TW202400240A - 抗ｖｅｇｆ抗體的放射性複合體及放射性醫藥 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題為提供能夠應用於核醫學診斷或放射線治療之新穎的放射性標識抗VEGF抗體。本發明之複合體為經抗體修飾胜肽部位特異性地修飾之抗體與螯合劑之複合體，抗體為抗VEGF抗體，在螯合劑中螯合有放射性金屬核種。

Description

抗ＶＥＧＦ抗體的放射性複合體及放射性醫藥
本發明係關於抗VEGF抗體的放射性複合體及放射性醫藥。
血管內皮細胞增殖因子(VEGF)為參與脈管形成或血管新生之一群醣蛋白，作為配體結合至主要位於血管內皮細胞表面之血管內皮細胞增殖因子受體(VEGFR)，具有刺激細胞分裂或遷移、分化，或者使微小血管的血管穿透性亢進之功能。除此以外，已知亦參與單核球／巨噬細胞的活化。就參與脈管形成或血管新生、淋巴管新生之增殖因子而言，有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PlGF(胎盤增殖因子(placental growth factor))-1、PlGF-2共7種，此等被統稱為「VEGF家族」。再者，就數種VEGF家族成員而言，由於選擇性剪接(alternative splicing)而存在數種亞型。例如，VEGF-A在人類中通常存在胺基酸數121個(VEGF-A 121)、165個(VEGF-A 165)、189個(VEGF-A 189)、206個(VEGF-A 206)共4種，除此以外，亦已報導VEGF-A 145、VEGF-A 183之類的稀有亞型。就VEGF-B而言，已知VEGF-B 167、VEGF-B 186。
抗VEGF抗體係藉由例如妨礙VEGF對細胞受體之結合、妨礙VEGF結合至細胞受體後之血管內皮細胞的活化或使由VEGF所活化之細胞死滅而產生作用。作為抗VEGF抗體，可列舉例如貝伐珠單抗(bevacizumab)(商品名：阿瓦斯汀(AVASTIN))、阿柏西普β(aflibercept beta)(商品名：柔癌捕(ZALTRAP))、阿柏西普(aflibercept) (商品名：采視明(EYLEA))及布西珠單抗(brolucizumab) (商品名：倍優視(BEOVU))。
抗體醫藥係對標的之選擇性較高，副作用比較少，另一方面，會有藥效不充分之情形。另一方面，化學療法劑具有強力的藥效，但對標的之選擇性較低，因而使癌細胞死滅所需之最小有效量較高，另一方面，從毒性之觀點而言，不太能提高用量，故最大耐受用量較低且治療用量範圍狹窄被視為課題。
作為彌補此等缺點之技術，有抗體-藥物複合體(antibody-drug conjugate，ADC)。ADC係藉由抗體將成為標的之細胞(例如癌細胞)的範圍縮小，將附加於抗體之藥物(有效負載)直接傳遞至標的細胞內，藉此避免對正常的細胞之影響，標的細胞特異性地發揮該藥物所持有之生物活性。
根據ADC，便可選擇性地將較多化學療法劑傳遞至標的細胞，其結果，變得在更少量下顯示出效果，由於到達正常細胞之化學療法劑減低，故最大耐受用量亦變高，而可期待治療用量範圍變廣。
作為ADC的一種方式，有放射性免疫複合體(radioimmunoconjugate)。在放射性免疫複合體中，係使用放射性核種來代替有效負載。
作為用於在不會對抗體對標的分子之特異性帶來影響之情形下附加機能之部位特異性化學修飾，已報導在特異性或選擇性地結合至抗體之胜肽(以下亦稱為抗體修飾胜肽)中導入能夠與交聯劑進行鍵結之胺基酸，藉由交聯劑修飾該胺基酸，藉此調製經交聯劑部位特異性地修飾之抗體修飾胜肽，並使用該等來部位特異性地修飾抗體之技術(專利文獻1、2)。
此外，在專利文獻3、4中，已揭示關於將抗體以放射性核種進行標識之數種手法之技術。
此外，在非專利文獻1中，已報導將屬於抗VEGF抗體之貝伐珠單抗以鋯-89進行標識，投予至人類並藉由正電子斷層造影法(PET)進行造影之結果。在此例中，已揭示使Fe-N-suc-Df-TFP隨機地鍵結至貝伐珠單抗的胺基基，並使鋯-89螯合至去鐵胺(Df)之方法。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2017/217347號 [專利文獻2]國際公開第2019/203191號 [專利文獻3]國際公開第2019/125982號 [專利文獻4]國際公開第2020/229974號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]EJNMMI Res. 2014 Dec; 4(1):35. doi: 10.1186/s13550-014-0035-5.
貝伐珠單抗係藉由與人類VEGF特異性地結合而阻礙VEGF與在血管內皮細胞上進行表現之VEGF受體之結合，並藉由阻止VEGF的生物活性而抑制在腫瘤組織中之血管新生，阻礙腫瘤的增殖。然而，單獨使用時無法獲得充分的效果，在臨床上必須與其他藥劑(抗癌劑)併用。 利用貝伐珠單抗之放射線治療效果仍未知。
此外，部位特異性地經放射性核種修飾之貝伐珠單抗仍未知。
從而，本發明之課題為提供能夠應用於核醫學診斷或放射線治療之新穎的放射性標識抗VEGF抗體。
本發明之一態樣為一種複合體，其係經抗體修飾胜肽部位特異性地修飾之抗體與螯合劑之複合體，抗體為抗VEGF抗體，在螯合劑中螯合有放射性金屬核種。
本發明之其他態樣為一種放射性醫藥，其含有上述複合體作為有效成分。
另外，本發明中所提及之所謂「連結」，在沒有特別指明之情況，係意味直接地或間接地連接兩者。
根據本發明，係提供能夠應用於核醫學診斷或放射線治療之新穎的放射性標識抗VEGF抗體。
(1)放射性複合體
本發明為一種複合體，其係經抗體修飾胜肽部位特異性地修飾之抗體與螯合劑之複合體，抗體為抗VEGF抗體，在螯合劑中螯合有放射性金屬核種(以下亦稱為本發明之放射性複合體)。
(1-1)放射性金屬核種 本發明之放射性複合體中所包含之放射性金屬核種為釋放出α射線之放射性核種、釋放出β射線之放射性核種、釋放出正電子之放射性核種或釋放出γ射線之放射性核種。在將本發明之放射性複合體用於癌症治療之情況，較佳係使用釋放出α射線之放射性核種或釋放出β射線之放射性核種。此外，在將本發明之放射性複合體用於癌症的診斷或檢測之情況，較佳係使用釋放出正電子之放射性核種或釋放出γ射線之放射性核種。作為釋放出α射線之放射性核種，可例示Bi-212、Bi-213、Ac-225、Th-227。此外，作為釋放出β射線之放射性核種，可例示Cu-64、Y-90或Lu-177。此外，作為釋放出正電子之放射性核種，可例示Cu-64、Ga-68、Y-86、Zr-89。此外，作為釋放出γ射線之放射性核種，可例示Tc-99m或In-111。本發明之放射性複合體中所包含之放射性金屬核種更佳為Ga-68、Zr-89、Y-90、In-111、Lu-177或Ac-225。
(1-2)抗體 本發明之放射性複合體中所包含之抗體為特異性地結合至血管內皮細胞增殖因子(VEGF)之免疫球蛋白(以下亦稱為本發明中所使用之抗體)。本發明中所使用之抗體可為多株抗體，亦可為單株抗體，較佳為單株抗體。抗體的來源並無特別限定，可列舉例如非人類動物的抗體、非人類哺乳動物的抗體及人類抗體，較佳係可例示人類、大鼠、小鼠及兔的抗體。在抗體係源自於人類以外之物種之情況，較佳係使用周知的技術加以嵌合化或人類化，用於本發明之抗體亦可為嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。此外，本發明中所使用之抗體亦可為雙重特異性抗體。抗體可為經單離之抗體或經精製之抗體。抗體可例如為IgG。抗體可例如為IgG1、IgG2(例如IgG2a及IgG2b)、IgG3或IgG4。
用於本發明之放射性複合體之抗體只要是抗VEGF抗體，即無限定，可列舉例如貝伐珠單抗、阿柏西普β、阿柏西普、布西珠單抗，更佳為貝伐珠單抗。 貝伐珠單抗(bevacizumab)為針對於VEGF之單株抗體。其持有藉由阻礙VEGF的功能而抑止血管新生或者抑止腫瘤的增殖或轉移之作用。屬於分子標的治療藥中之一種，可使用作為抗癌劑，除此以外，可期待作為年齡增長黃斑變性或糖尿病性視網膜症的治療藥。關於貝伐珠單抗，藉由編碼出由小鼠抗VEGF單株抗體的互補性決定部位及源自於人類IgG1之框架部分及恆定部所構成之人類化單株抗體之cDNA的表現，其係由中國倉鼠卵巢細胞所產生之由214個胺基酸殘基(C 1034H 1591N 273O 338S 6；分子量：23446.71)的輕鏈2分子及453個胺基酸殘基(C 2235H 3413N 585O 678S 16；分子量：約49838.57：包含C末端的離胺酸1殘基發生缺損者)的重鏈2分子所構成之醣蛋白質。 貝伐珠單抗亦公知為阿瓦斯汀(AVASTIN；註冊商標)或多種生物仿製品(貝伐珠單抗BS)，可依照例如先前報導(Presta et al., Cancer Res. (1997) 57:4593-4599)予以製造。具體而言，具有下述結構。
在此處，將分子內二硫醚鍵以實線表示。 H鏈E1：部分焦麩胺酸；H鏈N303：醣鏈鍵結；H鏈K453：部分加工 L鏈C214-H鏈C226、H鏈C232-H鏈C232、H鏈C235-H鏈C235：二硫醚鍵 醣鏈結構係示於下。
在此處，Fuc為L-岩藻糖，(Gal) 0-2為0、1或2分子的D-半乳糖，GlcNac為D-N-乙醯基葡萄糖胺，Man為D-甘露糖。
阿柏西普β為基因重組融合醣蛋白質，第1～104個係由人類血管內皮增殖因子受體(VEGFR)1的第2免疫球蛋白(Ig)樣C2結構域所構成，第105～205個係由人類VEGFR2的第3Ig樣C2結構域所構成，此外，第206～432個係由人類IgG1的Fc結構域所構成。阿柏西普β係由中國倉鼠卵巢細胞所產生。阿柏西普β為由2個次單元所構成之醣蛋白質(分子量：約115,000)，該次單元係由432個胺基酸殘基所構成，以柔癌捕(ZALTRAP)(註冊商標)的商品名進行市售。
此外，阿柏西普能夠以采視明(EYLEA)(註冊商標)之形式取得，布西珠單抗能夠以倍優視(BEOVU)(註冊商標)之形式取得。
(1-3)螯合劑 在本發明中，螯合劑只要是在結構中具有放射性金屬核種會進行配位之部位者，即無特別限定。作為螯合劑，可列舉例如CB-TE2A(1,4,8,11-四氮雜雙環[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸)、CDTA(環己烷-反-1,2-二胺四乙酸)、CDTPA(4-氰基-4-[[(十二烷基硫基)側硫基甲基]硫基]-戊酸)、DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α',α",α"'-四甲基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-肆(胺甲醯基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷)、DOTA-GA(α-(2-羧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTP(((1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)肆(亞甲基))四膦酸)、DOTMP(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(亞甲基膦酸))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(乙醯胺基亞甲基膦酸))、D02P(四氮雜環十二烷二甲烷膦酸)、Deferoxamine(DFO)、DTPA(甘胺酸，N,N-雙[2-[雙(羧基甲基)胺基]乙基]-)、DTPA-BMA(5,8-雙(羧基甲基)-11-[2-(甲基胺基)-2-側氧基乙基]-3-側氧基-2,5,8,11-四氮雜十三烷-13-酸)、EDTA(2,2',2",2"'-(乙烷-1,2-二基雙(氮雜三基))四乙酸)、NOTA(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸)、NOTP(1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三基參(亞甲基膦酸))、TETPA(1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四丙酸)、TETA(1,4,8,11-四氮雜環十四烷-N,N',N",N"'-四乙酸)、TTHA(3,6,9,12-肆(羧基甲基)-3,6,9,12-四氮雜十四烷二酸)、HEHA(1,2,7,10,13-六氮雜環十八烷-1,4,7,10,13,16-六乙酸)、1,2-HOPO(N,N',N",N"'-四(1,2-二氫-1-羥基-2-側氧基吡啶-6-羰基)-1,5,10,14-四氮雜十四烷)、PEPA(1,4,7,10,13-五氮雜環十五烷-N,N',N",N"',N""-五乙酸)、H4octapa(N,N'-雙(6-羧基-2-吡啶基甲基)-伸乙基二胺-N,N'-二乙酸)、H2bispa2(6,6'-({9-羥基-1,5-雙(甲氧基羰基)-2,4-二(吡啶-2-基)-3,7-二氮雜雙環[3.3.1]壬烷-3,7-二基}雙(-亞甲基))吡啶二甲酸)、H2dedpa(1,2-[{6-(羧基)-吡啶-2-基}-甲基胺基]乙烷)、H2macropa(6-(1,4,10,13-四氧雜-7,16-二氮雜環十八烷-N,N'-甲基)吡啶甲酸)、H5decapa(N,N"-雙(6-羧基-2-吡啶基甲基)-二伸乙基三胺-N,N',N"-三乙酸)、H6phospa(N,N'-(亞甲基膦酸酯)-N,N'-[6-(甲氧基羰基)吡啶-2-基]-甲基-1,2-二胺基乙烷)、HP-D03A(羥基丙基四氮雜環十二烷三乙酸)或卟啉(porphyrin)之類者，較佳為下述式(A)所示之化合物。
(式(A)中，R 11、R 12、R 13及R 14各自獨立地為由-(CH 2) pCOOH、-(CH 2) pC 5H 4N、-(CH 2) pPO 3H 2、-(CH 2) pCONH 2或-(CHCOOH)(CH 2) pCOOH所構成之基，R 15為氫原子，p為0以上且3以下的整數。)
作為式(A)所示之化合物，較佳為包含源自於1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)或其衍生物之結構之化合物，具體而言，在結構中可包含源自於選自DOTA(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α',α",α"'-四甲基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTAM(1,4,7,10-肆(胺甲醯基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷)、DOTPA (1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四丙酸)、L py(1,4,7,10-肆(吡啶-2-基甲基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷)、DOTA-GA(α-(2-羧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、DOTP(((1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四基)肆(亞甲基))四膦酸)、DOTMP(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(亞甲基膦酸))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-肆(乙醯胺基亞甲基膦酸))、D02P(四氮雜環十二烷二甲烷膦酸)中之一種螯合劑之結構，更佳係可列舉以下式(A-1)～(A-6)所示之化合物。用於本發明之放射性複合體之螯合劑再佳為DOTA-GA(式(A-6)所示之化合物)。在所使用之螯合劑為DOTA-GA之情況，前述螯合劑亦可為立體異構物(S體、R體)或外消旋體，在該外消旋體中，S體及R體的立體異構物亦可以任意的比例進行混合。
本發明中所使用之螯合劑較佳係經由連結子(L)而與胜肽進行連結。具體而言，在本發明之放射性複合體中，螯合劑及連結子(L)較佳係藉由共價鍵進行連接。從而，前述之螯合劑在本發明之放射性複合體中，化合物內之一部分基亦可被取代成與連結子(L)形成共價鍵之基。例如，在本發明中所使用之螯合劑為式(A)所示之化合物之情況，R 12或R 15亦可被取代成與連結子(L)形成共價鍵之基。較佳係R 12被取代成與連結子(L)形成共價鍵之基時，R 15為氫原子，R 12為由-(CH 2) pCOOH、-(CH 2) pC 5H 4N、 -(CH 2) pPO 3H 2、-(CH 2) pCONH 2或-(CHCOOH)(CH 2) pCOOH所構成之基時，R 15被取代成與連結子(L)形成共價鍵之基。
螯合劑與連結子(L)之共價鍵較佳係不包含硫脲鍵。藉由如此，便可在無損藥效之情形下提供安定性提高之複合體。作為螯合劑與連結子(L)之共價鍵之例，可列舉碳-碳鍵、醯胺鍵、醚鍵、酯鍵等。
螯合劑與連結子(L)之連接係藉由例如下述式(A-7)或(A-8)的N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)基或下述式(A-9)的2,6-二側氧基四氫-2H-哌喃基與連結子(L)的一級胺之反應而形成。
(1-4)抗體修飾胜肽 本發明中所使用之抗體修飾胜肽只要是部位特異性地修飾抗體，較佳係部位特異性地修飾Fc區域，更佳係部位特異性地修飾抗體的Fc區域中之離胺酸殘基者，即無特別限定。藉此，可維持抗體本身的活性(抗原識別作用、中和作用、補體活化作用及／或調理素作用)。
用於本發明之抗體修飾胜肽可為鏈狀胜肽，亦可為環狀胜肽，較佳為環狀胜肽。更佳係包含下述式(i)所示之由13個以上且17個以下胺基酸殘基所構成之胺基酸序列，且經交聯劑修飾。另外，在式(i)中，以胺基酸序列的紙面左側表示N末端側，胺基酸序列的紙面右側表示C末端側之形式進行說明。
式(i)中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續的a個X、連續的b個X、連續的c個X及連續的d個X， X為在側鏈不具有硫醇基及鹵乙醯基中之任何者之胺基酸殘基， a、b、c及d各自獨立地為1以上且5以下的整數，且滿足a+b+c+d≦14， Xaa 1及Xaa 3各自獨立地表示源自於在側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基或源自於在側鏈具有鹵乙醯基之胺基酸之胺基酸殘基，惟，Xaa 1及Xaa 3中之任一者為源自於具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基，較佳係藉由Xaa 1及Xaa 3連結而形成環結構， Xaa 2為離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸或二胺基丙酸，較佳為離胺酸殘基，且Xaa 2係經交聯劑修飾。
作為上述式(i)中之X中可包含之胺基酸殘基，可列舉例如源自於甘胺酸、丙胺酸、苯基丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、精胺酸、組胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、甲硫胺酸等胺基酸者，X可為由同一種類的胺基酸所構成之胺基酸殘基，亦可為各自由不同種類的胺基酸所構成之胺基酸殘基。
式(i)中之a、b、c及d只要是上述之範圍的數，即無特別限制，從胜肽與抗VEGF抗體之結合安定性之觀點而言，以a+b+c+d≦14為條件，a較佳為1以上且3以下的整數，b較佳為1以上且3以下的整數，c較佳為3以上且5以下的整數，及d較佳為1以上且3以下的整數。
Xaa 1及Xaa 3中之至少一者為源自於在側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基，該胺基酸可各自相同，亦可不同。作為在側鏈具有硫醇基之胺基酸，可列舉例如半胱胺酸、高半胱胺酸。此種胺基酸殘基較佳係藉由二硫醚鍵進行鍵結，或者經由以下式(4)所示之結構而鍵結有硫醚基。式(4)中，虛線部分表示與硫醚基之鍵結部分。
Xaa 1及Xaa 3亦可Xaa 1及Xaa 3中之任一者為源自於在側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基，另一者為源自於在側鏈具有鹵乙醯基之胺基酸之胺基酸殘基，以代替上述之組合。此等係經由硫醚鍵進行鍵結。鹵乙醯基係其末端經碘等鹵素取代，藉由與另一側鏈中之硫醇基之反應，鹵素脫離，而形成硫醚鍵。
式(i)所示之抗體修飾胜肽的具體的胺基酸序列可列舉例如國際公開第2016/186206號、國際公開第2017/217347號及國際公開第2018/230257號所記載之胜肽，亦可使用此等。 較佳係本發明中所使用之抗體修飾胜肽為下述式(i)'所示之由13～17個胺基酸殘基所構成之胺基酸序列。
式(i)'中，X各自獨立地為半胱胺酸以外之任意的胺基酸殘基， C為半胱胺酸殘基， H為組胺酸殘基， Xaa 1'為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸或二胺基丙酸， G為甘胺酸殘基， Xaa 2'為麩胺酸殘基或天冬醯胺酸殘基， L為白胺酸殘基， V為纈胺酸殘基， W為色胺酸殘基， Xaa 3'為丙胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基，且 Xaa 4'為酪胺酸殘基或色胺酸殘基。 在上述式(i)'中，N末端或C末端的X 1-3之標記係意味半胱胺酸(C或Cys)以外之獨立任意的胺基酸殘基X連續1～3個，構成該等之胺基酸殘基為相同或不同的殘基，較佳係3個全皆由並非相同的殘基之序列所構成。
此等之中，作為抗體修飾胜肽的胺基酸序列，較佳係具有以下序列(1)～(14)中之任一者，更佳係具有以下序列(1)、(2)、(13)或(14)。在以下胺基酸序列(1)～(14)中，(Xaa 2)表示離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸或二胺基丙酸，較佳為離胺酸殘基，較佳係(Xaa 2)經交聯劑修飾，(Xaa 1)及(Xaa 3)皆表示高半胱胺酸殘基。此外，以下胺基酸序列(1)～(14)中，(Xaa 1)、(Xaa 2)及(Xaa 3)以外之胺基酸係以一個字母代號加以標記。
(1)DCAYH(Xaa 2)GELVWCT(SEQ ID NO：3) (2)GPDCAYH(Xaa 2)GELVWCTFH(SEQ ID NO：4) (3)RCAYH(Xaa 2)GELVWCS(SEQ ID NO：5) (4)GPRCAYH(Xaa 2)GELVWCSFH(SEQ ID NO：6) (5)SPDCAYH(Xaa 2)GELVWCTFH(SEQ ID NO：7) (6)GDDCAYH(Xaa 2)GELVWCTFH(SEQ ID NO：8) (7)GPSCAYH(Xaa 2)GELVWCTFH(SEQ ID NO：9) (8)GPDCAYH(Xaa 2)GELVWCSFH(SEQ ID NO：10) (9)GPDCAYH(Xaa 2)GELVWCTHH(SEQ ID NO：11) (10)GPDCAYH(Xaa 2)GELVWCTFY(SEQ ID NO：12) (11)SPDCAYH(Xaa 2)GELVWCTFY(SEQ ID NO：13) (12)SDDCAYH(Xaa 2)GELVWCTFY(SEQ ID NO：14) (13)RGNCAYH(Xaa 2)GQLVWCTYH(SEQ ID NO：15) (14)G(Xaa1)DCAYH(Xaa 2)GELVWCT(Xaa 3)H(SEQ ID NO：16)
上述式(i)或(i)'所示之胜肽或具有序列(1)～(14)之胜肽較佳係在N末端導入連結子(L)，C末端加以醯胺化。此外，此等胜肽的Xaa 2(或相當於Xaa 2之部分)係經交聯劑修飾，藉此，胜肽可經由交聯劑而與抗VEGF抗體的Fc區域進行共價鍵結。
交聯劑係只要是熟習該項技術者，即能夠適宜選擇，可設為具有至少2處能夠與所期望的胺基酸(例如離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸或二胺基丙酸及精胺酸等)進行鍵結之部位之化合物。作為其例，並無限定，可列舉DSG(戊二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl glutarate))、DSS(辛二酸二琥珀醯亞胺酯(disuccinimidyl suberate))等較佳係包含2個以上琥珀醯亞胺基之交聯劑，DMA(己二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽(dimethyl adipimidate・2HCl))、DMP(庚二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽(dimethyl pimelimidate・2HCl))及DMS(辛二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽(dimethyl suberimidate・2HCl))等較佳係包含2個以上亞胺酸部分之交聯劑，以及DTBP(3,3'-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate・2HCl))及DSP(二硫代雙丙酸琥珀醯亞胺酯(dithiobis(succinimidyl propionate)))等具有SS鍵之交聯劑，SBAP(3-(溴乙醯胺基)丙酸琥珀醯亞胺酯(succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate))。DSS或DSG等包含琥珀醯亞胺基之交聯劑會與存在於N末端之一級胺進行反應，因而藉由在阻斷N末端之後再使其與DSS或DSG進行反應，便可僅以DSS或DSG特異性地修飾Xaa 2的胺基。亦可例如在抗體修飾胜肽的N末端預先導入連結子(L)後，使其與DSS或DSG進行反應。藉由DSS或DSG的琥珀醯亞胺基與抗VEGF抗體(例如貝伐珠單抗)中之依照Eu編號之Lys252殘基或Lys254殘基，較佳為Lys254殘基進行反應，抗VEGF抗體便受到胜肽部位特異性地修飾。此等Lys殘基係存在於人類IgG中之Fc區域，即便是貝伐珠單抗以外之抗VEGF抗體，只要是熟習該項技術者，亦可比對抗體的胺基酸序列，特定出相應的Lys殘基。
(1-5)連結子(L) 連結子(L)在本發明之放射性複合體中，只要是可將螯合劑及抗體修飾胜肽進行連結者，即無特別限定。本發明中所使用之連結子(L)只要不是包含硫脲鍵者，即無特別限定，可列舉經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之雜烷基、聚乙二醇(PEG)基、胜肽、醣鏈、二硫醚基、醯胺基及此等之組合等。 在本說明書中，所謂連結子(L)，係用於連接經抗體修飾胜肽修飾之抗VEGF抗體及螯合劑之連結子的總稱，其係包含抗體修飾連結子(L 1)及螯合連結子(L 2)之用語。抗體修飾連結子(L 1)係詳情後述，其係被導入(1-4)所說明之抗體修飾胜肽的N末端側，螯合連結子(L 2)亦詳情後述，其係被導入(1-3)所說明之螯合劑的官能基。
本發明中所使用之連結子(L)亦可包含以點擊反應所形成之鍵結部位，較佳係抗體修飾連結子(L 1)及螯合連結子(L 2)藉由點擊反應進行鍵結。在本發明中，在以點擊反應所形成之鍵結部位及螯合劑之間較佳係不包含硫脲鍵。換言之，螯合連結子(L 2)較佳係不包含硫脲鍵。在此處，一般認為以點擊反應所形成之鍵結部位較佳係下述式(10a)或(10b)所示之含有三唑骨架之結構或者下述式(10c)所示之含有嗒骨架之結構。式(10a)及式(10b)係處於異構物的關係，因而可以任意的比例包含在內。
式(10a)及式(10b)中，R 1A表示與螯合劑之連結部位，R 2A表示與抗體修飾胜肽之連結部位。式(10c)中，R 3A及R 4A中之任一者表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示與螯合劑之連結部位，R 5A表示與抗體修飾胜肽之連結部位。在式(10a)、式(10b)及式(10c)中，與抗體修飾胜肽之連結部位係胜肽經由抗體修飾連結子(L 1)進行連結，與螯合劑之連結部位係螯合劑經由螯合連結子(L 2)進行連結。
本發明之放射性複合體係抗體經抗體修飾胜肽部位特異性地修飾，且胜肽及螯合劑經由連結子(L)進行連結，因而成為1分子或2分子的螯合劑對1分子的抗VEGF抗體進行複合化而得之物。
(1-6)複合體的製造方法 本發明之放射性複合體的製造方法可由下列2個步驟進行製造：將螯合劑及抗VEGF抗體進行共軛之共軛步驟；及形成放射性金屬核種與螯合劑之錯合物之錯合物形成步驟。共軛步驟可在錯合物形成步驟之前，亦可在錯合物形成步驟之後。
在共軛步驟中，係將具有前述之式(i)所示之抗體修飾胜肽之螯合劑或連結子(L)對抗體的Fc區域進行部位特異性地修飾。
在錯合物形成步驟中，係使螯合劑螯合放射性金屬核種(錯合物形成)。在此處使用之放射性金屬核種，從提高錯合物形成效率之觀點而言，較佳係以能夠電離之態樣使用，更佳係以離子的態樣使用。錯合物形成步驟只要能夠與放射性金屬核種形成錯合物，放射性金屬核種向螯合劑之添加順序即不拘。例如，可將放射性金屬離子溶解於以水作為主體之溶媒中而得之溶液用作放射性核種。 錯合物形成後，亦可使用過濾器、膜濾器、已填充多種填充劑之管柱、層析等，將所獲得之錯合物進行精製。
本發明之放射性複合體的製造方法較佳係在錯合物形成步驟之後實行共軛步驟。 在更佳態樣中，在錯合物形成步驟(A)中，係在放射性金屬核種以及具有能夠進行點擊反應之第1原子團作為用以能夠與抗體進行複合化之取代基之螯合劑之間形成錯合物。接著，在共軛步驟(B)中，係在使用具有前述之式(i)所示之抗體修飾胜肽及能夠進行點擊反應之第2原子團之抗體修飾連結子(L 1)將Fc區域部位特異性地修飾而得之經胜肽修飾之抗體以及步驟(A)中所獲得之經錯合物形成之螯合劑之間實行點擊反應，獲得本發明之放射性複合體。 針對以下步驟(A)及(B)加以詳述。
作為能夠進行點擊反應之第1原子團與第2原子團之組合，係因應點擊反應的種類而選擇適切者，可列舉例如炔烴與疊氮化物之組合、1,2,4,5-四與烯烴之組合等。此等原子團只要第1原子團具有上述原子團之組合中之一者，且第2原子團具有上述原子團之組合中之成為與第1原子團不同的一者之原子團即可。從兼顧螯合劑及抗體的安定性以及此等的結合效率的提升之觀點而言，較佳係螯合連結子(L 2)為炔烴且抗體修飾連結子(L 1)為疊氮化物，或者螯合連結子(L 2)為1,2,4,5-四且抗體修飾連結子(L 1)為烯烴。作為此種原子團之組合所引發之點擊反應的具體例，可列舉Huisgen環化加成反應或反電子要求型Diels-Alder反應等。
作為能夠進行點擊反應之原子團之組合的具體例，如以下式所示，可列舉包含二苄基環辛炔(DBCO)作為第1原子團的炔烴之原子團(式(1a))與包含疊氮基作為第2原子團的疊氮化物之原子團(式(2a))之組合，或包含1,2,4,5-四作為第1原子團之原子團(式(1b))與包含反-環辛烯(TCO)作為第2原子團的烯烴之原子團(式(2b))之組合。較佳為式(1a)與式(2a)之組合。
式(1a)中，R 1表示與螯合劑之連結部位，式(2a)中，R 2表示與抗體修飾胜肽之連結部位。
式(1b)中，R 3及R 4中之任一者表示與螯合劑之連結部位或與抗體修飾胜肽之連結部位，另一者表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基。R 5在式(1b)的原子團與螯合劑進行連結時，表示與抗體修飾胜肽之連結部位，在式(1b)的原子團與抗體修飾胜肽進行連結時，表示與螯合劑之連結部位。
作為第1原子團的炔烴，在使用包含上述式(1a)所示之二苄基環辛炔(DBCO)之原子團之情況，可列舉市售的多種DBCO試劑。具體而言，可選擇例如DBCO-C6-酸(DBCO-C6-acid)、二苄基環辛炔-胺(dibenzylcyclooctyne-amine)、二苄基環辛炔馬來醯亞胺(dibenzylcyclooctyne maleimide)、DBCO-PEG酸(DBCO-PEG acid)、DBCO-PEG-醇(DBCO-PEG-alcohol)、DBCO-PEG-胺(DBCO-PEG-amine)、DBCO-PEG-NH-Boc、羧基羅丹明-PEG-DBCO (carboxyrhodamine-PEG-DBCO)、磺醯羅丹明-PEG-DBCO (sulforhodamine-PEG-DBCO)、TAMRA-PEG-DBCO、DBCO-PEG-生物素(DBCO-PEG-biotin)、DBCO-PEG-DBCO、DBCO-PEG-馬來醯亞胺(DBCO-PEG-maleimide)、TCO-PEG-DBCO、DBCO-mPEG等，較佳係使用二苄基環辛炔馬來醯亞胺。
在錯合物形成步驟(A)中，更佳係使用具有以下式(ii)所示之結構之化合物。 式(ii)中，A為前述之螯合劑，B及C的總稱為螯合連結子(L 2)。
式(ii)中，B係由以下式(iib)表示。
式(iib)中，La及Lb獨立地為至少包含醯胺鍵之碳數1以上且50以下的鍵結連結子，t為0以上且30以下的整數，s為0或1，＊與A之鍵結部位，＊＊為與C之鍵結部位。
式(ii)中，C為以下式(iic)所示之炔烴衍生物或式(iid)所示之四衍生物中之任一者。
式(iic)中，X為CHRk-＊＊或N-＊＊，Y為CHRk或C=O，Rk獨立地為氫原子或碳數1以上且5以下的烷基，在X為CHRk-＊＊且Y為CHRk之情況，Rk部分亦可共同形成環烷基，Rf、Rg、Rh及Ri獨立地為氫原子、鹵素原子、碳數1以上且5以下的烷基，Rf及Rg亦可共同形成烴環或者Rh及Ri亦可共同形成烴環，＊＊表示與B之鍵結部位，式(iid)中，＊＊表示與B之鍵結部位，Rj表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基。
作為步驟(A)中所使用之螯合劑，更佳為上述式(A)中，R 11至R 14為-(CH 2) pCOOH，p為1，R 15為與B之鍵結部位之DOTA衍生物；或者R 11至R 14為-(CH 2) pCOOH，p為1，R 12為與B之鍵結部位(＊)，R 15為氫原子之DO3A衍生物或DOTAGA衍生物中之任一者。
式(ii)中，在A為上述DO3A之情況，較佳為DO3A-PEGt-DBCO，其中，B係La為包含醯胺鍵之碳數1以上且50以下的鍵結連結子，s為0或1，在s為1之情況，t為0以上且30以下的整數，Lb為包含醯胺鍵之碳數1以上且50以下的鍵結連結子，C為式(iic)所示之炔烴衍生物，式(iic)中，X為N-＊＊，Y為CHRk，Rk為氫原子，Rf及Rg共同形成苯環，Rh及Ri共同形成苯環，＊＊為與B之鍵結部位。
式(ii)中，在A為上述DOTAGA衍生物之情況，較佳為DOTAGA-PEGt-DBCO衍生物，其中，B係La為包含醯胺鍵之碳數1以上且50以下的鍵結連結子，s為0或1，在s為1之情況，t為0以上且30以下的整數，Lb為包含醯胺鍵之碳數1以上且50以下的鍵結連結子，C為式(iic)所示之炔烴衍生物，式(iic)中，X為N-＊＊，Y為CHRk，Rk為氫原子，Rf及Rg共同形成苯環，Rh及Ri共同形成苯環，＊＊為與B之鍵結部位。更佳為下述DOTAGA-DBCO。
螯合劑與放射性金屬核種之莫耳比率就螯合部／放射性金屬核種而言，下限較佳為10／1以上，更佳為100／1以上，再佳為500／1以上，上限較佳為10000／1以下，更佳為8000／1以下，再佳為7000／1以下，例如，較佳為100／1以上且7000／1以下的範圍，更佳為500／1以上且7000／1以下的範圍。
錯合物形成反應較佳係在溶媒下施行。作為溶媒，可使用例如水、生理食鹽水，或者醋酸鈉緩衝液、醋酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、參羥基甲基胺基甲烷緩衝液(Tris緩衝液)、4-(2-羥基乙基)-1-哌乙磺酸緩衝液(HEPES緩衝液)或醋酸四甲基銨緩衝液等緩衝液等。
溶媒的液量並無特別限定，從製造步驟中之實用性之觀點而言，在步驟(A)的開始時，下限為0.01mL以上，較佳為0.1mL以上，更佳為1.0mL以上，再佳為10mL以上，再更佳為100mL以上，上限較佳為1000mL以下，更佳為100mL以下，再佳為10mL以下，再更佳為1.0mL以下，例如為0.01mL以上且100mL以下的範圍。
錯合物形成反應的反應液中之螯合劑的濃度，從目標螯合劑的產率之觀點而言，各自獨立地，在步驟(A)的開始時，下限較佳為0.001μmol／L以上，更佳為0.01μmol／L以上，再佳為0.1μmol／L以上，再更佳為1μmol／L以上，上限較佳為1000μmol／L以下，更佳為100μmol／L以下，再佳為10μmol／L以下，可列舉例如1μmol／L以上且100μmol／L以下的範圍。
作為錯合物形成反應的溫度，例如可為室溫(25℃)，亦可為在加熱條件下，從兼顧螯合劑的分解抑制及錯合物的形成效率提升之觀點而言，下限較佳為20℃以上，更佳為30℃以上，再佳為35℃以上，再更佳為37℃以上，特佳為45℃以上，上限較佳為150℃以下，更佳為120℃以下，再佳為100℃以下，再更佳為90℃以下，例如，較佳為30℃以上且100℃以下的範圍，更佳為35℃以上且90℃以下的範圍。
步驟(B)中所使用之抗體為使用具有前述之式(i)所示之抗體修飾胜肽及能夠進行點擊反應之第2原子團之抗體修飾連結子(L 2)將上述「(1-2)抗體」的項目中所詳述之抗VEGF抗體的Fc區域(恆定區域)部位特異性地修飾而得之經胜肽修飾之抗體。
抗體修飾胜肽可藉由組合使用不拘於天然胺基酸及非天然胺基酸之胺基酸，供予例如液相合成法、固相合成法、自動胜肽合成法、基因重組法及噬菌體呈現法等胜肽合成法而予以製造。在合成胜肽時，亦可視需要施行所使用之胺基酸的官能基的保護。此等可按照例如國際公開第2017/217347號及國際公開第2018/230257號所記載之方法施行。
抗體修飾連結子(L 2)亦可為抗體修飾胜肽及以下式(S1)所示之連結子(L 2)進行鍵結而得者。 (式中，＊表示與胜肽的N末端或C末端之鍵結部位， L i為聚乙二醇(PEG)連結子部， m為1以上且50以下的整數， Z為將(L i) m及L ii進行鍵結之第2連結子部， k為0或1， L ii為第2 PEG連結子部， AG2為第2原子團。)
在前述式(S1)中，Z的結構只要是(L i) m及L ii相互鍵結之連結子結構，即無特別限定，可包含例如由1個以上且5個以下的胺基酸殘基所構成之胺基酸序列。在此情況，Z中所包含之胺基酸序列較佳係包含半胱胺酸殘基，更佳係經由藉由半胱胺酸殘基的硫醇基及馬來醯亞胺基之鍵結所形成之硫醚基而與L 2進行鍵結。
在本發明中，構成L ii之聚乙二醇(PEG)連結子部較佳係具有以下式(P2)所示之結構。式(P2)中，n為整數，較佳為1以上且50以下，更佳為1以上且20以下，再佳為2以上且10以下，再更佳為2以上且6以下。
PEG連結子部的結構的一端亦可經源自於市售的PEG化試劑之結構或源自於進行PEG化時通常所使用之試劑之結構修飾，並無特別限定，可例示例如源自於二甘醇酸或其衍生物、馬來醯亞胺或其衍生物之結構。
向抗體修飾連結子(L 2)導入前述第2原子團之方法可列舉下列方法：藉由上述方法獲得具有所期望的胺基酸序列之抗體修飾胜肽後，將該胜肽溶解於已加入溶解輔助劑及還原劑以及視需要的酸之溶液中，在該溶液中添加包含疊氮基或反-環辛烯(TCO)之原子團作為第2原子團的有機溶媒溶液，於室溫進行攪拌，藉此進行導入。
在導入包含疊氮基之原子團作為第2原子團之情況，可使用市售的疊氮基導入試劑，依照常法，在胜肽的N末端或C末端直接導入疊氮基，或經由上述之連結子結構導入包含疊氮基之原子團。作為所使用之疊氮基導入試劑，可列舉例如矽烷基疊氮化物、磷酸疊氮化物、烷基銨疊氮化物、無機疊氮化物、磺醯基疊氮化物或PEG疊氮化物等。
此外，在導入包含TCO之原子團作為第2原子團之情況，可使用包含TCO之市售的點擊化學用試劑，依照常法，在胜肽的N末端或C末端直接導入TCO，或經由上述之連結子結構導入包含TCO之原子團。
使抗體修飾胜肽及抗VEGF抗體進行鍵結而獲得經胜肽修飾之抗體之方法可按照國際公開第2017/217347號的記載，例如使上述之抗體修飾胜肽、抗VEGF抗體、交聯劑及視需要的觸媒分散於適切的緩衝液中而施行。在此處，交聯劑可使用上述者。此外，在使抗體修飾胜肽及抗VEGF抗體進行鍵結時，亦可視需要將包含抗VEGF抗體之溶液以超過濾器等進行處理並實施1次或2次以上分散於緩衝液中之緩衝液更換之後，使其與抗體修飾胜肽進行鍵結。
在一態樣中，本揭示係關於生產抗體修飾胜肽與抗VEGF抗體之複合體之方法，其包含將經交聯劑修飾之抗體修飾胜肽及抗VEGF抗體進行混合之步驟。藉由本步驟，可在經交聯劑修飾之抗體修飾胜肽及抗VEGF抗體(例如貝伐珠單抗)之間發生交聯反應。交聯反應可在抗體修飾胜肽的上述Xaa 2的胺基酸殘基及人類IgG Fc中之依照Eu編號之Lys252殘基或Lys254殘基，較佳為Lys254殘基之間部位特異性地發生。
只要是在抗體修飾胜肽及抗VEGF抗體之間會發生交聯反應之條件下施行，該混合步驟的條件即無特別限定。例如，可藉由將抗體修飾胜肽及抗VEGF抗體在適當的緩衝液中，於室溫(例如約15℃～30℃)進行混合而施行反應。該混合步驟亦可視需要加入適量的促進交聯反應之觸媒而施行。
作為一例，係加入至少包含水之溶媒而將抗VEGF抗體進行溶解。此溶媒係除了水以外，尚可列舉例如二甲基亞碸、乙腈、生理食鹽水，或者醋酸鈉緩衝液、醋酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、Tris緩衝液、HEPES緩衝液、醋酸四甲基銨緩衝液或組胺酸緩衝液等緩衝液等。在使用緩衝液之情況，從抗體的安定性之觀點而言，較佳係將於25℃之pH值設為4.0以上且10.0以下，更佳為5.5以上且8.5以下。抗體的濃度在交聯反應的開始時，較佳係將下限設為1.0μmol／L以上，將上限設為1000μmol／L以下，針對上限，更佳係設為500μmol／L以下。
接著，可加入經交聯劑修飾之抗體修飾胜肽及視需要的觸媒，使其於10℃以上且30℃以下進行分散而施行。 該混合步驟中之抗體修飾胜肽與抗VEGF抗體之混合比率並無特別限定。抗體修飾胜肽與抗VEGF抗體之莫耳比率可設為例如1：1～20：1，較佳為2：1～20：1或5：1～10：1。
在某一較佳態樣中，在上述混合步驟中，可以抗體修飾胜肽相對於抗VEGF抗體(莫耳比)為0.5～2.2，較佳為0.8～1.8進行混合。藉由此方式，便可效率佳地獲得對1分子的抗VEGF抗體鍵結1分子的抗體修飾胜肽而得之抗體(以下稱為「一價抗體」)。
只要在抗體修飾胜肽及抗VEGF抗體之間會發生交聯反應，該混合步驟中之混合時間(反應時間)並無限定，可設為例如1分鐘〜5小時，較佳為10分鐘〜2小時。
歷經以上步驟所獲得之經胜肽修飾之抗體為以任意的比例含有對1分子的抗VEGF抗體鍵結1分子的抗體修飾胜肽而得之抗體(即，一價抗體)及對1分子的抗VEGF抗體鍵結2分子的抗體修飾胜肽而得之抗體(以下稱為「二價抗體」)之混合物，可將其依原樣供予以後的步驟，亦可以過濾器、膜濾器、已填充多種填充劑之管柱、各種層析等方法將未經修飾之抗體、一價抗體及二價抗體進行分離精製之後，僅將任一價數的抗體供予以後的步驟。在精製之結果，無法分離未經修飾之抗體及其他價數的抗體之情況，亦可以含有此等之混合物之形式供予以後的步驟。 在將未經修飾之抗體、一價抗體及二價抗體進行分離精製之情況，可以上述任何精製方法進行分離精製，可使用已填充多種填充劑之管柱，例如，可使用填充有將蛋白A、蛋白G或上述抗體修飾胜肽等蛋白質鍵結至擔體而得之填充劑之管柱。作為此種管柱中所填充之填充劑的擔體的形狀，可列舉凝膠(例如管柱用凝膠)、粒子、珠粒、奈米粒子、微粒子及微珠等的形狀，作為擔體的材質，可列舉磁性物質、乳膠、瓊脂糖、玻璃、纖維素、瓊脂糖凝膠(Sepharose)、硝基纖維素、聚苯乙烯、其他高分子材料。具體而言，可例示使上述抗體修飾胜肽鍵結至管柱用凝膠而得之IgG-BP管柱(國際公開第2021/080008號)。
IgG-BP管柱為將鍵結IgG之胜肽予以固相化而得之管柱。二價抗體係由於鍵結部位已被鍵結IgG之胜肽所佔有，因而無法鍵結至該管柱，僅一價抗體對該管柱顯示出親和性。可使用此IgG-BP管柱，利用各者對抗體修飾胜肽之相互作用的差異，各自將包含相對較多的未經修飾之抗體及一價抗體之第一抗體組成物及包含相對較多的二價抗體之第二抗體組成物進行分離精製。在某一較佳態樣中，在第一抗體組成物中，未經修飾之抗體與一價抗體之莫耳比為4～47：53～96，較佳為4～30：70～96，更佳為4～20：80～96，再佳為4～10：90～96。
依此方式，所分離精製而得之第一抗體組成物或第二抗體組成物可依原樣用於以後的步驟(B)中之點擊反應，亦可調節所含有之經胜肽修飾之抗體的蛋白質濃度之後再用於步驟(B)中之點擊反應。
步驟(B)中之點擊反應係在螯合劑所具有之能夠進行點擊反應之第一原子團及經胜肽修飾之抗體所具有之能夠進行點擊反應之第二原子團之間實行。藉由該種點擊反應，形成將螯合劑及抗體進行連結之鍵結基(能夠與抗體進行複合化之取代基)。
只要經胜肽修飾之抗體及步驟(A)中所獲得之錯合物能夠進行點擊反應，此等的添加順序即不拘，例如，可在收容溶媒之反應容器中添加該錯合物及該經胜肽修飾之抗體中之一者，接著添加另一者而進行反應，亦可在將該螯合劑及該抗體中之一者分散於溶媒中而得之分散液中添加另一者而進行反應。或者，亦可在收容溶媒之反應容器中同時添加此等而進行反應。
作為用於步驟(B)的點擊反應之溶媒，可使用包含水之溶媒，可使用例如水、生理食鹽水，或者醋酸鈉緩衝液、醋酸銨緩衝液、磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理食鹽水、Tris緩衝液、HEPES緩衝液或醋酸四甲基銨緩衝液等緩衝液等。在使用緩衝液之情況，從兼顧錯合物及抗體的安定性以及此等的結合效率之觀點而言，較佳係將於25℃之pH值設為4.0以上且10.0以下，更佳為5.5以上且8.5以下。
反應液量並無特別限定，從製造步驟中之實用性之觀點而言，在步驟(B)的開始時，下限較佳為0.001mL以上，更佳為0.01mL以上，再佳為0.1mL以上，再更佳為1mL以上，上限較佳為1000mL以下，更佳為100mL以下，再佳為10mL以下，再更佳為1mL以下，例如，較佳為0.001mL以上且1000mL以下的範圍，更佳為0.1mL以上且10mL以下的範圍。
此外，螯合劑及抗體的反應液中之濃度係各自獨立地，在步驟(B)的開始時，就下限而言，較佳為0.001μmol／L以上，更佳為0.01μmol／L以上，再佳為0.1μmol／L以上，再更佳為1.0μmol／L以上，就上限而言，較佳為1000μmol／L以下，更佳為100μmol／L以下，例如，較佳為0.1μmol／L以上且1000μmol／L以下的範圍，從目標複合體的產量之觀點而言，更佳為1μmol／L以上且100μmol／L以下的範圍。
從防止抗體的意外變性，同時提高反應效率之觀點而言，步驟(B)中之點擊反應係反應溫度的上限較佳為50℃以下，更佳為40℃以下。此外，反應溫度的下限只要是會進行反應之溫度，即無特別限制，較佳為15℃以上。點擊反應的反應時間，以上述反應溫度為條件，較佳為5分鐘以上，更佳為10分鐘以上，較佳為24小時以下，更佳為20小時以下，例如，較佳為5分鐘以上且24小時以下的範圍，更佳為10分鐘以上且20小時以下的範圍。
所獲得之複合體可將其依原樣使用，或者，亦可使用過濾器、膜濾器、已填充多種填充劑之管柱、層析等予以精製。
藉由步驟(A)及(B)所製造之複合體係抗VEGF抗體的Fc區域的離胺酸殘基經螯合劑特異性地修飾。此複合體係相對於1分子的該抗體而言，具備1分子或2分子的前述螯合劑。螯合劑係經由連結子(L)部位特異性地修飾本發明之抗體的Fc區域。該連結子(L)係由連接至螯合劑之螯合連結子(L 2)、連接至該連結子(L 2)之第1原子團、可與第1原子團進行點擊反應之第2原子團、連接至第2原子團之抗體修飾連結子(L 1)(包含上述式(i)所示之抗體修飾胜肽)所構成。從而，該連結子(L)具有源自於第1原子團及第2原子團之化學結構。作為此種化學結構，一般認為是前述式(10a)或(10b)所示之含有三唑骨架之結構或下述式(10c)所示之含有嗒骨架之結構。式(10a)及式(10b)係處於異構物的關係，因而可以任意的比例包含在內。
(1-7)放射性醫藥 所謂放射性醫藥，係指包含本發明之放射性複合體，且呈適合投予至對象的生體內之形態之組成物。放射性醫藥可例如將以上述(1-6)所示之方法所製造而得之放射性複合體依原樣或將其進行精製之後，使其溶解於以水作為主體且與生體略等張的溶媒中而予以製造。在此情況，放射性醫藥較佳為水溶液的形態，亦可視需要包含藥學上可容許的其他成分。放射性醫藥係將其有效量經口地或者靜脈內、皮下、腹腔內或肌肉內等非經口地投予至生體，用於癌症的治療、癌症的診斷或病灶的檢測等。 在此處，作為投予對象，係人類，或者小鼠、大鼠、猴、豚鼠、黑猩猩、羊、山羊、犬、貓、豬、牛或馬等動物，並無特別限定。較佳為人類。 作為較佳的對象疾患，可列舉VEGF陽性的癌症。本發明所治療、診斷或檢測之VEGF陽性的癌症只要會表現VEGF，其種類即無特別限定，可列舉例如肺癌、結腸／直腸癌、肝細胞癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、惡性神經膠瘤。此外，表現VEGF之癌症可為任何病期的癌症，亦可為侷限性或轉移性，或者原發性或復發性中之任何者。在此處，所謂「表現」，在以公知的檢查手法進行測定之情況，係指觀察到腫瘤組織中之VEGF基因相比於非腫瘤組織而言顯著的增幅或VEGF蛋白質的表現相比於非腫瘤組織而言顯著的亢進之狀態。 在此處之所謂「有效量」，係在投予對象中可獲得診斷上或治療上有效的效果之量。應投予至對象之有效量係依對象的種類、對象的體重、所投予之劑型(錠劑、注射劑等)及途徑(經口投予、非經口投予等)及疾患(例如癌症)的嚴重度等而有所不同。醫師或獸醫師可考慮該等因素而決定適切的有效量。
本發明之放射性醫藥於室溫保管時，以構成該放射性醫藥之放射性金屬核種的半衰期為基準，在經過半衰期的1以上且5以下的倍數的時間之時點，具有一定比例以上的放射化學純度。上述放射性金屬核種為β射線核種(例如Lu-177或Y-90)時，於室溫製造結束起保管7日時之複合體的放射化學純度較佳為90%以上，更佳為95%以上。此外，在放射性金屬核種為α射線核種(例如Ac-225)時，於室溫製造結束起保管14日時之複合體的放射化學純度較佳為90%以上，更佳為95%以上。
本發明之放射性醫藥的具體的態樣係含有螯合有放射性金屬核種之螯合劑與抗VEGF抗體之複合體作為有效成分，在抗VEGF抗體與螯合劑之連結(特定而言，經由連結子(L)之連結)中不包含硫脲鍵，於室溫保管時，以構成該放射性醫藥之放射性金屬核種的半衰期為基準，在經過半衰期的1以上且5以下的倍數的時間之時點，具有一定比例以上的放射化學純度。上述放射性金屬核種為β射線核種(例如Lu-177或Y-90)時，於室溫製造結束起保管7日時之前述複合體的放射化學純度較佳為90%以上，更佳為95%以上。此外，在放射性金屬核種為α射線核種(例如Ac-225)時，於室溫製造結束起保管14日時之複合體的放射化學純度較佳為90%以上，更佳為95%以上。
在此處，本說明書中之所謂「室溫」，較佳係指日本藥典中所定義之「常溫」，具體而言為15～25℃。 在此處，放射化學純度係指在將試料以市售的放射線檢測器進行分析之情況，相當於複合體之峰的放射能(計數)相對於所檢測出之全放射能(計數)之百分率。在放射化學純度的分析中，可使用高效液相層析或薄層層析，較佳係使用薄層層析。更佳係使用採用後述之實施例所記載之條件之薄層層析。
如前述，本發明之放射性醫藥較佳為水溶液的形態，從維持放射化學純度之觀點而言，更佳為緩衝液的形態。作為緩衝液，可使用含有抗VEGF抗體或抗VEGF抗體的ADC作為有效成分之抗體醫藥中所使用之任意的緩衝液，並無特別限定，作為一例，可使用磷酸緩衝液、琥珀酸緩衝液或檸檬酸緩衝液。磷酸緩衝液係由磷酸及其鹽所構成，例如，可由磷酸及其鈉鹽所構成。琥珀酸緩衝液係由琥珀酸及其鹽所構成，例如，可由琥珀酸及其鈉鹽所構成。檸檬酸緩衝液係由檸檬酸及其鹽所構成，例如，可由檸檬酸及其鈉鹽所構成。在本發明之放射性醫藥中，亦可包含海藻糖、蔗糖等任意的醣，亦可包含組胺酸等任意的胺基酸，亦可包含聚山梨糖醇酯20、聚山梨糖醇酯80等可溶化劑。
藉由選擇具有治療效果者，具體而言，釋放出α射線之放射性核種或釋放出β射線之核種(較佳為Ac-225、Y-90、Lu-177，更佳為Ac-225)作為放射性金屬核種，本發明之放射性醫藥便可用於癌症的放射線內用療法。在此放射線內用療法中，係將本發明之放射性醫藥進行靜脈注射或經口投予，使本發明之放射性複合體集聚於諸如癌症原發灶或轉移灶之病灶部位，藉由從放射性金屬核種所釋放出之放射線，便可破壞病灶部位的癌細胞。本發明之放射性醫藥的投予量、用量係因應有效成分的有效性、投予的形態／途徑、癌症的進行階段、患者的體型／體重／年齡、所併用之其他疾患的治療藥的種類或量而適宜選擇。
此外，藉由選擇釋放出正電子之放射性核種或釋放出γ射線之放射性核種(較佳為Ga-68、Zr-89、In-111)作為放射性金屬核種，便可用於癌症的診斷或病灶的檢測。在使用釋放出正電子之放射性核種之放射性醫藥之情況，可適合地用於PET(Positron Emission Tomography)檢查，在使用釋放出γ射線之放射性核種之放射性醫藥之情況，可適合地用於SPECT(Single Photon Emission Computed Tomography)檢查。亦可將其與上述之癌症的放射線內用療法中之癌症的診斷或病灶的檢測併用。本發明之癌症的診斷用放射性醫藥可用於施行癌症的放射線內用療法之前之診斷，亦可用於施行癌症的放射線內用療法之後之診斷。藉由用於施行癌症的放射線內用療法之前之診斷，可用於判斷是否實行使用具備釋放出α射線之金屬核種之本發明之放射性醫藥之癌症的放射線內用療法的治療選擇。此外，藉由用於施行癌症的放射線內用療法之後之診斷，可用於判定使用本發明之放射性醫藥之癌症的放射線內用療法是否有效果或將投予量的增減等治療計畫予以適當化。
以下態樣亦含括在本發明的技術思想中。 [1]一種複合體，其係經抗體修飾胜肽部位特異性地修飾之抗體與螯合劑之複合體， 前述抗體為抗VEGF抗體， 在前述螯合劑中螯合有放射性金屬核種。 [2]如[1]所記載之複合體，其中，前述胜肽為下述式(i)所示之由13～17個胺基酸殘基所構成之胺基酸序列： (式(i)中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續的a個X、連續的b個X、連續的c個X及連續的d個X， X為在側鏈不具有硫醇基及鹵乙醯基中之任何者之胺基酸殘基， a、b、c及d各自獨立地為1以上且5以下的整數，且滿足a+b+c+d≦14， Xaa 1及Xaa 3各自獨立地表示源自於在側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基或源自於在側鏈具有鹵乙醯基之胺基酸之胺基酸殘基，惟，Xaa 1及Xaa 3中之任一者為源自於具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基， 藉由Xaa 1及Xaa 3連結而形成環結構， Xaa 2為離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸或二胺基丙酸，且Xaa 2係經交聯劑修飾)。 [3]如[1]或[2]所記載之複合體，其中，前述放射性金屬核種為Ga-68、Zr-89、Y-90、In-111、Lu-177或Ac-225。 [4]如[1]至[3]中任一項所記載之複合體，其中，前述抗VEGF抗體為貝伐珠單抗。 [5]如[1]至[4]中任一項所記載之複合體，其中，前述胜肽及螯合劑係經由連結子(L)進行連結，該連結係藉由不包含硫脲鍵之共價鍵來進行。 [6]如[1]至[5]中任一項所記載之複合體，其中，前述胜肽及螯合劑係經由連結子(L)進行連結，前述連結子(L)包含式(10a)、式(10b)或式(10c)；
(式(10a)及式(10b)中，R 1A表示與前述螯合劑之連結部位，R 2A表示與前述胜肽之連結部位；式(10c)中，R 3A及R 4A中之任一者表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示與前述螯合劑之連結部位，R 5A表示與前述胜肽之連結部位)。 [7]如[6]所記載之複合體，其中，在與前述胜肽之連結部位及前述胜肽之間包含聚乙二醇基。 [8]如[1]至[6]中任一項所記載之複合體，其中，前述螯合劑為DOTAGA(α-(2-羧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)。 [9]如[1]至[8]中任一項所記載之複合體，其係藉由使經在N末端導入疊氮基而得之前述胜肽部位特異性地修飾之抗VEGF抗體及下述式所示之DOTAGA-DBCO的放射性金屬錯合物進行點擊反應而予以複合化；
。
[10]一種放射性醫藥，其含有如[1]至[9]中任一項所記載之複合體作為有效成分。 [11]如[10]所記載之放射性醫藥，其係用於癌症的放射線內用療法。 [12]如[10]所記載之放射性醫藥，其係用於癌症的診斷。 [13]如[12]所記載之放射性醫藥，其係與使用如[11]所記載之放射性醫藥之癌症的放射線內用療法併用。 [14]一種放射性醫藥，其含有螯合有放射性金屬核種之螯合劑與抗VEGF抗體之複合體作為有效成分， 在抗VEGF抗體與螯合劑之連結中不包含硫脲鍵，且滿足下述(1)或(2)的條件： (1)前述放射性金屬核種為 177Lu或 90Y，於室溫保管7日時之前述複合體的放射化學純度為90%以上； (2)前述放射性金屬核種為 225Ac，於室溫保管14日時之前述複合體的放射化學純度為90%以上。 [15]一種放射性醫藥，其含有螯合有放射性金屬核種之螯合劑與抗VEGF抗體之複合體作為有效成分， 在抗VEGF抗體與螯合劑之連結中不包含硫脲鍵， 以前述放射性金屬核種的半衰期為基準，在經過前述半衰期的1以上且5以下的倍數的時間之時點，前述複合體的放射化學純度為90%以上。 [實施例]
以下，藉由實施例來進一步詳細地說明本發明。然而，本發明的範圍並不限制於該實施例。
[實施例1]部位特異性地經 225Ac標識之DOTAGA與貝伐珠單抗之複合體( 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1)的製造 (1.抗體修飾步驟) 以國際公開第2017/217347號所記載之方法，獲得包含下述式(P3)所示之17個胺基酸殘基之胜肽。此胜肽的胺基酸序列係與SEQ ID NO：(2)的Xaa 2為離胺酸殘基之序列相同，離胺酸殘基的側鏈末端胺基係經R 1所示之結構修飾。此外，以2個半胱胺酸殘基相互進行二硫醚鍵結，胜肽的N末端係經由具有二甘醇酸及8個PEG之連結子(L 1)結構，鍵結乙基疊氮化物作為屬於第2原子團之包含疊氮基之原子團。
(式(P3)中，各自地，Gly表示甘胺酸，Pro表示脯胺酸，Asp表示天冬胺酸，Cys表示半胱胺酸，Ala表示丙胺酸，Tyr表示酪胺酸，Lys表示離胺酸，His表示組胺酸，Glu表示麩胺酸，Leu表示白胺酸，Val表示纈胺酸，Trp表示色胺酸，Thr表示蘇胺酸，Phe表示苯基丙胺酸。)
使將上述胜肽及貝伐珠單抗(Roche公司製)混合於0.02mol／L醋酸／醋酸鈉緩衝液(pH6.0)中而得之混合液於室溫進行反應60分鐘，而獲得包含經胜肽修飾之抗體之溶液。此經胜肽修飾之抗體係抗體的Fc區域經上述胜肽部位特異性地修飾。
接著，通液至IgG-BP管柱，而獲得包含相對較多的未經標識之抗體及一價抗體之第一抗體組成物。以所回收之部分中所包含之一價抗體的濃度成為14.6mg／mL之方式，以保存緩衝液(60g／L海藻糖及5.8g／L磷酸二氫鈉一水合物、無水磷酸一氫鈉、0.4g／L聚山梨糖醇酯20混液)調整濃度。將包含所獲得之第一抗體組成物之溶液供予後述標識步驟。
(2.錯合物形成步驟) 基於Bernhard et al. DOTAGA-Anhydride: A Valuable Building Block for the Preparation of DOTA-Like Chelating Agents Chem. Eur. J. 2012, 18, 7834-7841所記載之方法製造下述式所示之DOTAGA-DBCO。使此螯合劑分散於作為溶媒之0.1mol／L醋酸鈉緩衝液(pH5.0)中，製成包含螯合劑0.3mmol／L之分散液。使將此分散液0.028mL及作為放射性金屬源之含有 225Ac離子之溶液(0.1mol／L鹽酸水溶液，放射能濃度237.6MBq／mL，由State Atomic Energy Corporation Rosatom製所調製，液量0.0126mL)約2.99MBq (從檢定日時放射能量進行衰減計算而得之計算值)進行混合而得之反應液在加熱條件下進行反應，而獲得 225Ac錯合物溶液。螯合劑與放射性金屬離子之莫耳比率為螯合劑： 225Ac離子=約1350：1，反應液的加熱溫度係設為70℃，加熱時間係設為30分鐘。
以下列方法測定所獲得之 225Ac錯合物的放射化學純度(RCP，%)。即，將 225Ac錯合物溶液的一部分以薄層層析(Agilent公司製，型號：SGI0001，展開溶媒：乙腈／水混合液(體積比1：1))進行展開，然後，以放射性γ-TLC分析儀(raytest公司製，MODEL GITA Star)進行測定。將在原點附近所檢測出之峰的放射能(計數)相對於所檢測出之全放射能(計數)之百分率定為 225Ac錯合物的RCP。其結果， 225Ac錯合物的RCP為79%。所獲得之 225Ac錯合物溶液係依原樣用於標識步驟。
(3.標識步驟) 在歷經上述步驟(2)所獲得之未精製原樣的 225Ac錯合物的溶液中添加上述步驟(1)中所獲得之包含經胜肽修飾之抗體(一價抗體)之溶液，使其於37℃進行點擊反應120分鐘，而獲得 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1。 225Ac錯合物的量及經胜肽修飾之抗體(一價抗體)的量分別為8.7nmol及10.2nmol，DBCO基與疊氮基之莫耳比各自為約1：1.2。未精製時之 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1的反應率(%)為72%。在此處，所謂反應率(%)，係意味 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1的RCP相對於錯合物形成步驟中之標識率(%)，所謂標識率(%)，係意味 225Ac錯合物的放射能相對於饋入放射能之比例(%)。 再者，將使其於37℃反應2小時所獲得之 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1的溶液使用超過濾器(Merck公司製，型號：UFC505096)進行精製。精製後之 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1的放射化學產率(RCY，%)為70%，RCP為97%。
225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1的反應率、RCP及RCY的測定方法係如下。即，將薄層層析(Agilent公司製，型號：SGI0001，展開溶媒為乙腈：0.1mmol／L EDTA溶液的混液(體積比1：1))以放射性γ-TLC分析儀(raytest公司製，MODEL GITA Star)進行測定，將在原點附近所檢測出之峰的放射能(計數)相對於所檢測出之全放射能(計數)之百分率定為RCP(%)，除以標識率(%)而算出反應率(%)。此外，將相對於在標識步驟開始時所加入之全放射能(從以γ射線光譜儀(Ge半導體檢測器：GMX10P4-70(ORTEC公司製)，多道分析器：M7-000(Seiko EG&G公司製)，數據處理：Spectrum Navigator：DS-P300(Seiko EG&G公司製)及Gamma Studio：DS-P600(Seiko EG&G公司製))所測定而得之計數進行計算而得之放射能量)而言，在超過濾精製後所回收之放射能(與上述同樣地，從以γ射線光譜儀所測定而得之計數進行計算而得之放射能量)之百分率定為RCY(%)。
[實施例2]部位特異性地經 225Ac標識之DOTA與貝伐珠單抗之複合體( 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗2)的製造 除了將DOTAGA-DBCO替換成下述DOTA-Bn-DBCO以外，按照實施例1施行操作，獲得 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗2。反應率為50%，RCY為15%，RCP為62%。
[實施例3]製劑化步驟 將依照實施例1的記載所製造而得之 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1提取一部分至5mL Eppendorf管(LoBind，Eppendorf公司製)中，以配方緩衝液(60g／L海藻糖及5.8g／L磷酸二氫鈉一水合物、無水磷酸一氫鈉、0.4g／L聚山梨糖醇酯20混液)進行稀釋。
[評估1]活體外(in vitro)藥效評估 使用以下源自肺癌之細胞株對本發明之放射性複合體在活體外之藥效進行評估。 ・A549(人類肺腺癌；取得來源：ECACC(The European Collection of Authenticated Cell Cultures)；F-12K培養基) ・NCI-H358(人類肺腺癌；取得來源：ATCC(American Type Culture Collection)；RPMI 1640培養基) ・NCI-H520(人類肺扁平上皮癌；取得來源：ATCC；RPMI 1640培養基) ・NCI-H460(人類非小細胞肺癌；取得來源：ATCC；RPMI 1640培養基) 將上述細胞以適合各者之培養基進行培養，將依照實施例3的記載加以製劑化而得之 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1以成為0、0.001、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30kBq／mL(就貝伐珠單抗而言0.00229、0.0229、0.0687、0.229、0.687、2.29、6.87、22.9、68.7μg／mL)之方式以各培養基進行稀釋，添加至細胞中。此外，以成為與各放射能濃度的樣品同樣的抗體濃度之方式添加未經標識之貝伐珠單抗，進行培養。添加樣品起120小時後，在培養基中添加CellTiter-Glo(註冊商標)2.0 Cell Viability Assay(Promega公司製)，使用微量盤讀取器(SpectraMax i3x，Molecular Devices公司製)檢測化學發光，算出活細胞數。取得對所算出之活細胞數而言，與未添加抗體之條件之情況之活細胞數之比率，評估殺細胞效果。 將結果示於圖1。縱軸表示將未添加抗體之條件下之活細胞數設為100%之情況之相對值，橫軸表示所添加之抗體濃度。相比於屬於原本的抗體之貝伐珠單抗(未標識)(圖中，○)而言， 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1(圖中，●)係在少量的抗體投予下確認到殺細胞效果。此外，已確認所添加之放射能對殺細胞效果之依存性。
[評估2]活體內(in vivo)藥效評估 使用小鼠製作A549的皮下荷癌模型，對本發明之放射性複合體在活體內之藥效進行評估。 將從ATCC購入之屬於源自VEGF陽性的人類肺腺癌之細胞株之A549細胞懸浮於F-12K培養基中，移植5×10 6個細胞至5週齡的雌性BALB/c nu/nu(Jackson Laboratory Japan公司製)的側腹皮下而製作荷癌小鼠。使腫瘤體積生長至成為100～300mm 3，從適合腫瘤徑測定之形狀的個體中隨機地實施分組。將此時之各小鼠的腫瘤體積及體重示於表1。腫瘤體積係依照以下式予以算出。 腫瘤體積(mm 3)=(腫瘤長徑×(腫瘤短徑) 2)×1／2
將 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1以10kBq／隻(就貝伐珠單抗而言60μg／隻)的用量進行尾靜脈內投予。 另外，作為對照組，係各自設定抗體對照組、放射能對照組及媒劑組。 抗體對照組為投予與 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1相同的抗體量的貝伐珠單抗(未標識)之組。 放射能對照組為以10kBq／隻的用量投予在實施例1中除了將貝伐珠單抗替換成人類IgG抗體(InVivoPlus human IgG1 isotype control，Bio X cell公司製)以外，以同樣的程序所製造而得之 225Ac-CCAP-人類IgG抗體之組。 媒劑組為僅投予實施例3中所使用之配方緩衝液之組。 以各組100μL／隻的量進行投予。 各組係設為5或6隻，直至投予後42日為止，經時性地對一般狀態的觀察、體重及腫瘤體積進行計測。將經時性腫瘤體積的變化示於圖2的圖表。圖2的縱軸表示將各藥劑投予時之腫瘤體積設為1之情況之相對值，圖2的橫軸表示投予各藥劑之後之經過日數。圖表係顯示各組的腫瘤體積的平均值±標準偏差，「＊」表示相對於媒劑組而言可看出顯著差異(p＜0.01)之時點，「†」表示相對於放射能對照組而言可看出顯著差異(p＜0.05)之時點。
投予 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1之組在投予後42日點，與放射能對照組及媒劑組相比較，在抗腫瘤效果上可看出顯著的差異(P＜0.05及P＜0.01)。在顯著差異的檢定中，係使用統計解析軟體Stat Preclinica(Takumi Information Technology公司製)施行Tukey檢定。另一方面， 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1與抗體對照組相比較，在抗腫瘤效果上並未確認到顯著的差異，但獲得抗腫瘤效果較強的傾向。此外，各組皆在一般狀態上無明顯的變化，並未看出明顯的體重減少等毒性徵兆。
[實施例4]部位特異性地經 89Zr標識之DOTAGA與貝伐珠單抗之複合體( 89Zr-CCAP-貝伐珠單抗1)的製造 (1.錯合物形成步驟) 使DOTAGA-DBCO分散於作為溶媒之0.1mol／L醋酸鈉緩衝液(pH5.0)中，而製成包含螯合劑0.3mmol／L之分散液。使將此分散液0.1086mL及含有0.075mol／L龍膽酸之0.156mol／L醋酸鈉溶液0.0815mL、作為放射性金屬源之含有 89Zr離子之溶液(0.1mol／L鹽酸水溶液，放射能濃度5.76GBq／mL，由日本Medi-Physics股份有限公司製所調製，液量0.055mL)317MBq進行混合而得之反應液在加熱條件下進行反應，而獲得 89Zr錯合物溶液。螯合劑與放射性金屬離子之莫耳比率為螯合劑： 89Zr離子=約152：1，反應液的加熱溫度係設為70℃，加熱時間係設為60分鐘。所獲得之 89Zr錯合物溶液係依原樣用於標識步驟。以下列方法測定所獲得之 89Zr錯合物的RCP。即，將 89Zr錯合物溶液的一部分以薄層層析(Agilent公司製，型號：SGI0001，展開溶媒為乙腈／水混合液(體積比1：1))進行展開，然後，以放射性γ-TLC分析儀(raytest公司製，MODEL GITA Star PS)進行測定。將在原點附近所檢測出之峰的放射能(計數)相對於所檢測出之全放射能(計數)之百分率定為 89Zr錯合物的RCP(%)。其結果， 89Zr錯合物的RCP為74%。所獲得之 89Zr錯合物溶液係依原樣用於標識步驟。
(2.標識步驟) 將歷經上述步驟(1)所獲得之未精製原樣的 89Zr錯合物的溶液及依與實施例1同樣之方式所獲得之包含經胜肽修飾之抗體(一價抗體)之溶液依未精製原樣各自添加至含有0.1mol／L精胺酸之0.05mmol／L組胺酸緩衝液(pH6.1)中，使其於37℃進行點擊反應90分鐘，而獲得 89Zr-CCAP-貝伐珠單抗1。 89Zr錯合物的量及經胜肽修飾之抗體(一價抗體)的量分別為32.6nmol及24.6nmol，DBCO與疊氮化物之莫耳比各自為約1：0.75。未精製時之 89Zr-CCAP-貝伐珠單抗1的反應率(%)為74%。在此處，所謂反應率(%)，係意味 89Zr錯合物標識抗體的RCP相對於錯合物形成步驟中之標識率(%)，所謂標識率(%)，係意味 89Zr錯合物的放射能相對於饋入放射能之比例(%)。 再者，將使其於37℃反應2小時所獲得之 89Zr-CCAP-貝伐珠單抗1的溶液使用超過濾器(Merck公司製，型號：UFC505096)進行精製。精製後之 89Zr-CCAP-貝伐珠單抗1的RCP為96%，RCY為62%。另外， 89Zr-CCAP-貝伐珠單抗1的RCP及RCY的測定方法係與實施例1同樣地施行。
[實施例5]製劑化步驟 將依照實施例4的記載所製造而得之放射性複合體各自提取1.0mL至5mL Eppendorf管(LoBind，Eppendorf公司製)中，以配方緩衝液(42g／L海藻糖水合物、0.47g／L L-組胺酸鹽酸鹽水合物、0.30g／L L-組胺酸及85mg／L聚山梨糖醇酯20混液)3.64mL進行稀釋。
[評估3]活體內腫瘤集聚性 除了評估2中所使用之細胞以外，尚使用以下源自肺癌之細胞株製作荷癌小鼠。 ・NCI-H209(人類小細胞肺癌；取得來源：ATCC；RPMI 1640培養基) 調製各細胞株的細胞懸浮液，在5週齡的雌性BALB/c nu/nu(日本Charles River)的左前腳部移植5×10 6個細胞至皮下而製作荷癌小鼠。使腫瘤體積生長至成為約100～300mm 3，將 89Zr-CCAP-貝伐珠單抗1以6MBq／隻(各n=3)的用量進行尾靜脈內投予。在投予後72小時後，使用小動物PET成像裝置(PET/CT Si78，Bruker公司製)施行攝像。PET的攝像條件係擷取時間(acquisition time)設為600秒，能量窗(energy window)設為30%(357.7-664.3keV)。作為數據校正，係實施散射校正、隨機校正、衰變校正(decay correction)、部分體積(partial volume)、衰減(attenuation)，就PET影像再構成而言，係使用MLEM(最大似然期望最大化(maximum likelihood-expectation maximization))法(迭代次數(iterations)：12)。 另外，腫瘤體積係依照以下式予以算出。 腫瘤體積(mm 3)=(腫瘤長徑×(腫瘤短徑) 2)×1／2 將實施PET攝像而得之結果的代表例示於圖3。圖3中，箭頭表示腫瘤部位。 在腫瘤中，與其他臟器相比較，放射能係以較高的濃度集聚，能夠描繪出VEGF陽性腫瘤。
[評估4]安定性評估 將依照實施例1及實施例2的記載加以製造並依照實施例3的記載加以製劑化而得之各放射性複合體( 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1及 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗2)於室溫(24.8～24.9℃)保存2週，在各時間點(0日點、1日點、7日點及14日點)，評估RCP、凝集體的比例。另外，製造結束起14日，在放射性金屬核種為 225Ac之情況，係相當於約1.5半衰期。 [評估4-1]放射化學純度 以薄層層析(TLC)分析RCP。TLC的條件係與實施例1中調查反應率時所使用之條件相同。 將結果示於表2。
就 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1而言，在製造結束後於室溫保存7日之情況，RCP係維持於98%以上，即便在保存14日之情況，亦未確認到RCP的明顯降低。 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗2在製造結束後於室溫保存7日以上之情況，RCP低於80%。
凝集體的比例係以尺寸排除層析(SEC)予以確認。使用Waters公司製的2695型分離模組或e2695型分離模組作為液相層析裝置，使用Waters公司製的2489型UV／Vis檢測器作為UV檢測器，在下述的條件下進行分析。將製造結束後保存14日之情況之各成分的比例示於表3。在製造結束後保存14日之情況，就 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1及 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗2而言，凝集體的比例為同程度。
[HPLC條件] 管柱：TOSOH TSKgel guard column SWXL(6mm×4cm)，TOSOH TSKgel G3000SWXL(5μm，7.8×30cm)×2根(直列) 管柱溫度：25℃附近的一定溫度 移動相：含有0.2mol／L精胺酸鹽酸鹽之0.1mol／L磷酸二氫鈉緩衝液(pH6.8) 流量：每分鐘1.0mL 面積測定範圍：30分鐘 檢測波長：280nm
本申請案係以在日本申請之日本專利特願2022-021663(申請日：2022年2月15日)為基礎，該等的內容係全部含括在本說明書中。
[圖1]示出對經由本發明之放射性複合體的一例( 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1)所得之在活體外之藥效(殺細胞效果)進行評估而得之結果之圖。在此圖中，示出經由未經標識之貝伐珠單抗所得之結果作為比較對象。 [圖2]示出對經由本發明之放射性複合體的一例( 225Ac-CCAP-貝伐珠單抗1)所得之在活體內之藥效(抗腫瘤效果)進行評估而得之結果之圖。 [圖3]示出本發明之放射性複合體的一例( 89Zr-CCAP-貝伐珠單抗1)在荷癌小鼠中之PET影像的代表例之圖。
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Claims (13)

  1. 一種複合體，其係經抗體修飾胜肽部位特異性地修飾之抗體與螯合劑之複合體， 前述抗體為抗VEGF抗體， 在前述螯合劑中螯合有放射性金屬核種。
  2. 如請求項1之複合體，其中，前述抗體修飾胜肽為下述式所示之由13～17個胺基酸殘基所構成之胺基酸序列： (式(i)中，Xa、Xb、Xc及Xd分別表示連續的a個X、連續的b個X、連續的c個X及連續的d個X， X為在側鏈不具有硫醇基及鹵乙醯基中之任何者之胺基酸殘基， a、b、c及d各自獨立地為1以上且5以下的整數，且滿足a+b+c+d≦14， Xaa 1及Xaa 3各自獨立地表示源自於在側鏈具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基或源自於在側鏈具有鹵乙醯基之胺基酸之胺基酸殘基，惟，Xaa 1及Xaa 3中之任一者為源自於具有硫醇基之胺基酸之胺基酸殘基， 藉由Xaa 1及Xaa 3連結而形成環結構， Xaa 2為離胺酸殘基、精胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸或二胺基丙酸，且Xaa 2係經交聯劑修飾)。
  3. 如請求項1之複合體，其中，前述放射性金屬核種為Ga-68、Zr-89、Y-90、In-111、Lu-177或Ac-225。
  4. 如請求項1之複合體，其中，前述抗VEGF抗體為貝伐珠單抗(bevacizumab)。
  5. 如請求項1之複合體，其中，前述胜肽及螯合劑係經由連結子(L)進行連結，該連結係藉由不包含硫脲鍵之共價鍵來進行。
  6. 如請求項1之複合體，其中，前述胜肽及螯合劑係經由連結子(L)進行連結，前述連結子(L)包含式(10a)、式(10b)或式(10c)； (式(10a)及式(10b)中，R 1A表示與前述螯合劑之連結部位，R 2A表示與前述胜肽之連結部位；式(10c)中，R 3A及R 4A中之任一者表示氫原子、甲基、苯基或吡啶基，另一者表示與前述螯合劑之連結部位，R 5A表示與前述胜肽之連結部位)。
  7. 如請求項6之複合體，其中，在與前述胜肽之連結部位及前述胜肽之間包含聚乙二醇基。
  8. 如請求項1之複合體，其中，前述螯合劑為DOTAGA(α-(2-羧基乙基)-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸)。
  9. 如請求項1之複合體，其係藉由使經在N末端導入疊氮基而得之前述胜肽部位特異性地修飾之抗VEGF抗體及下述式所示之DOTAGA-DBCO的放射性金屬錯合物進行點擊反應而予以複合化； 。
  10. 一種放射性醫藥，其含有如請求項1至9中任一項之複合體作為有效成分。
  11. 如請求項10之放射性醫藥，其係用於癌症的放射線內用療法。
  12. 如請求項10之放射性醫藥，其係用於癌症的診斷。
  13. 如請求項12之放射性醫藥，其係與使用如請求項11之放射性醫藥之癌症的放射線內用療法併用。
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