JP6502319B2 - 高密度分子アレイ、特にペプチドアレイを作製する組み合わせ粒子操作の方法、及びそれを用いて得ることができる分子アレイ - Google Patents

Description

本発明は高密度分子アレイを作製する組み合わせ粒子操作（combinatorial particle manipulation：コンビナトリアル粒子操作）の方法、及びそれにより得られる高密度分子アレイに関する。特に、本発明は高密度分子アレイ、特にペプチド又はオリゴヌクレオチドアレイを粒子の組み合わせパターニングによって作製する方法であって、パターニングを電磁放射の選択的かつ直接的な作用によって達成する、方法に関する。

マイクロアレイ技術では、多数の異なる分子が固定化形態で基板表面上に所定のパターンで配置される。

この技術は非常に多数の異なる物質に対する分析及び／又は化学反応を行うことを可能にし、好ましくはバイオテクノロジー研究及び製薬業界においてハイスループットスクリーニングに用いられる。

このことは、その特性、特に互いに対する相互作用が複雑であることが多いため、実験的にしか研究することができないより大きな分子の合成に特に有利である。組み合わせ化学では、かかる分子アレイによってその上で合成された全ての生成物を特定の特性について並行して試験することが可能である。ペプチドアレイの場合、これらは例えば抗体相互作用であり得る。しかしながら、かかる分子アレイを高品質かつ所要の分解能で作製する方法は存在しない。

ｉｎ ｓｉｔｕペプチドアレイの作製は非特許文献１で初めて記載されており、ここでは固相結合ペプチド合成（メリフィールド合成）が用いられている。この目的で、２０個の異なるアミノ酸誘導体が溶媒中でアミノ末端を有する基板の規定のスポットに施され、それにより組み合わせ合成において多数のペプチドが並んで多層状に蓄積される。しかしながら、この「スポット合成」の欠点は、これまで１ｃｍ^２当たりおよそ２５個のペプチドの合成しか可能でなかったということである。この理由は、小さな液滴は計量が非常に困難であることから、必要とされる粘性の溶媒が表面に「広がり」、これらの小滴がカップリング反応中に比較長時間蒸発しないためである。

従来技術では近年、ペプチドアレイを作製する様々な方法が提案されている。既存のシステムは粒子の組み合わせ堆積のためのゼログラフィーに基づく。使用される粒子はアミノ酸誘導体を含む。このため、非特許文献２に記載されるように粒子ベースの（particle-based：粒子に基づく）合成用の特別なレーザープリンターを用いてペプチドアレイを作製することが可能であり、特許文献１又は特許文献２にも記載されているように、それによりＬＥＤラインの光パターンが初めにフォトローラー上に帯電パターンを生成する。摩擦電気的に帯電された粒子がフォトローラーの逆帯電した領域上に堆積し、粒子パターンが形成される。この粒子パターンがフォトローラーから基板へと転写される。次いで、粒子が加熱によって基板に固定される。しかしながら、かかる方法は粒子を直接パターニングするものではない。

ペプチドアレイの粒子ベースの合成及び作製用の上記のレーザープリンターは、商業的に成功することが既に証明されているが、かかるプリンターではピッチ、すなわちスポットの中点間距離が３５０μｍの粒子パターンしか達成することができない。さらに、合成に使用することができるモノマーの数はレーザープリンターの印刷ユニットの数によって制限される。印刷ユニットを互いに正確に整列させなければならいため、欠陥への感受性は印刷ユニット毎に増大する。プリンターの複雑性も更なる印刷ユニット毎に増大するため、印刷精度を維持しながら２０個以上の印刷ユニットを有するプリンターを構築するコストは非常に高い。

別の方法は、例えば非特許文献３に記載されているように半導体チップの使用に基づく。これは特別な高電圧ＣＭＯＳチップであり、その表面は異なる電極に分けられる。チップをプログラムすることによって、特定の電極のスイッチを入れることができる。生成する電場の結果として、帯電粒子がスイッチを入れた電極上に選択的に堆積する。分子アレイの合成をチップ表面上で直接行ってもよく、又はチップ上の全粒子パターンを例えばガラス標本スライド等の標的基板に電場を用いて転写し、そこで合成を行ってもよい。

高電圧ＣＭＯＳチップの場合、作製プロセスの結果としてのチップの使用可能な領域は非常に小さく、現行モデルで１２ｍｍ×１２ｍｍである。これは、利用可能な領域のために異なる分子の数が極めて制限されることを意味する。

チップベースの方法では、粒子の選択的な堆積はエアロゾルから行われる。再現可能な結果を達成するためには、例えばエアロゾル密度、粒子速度及び粒子電荷等のエアロゾルパラメーターの非常に高度な要件を満たす必要がある。しかしながら、実際にこれを行うのは困難であり、例えばエアロゾル通過量（passage）、流動力学、粒度分布、湿度等の非常に多数の影響変数を考慮に入れなければならないために問題及び遅延が引き起こされる。

ペプチドアレイを作製するリソグラフィー方法も既知であり、この方法は例えば非特許文献４に記載されているように光の照射によって切断される感光性保護基に基づく。

既知のリソグラフィー方法は根本的な欠点を有する。異なるモノマーの各々について、カップリングサイクルを別個に行う必要があり、すなわち各々のタイプのモノマーを施し、カップリングし、過剰なモノマーを洗い流した後、次のタイプのモノマーについて、例えば組み合わせペプチド合成の場合には多層状に行い、いずれの場合にも２０カップリングサイクルを行わなければならない。これにより、予想される二次生成物又はアーチファクトが各カップリングサイクルにおいて形成し得るために得られる分子ライブラリーの品質問題が生じる。したがってリソグラフィー方法は、それにより４つの異なるモノマーしか基板にカップリングさせることができないため、これまでほぼオリゴヌクレオチドアレイの合成のみにしか使用されてこなかった。

その結果として、ペプチドアレイを作製するリソグラフィー技法の場合、錯体化学はこれまでペプチド収率がこれらの技法を確立させるのに十分に高くないことを意味していた。

上述の方法に加えて、パターニングされた基板のウェル内での微小粒子の堆積が非特許文献５及び非特許文献６において提案されている。

欧州特許第１１４０９７７号 独国特許出願公開第１０１５６３２９号

Frank R., Tetrahedron, 48 (1992), 9217-9232 Stadler, V., et al., "Kombinatorische Synthese von Peptidarrays mit einem Laserdrucker", Angewandte Chemie, 2008, 120 (37), 7241-7244 Beyer, M., et al., "Combinatorial synthesis of peptide arrays onto a microchip", Science, 2007, 318 (5858), 1888 Fodor, S.P.A., et al., "Light-Directed, Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis", Science, 1991, 251 (4995), 767-773 Yin, Y., et al., "Template-assisted self-assembly: a practical route to complex aggregates of monodispersed colloids with well-defined sizes, shapes, and structures", Journal of the American Chemical Society, 2001, 123 (36) 8718-8729 Kim, Y.H., et al., "Selective assembly of colloidal particles on a nanostructured template coated with polyelectrolyte multilayers", Advanced Materials, 2007, 19 (24) 4426-4430

したがって、本発明の根底にある目的は、従来技術の既知の欠点及び制限を克服する高密度分子アレイ、特にペプチドアレイを作製する方法を提供することである。

この目的は特許請求の範囲において特徴付けられる主題によって達成される。

特に、ピッチが３００μｍ以下の高密度分子アレイを作製する方法であって、
（ｉ）複数の個別のスポットを有する標的基板を準備する工程、
（ｉｉ）選択されたスポットを電磁放射の選択的かつ直接的な作用によって調整する工程、及び
（ｉｉｉ）少なくとも１つのモノマーと固定化形態で存在する反応物とを前記標的基板の選択されたスポットにおいて反応させる工程、
を含む、方法が提供される。

本発明によると、組み合わせ合成のための異なるモノマーによる標的基板のパターニングは、
粒子を規定の部位に固定すること及び／又は電磁放射により粒子を規定の部位に転写すること、又は、
これらの部位へのアクセスを可能にするために電磁放射により規定の部位の粒子を除去すること、
によって粒子に直接影響を与え、それによりパターニングすることで達成される。

組み合わせ粒子パターニングのための本発明による方法のどちらの変形形態も、以下に詳細に記載するように、リソグラフィー方法及び粒子ベースのパターニング方法の技術的利点を組み合わせ、同時にその欠点を回避するものである。

本発明によると、「分子アレイ」という表現は基板に結合した分子ライブラリーを意味するものと理解され、分子ライブラリーは基板の規定の部位（いわゆるスポット）に結合した多くの異なる分子の全体を含む。分子が結合するこの基板は標的基板とも称される。

本発明によると、ピッチが３００μｍ以下の高密度分子アレイを作製することが可能である。このことは、いずれの場合にも中点から測定される個々のスポットの距離（ピッチとも呼ばれる）が３００μｍ以下であることを意味する。本発明によると、分子アレイのピッチは好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、特に好ましくは１００μｍ以下である。

以下において「アレイ」という用語は、異なる分子が実質的に２つの次元でのみ配置される基板、及び異なる分子が付加的な３次元で存在するパターニング表面を有する多孔質基板又は基板の両方を意味するものと理解される。

さらに、「個別のスポット」という表現は、隣接スポットから空間的に分離された（標的）基板の領域を意味するものと理解される。本発明によると、スポットは幾何学的造形及び異なる表面特性の両方の結果として隣接スポットから分離することができる。例えば、スポットは薄い隔壁の形態で若しくは網状構造を用いて互いに分離してもよく、又はウェルの形態で存在していてもよい。加えて、例えば基板表面の異なる湿潤特性の結果としてスポットは個別の領域の形態で存在することが可能である。

本発明の好ましい第１の実施の形態によると、組み合わせ合成用の異なるモノマーによる標的基板のパターニングは、電磁放射を用いた規定の部位での粒子の固定及び／又は規定の部位への粒子の転写によって達成される。

特に、本発明のこの実施の形態は、上記に規定された、（ｉ）複数の個別のスポットを有する標的基板を準備する工程、（ｉｉ）選択されたスポットを電磁放射の選択的かつ直接的な作用によって調整する工程、及び少なくとも１つのモノマーと固定化形態で存在する反応物とを前記標的基板の選択されたスポットにおいて反応させる工程、を含み、前記少なくとも１つのモノマーが存在する粒子層又はフィルム層の形態の材料層を有する少なくとも１つの出発基板を準備し、選択されたスポットを調整する工程（ｉｉ）が、出発基板から前記標的基板への材料の選択的転写及び該標的基板への該材料の部位特異的固定を含み、該転写及び／又は固定が電磁放射により行われる。

この方法では、材料層として粒子層で均一にコーティングされた出発基板が使用される。この粒子層は、例えば分子アレイの組み合わせ合成用のモノマー粒子の形態のモノマーを含む。本発明によると、「モノマー粒子」という表現は、モノマー又は分子アレイの作製用の他の化学成分を含む粒子を意味するものと理解される。これらのモノマー粒子は実質的に分子アレイ、特にペプチド又はオリゴヌクレオチドアレイの組み合わせ合成に好適な化学成分又はモノマーが埋め込まれたポリマーマトリクスからなる。これらのモノマーは例えば、ペプチドアレイの合成用のアミノ酸誘導体であり得る。

本発明によると、ポリマーマトリクスとして、例えば限定されるものではないが、ポリスチレン−ｎ−ブチルアクリレートコポリマー、スチレン−アクリレートコポリマー、ポリジメチルアクリルアミド、ポリエステル及びエポキシ樹脂等のポリマーを使用することができる。

さらに、更なる物質をそれらが組み合わせカップリング反応を妨げない限りにおいてモノマー粒子に添加することができる。ペプチド合成については、かかる成分は特にＮＨ_２基又はＳＨ基を含有しないものとし、オリゴヌクレオチド合成については、かかる構成成分はＯＨ基を更に含有しないものとする。例えば、吸収挙動に影響を与えるモノマー粒子又は物質の電荷を調整するためにモノマー粒子に鉄錯体を添加することができる。この機能は例えばグラファイトナノ粒子、カーボンブラック粒子、フラーレン又はブロモフェノールブルー等の化学的に不活性であり、同時に光を吸収する多数の物質によって発揮される。

モノマー粒子の層を有する出発基板の代わりに、本発明によると、ポリマーマトリクスからなるモノマー粒子のような均一なモノマーフィルムでコーティングされ、モノマー及び任意に吸収体材料等の更なる物質が埋め込まれた出発基板を使用することができる。ポリマーマトリクスが十分な機械的安定性を有する場合、上述の材料の自立フィルム又はブロックを使用してもよい。

したがって、モノマーフィルムという表現は、モノマー又は分子アレイを作製するための他の化学成分を含む材料層を意味するものと理解される。

既に上に記載されているように、本発明によると、材料層は粒子層又はフィルム層の形態で出発基板上に存在し得る。この実施の形態では、モノマーが埋め込まれた材料は出発基板から標的基板へと選択的に転写され、そこで部位特異的に固定される。本発明によると、材料、すなわちポリマーマトリクスに埋め込まれたモノマーの転写は、粒子形態に限定されない。この実施の形態の範囲内では、材料の転写は粒子の転写及び液体又は気体形態での材料の転写の両方を含む。

本発明によると、モノマーが埋め込まれた材料は、それに応じて準備された出発基板から電磁放射により標的基板へと転写され、そこで選択的かつ部位特異的に固定される。本発明によると、この操作は有利に同じ標的基板で異なる出発基板を用いて繰り返される。このため、異なるモノマーを組み合わせにより部位特異的に自由選択部位の標的基板に固定することが可能である。更なるプロセス工程では、これらのモノマーは並行して官能基を標的基板に施す化学反応を始める。これらは特にペプチドアレイの合成用のＮＨ_２基又はオリゴヌクレオチドアレイの合成用のＯＨ基である。カップリング反応は、部位特異的に固定された材料を加熱すること又はそれらを化学物質で溶解することによって開始させることができ、それにより埋め込まれたモノマーを動員し、基板の表面に拡散させ、そこで固定化された反応物の官能基と反応させることが可能である。この方法は、油又はろう様の粘稠度と仮定すると、施された材料によって上述のモノマーの拡散が制限されたままである場合に特に有利である。

出発基板の準備、すなわち均一なモノマー粒子又はモノマーフィルムの層の作製は様々な方法によって行うことができる。例えば、モノマー粒子はエアロゾル又は懸濁液から出発基板上に堆積させることができる。モノマー粒子は液体の表面から引き上げる若しくはすくい取るか、又はドクターブレード若しくはローラーによって出発基板へと施すことができる。モノマー粒子が荷電されている場合、電場を堆積に用いることができる。

基板への均一なフィルムによるコーティングは例えばスピンコーティング、浸漬コーティングを用いて、又はドクターブレード若しくはローラーの使用によって行うことができる。しかしながら、モノマーフィルムは別個のプロセスによって作製しても、例えば出発基板に接着接合してもよい。加えて、モノマーフィルムを例えばインクジェット印刷等の印刷プロセスによって出発基板に施すことができる。

本発明によると、出発基板の材料は限定されず、標的分子に応じて選択することができる。これらの材料は当業者に既知であるため、詳細に記載する必要はない。非限定的な例としてポリマー材料、セラミック材料又は金属材料に言及することができる。例えば、ポリジメチルシロキサンの基板を特に有利に使用することができる。標的基板については以下の注記を参照されたい。

出発基板及び標的基板の両方にマイクロメートル規模でパターニング、例えばウェルを施すことができる。このパターニングは材料の意図する転写を可能にする又は改善することができる。出発基板がパターニングを有する場合、これをコーティングによって均一にコーティングせず、パターニングに従ってコーティングを適合させる、すなわち例えばモノマー粒子を有する出発基板内のウェルのみを満たすことが好都合であり得る。出発基板上の構造を満たすことによって、転写される材料をウェルに従って個々の微小粒子へと分割することができる。

標的基板のパターニングによって、例えば標的基板上の個々の又は特定数の構造のみが転写時に出発基板の材料で満たされる又は覆われるように転写の局所的制限を行うことができる。

本発明の好ましい実施の形態によると、出発基板と標的基板との間に配置される少なくとも１つ以上の中間層が使用される。少なくとも１つの中間層は出発基板と材料層、すなわちモノマー粒子又はモノマーフィルムの層との間に位置するのが好ましい。

少なくとも１つの中間層は特に限定されず、例えばマイクロ粒子若しくはナノ粒子、固体フィルム又は液体からなるものであってもよい。中間層は出発基板又は標的基板上のモノマー及びその上に位置する反応物を電磁放射の作用から保護する機能を有し得る。これは、電磁放射又は電磁放射によって開始する化学反応によって発生する例えば熱、蒸気、気体又はプラズマ等の間接的な作用の場合にも当てはまる。少なくとも１つの中間層は、例えば接着剤層の形態の出発基板への更なる中間層の接着又は材料層の接着を確立する機能を更に有し得る。

更なる実施の形態によると、少なくとも１つの中間層は出発基板から標的基板への材料の転写を助けることができる。１つ又は複数のかかる中間層を使用する場合、モノマー粒子又はモノマーフィルムは例えば、例えば炭素又は金属からなる中間層（複数の場合もあり）を加熱することによって間接的に加熱することができる。

本発明によると、例えばチタン、クロム、金、銅、タングステン、パラジウム、銀、炭素等の金属又は元素中間層、例えばＩｎ_２Ｏ_３、Ｖ_２Ｏ_５、ＴｉＯ_２等の酸化物中間層、例えばアジド、トリアゼン若しくはトリアゼン基が組み込まれたポリマー等のフォトポリマー、又は例えばポリイミド若しくはポリシロキサン等の他の化合物若しくは混合物を使用することができる。それにより同じ又は異なる材料の複数の中間層を、上述の効果を増強する又は組み合わせるために組み合わせて使用することができる。

様々な機構が材料の転写に可能であり、以下に詳細に記載されている。使用される材料、電磁放射の波長及び照射方向は各々適切に選ばれる。照射方向は特に、出発基板から標的基板又は標的基板から出発基板というものであり得る。

本発明によると、前記出発基板から前記標的基板への材料の転写及び固定を、前記出発基板と前記標的基板とを接触させ、前記粒子層又はフィルム層を前記電磁放射の選択的かつ直接的な作用によって直接的又は間接的に加熱することで行うことができ、前記材料層が前記基板間に位置することができる。

モノマー粒子の層又はモノマーフィルムでコーティングされた固体出発基板を、それにより固体標的基板と接触させることで、コーティングを２つの基板間に位置させる。エネルギーを電磁放射によって特定の部位に選択的に導入する。マトリクス材料はそれに含有される物質とともに標的基板へと固定される。

照射方向、材料及び電磁放射の波長の好適な選択によって、特にモノマー粒子又はモノマーフィルムの形態の材料層を、上述の（例えば炭素又は金属の）１つ又は複数の中間層又は一方若しくは両方の基板を放射によって加熱するように、直接加熱するか又は間接的に加熱する。粒子又はフィルムの間接的な加熱は、吸収体として働く例えばグラファイトナノ粒子等の添加剤と混合することによって達成することもできる。固定された材料は２つの基板が分離された後も標的基板上に残る。

より良好な接触を確実にするために、担体（複数の場合もあり）を好ましくは可撓性材料から作製してもよい。基板表面の化学修飾及び／又はナノ及び／又はマイクロパターニングを用いて、標的基板への加熱された粒子又はフィルムの材料の接着を好ましくは達成することができる。

出発基板のコーティングとの標的基板の接触面積を増大させるために、標的基板及び／又は出発基板を振動に曝す又は機械的発振に供することができる。

更なる実施の形態によると、出発基板から標的基板への材料の転写及び固定は、基板と直接接触させることなく行うこともできる。特に、出発基板から標的基板への材料の転写はアブレーション機構によって行うことができる。例えば電磁放射によりモノマー粒子、モノマーフィルム、出発基板、任意の少なくとも１つの中間層又は特定の添加剤の一部を蒸発させることによって、材料を容量の拡大により出発基板から標的基板へと輸送する。既に記載したように、出発基板と標的基板との直接的な接触はこの場合に必要とは限らないが、除外されるものではない。

容量の拡大は例えば熱膨張、プラズマ形成、蒸発又は物質の分解によって引き起こすことができる。物質の分解は例えば光分解、例えばフォトポリマーの使用又は熱分解によって行うことができる。さらに、電磁放射又は電磁放射によって発生する温度上昇は、直接容量の拡大をもたらすか、又は温度上昇を生じることにより、熱効果によって容量の拡大をもたらす化学反応を引き起こし得る。これは例えば、重金属アジド塩、トリニトロトルエン、又はニトロ基を有する他の芳香族化合物及びその塩、ニトロ基を有する芳香族化合物が組み込まれた化合物及びポリマー、ニトロ基を有するポリマー、例えばニトログリセリン、ニトロペンタ（nitropenta）、ニトロセルロース、ニトログアニジン、ニトラミン、ヘキサニトロスチルベン、ニトロトリアゾロン、アセチリド塩、個々の又は種々の爆薬と安定化物質との混合物、プラスチック爆薬、有機アジド、エチレングリコール、ジニトレート、火薬、二成分系爆薬、硝酸アンモニウム、ニトロメタン及び硝酸塩を含む混合爆薬の群の化合物を含む中間層の使用によって行うことができる。

更なる実施の形態では、例えばポリイミド等の少なくとも１つの中間層、及び材料層の好適な選択による上記の容量の拡大は、転写された材料を標的基板へと輸送する気泡の形成をもたらす。

転写された材料は、電磁放射によりエネルギーの導入を局所的に制限することによって標的基板に固定される。既に記載したように、材料の直接的又は間接的な加熱が行われる。波長、エネルギー、パルス幅、焦点サイズ及び焦点面等の放射源のパラメーターをこの目的に合わせて変更することができ、又は好適な第２の放射源を使用する。

代替的には、標的基板への材料の固定は単に、接触時に互いに接着又は結合するようなポリマーマトリクス材料及び／又は標的基板材料の好適な選択によって達成される。

出発基板から標的基板への材料の転写は、光子伝送パルスを用いてモノマー粒子又はモノマーフィルムの材料を出発基板から分離し、標的基板へと移動させることで行うこともできる。代替的には、出発基板及び／又は添加した添加剤の一部をパルスによって加速し、これをそのパルスによって伝送することができる。基板への材料の固定は上記のように行われる。

本発明によると、出発基板から標的基板への材料の転写は光ピンセット原理を用いて行うこともできる。これは例えば、モノマー粒子が使用される放射源の波長に対して透過性であり、粒子での屈折に対する光子のパルス転写によって保持又は移動することを意味する。

更なる実施の形態によると、出発基板から標的基板への材料の転写を、２つの基板間に電場を発生させることによって行う又は補助することもできる。この場合、マトリクス材料は好適な方法、例えば摩擦電気的に又はコロナワイヤーによって既に帯電されたものでなければならず、その結果としてモノマー粒子の場合は電気力によって標的基板へとガイドされる。

出発基板から標的基板への材料の転写は、２つの基板間に磁場を発生させることによって更に行う又は補助することもできる。この場合、マトリクス材料は例えばマグネタイト等の磁気構成成分を含むものとする。この場合、モノマー粒子は例えば磁力によって磁場勾配へとガイドされる。

モノマー粒子間及び／又はマトリクス材料と基板との接着力を低減し、転写を促進するために、基板間及び／又はモノマー粒子間の間隙を液体で満たすことが好ましい。

既に上に記載されているように、本発明の更なる実施の形態によると、組み合わせ合成用の種々のモノマーによる標的基板のパターニングは、電磁放射により規定の部位の粒子を除去し、それによりこれらの部位へのアクセスを可能にすることによって達成される。この実施の形態によると、標的基板の複数の個別のスポットがそれへのアクセスを遮断する粒子で覆われる。

標的基板の複数の個別のスポットがそれへのアクセスを遮断する遮断粒子で覆われた、この実施の形態によると、選択されたスポットを調整する工程（ｉｉ）が、電磁放射を用いたこれらのスポット内に配置される遮断粒子の選択的な除去を含み、それによりこれらの選択されたスポットへの少なくとも１つのモノマーのアクセスが可能となる。

標的基板の個別のスポットはウェルを有するのが好ましい。標的基板として使用される基板は特に、基板上の規定の部位へのアクセスを遮断する、すなわちウェルを覆う粒子で覆われた基板である。これらの粒子は以下で遮断粒子とも呼ばれる。好適な基板は特に、１つ又は複数の遮断粒子が可能な限り正確に適合するウェルを有する予めパターニングされた基板である。特に毛細管力を用いて粒子をウェル内に保持することができるため、このような予めパターニングされた基板のウェルを特に１つ又は複数の粒子で単純かつ完全に満たすことができる。

本発明によると、これらの遮断粒子は一方で、更なる粒子又は物質が堆積することのないよう上述のウェルへのアクセスを可能な限り効率的に遮断し、他方で選択されたウェルから選択的に除去することが可能であるものとする。本発明によると、遮断粒子の除去は電磁放射、好ましくは短レーザーパルスを用いて行われる。結果として、開放ウェルを続いて少なくとも１つのモノマーと選択的に接触させることができる。更なる実施の形態によると、モノマーはモノマー粒子の形態で準備することができる。例えば、ウェルをかかるモノマー粒子で満たすことができる。上で既に規定したように、これらは標的分子の組み合わせ合成に好適なモノマー又はモノマー混合物を含む。モノマー粒子は少なくとも１つのモノマー及び任意に更なる物質をポリマーマトリクス中に含む。これらは実質的に分子アレイ、特にペプチド又はオリゴヌクレオチドアレイの組み合わせ合成に好適な化学成分又はモノマーが埋め込まれたポリマーマトリクスからなる。

ウェルを続いてレーザーを用いて連続して遮断粒子から開放させる場合、開放ウェルを特に異なるタイプの組み合わせ合成用のモノマーを含有する点で異なる、異なるタイプのモノマー粒子で満たすことができる。

このようにしてモノマー粒子による基板のパターニングを行った後、分子アレイ、特にペプチド又はオリゴヌクレオチドアレイの組み合わせ合成に好適なモノマーを、基板表面に拡散し、そこで好適な官能基と反応することが可能であるように動員する必要がある。この動員は例えば特許文献１に記載のように行うことができる。モノマーを基板表面で反応させることができる方法の例としては、ＯＰｆｐエステル又は酸無水物でＣ末端を活性化したアミノ酸誘導体を基板の遊離アミノ基と反応させ、それによりペプチドアレイを形成すること、又はホスホラミダイトをＯＨ基と反応させ、それによりオリゴヌクレオチドアレイを形成することに言及することができる。本発明の上記の実施の形態を概略的に図１に示す。

モノマー粒子が組み合わせ合成に好適なモノマー、ダイマー又はトリマーの前駆体を含有する場合、基板に結合した分子をカップリング反応の１つ又は複数の更なるサイクルによって更なるモノマー、ダイマー又はトリマーで拡張させることができる。基板に結合したモノマーを、必ずしも同一とは限らない反応の１つ又は複数の更なるサイクルで修飾することも可能である。合成を行った場合、合成されたオリゴマーから保護基を切断することができ、ここでは合成分子は基板に結合したままであり、任意に後続のカップリング工程に利用可能である。

本発明によると、概して特にペプチド、オリゴ糖又はヌクレオチド等の生体分子の合成の分野及び組み合わせ化学において十分に確立された、従来技術で既知の保護基技法を用いることが可能である。すなわち本発明によると、組み合わせ合成用のモノマーに任意に存在する１つ又は複数の保護基を、更なるカップリング工程を可能にするために方法の好適な時点で除去することができる。

本発明によると、例えばポリスチレンフィルム、紙、ＣＤ、ＭＯＤ、ＤＶＤ又はＦＭＤ等の様々な材料を標的基板として使用することができる。例えばリソグラフィー方法を用いて片面にパターニングが作製された例えばガラスウエハー等の官能化ガラス基板が特に好適である。多孔質ガラス基板を本発明に従って使用してもよい。

更なる好ましい実施の形態によると、標的基板のウェルを、このスポットが添加されたモノマーにとってアクセス可能でなくなる、すなわち問題のモノマーが例えば拡散によってもこれらのウェルに侵入することができないように遮断粒子によって遮断する。本発明による方法のこの実施の形態では、遮断粒子から開放させたスポットは必ずしもモノマー粒子で満たす必要があるとは限らず、代わりに基板を局所的に又は完全に組み合わせ合成に好適なモノマーと接触させてもよい。これらのモノマーは、対流、拡散又は気相によって遮断粒子から開放させたウェルに選択的に到達することが可能であり、そこで固定化された反応物の好適な官能基と反応することが可能であるように好適な溶媒中で基板に施すのが好ましい。好適な溶媒として、例えばペプチド合成用のジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン若しくはジメチルスルホキシド、又はオリゴヌクレオチドの合成用のアセトニトリルに言及することができる。

本発明による方法のこの実施の形態では、遮断粒子はここで既に動員されたモノマーが（上述のモノマー粒子とは対照的に）、例えば遮断粒子を通る拡散によってウェルに入るのを防ぐ必要があるため、遮断粒子のより高度な要件が課せられる。これは例えば、遮断粒子が例えば二酸化ケイ素等の非常に緻密な材料からなり、又は遮断粒子を通る拡散を抑制するのに十分に架橋していることで達成することができる。架橋材料の遮断粒子の例として架橋ポリスチレン粒子に言及することができる。

ウェルを確実に遮断し、モノマーが遮断粒子を通ってウェルに入ることのないよう、遮断粒子の狭いサイズ分布が特に必要とされる。ウェルを密閉するために後に遮断粒子の直径を増大することが更に可能である。これは例えば粒子を溶媒中又は浸透圧によって膨張させることによって行われ得る。

非常に狭いサイズ分布を有し、更に強い表面電荷を有する遮断粒子が特に好まれる。この強い表面電荷は、極性溶媒中の粒子が極性分子の大きなほぼ不動のシェル、例えば水中の水和物シェルを有し、そのため膨張状態で上述のウェルへのアクセスをストッパーのように非常に緊密に閉鎖する効果を有する。本発明の好ましい実施の形態によると、遮断粒子は付加的に、上述の組み合わせ合成用のモノマーと接触させる前に逆帯電したナノ粒子で更に密封することができる。

本発明によると、これらの様々な密封可能性は、選択された第１の部位又はスポットでの第１のモノマーの化学的カップリングの後、選択された第２の部位又はスポットの更なる遮断粒子を選択的に除去することができるように可逆性であり得る。この目的で、添加されたナノ粒子を初めに洗い流すか、又は液体中で膨張した遮断粒子を異なる膨張パラメーターを有する液体中でインキュベートしてもよく、それにより、電磁放射、例えばレーザーパルスを用いてウェルから確実に除去することができるようにこれらの粒子の直径が十分に縮小する。膨張した遮断粒子を単純に乾燥させることも可能である。

更なる実施の形態によると、上で規定した方法は、既に露出したスポットを遮断粒子で再度覆うために遮断粒子を堆積させる工程（ｉｖ）を更に含む（図２に概略的に示される）。

上で規定した方法の更なる実施の形態によると、選択されたスポットを調整する工程（工程（ｉｉ））、及び少なくとも１つのモノマーと固定化形態で存在する反応物とを標的基板の選択されたスポットにおいて反応させる工程（工程（ｉｉｉ））、及び任意に遮断粒子を既に露出したスポット上に更に堆積させる工程（工程（ｉｖ））を、いずれの場合にも同一又は異なるモノマーを使用して繰り返し行う。これにより高密度分子アレイを安価かつ効率的に作製することが可能である。

本発明によると、電磁放射により標的基板上の遮断粒子をこれらのスポットへのアクセスを可能にするために初めに選択的に除去する粒子の組み合わせ構造化の原理、又は出発基板から標的基板への少なくとも１つのモノマーを含む材料の選択的転写及び固定を更に有利に組み合わせることができる。

本発明によると、特にレーザーを使用する電磁放射源として、例えばパルスレーザー又は連続波レーザー等が好適である。放射を部位特異的に或る点に集中させるために、好適なレンズシステムが必要である。標的基板及び／又は出発基板を放射源に対して機械的に移動させてもよく、又は電磁放射を好適なミラーを介して位置付ける。このことは、単位時間当たりにより多数の点が処理されるという利点を有する。

方法の速度を増大させるために、複数の放射源を好ましくは並行して使用することができ、又は１つの放射源のビームを例えばレンズアレイ若しくはミラーアレイ等の好適なシステムによって少なくとも２つの部分ビームに分割する。部分ビームの強度は個別に変調することができる。

本発明によると、上記の方法によって得ることができるピッチが３００μｍ以下の高密度分子アレイが更に提供される。本発明によると、分子アレイのピッチは好ましくは２００μｍ以下、より好ましくは１５０μｍ以下、特に好ましくは１００μｍ以下である。

上述のように、本発明によるアレイは好ましくはペプチド又はオリゴヌクレオチドアレイ、特にペプチドアレイである。

本発明は、高密度分子アレイ、特にペプチド又はオリゴヌクレオチドアレイの組み合わせ合成を可能にするための電磁放射を用いた基板上の粒子のパターニングに基づく。電磁放射はそれにより粒子に直接作用することで、粒子を移動させる力を制御する。一実施の形態では、モノマー粒子としてのモノマーを直接パターニングし、モノマー粒子を基板のスポットに直接転写して、そこに選択的に固定する。別の実施の形態によると、粒子を基板から選択的に除去することで、開放部位（スポット）が分子アレイ、特にペプチド又はオリゴヌクレオチドアレイの合成用のモノマーにとってアクセス可能となる。モノマーはこれらの部位に液体、気相中又はモノマー粒子の形態で施すことができる。

粒子堆積の最小ピッチは粒子サイズ、電磁放射の焦点径及び基板上の例えばウェル等の任意の構造のサイズによってのみ制限されるため、ピッチが３００μｍ以下、特に１００μｍ以下の粒子パターンを有利に作製することができる。

加えて、本発明によると使用する化学成分の数に関して非常に大きな柔軟性が見られる。その数が増大した場合も、これを例えば較正に関する付加的な出費なしに既存の方法に組み込むことができる。

粒子リザーバは本発明では使用されない。基板への遮断粒子の堆積、又はモノマー粒子若しくはモノマーフィルムでのコーティングは別個のプロセス工程で行われる。これにより例えばコーティングが不十分な基板を分離する又は再度処理することができる。特に高電圧ＣＭＯＳチップの選択的コーティングにおいて生じるようなコーティング品質の変動に起因するプロセスにおける問題及び遅延を、これにより有利に排除することができる。したがって、本発明による方法は非常にロバスト（robust）である。

さらに、原則として非常に大きな基板もミラーによる電磁放射の屈折及び機械的方法によって処理することができるため、作製される粒子パターンの面積は原則として制限されない。

本発明による方法は、リソグラフィー方法（非常に小さなペプチド又はオリゴヌクレオチドスポットをもたらす非常に小さな構造）及び粒子ベースの方法（自己組織化、ロバストネスのためにより大きな領域に対する単純なパターニングが可能であり、基板上でのパターニングとカップリング反応とは時間及び空間的に分離している）の利点を組み合わせ、同時にその欠点（リソグラフィー技法の場合の多くのカップリング反応を順に行うことによる二次反応、及びこれまで用いられていた粒子ベースの技法の場合の大きなピッチ）を回避するものである。

本発明は非常に小さなピッチを有する、すなわち非常に大きな領域に対して非常に高い分解能を有する粒子パターンを作製することを可能にするため、それにより作製される分子アレイをハイスループットスクリーニングにおいて極めて効率的に使用することができる。ハイスループットスクリーニングでは、可能な限り多くの異なる分子を並行して安価に特定の特性について試験することが重要である。

本発明による方法は実質的に無限数のモノマーを使用することができるため、作製される分子アレイの多様性を増大させることができ、広範なハイスループットスクリーニングについてより興味深いものとなっている。

本発明及びそれにより生じる更なる利点を、実施例に記載の実施形態を参照して以下の記載において更に詳細に説明する。

Ａ）ペプチド又はオリゴヌクレオチドアレイの組み合わせ合成に好適なウェルを有する基板を、化学的に不活性の遮断粒子と接触させる。Ｂ）遮断粒子をウェルに堆積させる。Ｃ）次の工程でモノマー粒子をそこに堆積させるために、レーザーを用いて遮断粒子を選択されたウェルから除去する。 Ａ）基板のウェルは、オリゴヌクレオチド又はペプチドの組み合わせ合成用のモノマーと反応することが可能な官能基を有する。レーザーによって灰色の遮断粒子を一部のウェルから除去し、それにより露出した部位を活性化されたモノマーと接触させることができる。Ｂ）モノマーを露出したウェルにカップリングする。Ｃ）次いで、ウェルを遮断粒子で再度満たす。Ｄ）この手順を、異なるモノマーを用いて更なるウェルについて繰り返す。Ｅ）次いで、一時的な保護基（例えばペプチドアレイの場合はＦｍｏｃ若しくはｔＢｏｃ、又はオリゴヌクレオチドアレイの場合はトリチル）を除去し、更なるモノマーの層を既に施したモノマーにカップリングすることが可能である（メリフィールド合成）。 パターニングした基板のウェルへの粒子の導入を示す図である。Ａ）直径４．２±０．１１μｍの青色着色ポリスチレン粒子（暗色の粒子として示される）（Micro Particles GmbH）；Ｂ）直径６μｍ、ピッチ１０μｍの円筒形ウェルを有する構造化基板；Ｃ）ウェルを完全に粒子で満たした。 Ａ）直径１０μｍの赤色のポリスチレン粒子（暗色の粒子として示される）で満たされた直径２０μｍのＳＵ−８ウェル；Ｂ）文字「ＫＩＴ」（透過光画像のためにミラー反転した）が現れるようにパルスレーザーを用いてウェルを選択的に空にした；Ｃ）開放ウェルを青色のポリスチレン粒子で満たす一方で、他のウェルを赤色の粒子によって遮断した；Ｄ）赤色及び青色の粒子の組み合わせパターンの詳細な画像（明確にするために青色の粒子を有するウェルに「^＊」の印を付けた）。 ＰＤＭＳ出発基板から標的基板への粒子層の材料の転写を示す図である。Ａ）出発基板及び標的基板を接触させ、レーザーで加熱することによってドットパターンを作製した；Ｂ）転写された材料を有する標的基板；Ｃ）標的基板を第２の出発基板と接触させ、レーザーで加熱することによって第２のドットパターンを作製した、Ｄ）第１及び第２の転写による材料を有する標的基板。 超音波浴でのクリーニングの前（左）及び後（右）の標的基板を示す図である。これにより非照射領域での汚染を顕著に低減することができた。 Ａ）電場を用いて出発基板から転写された粒子層を有する標的基板。特定の領域をレーザーによって選択的に固定した；Ｂ）圧縮空気を用いた粒子層の除去後。 レーザーベースの粒子パターニングを用いて合成された蛍光標識ペプチド（ＨＡ：明、ＦＬＡＧ：暗）を示す図である。左：ＨＡスポットのフレームを有するＦＬＡＧスポットのＫＩＴ、右：チェッカボードパターンでのＦＬＡＧ及びＨＡ。 固体モノマーフィルムからガラス標的基板へのコポリマーマトリクスに埋め込まれたアミノ酸誘導体の転写を示す図である。Ａ）出発基板：材料を欠いたモノマーフィルムの反射光顕微鏡画像；Ｂ）標的基板：転写された材料のパターンを有するガラス基板の透過光顕微鏡画像。 パルスレーザーによるレーザーアブレーションを示す図である。Ａ）粒子層を有する出発基板；Ｂ）部位特異的に転写されたモノマー粒子を有する標的基板。 ２つの構造化基板間の粒子の転写を示す図である。Ａ）直径７０μｍ、ピッチ１００μｍ、深さ約４０μｍの円筒形ウェルを有する基板；Ｂ）粒子で満たされたウェル；Ｃ）５×５ウェルを部分的に空にしたレーザー転写後のパターニングされた出発基板；Ｄ）５×５構造を粒子で満たしたレーザー転写後のパターニングされた標的基板。 概略図である。ａ）レーザー１を用いて、モノマーフィルム２の材料を出発基板３から標的基板４へと転写する。モノマーフィルムと出発基板との間に中間層５が存在する。ｂ）異なる出発基板を用いた複数の反復の後、個別のスポットの形態の異なるモノマーのパターンが標的基板上に形成される。 ペプチドＦＬＡＧ及びＨＡからなるピッチ１５０μｍのペプチドアレイの蛍光画像を示す図である。アレイを蛍光標識抗ＨＡ１及び蛍光標識抗ＦＬＡＧ２で検出した。 概略図である。ａ）レーザー１を用いて粒子層２の粒子の形態の材料を、マイクロパターニング表面を有する出発基板３からマイクロパターニング表面を有する標的基板４へと転写する。ｂ）異なる出発基板を用いた複数の反復の後、個別のスポットの形態の異なるモノマーのパターンが標的基板上に形成される。 走査型電子顕微鏡を用いた画像である。ａ）粒子で覆われたウェル（深さ１０μｍ、直径５μｍ、ピッチ１０μｍ）を有するマイクロパターニング表面を有するガラス出発基板。レーザー放射を用いて一部のウェルの粒子を別の基板へと転写した。ｂ）ウェル（深さ１０μｍ、直径７μｍ、ピッチ１０μｍ）を有するマイクロパターニング表面を有するガラス標的基板。粒子を出発基板からレーザー放射を用いて一部のウェルに転写した。 ピッチ１０μｍのマイクロパターニングしたガラス基板間のシステインを有するモノマー粒子の形態の材料の転写を示す図である。ａ）ウェルの直径５μｍのシステイン粒子で満たされた出発基板。ｂ）ウェルの直径７μｍの転写された粒子を有する標的基板。 マイクロパターニング表面を有するガラス標的基板上のビオチンスポットの蛍光画像である。ビオチンスポットを蛍光標識ストレプトアビジンで検出した。スポットサイズ７μｍ、ピッチ１０μｍ、スポット密度１００００００ｃｍ^−２。 概略図である。ａ）レーザー１を用いて、出発基板２の材料を粒子の形態で粒子層３から標的基板４へと転写する。ｂ）異なる出発基板を用いた複数の反復の後、個別のスポットの形態の異なるモノマーのパターンが標的基板上に形成される。 異なるアミノ酸誘導体を含む材料を組み合わせパターンで配置した標的基板からのペプチドアレイの合成を示す図である。ａ）材料のポリマーマトリクスが融解するように基板を加熱し、アミノ酸誘導体は基板表面に拡散することが可能であり、そこで化学結合する。ｂ）ポリマーマトリクス及び過剰なモノマーを様々な洗浄工程で除去する。遊離アミノ基をブロックし、アミノ酸のＮ末端保護基を除去する。ｃ）プロセスを繰り返し行うことでペプチドアレイが形成される。

以下の実施例は遮断粒子の概念に関する実験（（１）及び（２）参照）、モノマー粒子の転写（（３）、（４）、（７）及び（９）参照）及びモノマーフィルムからの材料の転写（（６）参照）に関する様々な実験を示すものである。加えて、分子アレイの合成例を示す（（５）及び（８）参照）。

（１）ウェルにおける粒子の堆積
直径４．２±０．１１μｍの市販のポリスチレン粒子（図３Ａ参照）を、水性懸濁液中で、パターニングした基板にアプライした（図３Ｂ参照）。基板はフォトレジストＳＵ−８をリソグラフィー方法によってパターニングしたガラスウエハーである。円筒形ウェルの規則的パターンを作製した。ウェルの直径は６μｍであり、中点間距離（ピッチとも呼ばれる）は１０μｍである。ウェルは、ガラスウエハー上のＳＵ−８層の厚さに相当する深さが約１７μｍである。図３Ｄに見られるように、基板のウェルを確実にポリスチレン粒子で満たす。この場合、パルスレーザーを用いて構造を選択的に空にすることが可能である（セクション２参照）。

（２）異なる粒子の組み合わせパターン
直径１０μｍの市販の赤色着色ポリスチレン粒子を、水性懸濁液中で、パターニングした基板にアプライした（図４Ａ参照）。基板はフォトレジストＳＵ−８をリソグラフィー方法によってパターニングしたガラスウエハーである。直径２０μｍ、ピッチ５０μｍ及び深さ約４０μｍの円筒形ウェルの規則的パターンを作製した。ウェルの直径及び深さが粒子の直径よりも顕著に大きいため、幾つかの粒子が各々のウェルに存在する。図４Ｂに見られるように、文字「ＫＩＴ」が現れるようにパルスレーザーを用いて一部のウェルを選択的に空にした。次の工程では、青色着色ポリスチレン粒子（直径１０μｍ）を水性懸濁液からアプライした。赤色のポリスチレン粒子は遮断粒子として作用し、青色の粒子が堆積するのを防ぐため、青色の粒子を開放ウェルにのみ堆積させることができた（図４Ｃ及び図４Ｄ参照）。

（３）図１８に示される図解に従うＰＤＭＳ出発基板からガラス標本スライドへのモノマー粒子の組み合わせ転写
スチレン−アクリレートコポリマー及びグラファイトナノ粒子からなるモノマー粒子（平均径約８．８μｍ）を、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）基板上にエアロゾルから堆積させた。この基板は出発基板となり、僅かな機械的圧力でガラス標的基板と接触させた。レーザー（波長８１０ｎｍ、出力最大１００ｍＷ、焦点径７．５μｍ）を使用して、いずれの場合にも１０ｍｓにわたって特定の領域を選択的に加熱した（図５Ａ参照）。図５Ｂに見られるように、融解領域は２つの基板の分離後も標的担体上に残る。第２の出発基板を用いてこれらの工程を首尾よく繰り返した（図５Ｃ及び図５Ｄ）。合計で約８５％の照射スポットがこれにより転写された。

標的基板の非照射領域における粒子汚染は圧縮空気により時々除去されたが、これは完全には成功しなかった。代わりに図６に示されるように、超音波浴を使用することもでき、それにより汚染のほぼ完全な除去が達成される。

（４）電場を用いた微小粒子の転写及びレーザー放射による選択的な固定
スチレン−アクリレートコポリマー及びグラファイトナノ粒子のモノマー粒子（平均径約８．８μｍ）を、エアロゾルからガラス出発基板にアプライした。エアロゾル発生装置において生じる摩擦のために粒子が荷電した。次いで、ガラス標的基板を出発基板に対して約１６０μｍの距離で並行に位置付けた。電場を印加することにより、一部の粒子が標的基板へと転写され、それにより密閉粒子層がその上に形成された。レーザーを用いて、粒子層の特定の領域を選択的に照射した（図７Ａ参照）。次いで、圧縮空気を使用して標的基板上の粒子層を除去した。粒子層の加熱領域が標的基板上に残った（図７Ｂ参照）。この原理を、標的基板の異なる領域を照射して２回繰り返すことができた。

（５）レーザー構造化モノマー粒子によるペプチドの組み合わせ合成
レーザーを用いて基板上にパターニングしたアミノ酸粒子を用いてペプチドを合成することができることを実験によって示すことが可能であった。

２つのペプチドＦＬＡＧ（アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）及びＨＡ（アミノ酸配列：Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）を実験に選んだ。マトリクスとしてスチレン−アクリレートコポリマー、アミノ酸誘導体、及び吸収体としてグラファイトから作製されたモノマー粒子（平均径約５μｍ）を、官能化ガラス基板上にエアロゾルから堆積させた。レーザー（波長８１０ｎｍ、出力最大１００ｍＷ、焦点径７．５μｍ、パルス幅１０ｍｓ）を使用して粒子を選択的に加熱することで、基板に固定した。固定されなかった粒子を圧縮空気により除去した。このレーザーパターニングを、ＦＬＡＧペプチドの最初のアミノ酸、またＨＡペプチドの最初のアミノ酸に対応するモノマー粒子を用いて行った。次いで、図１９に概略的に示されるプロセス工程を行った。基板を窒素雰囲気下、９０℃で９０分間加熱した。マトリクス中のアミノ酸誘導体がこの時間に基板へと拡散し、そこで存在するＮＨ_２基に化学的にカップリングする。

次いで、コポリマーマトリクス、過剰なアミノ酸及び他の全構成成分をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で洗浄することによって除去した。遊離ＮＨ_２基をブロックした後、アミノ酸のＣ末端のＦｍｏｃ保護基を除去した。

このプロセスを、配列に従うアミノ酸を用いてペプチドが完全に合成されるまで数回行った。合成生成物を確認するために、基板を続いて蛍光標識抗ＨＡ抗体及び蛍光標識抗ＦＬＡＧ抗体で標識した（図８参照）。

（６）粘着フィルムからの材料の転写
材料をモノマーフィルムから転写するために図１２の図解に示される手順に従った。図１２とは対照的に、この実験におけるレーザーは標的基板の後ろに位置付けたため、レーザービームは標的基板を介して出発基板に作用した。さらに、中間層はこの実験に使用しなかった。

初めに、スチレン−アクリレートコポリマー、Ｆｍｏｃ−グリシン−Ｏｐｆｐエステル及びグラファイトナノ粒子の混合物を加熱し、それをドクターブレードで滑らかにアプライすることによって粘着モノマーフィルムをガラス出発基板上に作製した。冷却後に、出発基板を標的ガラス基板と接触させ、レーザー（波長８１０ｎｍ、出力１００ｍＷ、パルス幅１０ｍｓ、レーザー焦点径７．５μｍ）により照射した。２つの基板を分離した後、材料がモノマーフィルム（図９Ａ参照）から標的基板（図９Ｂ参照）へと首尾よく転写されたことが明らかである。

（７）図１４に示される図解に従う２つのパターニングした基板間の転写
この実験において、レーザーを用いて粒子をパターニングした出発基板からパターニングした標的基板へと目的に適って転写することが可能であることが示された。基板は、フォトレジスト（フォトレジストＳＵ−８）をリソグラフィー方法によってパターニングしたガラスウエハーである。円筒形ウェルの規則的パターンを作製した（図１１Ａ参照）。ウェルの直径は７０μｍであり、中点間距離（ピッチ）は１００μｍである。ウェルは、ガラスウエハー上のフォトレジスト層の厚さに相当する深さが約４０μｍである。出発基板のウェルを、ドクターブレードを用いてスチレン−アクリレートコポリマー及び２％グラファイト（平均径２．５μｍ、噴霧乾燥によって作製）で満たし、基板表面から過剰な粒子を除いた（図１１Ｂ参照）。出発基板を標的基板上に位置付け、２つのホールマトリクスを整列させた。次いで、５×５ウェルをパルスレーザー（波長５３２ｎｍ、パルスエネルギー約５０μＪ、パルス幅約１０ｎｓ）で上から処理した。出発基板のウェルをそれにより部分的に空にし（図１１Ｃ参照）、標的基板のウェルを満たした（図１１Ｄ参照）。

図１５は、ドライエッチング方法によって作製されたマイクロパターニングしたガラス基板の走査型電子顕微鏡画像を示す。円筒形ウェルは深さ約８μｍ及びピッチ１０μｍである。図１５ａは出発基板を示す。スパッタリングプロセスによって基板に数ナノメートル厚の金層を施した。次いで、既に記載したドクターブレード技法によってウェルを粒子で満たした。加えて、粒子をまとめて焼結するために出発基板を短時間加熱した。一部のウェルは、粒子が既にレーザーパルスを用いて別の基板に転写されているために空である。図１５ｂは、転写された粒子材料を有する標的基板を示す。図１５の粒子はスチレン−アクリレートコポリマーからなり、ビオチンを化学構成成分として含む。

図１６は、ピッチが１０μｍの円筒形ウェルを有する２つのマイクロパターニングしたガラス基板間のアミノ酸システインを含む粒子の複雑なパターンの転写の光学顕微鏡画像を示す（暗：材料で満たされたウェル、明：空のウェル）。図１６ａは出発基板（ウェルの直径約５μｍ）を示し、図１６ｂは標的基板（ウェルの直径約７μｍ）を示す。

図１７は、標的基板上のピッチが１０μｍのビオチンスポットの蛍光画像を示す（左：チェッカボードパターン、右：文字ＫＩＴ）。パターンを作製するために、ビオチン−ＯＰｆｐエステルを含むスチレン−アクリレートコポリマーの粒子を、図１４に示される図解に従って２つのマイクロパターニングしたガラス基板間に転写した。出発基板に数ナノメートル厚の金層をスパッタリングプロセスによって設けた後、マイクロウェルをドクターブレードプロセスによって粒子材料で満たした。

転写のために波長５３２ｎｍのパルスレーザーを使用した。標的基板をアミノ官能化に供した。転写後の標的基板へのビオチン−ＯＰｆｐエステルの化学的カップリングを達成するために、基板を不活性ガス雰囲気下でスチレン−アクリレートコポリマーのガラス転移温度を超えるまで加熱した。次いで、過剰な材料をジメチルホルムアミド及びアセトン使用する様々な洗浄工程において除去し、基板を蛍光標識ストレプトアビジンの溶液と接触させた。

（８）分子アレイの合成
アミノ酸配列Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（血球凝集素又はＨＡ）及びＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＦＬＡＧ）を有し、ピッチが１５０μｍのペプチドアレイを合成するために図１２に示される図解に従う手順に従った。

出発基板として、DuPontの粘着Ｋａｐｔｏｎフィルムの形態のポリイミドの中間層を設けたガラス標本スライドを使用した。次いで、対応するアミノ酸誘導体及びスチレン−アクリレートコポリマー（ＳＬＥＣ ＰＬＴ−７５５２、Sekisui Chemical GmbH）をジクロロメタンに溶解し、スピンコーティングによってアプライした。作製した完成出発基板を図１２に示されるようにアミノ官能化標的基板上に直接配置し、レーザー（波長５３２ｎｍ、レーザー出力３００ｍＷ〜４００ｍＷ、レーザーパルス幅約５ｍｓ、レーザー焦点径約２０μｍ）を用いて出発基板を介して上から照射した。アミノ酸誘導体を含む材料がそれにより標的基板へと転写された。上述のペプチドＦＬＡＧ及びＨＡの配列に従うアミノ酸を含む異なる出発基板を用いて転写を繰り返した。

アレイの各層の転写の後、アミノ酸を標的基板にカップリングするために標的基板を９０℃、アルゴン雰囲気下で９０分間加熱した。過剰なアミノ酸及びポリマーマトリクスを除去し、基板上の遊離アミノ基をブロックするために、標的基板をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジイソプロピルエチルアミン及び無水酢酸の混合物で洗浄した。次いで、ピペリジンのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液を用いてフルオレニルメトキシカルボニル保護基をアミノ酸から除去した。ペプチド配列の完成後に、側鎖保護基をトリフルオロ酢酸で除去した。

図１３は、蛍光標識された特異的抗体（抗ＦＬＡＧ Ｃｙ３及び抗ＨＡ Ｃｙ５）によるペプチドの検出後のペプチドアレイの蛍光画像を示す。

（９）図１８に示される図解に従うレーザーパルスによるモノマー粒子のアブレーション及び転写
モノマー粒子層で覆われたガラス出発基板をレーザーパルス（波長５３２ｎｍ、パルスエネルギー約５０μＪ、パルス幅約１０ｎｓ）に供した。層のモノマー粒子をこれにより除去することができた（図１０Ａ参照）。約１７０μｍの距離で配置した第２のガラス標本スライドを、粒子を再度堆積する標的基板とした（図１０Ｂ参照）。

Claims (10)

1. ピッチが３００μｍ以下の高密度分子アレイを作製する方法であって、
   （ｉ）複数の個別のスポットを有する標的基板を準備する工程、
   （ｉｉ）前記標的基板の選択されたスポットを電磁放射によって調整する工程、及び
   （ｉｉｉ）少なくとも１つのモノマーと固定化形態で存在する反応物とを前記標的基板の選択されたスポットにおいて反応させる工程、
   を含み、
   前記少なくとも１つのモノマーが存在するフィルム層を有する少なくとも１つの出発基板を準備し、
   選択されたスポットを調整する工程（ｉｉ）が、該出発基板から前記標的基板への該少なくとも１つのモノマーの材料の選択的転写及び該標的基板への該材料の部位特異的固定を含み、
   該選択的転写及び／又は部位特異的固定が、レーザー光を含む電磁放射により行われ、
   前記出発基板と前記フィルム層との間に、前記材料の前記選択的転写を助ける１つ又は複数の中間層が配置され、
   前記出発基板から前記標的基板への前記材料の前記選択的転写及び前記部位特異的固定が、基板間の直接的な接触なしに行われ、
   前記材料の前記選択的転写が、液体又は気体形態で行われる、方法。
2. ピッチが３００μｍ以下の高密度分子アレイを作製する方法であって、
   （ｉ）複数の個別のスポットを有する標的基板を準備する工程、
   （ｉｉ）前記標的基板の選択されたスポットを電磁放射によって調整する工程、及び
   （ｉｉｉ）少なくとも１つのモノマーと固定化形態で存在する反応物とを前記標的基板の選択されたスポットにおいて反応させる工程、
   を含み、
   前記少なくとも１つのモノマーが存在するフィルム層を有する少なくとも１つの出発基板を準備し、
   選択されたスポットを調整する工程（ｉｉ）が、該出発基板から前記標的基板への該少なくとも１つのモノマーの材料の選択的転写及び該標的基板への該材料の部位特異的固定を含み、
   該選択的転写及び／又は部位特異的固定が、レーザー光を含む電磁放射により行われ、
   前記出発基板と前記フィルム層との間に、前記材料の前記選択的転写を助ける１つ又は複数の中間層が配置され、
   前記出発基板から前記標的基板への前記材料の前記選択的転写及び前記部位特異的固定が、前記出発基板と前記標的基板とを接触させ、前記フィルム層を前記電磁放射によって直接的又は間接的に加熱することで行われ、前記フィルム層が前記基板間に位置し、
   前記材料の前記選択的転写が、液体又は気体形態で行われる、方法。
3. 前記出発基板及び／又は前記標的基板が前記接触時に振動に曝される又は機械的発振に供される、請求項２に記載の方法。
4. 前記出発基板及び／又は前記標的基板が可撓性材料からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記材料の前記選択的転写が、アブレーション、光子により伝送されるパルスによる該材料の脱離、光ピンセット原理、前記基板間での電場及び／又は磁場の生成を含む機構の１つ又は複数によって行われる、請求項１に記載の方法。
6. 前記転写された材料の標的基板への前記部位特異的固定が、該材料の直接的若しくは間接的な加熱又は該材料及び／又は標的基板材料の好適な選択によって行われる、請求項５に記載の方法。
7. 前記材料の前記選択的転写が、前記フィルム層又は前記少なくとも１つの中間層の容量の拡大によって行われる、請求項５又は６に記載の方法。
8. 前記材料の前記選択的転写が前記フィルム層又は前記少なくとも１つの中間層における気泡の形成によって行われる、請求項７に記載の方法。
9. 工程（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）を同一又は異なる出発基板を用いて繰り返し行う、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記基板間の間隙が液体で満たされる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

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