JP2003517259A - 骨および前駆体軟骨細胞の単離方法 - Google Patents

骨および前駆体軟骨細胞の単離方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は造血性および非造血性細胞から軟骨または骨の前駆体細胞を単離すること、および骨および軟骨の再生処理におけるそれらの使用方法に関する。この前駆体細胞は骨または軟骨の修復を必要とする骨の部位への当該細胞の移植によるインビボでの骨または軟骨の修復に使用され、この修復処理はキャリヤ材料の存在下または非存在下のいずれでもよく、上記細胞の予備的なインビトロでの培養を必要としない。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
本発明は一般に前駆体細胞の単離およびそれらの骨の中における使用方法、お
よび軟骨の再生方法に関する。特に、本発明は細胞表面抗原ＣＤ３４、またはＣ
Ｄ３４＋細胞における前駆体細胞表面抗原を利用するか、あるいは、陽性および
陰性の細胞選別技法によって種々の体内組織から骨／軟骨前駆体細胞を単離する
ための方法に関する。
【０００２】 骨形成および軟骨形成は医療的および臨床的に相当に関連する極めて複雑な生
物学的方法である。例えば、１，４００，０００件を超える骨移植処理が毎年先
進諸国において行なわれている。これらの処理の大半は関節置換手術後または外
傷性外科再構成手術中に行なわれる。移植処理の成功の可否は移植部位の生命力
、移植処理および、同種異系移植片（allografts）の場合におけるドナーとホス
トとの間の免疫学的な適合性に大きく依存する。なお、適合性の問題は自系の（
autologous）移植処理、すなわち、患者のある部位から骨の組織を採取して他の
部位に移植することに関連する処理の場合にはそれほど重要と考える必要がない
。自系的な骨の移植は一般的に有効であるが、移植材料を採取するための付加的
な外科手術を必要として、手術後の痛みや出血および感染を伴う場合がめずらし
くない。
【０００３】 軟骨再生および置換処理はさらに問題性が高いと考えられる。骨形成とは異な
って、軟骨形成は損傷した軟骨組織を修復するために発生しないのが一般的であ
る。これまで、あらゆる臨床的に有効と考えられる態様で損傷した軟骨を修復す
る試みが行なわれてきたが、限られた有効性が示されるだけであった。多くの場
合において、軟骨損傷に対応する最も有効な治療方法はプロテーゼ関節置換であ
る。
【０００４】 このような現在において有効な骨移植および軟骨再生処理における困難さによ
って、骨形成および軟骨形成の細胞および分子レベルの研究が積極的に行なわれ
るようになった。このうちで、今日において将来性のある研究は骨髄等の組織か
ら骨および軟骨の前駆体細胞を特定および単離することである。
【０００５】 骨髄の複雑さに関する初期的な研究によって、致死量の放射線照射を受けた動
物が骨髄移植によって救命できることが分かり、骨髄が造血系全体を再生する能
力を有する回復性因子を含むことが示されている。さらに、最近の実験によって
、拡散チャンバーにおけるインビボでの移植の場合に、骨髄は骨および他の間葉
組織を再生する能力も有してることが示されている。（例えば、A. Friedenstei
n 他の「骨髄細胞の移植における骨形成（Osteogenesis in transplats of bone
marrow cells）」(J. Embryol. Exp. Morph. 16, 381-390, １９６０年、M. Ow
enの「骨髄の骨形成能力（The osteogenic potential of marrow)」（UCLA Symp
. on Mol. and Cell. Biol. 46, 247-255, １９８７年を参照されたい。）この
性質によって、骨髄が、間葉、造血および支質の細胞系統の広範な種々の異なる
細胞種に分化（differentiate)する能力を有する幹細胞（stem cells)として知
られる多能性細胞の１個以上の集団(population)を含むと言う結論が得られる。
【０００６】 骨髄によって示される細胞種の多様性に基く生物学的な分化は明確に特殊化さ
れていない原始的な細胞種から特殊化された前駆細胞種（committed cell types
）が生じる一般的な方法である。分化は一定の経路に沿う一連の段階として考え
ることができ、この経路において、各段階は特異的な遺伝的および発現型の特徴
を潜在的に有する特定の細胞種によって支配される。分化の典型的な経路におい
て、多能性幹細胞は１回以上の中間段階の細胞分割を経て、最終的にＴリンパ球
および骨細胞のような１種以上の特別な細胞種が出現する。なお、完全に分化す
る形態の前で真の幹細胞となり得るかなり得ない未前駆型細胞種(uncommitted c
ell types)は前駆体細胞（precursor cells)と定義される。
【０００７】 特定の経路に沿う分化を開始する明確な信号は完全には理解されていないが、
走化性（chemotactic)、細胞および他の環境的な信号が関与することが明らかに
なっている。間葉系統の細胞、例えば、インビトロで培養した間葉幹細胞（ＭＳ
Ｃ）は、この細胞の置かれる組織環境または培養媒体によって、インビボおよび
インビトロで分化して骨または軟骨細胞に誘導できる。(例えば、S. Wakitani他
の「関節軟骨の大規模な完全な厚さの欠損の間葉細胞に基く修復（Mesenchymal
cell-based repair of large, full-thickness defects of articular cartilag
e）」（J. Bone and Joint Surg, 76-A, 579-592, １９９４年）、J Goshima、V
M Goldberg およびAl Caplanの「リン酸カルシウムセラミックブロック中におけ
るインビボで評価した培養展開したラット骨髄間葉細胞の骨形成能力（The oste
ogenic potential of culture-expanded rat marrow mesenchymal cells in viv
o in calcium phosphate ceramic blocks)」（Clin. Orthop. 262, 298-311, １
９９１年、H Nakahara他の「骨膜誘導細胞からの骨および肥大性軟骨のインビト
ロ分化(In vitro differntiation of bone and hypertrophic cartilage from p
eriosteal-derived cells）」（Exper. Cell Res. 195, 492-503, １９９１年）
を参照されたい。）
【０００８】 この種の研究は、結果的に、ＭＳＣが軟骨、骨、腱、靭帯等の接合組織細胞種
を含む種々の異なる細胞種に分化する能力を有する細胞集団であることを示して
いる。明らかに、全て別々の間葉組織細胞種が共通の始原幹細胞すなわちＭＳＣ
から由来している。ＭＳＣ自体は造血、間葉および支質細胞の系統を含む別個に
分化する細胞種の三部作（trilogy)に密接に関係している。また、造血幹細胞（
ＨＳＣ）は全ての血液細胞系統の自己再生および発生の能力を有し、支質幹細胞
（ＳＳＣ）は造血性微小環境を自己再生および生成するための能力を有する。
【０００９】 骨髄内に存在する細胞種の複雑な亜集団（subpopulations）（すなわち、造血
、間葉および支質）がそれ自体で共通の先祖からの子孫であるかどうかは予期は
しているがはっきりしていない。従って、これまで、先祖の系統研究は研究者ら
の目的とするところとなっていた。前駆体集団と幹細胞集団との間の関係を特定
するためには、「分化抗原（differentiation antigens)」と呼ばれる共通の細
胞表面マーカーの特定を必要とし、このようなマーカーの多くは分化の過程にお
いて一時的にかつ広範に関連する態様で現れる。例えば、一つの研究グループは
、後に部分的に撤回したが、ＭＳＣ、ＨＳＣおよびＳＳＣの間の先祖の系統につ
いて報告している(S. Huang & L.Terstappenの「単一種のヒト骨髄幹細胞からの
造血性微小環境および造血幹細胞の形成（Formation of hematopoietic microen
vironment and hematopoietic stem cells from single human bone marrow ste
m cells)」（Nature, 360, 745-749, １９９２年）、L. Terstappen & S. Huang
の「骨髄幹細胞の分析（Analysis of bone marrow stem cell）」（Blood Cells
, 20, 45-63, １９９４年）、EK Waller他の「再評価した共通幹細胞の仮説：ヒ
ト胎児の骨髄は造血および支質の始原細胞（progenitor cells）の別々の母集団
を含む（The common stem cell hypothesis reevaluated: human fetal bone ma
rrow contains separate populations of hematopoietic and stromal progenit
ors）」（Blood, 85, 2422-2435, １９９５年））。しかしながら、別のグルー
プによる研究では、マウスの骨芽細胞がＬｙ−６系の分化抗原を有していること
を示している。この発見はＬｙ−６抗原がマウスの造血系統の細胞によっても発
現されると言う理由で本明細書の内容において意義がある（M. C. Horowitz他の
「マウスの骨芽細胞によるＬｙ−６分化抗原の発現および調節（Expression and
regulation of Ly-6 differentiation antigens by murine osteoblasts）」（
Endocrinology, 135, 1032-1043, １９９４年））。それゆえ、共通の先祖を起
原とする間葉および造血細胞種の間には密接な系統的関係があると考えられる。
しかしながら、この問題についての最終的な解答は今後の研究を待つ必要がある
。
【００１０】 ヒト造血系における分化の経路に従う最も有用な分化抗原の一例はＣＤ３４と
して知られる細胞表面抗原である。このＣＤ３４は展開的に特定の段階において
正常なヒト成人の骨髄細胞の約１％乃至５％によって発現される［Cl Civin 他
の「造血の抗原分析。１＼１１。ＫＧ−１ａ細胞に対して産生したモノクローナ
ル抗体によって特定される造血始原細胞の表面抗原（Antigenic analysis of he
matopoiesis. 1＼11. A hematopoietic progenitor cell surface antigen defi
ned by a monoclonal antibody raised against KG-1a cells）」（J. Immunol,
133, 157-165, １９８４年）。ＣＤ３４＋細胞は未成熟の骨芽細胞と、僅かな
割合の成熟した骨髄系、赤血球および白血球の系統的前駆細胞との混合物である
。このＣＤ３４＋細胞の約１％は特定の細胞系統に関係する生存（段階）数を有
する真性のＨＳＣである。人間における評価結果において、末梢血液（peripher
al blood）または骨髄から単離したＣＤ３４＋細胞は一生において造血系全体を
再構成できることが分かっている。それゆえ、ＣＤ３４はＨＳＣおよび造血性始
原細胞に対応するマーカーとなる。
【００１１】 ＣＤ３４は造血細胞種に対応するマーカーとして広く認識されているが、イン
ビボにおける骨形成能力を有する前駆体細胞に対応する信頼性の高いマーカーと
してはこれまで認識されていなかった。これに反して、従来技術は骨の前駆体細
胞は起原において造血細胞種ではなく、さらに、この骨の前駆体細胞は造血細胞
の表面抗原ＣＤ３４を発現しないと教示していた（MW Long、JL Williamsおよび
KG Mannの「ヒト造血性微小環境における骨関連タンパク質の発現（Expression
of bone-related proteins in the human hematopoietic microenvironment）」
(J. Clin. Invest. 86, 1387-1395, １９９０年）、MW Long他の「骨形成性生長
因子によるヒト骨髄に由来する骨始原細胞の調節（Regulation of human bone m
arrow-derived osteoprogenistor cells by osteogenic growth factors)」（J.
Clin. Invet. 95, 881-887, １９９５年）、SE Haynesworth他の「ヒト骨髄に
由来する間葉細胞における細胞表面抗原はモノクローナル抗体によって検出され
る」（Bone, 13, 69-80, １９９２年)）。
【００１２】 今日において、骨形成性能力を有する前駆体細胞の最も一般的な供給源は骨膜
および骨髄とされている。すなわち、多くの研究者はインビトロアッセイにおけ
る骨膜から単離した細胞を使用している。（例えば、I Binderman他の「単離し
た骨細胞からの培養における骨組織の形成（Formation of bone tissue in cult
ure from isolated bone cells）」（J. Cell Biol. 61, 427-439, １９７４年
）を参照されたい）。骨および軟骨の形成を研究するために骨髄を培養して前駆
体細胞を単離する概念の先駆者はA. J. Friedensteinである。すなわち、彼は骨
を形成できる骨髄から細胞（ＣＦＵ−ｆ）を単離して展開する培養方法を開発し
ている（A. J. Friedenstein他の「ギニア豚の骨髄および脾臓細胞の単層培養に
おける線維芽コロニーの展開（The development of fibroblast colonies in mo
nolayer cultures of guinea pig bone marrow and spleen cells）」（Cell Ti
ss. Kinet. 3, 393-402, １９７０年)）。さらに別の研究者がFriedensteinの培
養系を広く使って骨芽細胞の起原を研究している。（例えば、M. Owenの「肛門
後方器官における骨細胞の起原（The origin of bone cells in the postnatal
organism）」（Arthr. Rheum. 23, 1073-1080, １９８０年）を参照されたい。
）Friedensteinは骨髄からのＣＦＵ−ｆ細胞が移植されると骨、軟骨および線維
組織を形成するが、胸腺、脾臓、末梢血液および腹膜液のような別の供給源から
培養したＣＦＵ−ｆ細胞は付加的な誘発剤なしでは骨や軟骨を形成しないことを
示している。さらに、Friedensteinは最近になってＣＦＵ−ｆの可能な臨床的有
用性を論じており、幾つかの経路における培養とその細胞を移植するための方法
の開発の必要性のような解決すべき障害を指摘している（A. J. Friedensteinの
「骨髄支質線維芽細胞（Marrow stromal fibroblast）」（Clacif. Tiss. Int.
56(S): S17, １９９５年））。
【００１３】 同様に、今日における軟骨前駆体細胞の最も一般的な供給源は骨膜、軟骨膜お
よび骨髄であるとされている。すなわち、骨髄から単離された細胞はインビボで
軟骨を生成するために使用されている（S. Wakitani他の「関節軟骨の大規模な
完全な厚さの欠損の間葉細胞に基く修復（Mesenchymal cell-based repair of l
arge, full-thickness defects of articular cartilage）」（J. Bone and Joi
nt Surg, 76-A, 579-592, １９９４年）。骨膜および軟骨膜移植片もまた軟骨修
復用の軟骨前駆体細胞の供給源として使用されてきた(SW O'Driscoll他の「連続
的な受動的動作の影響下における関節表面内の主要な完全な厚さの欠損における
遊離の自系的骨膜移植片によって生成された再生関節軟骨の耐久性（Durability
of regenerated articular cartilage produced by free autogenous perioste
al grafts in major full-thickness defects in joint surfaces under the in
fluence of continuous passive motion）」（J. Bone and Joint Surg. 70A, 1
017-1035, １９８６年）、R. Coutts他の「ラビットにおける完全な厚さの関節
欠損における肋骨の軟骨膜の自系的移植片（Rib perichondral autografts in f
ull-thickness articular defects in rabbits）」（Clin. Orthop. Rel. Res.
275, 263-273, １９９２年））。
【００１４】 一連の特許において、Caplan他は骨髄からの間葉幹細胞（ＭＳＣ）を単離して
増殖するための方法を開示している（米国特許第４，６０９，５５１号、同第５
，１９７，９８５号および同第５，２２６，９１４号）。このCaplan法は２種類
の基本的な工程、すなわち、１）骨髄の採取、および２）インビボ培養で２週間
乃至３週間採取した骨髄に含まれるＭＳＣを増殖することを含む。この方法は特
定の培養媒体が別の細胞種上におけるＭＳＣの付着および繁殖に有効に作用する
点で遊離である。また、この基本的方法の変形においては、インビトロ培養の前
にＭＳＣに対する特定の抗体を用いて骨髄からＭＳＣがまず選択される（Caplan
およびHaynesworthのＰＣＴ国際公開第ＷＯ ９２／２２５８４号）。次に、イ
ンビトロで増殖して骨髄単離したＭＳＣを移植修復部位における受容体の中に導
入する（A. Caplanの「前駆体細胞（precursor cells）」（J. Ortho. Res. 9,
641, １９９１年)、S. E. Haynesworth、M. A. BaberおよびA. L. Caplanの「ヒ
ト骨髄に由来する間葉細胞における細胞表面抗原はモノクローナル抗体によって
検出される」（Bone, 13, 69-80， １９９２年)）。
【００１５】 しかしながら、上述したような現在の前駆体細胞を単離するための方法は考慮
すべき問題を多く抱えている。第１に、これらの方法は骨髄や他の組織を採取す
る必要がある。さらに、骨髄の採取は麻酔、出血、感染および手術後の痛みによ
る合併症のおそれを伴う付加的な外科手術を必要とする。また、骨膜や軟骨膜の
採取もさらに侵襲性の高い処理である。第２に、上記のCaplan法は細胞をその後
の用途に使用できるまでに骨髄採取したＭＳＣのインビトロ培養にかなりの時間
（２週間乃至３週間）を必要とする。それゆえ、このような付加的な細胞培養処
理の工程は時間がかかり、費用がかさみ、人為的な誤操作の生じる可能性が高く
なる。
【００１６】 従って、インビボでの骨および軟骨再生処理に使用できる骨形成および軟骨形
成能力を有する前駆体細胞を同定して単離するための迅速かつ簡単な方法が要望
されている。
【００１７】
【発明の概要】
本発明は種々の造血性および非造血性組織から前駆体細胞を単離するための方
法に関するものであり、この前駆体細胞は骨形成および軟骨形成能力を有してい
る。この前駆体細胞は末梢血液、骨髄、または細胞表面抗原ＣＤ３４またはＣＤ
３４＋細胞上の他の表面抗原への試薬による結合に基く脂肪組織から単離される
。
【００１８】 別の実施形態においては、脂肪組織から成る細胞の沈降密度の差を利用した脂
肪組織から骨または軟骨の前駆体細胞を単離するための方法が説明されている。
【００１９】 さらに、本発明は末梢血液、骨髄または脂肪組織から単離したＣＤ３４＋前駆
体細胞を用いて移植に関与するインビボでの骨および軟骨の再生のための方法を
提供する。実施形態の一例において、末消血液、骨髄または脂肪組織からのＣＤ
３４＋前駆体細胞の単離と、修復を必要とする接合組織部位における即時の内植
（すなわち、インビトロでの細胞培養工程の非存在下で）とを含むインビボでの
骨または軟骨の再生のための直接的な単一工程の方法が提供される。
【００２０】 本発明の別の実施形態においては、骨プロテーゼ装置の内植可能性を向上する
ための方法が説明されている。また、本発明は改善された骨内植プロテーゼ装置
を説明しており、この装置には患者の末梢血液、骨髄または脂肪組織から単離し
た骨形成能力を有する前駆体細胞が植え付けられている。
【００２１】 骨形成および軟骨形成能力を有する自系前駆体細胞を単離する能力は、単独ま
たはプロテーゼ装置の存在下のいずれにおいても、骨および軟骨の修復治療にお
いてより遠くに到達する臨床的な可能性を有する。本発明は末梢血液、骨髄およ
び脂肪組織を含む種々の組織から骨または軟骨を再生する能力を有する前駆体細
胞を単離するための簡単な方法を提供する。これらの前駆体細胞は、ＣＤ３４ま
たは、例えばＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７４およびＴＨＹ１のようなＣＤ３４＋
前駆体細胞の表面上の別のマーカーを認識する試薬を用いて単離できる。あるい
は、前駆体細胞または前駆体細胞を豊富に含む細胞集団が非前駆体細胞から前駆
体細胞を分離するのに適した陰性選別技法によって単離できる。前駆体細胞の供
給源として脂肪組織を使用する場合には、前駆体細胞を豊富に含む細胞集団が沈
降／密度差に基く技法によって分離できる。
【００２２】 本発明は細胞をインビボ用途に使用する前に単離した前駆体細胞のインビトロ
培養を必要としない。実際に、本発明によって単離した前駆体細胞は骨や軟骨の
再生のために即座にインビボで移植できる。それゆえ、始原細胞のインビトロ培
養のために別の方法によって必要とされる２週間乃至３週間の時間遅延が省略で
き、経済的かつ実用的で臨床的環境において有用な方法が得られる。
【００２３】 従って、本発明は末梢血液を含む造血性および非造血性の組織から直接に骨や
軟骨を発生する能力を有する前駆体細胞を単離するための方法に関する。好まし
い実施形態の一例において、本発明の方法は、組織サンプルを採集する工程と、
抗原ＣＤ３４またはＣＤ３４＋前駆体細胞上の別の抗原を認識する抗体または他
の試薬に当該サンプルを接触させる工程と、例えばアフィニティクロマトグラフ
ィによって、未結合物質から試薬−前駆体細胞複合体を分離する工程を含む。本
発明によって単離した前駆体細胞はインビボでの骨および軟骨の再生に即座に使
用できる。
【００２４】 態様の一例において、本発明は末梢血液、骨髄または脂肪組織から前駆体細胞
を単離するための方法であり、この前駆体細胞は骨や軟骨を形成する能力を有し
ている。
【００２５】 別の態様において、本発明は細胞表面マーカーＣＤ３４を担持する造血性およ
び非造血性組織からの細胞の選別に基いて骨形成性および／または軟骨形成性の
前駆体細胞を単離するための方法に関する。
【００２６】 さらに別の態様において、本発明は末梢血液、骨髄または脂肪組織から単離し
たＣＤ３４＋前駆体細胞を利用する骨または軟骨の再生方法に関する。
【００２７】好ましい実施形態の説明 本明細書における開示において使用する各用語を以下のように定義する。
【００２８】脂肪組織（Adipose Tissue） 脂肪細胞および微小脈管細胞を含む多数の脂肪種を含有する複合体組織。脂肪
組織は体内における前駆体細胞の最も簡便な供給源の一つである。本明細書にお
いて使用する用語の「脂肪組織（adipose tissue）」は脂肪および胎盤や筋肉の
ような体内における脈管組織の別の供給源を意味する。この用語は特に接合組織
、血液、骨膜および軟骨膜を除く。
【００２９】軟骨形成（性）（Chondrogenic） 軟骨生長を促す能力。この用語は軟骨細胞のような軟骨生長を刺激する細胞お
よび軟骨細胞に分化する細胞に適用される。また、この用語は軟骨生長を促進す
るＴＧＦ−βのような特定の生物活性化合物に適用する。
【００３０】接合組織（Connective Tissue) 骨、軟骨、靭帯、腱、半月板および関節包を含む体内における多数の構造組織
のいずれか。
【００３１】分化（Differentiation) 原始的で特殊化されていない細胞が一連の細胞分割を経て特殊化された機能を
有する子孫細胞を生み出す生物学的な過程。特異的な遺伝的および発現型の特徴
を有する高度に特殊化された細胞を伴う最終の分化の終点に至る経路。分化が比
較的特殊化されていない状態から比較的特殊化された状態に至る一方向のみに進
行するという過去の知見によるこれまでの見識。しかし、このような教義(dogma
）は上記の経路が実際は二方向性を有し得るということを示唆する新しい結果に
よって覆されようとしている。すなわち、特定の条件下において、より特殊化さ
れた細胞はさらに大きな特殊化に向う流れに逆行する子孫を実際に生み出し得る
。
【００３２】造血（性）幹細胞（Hematopoietic Stem Cell) 自己再生して全ての血液細胞種に分化する能力を有する原始的な細胞。
【００３３】間葉幹細胞（Mesenchymal Stem Cell) 自己再生および一連の分離した系統を経て骨、軟骨、腱、靭帯、骨髄支質、脂
肪細胞、真皮、筋肉および接合組織を含む広範な種々の異なる発現型を有する子
孫細胞を生じる能力を有する原始的な細胞種。
【００３４】微小脈管細胞（Microvascular Cell） 内皮、平滑筋および周皮細胞のような微小脈管の構造から成る細胞。
【００３５】骨形成（性）（Osteogenic） 骨を生成するまたは骨の生成を促す能力。この用語は骨の生長を促す能力を有
する骨芽細胞または骨芽細胞に分化し得る細胞に適用できる。さらに、この用語
は骨の生長を促す能力を有する生長因子（growth factors）に適用される。
【００３６】前駆体細胞（Precursor Cell） 分化して特定の機能を実行する能力を有する細胞。
【００３７】幹細胞（Stem Cell) 自己再生して種々の分化した細胞種を生じる能力を有する多能性前駆体細胞。
【００３８】 本発明は２種類の画期的な発見に基く。すなわち、第１に、インビボで接合組
織を形成する能力を有する前駆体細胞は末梢血液および脂肪組織を含む種々の造
血性および非造血性の組織供給源から単離できるということである。第２に、細
胞表面マーカーＣＤ３４（接合組織前駆体細胞についてこれまで認識されなかっ
た同定手段）はインビボで骨および軟骨を形成する能力を有する前駆体細胞用の
マーカーとして使用できる。
【００３９】 本発明者らは骨形成性および軟骨形成性の前駆体細胞（すなわち、末梢血液お
よび脂肪組織）の２種類の簡便で新しい供給源と、骨または軟骨の修復を誘発す
るためにホスト内に内植を行なう前のインビトロでの培養工程を必要としない骨
髄から単離した細胞集団を発見した。骨形成性および軟骨形成性の前駆体細胞の
供給源として骨髄または骨膜を使用していた従来の方法と異なって、本発明は末
梢血液および脂肪組織のようなより簡便に採取した組織から上記の細胞を単離す
ることを可能にする。つまり、骨髄や骨膜以外の組織から骨形成性および軟骨形
成性の細胞を単離可能にすることによって、従来の複雑な方法に比して相当に簡
単容易な方法が実現できる。
【００４０】 実施形態の一例において、本発明は、抗原ＣＤ３４および抗原ＣＤ３４＋細胞
上の別の細胞表面マーカーの発現に基いて接合組織細胞を生じる能力を有する人
間における前駆体細胞の単離が可能なアフィニティ法である。ＣＤ３４＋細胞上
の別のマーカーの幾つかの例として、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ７４およびＴＨ
Ｙ１が含まれるが、これらに制限されるものではない。別の実施形態においては
、前駆体細胞は分化沈降特性に基いて脂肪組織から単離される。都合の良いこと
に、脂肪組織は細胞懸濁液に分離することができ、この脂肪細胞は当該脂肪細胞
の密度（すなわち、１．０ｇ／ｃｍ3 以下）および他の不要な細胞および細胞成
分に比して前駆体細胞が高い密度（すなわち、１．０ｇ／ｃｍ3 以上）を有する
ことに基いて当該前駆体細胞から分離できる。さらに、従来の方法とは異なって
、本発明はインビトロの培養を要することなく骨や軟骨の再生過程のために単離
した前駆体細胞を即時に使用することを可能にする。この結果、本発明の方法は
従来の方法に比してより迅速かつ容易に行なうことができる。
【００４１】 Ｉ．前駆体細胞の単離 実施形態の一例において、前駆体細胞を単離するための本発明の方法は、体内
組織サンプルを採取すること、当該サンプルを前駆体細胞の表面上の抗原を認識
してこれに結合する抗体または他の試薬に接触させること、および、例えばアフ
ィニティクロマトグラフによって未結合の材料から前駆体細胞−試薬の複合体を
分離することを含む。この方法は脂肪組織を含む末梢血液、骨髄等の組織に適用
できる。しかしながら、単離の簡明化のために、外科手術を必要としない血液が
供給源材料として好ましい。
【００４２】（ａ）前駆体細胞の供給源としての末梢血液細胞 例示的に、約１ユニットの血液を例えば静脈穿刺等の任意の適当な手段によっ
て採取する。臨床的環境において特に有効と思われる方法はアフェレーシス（ap
heresis)であり、この方法は赤血球細胞を取り出す上で付加的な利点を有してい
る。赤血球細胞の取り出しは、当該細胞がこの方法の性能を高めて好ましいが、
不可欠ではない。赤血球細胞は例えば溶解、遠心分離または密度勾配分離等の任
意の適当な手段によってサンプルから取り出すことができる。さらに、サンプル
は例えばクエン酸塩、ヘパリンまたはＥＤＴＡによる処理によって抗凝固化処理
が施されているのが好ましい。
【００４３】 前駆体細胞の収量は有核の血液細胞集団の約０．１％乃至０．５％と予想され
る。なお、収量はドナーの健康状態や年齢およびサンプルの鮮度によって異なる
。この収量は血液採集の前に患者に薬物または生長因子を投与することによって
大幅に増加することが可能である。この方法は冷凍保存のサンプルに有効である
が、新鮮なサンプルが好ましい。
【００４４】 末梢血液から前駆体細胞を単離するための陽性選別法における臨床的な工程は
ＣＤ３４＋細胞上の細胞表面を認識してこれに結合する試薬に血液サンプルを接
触させる処理を含む。なお、ＣＤ３４＋細胞を認識してこれに結合するあらゆる
試薬が本発明の範囲に含まれる。適当な試薬としては、例えば、大豆アグルチニ
ン（ＳＢＡ）およびＬ−セレクチンが挙げられる。
【００４５】 好ましい実施形態の一例において、上記サンプルはＣＤ３４に対する抗体に接
触される。この場合、モノクローナル（ｍＡｂ）またはポリクローナルのいずれ
の抗体も使用可能である。ＣＤ３４およびＣＤ３４＋細胞上の別の細胞表面抗原
に対する抗体を調製する方法は当該技術分野における熟練者において周知である
。例えば、ＣＤ３４およびＣＤ３４＋細胞上の別の細胞表面マーカーに対する適
当なヒト抗体調製物はワシントン州、ボーゼルのCell Pro社またはカリフォルニ
ア州、マウンテンビューのBecton-Dickinson社から市場により入手できる。
【００４６】 前駆体細胞上の適当な細胞表面抗原はＣＤ３４抗原および例えばＴＨＹ１、Ｃ
Ｄ３３、ＣＤ３８およびＣＤ７４のようなＣＤ３４＋細胞上の他の抗原を含む。
好ましい細胞表面マーカーはＣＤ３４である。なお、前駆体細胞用のマーカーと
してＣＤ３４＋細胞上の別の細胞表面抗原を使用することによってもこの処理方
法が有効となることが予想される。
【００４７】 結合を可能にするために抗体と共にサンプルを短いインキュベーションにかけ
た後に、例えばアフィニティクロマトフラフィ、磁気ビーズ、およびパニング(p
anning）のような任意の適当な方法によって前駆体細胞−抗体複合物が回収され
る。好ましい実施形態において、この回収処理はアフィニティクロマトグラフィ
によって行なわれる。(例えば、RJ Berenson他の「アビジン−ビオチン免疫吸着
による生存能力を有する細胞集団の陽性選別（Positive selection of viable c
ell populations using avidin-biotin immunoadsorption）」（J. Immunolog.
Meth. 91, 11-19， １９８６年）を参照されたい。)
【００４８】 簡潔に説明すると、上記の一実施形態に従うアフィニティ回収法はビオチン−
アビジンカップリング反応を利用して、当該反応において、抗体が任意の適当な
方法でビオチンに結合する。この抗体−ビオチンラベル化した前駆体細胞複合体
はアビジンラベル化したマトリックスを充填したカラムに反応混合物を通すこと
によって未結合物質から分離される。この未結合物質は洗浄によってカラムから
除去される。有用な市販の細胞分離装置はビオチン−ラベル化したヒト抗ＣＤ３
４およびアビジンラベル化したマトリックスを充填したカラム(ワシントン州、
ボーゼルのCellPro社により販売される「ＣＥＰＲＡＴＥ(登録商標)ＬＣ」）を
含む。
【００４９】 間接的なラベル化方法もまた本発明の範囲内に入る。例えば、一次的な抗体を
前駆体細胞表面マーカーに対して使用して、ビオチンでラベル化した二次的な抗
体を一次的な抗体に対して使用することができる。あるいは、二次的な抗体を適
当な固体支持物質に結合することができる。
【００５０】 陰性選別方式もまた本発明の範囲内に入る。この陰性選別によって、抗体また
は別の試薬はＣＤ３４＋細胞上に無い細胞表面マーカーに対して用いられる。そ
の後、この試薬（すなわち、抗体またはレクチン）に結合しない細胞が単離され
る。実施形態の一例によれば、骨形成および軟骨形成能力を有する細胞（すなわ
ち、軟骨および骨前駆体細胞）を豊富に含む細胞集団が、末梢血液、骨髄または
脂肪組織から単離した細胞を軟骨および骨前駆体細胞の表面上に存在しない表面
抗原に結合する試薬組成物に接触させることよって調製される。用語の「豊富に
含む細胞集団(enriched cell population)」は細胞を単離した天然組織における
特定の細胞種の存在率に比して当該細胞種の高い存在率を有する細胞集団を示す
ように本発明に従って用いられている。上記の試薬組成物はＣＤ３、ＣＤ８、Ｃ
Ｄ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９およびＣＤ２０から成る群から選択される細胞表面
抗原に結合するレクチンまたは抗体から選択できる。このうち、ＣＤ３抗原およ
びＣＤ８抗原はＴ細胞に関連し、ＣＤ１９抗原およびＣＤ２０抗原はＢ細胞に関
連し、ＣＤ１５抗原は顆粒細胞に関連し、ＣＤ１０抗原はリンパ球細胞前駆体お
よび顆粒細胞に関連する。好ましくは、これらの抗原の組合せを用いて非始原細
胞上に存在する幾つかの異なる抗原に結合させる。その後、この試薬に結合しな
い細胞を回収する。クロマトグラフィ、磁気ビーズまたはパニングを含む標準的
な分離技法が試薬に結合している細胞と試薬に結合しない細胞とを分離するため
に利用できる。
【００５１】（ｂ）前駆体細胞の供給源としての骨髄 血液から前駆体細胞を単離するための上記の方法は骨髄に対してもほとんど同
様の様式で適用できる。骨髄は例えば腸骨稜アスピレーションのような任意の適
当な様式で収集できる。好ましい実施形態において、骨髄はＥＤＴＡ、ヘパリン
またはクエン酸塩のような抗凝固剤によって処理されて、例えば溶血または密度
勾配遠心分離のような任意の適当な手段によって有核細胞が非有核細胞から分離
される。
【００５２】 ＣＤ３４細胞表面抗原を発現する前駆体細胞がＣＤ３４またはＣＤ３４＋細胞
の表面上の別の抗原を認識してこれに結合する試薬によって骨髄から単離される
。適当な試薬は抗体、レクチンおよび付着分子を含む。さらに、結合した細胞が
アフィニティクロマトグラフィ、磁気ビーズまたはパニングによって未結合細胞
から分離される。
【００５３】 好ましい実施形態において、ＣＤ３４に対して使用される抗体は結合反応にお
いて使用されて、結合した細胞が、後述する実施例においてより詳細に説明する
ように、アフィニティクロマトグラフィによって未結合の細胞から分離される。
【００５４】（ｃ）前駆体細胞の供給源としての脂肪組織 この部分の始めに定義したように、遺伝的意味において本明細書における開示
全体を通して、「脂肪組織」は脂肪その他の組織種（接合組織、血液、骨膜およ
び軟骨膜を除く）を意味し、微小脈管細胞も含む毛細管が形成された微小脈管組
織は血液輸送系の一体の部分であり、体内の至るところに存在している。この微
小脈管組織は少なくとも３種の細胞種、すなわち、内皮、周皮細胞および平滑筋
から成る。初期の研究では微小脈管組織が骨の代謝において重要な役割を果たす
可能性のあることが示唆されていた。この場合の決め手となる観察は、微小脈管
細胞および組織が新規に（de novo)発生して骨の修復および骨の生長の部位にお
いて増殖することであった。このような観察によって、内皮細胞、周皮細胞また
はこれらの両方が骨前駆体細胞となり得るか、あるいは、微小脈管細胞が骨前駆
体細胞に分裂促進作用（mitogenic effect）を及ぼすことが推測されるようにな
った。（例えば、C. Brighton他の「可能な骨芽細胞の始原細胞としての周皮細
胞(The pericyte as a possible osteoblast progenitor cell）」（Clin. Orth
op. 275, 287-299, １９９２年）を参照されたい。）さらに最近のインビトロ培
養した細胞を用いる研究は微小脈管細胞による始原様（progenitor-like）細胞
増殖および分裂促進作用の両方を示唆している（AR Jones他の「微小血管内皮細
胞および周皮細胞はラットの頭蓋冠骨細胞の培養において増殖作用を増大し、骨
芽細胞発現型マーカーを抑制する（Microvessel endotherial cells and pericy
tes increase proliferation and repress osteoblast phenotype markers in r
at calvarial bone cell culture）」（J. Ortho. Res. 13, 553-561, １９９５
年）。それゆえ、微小脈管細胞集団の中に骨形成および軟骨形成能力を有する前
駆体細胞が存在する。
【００５５】 本発明の脂肪組織に適用される方法は２種類の実施形態を有する。すなわち、
第１の実施形態において、上記組織がＣＤ３４またはＣＤ３４＋細胞上の表面抗
原を認識する試薬に接触される。末梢血液および骨髄の場合と同様に、脂肪組織
との使用に適する結合試薬として、レクチン、抗体および付着分子が含まれる。
一方、脂肪組織に適用されるアフィニティ結合法は、抗原結合性試薬を伴うイン
キュベーションの前に単一細胞懸濁液を精製する付加的な処理工程を必要とする
点で、血液および骨髄に適用される方法とは異なる。例えばコラーゲナーゼのよ
うな任意の適当な分解酵素が使用できる。その後、例えばアフィニティクロマト
グラフィ、磁気ビーズまたはパニングのような任意の適当な手段によって試薬に
結合した細胞が未結合細胞から分離できる。
【００５６】 脂肪組織に適用される本発明の好ましい実施形態において、骨形成および軟骨
形成能力を有する前駆体細胞を豊富に含む細胞部分を得るために沈降法が利用さ
れる。この組織の採取および酵素による消化によって単一細胞の懸濁液を形成し
た後に、細胞をベンチトップ（bench top)上の重力沈降または遠心分離によって
分離する。
【００５７】 例示的に、脂肪は脂肪吸引等の任意の適当な方法によって確保できる。約１０
ｃｃ乃至３０ｃｃの脂肪組織を十分な分解酵素（例えば、コラーゲナーゼ）によ
って消化して単一細胞の懸濁液を生成する。酵素の消化のための適当な反応条件
は当該技術分野における熟練者において既知のように使用する酵素によって変化
する。この酵素の消化に続いて、脂肪細胞が遠心分離によって他の細胞種から分
離される。一般に、この細胞はバッファー処理した水性溶液中に懸濁され、この
溶液中において、脂肪細胞は表面に浮遊し、前駆体細胞を含む１．０ｇ／ｃｍ3 以上の比較的高密度の細胞が底に集合してその後に任意の適当な手段によって分
離可能となる。採取した前駆体細胞を洗浄した後に、これらの細胞を適当なキャ
リヤと混合して即座に修復を必要とする部位にインビボで内植する。
【００５８】 ＩＩ．インビトロでの間葉組織再生 本発明の方法によって回収した前駆体細胞は種々の臨床的用途において有用で
ある。例えば、これらの細胞は付加的な処理を要さずに患者の接合組織部位に移
植して損傷した骨または軟骨の修復または再生を促すことができる。
【００５９】 従来の方法とは異なって、本発明はインビボ用途に使用する適当な細胞種また
は適量の前駆体細胞を得るためにインビトロの培養を必要としない。さらに、本
発明によって、骨形成および軟骨形成性の前駆体細胞が末梢血液および脂肪組織
のような種々の造血性および非造血性の体内組織から単離できるという予期せぬ
発見を得た。この発見によって、インビトロ培養によって細胞数を増やす付加的
な時間のかかる工程を省いてインビボ用途用の十分な細胞を簡便に生成すること
によって引き出される前駆体細胞の貯蔵所を形成することができる。すなわち、
本発明のこの特徴によって、時間および経費を節約することができ、複雑化のお
それを少なくして患者の痛みを軽減することができる。
【００６０】 本発明の例示のためだけであって、これを制限しない意味において、上記の任
意の適当な組織から本発明の方法によって単離した前駆体細胞は骨や軟骨の再生
を必要とする任意の接合組織部位に内植できる。なお、適当な内植方法としては
外科手術または関節鏡注射が含まれる。
【００６１】 生物学的な分化を決定する因子は完全には理解されていないが、修復を必要と
する体内の部位に移植した場合に、前駆体細胞は骨や軟骨に分化することが知ら
れている。本発明の方法によって単離した前駆体細胞は単独または例えば生長因
子を含む細胞信号賦与性分子のような生物活性を有する化合物とのプレミックス
の状態で移植できる。本発明に従う使用に適する生物活性を有する化合物として
は、形質転換生長因子β（ＴＧＦβ）、骨形態発生タンパク２，３，４または７
（ＢＭＰ２，３，４，７）、塩基性線維芽細胞生長因子（ｂＦＧＦ）、インシュ
リン様生長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、ソニックヘッジホグ（sonic hedgehog）（ｓ
ｈｈ）、インデアンヘッジホグ（ｉｈｈ）、生長および分化因子５、分化因子６
または分化因子７（ＧＤＦ５，６，７）が含まれる。さらに、本発明に従う使用
に適する他の信号賦与性分子として、ビトロネクチン（ＶＮ）、ラミニン（ＬＮ
）、骨シアロプロテイン（ＢＳＰ）およびオステオポンチン（ＯＰＮ）が含まれ
る。
【００６２】 実施形態の一例において、本発明の方法は修復の必要な所定部位において軟骨
や骨の生成を誘発するように構成されている。この方法は骨形成および軟骨形成
能力を有する細胞を豊富に含む細胞集団から成る組成物に上記部位を接触させる
工程から成り、この場合に、上記の細胞は末梢血液、骨髄または脂肪組織から単
離される。実施形態の一例において、上記の細胞集団は始原細胞を豊富に含み、
この豊富に含む細胞集団がＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９およ
びＣＤ２０から成る群から選択される細胞表面抗原に特異的な試薬に結合するこ
とに関する始原細胞の不全性に基いて調製される。あるいは、この豊富に含む細
胞集団は、末梢血液、骨髄または脂肪組織から調製した細胞懸濁液をＣＤ３４抗
原を支持する細胞に結合する試薬に接触させて試薬に結合した細胞と試薬に結合
しない細胞の混合物を形成して、標準的なクロマトグラフィ、磁気ビーズまたは
パニング技法によって試薬に結合した細胞を未結合の細胞から分離することによ
って調製される。
【００６３】 好ましい実施形態の一例において、上記の骨または軟骨の始原細胞は、これら
の細胞が患者に外科的に内植または注入される前に、当該技術分野における熟練
者に周知の生体許容性のキャリヤ材料と組み合わされる。このキャリヤは移植し
た細胞の移動を妨げるように機能して、損傷または病気の組織の修復をさらに促
進するように作用する。適当なキャリヤとしては、コラーゲン、ゼラチン、フィ
ブリン／フィブリンクロット、脱塩骨マトリックス（ＤＢＭ）、マトリゲル(Mat
rigel(登録商標))およびコラスタット（Collastat(登録商標)）のようなタンパ
ク質、澱粉、多糖類、サッカライド、アミロペクチン、ヘタスターチ（Hetastac
h）、アルギン酸、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースのよう
な炭水化物、ヒアルロン酸のようなプロテオグリカン、寒天、ポリエステル（特
に、グリコール酸、乳酸、カプロラクトン、マレイン酸およびグリコールのよう
な通常の代謝生成物）、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエチルメタク
リレート、ポリメチルメタクリレート、ポリ（アミノ酸）、ポリジオキサノンお
よびポリアンハイドライドを含む合成ポリマー、トリカルシウムホスフェート、
ヒドロキシアパタイト、アルミナ、ジルコニア、骨無機質および石膏のようなセ
ラミック、バイオガラス（Bioglass）、Ａ−Ｗグラスおよびカルシウムホスフェ
ートグラスのようなガラス、チタン、Ｔｉ−６Ａｌ−４Ｖ、コバルト−クロム合
金、ステンレススチールおよびタンタルを含む金属、ヒドロゲル基材(matrix)が
含まれる。実施形態の一例において、上記キャリヤは生体分解性（biodegradabl
e）または生体再吸収性（bioresorbable）である材料から選択される。
【００６４】 表２に示すデータはインビボ用途における本発明の作用性を示している。これ
らの研究において使用したラットの頭蓋冠モデルは、モノクローナル抗体によっ
て骨髄から単離したＣＤ３４＋細胞が陽性対照（自系移植片）と同様にインビボ
環境における骨の生長の促進に効果的にであることを示した。また、このデータ
は抗体自体がおそらく補体系との相互作用によって得られる結果に対して影響を
及ぼし得るということを示している。例えば、ｍＡｂ５Ｅ６によって結合した細
胞はラットの頭蓋冠モデルにおける骨の生長を刺激しない。両方の試験した抗体
はＣＤ３４を認識するＩｇＭアイソタイプであるが、５Ｅ６は補体に有効に結合
するが２Ｃ６は結合しない。
【００６５】 ＩＩＩ．プロテーゼ装置 種々の臨床的に有用なプロテーゼ装置が骨および軟骨移植処理における使用の
ために開発されている。（例えば、Bone Grafts and Bone Substitutions（Ed.
M.B. Habal & A. H. Reddi,W. B. Saunders Co., １９９２年）を参照されたい
。）例えば、有効な膝および股置換装置が開発されて臨床環境において広く使用
し続けられている。これらの装置の多くは免疫活性の低い体内において安全に機
能する種々の無機材料によって製造されている。これまで試みられて立証されて
きた合成材料の例としては、チタン合金、カルシウムホスフェート、セラミック
ヒドロキシアパタイトおよび種々のステンレススチールおよびコバルト−クロム
合金が含まれる。これらの材料は構造的な支持を行なって、ホストの血管新生お
よび細胞転移が生じる足場を形成することができる。
【００６６】 表面に織り目を付けた(textured)プロテーゼ装置は剥き出しの無機質構造とし
てホストの中に効果的に係留されるが、それらの付着力は骨形成性の前駆体細胞
または骨形成性細胞を引き付けて活性化する生物活性を有する化合物を受け付け
ることによって改善される。このような「生物学的植え付け（biological-seedi
ng）」はホストの血管新生および細胞転移が生じ得る繁殖力のある環境を与える
ことによって付着力が生じる効果および速度を高めると考えられる。
【００６７】 本発明は上記のプロテーゼ装置に「植え付ける（seed）」ために使用できる前
駆体細胞の供給源を提供する。好ましい実施形態において、前駆体細胞は装置に
適用する前にキャリヤ材料とまず混合される。当該技術分野における熟練者に周
知の適当なキャリヤはゼラチン、フィブリン、コラーゲン、澱粉、多糖類、サッ
カライド、プロテオグリカン、合成ポリマー、カルシウムホスフェートまたはセ
ラミックを含むがこれらに限られない。このようなキャリヤは有用な時間にわた
ってインプラント装置が多孔質表面上に細胞が保持されることを確実にする。
【００６８】 本発明の別の関連する態様は骨および軟骨の移植用のプロテーゼ装置を作成す
る場合に有用なキットである。このキットは１個以上の選択可能な生体許容性の
キャリヤと、患者の組織からの始原細胞を豊富に含む細胞集団を調製するための
試薬組成物とを含む。脂肪組織からプロテーゼを構成するための実施形態の一例
において、このキットは脂肪組織から細胞懸濁液を生成するための酵素混合物と
、当該細胞懸濁液から生じる始原細胞において豊富に含む細胞集団に混合するた
めのキャリヤマトリックスとから成る。さらに、このキットは上記の酵素混合物
と共に使用するためのバッファーおよび上記の細胞懸濁液を洗浄および処理する
ためのバッファーを含む。実施形態の一例において、このキットは脂肪吸引用の
廃棄可能な付着部品と、単離した脂肪組織および細胞懸濁液を処理するための廃
棄可能な容器を含む。さらに、このキットはＣＤ３４抗原を担持する細胞に結合
する試薬組成部とＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９およびＣＤ２
０から成る群から選択される抗原を担持する細胞に結合する成分を含む試薬組成
物も含むことができる。
【００６９】 本発明は当該発明を実施する以下の例示的な実施例を参照することによってよ
り完全に理解することができる。なお、これらの実施例は本発明を不当に制限す
ることを目的としていない。
【００７０】 実施例１前駆体細胞の骨再生能力用の動物体モデル ラットの頭蓋冠モデルをインビボ用途における本発明の作用性を試験するため
に用いた。このモデルはラットの頭蓋骨に外科的に導入した頭蓋冠欠損部におけ
る骨の生長を促進するための種々の試験サンプルの能力をモニターするように構
成されている。頭蓋冠欠損部は以下の手順に従って約３００ｇ乃至５００ｇの範
囲の体重を有する６ヶ月乃至９ヶ月の老いたフィッシャー（Fisher）ラットに導
入した。これらの動物体にKetamineRompun（キシラジン)−Acepromazine（アセ
プロマジンマレエート）カクテルによる筋肉内注射によって麻酔をかけて、頭蓋
骨の頭蓋冠部分に外科的な切開部を形成した。皮膚片を剥がした後に、直径８ｍ
ｍの頭蓋骨における円形部分を円形トレフィンおよび生理塩水の灌注を伴ってド
リルで除去した。８ｍｍ径の「ＧＥＬＦＩＬＭ」のディスクを各欠損部の中に入
れて試験材料から露出した脳を分離して止血状態に維持した。このように形成し
た頭蓋冠欠損部に単離した細胞母集団から成るテストサンプルを充填した。一部
の実験において、この試験サンプルは頭蓋冠欠損部への導入の前にラットテイル
コラーゲンまたはAvitene（登録商標)ボビンコラーゲンから成るキャリヤ材料と
混合した。陽性対照を自己移植片により構成し、陰性対照をトリカルシウムホス
フェート（ＴＣＰ）キャリヤのみの移植片によって構成した。傷の部分を外科的
に閉じた後に、処理した動物体をそれぞれの籠に戻して、通常の給食および給水
状態に維持して、手術後２８日目に殺して評価に用いた。
【００７１】 切断した骨の端部の間の直線距離における閉塞部分の測定または欠損部の中央
部分における骨の生長による島状の部分を観察することによって欠損部位におけ
る新しい骨の形成を調べて頭蓋冠欠損部における骨の生長を誘発する試験サンプ
ルの有効性を評価した。この評価点の基準を表１に示す。また、これらの結果を
表２にまとめた。
【００７２】 表１骨形成評価 部位 評価点 説明 欠損部 ０ 骨における実質的な増加がない。すなわち、吸収量 よりも形成量が少ないか、全く形成していない。 １ 切断した骨の端部間の直線距離の約５％以下が新し い骨によって架橋されている。 ２ 欠損部の約５％乃至３３％が新しい骨によって 架橋されているか、欠損部の中央部分に骨の島状の 部分が存在する。 ３ 欠損部の約３３％乃至６６％が新しい骨によって 架橋されている。 ４ 欠損部の６６％以上が新しい骨によって架橋されて いる。 ５ 新しい骨によって欠損部が完全に架橋している。
【００７３】 表２ 組織／細胞種 Ｎ ＲＢＲＡ（平均±Ｓ．Ｄ．） 自己移植片（陽性対照） １４２ ２．４±０．７ ＴＣＰ（陰性対照） １０５ １．０±０．９ 骨髄 ３０ ２．５±１．１ Marrow Ficoll １８ ２．３±０．８ Marrow/Avitene ９ １．８±０．４ Blood Ficoll １１ １．３±０．５ Blood/RTC Ficoll １６ １．４±０．５ ２Ｃ６＋細胞 １２ １．８±０．４ ２Ｃ６−細胞 １２ ０．７±０．５ ５Ｅ６＋細胞 １２ １．３±０．６ ５Ｅ６−細胞 １２ １．５±０．５ ＳＢＡ＋細胞 １２ １．８±１．１ ＳＢＡ−細胞 １８ １．４±０．７ ＲＢＲＡ：相対的な骨の再生活性 Ｎ：実験数 Ｓ．Ｄ．：標準偏差 ２Ｃ６および５Ｅ６細胞は骨髄から単離した ＳＢＡ：大豆アグルチニン
【００７４】 実施例２ラット骨髄からの豊富に含む有核細胞母集団の単離 ラットの骨髄を８週間乃至１０週間の年齢の雄のフィッシャーラットから採取
した６個の大腿骨の骨髄内空腔部から単離した。動物体を殺して評価する前に、
これらを通常の給食および給水状態で維持した。この骨髄を約５ｍｌのＡＣＤバ
ッファーを入れた試験管の中に洗い出すことによって摘出した大腿骨から抽出し
た。均一状態のバッファーＡＣＤは２．２ｇのＮａ3 クエン酸塩・２Ｈ2 Ｏ、０
．８ｇのクエン酸および２．４ｇの１００ｍｌ蒸留水に溶解したデキストロース
から成る。特に記載しない限り、バッファーＡＣＤはＰＢＳ中において１５％の
濃度に希釈されている。抽出した骨髄細胞はピペット操作によってバッファー中
に穏やかに懸濁される。赤血球細胞を白血球細胞から分離するために、この骨髄
細胞の懸濁液に比重１．０９のFicoll-Hypaque(ミズーリ州、セントルイスのSig
ma Chemical社)４ｍｌを加えて１２００×ｇで２０分間遠心分離処理した。遠心
分離処理後に、有核細胞を含有する中間層をピペット操作によって取り出した。
この細胞を５ｍｌのＡＣＤ内で洗浄して２５０×ｇで６分間乃至７分間遠心分離
処理した。このペレットを１％のＢＳＡ／ＰＢＳ（CEPRATE-LCキットに供給され
るボビン血清アルブミン、ホスフェートバッファー化生理塩水）においてさらに
２回洗浄する。なお、凝血を防止するために全てのＰＢＳはＣａ2+およびＭｇ2+ を含まない。
【００７５】 実施例３モノクローナル抗体およびアフィニティクロマトグラフィによるラット骨髄から のＣＤ３４＋細胞の単離と、ラット頭蓋冠モデルにおけるインビボでの骨再生に おけるそれらの使用 （材料および方法） マウスのＩｇＭモノクローナル抗体２Ｃ６および５Ｅ６をラットの造血性細胞
の亜集団の表面上に存在するラットＣＤ３４に対して増殖した。これらの実験に
おいて使用したＣＤ３４のｍＡｂはDr. Othmar Fosterに従って当該技術分野に
おける熟練者に周知の態様で作成した。ｍＡｂの２Ｃ６および５Ｅ６に結合した
細胞の蛍光分取に使用する抗−マウスＩｇＭ：ＦＩＴＣは Boehringer Mannheim
のカタログ番号１００８０７によって得られる。同様に蛍光分取に使用するアビ
ジン：ＦＩＴＣは Boehringer Mannheimのカタログ番号１００２０５によって得
られる。このようにｍＡｂ２Ｃ６または５Ｅ６によってラベル化したＣＤ３４＋
細胞はアフィニティカラム法によって未結合細胞から分離される。有用な市販の
アフィニティ細胞分離キット「CEPRATE LC」はCellPro(ワシントン州、ボーゼル
９８０２１の CellPro社）から入手できる。また、抗−マウスＩｇＭ：ビオチン
はアラバマ州、バーミンガムのSouthern Biotechのカタログ番号１０２２−０８
によって購入した。
【００７６】 ＣＤ３４表面抗原を担持する細胞をラットの骨髄から以下のように単離した。
実施例２において説明した態様で単離して洗浄した有核細胞を約０．５ｍｌの１
％ＢＳＡ／ＰＢＳ（CellProキットによる)の中に再懸濁した。その後、１μｇ／
ｍｌ乃至４０μｇ／ｍｌの濃度範囲の一定容量のｍＡｂを加えて、この混合物を
時々穏やかに振盪して室温で約１時間インキュベートした。このインキュベーシ
ョンの後に、混合物を１％ＢＳＡ／ＰＢＳによって１０ｍｌにしてから２５０×
ｇで６分間遠心分離処理した。このペレットを穏やかに再懸濁してからさらに１
０ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳにおいて２回洗浄して前述のように遠心分離処理し
た。さらに再懸濁および遠心分離処理した後に、最終的な細胞ペレットを２ｍｌ
の１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁して、ビオチン化した（biotinylated）抗−マウ
スＩｇＭでインキュベーションした。
【００７７】 約１０μｌのヤギ抗−マウスＩｇＭ：ビオチン（０．５ｍｇ／ｍｌ希釈前）を
前の工程において得た再懸濁したｍＡｂ細胞ペレットに加えた。この混合物を穏
やかに振盪して約３０分間室温でインキュベーションした後に、前述のように、
遠心分離処理およびＢＳＡ／ＰＢＳ中における再懸濁によって細胞を２回洗浄し
た。最終の細胞ペレットを１ｍｌ乃至４ｍｌの容量で５％ＢＳＡ中において約１
００×１０6 細胞／ｍｌに再懸濁してアビジンカラムに充填できるようにした。
【００７８】 抗体ラベル化した細胞および未ラベル化細胞を製造者（ワシントン州、ボーゼ
ルのCellPro社)によって推奨される条件下で「CEPRATE LC」カラム上で分離した
。要するに、このカラムはＰＢＳ−平衡化アビジンマトリックスの着床部を含む
。サンプルを充填する前に、約５ｍｌの５％ＢＳＡをカラム中に流した。その後
、予め希釈した細胞サンプルをゲルマトリックスの上面に層状に載せてマトリッ
クスゲル内に展開させた。未ラベル化細胞を約３ｍｌ乃至５ｍｌのＰＢＳによっ
てカラムから洗い出した。さらに、ｍＡｂラベル化した細胞をマトリックスから
放出してカラムを穏やかに絞ることによって少量の５％ＢＳＡの中に集めて、Ｐ
ＢＳでカラムを洗浄しながらマトリックスを攪拌した。結合および未結合のフラ
クションから僅かな部分を取り出して細胞計数およびフローサイトメトリー用に
使用した。また、移植実験用に、上記の細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで２回およびＰＢ
Ｓ中で１回洗浄した。
【００７９】 （結果） 各実験において約１０×１０6 乃至２０×１０6 個の付着性細胞が生じて、そ
のうちの約半数が頭蓋冠欠損部内に移植された。カラムから採取した細胞フラク
ションをヘマサイトメーターによるトリパンブルー細胞計数法によってその生存
能力を評価した結果、約８５％乃至９７％の範囲で生存可能であることが分かっ
た。付着性細胞集団は小芽細胞の群集であると思われる。さらに、ＦＡＣＳを用
いてカラム上で単離したＣＤ３４＋細胞の純度を決定した。この結果、付着性細
胞集団は約５０％の純度で元の数のＣＤ３４＋細胞の約５０％を含有していた。
【００８０】 ＣＤ３４＋細胞を適当なキャリヤの存在下または非存在下にラットの骨髄冠欠
損部内に移植した。これらの実験において２種類のキャリヤ、すなわち、アビテ
ン（Avitene）牛コラーゲンおよびラットテイルコラーゲンを試みた結果、これ
らの両方とも有効であることが分かった。しかしながら、炎症性の反応が最も少
ない点でラットテイルコラーゲンが好ましい。約５０ｍｇのコラーゲンを６０℃
で１ｍｌのＰＢＳの中に溶解して細胞と混合する前に３７℃に平衡化した。一部
の実験において、１００μｌのコラーゲン溶液を細胞ペレットに混合して、この
混合物を骨髄冠欠損部に移植する前に４℃に冷却することによってコラーゲンお
よび細胞を含有するペレットを形成した。外科手術的な移植を実施例１に記載し
たのと同様に行なって手術後２８日目に被検体の動物を殺して評価に用いた。
【００８１】 骨形成における組織学に基く評価点を表１に示す様式に従って見積った。
【００８２】 （考察） ｍＡｂ５Ｅ６によって単離したＣＤ３４＋細胞がインビボにおける骨再生を刺
激しないことは、この抗体がｍＡｂ２Ｃ６よりも補体系においてさらに有効な活
性化因子である（データを示さず）という補助的な観察によって説明できる。
【００８３】 実施例４（ａ）Ficoll分離処理した全血細胞によるラット骨髄冠モデルにおける骨の再生 実施例１において説明したラット骨髄冠モデルを用いてFicoll分離処理した全
血細胞の骨再生能力を評価した。約２．５ｍｌのドナー血液を各被検体の骨髄冠
欠損部に対して用いた。ドナーの動物は８週乃至１０週の老齢の雄のＦ３４４系
ラットである。また、被検体は６ヶ月乃至８ヶ月の年齢である。ドナーは３ｃｃ
の注射器で採血され、この注射器には約０．５ｃｃのＡＣＤ溶液が凝固を防ぐた
めに入れられている。
【００８４】 ＡＣＤストック溶液 ＡＣＤ作用溶液 ２．２ｇＮａ3 クエン酸塩・２Ｈ2 Ｏ １５ｍｌＡＣＤストック溶液 ０．８ｇクエン酸・１Ｈ2 Ｏ １００ｍｌＰＢＳ（Ca2+/Mg2+無し） ２．４ｇデキストロース １００ｍｌ蒸留水
【００８５】 血液を１５ｍｌの円錐形試験管に入れてＡＣＤ作用溶液で５ｍｌにした。この
サンプルに４ｍｌのFicoll-Hypaqueを加えて２０分間室温で１２００×ｇで遠心
分離処理した。遠心分離処理後に、白色の細胞層を各試験管からピペットによっ
て取り出した。
【００８６】 Ficoll分離処理した血液細胞を直接またはキャリヤ材料との混合後に移植実験
に用いた。直接の移植の場合には、細胞ペレットを１０ｍｌのＰＢＳ中において
２回洗浄し、約５×１０6 乃至１０×１０6 個の細胞を含有する最終ペレットを
骨髄欠損部内に均一に供給した。細胞サンプルのキャリヤ材料とのプレミックス
は移植前にラットテイルコラーゲンと混合した。約５０ｍｇのラットテイルコラ
ーゲン（ミズーリ州、セントルイスのSigma社のカタログ番号Ｃ−８８９７によ
り入手)を５００μｌのＰＢＳ中で６０℃に加熱してコラーゲンタンパクを溶解
した。このコラーゲン溶液を細胞ペレットと混合する前に３７℃に平衡化した。
約６０μｌのコラーゲン溶液を細胞ペレットと混合して、この細胞−コラーゲン
混合物の全体を骨髄欠損部に移植した。
【００８７】 実施例５モノクローナル抗体およびアフィニティクロマトグラフィによるラット血液から のＣＤ３４＋細胞の単離 （１）溶血バッファー−１０×ストック溶液 以下のものを１リットルの蒸留水に溶解して、ｐＨ値を７．３に調節し、ろ過し
て滅菌処理した後に２℃乃至８℃で貯蔵した。 ８３ｇのＮＨ4 Ｃｌ １０ｇのＮａＨＣＯ3 ４ｇのＮａ2 ＥＤＴＡ （２）ホスフェートバッファー化生理塩水（ＰＢＳ）Ｃａ2+およびＭｇ2+無し 以下のものを１リットルの蒸留水に溶解して、ｐＨ値を７．２に調節し、ろ過し
て滅菌処理した後に２℃乃至８℃で貯蔵した。 ８ｇのＮａＣｌ １．１５ｇのＮａ2 ＰＯ4 ０．２ｇのＫＨ3 ＰＯ4 ０．２ｇのＫＣｌ （３）ＰＢＳ＋ボビン血清アルブミン １００ｍｌＰＢＳ中に１ｇのＢＳＡを溶解した。
【００８８】 （ａ）標準の手法によってヘパリン処理した８週乃至１０週の年齢の１７匹の
雄のＦ３４４ラットから心臓に穴あけして約１００ｍｌの全血を収集した。この
全血に３００ｍｌの１×溶血バッファーを３７℃で混合して約３分間放置するこ
とによって赤血球細胞を溶解した。その後、１００ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ洗浄溶
液を加えて、混合物を１０分間１７０×ｇで遠心分離処理した。得られた上澄み
液を細胞ペレットに影響を及ぼすことなく吸い出した。その後、このペレットを
ＰＢＳ／ＢＳＡ中で穏やかに再懸濁してから遠心分離処理することによって２回
洗浄した。最終的なペレットをＰＢＳ／ＢＳＡ中で２ｍｌにしてｍＡｂとのイン
キュベーション用の調製物とし、少量の部分を取り出して細胞計数およびＦＡＣ
Ｓ分析に用いた。
【００８９】 （ｂ）上記工程（ａ）における２ｍｌＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁した細胞ペレット
を３ｍｌの純粋なｍＡｂ２Ｃ６によってインキュベーションしてＣＤ３４＋細胞
に結合させた。このｍＡｂ−細胞混合物を４５分間４℃でインキュベーションし
て、当該インキュベーション中に細胞を穏やかに１回攪拌して再懸濁させた。こ
のインキュベーション処理の後に容積をＰＢＳ／ＢＳＡによって１０ｍｌにして
から、サンプルを工程（ａ）と同様に洗浄した。その後、洗浄したペレットを２
ｍｌＰＢＳ／ＢＳＡ中で再懸濁して、１５μｌのヤギ抗−マウスＩｇＭ：ビオチ
ンを加えて４℃で３０分間インキュベーションし、このインキュベーション中に
１回穏やかに攪拌して細胞を再懸濁した。この細胞を工程（ａ）で説明したのと
同様にＰＢＳ／ＢＳＡ中で２回洗浄して、最終のペレットを１０ｍｌの５％ＢＳ
Ａ中に再懸濁した。この再懸濁したペレットの５ｍｌを用いて２種類の「CEPRAT
E LC」カラム分取を実施例３に記載したのと同様にそれぞれ行なった。抗体結合
細胞を実施例３に記載したのと同様にカラムから取り出して、この取り出した細
胞をＰＢＳ／ＢＳＡで２回さらにＰＢＳで１回洗浄した。最終の細胞ペレットを
ガラススライド上で６０μｌのラットテイルコラーゲン（１００ｍｇ／ｍｌ）と
３７℃で混合し、このコラーゲンと細胞の混合物を氷の上に短時間置いて固体の
ペレットを形成した。この細胞含有のペレットを実施例１に記載したようにラッ
トの骨髄冠欠損部の中に即座に移植した。
【００９０】 実施例６ラットの精巣上体の脂肪パッドからの微小脈管細胞の単離 雄のフィッシャーＦ３４４ラットから解剖によって２個の精巣上体の脂肪パッ
ドを取り出して滅菌条件下にはさみで細断してから、８ｍｇ／ｍｌのコラーゲナ
ーゼ（Type II Clude、２７３Ｕ／ｍｇ、ワーシングトンラボラトリー（Worthin
gton Laboratories)の存在下に１０ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で穏やかに振盪
しながら３７℃で４５分間インキュベーションした。消化処理後、サンプルを２
５０×ｇで４分間遠心分離処理し、チューブの上部における低密度の脂肪を吸引
によって除去した。その後、前駆体を含むペレットをＰＢＳ／１％ＢＳＡで２回
、ＰＢＳで１回洗浄した。さらに、洗浄したペレットに５０μｌのラットテイル
コラーゲンを３７℃で混合して氷上に置いてゲル化してからラットの骨髄冠欠損
部に移植した。
【００９１】 術後２８日目において被検体動物を殺して試験にかけた。骨形成に関する組織
学的な評価を表１に示す様式に従って行なった。この結果、キャリヤのみ（ＲＢ
ＲＡ＝１．６±０．７、ｎ＝３３）を受容した動物体に比べて前駆体細胞を含む
ラットテイルコラーゲン（ＲＢＲＡ＝２．０±０．４、ｎ＝８０）を受容した動
物体においてさらに新しい骨の形成が観察された。また、幾つかの実施例におい
て、骨が支配的であったが、軟骨の集中化が欠損部において見られた。なお、軟
骨は頭蓋骨の欠損部において通常は見られず、また、この領域における正常な再
生プロセスの部分でもないので、この軟骨の存在は通常の状態ではない。
【００９２】 実施例７微小脈管内皮細胞によるインビトロでの骨形成 （１）基本細胞培養媒体 以下のものを組合せて、ろ過して滅菌処理してから２℃乃至８℃で貯蔵した。 ９０ｍｌのダルベッコ改良イーグル媒体（Dulbecco's Modified Eagle Medium
）（ＤＭＥＭ）（GIBCOのカタログ番号１１８８５−０７６） １０ｍｌの胎児牛血清（熱不活性化処理）(Hycloneのカタログ番号Ａ−１１１
１−Ｌ） １ｍｌのＬ−グルタミン(GIBCOのカタログ番号１５０３９−０１９） （２）培養媒体追加物 （ａ）内皮細胞生長追加物（ＥＣＧＳ）＋ヘパリン（１００Ｘストック）： 内皮細胞生長追加物(Sigmaカタログ番号Ｅ−２７５９）３．０ｍｇ／ｍｌ／ＰＢ
Ｓ ヘパリン(Sigmaカタログ番号Ｈ３１４９）１０，０００ユニット／ｍｌ／ＰＢＳ
３３３μｌのＥＣＧＳおよび４３．８μｌのヘパリンを各チューブに入れる。１
個のチューブに１００ｍｌの培養媒体を加える。 （ｂ）デキサメタゾン（ＤＥＸ）(Sigmaカタログ番号Ｄ−２９１５） ＰＢＳ中において１０-4Ｍ濃縮ストックを調整する。１００ｍｌの媒体に１０μ
ｌを加えて最終濃度を１０-8Ｍにする。 （ｃ）Ｌ−アスコルビン酸（アスコルベート）(Sigmaカタログ番号Ａ−７６３１
） ５０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液を作成する。１００ｍｌの媒体に１００μｌを加え
て最終濃度を５０μｇ／ｍｌにする。 （ｄ）β−グリセロホスフェート(Sigmaカタログ番号Ｇ−９８９１） １０ｍｌのＰＢＳに対して２．１６ｇのβ−グリセロホスフェートの２００Ｘス
トックを作成する。１００ｍｌの媒体に対して５００μｌを加えて最終濃度を５
ｍＭにする。 （３）以下の３種類の追加物の組合せの一つを加えて基本細胞培養媒体から完
全な媒体配合物を構成する。 （ａ）ＥＣＧＳ／ヘパリン （ｂ）ＥＣＧＳ／ヘパリン＋ＤＥＸ＋アスコルベート （ｃ）Ｄｅｘ＋アスコルベート 上記の各媒体配合物には別の時点における実験で誘導したβ−グリセロホスフェ
ートが追加されている。
【００９３】 （方法） 微小脈管内皮細胞を実施例６に記載するようにラットの精巣上体の脂肪パッド
から単離した。コラーゲナーゼ消化および洗浄に続いて、細胞ペレットを滅菌処
理した２０ｍｌの４５％Ｐｅｒｃｏｌｌ（Pharmacia)／ＰＢＳ中で再懸濁した。
このサンプルを２個の滅菌した遠心分離チューブに分け入れて１０℃で２０分間
１３０００ＲＰＭで回転した。細胞の上層部をＰｅｒｃｏｌｌ勾配からピペット
によって除去した。その後、細胞を再懸濁して０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回、
ＤＭＥＭで１回洗浄した。さらに、最終的な細胞ペレットを完全な培養媒体中に
再懸濁して細胞をゼラチンコートした６個乃至１０個のＴ−２５フラスコ中に塗
布した。あるいは、細胞をＴ−２５フラスコまたはペトリ皿中のコラーゲンゲル
上で生長させた。
【００９４】 コラーゲンゲル調整 ３０ｍｌの滅菌ラットテイルコラーゲン(Collaborativeカタログ番号４０２３
６） ３．４ｍｌのＰＢＳ ３４０μｌの１規定ＮａＯＨ 試薬を冷却して氷上で混合する。３ｍｌ乃至４ｍｌの混合物を速やかに各Ｔ−
２５フラスコまたは３５ｍｍペトリ皿に入れて細胞を塗布する前に３７℃で３０
分間固める。
【００９５】 細胞を上記３種類の培養媒体配合物のいずれかにおける両方のマトリックス上
で１週間に３回の媒体交換をしながら生長させた。異なる時点においてβ−グリ
セロホスフェートを幾つかの培養体に加え始めてそれぞれの実験を通して添加し
続けた。
【００９６】 （結果） ＥＣＧＳのみを追加した細胞は最も速く生長した。多くの脂肪細胞が培養の初
期において存在していた。その後、内皮細胞の一次培養における他のものによっ
て見られるものと同様の細管状構造が見られた。幾つかの細胞クラスターが明瞭
となる場合があるが、培養体はvon Kossa による鉱物化またはアリザリンレッド
染色によって染色せず、また、アルシアンブルーまたはトルイジンブルーによる
軟骨の場合も同様である。
【００９７】 ＥＣＧＳ追加物を受容した培養体に対して、デキサメタゾンおよびアスコルベ
ートを含有する「鉱物化（mineralization)」媒体中に置いた培養体は極めて異
なる発現型を示した。これらの培養体は最初はゆっくりと成長したが、支配的な
細胞種は線維芽細胞状であった。１週間目において、多数の丸い明らかに代謝活
性を有する細胞が現れた。さらに、２週間目乃至３週間目までに、細胞のクラス
ターまたはノジュールがこれらの培養体の中に形成された。これらのノジュール
は胎児ラット骨髄冠の一次骨培養体に見られるものと類似していた。３週間目乃
至４週間目において、β−グリセロホスフェートを受容した培養体のノジュール
はvon Kossa およびアリザリンレッドによるカルシウム鉱物質に対して積極的に
染色した。
【００９８】 また、ＥＣＧＳおよびＤＥＸ＋アスコルベートの両方を受容した培養体は最も
広い範囲の発現型を示した。幾つかの鉱物化処理したノジュールもコラーゲンゲ
ルマトリックス上で生長した培養体において明瞭であったが、細胞は速やかに過
剰生長しやすく、ゼラチンコートしたプレートから衰退した。
【００９９】 実施例８付加的なキャリヤによる骨形成 幾つかの付加的なキャリヤは実施例６に記載する方法による脂肪から由来した
前駆体細胞と組み合わせた場合にラットの骨髄冠欠損部において有効に新しい骨
の形成を誘発した。
【０１００】 （ａ）脱塩処理した骨マトリックス（ＤＢＭ） ＤＢＭをOsteotech(ニュージャージー州、シュリュースベリー）によるフィッ
シャー（Ｆ３４４）ラットの長骨から作成した。２５０μｍ乃至４２５μｍ粒径
のＤＢＭ粒子を各実験に使用した。移植前に、各欠損部に対して約５ｍｇ乃至１
０ｍｇのＤＢＭをＰＢＳで湿らせた後に前駆体細胞ペレットと混合してペースト
状のスラリーを形成した。この細胞を伴うＤＢＭによって３．２０±０．６３（
ｎ＝１０）のＲＢＲＡの評価結果を得た。
【０１０１】 （ｂ）微小線維コラーゲン（コラスタット(登録商標）ＯＢＰ） 移植前に、各骨髄冠欠損部に対して約１５ｍｇ乃至２０ｍｇの止血用微小線維
コラーゲン（Collastat(登録商標)ＯＢＰ、Vitaphore Corporation）を少量のＰ
ＢＳ中において最終的な細胞ペレットと混合して穏やかに混練することによりパ
テ状の材料を作成した。この処理によるＲＢＲＡは２．６７±０．４９（ｎ＝１
２）であった。
【０１０２】 （ｃ）ヒアルロナン ソジウムヒアルロネートゲル（オルトヴィクス(Orthovisc(登録商標))、Anika
Reserch社）を洗浄した細胞ペレット上に滅菌処理した注射器によって滴下して
細胞と穏やかに混合した。この場合の各骨髄冠欠損部に対するヒアルロナンの量
は約６０μｌ乃至７０μｌであった。この結果、ＲＢＲＡは２．２５±０．４５
（ｎ＝１２）であった。
【０１０３】 （ｄ）外因性のフィブリンクロット 機械的な方法を用いて全血組織から直接にフィブリンクロットを生成した。各
実験において、５ｍｌの血液を心臓を穴あけ処理したドナーのフィッシャー（Ｆ
３４４）ラットから採取して、滅菌チューブ内に速やかに入れた。この血液を表
面を粗くしたガラス棒で円形状に手動で１分間乃至２分間移動攪拌して形成した
クロット（凝血）をガラス棒の周りに付着させた。その後、このガラス棒をチュ
ーブの側面に接触させて捩ることにより過剰の血液細胞を除去して、最終的なク
ロットを穏やかに外して移植処理まで湿らせたガーゼの間に保存した。結果とし
て得られたクロットは２０ｍｍ乃至２５ｍｍの中空の円筒体であった。その後、
前駆体細胞ペレットを直接にこの円筒体の中にピペットによって入れて、各クロ
ットによって２個の骨髄冠欠損部を充填した。この処理によるＲＢＲＡは１．８
３±０．３９（ｎ＝１２）であった。
【０１０４】 （ｅ）コラーゲンゲル 実施例６において記載したインビトロのコラーゲンゲル法の変形を用いて骨髄
冠欠損部に移植可能なコラーゲンゲルを生成した。 １．９ｍｌのＲＴＣ ０．７５ｍｌの４ＸＤＥＤＭ（フェノールレッド無しでパウダーから作成した
） ０．３５ｍｌの無菌水 ２０μｌの１規定ＮａＯＨ
【０１０５】 細胞ペレットを冷却したコラーゲンゲル試薬の中で穏やかに攪拌した。この最
終混合物の内の７５μｌを９６個の井戸を有するプレートにおける各井戸の中に
入れて３７℃で１５分間インキュベーションした後に、移植前に７５μｌの１Ｘ
ＤＥＤＭを加えてさらに３７℃で１５分間インキュベーションした。この場合の
コラーゲンゲル中の前駆体細胞のＲＢＲＡは１．９２±０．２９（ｎ＝１２）で
あった。また、細胞の Percollフラクションを同一の実験条件下で使用した場合
は、骨形成能力が若干増大した（ＲＢＲＡ＝２．１７±０．３９、ｎ＝１２）。
【０１０６】 （ｆ）ＴＣＰ ＴＣＰを直接に前駆体細胞と混合して移植した場合は、ＲＢＲＡは１．４４±
０．６２（ｎ＝１８）であった。この効果はビトロネクチンまたはフィブロネク
チンを移植フラクションに添加することによって若干向上できた（ＲＢＲＡ＝１
．６７±０．４９）。
【０１０７】 実施例９付着分子による骨形成 脂肪から単離した微小脈管内皮細胞を実施例６に記載したのと同様に単離した
。ラットテイルコラーゲンを作成して３７℃で保存した。コラーゲンと細胞を混
合する直前に、ビトロネクチン（ねずみ）(Gibcoカタログ番号１２１７４−０１
７）をラットテイルコラーゲンに直接に添加して最終的な濃度を１０μｇ／ｍｌ
にした。このＲＴＣ／ビトロネクチン混合物の６０μｌを各細胞ペレットと混合
して氷上で冷却固化した後に、骨髄冠欠損部内に移植して移植材当たりのビトロ
ネクチンの最終的な濃度を６００ｎｇにした。なお、幾つかの投与例のうちでこ
の濃度が最も有効であった。
【０１０８】 前駆体細胞およびコラーゲンキャリヤと組合せたビトロネクチンはビトロネク
チンとコラーゲンのみを含有する対照（ＲＢＲＡ＝１．６７±０．６５、ｎ＝１
２）に比してかなり高い骨の形成量（ＲＢＲＡ＝２．０８±０．２９、ｎ＝１２
）を示した。このビトロネクチンの実験における他の興味ある特徴は、ビトロネ
クチン処理において脳から試験物品を分離するゲルフィルム（Gelfilm）の下に
骨の生長した大きな島状の部分が見られたことである。このことによって、ビト
ロネクチンは欠損部位に付加的な前駆体細胞を補充すると考えられる。
【０１０９】 さらに、フィブロネクチン付着分子を用いて上記のビトロネクチンによる実験
と同様の実験を行なった。この分子の場合もある程度の骨の形成が見られたが、
前駆体細胞グループと対照との間で明確な差が見られなかった。
【０１１０】 本発明による骨および軟骨の前駆体を単離して使用するための方法とこれに伴
う利点が上記の説明によって理解されると考える。また、本発明の範囲およびそ
の趣旨に逸脱することなく、かつ、その実質的な利点を損なうことなく本発明の
形態、構成および配置において種々の変更が可能であり、上記の形態が単に本発
明の好ましいまたは例示的な実施形態であることは明らかである。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月２０日（２０００．１２．２０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２１】 始原細胞から成る脂肪組織由来組成物を調製するためのキ
ットにおいて、 前記脂肪組織から細胞懸濁液を生成するための酵素混合物と、 前記始原細胞と組み合わせて内植可能な組成物を形成するためのキャリヤマト
リックスとから成るキット。
【請求項２２】 さらに、前記脂肪組織の消化のための酵素混合物と共に使
用するバッファーと、前記細胞懸濁液を洗浄および処理するためのバッファーと
から成る請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】 さらに、脂肪吸引装置用の廃棄可能な付着装置と、単離し
た脂肪組織および細胞懸濁液を処理するための廃棄可能な容器とから成る請求項 ２１ に記載のキット。
【請求項２４】 さらに、ＣＤ３４抗原を担持する細胞に結合する試薬組成
物から成る請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】 さらに、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９
およびＣＤ２０から成る群から選択される抗原を担持する細胞に結合する試薬組
成物から成る請求項２１に記載のキット。
【請求項２６】 修復を必要とする部位における患者の骨または軟骨の成長
を促進するための方法において、当該方法が、 プロテーゼ装置を外科的に内植する工程から成り、当該装置がＣＤ３４抗原を
担持する細胞を豊富に含む前駆体細胞から成り、当該細胞がインビトロで予め培 養されない 方法。
【請求項２７】 前記豊富に含む細胞の集団は、ＣＤ３４抗原を担持する細
胞に結合する試薬に前記細胞の懸濁液を接触させて試薬に結合する細胞と試薬に
結合しない細胞の混合物を形成して、当該試薬に結合する細胞を結合しない細胞
から分離することによって生成される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】 前記分離工程がアフィニティクロマトグラフィ、磁気ビー
ズおよびパニング技法の使用から成る請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】 修復を必要とする部位において患者の骨または軟骨の生長
を促進するための方法において、当該方法が、 外科的に前記部位にプロテーゼ装置を内植する工程から成り、当該装置は脂肪
組織から分解されて少なくとも１．０ｇ／ｃｍ3 の密度を有する細胞を豊富に含
む細胞から成る方法。
【請求項３０】 前記豊富に含む細胞の集団は、分解した脂肪組織を遠心分
離処理または重力沈降処理して少なくとも１．０ｇ／ｃｍ3 の密度を有する細胞
を単離することによって生成される請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】 前記装置がさらに生体許容可能なキャリヤおよびビトロネ
クチンから成る請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】 修復を必要とする所定の部位に軟骨または骨の生成を誘発
するための方法において、当該方法が前記部位を骨形成または軟骨形成能力を有
する細胞を豊富に含む細胞集団から成る組成物に接触させる工程から成り、前記
細胞が末梢血液、骨髄または脂肪組織から単離されるものであって、当該単離処
理がＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９およびＣＤ２０から成る群
から選択される細胞表面抗原に特異的な試薬に細胞が結合しないことに基づいて
行なわれ、当該方法が前記部位を前記細胞集団に接触させる前にインビトロで培 養する工程を含まない 方法。
【請求項３３】 前記組成物がさらに生体許容可能なキャリヤから成る請求
項３２に記載の方法。
【請求項３４】 前記組成物がさらにビトロネクチンおよびコラーゲンから
成る請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】 前記修復を必要とする部位は当該部位に前記組成物を外科
手術的に内植することによって接触する請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】 前記修復を必要とする部位は当該部位に前記組成物を注入
することによって接触する請求項３２に記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/02 Ａ６１Ｋ 47/42 47/12 Ａ６１Ｐ 19/08 47/34 43/00 １０５ 47/42 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｐ Ａ６１Ｐ 19/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 43/00 １０５ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｇ０１Ｎ 33/48 37/12 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ピーターソン・デイル・アール アメリカ合衆国、46032 インディアナ州、 カーメル、リーズ・サークル 488 (72)発明者 ヌーセク−ゲーブル・ナンシー アメリカ合衆国、46038 インディアナ州、 フィッシャーズ、レディ・レーン 215 Ｆターム(参考） 2G045 CA25 CB13 DA80 FB03 FB06 4B065 AA91X BB19 BD15 CA44 4C076 BB32 CC09 DD24 DD26 EE24 EE30 EE41 EE43 4C084 AA02 BA44 CA26 CA34 CA36 DA40 DC11 DC50 MA02 MA67 NA05 NA14 ZA962 4C087 AA01 AA02 AA04 BB34 BB44 CA04 DA03 MA02 MA05 MA67 NA05 NA14 ZA96

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 骨または軟骨形成に用いるための脂肪組織から前駆体細胞を
    単離するための方法において、 （ａ）温血の脊椎動物種から脂肪組織を採取する工程と、 （ｂ）前記脂肪組織を酵素によって分解して細胞懸濁液を形成する工程と、 （ｃ）前記細胞懸濁液をＣＤ３４抗原を担持する細胞に結合する試薬に接触さ
    せて細胞に試薬に結合した細胞と結合しない細胞の混合物を形成する工程と、 （ｄ）前記試薬に結合した細胞を試薬に結合しない細胞から分離する工程とか
    ら成る方法。
  2. 【請求項２】 前記分離工程がアフィニティクロマトグラフィ、磁気ビーズ
    またはパニング技法の使用から成る請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記ＣＤ３４細胞結合性試薬がレクチンまたは抗体である請
    求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記ＣＤ３４細胞結合性試薬がＬ−セレクチンである請求項
    １に記載の方法。
  5. 【請求項５】 修復を必要とする所定の部位における軟骨または骨の生成を
    誘発するための方法において、当該方法が前記部位を脂肪組織から分解された細
    胞集団から成る組成物に接触させる工程から成り、前記細胞集団が少なくとも１
    ．０ｇ／ｃｍ3の密度を有する細胞を豊富に含む方法。
  6. 【請求項６】 前記豊富に含む細胞集団が修復を必要とする部位に接触する
    前にインビトロで培養される請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記修復を必要とする部位に前記細胞を注入することによっ
    て当該修復を必要とする部位を前記細胞集団に接触させる請求項５に記載の方法
    。
  8. 【請求項８】 前記組成物がさらに生体許容可能なキャリヤから成る請求項
    ５に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記組成物がさらに脱塩骨マトリックス、ヒアルロン酸塩、
    コラスタット(Collastat（登録商標))、ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、石膏
    、フィブリン、コラーゲンおよびリン酸カルシウムセラミックスから成る群から
    選択されるキャリヤから成る請求項５に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記組成物がさらに生物活性を有する化合物から成る請求
    項８に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 修復を必要とする所定の部位における軟骨または骨の生成
    を誘発するための方法において、当該方法が細胞表面抗原ＣＤ３４を有する細胞
    を豊富に含む細胞集団から成る組成物に前記部位を接触させる工程から成り、前
    記細胞が末梢血液、骨髄または脂肪組織から単離される方法。
  12. 【請求項１２】 前記豊富に含む細胞集団が修復を必要とする部位に接触す
    る前にインビトロで培養される請求項１１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記細胞集団を前記修復を必要とする部位に注入すること
    によって当該部位を細胞集団に接触させる請求項１１に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記組成物がさらに生体許容可能なキャリヤから成る請求
    項１１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記組成物がさらに脱塩骨マトリックス、ヒアルロン酸塩
    、コラスタット（登録商標)、ポリエステル、ポリ（アミノ酸）、石膏、フィブ
    リン、コラーゲンおよびリン酸カルシウムセラミックスから成る群から選択され
    るキャリヤから成る請求項１１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記修復を必要とする部位は当該部位における前記組成物
    の外科手術的な内植によって接触する請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記修復を必要とする部位は当該部位における前記組成物
    の注入によって接触する請求項１４に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記組成物がさらに付加的な生物活性を有する化合物から
    成る請求項１４に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 修復を必要とする所定の部位に軟骨または骨の生成を誘発
    するための方法において、当該方法が前記部位を骨形成または軟骨形成能力を有
    する細胞を豊富に含む細胞集団から成る組成物に接触させる工程から成り、前記
    細胞が末梢血液、骨髄または脂肪組織から単離されて、インビトロで予め培養す
    ることなく前記部位に接触配置される方法。
  20. 【請求項２０】 前記組成物がさらにビトロネクチンおよびコラーゲンから
    成る請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記修復を必要とする部位が当該部位に前記組成物を外科
    的に内植することによって接触する請求項１９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記修復を必要とする部位が当該部位に前記組成物を注入
    することによって接触する請求項１９に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記組成物がさらに付加的な生物活性を有する化合物から
    成る請求項１９に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 始原細胞から成る脂肪組織由来組成物を調製するためのキ
    ットにおいて、 前記脂肪組織から細胞懸濁液を生成するための酵素混合物と、 前記始原細胞と組み合わせて内植可能な組成物を形成するためのキャリヤマト
    リックスとから成るキット。
  25. 【請求項２５】 さらに、前記脂肪組織の消化のための酵素混合物と共に使
    用するバッファーと、前記細胞懸濁液を洗浄および処理するためのバッファーと
    から成る請求項２４に記載のキット。
  26. 【請求項２６】 さらに、脂肪吸引装置用の廃棄可能な付着装置と、単離し
    た脂肪組織および細胞懸濁液を処理するための廃棄可能な容器とから成る請求項
    ２４に記載のキット。
  27. 【請求項２７】 さらに、ＣＤ３４抗原を担持する細胞に結合する試薬組成
    物から成る請求項２４に記載のキット。
  28. 【請求項２８】 さらに、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９
    およびＣＤ２０から成る群から選択される抗原を担持する細胞に結合する試薬組
    成物から成る請求項２４に記載のキット。
  29. 【請求項２９】 修復を必要とする部位における患者の骨または軟骨の成長
    を促進するための方法において、当該方法が、 プロテーゼ装置を外科的に内植する工程から成り、当該装置がＣＤ３４抗原を
    担持する細胞を豊富に含む前駆体細胞から成る方法。
  30. 【請求項３０】 前記豊富に含む細胞集団は、ＣＤ３４抗原を担持する細胞
    に結合する試薬に前記細胞の懸濁液を接触させて試薬に結合する細胞と試薬に結
    合しない細胞の混合物を形成して、当該試薬に結合する細胞を結合しない細胞か
    ら分離することによって生成される請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記分離工程がアフィニティクロマトグラフィ、磁気ビー
    ズおよびパニング技法の使用から成る請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 修復を必要とする部位において患者の骨または軟骨の生長
    を促進するための方法において、 外科的に前記部位にプロテーゼ装置を内植する工程から成り、当該装置は脂肪
    組織から分解されて少なくとも１．０ｇ／ｃｍ3 の密度を有する細胞を豊富に含
    む方法。
  33. 【請求項３３】 前記豊富に含む細胞の集団は、分解した脂肪組織を遠心分
    離処理または重力沈降処理して少なくとも１．０ｇ／ｃｍ3 の密度を有する細胞
    を単離することによって生成される請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記装置がさらに生体許容可能なキャリヤおよびビトロネ
    クチンから成る請求項３２に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 修復を必要とする所定の部位に軟骨または骨の生成を誘発
    するための方法において、当該方法が前記部位を骨形成または軟骨形成能力を有
    する細胞を豊富に含む細胞集団から成る組成物に接触させる工程から成り、前記
    細胞が末梢血液、骨髄または脂肪組織から単離されるものであって、当該単離処
    理がＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９およびＣＤ２０から成る群
    から選択される細胞表面抗原に特異的な試薬に細胞が結合しないことに基づいて
    行なわれる方法。
  36. 【請求項３６】 前記組成物がさらに生体許容可能なキャリヤから成る請求
    項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記組成物がさらにビトロネクチンおよびコラーゲンから
    成る請求項３５に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記修復を必要とする部位は当該部位に前記組成物を外科
    手術的に内植することによって接触する請求項３５に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記修復を必要とする部位は当該部位に前記組成物を注入
    することによって接触する請求項３５に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 骨始原細胞から成る内植組成物によるインビボの骨の形成
    を促進するための方法において、骨の形成を促進するのに有効な量でビトロネク
    チンも含むように前記内植組成物を配合する工程から成る方法。
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