WO2014169928A1 - Verfahren zur kombinatorischen partikelmanipulation zur herstellung von hochdichten molekülarrays, insbesondere von peptidarrays, und damit erhältliche molekülarrays - Google Patents

Verfahren zur kombinatorischen partikelmanipulation zur herstellung von hochdichten molekülarrays, insbesondere von peptidarrays, und damit erhältliche molekülarrays Download PDF

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Felix LÖFFLER
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Definitions

  • the present invention relates to a method for combinatorial particle manipulation for the production of high-density molecular arrays and the high-density molecular arrays obtained therefrom.
  • the present invention relates to a method for producing high-density molecular arrays, in particular of peptide or oligonucleotide arrays, by combinatorial structuring of particles, the structuring being achieved by selective and direct exposure to electromagnetic radiation.
  • microarray technology a plurality of different molecules are arranged in a predefined pattern on a substrate surface in immobilized form.
  • This technology makes it possible to carry out analyzes and / or chemical reactions on a very large number of different substances and is preferably used in biotechnological research and in the pharmaceutical industry for high-throughput screenings.
  • the 20 different amino acid derivatives are applied in a solvent to defined spots of an aminoterminated carrier and thus layer by layer many peptides are built up side by side in a combinatorial synthesis.
  • a disadvantage of this "spot synthesis" is that so far only about 25 peptides per cm 2 can be synthesized. This is due to the fact that small liquid droplets are very difficult to dose, so that the required viscous solvents "creep" along the surface, and that these droplets must not evaporate for a long time during the coupling reaction.
  • Another method is based on the use of a semiconductor chip as described, for example, in Beyer, M., et al., "Combinatorial synthesis of peptide arrays onto a microchip", Science, 2007, 318 (5858), 1888. It is a special high-voltage CMOS chip whose surface is divided into different electrodes. By programming the chip certain electrodes can be switched on. Due to the resulting electric fields, charged particles are selectively deposited on the switched-on electrodes. The synthesis of the molecular array can either be performed directly on the chip surface, or the entire particle pattern on the chip is transferred by means of an electric field to a target support, such as a glass slide, where the synthesis also takes place.
  • a target support such as a glass slide
  • the usable area of the chip is very small due to the manufacturing process, with current models 12 mm x 12 mm. This means that the number of different molecules is very limited by the available area.
  • the chip-based process involves the selective deposition of particles from an aerosol.
  • aerosol parameters such as aerosol density, particle velocity and particle charge.
  • aerosol guidance flow dynamics, particle size distribution, air humidity, etc.
  • lithographic processes for the preparation of peptide arrays are known that are based on photolabile protecting groups which are cleaved by the irradiation with light, as described, for example, in Fodor, SPA, et al. Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis ", Science, 1991, 251 (4995), 767-773.
  • lithographic methods have a fundamental disadvantage. For each of the different monomers, it is necessary to go through the coupling cycle separately, i. Each type of monomer is applied, coupled, and excess monomers are washed away, followed by the next type of monomer, so that, for example, in combinatorial peptide synthesis, layer by layer must undergo 20 coupling cycles each. This leads to quality problems of the resulting molecule libraries, since expected by-products or artefacts can arise at each coupling cycle. Therefore, lithographic methods have hitherto been used almost exclusively for the synthesis of oligonucleotide arrays, since in this case only four different monomers have to be coupled to the support.
  • the object of the present invention is to provide a process for producing high-density molecular arrays, in particular peptide arrays, which overcomes the known disadvantages and limitations of the prior art. This object is achieved by the features characterized in the claims.
  • a method for producing high-density molecular arrays with a pitch of ⁇ 300 ⁇ m comprising the following steps:
  • the structuring of the target carrier with different monomers for combinatorial synthesis is achieved by directly influencing and thus structuring particles:
  • molecular array is understood to mean a molecule library bound to a support, the latter including the totality of many different molecules bound to defined locations of the support (so-called spots).
  • This carrier to which the molecules are bound is also referred to as the target carrier.
  • the pitch of the molecular array is preferably ⁇ 200 ⁇ , more preferably ⁇ 150 ⁇ and particularly preferably ⁇ 100 ⁇ .
  • array is understood as meaning both carriers in which different molecules are arranged essentially in only two dimensions, as well as porous carriers or carriers having a structured surface, in which the different molecules are present in an additional third dimension.
  • the term "discrete spot” is understood to mean a region of a (target) carrier that is spatially separated from adjacent spots.
  • the spots can be present separately from the neighboring spots both due to a geometric shape and due to different surface properties. For example, these can be separated from one another in the form of thin partitions or by means of web structures or can be in the form of depressions.
  • the spots are present as discrete areas, for example because of different wetting properties of the surface of the carrier.
  • the structuring of the target carrier with different monomers for combinatorial synthesis is achieved by removing particles by means of electromagnetic radiation at defined locations and thus allowing access to these locations.
  • a plurality of discrete spots of the target carrier are occupied by particles which block access to them.
  • the discrete spots of the target carrier preferably have depressions.
  • a carrier is used as the target carrier, which is so covered with particles that they block access to defined locations on the support, ie cover the wells. These particles are also called blockade particles below.
  • Particularly suitable carriers are prestructured carriers with recesses into which one or more blockade particles fit as precisely as possible. Since the particles can be held in the depressions, inter alia by means of capillary forces, the depressions of such pre-structured supports can be filled particularly easily and completely with one or more particles.
  • these blockade particles should, on the one hand, block access to said depressions as efficiently as possible, so that no further particles or substances can deposit there, and on the other hand, they must be able to be selectively removed from selected depressions.
  • the blockade particles are removed by electromagnetic radiation, which is preferably a short laser pulse. This then allows these free wells to be selectively contacted with the at least one monomer.
  • the wells can be filled with monomer particles.
  • These monomer particles essentially consist of a polymer matrix in which suitable chemical building blocks or monomers for the combinatorial synthesis of molecular, in particular of peptide or of oligonucleotide arrays, are embedded.
  • the free depressions can be filled with respectively different types of monomer particles, which differ in particular in that they contain different types of monomers for combinatorial synthesis.
  • the molecules bound to the support can be extended by further monomers, dimers or trimers by one or more further cycles of coupling reactions. It is also possible, by one or more further cycles of not necessarily identical reactions, to modify the molecules bound to the support.
  • the protective groups can be cleaved from the synthesized oligomers, wherein the synthesized molecules remain bound to the support and optionally available for the subsequent coupling step.
  • protecting group techniques known in the prior art, which are in particular established in the field of synthesis of biomolecules such as peptides, oligosaccharides or nucleotides or in combinatorial chemistry in general. That is, according to the present invention, one or more protecting group (s), optionally present in a monomer for combinatorial synthesis, may be removed at a convenient location of the process to allow further coupling steps.
  • polymers or copolymers of (meth) acrylates and / or styrenes are preferably used.
  • different materials may be used as target carriers, such as polystyrene films, paper, CDs, MODs, DVDs or FMDs.
  • functionalized glass supports such as glass wafers, which have a structuring on a surface, for example by means of lithographic process are suitable.
  • Porous glass carriers can also be used according to the invention.
  • the wells of the target carrier are blocked by the blocking particles such that this spot is no longer accessible to added monomers, i. that, for example, the respective monomer can not penetrate into these depressions by diffusion.
  • the spots freed from the blocking particles need not necessarily be filled with monomer particles, but instead the support may be locally or completely contacted with a suitable monomer for combinatorial synthesis.
  • These monomers are preferably applied to the carrier in a suitable solvent so that they can pass via convection, diffusion or via the gas phase selectively to the depressions freed from the blockade particles, where they can react with suitable functional groups of the reactants immobilized there.
  • suitable solvents for example, dimethylformamide, N-methyl-2-pyrrolidone or dimethyl sulfoxide for the peptide synthesis or acetonitrile for the synthesis of oligonucleotides can be mentioned.
  • blockade particles In this embodiment of the method according to the invention, higher demands are placed on the blockade particles, since here the blockade particles must prevent the already mobilized monomers (as opposed to the monomer particles mentioned) from entering the depressions, for example by diffusing through the blockade particles.
  • This can be achieved, for example, by making the blockade particles of a very dense material, such as silica, or cross-linked sufficiently to inhibit diffusion through the blockade particles.
  • Blockade particles of cross-linked material can be called cross-linked polystyrene particles.
  • blockade particles with a very narrow size distribution which also have a strong surface charge.
  • This strong surface charge causes the particles in polar solvents to carry a large, largely immobile shell of polar molecules, such as a hydrate shell in water, so that when swollen they seal access to the recesses, such as a plug, very tightly.
  • the blockade particles may be further sealed with oppositely charged nanoparticles before being contacted with said combinatorial synthesis monomers.
  • these various sealing options can be reversibly made in accordance with the present invention to selectively remove further blockade particles at selected second locations or spots after chemical coupling of a first monomer to selected first locations.
  • added nanoparticles can initially be washed away or blockade particles swollen in liquids can be incubated in liquids with other swelling parameters, so that the diameter of these particles shrinks to such an extent that they can be reliably removed from the depression by electromagnetic radiation, such as a laser pulse. It is also possible that the swollen blockade particles are simply dried.
  • the method as defined above further comprises a step (iv) of depositing blocking particles to re-blockade the previously exposed spots (as shown schematically in FIG. 2).
  • the steps of conditioning the selected spots (step (ii)) and reacting the at least one monomer with reactants present in the selected spots of the target support (step (iii)) and optionally further depositing are performed of blockade particles on previously exposed spots (step (iv)) iteratively using either the same or different monomers.
  • the structuring of the target carrier with different monomers for the combinatorial synthesis is achieved by fixing particles by means of electromagnetic radiation at defined locations and / or transferring them to defined locations.
  • this embodiment of the present invention comprises the steps of providing a target support having a plurality of discrete spots, conditioning selected spots by selective and direct exposure to electromagnetic radiation, and reacting at least one monomer with reactants immobilized in the selected spots of the target support, wherein providing at least one starting carrier having a layer of material in the form of a particle layer or film layer containing the at least one monomer, and wherein the step (ii) of conditioning selected spots selectively transfers material from the output carrier to the target carrier and fixes it in place Includes material on the target carrier, wherein the transmitting and / or fixing takes place by means of electromagnetic radiation.
  • a starting carrier is used which is evenly coated with a particle layer containing monomers for the combinatorial synthesis of molecular arrays.
  • These monomer particles essentially consist of a polymer matrix in which suitable chemical building blocks or monomers for the combinatorial synthesis of molecular, in particular of peptide or of oligonucleotide arrays, are embedded. These monomers may be, for example, amino acid derivatives for the synthesis of peptide arrays.
  • further substances can be added to the monomer particles, with the restriction that they must not interfere with the combinatorial coupling reaction.
  • these components must not contain any NH 2 or SH groups for the synthesis of the peptide; in addition, they should not contain any OH groups for oligonucleotide synthesis.
  • iron complexes can be added to the monomer particles in order to adjust the electrical charge of the monomer particles or substances which influence the absorption behavior. This object can be met by a variety of chemically inert and simultaneously light absorbing substances, such as graphite nanoparticles, fullerenes or bromophenol blue.
  • a starting carrier with a layer of monomer particles
  • a starting carrier can be used, which is coated with a uniform monomer film which, like the monomer particles, consists of a polymer matrix in which monomers and optionally further substances such as absorber materials are embedded. With sufficient mechanical stability of the polymer matrix and a self-supporting film or a block of the materials mentioned can be used.
  • the same materials for the polymer matrix as described above for the first embodiment may be used.
  • the material layer on the output carrier may be in the form of a particle layer or film layer. present.
  • the material with the monomers embedded therein is selectively transferred from the starting carrier to the target carrier where it is fixed in place.
  • the transfer of the material, ie the monomers embedded in the polymer matrix, according to the present invention is not limited to a particle shape.
  • the transfer of the material comprises both the transfer of particles and the transfer of the material in liquid or gaseous form.
  • the material with the monomers embedded therein is transferred from a suitably prepared output carrier with the aid of electromagnetic radiation to a target carrier where it is selectively and precisely fixed.
  • this process is advantageously repeated with different starting carriers but the same target carrier.
  • different monomers can be fixed in a combinatorially precise location on a target carrier at freely selectable locations.
  • these monomers enter into a parallel chemical reaction with functional groups applied to the target carrier. These are in particular NH 2 groups for the synthesis of peptide arrays or OH groups for the synthesis of oligonucleotide arrays.
  • the coupling reaction can be initiated by heating or dissolving the precisely fixed materials so that the embedded monomers can be mobilized and diffused to the surface of the support where they react with the functional groups of the reactants immobilized there. This process is particularly advantageous if the diffusion of the monomers mentioned here remains restricted in that the applied materials assume an oily or wax-like consistency.
  • the preparation of the starting carriers can be done in various ways.
  • the monomer particles may be deposited from an aerosol or suspension on the starting carrier.
  • the monomer particles may be lifted off the surface of a liquid or skimmed off or applied to the output substrate with a doctor blade or roller. If the monomer particles are electrically charged, can electric fields are used for deposition.
  • the coating with a homogeneous film on a support can be done, for example, by means of spin coating or by the use of a doctor blade or roller.
  • the material of the starting carrier is not limited and may be selected depending on the target molecule. These materials are known in the art and therefore need not be described in detail. Nonlimiting examples include polymeric, ceramic or metallic materials. For example, carriers made of polydimethylsiloxane can be advantageously used. For the target carrier reference is made to the above statements.
  • the output carrier as well as the target carrier can be provided with a structuring, for example with micron-scale depressions.
  • This structuring can enable or improve the targeted material transfer / If the starting carrier has a structuring, it may be useful not to coat it homogeneously with a coating, but to adapt the coating according to the structuring, for example only the depressions in the starting carrier with monomer particles to fill.
  • the material to be transferred can be portioned down to individual microparticles per well.
  • a local limitation of the carry can take place, so that during transfer, for example, only a single or a certain number of structures on the target carrier are filled or covered with material of the output carrier.
  • the transferring and fixing of the material from the carrier to the target carrier by contacting the output carrier with the target carrier and the direct or indirect heating of the particle or film layer by the selective and direct action of the electromagnetic radiation take place, wherein the material layer is located between the carriers.
  • a solid starting carrier coated with a layer of monomer particles or a monomer film, is brought into contact with a solid target carrier so that the coating is located between the two carriers.
  • electromagnetic radiation energy is selectively introduced at certain locations.
  • the matrix material together with the substances contained therein is fixed on the target carrier.
  • the monomer particles or the monomer film are either heated directly or indirectly heated by heating one or both of the carriers by the radiation. Indirect heating of the particles or film may also be achieved by mixing it with an additive, such as graphite nanoparticles, which serves as an absorber.
  • the fixed material remains after the separation of the two carriers on the target carrier.
  • the carrier may also be made of a flexible material to ensure better contact. Due to the chemical modification and / or nano- and / or microstructuring of the carrier surfaces can be achieved that the heated particles or the material of the film preferably adheres to the target carrier.
  • the target carrier and / or the output carrier can be exposed to vibrations or excited to mechanical vibrations.
  • the transferring and fixing of the material from the output carrier to the destination carrier can also take place without direct contact of the carriers.
  • the transfer of the material from the source carrier to the target carrier by ablation mechanisms. For example, by electromagnetic radiation, part of the monomer particles, the monomer film, the starting carrier or a special additive is evaporated, so that the volume expansion, material is transported from the output carrier to the target carrier.
  • a direct contact between the source carrier and the target carrier is not necessarily necessary, but not excluded.
  • the transferred material is fixed by locally limited energy is introduced by electromagnetic radiation.
  • a direct or indirect heating of the material takes place.
  • the parameters of the radiation source such as wavelength, energy, pulse duration, focus size and focal plane can be changed or a suitable second radiation source is used.
  • fixation of the material on the target support is accomplished solely by proper choice of the polymer matrix material and / or the target support material so that they adhere or adhere to one another upon contact.
  • the transfer of the material from the output carrier to the target carrier can also take place in that monomer particles or the material of a monomer film are detached from the output carrier by a pulse transmitted by photons and moved in the direction of the target carrier.
  • parts of the output carrier and / or admixed additives can be accelerated by the pulse, which in turn pass on their impulse.
  • the fixation of the material on the target carrier takes place as described above.
  • the transfer of the material from the output carrier to the target carrier can also be effected on the basis of the principle of optical tweezers.
  • the monomer particles are transparent to the wavelength of the radiation source used and are held or moved by the momentum transfer of the photons when refracted on the particles.
  • the transfer of the material from the output carrier to the target carrier can also be effected or supported by the fact that an electric field is generated between the two carriers.
  • the matrix material must first be electrically charged by a suitable method, for example triboelectrically or by a corona wire, whereby in the case of monomer particles they are controlled by the electric force in the direction of the target carrier.
  • the transfer of the material from the output carrier to the target carrier can also be effected or supported by the fact that a magnetic field is generated between the two carriers.
  • the matrix material must contain a magnetic component, such as magnetite.
  • the monomer particles are controlled by the magnetic force in the direction of the magnetic field gradient.
  • the space between the supports and / or between the monomer particles is filled with a liquid.
  • the principles of combinatorial patterning of particles wherein electromagnetic radiation is used to selectively remove blockade particles on the target support to allow access to those spots, or to selectively transfer and fix the material containing the at least one monomer contains, from an output carrier to the target carrier, also advantageously combined.
  • a source of the electromagnetic radiation used in particular lasers are suitable.
  • a suitable lens system is necessary.
  • the target carrier and / or the output carrier can be moved mechanically with respect to the radiation source or the electromagnetic radiation is positioned via suitable mirrors. This has the advantage that a larger number of points are processed per time unit. that can.
  • the beam of a radiation source is split into at least two partial beams via a suitable system, such as a lens array or a mirror array.
  • the partial beams can be modulated individually in their intensity.
  • a high-density molecular array with a pitch of ⁇ 300 pm which can be obtained by the method described above, is furthermore provided.
  • the pitch of the moleküjarrays is preferably ⁇ 200 pm, more preferably ⁇ 150 pm and particularly preferably ⁇ 100 pm.
  • the arrays according to the invention are preferably peptide or oligonucleotide arrays, in particular peptide arrays.
  • the present invention is based on patterning particles on a support with the aid of electromagnetic radiation in order to enable the combinatorial synthesis of high-density molecular, in particular of peptide or oligonucleotide arrays.
  • the electromagnetic radiation acts directly on the particles and thus contributes to the force with which the particles are moved.
  • particles are selectively removed from a support so that the spots now become accessible to monomers for synthesis of molecular, particularly peptide or oligonucleotide arrays.
  • the monomers can be brought to these locations either in a liquid, in the gas phase or as monomer particles.
  • the monomers are structured directly as monomer particles by transferring monomer particles directly onto the spots of a carrier and selectively fixing them there.
  • the focus diameter of the electromagnetic radiation and the size ger structures on the support, such as depressions is limited, can advantageously particle pattern with a grid ⁇ 300 ⁇ , in particular up to ⁇ 100 ⁇ be realized.
  • No particle reservoirs are used in the present invention.
  • the deposition of blockade particles on a support or the coating with monomer particles or a monomer film takes place in a separate process step.
  • insufficiently coated carriers can be sorted out or reprocessed. Problems and delays in the process, caused by variations in the coating quality, which occur in particular in the selective coating of the high-voltage CMOS chips, can thus be advantageously eliminated.
  • the method according to the invention thus becomes very robust.
  • the area of the generated particle pattern is in principle not limited, since the deflection of the electromagnetic radiation with mirrors, as well as the mechanical method, in principle, even very large carriers can be processed.
  • the method according to the invention combines the advantages of lithographic methods (very small structures that lead to very small peptide or oligonucleotide spots) and particle-based methods (simple structuring over larger areas due to self-organization, robustness, temporal and spatial separation of the structuring and the coupling reaction to the carrier), but at the same time avoids their disadvantages (side reactions due to the many sequentially carried out coupling reactions in the lithographic techniques or large grid in the previous particle-based techniques). Since the present invention makes it possible to produce particle patterns with a very small pitch, that is to say with very high resolution and on a very large area, the molecular arrays generated thereby can thus be used extremely efficiently in high-throughput screenings. In high-throughput screening, it is essential to investigate as many different molecules as possible in parallel and at low cost for certain properties.
  • Figure 1 A well-supported support suitable for combinatorial synthesis of peptide or oligonucleotide arrays is placed in contact with chemically inert blockade particles. B) The blockade particles are deposited in the wells. C) With a laser blockade particles are removed from selected wells to allow in the next step, the deposition of monomer particles.
  • Fig. 2 A) The wells of a support have functional groups that can react with monomers for the combinatorial synthesis of oligonucleotides or peptides.
  • a laser has removed the gray blockade particles from some wells so that the exposed sites can contact the activated monomers.
  • B) The monomers couple to the exposed wells.
  • C) The wells are then filled again with blockade particles.
  • D) This procedure is repeated for further wells with other monomers.
  • Fig. 3 introducing particles into the wells of a structured carrier.
  • Fig. 4 A) SU-8 wells, diameter 20 ⁇ , filled with red polystyrene particles (shown as dark particles), diameter 10 ⁇ ; B) depressions were selectively emptied with a pulsed laser, so that the lettering "KIT" results (mirror-inverted, since transmitted light); C) Free wells were filled with blue polystyrene particles while the other wells were blocked by the red particles; D) Detailed view of the combinatorial pattern of red and blue particles (wells with blue particles are marked with * "for clarity).
  • Fig. 6 target carrier before (left) and after (right) cleaning in an ultrasonic bath. Contaminations in non-irradiated areas could be significantly reduced.
  • Fig. 8 Fluorescence-labeled peptides (HA: bright, FLAG: dark), synthesized using laser-based particle structuring, left: KIT from FLAG spots with frames from HA spots, right: FLAG and HA in a checkerboard pattern.
  • FIG. 9 Transfer of amino acid derivatives embedded in a copolymer matrix, from a solid monomer film to a glass target,
  • FIG. 11 shows transfer of particles between two structured carriers; A) carrier with cylindrical depressions, diameter 70 ⁇ , pitch 100 ⁇ , depth about 40 [im; B) wells filled with particles; C) structured output carrier after laser transfer, 5x5 wells are partially deflated, D) structured target carrier after laser transfer, 5x5 structures are filled with particles.
  • FIG. 3A Commercially purchased polystyrene particles of 4.2 ⁇ 0.11 ⁇ m in diameter (see FIG. 3A) were applied in an aqueous suspension to a structured support (see FIG. 3B).
  • the support is a glass wafer on which the photoresist SU-8 has been patterned in a lithographic process. A regular pattern of cylindrical depressions was created. The diameter of the wells is 6 ⁇ and the center point to center distance (also called pitch) is 10 pm. The recesses are about 17 pm deep, which corresponds to the thickness of the SU-8 layer on the glass wafer.
  • the wells of the carrier are reliably filled with the polystyrene particles. Selective emptying of the structures with a pulsed laser is now possible (see also Section 2).
  • Fig. 4A Commercially acquired red colored polystyrene particles of 10 ⁇ m diameter were applied to a structured support in an aqueous suspension (see Fig. 4A).
  • the support is a glass wafer on which the photoresist SU-8 has been patterned in a lithographic process.
  • a regular pattern of cylindrical cavities with a diameter of 20 pm, pitch 50 pm and depth of about 40 pm was produced. Since the diameter and depth of the wells are significantly larger than the diameter of the particles, there are several particles in each well.
  • Individual wells were selectively depleted with a pulsed laser to give the word "KIT" as seen in Figure 4B.
  • blue-colored polystyrene particles (diameter 10 ⁇ m) were applied from aqueous suspension.
  • Monomer particles (average diameter about 8.8 pm) consisting of a styrene-acrylate copolymer and graphite nanoparticles were deposited from an aerosol on a support of polydimethylsiloxane (PDMS).
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • This carrier served as the starting carrier and was brought into contact with a glass target by slight mechanical pressure.
  • a laser wavelength 810 nm, power to 100 mW, focus diameter 7.5 pm
  • certain areas were selectively heated for 10 ms each (see Fig. 5A).
  • Fig. 5B remain after separation of the two carriers, the molten areas on the target carrier.
  • a second source carrier With a second source carrier, these steps were successfully repeated (Figs. 5C and D). In total, about 85% of the irradiated spots were transmitted.
  • Monomer particles (average diameter about 8.8 pm) of a styrene-acrylate copolymer and graphite nanoparticles were applied from an aerosol onto a glass starting substrate. Due to the friction occurring in the aerosol generator, the particles were electrically charged. Subsequently, the target carrier made of glass was positioned parallel to the output carrier at a distance of about 160 ⁇ m. By applying an electric field, a portion of the particles was transferred to the target carrier, so that there was a closed particle layer on this. With a laser selectively certain areas of the particle layer were irradiated (see Fig. 7A). Subsequently, the particle layer on the target carrier was removed with compressed air. The heated areas of the particle layer remained the target carrier (see Fig. 7B). This principle could be repeated a second time, with other areas of the target carrier being irradiated.
  • the two peptides FLAG amino acid sequence: Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys
  • HA amino acid sequence: Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala
  • This laser structuring was carried out with the corresponding monomer particles for the first amino acid of the FLAG peptide, as well as for the first amino acid of the HA peptide. Subsequently, the support was heated to 90 ° C in a nitrogen atmosphere for 90 minutes. The amino acid derivatives in the matrix diffuse in this time to the substrate and couple there chemically to the existing NH 2 - groups.
  • the copolymer matrix, excess amino acids and all other ingredients were then removed by washing with dimethylformamide (DMF). Still free NH 2 groups were blocked and then removed the Fmoc protecting groups at the C-terminal ends of the amino acids.
  • the process was run several times, with the amino acids corresponding to the sequence, until the peptides were completely synthesized.
  • the support was subsequently labeled with fluorescence-labeled anti-HA antibodies (green color in FIG. 8) and with fluorescence-labeled anti-FLAG antibodies (yellow coloration in FIG. 8).
  • An output carrier of glass covered with a layer of layer of monomer particles was exposed to laser pulses (wavelength 532 nm, pulse energy about 50 pJ, pulse duration about 10 ns). Monomer particles from the layer could thus be removed (see FIG. 10A).
  • a second glass slide positioned at a distance of about 170 pm served as a target support on which the particles settle again (see Fig. 10B).
  • the supports are glass wafers on which the photoresist SU-8 was structured in a lithographic process. There were generates a regular pattern of cylindrical recesses (see Fig. 11A). The diameter of the recesses is 70 pm and the center point to center distance (pitch) is 100 pm. The pits are about 40 pm deep, which corresponds to the thickness of the SU-8 layer on the glass wafer.
  • the wells of the starting carrier were filled with a squeegee with particles of a styrene-acrylate copolymer and 2% graphite (mean diameter 2.5 pm, preparation by spray-drying) and the carrier surface was cleaned of excess particles (see FIG. 11B).
  • the output carrier was positioned on a target carrier and matched both hole patterns. Subsequently, 5x5 structures were processed from above with a pulsed laser (wavelength 532 nm, pulse energy about 50 pJ, pulse duration about 10 ns). As a result, the recesses of the output carrier were partially emptied (see Fig. 11C) and the wells of the target carrier filled (see Fig. 11D).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kombinatorischen Partikelmanipulation zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays sowie die daraus erhaltenen hochdichten Molekülarrays. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays, insbesondere von Peptid- oder Oligonukleotidarrays, durch kombinatorische Strukturierung von Partikeln, wobei die Strukturierung durch selektive und direkte Einwirkung elektromagnetischer Strahlung erreicht wird.

Description

VERFAHREN ZUR KOMBINATORISCHEN PARTIKELMANIPULATION ZUR HERSTELLUNG VON HOCHDICHTEN MOLEKÜLARRAYS, INSBESONDERE VON PEPTIDARRAYS, UND DAMIT ERHÄLTLICHE MOLEKÜLARRAYS
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur kombinatorischen Partikelmanipulation zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays sowie die daraus erhaltenen hochdichten Molekülarrays. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays, insbesondere von Peptid- oder Oligonukleotidarrays, durch kombinatorische Strukturierung von Partikeln, wobei die Strukturierung durch selektive und direkte Einwirkung elektromagnetischer Strahlung erreicht wird.
In der Mikroarray-Technologie wird eine Vielzahl an verschiedenen Molekülen in einem vordefinierten Muster auf einer Substratoberfläche in immobilisierter Form angeordnet.
Diese Technologie erlaubt es, Analysen und/oder chemische Reaktionen an einer sehr hohen Anzahl verschiedener Substanzen durchzuführen und wird bevorzugt in der biotechnologischen Forschung und der pharmazeutischen Industrie für Hochdurchsatzscreenings eingesetzt.
Dies ist insbesondere bei der Synthese größerer Moleküle von Vorteil, deren Eigenschaften und insbesondere deren Wechselwirkungen miteinander oftmals so komplex sind, dass diese nur experimentell erforscht werden können. In der kombinatorischen Chemie ermöglichen es solche Molekülarrays, alle darauf synthetisierten Produkte parallel auf gewisse Eigenschaften zu untersuchen. Im Fall von Peptidarrays können dies zum Beispiel Antikörperwechselwirkungen sein. Allerdings mangelt es an Verfahren, um solche Molekülarrays in hoher Qualität und in der nötigen Auflösung herzustellen. Die Herstellung von in-situ Peptidarrays wurde erstmals in Frank R., Tetrahedron, 48 (1992), 9217-9232, beschrieben, wobei eine Festphasen-gekoppelte Peptid- synthese (Merrifield-Synthese) angewendet wurde. Dazu werden die 20 verschiedenen Aminosäurederivate in einem Lösungsmittel auf definierte Spots eines ami- noterminierten Trägers aufgebracht und somit Schicht für Schicht viele Peptide in einer kombinatorischen Synthese nebeneinander aufgebaut. Ein Nachteil dieser "Spot-Synthese" ist jedoch, dass damit bisher nur etwa 25 Peptide pro cm2 synthetisiert werden können. Dies liegt darin begründet, dass kleine Flüssigkeitströpfchen sehr schwer zu dosieren sind, so dass die benötigten viskosen Lösungsmittel an der Oberfläche entlang "kriechen", und dass diese Tröpfchen während der Kupplungsreaktion längere Zeit nicht verdunsten dürfen.
Im Stand der Technik wurden zuletzt verschieden Methoden zur Herstellung von Peptidarrays vorgeschlagen. Bestehende Systeme basieren auf der Xerographie zur kombinatorischen Ablagerung von Partikeln. Die verwendeten Partikel enthalten Aminosäurederivate. Dabei ist es möglich, unter Verwendung eines speziellen Laserdruckers für die partikelbasierte Synthese Peptidarrays zu produzieren, wie in Stadler, V., et al., "Kombinatorische Synthese von Peptidarrays mit einem Laserdrucker, Angewandte Chemie, 2008, 120 (37), 7241-7244 beschrieben und wie auch in EP 1 140 977 B1 oder DE 101 56 329 A1 beschrieben, erzeugt dabei das Lichtmuster einer LED-Zeile zunächst ein Ladungsmuster auf einer Fotowalze. Triboelektrisch aufgeladene Partikel setzen sich auf die gegensätzlich geladenen Bereiche der Fotowalze und es entsteht ein Partikelmuster. Dieses Partikelmuster wird von der Fotowalze auf einen Träger übertragen. Anschließend werden die Partikel durch Erhitzen auf dem Träger fixiert. Ein solches Verfahren erlaubt es jedoch nicht, die Partikel direkt zu strukturieren.
Obwohl sich die vorstehend beschriebenen Laserdrucker für die partikelbasierte Synthese und Produktion von Peptidarrays bereits kommerziell bewährt haben, können mit diesen Druckern zudem nur Partikelmuster mit einem Rastermaß, d.h. einen Mittelpunkt-zu-Mittelpunkt-Abstand der Spots, von 350 pm erzielt werden. Des Weiteren ist die Anzahl der für eine Synthese einsetzbaren Monomere durch die Anzahl der Druckwerke im Laserdrucker begrenzt. Da die Druckwerke exakt zueinander justiert sein müssen, nimmt mit jedem Druckwerk die Störanfälligkeit zu. Da mit jedem weiteren Druckwerk auch die Komplexität des Druckers zunimmt, ist der Bau eines Druckers mit 20 Druckwerken oder mehr bei gleich bleibender Druckgenauigkeit sehr teuer.
Ein anderes Verfahren basiert auf der Verwendung eines Halbleiterchips, wie beispielsweise in Beyer, M., et al., "Combinatorial synthesis of peptide arrays onto a microchip", Science, 2007, 318 (5858), 1888, beschrieben. Dabei handelt es sich um einen speziellen Hochspannungs-CMOS-Chip, dessen Oberfläche in verschiedene Elektroden unterteilt ist. Durch Programmierung des Chips können bestimmte Elektroden eingeschaltet werden. Durch die entstehenden elektrischen Felder werden geladene Partikel selektiv auf den eingeschalteten Elektroden abgelagert. Die Synthese des Molekülarrays kann entweder direkt auf der Chipoberfläche durchgeführt werden, oder das gesamte Partikelmuster auf dem Chip wird mittels eines elektrischen Feldes auf einen Zielträger, wie beispielsweise einen Glasobjektträger, übertragen, wo auch die Synthese stattfindet.
Beim Hochspannungs-CMOS-Chips ist die nutzbare Fläche des Chips bedingt durch den Herstellungsprozess sehr klein, bei aktuellen Modellen 12 mm x 12 mm. Dies bedeutet, dass die Anzahl an unterschiedlichen Molekülen durch die zur Verfügung stehende Fläche sehr begrenzt ist.
Beim chipbasierten Verfahren findet die selektive Ablagerung von Partikeln aus einem Aerosol statt. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, müssen sehr hohe Anforderungen an die Aerosolparameter gestellt werden, wie beispielsweise Aerosoldichte, Partikelgeschwindigkeit und Partikelladung. Dies ist in der Praxis jedoch nur schwer durchführbar und führt zu Problemen und Verzögerungen, da sehr viele Einflussgrößen beachtet werden müssen, wie beispielsweise Aerosolführung, Strömungsdynamik, Partikelgrößenverteilung, Luftfeuchtigkeit, etc.
Daneben sind lithographische Verfahren zur Herstellung von Peptidarrays bekannt, die auf photolabilen Schutzgruppen basieren, die durch die Bestrahlung mit Licht abgespalten werden, wie beispielsweise in Fodor, S.P.A., et al., "Light- Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis", Science, 1991 , 251 (4995), 767-773 beschrieben.
Bekannte lithographische Methoden weisen einen prinzipiellen Nachteil auf. Für jedes der unterschiedlichen Monomere muss gesondert der Kopplungszyklus durchlaufen werden, d.h. jede Art von Monomer wird aufgebracht, gekoppelt und überschüssige Monomere werden weggewaschen, gefolgt von der nächsten Art von Monomer, so dass beispielsweise bei der kombinatorischen Peptidsynthese Schicht für Schicht jeweils 20 Kopplungszyklen durchlaufen werden müssen. Dies führt zu Qualitätsproblemen der resultierenden Molekülbibliotheken, da bei jedem Kopplungszyklus zu erwartende Nebenprodukte bzw. Artefakte entstehen können. Daher werden lithographische Verfahren bisher fast nur für die Synthese von Oli- gonukleotidarrays verwendet, da hierbei nur vier verschiedene Monomere an den Träger gekoppelt werden müssen.
Bislang ist bei den lithographischen Techniken zur Peptidarrayherstellung die Pep- tidausbeute auf Grund der komplexen Chemie folglich nicht hoch genug, um diese Technik zu etablieren.
Neben den vorstehend erwähnten Methoden wurde die Ablagerung von Mikropar- tikeln in den Vertiefungen eines strukturierten Trägers in Yin, Y., et al., "Templateassisted self-assembly: a practical route to complex aggregates of monodispersed colloids with well-defined sizes, shapes, and structures", Journal of the American Chemical Society, 2001 , 123 (36) 8718-8729 und in Kim, Y.H., et al., "Selective assembly of colloidal particles on a nanostructured template coated with polyelec- trolyte multilayers", Advanced Materials, 2007, 19 (24) 4426-4430 vorgeschlagen.
Ausgehend hiervon liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays, insbesondere von Pep- tidarrays, bereitzustellen, welches die bekannten Nachteile und Einschränkungen des Stands der Technik überwindet. Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstände gelöst.
Insbesondere wird ein Verfahren zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays mit einem Rastermaß von < 300 μιτι bereitgestellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(i) das Bereitstellen eines Zielträgers mit einer Vielzahl an diskreten Spots,
(ii) das Konditionieren ausgewählter Spots durch selektive und direkte Einwirkung elektromagnetischer Strahlung, und
(iii) das Umsetzen mindestens eines Monomers mit in den ausgewählten Spots des Zielträgers immobilisiert vorliegenden Reaktanden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Strukturierung des Zielträgers mit unterschiedlichen Monomeren für die kombinatorische Synthese erreicht, indem Partikel direkt beeinflusst und somit strukturiert werden:
- entweder indem Partikel mittels elektromagnetischer Strahlung an definierten Orten entfernt werden, um somit den Zugang zu diesen Orten zu ermöglichen, oder
- indem Partikel mittels elektromagnetischer Strahlung an definierten Orten fixiert und/oder zu definierten Orten transferiert werden.
Beide Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens zur kombinatorischen Strukturierung von Partikeln ("combinatorial particle patterning") vereinen die technischen Vorteile der lithographischen und der partikelbasierten Strukturierungs- methoden und vermeiden gleichzeitig deren Nachteile, wie im Folgenden im Detail beschrieben wird.
Unter dem Begriff "Molekülarray" wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine auf einem Träger gebundene Molekülbibliothek verstanden, wobei letztere die Gesamtheit von vielen unterschiedlichen, an definierten Orten des Trägers (sog. Spots) gebundene Moleküle einschließt. Dieser Träger, auf welchem die Moleküle gebunden sind, wird auch als Zielträger bezeichnet. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich einen hochdichten Molekülarray mit einem Rastermaß von < 300 μιη herzustellen. Dies bedeutet, dass der Abstand der einzelnen Spots, auch Pitch genannt, gemessen jeweils vom Mittelpunkt, < 300 μηι beträgt. Gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt das Rastermaß des Molekülarrays vorzugsweise < 200 μιτι, mehr bevorzugt < 150 μιη und besonders bevorzugt < 100 μιη.
Im Folgenden werden unter dem Begriff "Array" sowohl Träger, bei denen unterschiedliche Moleküle im Wesentlichen in nur zwei Dimensionen angeordnet sind, als auch poröse Träger oder Träger mit einer strukturierten Oberfläche verstanden, bei denen die unterschiedlichen Moleküle in einer zusätzlichen dritten Dimension vorliegen.
Ferner wird unter dem Begriff "diskreter Spot" ein Bereich eines (Ziel)-Trägers verstanden, der räumlich von benachbarten Spots getrennt ist. Dabei können gemäß der vorliegenden Erfindung die Spots sowohl aufgrund einer geometrischen Formgebung als auch aufgrund unterschiedlicher Oberflächeneigenschaften von den benachbarten Spots getrennt vorliegen. Beispielsweise können diese in Form dünner Trennwände oder mittels Stegstrukturen voneinander getrennt sein oder in Form von Vertiefungen vorliegen. Außerdem ist es möglich, dass die Spots beispielsweise aufgrund unterschiedlicher Benetzungseigenschaften der Oberfläche des Trägers als diskrete Bereiche vorliegen.
Wie bereits beschrieben, wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Strukturierung des Zielträgers mit unterschiedlichen Monomeren für die kombinatorische Synthese erreicht, indem Partikel mittels einer elektromagnetischen Strahlung an definierten Orten entfernt werden und somit den Zugang zu diesen Orten ermöglichen. Gemäß dieser Ausführungsform ist eine Vielzahl diskreter Spots des Zielträgers mit Partikeln belegt, die den Zugang zu diesen blockieren. Vorzugsweise weisen die diskreten Spots des Zielträgers Vertiefungen auf. Insbesondere wird als Zielträger ein Träger verwendet, der so mit Partikeln belegt ist, dass diese den Zugang zu definierten Orten auf dem Träger blockieren, d.h. die Vertiefungen abdecken. Diese Partikel werden im Folgenden auch Blockadepartikel genannt. Als Träger eignen sich insbesondere vorstrukturierte Träger mit Vertiefungen, in die ein oder mehrere Blockadepartikel möglichst genau hineinpassen. Da die Partikel unter anderem mit Hilfe von Kapillarkräften in den Vertiefungen festgehalten werden können, können die Vertiefungen von solchen vorstrukturierten Trägern besonders einfach und vollständig mit einem oder mehreren Partikeln) befüllt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung, sollten diese Blockadepartikel einerseits den Zugang zu den genannten Vertiefungen möglichst effizient blockieren, damit sich dort keine weiteren Partikel bzw. Stoffe ablagern können und andererseits müssen sie selektiv aus ausgewählten Vertiefungen entfernt werden können. Erfindungsgemäß erfolgt das Entfernen der Blockadepartikel durch eine elektromagnetische Strahlung, die vorzugsweise ein kurzer Laserpuls ist. Dadurch können anschließend diese freien Vertiefungen selektiv mit dem mindestens einen Monomer in Kontakt gebracht werden. Beispielsweise können die Vertiefungen mit Monomer- pärtikeln gefüllt werden. Diese enthalten geeignete Monomere oder Monomerge- mische für die kombinatorische Synthese der Zielmoleküle. Diese Monomerpartikel bestehen dabei im Wesentlichen aus einer Polymermatrix, in die geeignete chemische Bausteine bzw. Monomere für die kombinatorische Synthese von Molekül-, insbesondere von Peptid- oder von Oligonukleotidarrays, eingebettet sind.
Werden nun nacheinander Vertiefungen mit Hilfe des Lasers von Blockadepartikeln befreit, können die freien Vertiefungen mit jeweils unterschiedlichen Arten von Monomerpartikeln gefüllt werden, die sich insbesondere dadurch unterscheiden, dass sie unterschiedliche Arten von Monomeren für die kombinatorische Synthese enthalten.
Nach einer so erfolgten Strukturierung des Trägers mit Monomerpartikeln, müssen die für die kombinatorische Synthese von Molekül-, insbesondere von Peptid- oder Oligonukleotidarrays geeigneten Monomere, mobilisiert werden, sodass sie zur Trägeroberfläche diffundieren können, wo sie mit geeigneten funktionellen Gruppen abreagieren. Diese Mobilisierung kann beispielsweise wie in EP 1 140 977 B1 beschrieben erfolgen. Als Beispiele, wie die Monomere auf der Trägeroberfläche abreagieren können, seien C-terminal mit OPfp-Estern oder über Säureanhydride aktivierte Aminosäurenderivate, die mit freien Aminogruppen des Trägers reagieren, wodurch Peptidarrays entstehen, oder Phosphoramidite genannt, die mit OH- Gruppen abreagieren, wodurch Oligonukleotidarrays entstehen. Die vorstehend beschriebene Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist schematisch in Fig. 1 dargestellt.
Enthalten die Monomerpartikel Vorstufen von für eine kombinatorische Synthese geeigneten Monomeren, Dimeren oder Trimeren, so können durch ein oder mehrere weitere Zyklen von Kopplungsreaktionen die an den Träger gebundenen Moleküle um weitere Monomere, Dimere oder Trimere verlängert werden. Auch ist es möglich, durch ein oder mehrere weitere Zyklen von nicht notwendigerweise identischen Reaktionen die an den Träger gebundenen Moleküle zu modifizieren. Nach erfolgter Synthese können die Schutzgruppen von den synthetisierten Oli- gomeren abgespalten werden, wobei die synthetisierten Moleküle an dem Träger gebunden bleiben und gegebenenfalls für den nachfolgenden Kopplungsschritt zur Verfügung stehen.
Erfindungsgemäß kann auf im Stand der Technik bekannte Schutzgruppen- Techniken zurückgegriffen werden, die insbesondere im Bereich der Synthese von Biomolekülen wie Peptiden, Oligosacchariden oder Nukleotiden bzw. in der kombinatorischen Chemie im Allgemeinen etabliert sind. Das heißt gemäß der vorliegenden Erfindung können an geeigneter Stelle des Verfahrens eine oder mehrere Schutzgruppe(n), die gegebenenfalls in einem Monomer für die kombinatorische Synthese vorhanden sind, entfernt werden, um weitere Kopplungsschritte zu ermöglichen.
Als Polymermatrix werden gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise Polymere oder Copolymere aus (Meth)acrylaten und/oder Styrolen verwendet. Gemäß der vorliegenden Erfindung können als Zielträger unterschiedliche Materialien verwendet werden, wie beispielsweise Polystyrolfolien, Papier, CDs, MODs, DVDs oder FMDs. Insbesondere eignen sich funktionalisierte Glasträger, wie z.B. Glaswafer, die auf einer Oberfläche beispielsweise mittels lithographischem Verfahren eine Strukturierung aufweisen. Auch poröse Glasträger können erfindungsgemäß verwendet werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Vertiefungen des Zielträgers von den Blockadepartikeln derart blockiert, dass dieser Spot für hinzugefügte Monomere nicht mehr zugänglich ist, d.h. dass das jeweilige Monomer zum Beispiel auch durch Diffusion nicht in diese Vertiefungen eindringen kann. In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens müssen die von den Blockadepartikeln befreiten Spots nicht notwendigerweise mit Monomerpartikeln gefüllt werden, sondern stattdessen kann der Träger lokal oder vollständig mit einem geeigneten Monomer für die kombinatorische Synthese in Kontakt gebracht werden. Vorzugsweise werden diese Monomere in einem geeigneten Lösungsmittel auf den Träger aufgebracht, sodass sie über Konvektion, Diffusion oder über die Gasphase selektiv zu den von den Blockadepartikeln befreiten Vertiefungen gelangen können, wo sie mit geeigneten funktionellen Gruppen der dort immobilisierten Reaktanden abreagieren können. Als geeignete Lösungsmittel können beispielsweise Dimethylformamid, N-Methyl-2-pyrrolidon oder Dimethylsulfoxid für die Peptidsynthese oder Acetonitril für die Synthese von Oligonukleotiden genannt werden.
Bei dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden höhere Anforderungen an die Blockadepartikel gestellt, da die Blockadepartikel hier verhindern müssen, dass die bereits mobilisierten Monomere (im Gegensatz zu den erwähnten Monomerpartikeln) in die Vertiefungen gelangen, zum Beispiel indem sie durch die Blockadepartikel hindurch diffundieren. Dies kann zum Beispiel dadurch erreicht werden, dass die Blockadepartikel aus einem sehr dichten Material, wie etwa Siliziumdioxid, bestehen oder hinreichend stark quervernetzt sind, um eine Diffusion durch die Blockadepartikel hindurch zu unterbinden. Als Beispiel für Blockadepartikel aus quervernetztem Material können quervernetzte Polystyrolpartikel genannt werden.
Damit die Vertiefungen zuverlässig blockiert werden und keine Monomere an den Blockadepartikeln vorbei in die Vertiefungen gelangen, ist insbesondere eine enge Größenverteilung der Blockadepartikel notwendig. Weiterhin ist es möglich, den Durchmesser der Blockadepartikel nachträglich zu vergrößern, um die Vertiefungen dicht zu verschließen. Dies kann beispielsweise durch Aufquellen der Partikel in Lösungsmitteln oder durch Osmose erfolgen.
Besonderes bevorzugt sind Blockadepartikel mit einer sehr engen Größenverteilung, die zudem eine starke Oberflächenladung aufweisen. Diese starke Oberflächenladung bewirkt, dass die Partikel in polaren Lösungsmitteln eine große, weitgehend immobile Hülle aus polaren Molekülen tragen, wie beispielsweise eine Hydrathülle in Wasser, sodass sie im gequollenen Zustand den Zugang zu den genannten Vertiefungen wie ein Pfropfen sehr dicht verschließen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Blockadepartikel zusätzlich mit gegensätzlich geladenen Nanopartikeln weiter abgedichtet werden, bevor sie mit den genannten Monomeren für die kombinatorische Synthese in Kontakt gebracht werden.
Diese verschiedenen Möglichkeiten der Abdichtung können gemäß der vorliegenden Erfindung reversibel gestaltet werden, um nach der chemischen Kupplung eines ersten Monomers an ausgewählte erste Orte bzw. Spots, weitere Blockadepartikel an ausgewählten zweiten Orten bzw. Spots selektiv zu entfernen. Dazu können zugegebene Nanopartikel zunächst weggewaschen oder in Flüssigkeiten gequollene Blockadepartikel in Flüssigkeiten mit anderen Quellungsparametern inkubiert werden, sodass der Durchmesser dieser Partikel soweit schrumpft, dass sie verlässlich, mit elektromagnetischer Strahlung wie zum Beispiel mit einem Laserpuls aus der Vertiefung entfernt werden können. Es ist auch möglich, dass die gequollenen Blockadepartikel einfach getrocknet werden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform umfasst das vorstehend definierte Verfahren weiter einen Schritt (iv) des Ablagerns von Blockadepartikeln, um die zuvor freigelegten Spots erneut mit Blockadepartikeln zu belegen (wie schematisch in Fig. 2 dargestellt).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des vorstehend definierten Verfahrens werden die Schritte des Konditionierens der ausgewählten Spots (Schritt (ii)) und des Umsetzens des mindestens einen Monomers mit in den ausgewählten Spots des Zielträgers immobilisiert vorliegenden Reaktanden (Schritt (iii)) sowie gegebenenfalls des weiteren Ablagerns von Blockadepartikeln auf zuvor freigelegten Spots (Schritt (iv)) iterativ unter Verwendung jeweils gleicher oder verschiedener Monomere durchgeführt. Dadurch ist es möglich, kostengünstig und effizient hochdichte Molekülarrays herzustellen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Strukturierung des Zielträgers mit unterschiedlichen Monomeren für die kombinatorische Synthese erreicht, indem Partikel mittels elektromagnetischer Strahlung an definierten Orten fixiert und/oder zu definierten Orten transferiert werden.
Insbesondere umfasst diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Schritte des Bereitstellens eines Zielträgers mit einer Vielzahl an diskreten Spots, des Konditionierens ausgewählter Spots durch selektive und direkte Einwirkung elektromagnetischer Strahlung, und des Umsetzens mindestens eines Monomers mit in den ausgewählten Spots des Zielträgers immobilisiert vorliegenden Reaktanden, wobei mindestens ein Ausgangsträger mit einer Materialschicht in Form einer Partikelschicht oder Filmschicht bereitgestellt wird, in der das mindestens eine Monomer enthalten ist, und wobei der Schritt (ii) des Konditionierens ausgewählter Spots das selektive Übertragen von Material vom Ausgangsträger auf den Zielträger und das ortsgenaue Fixieren dieses Materials auf dem Zielträger umfasst, wobei das Übertragen und/oder Fixieren mittels elektromagnetischer Strahlung erfolgt. Bei diesem Verfahren wird ein Ausgangsträger verwendet, der gleichmäßig mit einer Partikelschicht, enthaltend Monomere für die kombinatorische Synthese von Molekülarrays, belegt ist. Diese Monomerpartikel bestehen dabei im Wesentlichen aus einer Polymermatrix, in die geeignete chemische Bausteine bzw. Monomere für die kombinatorische Synthese von Molekül-, insbesondere von Peptid- oder von Oligonukleotidarrays, eingebettet sind. Diese Monomere können zum Beispiel Aminosäurederivate zur Synthese von Peptidarrays sein.
Des Weiteren können den Monomerpartikeln weitere Stoffe zugesetzt werden, mit der Einschränkung, dass diese die kombinatorische Kupplungsreaktion nicht stören dürfen. Für die Peptidsynthese dürfen diese Bestandteile insbesondere keine NH2- oder SH-Gruppen enthalten, für die Oligonukleotidsynthese sollten sie zusätzlich auch keine OH-Gruppen enthalten. Beispielsweise können den Monomerpartikeln Eisenkomplexe zugesetzt werden, um die elektrische Aufladung der Monomerpartikel einzustellen oder Stoffe, die das Absorptionsverhalten beeinflussen. Diese Aufgabe kann durch eine Vielzahl von chemisch inerten und gleichzeitig Licht absorbierenden Substanzen übernommen werden, wie beispielsweise Graphitnanopartikeln, Fullerenen oder Bromphenolblau.
Alternativ zu einem Ausgangsträger mit einer Schicht aus Monomerpartikeln, kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein Ausgangsträger verwendet werden, der mit einem gleichmäßigen Monomerfilm belegt ist, der wie die Monomerpartikel aus einer Polymermatrix besteht, in den Monomere sowie gegebenenfalls weitere Stoffe wie Absorbermaterialien eingebettet sind. Bei ausreichender mechanischer Stabilität der Polymermatrix kann auch eine selbst tragende Folie oder ein Block aus den genannten Materialien eingesetzt werden.
Dabei können bei dieser Ausführungsform dieselben Materialien für die Polymermatrix wie vorstehend für die erste Ausführungsform beschrieben verwendet werden.
Wie bereits vorstehend beschrieben kann gemäß der vorliegenden Erfindung die Materialschicht auf dem Ausgangsträger in Form einer Partikelschicht oder Film- schicht vorliegen. In dieser Ausführungsform wird das Material mit den darin eingebetteten Monomeren selektive vom Ausgangsträger auf den Zielträger übertragen, wo dieses ortsgenaue fixiert wird. Das Übertragen des Materials, d.h. der in der Polymermatrix eingebetteten Monomere, ist gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf eine Partikelform beschränkt. Im Rahmen dieser Ausführungsform umfasst das Übertragen des Materials sowohl das Übertragen von Partikeln als auch das Übertragen des Materials in flüssiger oder gasförmiger Form.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Material mit den darin eingebetteten Monomeren von einem entsprechend präparierten Ausgangsträger mit Hilfe von elektromagnetischer Strahlung auf einen Zielträger übertragen und dort selektiv und ortsgenau fixiert. Erfindungsgemäß wird dieser Vorgang vorteilhaft mit unterschiedlichen Ausgangsträgern aber gleichem Zielträger wiederholt. Somit können auf einem Zielträger unterschiedliche Monomere an frei wählbaren Orten kombinatorisch ortsgenau fixiert werden. Diese Monomere gehen in einem weiteren Prozessschritt parallel eine chemische Reaktion mit auf dem Zielträger aufgebrachten funktionellen Gruppen ein. Dies sind insbesondere NH2-Gruppen für die Synthese von Peptidarrays oder OH-Gruppen für die Synthese von Oligonukleotidarrays. Die Kupplungsreaktion kann dadurch gestartet werden, dass die ortsgenau fixierten Materialien erhitzt werden oder durch eine Chemikalie gelöst werden, sodass die eingebetteten Monomere mobilisiert werden und zur Oberfläche des Trägers diffundieren können, wo sie mit den funktionellen Gruppen der dort immobilisierten Reaktanden abreagieren. Besonders vorteilhaft ist dieses Verfahren, wenn dabei die Diffusion der erwähnten Monomere eingeschränkt bleibt, indem die aufgebrachten Materialien eine ölige oder wachsähnliche Konsistenz einnehmen.
Die Vorbereitung der Ausgangsträger, das bedeutet die Erzeugung einer homogenen Schicht aus Monomerpartikeln oder eines Monomerfilms, kann auf verschiedene Arten erfolgen. Die Monomerpartikel können zum Beispiel aus einem Aerosol oder einer Suspension auf dem Ausgangsträger abgelagert werden. Die Monomerpartikel können von der Oberfläche einer Flüssigkeit abgehoben oder abgeschöpft werden oder mit einer Rakel oder einer Walze auf den Ausgangsträger aufgetragen werden. Sofern die Monomerpartikel elektrisch geladen sind, können elektrische Felder zur Ablagerung eingesetzt werden.
Die Beschichtung mit einem homogenen Film auf einem Träger kann zum Beispiel mit Hilfe von Rotationsbeschichtung oder durch den Einsatz einer Rakel oder Walze geschehen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Material des Ausgangsträgers nicht beschränkt und kann je nach Zielmolekül ausgewählt werden. Diese Materialien sind dem Fachmann bekannt und müssen daher nicht im Detail beschrieben werden. Als nichtbeschränkende Beispiele seien polymere, keramische oder metallische Materialien genannt. Beispielsweise können insbesondere Träger aus Poly- dimethylsiloxan vorteilhaft verwendet werden. Für den Zielträger wird auf vorstehende Ausführungen verwiesen.
Der Ausgangträger als auch der Zielträger können mit einer Strukturierung versehen sein, zum Beispiel mit Vertiefungen im Mikrometermaßstab. Diese Strukturierung kann den gezielten Materialtransfer ermöglichen oder verbessern/Weist der Ausgangsträger eine Strukturierung auf, so kann es sinnvoll sein, diesen nicht homogen mit einer Beschichtung zu überziehen, sondern die Beschichtung entsprechend der Strukturierung anzupassen, also zum Beispiel nur die Vertiefungen im Ausgangsträger mit Monomerpartikeln zu füllen. Durch das Auffüllen von Strukturen auf dem Ausgangsträger kann das zu übertragende Material portioniert werden, bis hin zu einzelnen Mikropartikeln pro Vertiefung.
Durch Strukturierung des Zielträgers kann eine örtliche Begrenzung des Übertrags stattfinden, sodass beim Übertrag beispielsweise nur einzelne oder eine bestimmte Anzahl von Strukturen auf dem Zielträger mit Material des Ausgangsträgers gefüllt oder bedeckt werden.
Für den Übertrag und die räumliche Fixierung des Materials sind verschiedene Mechanismen möglich, die im Folgenden im Detail beschrieben werden.
Erfindungsgemäß kann das Übertragen und Fixieren des Materials vom Aus- gangsträger auf den Zielträger durch das Inkontaktbringen des Ausgangsträgers mit dem Zielträger und das direkte oder indirekte Erwärmen der Partikel- oder Filmschicht durch die selektive und direkte Einwirkung der elektromagnetischen Strahlung erfolgen, wobei sich die Materialschicht zwischen den Trägern befindet.
Dabei wird ein fester Ausgangsträger, belegt mit einer Schicht aus Monomerpartikeln oder einem Monomerfilm, in Kontakt mit einem festen Zielträger gebracht, sodass sich die Beschichtung zwischen den beiden Trägern befindet. Mit elektromagnetischer Strahlung wird selektiv an bestimmen Orten Energie eingebracht. Das Matrixmaterial mitsamt den darin enthaltenen Substanzen wird auf dem Zielträger fixiert.
Durch geeignete Wahl der Einstrahlrichtung, der Materialien und der Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung werden die Monomerpartikel oder der Monomerfilm entweder direkt erwärmt oder indirekt erwärmt, indem einer oder beide Träger durch die Strahlung erwärmt werden. Ein indirektes Erwärmen der Partikel oder des Films kann auch erreicht werden, indem dieser mit einem Zusatz, wie zum Beispiel Graphitnanopartikeln, vermischt wird, der als Absorber dient. Das fixierte Material verbleibt nach der Trennung der beiden Träger am Zielträger.
Vorzugsweise kann der Träger auch aus einem flexiblen Material gefertigt sein, um einen besseren Kontakt zu gewährleisten. Durch die chemische Modifikation und/oder Nano- und/oder Mikrostrukturierung der Trägeroberflächen kann erreicht werden, dass die erwärmten Partikel bzw. das Material des Films vorzugsweise am Zielträger haftet.
Um die Kontaktfläche des Zielträgers mit der Beschichtung des Ausgangsträgers zu vergrößern können der Zielträger und/oder der Ausgangsträger Vibrationen ausgesetzt werden oder zu mechanischen Schwingungen angeregt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Übertragen und Fixieren des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger auch ohne direkten Kontakt der Träger erfolgen. Insbesondere kann das Übertragen des Materials vom Ausgangs- träger auf den Zielträger durch Ablationsmechanismen erfolgen. Zum Beispiel indem durch elektromagnetische Strahlung ein Teil der Monomerpartikel, des Mo- nomerfilms, des Ausgangsträgers oder eines speziellen Zusatzes verdampft wird, sodass durch die Volumenausdehnung, Material vom Ausgangsträger auf den Zielträger befördert wird. Wie bereits beschrieben, ist in diesem Fall ein direkter Kontakt zwischen dem Ausgangsträger und dem Zielträger nicht zwangsweise notwendig, jedoch nicht ausgeschlossen.
Auf dem Zielträger wird das übertragene Material fixiert, indem durch elektromagnetische Strahlung lokal begrenzt Energie eingebracht wird. Wie bereits beschrieben, findet eine direkte oder indirekte Erwärmung des Materials statt. Hierfür können die Parameter der Strahlenquelle wie Wellenlänge, Energie, Pulsdauer, Fokusgröße und Fokusebene geändert werden oder es wird eine geeignete zweite Strahlenquelle verwendet.
Alternativ wird eine Fixierung des Materials auf dem Zielträger allein durch geeignete Wahl des Polymermatrixmaterials und/oder des Zielträgermaterials erreicht, sodass diese bei Kontakt aneinander haften oder kleben.
Das Übertragen des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger kann auch dadurch erfolgen, dass Monomerpartikel bzw. das Material eines Monomerfilms vom Ausgangsträger durch einen von Photonen übertragenen Impuls abgelöst und in Richtung des Zielträgers bewegt werden bzw. wird. Alternativ können durch den Impuls Teile des Ausgangsträgers und/oder zugemischte Zusätze beschleunigt werden, die wiederum ihren Impuls weitergeben. Die Fixierung des Materials auf dem Zielträger erfolgt wie vorstehend beschrieben.
Erfindungsgemäß kann der Übertrag des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger auch anhand des Prinzips der optischen Pinzette erfolgen. Das bedeutet beispielsweise, die Monomerpartikel sind für die verwendete Wellenlänge der Strahlenquelle transparent und werden durch den Impulsübertrag der Photonen bei Brechung an den Partikeln festgehalten oder bewegt. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Übertrag des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger auch dadurch erfolgen bzw. unterstützt werden, dass zwischen den beiden Trägern ein elektrisches Feld erzeugt wird. In diesem Fall muss das Matrixmaterial vorher durch ein geeignetes Verfahren beispielsweise triboelektrisch oder durch einen Coronadraht elektrisch aufgeladen werden, wodurch im Falle von Monomerpartikeln diese durch die elektrische Kraft in Richtung des Zielträgers gesteuert werden.
Ferner kann der Übertrag des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger auch dadurch erfolgen bzw. unterstützt werden, dass zwischen den beiden Trägern ein magnetisches Feld erzeugt wird. In diesem Fall muss das Matrixmaterial einen magnetischen Bestandteil, wie beispielsweise Magnetit, enthalten. In diesem Fall werden beispielsweise die Monomerpartikel durch die magnetische Kraft in Richtung des Magnetfeldgradienten gesteuert.
Um Adhäsionskräfte zwischen den Monomerpartikeln und/oder zwischen dem Matrixmaterial und Trägern zu verringern und den Übertrag zu erleichtern, ist es bevorzugt, dass der Raum zwischen den Trägern und/oder zwischen den Monomerpartikeln mit einer Flüssigkeit gefüllt ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Prinzipien der kombinatorischen Strukturierung von Partikeln, bei welchen mittels elektromagnetischer Strahlung zunächst Blockadepartikel auf dem Zielträger selektiv entfernt werden, um den Zugang zu diesen Spots zu ermöglichen, oder das selektive Übertragen und Fixieren des Materials, das das mindestens eine Monomer enthält, von einem Ausgangsträger auf den Zielträger, zudem vorteilhaft kombiniert werden.
Als Quelle für die verwendete elektromagnetische Strahlung sind insbesondere Laser geeignet. Um die Strahlung ortsgenau auf einen Punkt zu fokussieren ist ein geeignetes Linsensystem notwendig. Es können der Zielträger und/oder der Ausgangsträger gegenüber der Strahlenquelle mechanisch verfahren werden oder die elektromagnetische Strahlung wird über geeignete Spiegel positioniert. Dies hat den Vorteil, dass pro Zeiteinheit eine größere Anzahl von Punkten bearbeitet wer- den kann.
Um die Geschwindigkeit des Verfahrens zu erhöhen kann vorzugsweise parallel mit mehreren Strahlenquellen gearbeitet werden oder der Strahl einer Strahlenquelle wird über ein geeignetes System, wie beispielsweise einem Linsenarray oder einem Spiegelarray, in mindestens zwei Teilstrahlen aufgespaltet. Die Teilstrahlen können individuell in ihrer Intensität moduliert werden.
Erfindungsgemäß wird ferner ein hochdichter Molekülarray mit einem Rastermaß von < 300 pm bereitgestellt, der mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhältlich ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt das Rastermaß des Mo- leküjarrays vorzugsweise < 200 pm, mehr bevorzugt < 150 pm und besonders bevorzugt < 100 pm.
Wie vorstehend erwähnt handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Arrays vorzugsweise um Peptid- oder Oligonukleotidarrays, insbesondere um Peptidarrays.
Die vorliegende Erfindung basiert darauf, Partikel auf einem Träger mit Hilfe elektromagnetischer Strahlung zu strukturieren, um die kombinatorische Synthese von hochdichten Molekül-, insbesondere von Peptid- oder Oligonukleotidarrays zu ermöglichen. Die elektromagnetische Strahlung wirkt dabei direkt auf die Partikel ein und steuert somit die Kraft bei, mit der die Partikel bewegt werden. In einer Ausführungsform werden Partikel selektiv von einem Träger entfernt, sodass die freien Orte (Spots) nun zugänglich für Monomere zur Synthese von Molekül-, insbesondere von Peptid- oder Oligonukleotidarrays werden. Die Monomere können entweder in einer Flüssigkeit, in der Gasphase oder als Monomerpartikel an diese Orte gebracht werden. Gemäß einer anderen Ausführungsform werden die Monomere als Monomerpartikel direkt strukturiert, indem Monomerpartikel direkt auf die Spots eines Trägers transferiert und dort selektiv fixiert werden.
Da das kleinste Rastermaß für die Partikelablagerung nur von der Partikelgröße, dem Fokusdurchmesser der elektromagnetischen Strahlung und der Größe etwai- ger Strukturen auf dem Träger, wie zum Beispiel Vertiefungen, begrenzt ist, können vorteilhaft Partikelmuster mit einem Raster < 300 μιτι, insbesondere bis zu < 100 μιτι realisiert werden.
Zudem besteht erfindungsgemäß eine sehr hohe Flexibilität gegenüber der Anzahl der verwendeten chemischen Bausteine. Wird deren Anzahl erhöht, so lässt sich dies ohne zusätzlich Aufwand, beispielsweise bezüglich der Kalibrierung, in das bestehende Verfahren einbinden.
In der vorliegenden Erfindung werden keine Partikelreservoirs verwendet. Die Ablagerung von Blockadepartikeln auf einem Träger bzw. die Beschichtung mit Monomerpartikeln oder einem Monomerfilm erfolgt in einem separaten Prozessschritt. So können zum Beispiel ungenügend beschichtete Träger aussortiert oder erneut bearbeitet werden. Probleme und Verzögerungen im Prozess, hervorgerufen durch Schwankungen in der Beschichtungsqualität, wie sie insbesondere bei der selektiven Beschichtung der Hochspannungs-CMOS-Chips auftreten, können so vorteilhaft eliminiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird somit sehr robust.
Darüber hinaus ist die Fläche der erzeugten Partikelmuster prinzipiell nicht begrenzt, da über die Ablenkung der elektromagnetischen Strahlung mit Spiegeln, sowie mechanisches Verfahren prinzipiell auch sehr große Träger bearbeitet werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert die Vorteile lithographischer Methoden (sehr kleine Strukturen, die zu sehr kleinen Peptid- oder Oligonukleotidspots führen) und der partikelbasierten Methoden (einfache Strukturierung über größere Flächen auf Grund von Selbstorganisation möglich; Robustheit; zeitliche und räumliche Trennung der Strukturierung und der Kupplungsreaktion an den Träger), vermeidet aber gleichzeitig deren Nachteile (Nebenreaktionen auf Grund der vielen sequenziell durchgeführten Kupplungsreaktionen bei den lithographischen Techniken bzw. große Raster bei den bisherigen partikelbasierten Techniken). Da die vorliegende Erfindung es ermöglicht, Partikelmuster mit einem sehr kleinen Rastermaß, das heißt mit sehr hoher Auflösung und auf einer sehr großen Fläche herzustellen, können die dadurch erzeugten Molekülarrays somit äußerst effizient in Hochdurchsatzscreenings eingesetzt werden. Bei den Hochdurchsatzscree- nings kommt es maßgeblich darauf an, möglichst viele verschiedene Moleküle parallel und kostengünstig auf gewisse Eigenschaften zu untersuchen.
Durch die praktisch unbegrenzte Anzahl von Monomeren, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, kann die Vielfalt der erzeugten Molekülarrays erhöht werden, was diese wiederum interessanter für verschiedenste Hochdurchsatzscreenings macht.
Die vorliegende Erfindung sowie weitere sich daraus ergebende Vorteile werden in der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die in den Beispielen beschriebenen Ausführungsformen näher erläutert.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 A) Ein Träger mit Vertiefungen, der für die kombinatorische Synthese von Peptid- oder Oligonukleotidarrays geeignet ist, wird in Kontakt mit chemisch inerten Blockadepartikeln gebracht. B) Die Blockadepartikel werden in den Vertiefungen abgelagert. C) Mit einem Laser werden Blockadepartikel aus ausgewählten Vertiefungen entfernt, um dort im nächsten Schritt die Ablagerung von Monomerpartikeln zu ermöglichen.
Fig. 2 A) Die Vertiefungen eines Trägers besitzen funktionale Gruppen, die mit Monomeren für die kombinatorische Synthese von Oligonukleotiden oder Peptiden abreagieren können. Ein Laser hat die grauen Blockadepartikel aus einigen Vertiefungen entfernt, sodass die dadurch freigelegten Orte mit den aktivierten Monomeren in Kontakt treten können. B) Die Monomere kuppeln an die freigelegten Vertiefungen. C) Anschließend werden die Vertiefungen wieder mit Blockadepartikeln befüllt. D) Dieser Vorgang wird für weitere Vertiefungen mit anderen Monomeren wiederholt. E) Wird die transiente Schutzgruppe (z.B. Fmoc oder tBoc im Falle von Peptidarrays oder Trityl im Falle von Oligonukleotidarrays) danach entfernt, so kann eine weitere Schicht von Monomeren an die bereits aufgebrachten Monomeren kuppeln (Merrifieldsynthese).
Fig. 3 Einbringen von Partikeln in die Vertiefungen eines strukturierten Trägers.
A) Blau gefärbte Partikel aus Polystyrol (wiedergegeben als dunkle Partikel), Durchmesser 4,2±0, 1 1 μιη (Micro Particles GmbH); B) Strukturierter Träger mit zylinderförmigen Vertiefungen, Durchmesser 6 μιη, Pitch 10 im; C) Die Vertiefungen wurden vollständig mit Partikeln befüllt.
Fig. 4 A) SU-8-Vertiefungen, Durchmesser 20 μιη, gefüllt mit roten Polystyrolpartikeln (wiedergegeben als dunkle Partikel), Durchmesser 10 μηι; B) Vertiefungen wurden selektiv mit einem gepulsten Laser entleert, so dass sich der Schriftzug "KIT" ergibt (spiegelverkehrt, da Durchlichtaufnahme); C) Freie Vertiefungen wurden mit blauen Polystyrolpartikeln gefüllt, während die anderen Vertiefungen durch die roten Partikel blockiert waren; D) Detailaufnahme des kombinatorischen Musters aus roten und blauen Partikeln (Vertiefungen mit blauen Partikeln sind zur Verdeutlichung mit , *" gekennzeichnet).
Fig. 5 Übertrag von Material aus einer Partikelschicht von einem PDMS-Aus- gangsträger auf einen Zielträger, A) Ausgangsträger und Zielträger befinden sich in Kontakt, Punktmuster wurde durch Erhitzen mit einem Laser erzeugt, B) Zielträger mit übertragenem Material, C) Zielträger befindet sich in Kontakt mit zweitem Ausgangsträger, ein zweites Punktmuster wurde durch Erhitzen mit einem Laser erzeugt, D) Zielträger mit Material aus dem erstem und dem zweitem Übertrag.
Fig. 6 Zielträger vor (links) und nach (rechts) dem Reinigen in einem Ultraschallbad. Kontaminationen in nicht bestrahlten Bereichen konnten so deutlich reduziert werden. Fig. 7 A) Zielträger mit Partikelschicht, die mit Hilfe eines elektrischen Feldes vom Ausgangsträger übertragen wurde. Bestimmte Bereiche wurden selektiv mit dem Laser fixiert, B) nach Entfernen der Partikelschicht mit Druckluft.
Fig. 8 Fluoreszenzmarkierte Peptide (HA: hell, FLAG: dunkel), Synthetisiert mit Hilfe der laserbasierten Partikelstrukturierung, links: KIT aus FLAG-Spots mit Rahmen aus HA-Spots, rechts: FLAG und HA im Schachbrettmuster.
Fig. 9 Übertrag von Aminosäurederivaten eingebettet in eine Copolymer Matrix, aus einem festen Monomerfilm auf einen Zielträger aus Glas, A) Ausgangsträger: Auflichtmikroskopaufnahme, Monomerfilm mit fehlendem Material, B) Zielträger: Durchlichtmikroskopaufnahme, Glasträger mit Muster aus übertragenem Material.
Fig. 10 Laserablation mit einem gepulstem Laser, A) Ausgangsträger mit Partikelschicht, B) Zielträger mit ortsgenau übertragenen Monomerpartikeln.
Fig. 11 Übertrag von Partikeln zwischen zwei strukturierten Trägern; A) Träger mit zylinderförmigen Vertiefungen, Durchmesser 70 μιτη, Pitch 100 μιη, Tiefe ca. 40 [im; B) Vertiefungen gefüllt mit Partikeln; C) strukturierter Ausgangsträger nach Laserübertrag, 5x5 Vertiefungen sind teilweise entleert, D) strukturierter Zielträger nach Laserübertrag, 5x5 Strukturen sind mit Partikeln gefüllt.
Beispiele
In den folgenden Beispielen werden Experimente zum Konzept der Blockadepartikel (siehe (1 ) und (2), verschiedene Experimente zum Übertrag von Monomerpartikeln (siehe (3), (4), (7) und (8)) sowie zum Übertrag von Material aus einem Monomerfilm (siehe (6)) gezeigt. Zudem wird gezeigt, dass die mit dem Laser strukturierten Monomerpartikel mit Aminosäurederivaten für die Synthese von Peptiden verwendet werden können (siehe (5)). (1) Ablagern von Partikeln in Vertiefungen
Kommerziell erworbene Polystyrolpartikel mit einem Durchmesser von 4,2±0,11 pm (siehe Fig. 3A) wurden in einer wässrigen Suspension auf einen strukturierten Träger (siehe Fig. 3B) aufgetragen. Bei dem Träger handelt es sich um einen Glaswafer auf dem in einem lithographischen Verfahren der Fotolack SU-8 strukturiert wurde. Es wurde ein regelmäßiges Muster aus zylinderförmigen Vertiefungen erzeugt. Der Durchmesser der Vertiefungen beträgt 6 μιτι und der Mittepunkt zu Mittelpunkt Abstand (auch Pitch genannt) beträgt 10 pm. Die Vertiefungen sind ca. 17 pm tief, dies entspricht der Dicke der SU-8-Schicht auf dem Glaswafer. Wie in Fig. 3D zu sehen, werden die Vertiefungen des Trägers zuverlässig mit den Polystyrolpartikeln befüllt. Ein selektives Entleeren der Strukturen mit einem gepulsten Laser ist nun möglich (siehe auch Abschnitt 2).
(2) Kombinatorisches Muster aus verschiedenen Partikeln
Kommerziell erworbene rot gefärbte Polystyrolpartikel mit einem Durchmesser von 10 pm wurden in einer wässrigen Suspension auf einen strukturierten Träger aufgetragen (siehe Fig. 4A). Bei dem Träger handelt es sich um einen Glaswafer auf dem in einem lithographischen Verfahren der Fotolack SU-8 strukturiert wurde. Es wurde ein regelmäßiges Muster aus zylinderförmigen Vertiefungen mit Durchmesser 20 pm, Pitch 50 pm und Tiefe ca. 40 pm erzeugt. Da Durchmesser und Tiefe der Vertiefungen deutlich größer sind als der Durchmesser der Partikel, liegen in jeder Vertiefung mehrere Partikeln. Einzelne Vertiefungen wurden selektiv mit einem gepulsten Laser entleert, so dass sich, wie in Fig. 4B zu sehen, der Schriftzug "KIT" ergibt. Im nächsten Schritt wurden blau gefärbte Polystyrolpartikel (Durchmesser 10 pm) aus wässriger Suspension aufgebracht. Die roten Polystyrolpartikel fungierten als Blockadepartikel und verhinderten ein Ablagern der blauen Polystyrolpartikel, so dass sich diese nur in den freien Vertiefungen absetzen konnten (siehe Fig. 4C und D). (3) Kombinatorischer Übertrag von Monomerpartikeln von einem PDMS Ausgangsträger auf einen Glasobjektträger
Monomerpartikel (mittlerer Durchmesser ca. 8,8 pm) bestehend aus einem Styrol- Acrylat-Copolymer und Graphitnanopartikeln wurden aus einem Aerosol auf einem Träger aus Polydimethylsiloxan (PDMS) abgelagert. Dieser Träger diente als Ausgangsträger und wurde mit leichtem mechanischem Druck in Kontakt mit einem Zielträger aus Glas gebracht. Mit einem Laser (Wellenlänge 810 nm, Leistung bis 100 mW, Fokusdurchmesser 7,5 pm) wurden bestimmte Bereiche selektiv für jeweils 10 ms erhitzt (siehe Fig. 5A). Wie in Fig. 5B zu erkennen ist, verbleiben nach Trennung der beiden Träger die geschmolzenen Bereiche auf dem Zielträger. Mit einem zweiten Ausgangsträger wurden diese Schritte erfolgreich wiederholt (Fig.5C und D). Insgesamt wurden so ca. 85 % der bestrahlten Spots übertragen.
Partikelkontaminationen in den nicht bestrahlten Bereichen des Zielträgers wurden zwischendurch mit Druckluft entfernt, was aber nicht vollständig gelang. Stattdessen kann dafür, wie in Fig. 6 gezeigt, auch ein Ultraschallbad eingesetzt werden, womit eine fast vollständige Entfernung der Kontaminationen erzielt wird.
(4) Übertrag von Mikropartikeln mit Hilfe eines elektrischen Feldes und selektives Fixieren mit Laserstrahlung
Monomerpartikel (mittlerer Durchmesser ca. 8,8 pm) aus einem Styrol-Acrylat- Copolymer und Graphitnanopartikeln wurden aus einem Aerosol auf einen Ausgangsträger aus Glas aufgetragen. Durch die auftretende Reibung im Aerosolgenerator wurden die Partikel elektrisch geladen. Anschließend wurde parallel zum Ausgangsträger im Abstand von ca. 160 pm der Zielträger aus Glas positioniert. Durch das Anlegen eines elektrischen Feldes wurde ein Teil der Partikel auf den Zielträger übertragen, sodass sich auf diesem eine geschlossene Partikelschicht befand. Mit einem Laser wurden selektiv bestimmte Bereiche der Partikelschicht bestrahlt (siehe Fig. 7A). Anschließend wurde die Partikelschicht auf dem Zielträger mit Druckluft entfernt. Die erhitzten Bereiche der Partikelschicht verblieben auf dem Zielträger (siehe Fig. 7B). Dieses Prinzip konnte ein zweites Mal wiederholt werden, wobei andere Bereiche des Zielträgers bestrahlt wurden.
(5) Kombinatorische Synthese von Peptiden mit laserstrukturierten Monomerpartikeln
Es konnte experimentell gezeigt werden, dass es möglich ist, mit Hilfe von Aminosäurepartikeln, die mit einem Laser auf einem Substrat strukturiert wurden, Peptide zu synthetisieren.
Für das Experiment wurden die beiden Peptide FLAG (Aminosäuresequenz: Asp- Tyr-Lys-Asp- Asp-Asp-Asp-Lys) und HA (Aminosäuresequenz: Tyr-Pro-Tyr-Asp- Val-Pro-Asp-Tyr-Ala) ausgewählt. Monomerpartikel (mittlerer Durchmesser ca. 5 pm) hergestellt aus einem Styrol-Acrylat-Copolymer als Matrix, Aminosäurederivaten und Graphit als Absorber, wurden aus dem Aerosol auf einem funktio- nalisierten Glasträger abgelagert. Mit einem Laser (Wellenlänge 810 nm, Leistung bis 100 mW, Fokusdurchmesser 7,5 pm, Pulsdauer 10 ms) wurden die Partikel selektiv erhitzt und so auf dem Träger fixiert. Nicht fixierte Partikel wurden mit Druckluft entfernt.
Diese Laserstrukturierung wurde mit den entsprechenden Monomerpartikeln für die erste Aminosäure des FLAG-Peptids, sowie für die erste Aminosäure des HA- Peptids durchgeführt. Anschließend wurde der Träger in Stickstoffatmosphäre für 90 min auf 90°C erhitzt. Die Aminosäurederivate in der Matrix diffundieren in dieser Zeit zum Substrat und kuppeln dort chemisch an die vorhandenen NH2- Gruppen.
Die Copolymermatrix, überschüssige Aminosäuren sowie alle anderen Bestandteile wurden anschließend durch Waschen mit Dimethylformamid (DMF) entfernt. Noch freie NH2-Gruppen wurden blockiert und anschließend die Fmoc- Schutzgruppen an den C-terminalen Enden der Aminosäuren entfernt. Der Prozess wurde mehrmals, mit denen der Sequenz entsprechenden Aminosäuren, durchlaufen, bis die Peptide vollständig synthetisiert waren. Zur Kontrolle der Syntheseprodukte wurde der Träger anschließend mit fluoreszenzmarkierten Anti- HA-Antikörpern (grüne Färbung in Fig. 8) sowie mit fluoreszenzmarkierten Anit- FLAG-Antikörpern (gelbe Färbung in Fig. 8) markiert.
(6) Übertrag von Material aus einem zusammenhängenden Film
Anstatt von Monomerpartikeln wurde in diesem Experiment ein zusammenhängender Monomerfilm auf einem Ausgangsträger aus Glas erzeugt, indem ein Gemisch aus Styrol-Acrylat-Copolymer, Fmo-Glycin-Opfp-Ester und Graphitnano- partikeln erhitzt und glatt gezogen wurde. Dieser Ausgangsträger wurde nach dem Abkühlen in Kontakt mit dem Zielglasträger gebracht und mit einem Laser (Wellenlänge 810 nm, Leistung 100 mW, Pulsdauer 10 ms, Laserfokusdurchmesser 7,5 pm) bestrahlt. Nach Trennung der beiden Träger ist deutlich zu erkennen, dass erfolgreich Material aus dem Monomerfilm (siehe Fig. 9A) auf den Zielträger (siehe Fig. 9B) transferiert wurde.
(7) Ablation und Transfer von Monomerpartikeln mit Laserpulsen
Ein Ausgangsträger aus Glas bedeckt mit einer Schicht aus Schicht aus Monomerpartikeln, wurde Laserpulsen (Wellenlänge 532 nm, Pulsenergie ca. 50 pJ, Pulsdauer ca. 10 ns) ausgesetzt. Monomerpartikel aus der Schicht konnten so abgetragen werden (siehe Fig. 10A). Ein zweiter Glasobjektträger, der im Abstand von etwa 170 pm positioniert wurde, diente als Zielträger, auf dem sich die Partikel wieder absetzen (siehe Fig. 10B).
(8) Übertrag zwischen zwei strukturierten Trägern
In diesem Experiment wurde gezeigt, dass es möglich ist mit einem Laser gezielt Partikel von einem strukturierten Ausgangsträger auf einen strukturierten Zielträger zu übertragen. Bei den Trägern handelt es sich um Glaswafer auf denen in einem lithographischen Verfahren der Fotolack SU-8 strukturiert wurde. Es wurden ein regelmäßiges Muster aus zylinderförmigen Vertiefungen erzeugt (siehe Fig. 11A). Der Durchmesser der Vertiefungen beträgt 70 pm und der Mittepunkt zu Mittelpunkt Abstand (Pitch) beträgt 100 pm. Die Vertiefungen sind ca. 40 pm tief, dies entspricht der Dicke der SU-8-Schicht auf dem Glaswafer. Die Vertiefungen des Ausgangsträgers wurden mit einer Rakel mit Partikeln aus einem Styrol-Acrylat- Copolymer und 2% Graphit befüllt (mittlerer Durchmesser 2,5 pm, Herstellung mittels Sprühtrocknung) und die Trägeroberfläche von überschüssigen Partikeln gereinigt (siehe Fig. 11 B). Der Ausgangsträger wurde auf einem Zielträger positioniert und beide Lochraster in Übereinstimmung gebracht. Anschließend wurden 5x5 Strukturen von oben mit einen gepulsten Laser bearbeitet (Wellenlänge 532 nm, Pulsenergie ca. 50 pJ, Pulsdauer ca. 10 ns). Dadurch wurden die Vertiefungen des Ausgangsträgers teilweise geleert (siehe Fig. 11C) und die Vertiefungen des Zielträgers gefüllt (siehe Fig. 11 D).

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von hochdichten Molekülarrays mit einem Rastermaß von < 300 μιτι, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
(i) das Bereitstellen eines Zielträgers mit einer Vielzahl an diskreten Spots,
(ii) das Konditionieren ausgewählter Spots durch selektive und direkte Einwirkung elektromagnetischer Strahlung, und
(iii) das Umsetzen mindestens eines Monomers mit in den ausgewählten Spots des Zielträgers immobilisiert vorliegenden Reaktanden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Vielzahl diskreter Spots des Zielträgers mit Blockadepartikeln belegt ist, die den Zugang zu diesen blockieren, und wobei der Schritt (ii) des Konditionierens ausgewählter Spots das selektive Entfernen der in diesen Spots angeordneten Blockadepartikeln mittels elektromagnetischer Strahlung umfasst, wodurch der Zugang für das mindestens eine Monomer zu diesen ausgewählten Spots ermöglicht wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die diskreten Spots des Zielträgers Vertiefungen aufweisen, welche durch die Blockadepartikel abgedeckt werden können.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das mindestens eine Monomer in Form eines Monomerpartikels bereitgestellt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Monomerpartikel das mindestens eine Monomer und gegebenenfalls weitere Substanzen in einer Polymermatrix umfasst.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, weiter umfassend einen Schritt (iv) des Ablagerns von Blockadepartikeln, um die zuvor freigelegten Spots erneut mit Blockadepartikeln zu belegen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Schritte (ii) und (iii) und gegebenenfalls (iv) iterativ unter Verwendung jeweils gleicher oder verschiedener Monomere durchgeführt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei mindestens ein Ausgangsträger mit einer Materialschicht in Form einer Partikelschicht oder Filmschicht bereitgestellt wird, in der das mindestens eine Monomer enthalten ist, und wobei der Schritt (ii) des Konditionierens ausgewählter Spots das selektive Übertragen von Material vom Ausgangsträger auf den Zielträger und das ortsgenaue Fixieren dieses Materials auf dem Zielträger umfasst, wobei das Übertragen und/oder Fixieren mittels elektromagnetischer Strahlung erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Übertragen von Material vom Ausgangsträger und das Fixieren auf dem Zielträger durch das Inkontaktbrin- gen des Ausgangsträgers mit dem Zielträger und das direkte oder indirekte Erwärmen der Partikel- oder Filmschicht durch die selektive und direkte Einwirkung der elektromagnetischen Strahlung erfolgt, wobei sich die Materialschicht zwischen den Trägern befindet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Ausgangsträger und/oder der Zielträger aus einem flexiblen Material besteht.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei der Ausgangsträger und/oder der Zielträger während des Inkontaktbringens Vibrationen ausgesetzt sind bzw. ist oder zu mechanischen Schwingungen angeregt werden bzw. wird.
12. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Übertragen und Fixieren des Materials vom Ausgangsträger auf den Zielträger ohne direkten Kontakt der Träger erfolgt, und wobei das Übertragen des Materials durch einen oder mehrere der Mechanismen, umfassend Ablation, Ablösen des Materials durch einen von Photonen übertragenen Impuls, Prinzip der optischen Pinzette, Erzeugen eines elektrischen und/oder magnetischen Feldes zwischen den Trägern, erfolgen kann.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Fixieren des übertragenen Materials auf dem Zielträger durch direktes oder indirektes Erwärmen des Materials oder durch geeignete Wahl des Materials und/oder des Zielträgermaterials erfolgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, wobei die Schritte (ii) und (iii) mit gleichen oder verschiedenen Ausgangsträgern iterativ durchgeführt werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, wobei ein Raum zwischen den Trägern und/oder zwischen Monomerpartikeln mit einer Flüssigkeit gefüllt ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die elektromagnetische Strahlung Laserlicht umfasst.
17. Molekülarray mit einem Rastermaß von < 300 μηι, erhältlich gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
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