JPH10508832A

JPH10508832A - 腎臓による取り込みが減少する修飾放射性抗体フラグメント

Info

Publication number: JPH10508832A
Application number: JP8510937A
Authority: JP
Inventors: グリフィス，ゲイリー・エル; ハンセン，ハンス・ジェイ; カラケイ，ハビベ
Original assignee: イムノメディクス，インコーポレイテッド
Priority date: 1994-09-20
Filing date: 1995-09-18
Publication date: 1998-09-02
Also published as: ES2188671T3; EP0784634A1; DE69529084T2; CA2200482C; WO1996009325A1; DE69529084D1; EP0784634B1; US5670132A; EP0784634A4; IL115255A0; DK0784634T3; AU3674995A; CA2200482A1; ATE229035T1; IL115255A

Abstract

(57)【要約】腫瘍および感染病巣の放射免疫検出に有用であり、ＰＥＧで修飾していないフラグメントと比較して腎臓による放射性同位体の取り込みと保持を顕著に減少する作用がある、ＰＥＧで修飾され、Ｔｃ−９９ｍで放射能標識された抗体フラグメント。

Description

【発明の詳細な説明】腎臓による取り込みが減少する修飾放射性抗体フラグメント背景技術本発明は、放射免疫診断（RAID）に使用されるモノクローナル抗体フラグメントの腎臓による取り込みを減少する方法に関する。放射能標識された抗体が、疾病の放射線免疫検出に有用であることは、これまでに数多くの臨床研究により証明されてきた。テクネチウム−９９ｍ（technetium-99m）放射性同位体で標識された抗体は、すべての核医学機関にとり入手が容易で、安価であり、患者の放射線被曝量は最小で、しかも核イメージング特性も理想的であることから、この分野で好ましい薬剤であるとされている。テクネチウム−９９ｍの半減期は６時間しかないので、無傷(intact)のイムノグロブリンよりも早く標的に到達できるＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ）₂などの抗体フラグメントと併用することが最も好適である。これらのフラグメントには、この他にも、無傷のイムノグロブリンと比べて、ヒト免疫応答の発生頻度が遥かに低いという利点がある。放射性免疫検出剤の好ましい形態は、タンパク質と過テクネチウム酸塩還元剤を充填したバイアルに、過テクネチウム酸ナトリウムを添加することによって、固有のジスルフィド結合の還元によって生じたチオール基を含有するフラグメントを定量的に標識することからなる、テクネチウム−９９ｍを直接的に標識した抗体フラグメントの使用である。最近開示された新規のタンパク質・チオール化剤を用いる方法を始めとする、他のＴｃ−９９ｍ標識フラグメントの調製方法も有用である。例えば、米国特許出願第０８／２５３，７７２号を参照されたい。Ｔｃ−９９ｍの標識を付けたフラグメントでイメ−ジングを実施する場合、腎臓での放射能の取り込みと保持が比較的に高いため、腎臓領域のイメ−ジングが難しくなるという大きな欠点がある。このため、放射能標識された抗体フラグメントの腎臓による保持を少なくする方法が強く求められていることは明かである。発明の要旨したがって、本発明の目的は、腎臓による取り込みと保持とを大幅に減少する効果があるＴｃ−９９ｍ標識を付けた抗体フラグメントの調製方法を提供することにある。本発明の他の目的は、腎臓による取り込みと保持とを大幅に減少する効果があるＴｃ−９９ｍで最終的に標識されるイメ−ジング剤先駆物質を調製する方法を提供することにある。本発明の上記及びその他の目的を達成するため、腫瘍または感染病巣から生じる、またはこれらに関連するマ−カ−と特異的に結び付くＴｃ−９９ｍ放射能標識抗体フラグメントを、腫瘍または感染病巣を持つ患者に非経口的に注入した後、腫瘍または感染病巣の部位が、ガンマ・カメラによるイメ−ジングによって検出される。本発明の腫瘍または感染病巣のイメ−ジング方法の改良点は、標識の付いた抗体フラグメントが、ＰＥＧ化（non-PEGylated）していない抗体フラグメントと比較して、腎臓による標識の取り込みと保持を有意に減少させるのに充分な量のポリエチレン・グリコ−ル（PEG）と複合する点にある。本発明は、さらに、Ｔｃ−９９ｍ放射性同位体で最終的に標識されるイメ−ジング剤先駆物質を調製する方法も提供する。発明の詳細な説明腫瘍または感染病巣に関連する抗原を認識する抗体フラグメントを、ポリエチレン・グリコ−ル（PEG）と複合させた後、さらに修飾して、テクネチウム−９９ｍによる放射能標識を付ける。このようにしても抗体の免疫反応性に影響はなく、また、後日のテクネチウムによる放射能標識のために、ＰＥＧ−フラグメントの複合体を安定に調製し得る。ＰＥＧで修飾し、Ｔｃ−９９ｍで放射能標識したフラグメントは、免疫診断に有用であるばかりでなく、ＰＥＧ修飾していないフラグメントと比較して、腎臓による放射性同位体の取り込みを顕著に減少させる効果がある。本明細書中において、腎臓による放射性同位体の取り込みと保持の「有意な」減少とは、イメ−ジング時において、ＰＥＧ化していない抗体フラグメントの同じイメージング時における場合と比べて、少なくとも２倍、好ましくは３倍、より好ましくは４倍、６倍、８倍、１０倍以上の程度にまで減少することを意味する。腎臓による放射性同位体の取り込みと保持の「有意な」減少の他の尺度としては、特に短いイメ−ジング時間、例えば５〜１０時間では、ＰＥＧ化していない抗体フラグメントを使用すると、腎臓隣接領域の高いバックグラウンドの放射線によって、腫瘍や感染病巣がかすんでしまうが、同一のイメ−ジング時間内でこれを鮮明に検出し、イメ−ジングすることができる性能を挙げることができる。一般に、この減少は、短いイメ−ジング時間で最も著しく、臨床家にとっての現実の利益となる。テクネチウム−９９ｍの半減期は６時間であるため、テクネチウムの標識を付けた抗体が早く標的に到達することが望まれる。Ｆ（ａｂ’）₂、やＦ（ａｂ）₂ などの抗体フラグメント、特にＦａｂ’とＦａｂは、全イムノグロブリンよりも速いスピ−ドで標的に到着することができ、そればかりでなくヒト抗ネズミ抗体（HAMA）免疫応答の発生頻度が極めて低い。したがって、これらの抗体フラグメントは、Ｔｃ−９９ｍ標識と併用してＲＡＩＤに好ましく適用される。従来の研究者らは、ポリエチレン・グリコ−ル・ポリマ−とタンパク質とを複合(conjugate)させると、タンパク質類の免疫原性が減少し、血液中を循環するタンパク質の寿命を延ばす効果のあることを立証した。例えば、２種のヒト・モノクロ−ナル抗体へのＰＥＧの複合は、マウスの免疫原性の著しい低下を引き起こし、また同時に、在来のヒト抗体による攻撃に対する該マウス中における寛容を誘導した。Wilkinson et al.，Immunol．Lett．15:17 (1987)を参照されたい。他の例では、カタラ−ゼをＰＥＧ−５，０００と結合させると、その複合体は、在来のカタラ−ゼの酵素活性の９５％を保持していたが、これをマウスに注射しても有意な免疫応答を誘導しなかった。さらに、ＰＥＧと複合したカタラ−ゼは、注射後５２時間、マウスの血流中で完全な活性を保っていたが、在来のカタラ−ゼの活性は、注射後１０時間以内にバックグラウンドのレベルにまで低下してしまった。Abuckowski et al.，J.Biol．Chem．252:3582 (1977)を参照されたい。抗体フラグメントは、問題となるＨＡＭＡ反応を引き起こさず、標的への到達も早いので、通常はイメ−ジング用フラグメントをＰＥＧ化する必要はないかもしれない。本発明者らは、ＰＥＧとＴｃ−９９ｍ標識抗体フラグメントを複合させると、腎臓によるこのフラグメントの取り込み量と保持量が顕著に減少することを発見した。タンパク質へのＰＥＧの複合（「ＰＥＧ化」）が、血清の半減期を長くすることは、周知の事実である。ところが、驚くべきことに、また予期せぬことに、通常は腎臓に対してクリアーであり、しばしば腎臓の隣接領域の腫瘍や感染の像をぼかしてしまうＦ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂、ＦａｂおよびＦａｂ ’の抗体フラグメントをＰＥＧ化すると、腎臓によるこれらのフラグメントの取り込みと保持が劇的に減少するのである。このことは、Ｔｃ−９９ｍ標識でイメ −ジングするために、抗体フラグメントをＰＥＧで修飾する動機づけを従来欠いていたことを示す。Ａ．抗体フラグメントの調製とＰＥＧ複合本明細書で用いる「抗体フラグメント」の語は、相補的抗原と特異的に結合する分子を意味し、この分子は、切断、組換え法、あるいは従来の抗体フラグメントと同等の機能をもつフラグメントを得ることができるその他の方法によって、全イムノグロブリンから誘導される。好適な抗体フラグメントの例としては、二価のフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆ（ａｂ’）₂；一価のフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’；Ｆｖ；およびこれらの一本鎖組換え体などを挙げることができる。一部の天然抗体では、Ｆｃ部以外で炭水化物を含有している場合がある。例えば、共通グリコシル化受容体配列(consensus glycosylation accepto r sequences)は、ネズミ可変部の約１５〜２５％で確認されている。Kabat et a l.，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，5th ed．US．Departm ent of Health and Human Services (1990)を参照されたい。代わりに、組換えＤＮＡ法を使って、例えば抗体フラグメントのＬ鎖に炭水化物(carbohydrate)を導入することもできる。ＰＥＧ剤は、広く各種の平均分子量を持つものを調製して、本発明に使用することができる。好適なＰＥＧの平均分子量は、例えば１，０００〜３０，０００である。好適な態様においては、平均分子量５，０００のＰＥＧが使われている。本発明の実施に好適なＰＥＧは、商業ベースでも、例えばAldrich（Milwaukee ,WI）やShearwater Polymers（Huntsville，AL）から入手することができる。抗体フラグメントのＰＥＧ化の方法としては、ＰＥＧをフラグメント全体に分布しているリシン残基と部位非特異的に結合する方法と、分子のヒンジ部Ｌ鎖中の炭水化物部分やチオ−ル基のような部位と部位特異的（site-specifically）に結合する方法の二つがある。部位非特異的に、抗体フラグメント内のリシン残基にＰＥＧを複合させるには、ＰＥＧの活性エステル誘導体を使用する。好適な活性エステル誘導体としては、ペンタフルオロフェノ−ル、Ｎ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾ−ルおよびＮ− ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）のエステル類が挙げられる。好適な態様においては、炭酸塩を使って、ＰＥＧとタンパク質との間のウレタン結合を作っている。ＰＥＧと過剰のＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジル・カーボネートとを反応させて、ＰＥＧ−スクシンイミジル・カーボネート（PEG-SC）を調製するか、あるいはこのＰＥＧ−ＳＣをShearwater Polymers Inc.（Hunntsville，AL）から購入する。このＰＥＧ−ＳＣを抗体フラグメントのリシン残基と結合させるためには、過剰のＰＥＧ−ＳＣを、ｐＨが約７〜約９の緩衝水溶液中でフラグメントと混合する。反応を放置して０．５〜１８時間進行させる。反応温度は約４℃〜２５℃ である。好適な態様においては、ｐＨは約８．４に維持し、温度は２５℃、反応時間は３０分である。炭酸塩および過剰のＰＥＧ−ＳＣと反応し得るリシン残基の数、ならびに抗体がどの程度の抗原結合能を持っていなければならないかの必要度によって、抗体と結合するＰＥＧの量が限定されるであろう。一般に、二価のフラグメントには約２〜２０個、好ましくは４〜１０個のＰＥＧ−５，０００部分が、一価のフラグメントにはその約半数が必要とされ、ＰＥＧの分子量が大きくなるにつれて必要個数が小さくなる。好適な態様においては、二価のフラグメントのＰＥＧ化に６〜１０倍量の過剰のＰＥＧ−ＳＣが使用される。これは、通常、４〜１０個のリシンをＰＥＧ化し、さらに二価のフラグメントが切断されたときに、一価のフラグメント１個当り２〜５個のＰＥＧ基を翻訳する。修飾されるリシン残基の数は、フルオレサミンを用いる定量分析によって測定することができる。その後、ＰＥＧ−抗体の複合体を、サイズ排除クロマトグラフィ−、例えばＢｉｏＳｉｌ４００カラム（BioRad，Hercules，CA）上のＨＰＬＣによって精製する。次に、部位特異的にチオ−ル基をＰＥＧ化していながら、ジスルフィド結合を保持していて、還元後にＴｃ−９９ｍを結合するのに使うことができる抗体フラグメントを調製するために、無傷のイムノグロブリンを出発原料として使用するのが有利である。先ず、無傷のイムノグロブリンを弱い条件下で部分還元して遊離チオ−ル基を形成する。その後、遊離チオ−ル基を、チオ−ル類と選択的に反応できるＰＥＧ誘導体と反応させる。この反応に好適なＰＥＧ誘導体としては、 α−ハロ・カルボニル、α−ハロ・カルボキシル、ジスルフィド類およびマレイミド基類が挙げられる。これら誘導体の製法と使用法は、当業者によく知られている。チオ−ル選択的な活性化ＰＥＧ誘導体は、また、商業ベ−スで、例えばSh earwater Polymers（Huntsville，AL）から入手することができる。このようにしたＰＥＧ−抗体複合体は、サイズ排除クロマトグラフィ−で精製し、標準的方法によりペプシンでタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメントを、またはパパインで切断してＦ（ａｂ）₂フラグメントを形成する。フラグメントに炭水化物残基がある場合でも、ＰＥＧと抗体フラグメントとを部位特異的に複合させることができる。無傷のイムノグロブリンのＦｃ部をグリコシル化して、このグリコシル化部位を便宜的に複合反応に使うのである。しかしながら、Ｆ（ａｂ’）₂などの抗体フラグメントにはすべてＦｃ部が欠けているので、残念ながら結合に使う炭水化物がない。一部の抗体では可変部内がグリコシル化されているため、対応するフラグメント中にこの炭水化物が保持されている場合がある。この場合には、炭水化物部分を過ヨウ素酸塩で酸化して、常法により、求核アミン残基を持つＰＥＧ誘導体と結合させる。例えば、ＰＥＧヒドラジド（Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，AL）を抗体フラグメントと混合して、ヒドラゾンを形成する。代わりに、ＰＥＧ−アミンを上記の酸化炭水化物と反応させてシッフ塩基を形成した後、シアノボロ水素化ナトリウム（sodi um cyanoborohydride）と反応させて還元し、安定な第２級アミン結合を形成してもよい。さらにその代わりに、使用する抗体フラグメントに固有のＬ鎖炭水化物がない場合、米国特許出願第０８／１６９，９１２号で説明されているように、この抗体をコ−ドしているＤＮＡのクロ−ンを作り、突然変異させて可変部Ｌ鎖炭水化物部分を含有する組換え抗体フラグメントを形成してもよい。上記の米国特許出願第０８／１６９，９１２号を引用することによりその全文を本明細書の一部とする。複合体が、複合前のフラグメントと同等の結合活性を持っていることを証明することは、すべての複合方法にとって有利なことである。免疫反応性の測定方法は当業者によく知られている。例えば、複合していないフラグメントならば１００％保持される条件下で、抗原をカラムに充填しておき、このカラム内に複合抗体フラグメントを通過させて、この抗体が保持されている量と保持されなかった量を測定し、比較する。Ｂ．ＰＥＧ−抗体フラグメントの還元または誘導体形成とテクネチウム標識付け抗体フラグメントをＰＥＧと複合させた後、還元するか、あるいは他の方法で誘導体を形成して、Ｔｃ−９９ｍを直接標識付けするのに好適な遊離チオ−ル基を得る。制御しながら抗体フラグメントを還元する方法は、通常程度の技術を持つ当業者にもよく知られている。例えば、米国特許第５，１２８，１１９号を参照されたい。この米国特許は引用することによりその全文を本明細書の一部とする。一般に、抗体フラグメントのヒンジ部にあるジスルフィド結合は、一般的に、ジスルフィド還元剤に対してより接近し易く、通常、選択的に切断することが可能である。慎重な制御条件下で還元を行いさえすれば、還元されたフラグメントは、免疫特異性と抗原に対する結合能を保持するものである。抗体フラグメントを公知のジスルフィド結合還元剤、例えばジチオトレイト−ル、システイン、メルカプトエタノ−ル、その他で還元すると、短時間で、典型的には１時間以内に少なくとも１個の遊離スルフヒドリル基を持つフラグメントが形成される。還元条件が厳しすぎたり、あるいは還元剤をあまりに長時間フラグメントと接触したままにしておくと、Ｌ鎖とＨ鎖を結び付けている通常は反応性の低いジスルフィド結合が、結局のところ還元されて、抗体の結合特性に悪影響を与えるので注意しなければならない。Ｆ（ａｂ’）₂およびＦ（ａｂ）₂フラグメントを還元すると、これら二価のフラグメントの両半分をつなぎ止めているジスルフィド結合が優先的に切断され、各々遊離チオ−ル基を持つＦａｂ’およびＦａｂフラグメントが形成される。二価のＦ（ａｂ’）₂やＦ（ａｂ）₂フラグメントでイメ−ジングを行うことを所望する場合には、フラグメントをさらに切断することなく鎖間ジスルフィド結合を部分還元すること、あるいはチオ−ル基を持つリガンドを常法により部位非特異的に導入するか、または炭水化物部分、好ましくはフラグメントのＬ鎖不変部に操作して作った炭水化物部分に導入して、フラグメントをチオ−ル化することのいずれかが必要である。抗体−ＳＨ部分は、一旦還元すれば、厳格な無酸素条件下で貯蔵しさえすれば極めて安定である。また、低いｐＨ、特にｐＨ６以下で貯蔵すると、安定性は増大する。遊離チオ−ル基を含有する抗体フラグメントは、液体窒素温度まで急速冷却すると、チオ−ル基を劣化させたり大量に失うことなく、長期間貯蔵できることがこれまでに見いだされている。フラグメント−ＳＨをチュ−ブに充填して、アルゴンまたは窒素などの不活性ガス雰囲気中に蔵置しておくと、低温保護効果が増進し、チオ−ル基が再酸化してジスルフィド類に戻るのを効果的に防止することができると信じられている。テクネチウムの還元に用いられる薬剤を複合体に混合することによっても、遊離チオ−ル基を安定にすることができる。好適な態様においては、この還元剤として２価のスズ塩を添加している。この塩は、必要に応じて、箔、顆粒、粉末、けずり屑等のスズ金属と、ＨＣｌ等の水溶性の酸とを接触させて、作ることができる。通常、２価のスズ塩は、ＳｎＣｌ₂の形で、便宜上その０．１ｍＭをＨＣｌに溶解して溶液とする。この溶液を、酒石酸塩、グルコヘプタン酸塩、グルカル酸塩などの２価のスズ・イオンのキレ−ト化リガンド溶液中に添加して、Ｓｎ^II を生理ｐＨの溶液中に維持する。その上で、このスズ（ＩＩ）溶液を抗体に添加する。このようにして得た混合物は、凍結溶液として貯蔵することができ、または、好ましくは凍結乾燥粉末として貯蔵することもできる。このようにして還元剤の存在下で複合体を貯蔵すると、チオ−ル基の再酸化を防止できるばかりでなく、後述のような放射性核種の還元のための追加工程が不要になり、有利である。ＰＥＧ複合体と還元剤の混合物を、Ｔｃ−９９ｍ標識付け用単品バイアルあるいはキットに収集することができる。必要に応じてＴｃ−９９ｍをキットに添加して、放射能標識を付けた抗体フラグメントを作ることができる。本発明の単品バイアルやキットに適当な抗体フラグメントを入れて、特定の免疫診断法用に設計することもできる。これらのバイアルやキットは、便宜上密閉されるが、無菌条件で試薬を出し入れできるメカニズムを付ける。好ましくは、注入器のための注入口を備えるバイアルを本方法で使用する。バイアルやキット中の試薬の剤形は典型的には、水溶液、凍結剤または凍結乾燥剤である。好適な態様においては、試薬は、冷蔵庫等で低温貯蔵し、貯蔵期間は数日間〜数週間であり、ｐＨは好ましくは約３．５〜５．５、より好ましくは４．５〜５．０であって、例えば、窒素またはアルゴンなどの不活性ガス雰囲気下で貯蔵すると有利である。また、貯蔵と安定化が容易な凍結乾燥剤形の試薬を提供することも本発明の範囲内である。この凍結乾燥は、有利には、ｐＨを約５．５とし、例えば、酢酸ナトリウムなどの緩衝剤の溶液を用い、さらに凝集を防ぐ安定剤、例えばトレハロ −スやシュ−クロ−スなどの糖質の存在下で行うのが好ましい。このような凍結乾燥条件は、従来からのものであり、通常程度の技術を持つ当業者にもよく知られている。Ｔｃ−９９ｍによる標識付けは、放射性同位体を過テクネチウム酸ナトリウム水溶液などの形の発生剤から直接形成し、この同位体を還元剤と還元済みのＰＥＧ−抗体複合体との混合物に添加することによって、簡単に達成することができる。反応物を混合し、抗体フラグメントの標識付けが完成するに充分な時間をかけてインキュベ−トする。インキュベ−トの持続時間と条件は重要ではないが、典型的にはＴｃ−９９ｍが抗体フラグメントに定量的に結合するのに充分な時間、インキュベ−トする。通常は塩類溶液中のＰＥＧ複合体の濃度が、普通は塩類溶液１ｍｌ当り約０．０１〜１０ｍｇ、好ましくは約０．１〜５ｍｇ／ｍｌで、またｐＨは弱酸の約４．０〜４．５に調整したものを用いると一般的に有利である。この場合、過テクネチウム酸塩の通常のイメ−ジング活性を還元するのに必要な２価のスズ・イオンの量は、タンパク質の量と釣合を取って、約０．１〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜２５μｇ／ｍｌである。上記量のタンパク質の標識付けをする場合、過テクネチウム酸塩の量は、タンパク質１ｍｇ当り約２〜５０ｍＣｉであり、反応時間は０．１〜１０分である。タンパク質と２価のスズ・イオンが好適な濃度である場合、過テクネチウム酸塩の量は、好ましくは約５〜３０ｍＣｉ／ｍｇであり、反応時間は好ましくは約１〜５分である。過テクネチウム酸塩は、一般に市販の発生剤から得ることができ、剤形は、最も一般的にはＮａＴｃＯ₄を塩類溶液に溶解した溶液である。他の剤形の過テクネチウム酸塩も使用することができるが、この場合、新剤形の発売元の提案、あるいは通常程度の技術を持つ医療関係者の考えにしたがって、用法を適当に変える必要がある。過テクネチウム酸塩は、一般的には、塩類液、例えば０．９％（「生理的」）塩類液に含有されている約０．２〜１０ｍＣｉ／ｍｌの活性のものであって、これを約３〜７、好ましくは約４．５〜５．０のｐＨに緩衝したものを用いる。好適な緩衝剤としては、例えば酢酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、リン酸塩などが挙げられる。過テクネチウム酸塩の還元は、通常、窒素やアルゴンなどの不活性ガス雰囲気下で行われる。反応温度は、一般にほぼ室温、例えば１８ ℃〜２５℃である。Ｃ．標識を付けた診断用ＰＥＧ−抗体フラグメントの投与一般に、標識を付けたＰＥＧ複合体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、一般的医療条件、および病歴などの要因によって異なる。典型的には、患者のタンパク受取量が約１ｐｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（薬剤量／患者の体重）の範囲となるように投与することが望まれる。しかしながら、量がこれよりも少なくてもよいし、大きくてもよい。例えば、多くの研究では投与量が０．１〜１．０ミリグラムであると良好な診断イメ−ジングを行えることを示している反面、他の研究では、１０ミリグラムを超える量を投与して、位置測定を改善したとしている。Brown，"Clinical Use of Monoclonal Antibodies,"in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY，Pezzuto et al.，eds．Chapman & Hall，pp.227-249 (1993)を参照されたい。標識を付けたタンパク類の患者への投与経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜腔内、鞘内に、局所カテ−テルをつないで行う灌流、または病巣内直接注入である。注入（injection）による投与の場合、連続注入であるか、あるいは一回または複数回の大量投与である。本発明の放射能標識されたＰＥＧ複合体は、公知の方法により、製薬的に有用な組成物を調製することができる。それによって、製薬的に許容できる担体を含む混合物中に結合させることができる。組成物を投与した患者に対し、寛容である場合、この組成物を「製薬的に許容できる担体」という。無菌リン酸緩衝塩類溶液は、製薬的に許容できる担体の一例である。他の好適な担体も当業者によく知られている。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，18th Ed．(199 0)を参照されたい。本発明は、上記で一般的に説明してきたが、より容易に理解されるため、以下、実施例により説明する。但し、これらの実施例は本発明を限定することを意図するものではない。実施例実施例１．リシンとの複合によるＰＥＧ修飾フラグメントの調製ＩＭＭＵ−１４は、多くの腫瘍中で発現する細胞表面タンパク質である癌胎児抗原（ＣＥＡ）を認識するモノクロ−ナル抗体である。常法を用いるパパイン切断によりＩＭＭＵ−１４のＦ（ａｂ）₂フラグメントを調製した。ＩＭＭＵ−１４Ｆ（ａｂ）₂（2.16 mg，2.16×10^-8モル）を０．１Ｍリン酸ナトリウム１５０μｌ中に溶解した溶液を、モル比で１０倍量、８倍量、６倍量、４倍量、２倍量のメトキシ−ＰＥＧのスクシンイミジル・カーボネート誘導体（methoxy-SC-PEG、MW 5000，Shearwater Polymers，Inc.，Huntsville，AL）とｐＨ７．５で混合して、４℃で１８時間インキュベ−トした。このＰＥＧ修飾複合体を、セファデックスＧ−５０−８０（Pharmacia，Piscataway，NJ）を用いたスピン・カラムに充填し、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウムで溶離したものを遠心分離することによって、ＰＥＧ修飾複合体を精製した。精製複合体をＢｉｏＳｉｌ４００サイズ−排除ＨＰＬＣカラム（BioRad，Hercules，CA）により分析した。各種ＰＥＧ複合体のカラムでの保持時間が、反応体の比率によって、次の表に示すように異なることが観察された。（ＰＥＧ）−ＩＭＭＵ−１４Ｆ（ａｂ）₂の高分子複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、予期していたように不均一であることが認められた。１０当量のＰＥＧと反応させて調製したＰＥＧ−ＩＭＭＵ−１４Ｆ（ａｂ）₂をフルオレサミン分析したところ、ＰＥＧで修飾された、利用可能なリシン残基を２２．５％（リシン残基８．５個）含有していることが分かった。以下これをＰＥＧ_8. ₅ −ＩＭＭＵ−１４−Ｆ（ａｂ）₂と言う。実施例２．ＰＥＧ_8.5−ＩＭＭＵ−１４−Ｆ（ａｂ）₂からＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂへの還元修飾していないＦ（ａｂ）₂に使用した条件と同様にして、ＰＥＧ_8.5−ＩＭＭＵ−１４−Ｆ（ａｂ）₂のヒンジ部ジスルフィド結合にシステインを加えることにより還元して、ＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂ−ＳＨを得た。Ｆ（ａｂ）₂（１５ｍｇ／ｍｌ）を、システイン２０ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、およびＰＢＳ４０ｍＭを含有するｐＨ６．６の溶液中で３７℃で６０分間還元した。ＰＥＧ_8.5 −ＩＭＭＵ−１４−Ｆ（ａｂ）₂の還元によって得たこのＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂ−ＳＨを、サイズ排除ＨＰＬＣとＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、ＰＥＧと抗体フラグメントとの複合の程度が異なることを示す、分かれていない肩２個を持つ幅広いピ−ク１個が認められた。ＨＰＬＣでのＰＥＧ_4.25 −Ｆａｂ−ＳＨの保持時間は、９．３４分、肩まででは９．６７分と１０．０８分であった。修飾されていないＦａｂが存在する証拠は認められなかった（保持時間１０．６８分）。実施例３．Ｔｃ−９９ｍの放射能標識付けに用いるＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ− １４−Ｆａｂ製剤の調製バイアル１個当り、ＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂのアリコ−ト２００ μｇ、第一スズ・イオン３８μｇおよび酒石酸ナトリウムをモル比でＳｎ（ＩＩ）の３５倍量を充填して製剤を調製した。バイアルをドライアイスで凍らせて、一晩かけて凍結乾燥した。このＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂ−ＳＨの凍結乾燥バイアルを塩類液で溶かして、ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、凍結乾燥していないサンプルとの安定性の比較分析を行った。新しく調製したサンプルと凍結乾燥サンプルとの間には少しの違いもなく、ＰＥＧ−抗体の結合は凍結乾燥条件下でも安定であることが証明された。実施例４．ＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂの^99mＴｃ標識付け実施例３と同様にして凍結乾燥バイアルを調製し、Ｎａ^99mＴｃＯ₄（１〜４ｍＣｉ）をアルゴンでパ−ジした塩類液に溶解した溶液１ｍｌで該バイアルを溶かすことにより、^99mＴｃ標識付けを行った。この標識付けは、ＨＰＬＣと瞬間薄層クロマトグラフィ−（ＩＴＬＣ）でモニタ−した。ＨＰＬＣ法によって、^99m Ｔｃ標識を付けたＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂフラグメントの免疫反応性を測定した。モル比で８０倍量のＣＥＡを^99mＴｃ標識物に混合して、この混合物をＨＰＬＣで分析した。^99mＴｃ−ＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４−ＦａｂがＣＥＡに結合すると直ちに、対応するＨＰＬＣピ−クは、保持時間を高い分子量にシフトさせ、抗体が基本的にすべてＣＥＡに結合したこと、およびＰＥＧ複合体が^99mＴＣ標識を付けた後でも免疫反応性を保持していたことを示していた。実施例５．実験動物に対する^99mＴｃ−ＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂの注入後の生物学的分布 ^99mＴｃ標識を付けたＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂ−ＳＨおよびＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂ−ＳＨの腎臓への取り込みについて、比較実験を行った。２群の通常のＢａｌｂ／Ｃマウスに、^99mＴｃ標識を付けたＩＭＭＵ−１４−Ｆａｂ−ＳＨ（第１群）または^99mＴｃ標識を付けたＰＥＧ_4.25−ＩＭＭＵ−１４− Ｆａｂ−ＳＨ（第２群）を、１匹当り１００μＣｉづつ、静脈内に注射した。各群から５匹づつ、注射の１時間後、４時間後および２４時間後に殺して、組織を採取、重量を計量して、ガンマ・カウンタ−による測定を行った。各組織の注射量／ｇを％で下記の表２に示す。実施例６．高ｐＨ値と高温度によりＰＥＧ複合を形成する別法ＩＭＭＵ−１４−Ｆ（ａｂ）₂を０．１Ｍリン酸ナトリウムに溶解したｐＨ８．２の溶液のｐＨを、飽和三塩基性リン酸ナトリウムで８．５８に上昇させた。この溶液２２１μｌ（3.52mg IMMU14-F(ab)，3.52×10^-8モル）に、ｐＨ８．２の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５．８μｌおよびメトキシ−ＳＣ−ＰＥＧ溶液（pH8.2の緩衝液中に0.1mg／ml）１７．６μｌ（3.52×10^-7モル）を加えた。この反応混合物を２５℃、ｐＨ８．４で３０分間インキュベ−トした。３０分経過時点でのｐＨは８．２であり、ＨＰＬＣ分析結果は、修飾していないＦ（ａｂ）₂が２％存在すること、これはｐＨを８．６に調整してさらに３０分間２５℃ でインキュベ−トすれば修飾可能であることを示していた。ＩＭＭＵ−１４−Ｆ（ａｂ）₂に対してモル比で８倍量、６倍量または４倍量のＳＣ−ＰＥＧを用い、ｐＨ８．５、２５℃で３０分間、複合を形成した。ＨＰＬＣ分析は、モル比で８倍量および６倍量のＳＣ−ＰＥＧに対して、３０分で完全な修飾を示したが、４：１のモル比では少量の未修飾のＦ（ａｂ）₂を示していた。実施例７．Ｈｚ−ＰＥＧ（メトキシ・ポリエチレン・グリコ−ル・ヒドラジド）とＦ（ａｂ’）₂Ｌ鎖炭水化物との複合ＬＬ２は、非ホジキンズ（non-Hodgkins）Ｂ細胞リンパ腫の診断治療に有効であることが証明されているネズミ・モノクロ−ナル抗体である。このＬ鎖領域をグリコシル化して、リシン残基の他にＰＥＧを付加する特異的な部位を作ることができる。複合プロトコル（ａ）．ＩＭＭＵ−ＬＬ２−Ｆ（ａｂ’）₂炭水化物部分を、過ヨウ素酸ナトリウム（最終濃度20mM）を用いてｐＨ６、０℃で９０分間酸化した。この酸化したフラグメントは、セファデックスＧ−５０−８０をｐＨ６．０のＰＢＳに溶解した溶液を充填するスピン・カラムに入れ、遠心分離する方法で、過剰の過ヨウ素酸塩から分離した。精製された酸化中間体にモル比で（50×および300×）倍量のメトキシ−ＰＥＧヒドラジド（MW5000，Shearwater Polymers Inc.，Huntsville，AL）を添加することにより、ヒドラゾン結合を得た。反応は、室温で２時間進行させた。生成物をセファデックスＧ−５０−８０およびｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウムを含有するスピン・カラムに入れ、遠心分離により精製した。この精製物をＢｉｏＳｉｌＳＥＣ−４００カラムを用いるサイズ排除ＨＰＬＣにより、ｐＨ６．８の０．２Ｍリン酸ナトリウムと０．０２％アジ化ナトリウムで溶離して分析した。分析結果は、５０倍量のモル比のＨｚ−ＰＥＧを用いた反応では、１６％が修飾しないまま残り、モル比で３００倍量用いた反応では、２．３％が修飾しないことを示していた。複合プロトコル（ｂ）．ＩＭＭＵ−ＬＬ２−Ｆ（ａｂ）₂２００μｌ（2.1mg,2.1×10^-8モル）を、０．５ＭＮａＩＯ₄２９．４μｌ（700×2.1×10^-8モル）により２６℃で４５分間酸化した。このように酸化したフラグメントを、０．１Ｍリン酸ナトリウムにセファデックスＧ−５０−８０を溶解したｐＨ７の溶液を充填した２．４ｍｌのスピン・カラムに入れ、遠心分離するステップを２回連続反復して過剰のＮａＩＯ₄ から分離した。この酸化ＩＭＭＵ−ＬＬ２−Ｆ（ａｂ）₂２０５μｌ（1 52mg，1,52×10^-8モル）を、メトキシ−Ｈｚ−ＰＥＧ（MW5000）２２．８ｍｇ（300×1.52×10^-8モル）と共に２５℃で１時間インキュベ−トすることにより、メトキシ−Ｈｚ−ＰＥＧと酸化フラグメントの複合を達成した。この複合体を、セファデックスＧ− ５０−８０を充填するスピン・カラム（２．４ｍｌ連続４回）に入れ、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウムで溶離して精製した。ＢｉｏＳｉｌ４００のサイズ排除カラムを用い、０．２Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ６．８の０．０２％アジ化ナトリウムで溶離して、ＨＰＬＣ分析を行った結果では、７．４分（16.9%）と８．３分（83.1%）の二つの新しいピ−クが認められた。実施例８．ＰＥＧ−ＩＭＭＵ−ＬＬ２−Ｆ（ａｂ）₂からＰＥＧ−Ｆａｂへの還元Ｈｚ−ＰＥＧ−ＩＭＭＵ−ＬＬ２Ｆ（ａｂ）₂（130μl，923 μg，9.23×10^-9 モル）を、５０ｍＭのＤＴＴ２．７μｌおよび０．１ＭのＥＤＴＡ２．７μｌと共に、アルゴン下３７℃で３０分間インキュベ−トして還元した。この還元した物質を、セファデックスＧ−５０−８０を５０ｍＭ酢酸塩および１５０ｍＭ塩化ナトリウム中に溶解したｐＨ５．３の溶液１ｍｌを充填したスピン・カラムで２回連続精製した。エルマン分析を行ったところ、Ｆａｂフラグメント１個当りチオ−ル基が４．８個存在していることが認められた。この還元物質のサイズ排除ＨＰＬＣ分析は、９．３１分の主たるピ−クに分かれていない肩があることを示していた。修飾していないＩＭＭＵ−ＬＬ２−Ｆａｂ−ＳＨも少量観察された。実施例９．Ｈｚ−ＰＥＧ−ＩＭＭＵ−ＬＬ２Ｆ（ａｂ）ＳＨの製剤調製と⁹⁹ ^mＴｃ標識付けＨｚ−ＰＥＧ−ＩＭＭＵ−ＬＬ２Ｆａｂ−ＳＨ２００μｇ、Ｓｎ（１１）３３μｇ、およびスズの６．５倍量の酒石酸塩から製剤を調製した。シュ−クロ− ス（最終容積の２％）は凍結乾燥前に添加した。この凍結乾燥バイアル品を、アルゴンでパ−ジした塩類液１ｍｌ中に過テクネチウム酸ナトリウム３．５ｍＣｉを溶解した溶液で溶かした。このようにしてバイアル品にテクネチウム標識を付け、この標識付け５分後にサイズ排除ＨＰＬＣカラム（ＢｉｏＳｉｌ４００）およびＩＴＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ分析では、９．７８分に分かれていない肩を持つ、幅広い主たるピ−クを認めた。保持時間１２．６７分では還元していない過テクネチウム酸ナトリウムが３％残存していた。これと比較して、テクネチウム標識を付けた未修飾のＩＭＭＵ−ＬＬ２Ｆａｂ’−ＳＨの保持時間は、１０．３８分であった。実施例１０．Ｈｚ−ＰＥＧ−ＩＭＭＵ−ＬＬ２Ｆ（ａｂ）ＳＨを用いるリンパ腫の診断イメ−ジング組織学的に確認された中等度の小胞（follicular）および小結節（nodular）大細胞リンパ腫を持つ患者に、１ｍｇのＩＭＭＵ−ＬＬ２Ｆ（ａｂ）Ｓ−^99mＴｃ（〜２５ｍＣｉ）を塩類液に溶解した溶液を注入する。１．４時間後および２４時間後ＳｏｐｈａＤＳＸガンマ・カメラにより胸腔および骨盤の多角的平面投影（multiple planar views）を行う。１週間後、同じ患者にＨｚ−ＰＥＧ− ＩＭＭＵ−ＬＬ２Ｆ（ａｂ）Ｓ−^99mＴｃを注入して、同じイメ−ジング・プロトコルを実施する。ＰＥＧ複合体の効果として、４時間は大きな腹部病巣を鮮明に観察することができる。反面、複合していない抗体を用いる４時間のイメ−ジングでは、腎臓からのバックグラウンド放射線のため、病巣が不鮮明となる。上記したように、本発明を広範に説明し、代表的な実施例を例示した。当業者は本発明に各種の変更を加えることができるが、これらの変更は本発明の範囲内であることを認識するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者カラケイ，ハビベアメリカ合衆国、 07747 ニュー・ジャージー、マタワン、モリスタウン・ロード 206エイ

Claims

【特許請求の範囲】１．腫瘍または感染病巣から生じる、またはこれらに関連するマ−カ−と特異的に結合するＴｃ−９９ｍ放射能標識された抗体フラグメントを、腫瘍または感染病巣を持つ患者に非経口的に注入して、外部のガンマ・カメラによるイメ−ジングによって腫瘍または感染病巣の部位を検出する、腫瘍または感染病巣のイメ −ジング方法であって、該放射能標識された抗体フラグメントを、ＰＥＧ化していない抗体フラグメントと比較して、腎臓による放射能標識の取り込みと保持を有意に減少させるのに十分な量のポリエチレン・グリコ−ル（ＰＥＧ）と複合させる、腫瘍または感染病巣のイメージング方法。２．上記の抗体フラグメントが二価のフラグメントである請求項１に記載の方法。３．上記の抗体フラグメントが一価のフラグメントである請求項１に記載の方法。４．約２〜２０個のＰＥＧ−５，０００部分が、上記の二価のフラグメントと複合する請求項２に記載の方法。５．約１〜１０個のＰＥＧ−５，０００部分が、上記の一価のフラグメントと複合する請求項３に記載の方法。６．上記のＰＥＧ部分が、上記抗体フラグメントのリシン残基と部位非特異的に複合する請求項１に記載の方法。７．ａ）腫瘍または感染病巣から生じる、またはこれらに関連するマ−カ− と特異的に結合するＦ（ａｂ）₂またはＦ（ａｂ’）₂抗体フラグメントを、活性化したポリエチレン・グリコ−ルと反応させて、ＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂またはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂を形成するステップと、ｂ）ＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂またはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂をジスルフィド還元剤で切断して、Ｔｃ−９９ｍで最終的に標識されるためのＰＥＧ−Ｆａｂ−ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆａｂ’−ＳＨを形成するステップとからなる、Ｔｃ−９９ｍで最終的に標識されるためのイメ−ジング剤先駆物質の調製方法。８．さらに、続いて、９９ｍ−過テクネチウム酸塩が添加され、該９９ｍ−テクネチウム酸塩を還元するための有効量の２価のスズ・イオンをＰＥＧ−Ｆａｂ −ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆａｂ’−ＳＨに添加するステップを含む請求項７に記載の方法。９．さらに、有効なイメ−ジング量の９９ｍ−過テクネチウム酸塩を、２価のスズ・イオンとＰＥＧ−Ｆａｂ−ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆａｂ’−ＳＨとの混合物に添加するステップを含み、該９９ｍ−過テクネチウム酸塩が還元されてＴｃ− ９９ｍカチオンとなり、Ｔｃ−９９ｍカチオンがＰＥＧ−Ｆａｂ−ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆａｂ’−ＳＨのチオ−ル基と結合して、ＰＥＧ−Ｆａｂ−Ｓ−Ｔｃ−９９ｍまたはＰＥＧ−Ｆａｂ’−Ｓ−Ｔｃ−９９ｍを形成する請求項８に記載の方法。１０．さらに、還元された９９ｍ−過テクネチウム酸塩をＰＥＧ−Ｆａｂ−ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆａｂ’−ＳＨに添加し、ＰＥＧ−Ｆａｂ−Ｓ−Ｔｃ−９９ｍまたはＰＥＧ−Ｆａｂ’−Ｓ−Ｔｃ−９９ｍを形成するステップを含む請求項７に記載の方法。１１．ａ）腫瘍または感染病巣から生じる、またはこれらに関連するマ−カ −と特異的に結合するＦ（ａｂ）₂またはＦ（ａｂ’）₂抗体フラグメントを、活性化したポリエチレン・グリコ−ルと反応させて、ＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂またはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂を形成するステップと、ｂ）該ＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂またはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂をチオ−ル化して、最終的にＴｃ−９９ｍで標識されるためのＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂−ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂−ＳＨを形成するステップとからなる、Ｔｃ−９９ｍで最終的に標識されるためのイメ−ジング剤先駆物質の調製方法。１２．さらに、続いて、９９ｍ−過テクネチウム酸塩が添加され、該９９ｍ− テクネチウム酸塩を還元するための有効量の２価のスズ・イオンを、ＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂−ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂−ＳＨに添加するステップを含む請求項１１に記載の方法。１３．さらに、有効なイメ−ジング量の９９ｍ−過テクネチウム酸塩を、２価のスズ・イオンとＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂−ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂−ＳＨとの混合物に添加するステップを含み、９９ｍ−過テクネチウム酸塩が還元されてＴｃ−９９ｍカチオンとなり、Ｔｃ−９９ｍカチオンがＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂ −ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂−ＳＨのチオ−ル基と結合して、ＰＥＧ− Ｆ（ａｂ）₂−Ｓ−Ｔｃ−９９ｍまたはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂−Ｓ−Ｔｃ−９９ｍを形成する請求項１２に記載の方法。１４．さらに、還元された９９ｍ−過テクネチウム酸塩を、ＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂−ＳＨまたはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂−ＳＨに添加して、ＰＥＧ−Ｆ（ａｂ）₂ −Ｓ−Ｔｃ−９９ｍまたはＰＥＧ−Ｆ（ａｂ’）₂−Ｓ−Ｔｃ−９９ｍを形成する請求項１１に記載の方法。１５．単一の包装に包装されている次の内容物、すなわち、少なくとも１個の遊離チオール基を有しており、腫瘍または感染病巣から生じる、またはこれらに関連するマ−カ−と特異的に結合しており、ＰＥＧ化していないＴｃ−９９ｍで標識された抗体フラグメントと比較して、Ｔｃ−９９ｍで放射能標識された後にＰＥＧ化された抗体フラグメントの腎臓への取り込みおよび保持を有意に減少させるのに十分な量のポリエチレン・グリコ−ル（ＰＥＧ）と複合している抗体フラグメントと、続いて添加される９９ｍ−過テクネチウム酸塩を還元するのに有効な量の２価のスズ・イオンを含む、腫瘍または感染病巣用のＴｃ−９９ｍで標識されたイメ−ジング剤の調製用キット。１６．上記フラグメントが、１〜１０個のＰＥＧ−５，０００部分と複合している一価のフラグメントである請求項１５に記載のキット。