JP2003516308A - 分子ライブラリーをコンビナトリアル合成するための物質、とりわけモノマーを担体に付着させる方法と装置 - Google Patents
分子ライブラリーをコンビナトリアル合成するための物質、とりわけモノマーを担体に付着させる方法と装置Info
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Abstract
Description
折挙動を検知する時に使用されるような分子ライブラリーをコンビナトリアル合
成するための物質、とりわけモノマーを担体に付着させる方法と装置に関する。
だけ密集させて配列、結合させた多数の異なる分子の総体を意味する。本発明に
関係する分子ライブラリーは、限定された数のコンビナトリアル合成によって作
られる。図1はコンビナトリアル合成の原理を模式的に説明したものである。
る分子構成員から成る分子ライブラリーを意味する。
とができる。その場合、位置が正確に規定された担体上の場所を、分子ライブラ
リーの異なる各構成員に指定することができる。このことは、正確に規定された
反応、たとえば呈色反応によって、担体に結合させた反応相手を逆に、正確かつ
一義的に推定することができることを意味する。この明細書では、前記分子ライ
ブラリー構成員の、位置が正確に規定された場所を「スポット」と呼び、二次元
の担体の分子ライブラリー全体を「アレー」と呼ぶことにする。
て浸透性はない。しかしこの二次元アレーは、平滑表面に対比される多孔性構造
を持つこともできる。その場合、第三の次元が、使用される溶媒およびカップリ
ングさせる物質に開放される。特に、この種の担体は、表面が平滑な担体と比べ
て、シグナル強度を強める必要がある時に不可欠である。たとえば、ペプチドア
レーを患者の血清で発色させる必要があり、抗体の反応性が比較的弱い結合シグ
ナルを検知しなければならない時は不可欠である。
なる分子が基本的には二次元のみに配列されている担体ばかりでなく、異なる分
子が第三次元にも追加的に存在する多孔性の担体をも意味する。従って、(基本
的には二次元の)担体はもはや本来的な意味を持たない。
質、たとえば質量スペクトル図などを包含するばかりでなく、たとえば、主とし
て−すなわち単なる存在によって−ある決まった反応を示す能力をも包含するた
め、本発明は、ある決まった光学反応から、まず、物質の存在を−そればかりで
なく種類をも−判定する(そのあとで、たとえば担体上のその位置からその物質
の種類が決定される)方法および装置に関する。
に関係する分子、すなわち、ペプチド、D−ペプチド、L−ペプチドおよびそれ
らから成る混合物、天然に存在するオリゴヌクレオチド、それらの鏡像体、およ
びそれらから成る混合物、たとえばアプタマーの構築に使用される合成的に誘導
されたオリゴヌクレオチド、オリゴ糖類および前記分子の修飾体を意味する。特
に、自然界には存在しない、モジュラー的に構築されるオリゴマーは、薬学的に
特別な重要性を有する。これと関連して、生物分子、特に有機化合物およびステ
ロイド誘導体などのリガンドとして使用される、化学コンビナトリアル手法によ
って合成される、非天然系物質も挙げておきたい。多数のこのような分子から、
天然に存在する分子に特異的に結合してその分子の活性を変える分子を単離する
ことができる。しかし、この結合分子は、天然の消化酵素によって分解されない
ため、治療薬として使用するのに特に適している。
知られている。しかしそれらには欠点も存在する。たとえば、公知の方法を実施
するには、高価で費用のかかる装置を必要とし、蛍光シグナルの読み出しも比較
的遅い。特に、一つの担体にきわめて多数の異なる分子群を配置し、それらを個
別に調べようとすると−あとで詳しく述べるが、このことはさまざまな理由で利
点でもある−、個々の分子群にたどり着くには、多額の費用がかかり、高価な上
に妨害を受けやすいばかりでなく、最高度の精密作業においても、検査に必要な
分子群の最小の大きさより数桁精度の高い製造許容誤差を持つ機械技術を駆使し
なければならない。それゆえ、従来の方法と装置では、担体に収容しうる分子ま
たは分子群の最大数には限界があり、分子群の規模は105程度である。特にあ
る種の血清やDNA分析には、担体におよそ108ないし109程度の分子を付
着させ、検査することができることが望まれる。
点レーザー顕微鏡の原理を示す。アレーの各点を読み出すこの機構では、時間か
精度のいずれかを犠牲にしてでも、三次元をくまなく探さなければならないこと
が分かるだろう。
フ法がよく知られている(図3)。しかしこの方法では、その後の検査の場合と
同様に、分子と、目標通りに再現性よく到達できる担体上の位置とを正確に帰属
することが難しく、そのことが、付着させることができる分子数を制限する。そ
のため、どの分子が担体上のどの位置に存在するかをくり返し正確に知ることな
しに、担体に極めて多数の異なる分子を密に充填して配列させることはできない
。特に、公知の方法および装置では、担体上での極めて多数の蛍光反応を、適切
な時間に、しかも極めて正確に読み出すことは難しい問題である。異なる各種分
子をあらかじめ結合させた担体に検査すべき物質を付着させる、本発明に関係す
る方法と装置で有利に行うことができる発色検査の場合、たとえば血清中のある
決まった抗体のような、検査すべき試料中に存在する物質を同定するためには、
試料またはその成分が、担体に結合させた分子のどれと結合したかによって、そ
の糸口を引き出さなければならず、それにはどの分子が担体上のどこに存在する
かを正確に知らなければならない。
持つモノマーを反発させるか、または吸引して正確な位置に合成するいくつかの
別の方法)は、別の原理的な欠点を持っている。すなわち、異なるモノマーに対
して、カップリングサイクル全体をそれぞれ個別に実施しなければならない。つ
まり、ある一つのモノマーを付着させ、カップリングを行い、過剰のモノマーを
洗い流すサイクルを終えてから、次の種類のモノマーに対して同様なサイクルを
くり返さなければならない。たとえば、コンビナトリアル法によってペプチドを
合成するためには、順次に20回のサイクルを行わなければならない。この欠点
は図4に模式的に書かれている。この方法によれば、複雑なペンタペプチドライ
ブラリーを合成するために、100回のカップリングサイクルを必要とする。既
存の技術では、各カップリングサイクルで予想されるアーチファクトのために、
得られる分子ライブラリーの質に重大な問題が生じ、その結果、このようにして
作られるペンタペプチドライブラリーは、実際には使用することができないこと
を、当業者であれば直ちに了解することができよう。
プリングしさえすればよいオリゴヌクレオチドアレーの合成にしか使用されなか
ったかという理由でもある。
全体を反応性モノマーで一様に覆わなければならないため、他の方法に比較して
化学的な収率が低いという点である。
法が知られている(図5IIaおよびIIb)。しかしこれまでのところ、これ
らの方法のいずれもリソグラフ法の高い分解能を実現していない。その理由は、
主として、比較的小さいモノマーの拡散速度が大きいことにある。担体上でモノ
マーをカップリングするためにも、また、モノマーを担体上の正確な位置に付着
させるためにも、ある一定の時間を必要とするため、コンビナトリアル合成によ
って作られる分子ライブラリーの密集性は拡散速度が高いことによって制約を受
け、同時に、その複雑性も制約される。
はずである(図6)。カラーインクジェットプリンターのカラー印刷の鮮明さは
、色素粒子の拡散を極力低く抑えることによって実現される。これは、色素粒子
が前記のモノマーと比べて非常に大きいことと、そして印刷されるトナー液が速
乾性の物質を含んでいて色素粒子が極めて速やかに析出することによって引き起
こされる。さらに付け加えれば、吸収力の強い特殊な高光沢性の紙が使用される
。
ては適さないばかりでなく、できるだけ密に充填した分子ライブラリーを担体に
カップリングさせるという要件に、次に挙げる別の2点で適合しない。 1.コンビナトリアル合成のためのモノマーは、通常使用されるカラーインク
ジェットプリンターの発色体よりはるかに小さく、単純にこのことが拡散速度を
非常に大きくしている。 2.印刷されるモノマーは、容易に揮発しやすい溶媒に溶解されていてはなら
ない。ナノリットル領域の目標量であまり速く蒸発しないような溶媒を見つけだ
すことはほとんど実現の見込みがなく、もしそうなると、カップリングの相手の
濃度は大きく変化して好ましくないばかりでなく、担体とのカップリング反応(
および担体上の正確な位置にモノマーを付着させること)にはある一定の時間を
必要とする。
差を伴いやすくなり、そのうえ高価になる理由はここにある。これらの寸法では
、付着されるスポットが移動して、噴霧によって取り除かれるか、モノマーが広
く拡散しすぎるか、または溶媒がその一部または全部が揮散するおそれが常にあ
る。
する時の前記欠点を解決することができる方法および装置を提供することである
。
使用されるモノマーを、−5℃より低い温度、そして好ましくは+20℃より低
い温度で固体凝集状態にあり、沸点が>100℃、そして好ましくは>150℃
である第一の溶媒に溶解することを特徴とする高度に複雑な分子ライブラリーを
平行合成するための方法が提案される。この方法のさらに別の特徴は、モノマー
と担体の本来のカップリング反応の間に、前記の固体凝集状態が、エネルギーを
供給することによって、または第二の溶媒を導入することによって、できれば短
時間で再び液体状態、できればゲル状の凝集状態に変化することである。
の揮散は部分的に、または完全に阻止される。
較的長い時間がかかる場合に、非常に重要であり、たとえば、異なるアミノ酸の
コンビナトリアル合成において、インクジェットプリンターを使って高度に複雑
なペプチドライブラリーを作らなければならない場合などがこれに該当する。
よって、前記粒子または物質を担体上の正確な位置にくり返し付着させ、それぞ
れの場合に応じて、さらに、前記の固定化された物質を可動化させ、そしてそれ
を担体にカップリングさせ、カップリングしなかった物質を洗い流し、一時的に
使用した保護基を除去する。ここで、改造したカラーレーザープリンターまたは
カラーレーザー複写機を使用する場合、担体は、くり返し操作全体が実行されて
いる間、プリンターまたは複写機の担体ロールまたはプリンターロールに固定さ
れたままである。
るアレー、特にミクロレーザーのアレーを使用することもできる。粒子または担
体に電磁波を照射することにより、その正確な位置が帯電し、または加熱され、
その結果、前記粒子は正確な位置に移動させ、または固定される。
ーの前駆体を含むなら、カップリング反応のサイクルを一回または複数回行うこ
とによって、担体に結合した分子にさらにモノマー、ダイマー、トリマーを延長
させることができる。また、必ずしも同じである必要のない反応のサイクルを一
回または複数回行うことにより、担体に結合する分子を修飾することも可能であ
る。合成が終了すれば、合成したオリゴマーの保護基を除去することができる。
この時、合成した分子は担体に結合したままである。
ル状態に変換される。
射するか、電圧をかけるか、熱エネルギーを供給するか、溶媒を添加することに
よって有利に行うことができる。ここで、固定した物質の運動可能な範囲を選択
して限定することもできる。可動化されなかった物質またはカップリングしなか
った物質は、溶媒、好ましくは加温した溶媒で担体から洗い流すか、機械的に、
特に空気の流れによって担体から除去することができる。
ート、紙、CD、MOD、DVDまたはFMDを使うことができる。
学的な検査に利用することができる。普通、担体は検査しようとする液体と接触
させる。この液体としては、たとえば、血液、血清、尿、糞、リンパ液、唾液、
羊水、胃液、おう吐物、汗、精液、母乳、抗体を含む液体または前記各液体から
の抽出物を対象とすることができる。検査すべき液体が血清の場合、免疫グロブ
リンに特異的に反応する検出試薬、特にIgE、IgM、IgG、IaAタイプ
の免疫グロブリンと接触させることが好ましい。検査すべきDNAと担体を接触
させることも可能である。DNAまたは免疫グロブリンを含む液体が検査対象で
ある場合は、検査すべき液体または検査すべきDNAを、担体と接触させる前ま
たは後に、免疫グロブリンまたはDNAと反応する物質、特に免疫グロブリンま
たはDNAと結合する物質、と接触させることが有利である。免疫グロブリンま
たはDNAと反応するこの物質は、検査対象の液体または検査対象のDNAと接
触させる前に、励起によって蛍光を発する物質で発色させることができ、そして
/または、蛍光を引き起こすことができる別の物質、とりわけ酵素または蛍光性
物質の前駆体とカップリングさせることができる。前記の別の物質としては、酵
素、特にワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸ヒドロギナーゼもしくはルシフェラーゼ、
または酵素の結合が有利である。
射によって蛍光を発する色素が好適である。
査結果に存在する正規分布からのずれを突き止めることにより、病理パターンの
系統的な分類と分割、そして特に診断マーカーを決定するのに有利に使用するこ
とができる。
ずれかの方法によって調べることができる。正規分布からのずれは、たとえば、
がん、特に個々のがんの種類、パーキンソン病、多発性硬化症、アルツハイマー
病、感染症、自己免疫疾患、特にクローン病に罹っている検査対象者、または心
筋梗塞または卒中発作に襲われた検査対象者、またはアレルギー患者であったか
アレルギー患者になった検査対象者について突き止めることができる。
分子の構造パラメーターとを関係づける診断パターンを決定するために自動的に
分類され、相関性、特に未知試料のパターンの診断的判定を可能にする相関性が
見出される。また、検出された分子の構造的特徴を明らかする相関性を探しだす
こともできる。検出された分子のここで規定される構造的特徴は、機能的に同族
の別の分子、特に治療に応用可能な分子を開発するためのリード構造として役立
つ可能性がある。その際、相互に重なるペプチドによって既知のヒト遺伝子産物
をカバーするペプチドアレーを有利に使用することができる。
し200μm、好ましくは2μmないし40μmの大きさのモノマー−トナー粒
子に封じこめたものがコンビナトリアル合成に使用される。ここで室温という意
味は、−10℃ないし80℃、好ましくは0℃ないし40℃を意味する。この粒
子の別の特徴は、前記第一溶媒と共にカップリング反応に対して不活性な成分を
含み、前記のように凝集状態を変化させることができることである。さらに、前
記粒子は、磁性成分を含むか、磁性粒子を含む粒子と結合させることが好ましい
。図7は、このようなモノマー−トナー粒子と普通の発色体−トナー粒子とを模
式的に比較したものである。
機、特にカラーレーザープリンター(図9)を使って粒子を担体上の正確な位置
に移す。特にレーザープリンターを使用する時は、粒子の転写を担うレーザーを
ミクロレーザーの一次元または二次元アレーに置き換えることができる。
態から液体状態、好ましくはゲル状態に変換して、位置を正確に規定したカップ
リング反応を行う。
術と比較して、格段に密度の高い配置をとらせることができ、その結果、複雑で
比較的アーチファクトの少ない分子ライブラリーを作ることができる。
るであろう。 使用される市販のレーザープリンターは、600dpi(1インチ当たりのド
ット数)の分解能を有する。これは、印刷されたピクセルの直径が約40μmに
相当し、このようなレーザープリンターで印刷される点の数は、標準的な印刷条
件でDIN A4用紙(約20×30cm)片面当たり4500×7000とな
る。すなわちDIN 4A片面当たり約3000万個の点に相当する(図10)
。
時に、ほとんどエラーがなく再現できることを示している。実際に図11は、最
大限に拡大しても、ただの一つの間違いのないピクセルを示している。
識別が可能である。しかし技術開発は急速に進んでおり、これが終点でないこと
は明らかである。現在では2,400dpiの分解能を持つレーザープリンター
の購入が可能であり、DIN A4用紙片面に約5億個の画像点を展開すること
ができる。これを使用すれば、DIN A4用紙の片面にさらに多数のスポット
を互いに分離した状態で構成することができる。
プチドまたはペンタペプチドライブラリーのコンビナトリアル合成を可能にする
数値水準に迫っている。該当する数字が図12に示してある。
従来の技術に従って、たとえば基本的に市販のインクジェットプリンターまたは
別の印刷法を使って、液状の凝集状態で担体上の正確な位置に付着される。
媒(たとえばジメチルホルムアミド)以外に、前記成分を室温で固体凝集状態か
ら液状凝集状態に変換する(すなわち溶解する)少なくとも第二の溶媒(たとえ
ばN−メチルピリリドン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、メタノール
またはイソプロパノール)を混合した溶媒混合物が作られる。ここで、室温とい
う表現は、−10℃ないし80℃、そして好ましくは0℃ないし40℃の温度範
囲を意味する。
べて室温ではるかに揮発性が高いということ、すなわちこれら二つの溶媒の沸点
は>80℃の差があるということである。
解するコンビナトリアル合成のためのモノマーがまず濃縮され、それから、モノ
マーが最初の付着位置から拡散によって大きく移動するおそれもなく、液体凝集
状態から再び固体凝集状態またはゲル状態に変化する。ここで、前記担体は、前
記溶媒混合物が収容された容器より>10℃は低いことが好ましい。揮発しにく
い溶媒成分は、前記混合物より前に、その全量または一部を担体に付着させるこ
とができる。使用される溶媒はカップリング反応に対して不活性でなければなら
ない。
ら液状の凝集状態、好ましくはゲル状の凝集状態に変換され、その結果、位置を
正確に規定されたカップリング反応が引き起こされる。
の技術と比べて、格段に密集性が高く、そのため高度に複雑で比較的アーチファ
クトの少ない分子ライブラリーを作ることができる。
クレオチドライブラリーをコンビナトリアル合成するためのモノマーを正確な位
置に付着させることができる装置が包含される。その場合、付着されるモノマー
各層のカップリングは、上で述べたように行われる。
機(図13および図14)、特にカラーレーザープリンターまたはカラーレーザ
ー複写機を基本とする装置によって、担体上の正確な位置に移される。ここで、
粒子の転写に対して責任を持つレーザーは、特にレーザー複写機の場合、ミクロ
レーザーの一次元または二次元アレーに代えることができる。
の通りである。 1.通常のトナーの代わりに後で述べる、前記のモノマーを含むトナーが使用
される。 2.モノマー粒子は一つの層ではなく、モノマーを含む粒子が複数の層に次々
重ねて印刷される。 3.場合に応じて、前記複数の層を付着させる間に、前記モノマーは担体にカ
ップリングされ、カップリングされなかったモノマーは担体から除去され、一時
的な保護基は担体に結合したモノマーから切断される。 4.前記モノマーの最後の層を付着させるまで担体は、粒子の転写に対して責
任を持つレーザーに対する正確な空間的位置関係を維持される。この空間的な位
置関係は、十分にくり返し作ることができる。そのため、前記の層と、層内部の
前記の異なるモノマー粒子は、正確な位置に、横に並べてまたは上下に重ねて配
置することができる。前記の空間的な関係は、自己制御機構(図14)を通して
作り出すこともできるし、担体ロールまたは担体ユニットと、レーザーによって
イオン化することができるロールとの正確な機械的連携(図13)によって作り
出すこともできる。もちろん両者を組み合わせることも可能である。
けることができる(図14,38)。この網目はスキャナーの行列(図14,3
7)によって読みとられ、保存された網目と照合される(図14,39)。測定
されたずれの大きさ(図14,40)に正確に対応してプリンターメモリーの画
像点の電子的な変位が、自己制御機構の一部となる。
ープリンターまたはレーザー複写機を基本とする装置によって担体上の正確な位
置に付着させることができるモノマー−トナー粒子はその一つである。これらの
モノマー−トナーは、以下の通り、市販のトナーとは異なっている。 1.モノマー−トナー粒子は、発色体の代わりに、コンビナトリアル合成に適
するモノマーまたはその誘導体、そして特にあらかじめ活性化されたモノマーを
含む。 2.溶融可能なプラスチック成分(たとえばポリスチレン)に代わって、また
はそれに加えて、モノマー−トナー粒子は、室温で固体凝集状態をとる、モノマ
ーの担体へのカップリングに対して不活性な溶媒(ジフェニルホルムアミド)を
含む。ここで室温という表現は、−10℃ないし80℃、そして好ましくは0℃
ないし40℃の温度範囲を意味する。 前記モノマー−トナー粒子のさらに別の特徴を挙げれば次の通りである。 3.粒子の大きさは、直径が0.2μm〜200μm、好ましくは2μm〜4
0μmである。 4.前記モノマー−トナー粒子は室温で固体凝集状態をとる。ここで室温とい
う表現は、−10℃ないし80℃、そして好ましくは0℃ないし40℃の温度範
囲を意味する。 5.前記モノマー−トナー粒子のさらに別の特徴は、それが磁性成分を含むか
、磁性成分を含む粒子に結合していることである。
トプリンターまたはカラーインクジェットプリンターによって担体上の正確な位
置に付着させることができる液状のモノマー−トナーを包含される。
る。 1.液状モノマー−トナー粒子は、発色体の代わりに、コンビナトリアル合成
に適するモノマーまたはその誘導体、そして特にあらかじめ活性化されたモノマ
ーを含む。 2.液状モノマー−トナー粒子は、室温で液体の第一の溶媒成分(たとえば、
イソプロパノール、ジメチルホルムアミド、N−メチルピリリドン、ジクロロメ
タン)以外に、少なくとも、室温で固体凝集状態をとる、モノマーの担体へのカ
ップリングに対して不活性な第二の溶媒(たとえば、ジフェニルホルムアミド)
を含む。ここで室温という表現は、−10℃ないし80℃、そして好ましくは0
℃ないし40℃の温度範囲を意味する。ここで、前記第二の溶媒は、室温で第一
の溶媒に溶解される。
り40℃、好ましくは70℃を上回って低いことである。
温度で固体状態で存在し、>40℃、好ましくは>70℃の沸点を有することで
ある。
度で固体状態で存在し、>200℃、好ましくは>250℃の沸点を有すること
である。
徴は、その混合物が−20℃、好ましくは0℃より低い温度で固体またはゲル状
の凝集状態で存在することである。
って作られる分子ライブラリー、特にペプチドライブラリーまたはオリゴヌクレ
オチドライブラリーを包含する。この分子ライブラリーの特徴は、 1.それが、限定された数のモノマーのコンビナトリアル合成モノマーによっ
て作られること、 2.それが、用途に合わせて調製した担体上に二次元のアレーとして存在し、
分子ライブラリーの各成分の位置が正確に帰属できることである。ここで、担体
の調製は、当業者に良く知られた技術によって行われる。
て、目の細かい網目状位置マークを入れた、本発明に従う担体を使用することが
でき、これによって、たとえば検出装置を備えた通常の機構によって、担体上の
調べるべき場所の位置を制御することが可能になる。その場合、光エレクトロニ
クス的な検出システムによって検知できるような位置マークを工夫することが好
ましい。
を発見するチャンスを高めてくれる。たとえば、完全な6量体ペプチドライブラ
リーとより多くの数の患者血清を結びつけ、たとえば、呈色反応によって血清の
成分がどのペプチドに付加したかを調べれば、病気と発色したペプチドの相関性
が明らかになる。これは、すべての人間が、その血清中に抗体反応性に関する極
めて複雑な固有のパターンを持つことにあり、そのパターンは、急性、慢性ある
いは隠れていた、または既に克服した病気との免疫系の対決を反映している。抗
体反応性の大きな部分は、ペンタペプチドまたはヘキサペプチドとの特異的な結
合によって明確にすることができる。このことを通して、完全なペンタペプチド
またはヘキサペプチドライブラリーに対する結合反応性を分析することで、これ
まで分からなかった各人の抗体反応性パターンを決めるることができる。
、このような完全なペプチドライブラリーのアレーの、位置が正確に規定された
スポットは、ペプチド混合物を表し、そのペプチド混合物は、スポット当たり、
Nで示した位置のみに、場合に応じて、規定されたいずれかの配列を持っている
。このペプチド混合物で作業をすすめる根拠は、認められたペプチド抗原は、抗
体−ペプチド抗原反応において、ある決まった大きさを持っていなければならな
いという点にあり、それによってペプチド抗原は、抗体によって特異的に認識さ
れる。しかし、現在の技術水準では、2010種類のメンバーからなる完全なデ
カペプチドライブラリーを作ることができないため、前記の混合物が使用される
。
1)も参照)。ここで、対照の血清と患者の血清による、高度に複雑なペプチド
アレーの発色の違いは、両血清によって認識される反応相手(従って、ペプチド
配列)を明らかにする一方で(図16,42)、患者の血清によって特異的に認
識されるペプチドも認識される(図16,43)。このことは患者に特異的な発
色パターンの同定を可能にする。記載する実施例(図16および実施例(1))
では、ピロリ菌によって発現され、胃潰瘍を引き起こす遺伝子産物、に合致する
ペプチドが同定される(図16,43)。このことは、このようなアレーによっ
て病気とペプチドパターンとの相関性を明らかにすることができることを意味す
る。
ばかりでなく、血清プロフィールと診断された疾病、たとえば自己免疫疾患やア
レルギー(たとえばリウマチ原質、枯草熱、ぜん息、食品アレルギー、紅斑性狼
瘡、若年性糖尿病など)、感染症(たとえばインフルエンザ、流行性感冒感染症
、エイズ、肝炎、麻疹、流行性耳下腺炎、脳膜炎、胃潰瘍、マラリア、シャーガ
ス病など)、がん(たとえば肺がん、肝がん、腸がん、腎臓がん、肺がん、前立
腺がん、グリア芽細胞腫、リンパ腫など)および従来原因が不明または疑問であ
った病気(たとえば心筋梗塞、卒中発作、パーキンソン病、多発性硬化症、アル
ツハイマー病、クローン病、クロイツフェルト・ヤコブ病など)の診断マーカー
との関係を明らかにすることによって診断マーカーを見つけだすのに適している
。
に多くの病気を診断し、または逆に、発見されたペプチドによって、これまで分
からなかった病気の原因を追求することもできる。
は完全な前記ライブラリーを発色させる相互作用の相手を見つけだすのにも適し
ている。精製したウイルス粒子で発色する場合、たとえば一つまたは複数個の結
合要因をきわめて迅速に同定することができ、該当するペプチド配列をデーター
ベースに保存されたヒトペプチド配列と比較することによって、ヒトの細胞中へ
のウイルスの侵入口を同定することができる。
ことができる。そのライブラリーでは、すべてのアミノ酸が偶然的というわけで
はなく、構造から導かれる決められた位置に限られる。これによって、新しい診
断マーカーおよび病気と抗体の特異的反応性との間の、これまで知られていなか
った相関性を発見することができる。その例として、腫瘍性疾患、心筋梗塞のよ
うな心臓循環器系疾患、多発性硬化症およびパーキンソン病、あらゆる種類の自
己免疫疾患およびアレルギー、あらゆる種類の感染症をあげることができる。
に関して何らかのことが言えるようになる可能性がある。しかし、新たに発見さ
れるマーカーを別々に担体に付着させて、将来、検査に使用することも可能であ
る。
て約500個のアミノ酸をコードする約100,000個の遺伝子を持っている
。今後数年のうちにこれらの遺伝子の約90%以上が明らかにされるだろう。こ
れらの遺伝子産物のそれぞれを、その場合場合に応じて、相互に向かってアミノ
酸5個だけずらした平均100個の重複した15量体ペプチドで表現すると、す
べてのヒト遺伝子産物をカバーするには約1000万種類のペプチドが必要であ
る。図17にそのようなアレーを模式的に示してある。
み、たとえば「発がんアレー」や「免疫アレー」など、をカバーする発現アレー
も提案される。
わけ自己免疫疾患の患者の血清−抗体プロフィールの分析に適している(前記参
照)。ここではそれぞれが規定された比較的長いペプチドを持つアレーが存在す
るため、明瞭なシグナルが期待できる。
に適している。これらのアレーは、たとえば、多発性硬化症、パーキンソン病、
各種がんが自己免疫成分を持っているかどうかという問題に答えることができる
かもしれない。逆に考えれば、これらのアレーは前記各種病気の診断法としても
特に適している。
きる。そこで、たとえばどのヒト遺伝子産物が、明確なウイルス粒子の侵入口に
なるのか、という疑問に答えるのに役立つ。
リーやオリゴ糖ライブラリーの結合パターンとの関係を明らかにする試みも可能
である。この方法は、この場合、ヒトの病気に限られるものではなく、法医学や
獣医学上の問題にも適するし、植物抽出物から微生物抽出物まで、その他の液体
の分析にも好適である。
−ペプチドのような治療上興味が持たれる有望な分子を担体に配置し、それを医
学に関連する分子、特に、病気を誘発する特異的なタンパク質、または病気を誘
発する特異的なタンパク質の混合物と接触させる。この方法は、この医学的に関
連する分子の結合相手に目標を定めて迅速に探索することを可能にしてくれる。
同様にして、酵素リガンド、酵素基質アナローグ、酵素インヒビターを探すこと
も可能であろう。
によって検出することができるので、少なくとも病気発現因子の一部を結合する
D−ペプチドまたはアプタマー(Aptamere)を同定することができる。
つづいて、このD−ペプチドおよびアプタマーが病気発現因子を抑制するかどう
かを試験することができる。たとえば病気発現因子酵素(たとえば、HIVプロ
テアーゼ、逆転写酵素など)を適当量存在させるとこれらの酵素を蛍光標識する
ことができる(直接に、または抗体によって、またはモノクローナル抗体によっ
て発色可能な小さいペプチドタグの組み換え体発現)。これによって、酵素がど
のD−ペプチドに結合したかを決定することができる。次に、酵素活性によって
もたらされるさらに別の呈色反応を行うことができる。たとえば、HIVプロテ
アーゼで切断すると検出可能な蛍光性のペプチドが分離される。このように酵素
と結合するばかりでなくその作用を抑制するD−ペプチドが得られる。
レーが2種類の酵素検出を可能にしている。 a.酵素の活性を封鎖しないで酵素と結合するペプチドの同定(図18,44
)。 b.酵素と結合し、同時に酵素の活性も封鎖するペプチドの示差的同定(図1
8,45)。後者のD−ペプチドのモジュールは期待される治療薬の基礎物質と
して特に適している。
相互に連結し、つづいて、禁止作用をさらに検出することができる。
を血清またはDNAに接触させた後でまたは接触させる前に、血清またはDNA
を、血清またはDNAと反応して特に結合する物質と接触させることができる。
この場合、血清またはDNAと接触する前に、血清またはDNAと反応する物質
を、励起すると発光する物質、特にレーザー光を照射すると励起されて発光する
色素で発色させると良い。このような色素は、「Cy3」、「Cy5」、「FI
TC」、「TRITC」の名称で市販品を購入することができる。これらの蛍光
色素の複合体のひと揃い(たとえばヒツジ−アンチ−ヒト抗体複合Cy5)が入
手可能であり、それを利用するのが便利である。
疫グロブリンE型はぜん息や枯草熱のようなアレルギー反応に関係するため、患
者にアレルギーがあるかどうかが分かる。非アレルギーの者は血清中にIgEs
をほとんど持たないのに対して、アレルギーを起こす者は区別できるほど大量の
IgEsを持ち、異なるアレルゲンを認識させる。最後に、本発明は、高度に複
雑なライブラリーから目標分子に対する特異的な結合の相手を、そしてそれゆえ
、−多くの(結合力の異なる)結合相手によって−目標分子にリガンドを結合さ
せることに関係する構造パラメーターを捜し出すことを可能にする。かくして、
リード構造に到達することがずっと容易になる。たとえば、前に挙げた方法によ
って得られるシグナルパターンと、使用したライブラリーから同定されたリガン
ドの構造パラメーターまたは構造モデルとの相関性を自動的に明らかにすること
ができる。
るものではない。さらに、可能性がある多数の結合相手を有利に検査する必要が
ある時、さらに別の多くの応用の道がある。特にこの点は二つの分子ライブラリ
ーを組み合わせる時に言うことができる。ライブラリーの一方はアレーであり、
前記の血清は、このような二つのライブラリーに対する多くの例の中の一例に過
ぎない。結合相手の同定は、前記アレーでは、アレー上の位置によって行われる
。第二の結合相手の同定には、質量スペクトルなど、別の有利な確認方法を使用
することができる。
いて図の参照番号を引用しながら以下に説明する。
たはオリゴヌクレオチド合成用に誘導された、基本的にポリスチレンから成る複
写用シート、またはペプチド合成またはオリゴヌクレオチド合成用に誘導された
紙)を、外部信号が担体ロールへの固体を終了するまで、固定したままにしてお
く − トナー容器が付属する4種類の交換磁気ロールの代わりに、トナー容器が付
属する24種類の交換磁気ロールを書き込みが可能なロールの近くに配置する
トナー容器を備えた改造カラーレーザープリンター6台に挿入することもできる
。全部合わせると、最大24個の異なるトナー粒子が、一つの層として転写ユニ
ットに付着される。装置によってそれぞれ異なるレーザー位置をあらかじめ調整
し、印刷見本で確認する。
定された担体に供給することができる回転可能なロール − 時間的にプログラム可能な各種液体を、担体ロールに固定された担体から誘
導することができる回転可能なロール
(図14) 市販カラーレーザープリンターの転写ロールのベルトに担体を固定する。担体
、特に転写ユニットには、光エレクトロニクス検知ユニットによって検知可能な
構造を設ける。これによって、トナー粒子の転写に責任を持つレーザーの位置に
対して、転写ユニットの位置を調整することが可能になり、さらに転写ユニット
に固定された担体の位置を調整することが可能になる。
給することができる槽 − 時間的にプログラム可能な各種液体を、担体ロールに固定された担体から誘
導することができる回転可能なロール
から、担体が固定されている前記転写ユニットを取り出し、さらに別の前記外部
装置に装着することができる。いくつかの液体の供給および排出を行った後で、
前記光エレクトロニクス検知器によって、トナー粒子の転写に対して責任を持つ
レーザーの位置に対する転写ユニットの位置を再度正確に調整することができる
。
アミノ酸無水物を、磁鉄鉱粒子と一緒に75℃でジフェニルアミドに溶解し、急
速凍結させ、それから細かく粉砕し、できるだけ一様な、直径が約1〜200μ
m、特に5〜40μmの粒子が得られるようにする。この粒子をトナーカセット
に充填して紙に印刷する。図19は、普通のトナーと各種アミノ酸トナーによる
印刷品質を比較したものである。
ルアミド/アセトニトリルに溶解し、急速凍結させ、それから溶解した成分を低
温で昇華させた。次に細かく粉砕し、できるだけ一様な、直径が約1〜200μ
m、特に2〜40μmの粒子が得られるようにする。この粒子をトナーカセット
に充填して紙に印刷する。
実施例c)に記載したアミノ酸トナー(図19も参照)を使用する。
な方法によってさらに2種類のアミノ酸を紙にカップリングする。次に、実施例
(c)に記載した各アミノ酸トナーで、誘導体化した紙に卵形の碁盤の目パター
ンを印刷し、それからトナーカセットを交換した後、長方形の、互いにかみ合っ
たパターンを印刷する。このようにして全部で5層のアミノ酸を印刷し、それか
ら、それぞれに応じて、アミノ酸トナーに含まれる保護基を持ったアミノ酸をカ
ップリングさせ、N−末端保護基を切断する。別の段階では、再び標準的な方法
で最後のN−末端アミノ酸を一様にカップリングさせ、それからペプチド鎖の側
鎖の保護基を標準的な方法で切断する。このようにしてペプチド、(N−末端)
−DYKDDDDK−(担体)および(N−末端)−DDEETTDK−(担体
)の2つの、互いにかみ合った碁盤の目パターンを合成した。
の確認 2つの、互いにかみ合った碁盤の目パターンをカップリングさせた、実施例(
e)に記載の紙を小さく切り、まず、適当な水溶液、たとえばPBS中の2%粉
ミルクで非特異的な結合をブロックする。2種類のモノクローナル抗体(マウス
から)を同じ緩衝液中で希釈する。次に、紙片を60分間穏やかに振とうしなが
らどちらかのモノクローナル抗体で発色させる。次に、3回洗浄する。酵素に結
合させたヤギ−アンチ−マウス抗体をPBS中の2%粉ミルクで希釈する。つづ
いて、担体を浸し60分間穏やかに振とうする。それから3回洗浄する。図20
は、各種酵素基質による紙片の発色を示したものである。ペプチド、(N−末端
)−DYKDDDDK−(担体)を特異的に認識するモノクローナルマウス抗体
FLAG M1(シグマ社)すなわちレーザープリンターで生成させた長方形の
碁盤の目パターン。
リーの合成 好適な平滑担体を標準的な方法によって遊離アミノ基で誘導体化する。担体と
しては、紙か、または本質的にポリスチレンから成る複写シートが好適である。
当業者によって汎用されているfMocペプチド合成によって、まず遊離アミノ
基に対して、無水条件下に好適なスペーサー、特にアミノ酸の長さが2〜3個の
スペーサーを合成する。希望すれば、カップリングされるアミノ酸、好ましくは
19ないし20種類の異なるアミノ酸の混合物(すなわち、希望によってはシス
テインを除く)をさらに2〜3層だけこのスペーサーに連結することができる。
次に、誘導体化した担体を実施例(a)または(b)に記載した改造カラーレー
ザープリンターの担体ロールまたは転写ユニットに固定する。
容器には実施例(c)に記載した各種アミノ酸トナーを含む。
法に従って、特に19種類または20種類の異なるアミノ酸トナーを正確な位置
に並置して印刷する。その場合、担体は、位置が正確に規定され、互いに19ま
たは20に分離された領域に分割される。次に、正確な位置に印刷された活性化
アミノ酸、特にアミノ酸無水物のカップリングを約65℃で5〜30分間行う。
この過程中、担体ロール(または転写ロール)は、それに固定された誘導体化担
体と一緒に、実施例(a)または(b)に加熱ユニットとして記載した赤外線ラ
ンプ列の下で一様に回転する。
ナーを洗い流し、fMoc保護基を標準的な方法によって切断し、再度洗浄し、
それから実施例(a)または(b)に記載した加熱ユニットで乾燥する。この間
、担体は、終始一様に回転する担体ロール(または転写ユニット)上に固定した
ままである。
ーをそれぞれ正確な位置に、横並びにまたは重ねて印刷する。これによって、担
体は、好ましくは、正確に位置を規定された192ないし202個の領域に分割
される。すぐ前に述べたのと同様にして、活性化アミノ酸をカップリングさせ、
反応しなかったアミノ酸トナーを洗い流し、fmoc保護基を切断する。
れた195ないし205個の領域に分割する。希望によっては、カップリングさ
れるアミノ酸、好ましくは19ないし20種類の異なるアミノ酸の混合物(すな
わち、希望によってはシステインを除く)を、このペプチドアレーの遊離アミノ
末端に、標準的な方法によって、さらに2〜3層だけ連結することができる。
10%シランによって切断し、担体をDMFおよびメタノールで洗浄し、乾燥し
、最終的に、たとえば205=3,200,000個の異なる領域を持つ担体が
生成する。これらの領域は、それぞれの場合に応じて、自然に存在するすべての
考えられるC末端で結合したペンタペプチドの一つを表す。
ヌクレオチドライブラリーの合成 実施例(d)に記載したように、4種類の異なるホスホロアミダイトトナー粒
子を調製する。これら4種類のトナー粒子には、オリゴヌクレオチドを合成する
ために4種類の異なる活性化モノマーを含むことが好ましい。これらのトナーを
トナー容器に充填し、実施例(a)または(b)に記載したように、改造したカ
ラーレーザープリンターで担体に印刷する。
ように、ここでは標準的な方法で調製された遊離アミノ基(またはヒドロキシル
基)を持つ適当な担体が使用される。最初の段階でまだ存在していない場合は、
当業者によって汎用されている標準的な合成法によって、無水条件下で、遊離ア
ミノ基(またはヒドロキシル基)を基に適当なリンカーを合成する。そのリンカ
ーは、今度は表面から約22原子の距離を隔てて遊離アミノ基(またはヒドロキ
シル基)を再度担体につなぎ止める。
ように、4種類の異なるホスホロアミダイトトナー粒子に存在するモノマーを、
テトラゾールで活性化後、加熱ユニットによって可動化させる。つづいて、それ
を2〜10分間反応させて担体に結合させる。
および洗浄は、当業者によく知られたオリゴマー合成の標準的な方法によって行
った。
、実施例(a)または(b)に記載したように洗い出し、標準的な方法によって
ホスホロアミダイトの5’末端のDMTr保護基を切断し、再度洗浄し、担体を
実施例(a)または(b)に記載した加熱ユニットで乾燥した。この間、担体は
担体ロールに固体されたままである。
リド(DMTr) − アデニンおよびシトシン塩基の場合ベンゾイル基(図22) − グアニン塩基の場合イソブチリル(図22) − リン酸基の場合メトキシ基またはβシアノエチル基(図22)
いる場合は、その後の反応に関与できないようにするため、それぞれの段階で「
キャップ」を取り付ける(図23)。そして、三価のリン酸基を酸化する最後の
段階で合成のサイクルは終了する(図24)。
で実施例(g)に記載したように担体に再度印刷する。ここでは、担体は、42 個の互いに分離された領域に分割されることが好ましい。個々に分離されたこれ
らの領域のそれぞれには、5’末端に遊離のOH基を持つ、考えられる16個の
ジヌクレオチドの一つが存在し、それぞれの場合に応じて、3’末端を通して、
スペーサーによって担体に結合されている。
アミダイトについて、全部で10回くり返され、前記の互いに仕切られた16個
の領域は、さらに、全部で412個の、位置が正確に規定された領域に分割され
、さらに、各合成段階ではそれぞれの場合に応じて、残っている遊離の5’OH
末端、三価のリン酸基の酸化、およびTCAによるDMTr保護基の新たな切断
が続く。
合成に対応している。ただし、最後に保護基を完全に切断したあとでも、オリゴ
ヌクレオチドを固体の担体から切断しないで結合させたままにしておくように、
オリゴヌクレオチドを担体につなぎ止めておく点が、当業者によって汎用されて
いる標準合成法と異なっている。
をアセトニトリルで洗浄し、乾燥する。このようにして、最終的に、それぞれの
場合に応じて、考えられるすべての、3’末端基を通してカップリングした12
量体オリゴヌクレオチドの一つを代表する、412=16,777,216個の
異なる領域を持つ担体が生成する。
応するアミノ酸無水物をイソプロパノールまたはNMPおよびジフェニルホルム
アミドと一緒に溶解する。この液体を多色トナーパトローネに充填し、基本的に
市販のカラーインクジェットプリンター内に取り付け、実施例(g)に記載した
方法と同様にして紙に印刷する。
レーザープリンターと同様に、印刷サイクルがくり返される間、できれば回転可
能な担体ロールを使用して、担体が印刷ヘッドに対して固定されたままで維持さ
れるように、あらかじめ改造される。実施例(a)または(b)に記載したよう
に、外部装置は次のような構成で製作される: − 加熱ユニット、特に赤外線または熱風オーブンによる − 時間的にプログラム可能な各種液体を、担体ロール上に固定された担体に供
給することができる回転可能なロール − 時間的にプログラム可能な各種液体を、担体ロール上に固定された担体から
誘導することができる回転可能なロール
しては、紙か、または本質的にポリスチレンから成る複写シートが好適である。
当業者によって汎用されているfMocペプチド合成によって、まず遊離アミノ
基に対して、無水条件下に好適なスペーサー、特にアミノ酸の長さが2〜3個の
スペーサーを合成する。希望すれば、カップリングされるアミノ酸、好ましくは
19ないし20種類のアミノ酸の混合物(すなわち、希望によってはシステイン
を除く)をさらに2〜3層だけこのスペーサーに連結することができる。
ことができる。ドラフト中でジクロロメタンを蒸発させる。つづいて、誘導体化
した紙を前記の改造したカラーインクジェットプリンターの印刷ユニットに対し
て動くことができる担体上に固定する。
の操作法に従って、特に19種類または20種類の異なるアミノ酸トナーを正確
な位置に並置して印刷する。その場合、担体は、位置が正確に規定され、互いに
19または20に分離された領域に分割される。次に、正確な位置に印刷された
活性化アミノ酸、特にアミノ酸無水物のカップリングを約65℃で5〜30分間
行う。この過程中、担体ロールは、それに固定された誘導体化担体と一緒に、実
施例(a)または(b)に加熱ユニットとして記載した赤外線ランプ列の下で一
様に回転する。
Moc保護基を標準的な方法によって切断し、再度洗浄し、それから前記の加熱
ユニットで乾燥する。この間、担体は、終始一様に回転する担体ロール上に固定
したままである。
をそれぞれ正確な位置に、並置してまたは重ねて印刷する。これによって、担体
は、好ましくは正確に位置を規定された192ないし202個の領域に分割され
る。すぐ前に述べたのと同様にして、活性化アミノ酸をカップリングさせ、反応
しなかったアミノ酸トナーを洗い流し、fmoc保護基を切断する。
れた195ないし205個の領域に分割する。希望によっては、カップリングさ
れるアミノ酸、好ましくは19ないし20種類のアミノ酸の混合物(すなわち、
希望によってはシステインを除く)を、このペプチドアレーの遊離アミノ末端に
、標準的な方法によって、さらに2〜3層だけ連結することができる。
10%シランによって切断し、担体をDMFおよびメタノールで洗浄し、乾燥し
、最終的に、たとえば205=3,200,000個の異なる領域を持つ担体が
生成する。これらの領域は、それぞれの場合に応じて、自然に存在するすべての
考えられるC末端で結合したペンタペプチドの一つを表す。
色させる。まず、適当な水溶液、たとえばPBS中の2%粉ミルクで非特異的な
結合をブロックし、血清を同じ緩衝液で希釈する。次に、担体を血清に浸して6
0分間穏やかに振とうし、それから3回洗浄する。
とえば、ヤギ−アンチ−ヒト−抗体または、タンパク質Gまたはタンパク質Aと
いったような抗体結合タンパク質が使用される。これらの検出試薬は、ペルオキ
シダーゼまたはホスファターゼといった酵素や、たとえばCy5またはヨウ素1
31といったような色素や放射性物質に結合させる。
やかに振とうする。酵素の活性によって着色した沈殿が生成する。これは市販の
スキャナーで読み取ることができる。ホスホイメージャーを使って、結合した放
射能または蛍光の位置を正確に検出する。
ーの異なるペンタペプチドに帰属させる。
同定 実施例(g)に記載したペンタペプチドライブラリーを、実施例(j)の記載
に従って、胃潰瘍に罹っている患者50名の血清で発色させる。ここで、複数の
患者の血清を互いに混合してもよいし、血清ごとにそれぞれの場合に応じてアレ
ーを発色させてもよい。次に、アレーの各ペプチドに対して、複数個の着色から
シグナルの平均強度を求める。
に強く発色するいくつかのペプチドを同定することができる。その結果を図16
に模式的に示す。このペプチド配列をデータバンクで検索すると、これらのペプ
チドとピロリ菌の遺伝子産物との近縁性が明らかになる。
DNAの検査 完全なオリゴヌクレオチドライブラリーを持つ実施例(h)に記載した担体を
患者のDNAで発色させる。ここでは当業者によく知られた標準的な方法を使用
する。非特異的な結合をたとえばニシンの精子から分離したDNAで飽和させる
。
ノムDNAを、腫瘍原特異的な一組または複数組のプライマー(たとえば遺伝子
p53,p16,ras,c−myc,n−mycに特異的)を使用するポリメ
ラーゼ連鎖反応によって複製する。ここで、腫瘍の検体はフルオレセイン−12
−dUTPで標識し、他方、正常な検体はテトラメチルローダミン−5−dUT
Pで標識する。両検体は混合され担体上でハイブリッド形成させる。
市販のホスホイメージャーで検出される。その場合、緑色の蛍光と赤色の蛍光の
比か、発色した混合色などが決定される。信号はアレーの異なる12量体オリゴ
ヌクレオチドに帰属される。
きる。市販されているシステムと違い、完全な12量体オリゴヌクレオチドライ
ブラリーによれば、多数の遺伝子を同時に分析することができる。
る複製のテンプレートの役をする。そのAluプライマーは、極めて高い頻度で
ゲノムに出現するくり返しAlu配列の周辺にハイブリッド化し、2つのAlu
配列の間に存在する非くり返しDNAを複製する。この場合も、腫瘍の検体は、
たとえばフルオレセイン−12−dUTPで標識されるのに対して、正常な検体
は、テトラメチルローダミン−5−dUTPが組み込まれる。前記と同様に、検
体は混合され担体上でハイブリッド化される。
常組織と腫瘍組織の間で極めて多数のゲノムの違いが検出される。その違いを通
して、腫瘍の発達に関する重要な情報をもたらす新しい診断マーカーを発見する
ことができる。
ナルを明確に同定することができるまで、全三次元空間を検査しなければならな
い。それに対して、スキャナーはずっと迅速である: 2.スキャナーはレーザーが使用できるばかりでなく、作業が発光ダイオードの
一次元アレーと並行して進められる。発光ダイオードの光は、担体に対してほぼ
平行に照射されるため、スキャナーの場合、三次元空間の検査は省略される。
作用によって行われるが(図3、I)、光に感じる保護基は切断されるため(図
3、II)位置的に規定された分子鎖の延長が可能である。両者の利点は分解能
が高いことである。両者の欠点は、各モノマーに対して、サイクル全体が最初か
ら最後まで逐次的に行われるため、質は費用に関係することである。 Ia. 光(16)を照射すると光に感じる保護層(17)は正確に規定された
位置(18)から除去される。 Ib. これによって、コンビナトリアル合成のために付着させたモノマー(2
)を、正確に規定された位置(18)で担体(1)にカップリング(11)させ
ることができる。 IIa. 光(16)を照射すると光に感じる保護基(15)は正確に規定され
た位置(18)で切断される。 IIb. これによってコンビナトリアル合成のために付着させたモノマー(2
)を、正確に規定された位置(18)で担体(1)にカップリング(11)させ
ることができる。
付着させる。それから、次のモノマー層(2)を印刷する前に、ひとつのカップ
リングサイクルを一斉に行う。それに対して、図3に示したリソグラフ法による
合成法ではモノマー(2)を各種類ごとに個別に逐一付着させ、カップリング(
11)させ、過剰のモノマーを洗い去らなければならない。このことは、オリゴ
マーの同じアレーの合成に対して、リソグラフ合成法は、印刷法よりN倍多くの
カップリングサイクルを行わなければならないことを意味する。ここで、数字N
は、異なるモノマー(2)の数、すなわちオリゴマーペプチドアレーの合成を表
し、リソグラフ合成法は、印刷法に比べて20倍多くのカップリングサイクルを
必要とする。
ユニット(19)を、用途に合わせて調製した担体(1)上の正確に規定された
位置(18)に付着させる。 Ib. 次に、コンビナトリアル合成のためのモノマー(2)を、トナー粒子ま
たは転写ユニット(19)から遊離させ、担体(1)上の正確に規定された位置
(18)にカップリング(11)させる。 IIa. コンビナトリアル合成に適する物質(2)を含む液体を、用途に合わ
せて調製した担体(1)上の正確に規定された位置(18)に付着させる。 IIb. 次に、コンビナトリアル合成のためのモノマー(2)を、担体(1)
上の正確に規定された位置(18)にカップリング(11)させる。 IIa.およびIIb.は、現在の技術で使用されている印刷法を記述したもの
である。Ia.およびIb.は、本発明に従う新しい方法を記述したものである
。それは、印刷法の利点とリソグラフ法の利点を組み合わせた方法である。この
場合も、リソグラフ法と同様に、密集性の高い分子ライブラリーを得るためにレ
ーザー光の高い分解能が利用される。そのため、他方で別の印刷法と同様に、並
行して、異なるモノマーの層全体を担体に付着させることができる。
るため、印刷される発色体の拡散は極力抑える必要がある。これは、使用される
液体トナー中の成分を速乾性にして、付着させる発色体を所定の位置に極めて迅
速に固定することで実現することができる。また、使用される発色体は比較的大
きいため、拡散速度はかなり抑えられる。そしてさらに、吸収性の高い特別な高
光沢紙が使用される。 それに対して、(コンビナトリアル合成のための)付着させるモノマーは、合
成に使用される溶剤の揮発性が極めて低いことと、反応相手のカップリングに時
間がかかることのため、拡散が著しい。その上、使用されるモノマーは、分子が
比較的小さいため、その拡散速度はかなり大きい。特殊紙は通常分子ライブラリ
ーの担体としては適さない。
9,2,50)の模式的な比較図: − この場合、室温で固体の普通のトナーのポリスチレン球状粒子(47)の等
価物は、融点が約71℃のジフェニルホルムアミド(50)である。 − 両者とも磁性体成分には磁鉄鉱粒子(46)が使用されている。 − 「アミノ酸トナー」は、発色体の代わりに、N−末端に保護基を持つ活性化
されたアミノ酸(49,2)を含む。
性成分によって、磁気ロール(21)に付着する。そこで粒子は帯電し、その電
荷のために、レーザーで書き込み可能なロール(22)の正確に位置が規定され
た領域に引き寄せられる(23)。領域の定義は、レーザーが、スイッチの開閉
によって、決められた領域に「書き込む」ことによって行われる。トナー粒子(
19)は、電気的な吸引力によって、磁気ロール(21)から、ロール(22)
のレーザーによって書き込まれた領域に引き寄せられる。トナー粒子(19)は
さらにそこから担体(24)(たとえば紙または複写用シート)上に移り、熱ロ
ール(25)によって溶融されるか、アミノ酸トナーの場合は、その中に封入さ
れている物質が可動化(26)される。
場合もトナー粒子(20)は、磁性成分を含むポリスチレンの微粒子からなる。
トナー粒子は磁性成分のために磁気ロール(21)に付着する。そこでトナー粒
子は帯電し、その電荷のために、レーザーで書き込み可能なロール(22)の正
確に位置が規定された領域に引き寄せられる。領域の定義は、レーザーが、スイ
ッチの開閉によって、決められた領域に「書き込む」ことによって行われる。ト
ナー粒子(20)は、電気的な吸引力によって、磁気ロール(21)から、ロー
ル(22)のレーザーによって書き込まれた領域に引き寄せられる(23)。ト
ナー粒子(20)はさらにそこから担体(24)(たとえば紙または複写用シー
ト)上に移り、熱ロール(25)によって溶融されるか、アミノ酸トナーの場合
は、その中に封入されている物質が可動化(26)される。 白黒レーザープリンター(図8)と異なり、カラーレーザープリンターはトナ
ー(20)を印刷するばかりでなく、4色(31,32,33,34)のトナー
粒子(20)も印刷しなければならない。 図9はこの問題を解決する道を模式的に示している: − レーザーで書き込み可能なロール(22)は、白黒のレーザープリンターよ
りかなり大きい(図8) − そのため、レーザーは、このロール上のシート全体に「書き込む」ことがで
きる − レーザーが、レーザーで書き込み可能なロール(22)に第一の色で「書き
込む」 − 第一の色トナー(21,31)を引き渡す磁気ロール(21)が、書き込み
可能なロール(22)に密着する − そこから、トナー粒子(21,31)が、「書き込まれた」書き込み可能な
ロール(22)に引き寄せられる − 書き込み可能なロール(22)が、正確に同じ大きさの第二のロール(35
)と機械的に緊密に連携する − 担体(1)がこのロール(35)に引き寄せられ、そこで固定される − 両ロール(22および35)がもう一方に対して回転する − それによって、第一のトナー(27)は、ロール(35)に固定されたまま
の担体(1)の上に移される。 − レーザーが、第二の色で書き込み可能なロール(22)に書き込む − つづいて、残りの交換磁気ロール(31,32,33,34)が、書き込み
可能なロール(22)に近づく − 残りの色(28,29,30)が書き込み可能なロール(22)に移される − そこから、残りの色(28,29,30)が担体(1)に移される − 印刷過程全体が終了したら、そこで初めて担体は解放される 担体ロール(35)の代わりに、いわゆる転写ユニットが存在することも可能
で、自己制御機構によって書き込み可能なロールに対して調節される。
が印刷する各点の直径は、約40μmである。
00dpiの市販スキャナーで走査する。取り込まれたレーザー印刷画像を高い
倍率で走査しても、画素(ピクセル)に一つの誤りも見られない。
ロール(25)に代わって装置(36)が使用され、これによってカップリング
試薬または洗浄液がガスまたは液体の状態で回転する担体ロール(35)と接触
することが可能となる。ガス状物質(熱空気も)は幅広いノズルで供給され(3
6)、液体はたとえば回転ベルト(36)によって担体ロール(35)に固定さ
れた分子ライブラリーの担体(1)に接触する。物質(2)を運動可能にするた
めには、赤外線の光源(36)からの光線を使用することもできる。4色のトナ
ー(31,32,33,34)を持つ交換磁気ロール(21)は、20種類のア
ミノ酸トナー(2,19)を持つ交換磁気ロールと交換される。
されたパターン(38)を取り込み、既に保存されたパターン(39)と比較す
る。ここで目標値からの偏差が確認されたら、印刷メモリーに入れられた画像を
この偏差の大きさだけ電子的に位置をずらす(40)。このようにして、転写ユ
ニット(19)またはその中に封入された物質(2)を正確な位置に、横並びに
または重ねてくり返し印刷することができる。
合成される。ここでは、Nで表されるアミノ酸の考えられるあらゆる組み合わせ
がアレー上でカバーされる。
ると、一方に両血清によって認識されるペプチド(従ってペプチド配列)(42
)が、またもう一方で患者の血清に特異的に認識されるペプチド(43)が明ら
かになる。これによって、患者に特異的な色パターンの同定が可能となる。記載
された実施例では、ピロリ菌によって発現され、胃潰瘍を引き起こす遺伝子産物
に合致するペプチド(43)が同定される。 この方法は、一つの病気に限定されず、複数の病気を並行して診断することも
できるし、逆に検出されたペプチドによってこれまで分からなかった病気の原因
を追跡することができる。
個よりやや少ないアミノ酸をコードしている。今後数年のうちにはこの遺伝子の
ほとんどが明らかにされるものと思われる。該当する遺伝子産物は、平均100
個の重複した15量体ペプチドによって代表させることができ、それらのペプチ
ドは、それぞれに、アミノ酸5個だけ互いにずらしたものである。全部合わせて
、10万個すべてのヒト遺伝子産物(すなわちゲノム)をカバーするには、約1
000万個の異なるペプチドが必要である。
。後者のD−ペプチドのモジュールは期待される治療薬の基礎物質として適して
いる。
アミノ酸トナー」の発色は中に含まれる磁気粒子によって可能になる。
スパラギン酸をカップリングさせる。次に、用途に合わせて調製した紙の担体に
二種類のペプチドを碁盤の目状に合成する。ここでは、図20に示すアミノ酸1
から10までに相当する「アミノ酸トナー」を作る。図20に示すアミノ酸1か
ら5までは均斉のとれた卵形11のパターンとして印刷されている。それに対し
て、アミノ酸6から9までは規則正しく並んだ長方形12の二つのパターンとし
て印刷される。両パターンは碁盤の目のように相互にかみ合っている。次に、N
−末端アミノ酸のアスパラギン酸は、最後の段階で再び担体に一様にカップリン
グされ、つづいて保護基が切断される。 (A)に示したペプチドの合成部位は(B)に見られる灰色卵形または長方形
に対応している。短冊状の紙をPBS中、粉ミルクでブロックし、アンチ FL
AG M1抗体またはアンチ アクチン抗体と保温する。結合した第一抗体は、
ペルオキシダーゼ複合ヤギ アンチ マウス抗体(基質13)またはアルカリホ
スファターゼ複合ヤギ アンチ マウス抗体(基質14)を使って検出した。
NH2基にカップリング
る同パターンとの比較 40 プリンターのメモリーに保存されている画像の位置を目標値からのずれ
だけ電子的に修正 41 使用されない 42 患者の血清と対照の血清の両方によって認識されるペプチド 43 患者の血清によって特異的に認識されるペプチド 44 酵素を結合するアレーのD−ペプチド 45 酵素を結合し、同時に不活性化するアレーのD−ペプチド 46 磁性成分 47 溶融可能なプラスチック成分 48 発色体 49 コンビナトリアル合成物質(2)のためのモノマー 50 固体凝集状態にある溶媒
Claims (14)
- 【請求項1】 − 最初に、物質(2)を、<90℃の温度で、そして好ま
しくは<50℃の温度で固体状態(7)で存在する少なくとも第一の溶媒から成
るマトリクス(3)中に入れること、 − 少なくとも第一の溶媒(4)から成る前記マトリクス(3)に入れた前記
物質(2)が一つの単位として動きうる(6)転写ユニット(5)を形成するこ
と、 − つづいて、<90℃の温度で、好ましくは<50℃の温度で固体状態(7
)で存在する前記転写ユニット(5)を担体(1)に付着させる(6)か、また
は前記転写ユニット(5)を第二の溶媒(12)によって溶解し、前記温度にお
いて液体状態(13)で担体(1)に付着させ(6)、そこで前記第二の溶媒成
分(12)を完全に、または部分的に揮散させたあとで、固体状態またはゲル状
態(7)をとらせること、 − 担体(1)に付着させたあとで前記転写ユニット(5)が、固体状態また
はゲル状態(7)のままで存在しうること、 − つづいて、前記担体(1)に存在する前記第一の溶媒に溶解した前記物質
(2)を、とりわけ前記第一の溶媒(4)の内部の物理的な環境(8)を変える
(9)ことによって運動ができるようにすること、 − このようにして運動できるようになった物質(2,9)を物理的な過程に
よって担体表面付近に到達させる(10)こと、 − このようにして運動できるようになった物質(2,9)が、担体(1)に
存在する分子と共有結合によってカップリングするか、または前記分子と化学反
応するか、または前記分子を触媒すること、 − このようにして運動できるようになり、担体にカップリングした物質(1
1)が、多くの異なる物質(2)であるか、多くの異なる物質を生成すること、 − 前記物質(2)の複数個のくり返し可能な層を担体(1)上の正確な位置
に付着させ、それから場合に応じて、物質を共有結合によって担体(1)にカッ
プリングさせ、カップリングしなかった物質を洗い流すこと を特徴とする、分子ライブラリーをコンビナトリアル合成するために、担体に
物質、特にモノマーを付着させる方法。 - 【請求項2】 前記物質(2)が、<90℃の温度で、そして好ましくは<
50℃の温度で、大きさが0.2μm〜200μm、好ましくは2μm〜40μ
mの粒子中に固定化されて存在することを特徴とする請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記モノマーを担体(1)にカップリング反応(10,11
)させるまで、担体(1)を前記の温度範囲(7、13)より少なくとも10℃
だけ低い温度に維持することを特徴とする請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】 適合するように修正した印刷方法、特にレーザープリンター
、レーザー複写機またはインクジェットプリンターによって物質を正確な位置に
転写することを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 目的に合わせたいくつかの光源、特に発光ダイオードまたは
ミクロレーザーのアレーによって物質を正確な位置に転写することを特徴とする
請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 - 【請求項6】 担体に付着させるべき粒子を担体上に噴霧することを特徴と
する請求項1〜5のいずれかに記載の方法。 - 【請求項7】 担体上の粒子を冷却し、低温で凍結させることを特徴とする
請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 粒子が次に挙げる群の少なくとも一つの要素を含むか、また
は次に挙げる、 磁性成分、ジフェニルホルムアミド、コンビナトリアル合成に適するモノマー
、ダイマーまたはトリマーの前駆体、特にD−アミノ酸またはL−アミノ酸、そ
して、ヌクレオシドまたは誘導体化されたヌクレオシド、またはそれらの鏡像体
またはそれらの誘導体、またはポリスチレンもしくはセルロース、特に一つまた
は複数個のモノマー層にカップリングさせたポリスチレンもしくはセルロースか
ら成る群の一つの要素を含むそのような粒子に結合することを特徴とする請求項
1〜7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】 カップリング反応の第一サイクルの後で、モノマー、ダイマ
ーまたはトリマーの前駆体がカップリングすることができる好ましくは遊離のア
ミノ基またはヒドロキシル基が生成するように、保護基を標準的な方法で切断す
ることを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の方法。 - 【請求項10】 電磁波、特にレーザー光を、担体の選択された領域の正確
な位置にくり返し照射すること、担体の選択された領域に異なる分子またはこれ
らの分子の集合体をのせてあるか、またはのせること、異なる分子またはこれら
の分子の集合体が相互作用すること、選択された領域に存在する異なる分子また
は、これらの分子の集合体または別の分子が、照射される電磁波と相互作用する
こと、および照射される電磁波と、分子またはこれらの分子の凝集体またはその
他の分子とが相互作用して、局所的な物理的化学的過程を受けること、を特徴と
する、物質、特に分子ライブラリーのコンビナトリアル合成のためのモノマーを
担体に付着させる方法。 - 【請求項11】 回転可能な、担体を保持するための手段と、回転軸の領域
の担体表面に種々の異なる液体を付着させるための手段と、担体の選択された領
域にレーザー光を照射するための、担体に作用しうる少なくとも一つのレーザー
とを含む、本質的に平面を成す担体表面に分子を付着させる装置。 - 【請求項12】 結合すべき分子を担体にできるだけ少量付着するためのノ
ズル状の手段と、分子と担体とを互いに付着させるための手段を働かせるための
手段と、担体の選択された領域にレーザー光を照射するための少なくとも一つの
レーザーとを含む、本質的に平面を成す担体表面に分子を付着させる装置。 - 【請求項13】 付着させるべき分子を含む粒子のための容器と、レーザー
と、担体とレーザーを互いに対して動かすための手段とを含む、本質的に平面を
成す担体表面に分子を付着させる装置。 - 【請求項14】 変更を加えた、しかし基本的には市販されている、レーザ
ープリンターまたはレーザー複写機を問題の装置とし、付着させるべき分子を含
む粒子としてトナー粒子を使用することを特徴とする請求項13に記載の方法。
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