依赖方式抑制LPS诱导的人淋巴细胞分泌TNFα。因此，将人PBL分泌的TNFα用作化合物升高细胞内cAMP浓度和/或抑制细胞内PDE4活性的能力的标准。
将抽自自愿者的肝素化血液(约30ml)与Dulbecco’s改良磷酸盐缓冲盐水以1∶1混合。将该混合物与HISTOPAQUE1∶1混合并于室温下，在Beckman TJ6型离心机的吊桶式转头(swinging bucket)中以1500rpm不减速地离心。红细胞被离心到试管的底部，血清仍在试管的表面。含有淋巴细胞的层沉降在血清和HISTOPAQUE层之间，并通过抽吸转移到一个新试管中。对细胞定量并调节到3×106个细胞/ml，并将100μl等份试样放置到96孔板的各孔中。在加入细菌LPS(25mg/ml)前15分钟，将试验化合物和RPMI培养基(Gibco/BRL Life Sciences)加入到每个孔中。于37℃，在一个湿润的箱中孵育该混合物20小时。然后，在室温下，通过以800rpm离心5分钟分离该细胞。为了测定TNFα的浓度，将一等份180μl上清液转移到一个新的平板中。用一种商业上可获得的酶联免疫吸附测定(ELISA)(来自Biosource International的CYTOSCREEN免疫测定试剂盒)测量在细胞上清液流体中的TNFα蛋白。
对于本发明的各种化合物而言，所述细胞基测试提供了以下结果。EC50值(即化合物能够抑制总TNFα的50％的有效浓度)说明本发明化合物抑制LPS-刺激的人PBL释放TNFα的能力。
以下总结了对结构式(I)化合物抑制人重组PDE4所测定的IC50值。在下表中，除非另外说明，否则R3和R4均为甲基，Y和Z为O，p为1。
Figure A0081909000691
Figure A0081909000711
Figure A0081909000721
Figure A0081909000731
Figure A0081909000741
Figure A0081909000751
以上提供的数据显示式(I)的化合物是有效和选择性的PDE4抑制剂，例如所述化合物具有对于人重组PDE4的IC50为约0.1-180μM。作为一个重要的附加优势，式(I)的化合物可以减少或消除与先前的PDE4抑制剂有关的付作用如CNS作用和呕吐。尤其是，在基于细胞的测定和在动物模型中测试式(I)的化合物以说明所述化合物在体外和体内抑制PDE4的能力。
基于细胞的测试提供了以下对于本发明不同吡唑化合物的结果。EC50值(即化合物能够抑制总TNFα50％的有效浓度)说明本发明的化合物抑制LPS-刺激从人外周血淋巴细胞中分泌TNFα的能力。
化合物  PDE4 IC50(μM) PBL/TNFαEC50(μM)
实施例19     0.053     0.52
实施例10     .20     2.0
实施例11     .30     1.0
实施例3     .31     1.8
实施例38     .40     1.0
实施例39     .69     1.3
实施例40     .92     6.2
实施例12     .94     2.6
实施例9     1.0     1.9
上表显示了式(I)的化合物抑制PDE4活性和TNFα释放的能力。优选的化合物具有PBL/TNFα的EC50为约50nM或更低，并优选为约20nM或更低。更优选的化合物具有PBL/TNFα的EC50为15nM或更低。
为了充分体现本发明的优势，所述化合物具有对人重组PDE4的IC50为约100nM或更低和具有PBL/TNFα的EC50为约50nM或更低。更优选的化合物具有IC50为约50nM或更低，具有PBL/TNFα的EC50为约10nM或更低。动物模型对哺乳动物的血清TNFα水平抑制的测定(小鼠/TNFαED50(mg/kg))
为了评估一种化合物在哺乳动物中降低血清TNFα水平的能力，采用以下方案。本领域的那些技术人员可以理解，在先的研究已经证明，将LPS-激活的人单核细胞与可以升高cAMP的药物，如PGE2、毛喉素和dbcAMP一起孵育会抑制TNFα的分泌。PDE4抑制剂如也可以升高cAMP的咯利普兰已被发现也可抑制血清TNFα。也已发现咯利普兰抑制LPS-激活的小鼠巨噬细胞分泌TNFα。因此，通过对注射LPS的小鼠给予化合物并测量降低的血清TNFα水平显示一种降低PDE4的化合物在体内的功效。雌性C3H小鼠，20-25g体重，禁食过夜并在LPS注射前60分钟腹膜内给予在适宜溶媒中的试验化合物。然后，将5μg LPS腹膜内注射到小鼠中。LPS注射后90分钟，小鼠心脏抽血。在4℃下让血液凝结过夜。在一个小型离心机中离心样品10分钟，移去血清并在-20℃下保存直到分析。随后用商业上可获得的ELISA试剂盒(Genzyme)，按照在试剂盒所附的方案测量TNFα的血清水平。相对于仅接受溶媒的对照小鼠的血清TNFα水平，确定由所述化合物引起的血清TNFα水平的抑制百分比。该结果总结在图1中。结合的小鼠内毒素刺激的TNFα释放和运动活性测试(ED50(mg/kg))
本研究的目的是在一个LPC小鼠模型中测定PDE4抑制剂在体内的功效以及测定与中枢神经系统(CNS)有关的表现为自发性运动减少的副作用。
该试验动物为平均体重约20g的雌性Balb/c小鼠。用30％CremophorEL配制的PDE4抑制剂以0.1、1.0、10.0和100mg/kg的剂量经腹膜内(i.p.)注射给药。以测量的体重为基础调节个体的剂量体积(约150μl)。一小时后，将5mg/kg的LPS以200μl的终体积经尾静脉注射给每只动物。在LPS处理后90分钟，给所述动物抽血并且收集血清样品，然后于-70℃保存，直到分析。
为了测定功效，该血清样品被稀释两倍并且用CYTOSCREEN免疫测定试剂盒(Biosource International)测定TNFα水平。对于每种试验化合物而言，该数据为一式三份样品被试者间的平均值。
对于副作用分布而言，在给予PDE4抑制剂后5分钟和20分钟，采用一种主观目测评分系统。将溶媒对照组动物定为一个“+”并且将实际上不能移动和伸出该笼子底部几乎觉察不到运动的动物定为“++++”。或者，为了评估PDE4抑制剂对小鼠和/或大鼠的作用，使用了监测运动的一种半自动“开放区”系统(如一个由San DiegoInstruments出售的光束活动测量系统(Photobeam Activity MeasurementSystem))。在这种情况下，可以在预先设置的时间间隔连续监测受试者。
通过计算每单位时间“光束”穿过的次数对X-Y平面运动或抬起后腿进行量化。活动事件次数的减少直接与所述动物的移动或不能移动成比例。定量的分数与上述的主观测量密切相关。
化合物 溶媒对照     1mg/kg     10mg/kg     100mg/kg
对比实施例1 3     3     3     3
实施例2     3     3     3
1反式-3-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)-1-甲氧基羰基-4-甲基-4-(甲基羰基)吡咯烷，即Feldman等美国专利第5,665,754号的实施例12，作为参考结合在本文中。
  化合物号     剂量(mg/kg)     镇静作用   ％TNFα抑制
  对比实施例     1     --     43
    10     +     100
    100     +++     100
  实施例2     1     --     --
    10     --     70
    100     --     100
以上提供的数据显示式(I)的化合物是有效和选择性PDE4抑制剂。作为重要的附加的优势，式(I)的化合物也可以减少或消除与先前PDE4抑制剂有关的、不利的中枢神经系统的付作用。对式(I)化合物的催吐性质的进一步动物模型的试验再次证实了所述化合物的效能。所述催吐试验的方法和结果在以下叙述。
结果显示，本发明的化合物用于选择性地抑制哺乳动物体内PDE4的活性，而不显示与在先PDE4抑制剂有关的不利的中枢神经系统作用和催吐作用。
显而易见，在不背离本发明的精神和范围的条件下，可以对此前提出的本发明内容作各种修饰和改进，因此，只有所附带的权利要求书才是对本发明的唯一的限定。

Claims (44)

1.一种具有下式的化合物：
Figure A0081909000021
其中Y是O或NOH；Z是O或NH；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、甲基、C3-16烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基和芳基；条件是当R1是未取代的苯基时，R2不是未取代的苯基、未取代的吡啶基和对-甲苯基。
2.权利要求1的化合物，其中R1选自任选取代的烷基、芳基、烷芳基和杂芳基。
3.权利要求1的化合物，其中R1选自芳基、烷基或杂芳基，它们任选由以下一个或更多个基团取代：硝基、氨基、低级烷基、烷氧基、卤代基、三氟代甲基、
Figure A0081909000031
和
4.权利要求1的化合物，其中R1是任选取代的苯基、吡啶基或环己基。
5.权利要求1的化合物，其中R2选自氢、任选取代的烷基和任选取代的芳基。
6.权利要求1的化合物，其中R2选自氢、和
Figure A0081909000042
7.权利要求1的化合物，其中R3和R4独立选自烷基、芳基和氢。
8.权利要求1的化合物，其中R3和R4独立选自烷基、氢和三氟代甲基。
9.权利要求1的化合物，其中R1是任选取代的苯基或吡啶基；R2是甲基或氢；R3和R4独立是甲基或氢，Y和Z是O。
10.权利要求1的化合物，该化合物选自：
1-(4-溴代苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-(3-硝基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-对-甲苯基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-(2-硝基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-(2-氨基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
1-(3-氨基苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-(4-氨基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
1-(3-氨基吡啶-2-基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-(3-硝基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸；
3，5-二甲基-1-(5-硝基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
1-(4-氨基苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸；
1-环己基-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
1-苄基-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
1-(3-氯代苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-间-甲苯基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
1-(3-氟代苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
1-(3-甲氧基苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
1-(3-溴代苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3-甲基-1-吡啶-2-基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；和
1-(4-氨基苯基)-5-三氟代甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯。
11.权利要求1的化合物，该化合物选自：
3，5-二甲基-1-(3-硝基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-(2-氨基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-(2-硝基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
1-(3-氨基苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；
3，5-二甲基-1-(4-氨基苯基)-1H-吡唑-4-甲酸乙酯；和
1-(3-氨基吡啶-2-基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯。
12.权利要求1的化合物，它具有的对于人重组PDE4的IC50值为约0.05μM-25μM。
13.权利要求1的化合物，它具有的PBL/TNFα的EC50值为约0.01μM-15μM。
14.权利要求1的化合物，它具有的对于人重组PDE4的IC50值为约0.05μM-25μM和PBL/TNFα的EC50值为约0.01μM-15μM。
15.权利要求1的化合物，它具有的对于人重组PDE4的IC50值为约100μM或更低。
16.权利要求1的化合物，它具有的对于人重组PDE4的IC50值为约50μM或更低。
17.权利要求1的化合物，它具有的PBL/TNFα的EC50值为约50μM或更低。
18.权利要求1的化合物，它具有的PBL/TNFα的EC50值为约20μM或更低。
19.权利要求1的化合物，它具有的对于人重组PDE4的IC50值为约100μM或更低和PBL/TNFα的EC50值为约50μM或更低。
20.一种药用组合物，它含有权利要求1的化合物、药学上可接受的载体和任选第二种抗炎治疗药物。
21.一种具有下式的化合物：其中Y是O或NOH；Z是O或NH；p是0或1；R1选自烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2是乙基；R3和R4独立选自氢、烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元环，条件是R1不是硝基取代的吡啶基、氨基取代的苯基、硝基取代的苯基、三氯代苯基和氯代三氟苯基。
22.一种化合物，它具有以下结构：或
23.一种治疗患有其中抑制cAMP-特异性PDE是治疗上有益的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的具有下式的化合物：其中Y是O或NOH；Z是O或NH；p是0或1；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元环。
24.一种调节哺乳动物体内cAMP水平的方法，该方法包括给予所述哺乳动物有效量的具有下式的化合物
Figure A0081909000082
其中Y是O或NOH；Z是O或NH；p是0或1；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元环。
25.一种治疗患有其中抑制cAMP-特异性PDE为治疗上有益的疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的一种药用组合物，该组合物含有下式的化合物：
Figure A0081909000091
其中Y是O或NOH；Z是O或NH；p是0或1；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元环，一种药学上可接受的载体和任选的第二种抗炎治疗药物。
26.权利要求25的方法，其中所述疾病是变应性疾病、自身免疫性疾病、炎性疾病、关节疾病或皮炎性疾病。
27.权利要求25的方法，其中所述疾病是类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风性关节炎或脊椎炎。
28.权利要求25的方法，其中所述疾病是与甲状腺有关的眼病、贝赫特病、脓毒病、败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒病、革兰氏阳性脓毒病、中毒性休克综合征、变应性结膜炎、春季结膜炎或朗格斯细胞肉芽肿。
29.权利要求25的方法，其中所述疾病是哮喘、慢性支气管炎、变应性鼻炎、成人呼吸窘迫综合征、慢性肺炎、慢性阻塞性肺炎、硅肺或肺结节病。
30.权利要求25的方法，其中所述疾病是由于脑或脊髓的创伤性损伤引起的心肌、脑或肢端再灌注损伤。
31.权利要求25的方法，其中所述疾病是纤维变性、疤痕疙瘩形成或疤痕组织形成。
32.权利要求25的方法，其中所述疾病是系统性红斑狼疮、移植排斥反应、移植物抗宿主反应或同种移植物的排斥反应。
33.权利要求25的方法，其中所述疾病是慢性肾小球性肾炎、炎性肠疾病、局限性回肠炎或溃疡性结肠炎。
34.权利要求25的方法，其中所述疾病是增殖性淋巴细胞疾病或白血病。
35.权利要求25的方法，其中所述疾病是炎性皮肤病、特应性皮炎、牛皮癣或荨麻疹。
36.权利要求25的方法，其中所述疾病是心肌病、充血性心力衰竭、动脉粥样硬化、发热、恶病质、感染或恶性肿瘤继发的恶病质、获得性免疫缺陷综合征继发的恶病质、ARC、脑型疟、骨质疏松、骨吸收疾病、由于感染引起的发烧和肌痛、尿崩症、中枢神经系统疾病、抑郁症或多梗死性痴呆。
37.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物没有催吐反应。
38.权利要求27的方法，其中所述哺乳动物显示最低的催吐反应。
39.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物显示最低的、不利的中枢神经系统的副作用。
40.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物没有不利的中枢神经系统的副作用。
41.权利要求25的方法，其中所述第二种抗炎治疗药能够针对TNFα。
42.一种降低哺乳动物体内TNF水平的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的具有下式的化合物：
Figure A0081909000111
其中Y是O或NOH；Z是O或NH；p是0或1；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元环。
43.一种抑制哺乳动物体内炎性细胞激活的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的具有下式的化合物：其中Y是O或NOH；Z是O或NH；p是0或1；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元环。
44.一种抑制哺乳动物体内PDE4功能的方法，该方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的具有下式的化合物：其中Y是O或NOH；Z是O或NH；p是0或1；R1选自任选取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、烷芳基、芳烷基、杂芳烷基和杂烷芳基；R2选自任选取代的氢、烷基、芳基、杂芳基、烷氧基烷基、芳氧基烷基、芳烷氧基烷基、(烷硫基)烷基、(芳硫基)烷基和(芳烷硫基)烷基；R3和R4独立选自氢、烷基、卤代烷基、烷氧基烷基、芳基、C(＝O)烷基和C(＝O)CH＝CHNR5R6；R5和R6独立是氢或烷基，或R5和R6一起形成5-或6-元环。
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