JP2003515570A - レセプターに結合する複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗体、放射性核種および葉酸塩または葉酸塩誘導体からなるレセプターに結合する複合体に関し、前記複合体は二次元的結合能力を有するかあるいは有しないことを特徴とする。また、本発明はこのような複合体を使用するための方法だけでなく、調製するための方法およびキットに関する。さらに、製薬剤溶液を調製するための本発明に係る複合体の使用を解決する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、抗体、放射性核種および葉酸塩または葉酸塩誘導体からなり、２元
的な結合能力を有するかもしくは有しないことを特徴とするレセプターに結合す
る複合体に関する。本発明は、さらにそのような複合体の製造方法および調製用
キットならびにそのような複合体の使用方法に関する。製薬剤溶液の製造のため
本発明による複合体の使用についても開示されている。

【０００２】 葉酸塩結合タンパク質（FBP）を発現している標的腫瘍に対する葉酸塩および
葉酸塩誘導体の使用、エンドサイトーシスを介して酸化された葉酸塩の細胞内取
り込みに関与するグリコシル-ホスファチジル-イノシトール-結合細胞膜タンパ
ク質は、研究者らの注意を惹いてきた（Kranzら1996年;Reddyら1998年;Shinoda
ら1998年;Trippetら1999年）。ヒトガン細胞のいくつかのタイプには、FBPの発
現過剰が見られることから、このレセプターは、葉酸塩と結合した治療用放射性
元素を送達するための標的になり得る。低分子量の葉酸塩-キレート-放射性核種
複合体のさまざまなタイプが、FBPを発現している標的細胞にインビボおよびイ
ンビトロで用いることができることが示されてきた(Mathiasら、1998年)。しか
しながら、薬物動態学では小さな分子は一般に好ましくない。小さな分子は、一
般に速やかに身体から排泄され、それにより腎臓内での葉酸塩レセプターはより
高濃度の放射線医薬品にさらされるからである。しかも、標的組織内の血中濃度
が速やかに減少するため、腫瘍への取り込みには限度がある。

【０００３】 最近の研究で、shinodaら(1998年)は、放射性核種インジウム-111で標識した
葉酸塩と結合したウシ血清アルブミン(BSA)を評価し、葉酸塩なしのものは葉酸
塩標識BSAと比較して、薬物動態および生体分布(biodistribution)において顕著
な違いがあることを見出された。高い肝臓での取り込みと速やかな血液からのク
リアランスは、葉酸塩標識型の¹¹¹In-BSAが葉酸塩結合タンパク質を発現してい
るガン細胞に放射性核種を送達するのに特に適しているわけではないことを示し
た。

【０００４】 前記葉酸塩−抗体−放射性核種の組合せは、我々の知りうる限り、以前には存
在していなかった。しかしながら、葉酸塩と抗体との組合せは、他の用途では評
価されていた。Kranzら(1996年)は、（１）葉酸塩-抗体を標的細胞上の葉酸塩結
合タンパク質と結合させること、（２）エフェクター細胞と相互作用する、抗体
の抗原結合部位に起因して標的細胞の溶解に影響を及ぼすことを意図して、葉酸
塩を抗エフェクター細胞抗体と結合させた。しかしながら、前記FBPレセプター
システムを使ってガン細胞が放射性核種の標的となるようにすることはいまだに
成功していない。

【０００５】 放射性核種を、特に移動局所性（locoregional）の状況にあるFBP含有腫瘍を
標的として向かわしめるためには、注射された領域から急速に拡散しすぎない大
きな担体を使用することが有利である。モノクローナル抗体が、FBPに対して産
生されたが(Campbellら、1991年)、モノクローナル抗体における問題点は、それ
らがたいていヒト以外の種からのタンパク質全体またはペプチドの配列を含有し
ていることであり、それゆえヒトに使用した際には様々な程度に免疫原性となる
ことである。このことは繰り返しの注射を要するプロトコルにおいて、ヒトの抗
マウス-抗体またはヒトの抗キメラ-抗体が出現するがゆえに、モノクローナル抗
体の使用を阻害する。これは免疫複合体形成および放射性免疫複合体の好ましく
ない生体分布(biodistribution)をひき起こす(Brulandら、1995年；Meredithら
、1993年)。さらに、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントは通常、
抗原結合部位に関して、１価または２価（すなわち、多価ではない）であるのみ
である。

【０００６】 したがって、本発明の目的は、担体分子（すなわち抗体）、前記担体に化学的
に結合させた放射性核種および葉酸塩から製造された、有効なレセプター選択性
の腫瘍ターゲッティング剤（複合体）を提供することにある。さらに、前記複合
体は、同時に本来の抗原に対する著しい抗原結合能力を保持しているべきである
；すなわち、前記複合体は２元的結合能力を有している。それゆえ、本発明の目
的はそのような複合体を製造し使用する方法を提供することにある。これらの目
的は、本発明によって得られ、記載したクレームによって特徴付けられる。

【０００７】 本発明は、新しい種類の葉酸塩誘導体（複合体）、ならびにそのような複合体
を製造し使用する方法に関する。前記複合体は、（１）好ましくはIgGまたはIgM
クラスの抗体または抗体群、またはそれらのフラグメントもしくはそれらの構築
物（たとえば、ミニボディ(minibody)）、（２）放射性核種、（３）葉酸塩から
なる。本発明によれば、前記複合体は、ヒトのタンパク質またはペプチドのみを
含み、抗体あたり複数の葉酸塩が結合する可能性のために、結合活性が増加して
おり、それにより前記複合体を標的細胞に結合させる確率が増すだろう。使用さ
れる抗体は、不活性な抗体か、腫瘍に関係する抗原に対して親和性を有するモノ
クローナル抗体のどちらかである。最初のケースでは、FBP親和性のみを有する
複合体が構築される一方、２番目のケースでは、潜在的に２元的レセプター親和
性を有する複合体が作られる。前記抗体は、葉酸塩のFBPに対する結合能力ばか
りでなく本来の抗原に対して顕著な抗原結合能力を保持しているからである。２
元的レセプター親和性の代表的な利点は、複合体に対して少なくとも１つのレセ
プターすら有しない大量の標的細胞を減らし、首尾よく標的とする機会を増やす
ことである。我々の知る限りにおいては、腫瘍細胞へ放射線を送達するために葉
酸塩-抗体-放射性核種を使うことを提案するのは我々が最初である。 本発明を、図および実施例を参照して、以下により詳細に述べる。 新しい種類の葉酸塩誘導体を開発するために、すなわち、新規な化合物（複合
体）、好ましくは、ヒトのタンパク質またはペプチドのみを含有するもの、言い
換えれば、FBPに対して多価であり、２元的結合能力を有するかまたは有しない
ものを作るために、葉酸塩および放射性同位元素で標識された抗体を使用する可
能性が明らかにされた。このような複合体において抗体を用いる利点は、２重に
ある。低分子量の化合物と比較して、抗体の大きなサイズは、複合体の薬物動態
に影響する。すなわち、静脈注射した場合に、血液からのクリアランスがより遅
くなり、放射性化合物の濃度が維持され、腫瘍へのより高い取り込みが可能にな
る。つまり、腔内に注射した場合、その領域からの放射性同位元素のクリアラン
スを遅くする(Larsenら、1995年)。葉酸塩の結合の程度（すなわち、結合活性、
またはレセプター結合単位の数）に依存して、該複合体はFBPの合わさった結合
部位に関して多価になりうる。しかも、FBPとは異なる抗原に対する抗原結合能
力を有する抗体に、葉酸塩を複合化することにより、２つの異なるレセプターと
結合しうる（すなわち、２元的結合能力を有する）複合体が作られる。たとえば
、ある抗原に対して産生される抗体、たとえば、抗-骨肉腫抗体TP-3は、葉酸塩
と放射性同位元素で標識されており、抗原を発現している骨肉腫細胞に、従来の
抗体抗原相互作用によって結合しうるが、さらに葉酸塩の官能基を介して、FBP
を発現している細胞にも結合できる。この２元的結合能力の原理は、抗原と同様
、FBPの細胞発現が標的細胞および系統群によって異なるため重要である。

【０００８】 したがって、前記抗体自体も異なるレセプターを介して腫瘍細胞に結合する場
合には、全腫瘍細胞に対して治療に充分な標的となしうる確率が増加する。この
ように、この原理は、それぞれレセプターのうちの１つのみを有する２つの異な
る細胞集団を標的とするのに用いることができる。あるいは、両方のレセプター
を発現している細胞を標的とする確率を増加させるのに用いることができる。こ
のタイプの複合体は、多くの様式で用いることができ、ガン細胞に対する、治療
または診断用の放射性同位元素のインビボでの標的化が挙げられる。

【０００９】 さらに、前記２元的結合能力の原理は、葉酸塩以外のレセプターに結合する分
子に用いることもできる。たとえば、エストロゲン誘導体およびテストステロン
誘導体は、乳ガンまたは前立腺ガンに親和性を有する抗体と複合体化でき、乳ガ
ンまたは前立腺ガン細胞に対する２元的結合能力を有する複合体を与える。 さらに、我々は、放射能標識または葉酸塩標識をした場合に、これらの抗体が
２元的レセプター親和性（すなわち、FBPおよび骨肉腫に関係する抗原の両方に
対する親和性）を有することを示すため、骨肉腫に関係する抗原に対するモノク
ローナル抗体の使用を研究した。

【００１０】 我々は、葉酸塩で標識され、かつ、アスタチン-211およびヨウ素-125で放射能
標識されたヒトIgGを評価した際に、驚くべきことに、葉酸塩標識および放射能
標識したIgGと、葉酸塩なしの放射能標識したIgGとの間には、マウス内の生体分
布に顕著な違いが見られなかったことを見出した。したがって、我々は、葉酸塩
-抗体-放射性核種複合体は、インビボの腫瘍ターゲッティング化に有用であると
結論した。

【００１１】 前記葉酸塩-抗体-放射性同位元素複合体の利用は、移動局所性の適用のみなら
ず静脈注射に使用することにより開発することができる。たとえば、短寿命の放
射性核種（すなわち、t_1/2が数時間）に基づく複合体は、腹腔内に転移した卵巣
ガンの治療に有望である。なぜなら、このタイプのガンは、FBPを過剰に発現し
ている確率が高く、この部分からの抗体のクリアランスは比較的遅いため、腫瘍
に影響される領域内の放射性化合物の濃度が高く確保される。

【００１２】 前記葉酸塩-抗体-担体分子を、別種の放射性同位元素を輸送するために使うこ
ともできる。たとえば、治療のためのアルファ線および／またはベータ線放射体
、ならびに腫瘍のシンチグラフィーおよび陽電子放射-断層撮影法（PET）のため
のX線および／またはガンマ線放射体および／または陽電子放射体がそれぞれ挙
げられる。実験のセクションで述べるように、金属放射性核種のみならずハロゲ
ンも葉酸塩-抗体に複合体化することができる。前記金属放射性核種は、たとえ
ば、タンパク質中のアミノ基（たとえばリジン）に対するカップリング反応性を
有する２官能性キレートの手段による。アルファ線放射体の例としては、²¹¹At
、²¹²Pb（ジェネレータ核種に結合した化学物質として）、²¹²Bi、²¹³Bi、²²³Ra
、²²⁴Ra、²²⁵Acおよび²²⁷Thが挙げられる。ベータ線放射体の例としては、⁶⁷Cu
、⁹⁰Y、¹³¹I、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Hoおよび¹⁸⁶Reが挙げられる。X線放射体およびPET核種
の例としては、^99mTcおよび¹⁸Fが挙げられる。放射線誘導手術における特別な用
途には、たとえば、¹²⁵I-標識抗体-葉酸塩複合体が挙げられる。

【００１３】 一般に、葉酸塩は、そのα−またはγ−カルボニル位置で活性化エステルを形
成して、アミノ基とリガンド上でカップリングさせることができる。葉酸塩から
活性化したカップリング剤を生成させるいくつかの方法がある(Readdyら、1998
年)。α−位で複合体化した葉酸塩は、γ−位で複合体化したものと同じレセプ
ター活性を示さないかも知れない。葉酸塩が、EDC法を使用して抗体とカップリ
ングさせ得ることはよく知られている(Reddyら、1998年)。この方法は、葉酸塩
のα−またはγ―カルボニル位置に対して選択的ではないが、EDC法を使用する
場合には、γ−位置が立体障害的に好ましい。担体分子に１つ当たり複数の葉酸
塩の複合体化は、少なくとも1つのγ−位で複合体化した葉酸塩が含まれること
を保証する(Reddyら、1998年)。

【００１４】 本明細書で用いられる葉酸塩-抗体-放射性核種複合体を生成する方法は、放射
活性カップリング剤によるアミンカップリングおよびチロシンのヨウ素産生物質
による標識の両方が、葉酸塩ターゲッティング特性を有する生成物をつくるのに
用いることができることを示した。抗体を放射能標識する最も一般的な方法は、
おそらく葉酸塩標識と併用できる。もしも抗体が葉酸塩で多量にプレラベルされ
ているならば、利用できるリジンのアミンが減少するため、アミノカップリング
剤を用いる場合には、放射能標識の収率は減少するだろう。放射能標識は、主に
抗体の葉酸塩標識の前にまたは後に行うことができる。

【００１５】 本発明に係る葉酸塩-抗体-放射性核種複合体は、ヒトを含む哺乳動物へ注射ま
たは注入するのに好適な製薬剤溶液を製造するために用いることができる。この
溶液は、必要に応じて、公知である全ての全身的な投与経路を介して患者に投与
される。たとえば、経静脈、局所的および／または腫瘍内の経路が挙げられる。
その結果、本発明による調製物は、活性複合体からなり、所望により、アジュバ
ント、製薬学的に認められている変性剤、溶剤および担体を含み、選択した投与
経路に適した注射液および／または注入液を含有してなる。

【００１６】 本発明に係る放射性免疫複合体は、さらに、葉酸塩結合タンパク質を発現して
いるガンを治療するための他の放射性免疫複合体、葉酸塩-および放射能標識さ
れたIgGおよびIgMまたはそれらのフラグメントおよび／または他の形態の放射性
製剤治療、化学療法、外部光線治療または手術と組み合わせて用いられる。 前記葉酸塩-抗体-放射性核種複合体は、さらに、葉酸塩結合タンパク質を発現
しているレセプター含有細胞または組織を画像化するため、または葉酸塩結合タ
ンパク質を発現している悪性細胞に強力な治療用放射線を照射するための方法に
使用される。ここで、前記悪性組織は、たとえば、脳、肺、子宮頚管、卵巣およ
び乳房のガンからなる群から選択される。

【００１７】 本発明によれば、葉酸溶液を含むバイアルと、カップリング活性化剤（たとえ
ば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）の溶液を含むバ
イアルとを含んでなり、所望により、放射性同位元素、あるいはプレラベルされ
ているか、後で抗体または抗体フラグメントに共有結合かキレート化によって放
射性同位元素で標識されるリガンドを含有する溶液を含む３つ目のバイアルを含
んでなり葉酸塩標識の抗体または抗体フラグメントの調製用キットが提供される
。

【００１８】 さらに、本発明は、活性成分が、（１）IgM、IgGまたはそれらのフラグメント
およびそれらの構築物であって、（２）放射性核種で標識され、（３）抗体自身
のものとは別のレセプター親和性を有する一般の分子（たとえば、エストロゲン
またはその誘導体またはテストステロンまたはその誘導体）からなる複合体であ
る場合に、２元的結合能力の原理に基づいた放射線療法または放射線検出に好適
な製薬剤溶液の製法を提供する。

【００１９】 最良の形態 本発明に係るレセプターに結合する複合体は、３つの構成要素； （１）好ましくはIgGもしくはIgMクラスの抗体または抗体群、あるいはそれらの
フラグメントもしくはそれらの構築物（たとえばミニボディ（minibody））、 （２）放射性核種または放射性核種の混合物、および （３）葉酸塩からなり、前記複合体が２元的な標的結合能力を有するかまたは有
しないことを特徴とし、その放射性核種が²¹¹Atまたは¹²⁵Iから選択できること
を特徴としている。

【００２０】 ３つの構成要素； （１）好ましくはIgGもしくはIgMクラスの抗体または抗体群、あるいはそれらの
フラグメントもしくはそれらの構築物（たとえばミニボディ）、 （２）放射性核種または放射性核種混合物、および （３）葉酸塩からなり、 抗体の放射性核種標識および葉酸塩標識に関する標準的な手順を用いることを含
む、レセプターに結合する複合体を製造する方法。

【００２１】 一般に、前記製法条件は、標識される各抗体について、最適化されなければな
らない。リジン単位の数および局在（たとえば、抗体結合部位または非結合領域
）が異なるからである。 IgGの前処理 抗体のバッチは、特定の抗体に関して最適の葉酸塩標識条件を与えるのに用い
られるバッファー（たとえば、0.05Mホウ酸塩、pH8.5）で予備-平衡化したSepha
dex PD-10カラム(Pharmacia)を使用して、バッファー交換される。前記抗体を、
カラムから溶離し、必要であれば、バッファーで希釈して、標識工程を行うのに
最適な濃度を得る（たとえば、1〜50mg/ml）。

【００２２】 記載した実施例で詳細に述べるプロセスは、明確にするためのものであり、限
定されるものではなく、以下の工程からなる。； 葉酸塩標識 全体的な手順は実験のセクションで述べる。最初に、葉酸塩を抗体に複合体化
する（典型的には、抗体ごとに1〜20葉酸塩）。抗体をカップリング活性化した
葉酸塩の溶液に加える。反応を、10秒未満〜2日超の間放置し進行させる。たと
えば、ホウ酸バッファーに過剰のグリシンを加えて、反応を失活させてもよい。
得られた複合体をゲルろ過分離（サイズ排除、たとえばSephadex G-25 PD-10カ
ラム）を用いて精製する。次に、葉酸塩標識抗体を放射性核種で放射能標識する
。最終的な生成物を、たとえば、Sephadex G-25 PD-10カラムを用いるゲルろ過
により精製する。

【００２３】 放射能標識は、葉酸塩複合体化に引き続いて行うことができる。実験のセクシ
ョンで詳細に述べるように、標準的な放射能標識手順が使用できる。放射能標識
された複合体は、1Bq/mg抗体未満から数GBq/mg抗体までの範囲の比活性を有する
ように調製できる。

【００２４】

【実施例】

【００２５】

【実施例１】 ヒトIgGと葉酸塩の複合体 IgGの前処理 商業的に入手できるヒトIgG（HIgG）（Gammanorm:Pharmacia ＆ Upjohn社製）
を、グリシン、NaClおよびNaAcの緩衝液中165mg/ml初期濃度で使用した。

【００２６】 HIgGを、PBSで予備平衡化したSephadex G-25カラム（PD-10、Pharmacia）で混
合物を溶離することによって低分子量の成分から分離した。 IgG濃度を、該タンパク質の吸光係数224,000を用いて280nmでの吸光度の示度
により求めた。 TSK-G3000SW_xlカラム（東ソー Haas社製）を用いたサイズ排除HPLCでの精製H
IgGの溶離プロファイルは、本質的にIgGに対応する1つのピークを示した。

【００２７】 （HPLCシステム：島津社製、LC-10ATポンプ、SPD-M10A ダイオードアレイ検
出器） 葉酸の複合体化 反応性を確保するために、葉酸の保存液を、商業的に入手した葉酸（シグマ社
製）を含水率0.05％未満のジメチルスルホキシドに溶解して調製した。保存液を
、活性化された4オングストロームのシーブ（Fluka）を含むボトルにカニューレ
挿入し、アルゴン雰囲気、暗所で6〜10時間保管した。

【００２８】 ³H−葉酸（Amersham Pharmacia Biotech.社製 Buckinghamshire. 英国）を、
葉酸調製物にトレーサーとして含有させ、³H−葉酸のカリウム塩水溶液（クエン
酸については1％）として添加し、その後8mTorrで3日間乾燥保存した。その後、 ³ H−葉酸を含有する前記葉酸を上述のように処理した。葉酸をHIgGに結合するた
めに、4〜10mol当量の1−エチル−3−（3−ジメチルアミノプロピル）カルボン
ジイミドを前記葉酸溶液に添加し、30分間、周囲温度でインキュベートすること
によって、活性化した。その後、20〜60倍モル過剰の活性化された葉酸をPBS中
のHIgG（15mg/ml）に添加し、30〜60分間反応させた。反応をpH8.5のPBS／ホウ
酸塩中0.3Mグリシン0.2mlを添加することによって抑制した。葉酸−HIgG複合体
（FA-HIgG）を、PBSで予備平衡化したPD-10カラムを用いて未反応物から分離し
た。サイズ排除HPLCによって、HIgGの凝集体／二量体／フラグメント、あるいは
低分子量の成分の存在について個々の分画を分析した。

【００２９】 葉酸複合体化の程度を、分光光度的なタンパク質濃度の決定と組み合わせて、
液体シンチレーションカウンティング（Beckmann LS6500）によって測定される
精製FA-HIgGの³H−含有量によって求めた。タンパク質濃度は、吸収係数および³ H測定から得られる葉酸濃度から算出される、葉酸に帰因する280nmでの吸収への
寄与について補正した280nmでの吸収により求めた。

【００３０】

【実施例２】¹²⁵ I-FA-HIgGおよび²¹¹At-FA-HIgGの調製 Iodogen法による放射性ヨウ素標識 PBS中のFA-HIｇG（例えば2〜5mg/ml）を、標準的な方法論（Fraker ら, 1978
）を用いてIodogen法によりヨウ素化した。放射標識した生成物は、PD-10により
精製し、HPLCサイズ排除カラムで分析した。この研究は、放射標識前あるいは標
識後に抗体を葉酸塩で標識しても、放射標識した生成物の収率は同じであること
を示した。

【００３１】 N−スクシンイミジル−3−［¹²⁵I］ヨウ化安息香酸を用いた放射標識（ATE法） 葉酸塩標識した抗体あるいは抗体のみを、例えばホウ酸塩緩衝液（pH8〜9）中
濃度1〜10mg/mlで、N−スクシンイミジル−4−［²¹¹At］アスタト安息香酸か、
あるいはN−スクシンイミジル−3−［¹²⁵I］ヨウ化安息香酸を入れた乾燥バイア
ルに添加した。2つの標識化試薬を、記載（Larsen ら, 1994b）のとおりに調製
した。バイアルを穏やかに15分間攪拌した後、ホウ酸塩（pH8〜9）中0.2Mのグリ
シン0.3mlを添加し、バイアルをさらに5分間攪拌した。その後、溶液をSephadex
G-25 PD10カラム（Pharmacia社製）に移し、放射標識されたIgGをPBS緩衝液（p
H7.4）を用いて溶離した。 結果：全標識収率はこの方法を用いて35〜60％の範囲であった。これらの手順を
、TP-1 F(ab^-)₂と同様に、TP-3、RituximabおよびヒトポリクロナールIgGにも使
用し、N−スクシンイミジル−［²¹¹At］アスタト安息香酸（Larsen ら, 1994）
と同様に実施することができた。

【００３２】 ²¹¹Atおよび¹²⁵Iのタンパク質への結合割合を求めるための実験において、精
製された生成物をタンパク質のメタノール沈殿を用いて評価した。97％以上の放
射能が、¹²⁵I-FA-HIgG、²¹¹At-FA-HIgG、¹²⁵I-HIgGおよび²¹¹At-HIgG調製物とし
て沈殿した。

【００３３】

【実施例３】¹²⁵ I-FA-HIgGおよび²¹¹At-FA-HIgG対¹²⁵I-HIgGおよび²¹¹At-HIgGの体内分布 方法：平均FA／HIgGの比2.3の単一のFA-HIgG調製物を¹²⁵I-FA-HIgGおよび²¹¹At-
FA-HIgGの両方の調製物に使用し、比較のために¹²⁵I-HIgGおよび²¹¹At-HIgGも実
施例2で記載したように調製した。

【００３４】 体重が16〜20gの範囲の雌性Balb/C白マウスを体内分布実験で使用した。前記
化合物を各動物に対して調製物500μlの腹腔内注射により投与した。前記化合物
を各動物に対して約100ｋBqの²¹¹Atおよび約50ｋBqの¹²⁵Iを用いて、一対標識配
列（²¹¹At-FA-HIgG対¹²⁵I-HIgGおよび¹²⁵I-FA-HIgG対²¹¹At-HIgG）で投与した。
動物を頚椎脱臼により犠死せしめ、各時点3匹のマウスのグループを用い、標識
対抗体型を（葉酸について）反対にして、2系列の実験を実施し、1時間、6時間
および24時間での組織分布を求めた。組織試料の放射能含有量をNaI（Tl）井戸
型検出器で測定した。まず、検出器の窓と閾値を¹²⁵Iからの検出可能な乗り換え
がなく、²¹¹At崩壊を測定するために調整した。次に、²¹¹Atの20半減期に相当す
る時間の経過後、組織試料を¹²⁵I含有量の数量化のために再び測定した。単一核
種および該核種の混合物による放射標識されたHIgG調製物の試料を対照として使
用した。 結果：表1は葉酸塩標識HIgGと葉酸塩化されていない放射標識HIgGとの分布比を
示す。前記比率は、いくつかの組織で抗体上の葉酸塩標識の影響として、わずか
な分布の変化のみを示したが、すべての点で0.7〜1.9の間で維持された。葉酸塩
に結合するレセプターであるために感受性組織と考えられる腎臓について、葉酸
塩標識の重大な影響は確認されなかった。一般に、葉酸塩標識は、放射標識され
た抗体の体内分布に大きな影響はなく、葉酸塩標識された放射性免疫複合体が生
体内での利用に有効であるかもしれないことを示している。 結論：葉酸塩標識されたIgGの腎クリアランスは徐々であり、腎臓中の葉酸塩に
結合するレセプターでの蓄積を妨げるように思われる。また、葉酸塩標識は他の
組織中の放射標識されたHIgGの体内分布に大きな影響はなく、葉酸塩化および放
射標識されたIgGを癌治療に対する有効な道具でありうることを示している。

【００３５】

【表１】

【００３６】

【実施例４】 葉酸および葉酸複合体の結合アッセイ 固定化された葉酸塩に結合するタンパク質（FBP）を、葉酸複合体の結合特性
を検討するために使用した。2.5g／mgタンパク質の葉酸結合能を有するFBP（シ
グマ社製）を、高タンパク質結合性の96ウェル(well) EIA／RIAアッセイプレー
ト（Costar Corning Inc. NY, USA）上に固定化した。 葉酸塩に結合するタンパク質の固定化の検討 FBPをIodogen法により¹²⁵Iで標識し、標識されたタンパク質をPD-10カラムで
反応混合物を溶離することによって単離した。精製¹²⁵I-FBPを、PBS中5〜20g/ml
の範囲の濃度で96ウェルアッセイプレートに添加し、4℃で一晩回転式ラック上
でインキュベートした。ウェル中の液を除去し（L1）、その後、ウェルをPBSで4
回洗浄した（L2）（室温）。このあと、ウェルに2MのNaOHを添加し、約1時間室
温で静置した後、液を除去した（L3）。液体シンチレーションカウンティングに
より各試料の放射能を測定してから、4連の種々の濃度の¹²⁵I-FBPの固定化され
た量をL3/L1+L2の比として求めた。ウェル上に固定化されたFBPが平均1gになる
ような条件を、³H-FAおよび¹²⁵I-FA-HIgGの結合アッセイで使用した。

【００３７】 葉酸塩に結合する固定化されたタンパク質への³H-FAの結合 ウェルをFBPのPBS溶液でインキュベートし、インキュベーション混合物を除去
した後、PBSでウェルを3回洗浄した。被覆されたウェルの半数に5M葉酸のPBS溶
液を添加し、他の半数にPBSのみを添加した。室温で1時間後、液を除去し、その
後、³H-FAを含有する0.1から2.8nMの範囲の濃度（6並列）の葉酸を、ウェルに添
加し、4℃で一晩インキュベートした。葉酸が特異的に結合された割合を、¹²⁵I-
FBPについて記載された方法と同様にして求め、葉酸でプレインキュベートされ
たウェルに保持された³H-FAの割合について補正した。

【００３８】 固定化葉酸塩に結合するタンパク質への¹²⁵I-FA-HIgGの結合 ウェルをFBPのPBS溶液でインキュベートし、インキュベーション混合物を除去
した後、PBSで2回洗浄し、続いてHIgGのPBS溶液（10g/ml）で洗浄した。被覆さ
れたウェルの半数に5Mの葉酸のPBS溶液を添加し、他の半数にPBSのみを添加した
。室温で1時間後、液を除去し、ウェルに¹²⁵I-FA-HIgGを、複合化葉酸について0
.2(4)〜13.(3) nMの範囲の濃度（5並列）で添加した。特異的に結合された¹²⁵I-
FA-HIgGを³H-FAについて上述したように求めた。 結合特性の決定 特異的に結合された³H-FAを、スキャッチャードプロットで³H-FAの濃度に対し
てプロットした（図1）。¹²⁵I-FA-HIgGについて、少なくとも1つの結合−反応性
の葉酸誘導体が各HIgG分子に存在すると仮定して、同様のプロットを実施した。
以下の値を結合アッセイから求めた。

【００３９】 K_aは³H-FAについてのプロットから求められ、2×10⁸であった。 K_aは¹²⁵I-FA-HIgGについてのプロットから求められ、0.5×10⁸であった。（3
つの最低濃度の点だけを考えると、かなり高いK_a値が得られるので、2成分のプ
ロットもまた可能な解にもなり得ることを記載した。） 結論：放射標識された葉酸塩−IgG複合体は、レセプター（葉酸に結合するタン
パク質）に対してかなりの結合親和性を示した。

【００４０】

【実施例５】 OHS-細胞上の葉酸塩化および放射性同位体標識されたTP-3 IgGおよびTP-1 F(ab'
)₂の抗原結合能力 TP-3およびTP-1モノクロナール抗体（Bruland ら, 1986）は、骨肉種細胞に発
現される細胞表面抗原の2つの異なったエピトープに結合する（Bruland ら, 198
8）。これらの抗体を、インビボで抗原に結合する抗体の能力への葉酸塩複合体
化による影響を調べるために使用した。OHS細胞を、13％のウシ胎児血清の代わ
りに10％のウシ胎児血清を用いた以外は、標準的な方法（Larsen ら, 1994a）に
基づいて成長させた。DMSOを添加して細胞を収集し、−80℃で凍結した。 方法：TP-1 F(ab')2およびTP-3 IgGを（上述したように）葉酸塩で標識し、それ
ぞれ2：1および4：1の葉酸塩：抗体比を得た。続いて、TP-3およびTP-1 F(ab')₂ の葉酸塩化されていないものだけでなく葉酸塩標識されたものも、実施例1に記
載したようにN−スクシンイミジル−3−［¹²⁵I］ヨウ化安息香酸を用いて放射標
識した。1細胞当り、平均7.4×10⁵抗原を発現させたOHS骨肉種細胞（Larsen ら,
1994a）の凍結分を溶解し、PBSで2回洗浄、遠心分離してDMSOを除去し、PBS（
１％BSA含有）に400万個／mlの細胞濃度で懸濁した。4mlの試験管にこの懸濁液
を0.3ml添加した。その後、4つの複合体、¹²⁵I-TP-1(Fab')₂−葉酸塩、¹²⁵I-TP-
1 F(ab')₂、¹²⁵I-TP-3、 IgG−葉酸塩のうちの1つ、0.5ngを前記試験管に添加し
た。続いて、試料管を3時間インキュベートした。その後、試験管を放射能につ
いてNaIカウンターで計数し、3回洗浄、遠心分離して放射能を結合した細胞ペレ
ットを計数した。保持された細胞結合能力（RCBA）を以下のように求めた。 RCBA＝葉酸塩標識されたRICの細胞に結合する割合／葉酸塩化されていないRICの
細胞に結合する割合 （RICとは放射性免疫複合体を意味する） 結果：¹²⁵I-TP-3 IgG−葉酸塩対¹²⁵I-TP-3 IgGのRCBAは0.36であり、一方、¹²⁵I
-TP-1 F(ab')₂−葉酸塩対¹²⁵I-TP-1 F(ab')₂のRCBAは0.62であった。これは、い
くつかの免疫反応性は失われたが、抗体は抗原を結合させた骨肉種との反応性が
まだあったことを示す。 結論：葉酸塩で標識された抗体は、原則として抗原と葉酸塩に結合するタンパク
質との両方と反応することができる。すなわち、このような複合体は二元的結合
能力を有する。

【００４１】

【実施例６】 葉酸塩に結合するタンパク質を発現しているOVCAR-3およびHELA-S3細胞への葉酸
塩標識化および放射標識化抗体の結合。OHS細胞を用いた二元的結合能力の実証
方法：OVCAR-3細胞（ヒト卵巣癌）、HELA-S3（ヒト頚癌）を、葉酸塩を発現する
細胞として使用した。該細胞を10％のウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマ
イシンおよびグルタミンを補充したRPMI1640培地で満たされた75cm²のプラスチ
ックフラスコで培養した。回収10日前に、培養培地を10％の胎児血清で補充され
た葉酸塩のないRPMI1640培地で置換し、細胞を収集するまえに葉酸塩に結合する
タンパク質の発現を確実にした。収集された細胞にDMSOを添加し、−80℃で凍結
した。結合アッセイで使用する前に、凍結細胞を溶解し、すぐに1％BSAを含有す
るPBSを添加し、2回洗浄、遠心分離してDMSOを除去した。1％BSAを含むPBSの細
胞懸濁液を、複合体でインキュベートする間、氷上に保持した。結合アッセイを
以下のように実施した。100万個／mlのOVCAR-3およびHELA-S3保存細胞懸濁液を
調製し、0.5mlを2ml容量試験管に添加した。試験管に種々の量の葉酸塩−抗体− ¹²⁵ Iを添加した。非特異的な結合を決定するために、同様の試験管に非葉酸塩化
抗体−¹²⁵Iを同じ濃度で添加した。これらの試験管を振盪機で3時間インキュベ
ートし、放射能を計数し、洗浄した。最後に、放射能を結合させた細胞ペレット
を計数した。以下の複合体を評価した。

【００４２】 葉酸塩−TP-1 F(ab')₂-¹²⁵I（1抗体分子当り約2個の葉酸塩、SIBで標識化（SI
B=N−スクシンイミジル−3−［¹²⁵I］ヨウ化安息香酸）、50MBq/mg）、TP-1 F(a
b')₂-¹²⁵I（SIB標識化、90MBq/mg）、葉酸塩−TP-3-IgG-¹²⁵I（1抗体分子当り約
4個の葉酸塩、SIB標識化、70MBq/mg）、TP-3-IgG-¹²⁵I（SIB標識化、120MBq/mg
）、葉酸塩−HIgG-¹²⁵I（ヨウ化物標識化、400MBq/mg）。

【００４３】 非特異性の対照として、HELA-S3を用いてインキュベートされたTP-3-IgG-¹²⁵I
についてのデータを用いて、OHS細胞で葉酸塩−TP-3-IgG-¹²⁵IおよびTP-3-IgG-^{1 25} Iをインキュベートすることにより補足実験を実施した。 結果：予備データは、葉酸塩に結合するタンパク質との少なくとも2種の相互作
用があることを示す。1つは高い親和性を有し、低濃度（例えば50ng/ml未満）で
飽和する。K_aは、10¹⁰〜10¹²の範囲で、これら低濃度で利用できる限られたデー
タの点により求めた（図2〜4）。1点のアッセイでは、0.1ng/ml濃度の葉酸塩−T
P-3-IgG-¹²⁵I（および非特異的な結合の対照として0.1ngのTP-3-IgG-¹²⁵I）およ
び0.5ml中の5×10⁵個のOVCAR-3細胞を用いたところ、67％の葉酸塩−抗体−放射
性核種が前記細胞に特異的に結合したことがわかった。より高濃度では、親和性
の低い結合が生じるようであった（図5）。結合の飽和は、μg／mlの範囲の複合
体濃度については起こらないように思われた。細胞への結合は、葉酸塩−抗体−
放射性核種複合体の培地濃度での増加とともに直線的に増加するようであった。
注目すべきは、非特異的な結合について補正した場合、OHSの葉酸塩−TP-3-IgG- ¹²⁵ Iの特異的な取り込みは、HELA-S3およびOVCAR-3のそれと同様であったことで
ある（図5）。葉酸塩−TP-3-IgG-¹²⁵I（1抗体当り4つの葉酸塩）の親和性を、非
葉酸塩化TP-3-IgG-¹²⁵Iのそれと比較した（図6）。両方のTP-3型は、OHS細胞に
対してかなりの親和性を有していた。データは、TP-3 IgG抗体の非葉酸塩化型と
比較して、葉酸塩化型についてK_aが約5減少したことを示す。これは、恐らく抗
原に結合する部位でのリジンの修飾による。 結論：葉酸塩−抗体−放射性核種複合体は、細胞中の葉酸塩に結合するタンパク
質（FBP）に著しい結合を示し、これらの複合体を、インビボでFBP−発現腫瘍細
胞を標的とするために使用することができることを示す。また、FBP−陽性のHEL
A-S3およびOVCAR-3細胞ばかりでなく、抗原−陽性OHS細胞に対する葉酸塩−TP-3
-IgG-¹²⁵Iの特異的な結合により示されたように、葉酸塩−抗体−放射性核種複
合体は、二次元的結合能力を有する。

【表２】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、トリチウム標識葉酸塩（³H-FA;上のグラフ）についての結合
アッセイおよびヨウ素-125で標識されたポリクローナルヒトIgG（¹²⁵I-FA-HIgG
；下のグラフ）についての結合アッセイを示す。

【図２】 図２は、10〜50ng/mlの範囲における、HELA-S3細胞への葉酸塩-TPIgG
-¹²⁵Iの結合を示す。

【図３】 図３は、1〜10ng/mlの範囲における、HELA-S3細胞について葉酸塩-HI
gG-¹²⁵Iの結合アッセイを示す。

【図４】 図４は、0、1〜20ng/mlの範囲における、OVCAR-3細胞への葉酸塩-TP-
3IgG-¹²⁵Iの結合を示す。

【図５】 図５は、細胞への特異的な複合体の結合を示す。

【図６】 図６は、OHS細胞上での、葉酸で標識されたVs非葉酸塩化TP-3IgGモノ
クローナル抗体の結合アッセイを示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年７月２２日（２００２．７．２２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ79 QR48 QR51 QR90 QS36 QX07 4C084 AA12 MA66 MA70 NA14 ZB26 4C085 HH03 JJ02 KA03 KA04 KA29 KB11 KB12 KB18 LL18 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA75 EA20

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ３つの構成要素； （１）好ましくはIgGもしくはIgMクラスの抗体または抗体群、あるいはそれらの
   フラグメントもしくはそれらの構築物（たとえばミニボディ（minibody））、 （２）放射性核種または放射性核種混合物、 （３）葉酸塩または葉酸塩誘導体、 からなることを特徴とするレセプターに結合する複合体であって、該複合体が２
   元的な標的結合能力を有するかあるいは有しないことを特徴とする、レセプター
   に結合する複合体。
2. 【請求項２】 前記抗体または抗体群が、２元的な結合能力を有しないポリクローナルIgGで
   あることを特徴とする請求項１に記載のレセプターに結合する複合体。
3. 【請求項３】 前記放射性核種が、アルファ線放射体、ベータ線放射体、ガンマ線放射体、陽
   電子放射体および／またはX線放射体からなる群より選択されうるものであるこ
   とを特徴とする請求項１または２に記載のレセプターに結合する複合体。
4. 【請求項４】 前記放射性核種が、アルファ線放射体、たとえば²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹²Pb
   、²²⁵Ac、²²³Ra、²²⁴Raまたは²²⁷Thであることを特徴とする請求項１〜３のいず
   れかに記載のレセプターに結合する複合体。
5. 【請求項５】 前記放射性核種が、ベータ線放射体、たとえば¹³¹I、⁹⁰Yまたは¹⁵³Smであるこ
   とを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のレセプターに結合する複合体。
6. 【請求項６】 前記放射性核種が²¹¹Atまたは¹²⁵Iであることを特徴とする請求項１〜３のい
   ずれかに記載のレセプターに結合する複合体。
7. 【請求項７】 ３つの構成要素； （１）好ましくはIgGもしくはIgMクラスの抗体または抗体群、あるいはそれらの
   フラグメントもしくはそれらの構築物（たとえばミニボディ（minibody））、 （２）放射性核種または放射性核種混合物、 （３）葉酸塩 からなることを特徴とする、レセプターに結合する複合体を製造する方法であっ
   て、 前記方法が抗体の放射性核種標識および葉酸塩標識に関する標準的な手順を用
   いることを特徴とする、レセプターに結合する複合体を製造する方法。
8. 【請求項８】 1〜50単位の葉酸塩が付加され、 放射線治療に有用ないずれかの放射性核種で標識され、 前記放射性核種と、抗体、抗体フラグメントまたは抗体構築物との間に、リンカ
   ーを使用するか使用しないで 抗体、抗体フラグメントまたは抗体構築物からなる複合体を製造する工程を含み
   、前記放射能標識が、抗体、抗体フラグメント、抗体構築物の葉酸塩標識の前に
   または同時にまたは後に行われるようにすることを特徴とする、レセプターに結
   合する複合体を製造する方法。
9. 【請求項９】 前記放射性核種が、アルファ線放射体、ベータ線放射体、ガンマ線放射体、陽
   電子放射体および／またはX線放射体からなる群から選択されうるものであるこ
   とを特徴とする請求項７または８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記放射性核種が、アルファ線放射体、たとえば²¹¹At、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹²Pb
    、²²⁵Ac、²²³Ra、²²⁴Raまたは²²⁷Thであることを特徴とする請求項７〜９のいず
    れかに記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記放射性核種が、ベータ線放射体、たとえば¹³¹I、⁹⁰Yまたは¹⁵³Smであるこ
    とを特徴とする請求７〜９のいずれかに記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記放射性核種が、放射線誘導手術に有用な放射体、たとえば¹²⁵Iであること
    を特徴とする請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記抗体または抗体フラグメントがポリクローナルヒト抗体、または他の種か
    らのポリクローナル抗体であることを特徴とする請求項７〜１２のいずれかに記
    載の方法。
14. 【請求項１４】 前記抗体または抗体フラグメントが、 葉酸塩結合タンパク質とは別の抗原に対する結合親和性を有するかあるいは有せ
    ず、マウスまたはキメラまたは充分にヒト化したモノクローナル抗体であること
    を特徴とする請求項７に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記抗体または抗体フラグメント自体が、葉酸塩結合タンパク質とは別の抗原
    に対する結合親和性を有する、すなわち、前記複合体は、葉酸塩が複合体化して
    いる場合には２元的レセプター親和性を有することを特徴とする請求項８および
    １４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 ヒトを含む哺乳動物への注射または注入に好適な製薬剤溶液を製造するための
    、請求項１〜５のいずれかに記載の葉酸塩−抗体−放射性核種複合体の使用。
17. 【請求項１７】 静脈内および／または局所および／または腫瘍内への投与経路により、ヒトを
    含む哺乳動物への注射または注入に好適な製薬剤溶液を製造するための請求項１
    ６に記載の葉酸塩−抗体−放射性核種複合体の使用。
18. 【請求項１８】 レセプター含有細胞（組織）を画像化する目的で、ヒト患者を含む哺乳動物へ
    の注射または注入による、葉酸塩結合タンパク質を発現している細胞を標的とす
    るための請求項１６に記載の複合体の使用。
19. 【請求項１９】 葉酸塩結合レセプター（群）を発現している悪性細胞（組織）に強力な治療用
    放射線を照射する目的で、ヒト患者への注射により、葉酸塩結合タンパク質を発
    現している細胞を標的とするための請求項１６に記載の複合体の使用。
20. 【請求項２０】 悪性組織が、脳、肺、子宮頚管、卵巣または乳房のガンである場合に、葉酸塩
    レセプター（群）を発現している悪性細胞（組織）に強力な治療用放射線を照射
    する目的で、ヒト患者への注射により、葉酸塩結合タンパク質を発現している細
    胞を標的とするための請求項１６に記載の複合体の使用。
21. 【請求項２１】 葉酸塩結合タンパク質を発現しているガンを治療するため、葉酸塩-および放
    射能標識されたIgG、IgM、またはそれらのフラグメント、およびいくつかの放射
    性免疫複合体および／または他の形態の放射性製剤治療、化学療法、外部光線治
    療または手術の併用における請求項１６に記載の使用。
22. 【請求項２２】 葉酸溶液を含むバイアルと、カップリング活性化剤（たとえば、1-エチル-3-(
    3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド）の溶液を含むバイアルとを含んで
    なり、使用にあたり、抗体または抗体フラグメントを含む溶液に添加する前に、
    前記２つのバイアルの内容物が結合されることを特徴とする、請求項７〜１５に
    記載の葉酸塩標識抗体または抗体フラグメントを調製するためのキット。
23. 【請求項２３】 ２つのバイアルと、放射性同位元素または プレラベルされるか放射性元素で後に標識され得て、共有結合かキレート化の
    手段によって、抗体または抗体フラグメントと結合しうるリガンド を含有する溶液を含む３つ目のバイアルを含んでなる葉酸塩および放射性同位元
    素で標識された抗体または抗体フラグメントを調製するための請求項２２に記載
    のキット。
24. 【請求項２４】 活性成分が、（１）IgM、IgGまたはそれらのフラグメントおよびそれらの構築
    物であって、（２）放射性核種で標識され、（３）抗体自身のレセプター親和性
    とは別のレセプター親和性を有する一般の分子（たとえば、エストロゲンまたは
    その誘導体またはテストステロンまたはその誘導体）からなる複合体である場合
    に、２元的結合能力の原理に基づいた放射線療法または放射線検出に好適な製薬
    剤溶液の製造。