JP2003514664A - アニオン交換吸着方法およびアニオン交換体 - Google Patents
アニオン交換吸着方法およびアニオン交換体Info
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Abstract
Description
方法に関する。本方法は: i)当該液体と、リガンドと物質の間の結合をさせる条件下に(a)陽性荷電構造お
よび(b)疎水性構造を含む、複数の混合モードアニオン交換体を担持するベース
マトリックスを含むアニオン交換体を接触させる、そして ii)該物質を該マトリックスから、液体(II)の使用により脱着させる 段階を含む。
ガンドが存在する、新規アニオン交換体に関する。
上の陰性電荷を有するおよび/または陰性の正味の電荷であることを意味する。
イモードアニオン交換体リガンド」なる用語は、結合する物質と相互作用する、
少なくとも二つの、しかし、協同(co-operative)の部位を提供することができる
リガンドを意味する。この部位の一つは、リガンドと目的の物質の間の電荷−電
荷相互作用の興味深いタイプを提供する。第2の部位は、典型的に、電子アクセ
プター−ドナーおよび/または疎水性相互作用を提供する。電子ドナー−アクセ
プター相互作用は、水素結合、π−π、電荷移動、双極子−双極子、誘起双極子
等のような相互作用を含む。
リックスを利用したクロマトグラフィー手順、またバッチ式手順にも使用される
。手順の目的は、陰性電荷を担持する物質の精製であり得、この場合、標的物質
をマトリックスに結合させ、必要な場合、マトリックスからの脱着に続いて更に
精製する。他の目的は、液体からの陰性電荷を担持する望ましくない物質の除去
である。後者の場合、液体を、段階(i)でマトリックスと接触させた後に更に処
理し得る。両方の場合、そして望ましいなら、マトリックスを結合物質の脱着後
に再使用し得る。
定が関与するアッセイ手順である。
級、2級、3級または4級アンモニウム構造のような窒素構造を含んでいる。あ
る場合、リガンドは、荷電構造および脱着プロトコールの必要な修飾をされてい
る疎水性構造の両方を含むことによりデュアルまたはバイモード機能性である。 ・Simmonds et al (Biochem. J. 157 (1976) 153−159);Bur
ton et al (J. Chromatog. A 814 (1998) 71−81);およびYon
et al (Biochem. J. 151 (1975) 281−290は、飽和炭化水素基
を有するアニオン交換体リガンドを記載している。 ・Crowther et al (J. Chrom. 282 (1983) 619−628);Crowt
her et al (Chromatographia 16 (1982) 349−353);Wongyai (
Chromatographia 37(7/8) (1994) 485−490);Bischoff et
al (J. Chrom. 270 (1983) 117−126)は、芳香族成分が存在す
るアニオン交換体リガンドを担持する逆相でのオリゴヌクレオチドおよび小分子
の高速液体クロマトグラフィーを記載している。 疎水性マトリックスに基づいたアニオン交換体からの類似の効果が記載されて
いるSasaki et al (J. Biochem. 86 (1979) 1537−1548)も参
照のこと。
有結合的に結合しているマトリックスに/から親和性吸着/脱着している。参照 ・脱着緩衝液よりもpHが高く、塩濃度が低い吸着緩衝液を四お湯しているChan
g et al (J. Chem. Tech. Biotechnol. 59 (1994) 133−139)
; ・Chang et alと同様の方法でpHを変えているが、塩濃度は変えていないLee
et al (J. Chromatog. A 704 (1995) 307−314); ・脱着のためにリガンドアナログを使用しているKhamlichi et al., J. Chro
matog. 510 (1990) 123−132。吸着および脱着中のpHは同じであ
った。イオン強度の増加のみによる脱着は失敗した。 これらの3つの文献のいずれも、アニオン交換条件下での十分な脱着手順を記
載していない。
酸素と陽性荷電アミン窒素から2−3炭素距離のアミノ窒素が関与する水素に基
づく相互作用を提供する、混合モードアニオン交換体を記載する。本刊行物は、
この種のリガンドが、結合物質を溶離するのに相対的に高いイオン強度を必要と
するアニオン交換体を提供できるという発見に基づく。
離するのに相対的に高いイオン強度を必要とする混合モードリガンドが存在する
カチオン交換体を記載する。
ドを各々提供するWO9729825(US6,090,288)およびWO996
5607を、引用して本明細書に包含させる。
(ここで、Mは疎水性であり得る支持マトリックス、SP1はスペーサーおよび
Lは、置換し得る単環または二環式同種芳香族または異種芳香族部分(同種芳香
族部分は炭素環のみから成る芳香族環を含む)である)の分離媒体を記載する。置
換基は、主に酸性である。分離媒体は、イオン交換よりもむしろ疎水性相互作用
によるタンパク質、特に免疫グロブリンの吸着のために提案されている(塩濃度
2Mまで)。
on et al)は、疎水性相互作用に基づいた分離媒体を記載する。吸着および脱着
は、液体の塩濃度の各々上昇または低下により、またはpHの変化による吸着/
脱着するリガンドおよび/または物質上の電荷の変化により支持される。リガン
ドは典型的に、芳香族構造を含み得る疎水性部分を含む。リガンドのいくつかは
、加えて、またpH変化による媒体の疎水性/親水性バランスの変更を可能にす
るための荷電可能構造を含み得る。荷電可能構造は、アミン基であり得る。
炭素二重結合にチオール基を添加することにより、3−メルカプトプロピオン酸
、グルタチオン等のチオール含有リガンドを固定化することを提案する。発明者
らは、この場合、アニオン交換吸着のために得られる物質を用いておらず、使用
を示唆していない。
収剤が記載されている(リガンド+スペーサー=−CH2CHOHCH2N+H
2C6H4SO3 −)(Porat et al., J. Chromatog. 51 (1970) 47
9−489;およびOhkubo et al., J. Chromatog. A, 779 (1997),
113−122)。これらの文献は、リガンドが陽性に、取り除く物質が陰性に
荷電している分離法を記載していない。
44、Behrend et al)は、物質RHNR'Xを、担体、とりわけセルロースに結
合させるための2,4,6−トリハロ−1,3,5−トリアジンの使用を記載する。
Rは水素、アリールまたはアルキルである。R'はアルキレンまたはアリレンで
ある。Xはカルボキシ、スルホニル、ホスフェート、ホスホネート、ボロネート
等である。
オン交換体への吸着/結合を達成すること; b)減少したリガンド含量であるが、標的物質を結合する十分な能力を有すること
ができるアニオン交換媒体を提供すること; c)広いイオン強度の範囲内のアニオン交換体に吸着/結合する物質の溶出/脱着
を可能にすること; d)タンパク質の高い貫流容量、良好な回収率(しばしば、95%以上)を有するア
ニオン交換体を設計すること; e)クロマトグラフィー特性の有意な損失なく、アルカリおよびまたは酸性環境で
の再生および/または洗浄に耐えることができるアニオン交換体を設計すること
; f)低いイオン強度が必要な処理において使用する、高いイオン強度のサンプルの
大量の希釈を不必要にすること; g)単純な脱塩手順を提供すること; h)支持マトリックスに結合したとき、陰性電荷物質の吸着において慣用の対照ア
ニオン交換体と同等か優れた、アニオン交換体またはアニオン交換リガンドの選
択法を提供すること; i)例えば、生産性の改善および/または装置および投資の費用の軽減のための、
アニオン交換体が関与する単純工程を提供すること; j)1リットルより多いサンプル容量(=液体(I))がアニオン交換体に適用され、
処理される、例えば、大規模工程のための、分取適用に適したアニオン交換体を
提供すること; k)高塩濃度でのアニオン交換体吸着剤の分離原則ベースの溶出の新規組合せ例え
ば、イオン交換段階後の疎水性相互作用吸着のための機会を提供すること である。
であるという認識に基づく。これは、脱着段階で高塩濃度および高イオン強度を
利用する慣用的イオン交換体と矛盾する。
一部分この目的に合うアニオン交換体を提供し得ることを発見した。本発明者ら
は、アニオン交換リガンド中の陽性に荷電した原子の近くへの電子ドナー−アク
セプター相互作用に関係する付加的な原子または基の包含が、物質と吸着剤の間
の相互作用の強度を強め得る。
た原子の間の距離が1−7原子、好ましくは2、3、4および5原子であること
を意味する。
子がドナーとして作用し、ドナーの電子対のアクセプターとして働く電子不足原
子に結合することを意味する。Karger et al., An Introduction into Sepa
ration Science, John Wiley & Sons (1973) page 42参照。
−)のような、電子の遊離対を伴う酸素およびアミド、 (b)チオエーテル(−S−)におけるような、遊離電子対を伴う硫黄、 (c)アミン、スルホンアミドを含むアミドにおけるような、遊離電子対を伴う窒
素、シアノ、 (d)ハロ(フッ素、塩素、臭素およびヨウ素)、そして (e)sp−およびsp2−混成軌道を有する炭素 である。
ような電子不足原子または基であり、ヒドロキシおよびカルボキシ中のHO−、
アミドおよびアミン中の−NH−、チオール中のHS−等のような負に帯電した
原子への水素結合を含む。
する物質の除去法である。本方法は、上記のように段階(i)および段階(ii)を含
む。主な特徴的性質は ・スペーサーを伴うリガンドが式: −−SP−−−[Ar−R1−N+(R2R3R4)] を有する ・段階(ii)における脱着が、R1が−C(=NH)−であり、物質がセリンプロテ
アーゼである場合、アニオン交換条件下で行なわれる。他の物質の脱着に関して
は、下記表題「脱着」参照。
ゲンの寄与による分子量以外に、<1000、例えば、<7000ダルトンの分
子量を有する。
することを示す。 ・−−はベースマトリックスへの結合を示す。
より置換され、下記R2−4に関して記載するような炭素鎖を有するC1−10 、例えば、C1−6の飽和炭化水素基を意味する。下記参照。
未満、例えば、10.5未満のpKa値を有する。これは、典型的にリガンドが1
級、2級または3級アンモニウム基であることを意味する。pKaの測定に関して
は、下記「吸着」の欄参照。
ある場合、n=0である場合が好ましい; ・Lはアミノ窒素、エーテル酸素またはチオエーテル硫黄である; ・R'1は 1)直鎖、分枝鎖または環状炭化水素基; 2)−C(=NH)− から選択される2価リンカー基; c)R2、R3およびR4は水素および低級アルキルから選択される。
ける原子または基から脱局在化し得る。―C(=NH)−(m=1)のR'1に関して
、R2−4の1個、2個または3個が好ましくは水素である。
たはナフチル構造、および縮合環または2環式構造を含む他の芳香族環系を含み
得る。芳香族環は、ヘテロ環であり得、すなわち、1個以上の窒素、酸素または
硫黄原子を含む。環は、R1および可能性のあるスペーサーに加えて、更なる置
換基を有し得る。これらの他の置換基は、例えば、水素結合を可能にする、電子
ドナーまたはアクセプター原子または基を含み得る。
ミダゾリル(benzimadazolyl)、メチルチオキシフェニル(2−、3−および4−)
、3−インドリル、2−ヒドロキシ−5−ニトロフェニル、アミノフェニル(2
−、3−および4−)、4−(2−アミノエチル)フェニル、3,4−ジヒドロキシ
フェニル、4−ニトロフェニル、3−トリフルオロメチルフェニル、4−イミダ
ゾリル、4−アミノピリジン、6−アミノピリミジル、2−チエニル、2,4,5
−トリアミノフェニル、4−アミノトリアジニル−、4−スルホンアミドフェニ
ル等である。
い2価炭化水素基において、典型的に1個以上の原子または基が、水素結合また
は上記で定義のような他の電子アクセプター−ドナー相互作用に関与する。した
がって、炭化水素基の形のR'1は a)1個以上の水素が低級アルキルで置換され得る1個以上の1級アンモニウム基
(−N+H3) b)水素が低級アルキルで置換され得る1個以上のヒドロキシ(−OH)、 で置換され得、および/または 炭化水素基の炭素鎖が1個以上の位置をチオエーテル硫黄、エーテル酸素または
アミン窒素で中断され得る。
、−CH2CH(CH3)−、−CH2OCH2−、−C(=O)−、−C(=NH)
−、−CH2N+(C2H5)2CH2CH2−、−CH2CH2(OCH2CH
2−)n'(ここで、n'は1より大きい整数、例えば、<100、例えば、<25
または<10)等である。n=m=1である場合、R'1は好ましくは(a)−CH2 −、(b)その炭素原子の1個または2個をヒドロキシおよび/またはヒドロキシ
低級アルキルまたは低級アルキル(例えば、各々ヒドロキシメチルまたはメチル)
で置換されていてもよい−CH2CH2−、(c)−(CH2)n"SCH2)n'''(
ここで、n"およびn'"は各々独立して1−3の整数、例えば、1および2であ
る)、および(d)−CH2N+(C2H5)2CH2CH2−、(e)−CH2CH2(
OCH2CH2−)n'(ここで、n'は1、2または3)からのような2価炭化水
素基である。
ある。したがって、アニオン交換体リガンドは好ましくは1級または2級アミン
/アンモニウム基である。
R2−4の水素は、1個以上の位置を−OR"1および/または−N+(R'2R' 3 R'4)(ここで、R'2−4およびR"1は水素または低級アルキルである)で置
換され得る。加えて、R2−4の炭素鎖は、1個以上の位置をチオエーテル硫黄
、エーテル酸素またはアミン窒素で中断され得る。
するか、残りのR2、R3およびR4の一つを置換することにより、5または6
員環を形成する2価アルキレンであり得る。
−3炭素原子を有する低級アルキル基から選択される。 R2−4、R'1−4およびR"1基の変形において、各sp3−混成軌道を有す
る炭素は、アミノ窒素、チオエーテル硫黄およびエーテルおよびヒドロキシ酸素
から選択される最大1個の原子を担持する。
R3R4)をArに接続する原子の鎖まで、R1の水素を置換することにより、ま
たは(c)Arの芳香族環までAr中の水素を置換することにより伸びる。SPは常
にリガンド[Ar−R1−N+(R2R3R4)]の水素を置換する。したがって、
スペーサーがリガンドの窒素または硫黄原子に直接結合する場合、置換基R2− 5 は水素である。
直鎖、分枝鎖、環状、飽和、不飽和および芳香族炭化水素(例えば、1−20、
例えば、1−10炭素原子まで)を含み得る。R1−4に関して上記のように、
炭化水素基はヒドロキシ基、アルコキシおよびアリールオキシおよび対応するチ
オアナログ、および/またはアミノ基を担持し得る。炭素鎖は、1個以上の位置
でアミノ窒素、エーテル酸素、チオエーテル硫黄により、R1−5に関して上記
のように中断され得る。アミドおよびケトンにおけるようなカルボニル基、およ
び加水分解に対して同等な安定性を有する他の基でもあり得る。酸素、硫黄およ
び窒素から選択される多くても一つの基は、一つのそして同じsp3−混成軌道を
有する炭素に結合する。
ン交換体への結合を促進する1個以上の電子ドナーまたはアクセプター原子また
は基を提供し得る。これらの原子または基は、(a)ベースマトリックスからリガ
ンドまで伸びるスペーサーにおける原子の鎖の一部またはそれに直接結合し得る
、または(b)この鎖に結合する分枝基の一部であり得る。本明細書における分枝
基は ・前段落に記載の原子の鎖に直接結合する、そして ・水素結合のような電子ドナーアクセプター相互作用に関与する原子または基を
含む 基である。
の部分は: ・炭素、好ましくはカルボニル炭素またはsp3−混成軌道を有する炭素;または ・窒素、好ましくはアミノまたはアミド窒素;または ・硫黄、好ましくはチオエーテル硫黄;または ・酸素、好ましくはエーテル酸素 であるが、但し、SPは(b)−(d)に関して、[Ar−R1−N+(R2R3R4)]
における炭素に結合する。
H2−、−CH2CH2−、−CH2CH2CH2−、−CH2CH(CH3)−
、−C(CH3)2−、−C(CH2CH3)2−、−C(OCH3)2−、−CH2 OCH2−、−CH2SCH2−、−CH2NHCH2−、−CH2O−、−C
H2CH2O−、−CH2S−、−CH2CH2S−、−CH2NH−、−CO
NH−、−CONH(CH2)2SCH2−、−NHCH2CH2CH2CH2C
H2CONH−、−CH2CH2NH−、−CH2CH(OH)CH2OCH2C
H(OH)CH2O−である(Ar−R1−N+(R2R3R4)に結合する正確な原
子価)。スペーサーの残りの部分は、伝統的イオン交換体と同じ種であり得る。
入し得る。説明的結合化学は、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、アリ
ル−グリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなビスエ
ポキシド、ジクロロプロパノールのようなハロゲン置換脂肪族物質、ジビニルス
ルホン、カルボニルジイミダゾール、グルタル酸ジアルデヒドのようなアルデヒ
ド、キノン、シアノーゲンブロミド、メタ過ヨウ素酸ナトリウムのような過ヨウ
素酸塩、カルボジイミド、クロロトリアジン、トシルクロライドおよびトレシル
クロライドのようなスルホニルクロライド、N−ヒドロキシサクシンイミド、オ
キサゾロン、マレイミド、2−フルオロ−1−メチルピリジニウムトルエン−4
−スルホネート、ピリジルジスルフィドおよびヒドラジドを含む。
は水に不溶性であり、多かれ少なかれ水中で膨張性である。親水性になるように
誘導体化されている疎水性ポリマーはこの定義に含まれる。適当なポリマーは、
例えば、アガロース、デキストラン、セルロース、澱粉、プルラン等のようなポ
リサッカライドをベースにしたポリヒドロキシポリマーであり、ポリアクリル酸
アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ(ヒドロキシアルキルビニルエーテル)、
ポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)、およびポリメタクリレート(例えば、
ポリグリシジルメタクリレート)、ポリビニルアルコールのような完全な合成ポ
リマー、スチレンおよびジビニルベンゼンをベースにしたポリマー、2個以上の
モノマーが上記ポリマーに対応するコポリマーを含む。水に可溶性のポリマーは
、例えば、架橋により、および不溶性体に吸着または共有結合的結合を介して結
合することにより、不溶性となるように誘導体化し得る。親水性基を、疎水性ポ
リマーに(例えば、モノビニルおよびジビニルベンゼンのコポリマー上に)、OH
に変換できる基を示すモノマーの重合化により、または最終ポリマーの親水性化
により、例えば、親水性ポリマーのような適当な化合物の吸着により、導入でき
る。
、グラファイト、酸化タンタル等である。 好ましいマトリックスは、シラン、エステル、アミド基のような加水分解に対
して不安定な基およびシリカ自体に存在する基を欠く。これは、使用する液体と
直接接触する基に関して特に当てはまる。
する物質が完全に一部透過性であるか(多孔性)、または非透過性である(無孔性)
、すなわち、マトリックスが除去する物質に対して0.40−0.95の間のKav
を有すべきであることを意味する。これは、例えば、エクステンダーを有するあ
るマトリックスに関して、Kavがより低い、例えば、0.10まで低いまたはよ
り低いことがあり得ることを排除しない。例えば、WO9833572(Amersh
am Pharmacia Biotech AB)参照。
好ましくは高性能適用に関しては5−50μmの、分取目的では50−300μm
の範囲のサイズの不規則なまたは球状粒子の形であり得る。
種のマトリックスは、流動床または膨張床クロマトグラフィーでの、ならびに異
なるバッチ式手順、例えば、撹拌タンクでの大規模操作に特に適用可能である。
流動および膨張床手順は、WO9218237(Amersham Pharmacia Biotech
AB)およびWO9200799(Kem−En−Tek)に記載されている。
がマトリックスを通過できる点で親水性であることを意味する。典型的に、親水
性ベースマトリックスの接近可能な表面は、例えば酸素および/または窒素原子
を含む複数の極性基を曝す。このような極性基の例は、ヒドロキシル、アミノ、
カルボキシ、エステル、低級アルキルのエーテル(例えば、(−CH2CH2O−
)nH(ここで、nは整数である))である。
通常、0.001−4mmol/mlマトリックス、例えば、0.002−0.5mmol/m
lマトリックスの間から通常選択され、0.005−0.3mmol/mlマトリックス
が好ましい。可能性のあるそして好ましい範囲は、とりわけ、マトリックス、リ
ガンド、除去する物質物質の種により決定される。したがって、アニオン交換リ
ガンドのレベルは、通常、アガロースベースのマトリックスに対して0.01−
0.3の範囲であり、0.01−0.1mmol/mlが好ましい。デキストランベース
のマトリックスに関して、範囲は典型的には0.01−0.6mmol/mlマトリック
スであり、サブレンジは0.01−0.2mmol/mlである。ある変形において、例
えば、R1が−C(=NH)−である場合、混合モードリガンドのレベルは、しば
しば、この範囲の下半分である。本発明のこれらの変形において、アニオン交換
リガンドのレベルは、したがって、0.150mmol/mlマトリックスより小さく
および/または1mmol/gマトリックス乾燥重量より小さい。「mmol/mlマトリ
ックス」なる表現は、水で飽和された完全に沈降したマトリックスに関する。容
量範囲は、結合塩素イオンに結合するために完全にプロトン化された形のマトリ
ックスの容量に関する。これは、また、基−−−[Ar−R1−N+(R2R3R
4)]以外の、例えば、スペーサー、または基R2−4、R'1−4およびR"1の
可能性のある陽性荷電基に由来する寄与も含む。
工程で通常適用される条件に耐えるべきである。一般的な原則として、これは、
本発明のアニオン交換体が0.1または1M NaOH水溶液に少なくとも10時
間、全イオン結合能に本質的な減少なく耐えることができなければならないこと
を意味する。「全イオン結合能に本質的な減少なく」なる用語は、全イオン結合
能が最大で10%減少することを意図する。構造的な態様から、これは、好まし
い変形のアニオン交換リガンドが、純粋炭化水素基(同種芳香族および異種芳香
族構造を含む)、チオエーテルおよびエーテル基、ジスルフィド基、ヒドロキシ
基、スルホキシド基またはスルホン基、カルボキサミド基、スルホンアミド基、
アセタールおよびケタール基、および類似の加水分解安定性の基から選択される
構造のみを含むべきであることを意味する。
ン強度で特定の物質を吸着するアニオン交換体から選択する。使用するアニオン
交換体(1)は、したがって: (a)0.25M NaClに対応するイオン強度の水性対照液体(II)中の目的物質を
結合することができ、そして (b)該物質について、2−12の範囲のpHで、慣用のアニオン交換体(2)(対照
アニオン交換体)についての物質の貫流容量の>200%、例えば>300%ま
たは>500%または>1000%の最大貫流容量を可能でする ことができる。
対照液体は、典型的に緩衝化水性液体から成る。
に関して、慣用のアニオン交換体(対照アニオン交換体)上の同じ物質で必要な溶
出イオン強度と比較して、増加した最大溶出イオン強度を有するアニオン交換体
のスクリーニングである。したがって、アニオン交換体は、除去される選択物質
に適用する特定条件で、慣用のアニオン交換体で必要な溶出イオン強度の125
%以上、例えば、140%以上または200%以上の溶出イオン強度であるもの
から選択し得る。WO9729825(Amersham Pharmacia Biotech AB)参
照。
すなわち、本質的に同じ支持マトリックス(支持物質、ビーズサイズ、孔サイズ
、孔容量、充填法等)、pH、温度、溶媒組成、上記の式を有する荷電リガンドの
数等で行なう測定を参照とする。貫流容量は、同じ貫流における物質の同じ相対
的濃度で測定する(例えば、c/c0=10、c/c0に関して実験部分参照)。スペ
ーサーおよび結合化学は異なり得る。ある種の結合化学が、支持マトリックスの
架橋を導き、より剛直なマトリックスをもたらし得る。この場合、比較を成す流
動条件は、マトリックスが本質的に非圧縮であるレベルを選択する。
se Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を、本
明細書の内容において選択した。このアニオン交換体は、リガンドおよびスペー
サーアーム構造が: −O−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+(CH3)3 である、強アニオン交換体である。その塩素イオンキャパシティーは0.18−
0.25mmol/mlゲルである。ベースマトリックスは、ビーズ形のエピクロロヒ
ドリン架橋アガロースである。ビーズは45−165μmの範囲の直径を有する
。球状タンパク質の排除限界は4×106である。
R'1−N+H3=−C(=N+H2)NH2、およびAr=p−C6H4−を有す
るとみなされた。式−C(=N+H2)NH2は、実際の電荷が−N−C−N−配
置上に非局在化し、水素がそれにしたがって結合している基の代表のみである。
SPはArにアミド基の窒素原子を介して結合した。スペーサーおよびベースマ
トリックスの最良モードの情報に関しては更に実験部分参照。 優先権主張年の間に、支持体は多くの種々のリガンドに広がっている。最良モ
ードは目的の物質によって変化し、今日までに発見された最良のリガンドを示す
実験部分から明白である。
してのアニオン交換マトリックスでのクロマトグラフィー手順として行ない得る
。粒子状マトリックスに関して、これらの段階は、粒子が多かれ少なかれ液体中
に完全に分散されているバッチ式モードで行ない得る(例えば、流動/膨張床で)
。 段階(i)および(ii)で使用する液体は水性、すなわち、水混和性溶媒と混合さ
れていてもよい、水である。
交換体と、好ましくはアニオン交換による、吸着(結合)を可能にする条件下で接
触させる。言い替えると、物質は少なくとも一部陰性であり、リガンドは少なく
とも一部陽性である。
体が陽性に荷電している(=アニオン交換体条件)ことを意図する。水性液体に存
在する両性物質に関して、これは、pH>pl−0.5、好ましくは、pH>plを意
味する。
級または2級アミン基として存在する)を、<pKa+2、好ましくは<pKa+1
の範囲内に緩衝化する。下限は、少なくともpH=1または2まで低下でき、主
に酸性環境でのアニオン交換体の安定性および等電点(pl)、および除去する物質
の安定性により決定される。アニオン交換体のpKa値は、50%のその滴定可能
基が中和されているpHとして取る。
する物質、温度とpH、溶媒組成等の特定の組合せに関する溶出イオン強度より
低い。本発明の利点の一つは、上記で定義の混合モードアニオン交換体の使用に
より、吸着/結合がまた、慣用のイオン交換体(対照イオン交換体)で通常行なわ
れるよりも、上昇したイオン強度でも行なうことが可能であることである。アニ
オン交換体を除去する物質と適合させることにより。吸着は対照イオン交換体を
使用するときよりも高いイオン強度で行ない得る(同じpHおよびそうでなければ
同じ条件下で測定して)。使用するアニオン交換体に依存して、イオン強度は上
記で定義の対照アニオン交換体よりも25%以上高い、例えば、40%以上高い
可能性がある。アニオン交換体と除去する物質のある組合せは、上記の対応する
対照イオン交換体を使用したときよりも、100%より高いイオン強度での吸着
を可能にし得る。
m以上または以下のイオン強度で行ない得ることを意味する。イオン強度は30m
S/cmを超え、ある場合、40mS/cmをさえ超える。有用なイオン強度は、し
ばしばNaCl濃度(純水)>0.1M、例えば、>0.3M、または>0.5Mさえ
対応する。使用する導電率/イオン強度は、使用するリガンド、そのマトリック
ス上での密度、結合する物質、その濃度等に依存する。
れる貫流容量の200%以上、例えば300%以上または500%以上または1
000%以上の最大貫流容量が達成され得る(前記と同じ条件)。
程は少なくとも以下の手順の一つを含む: (A)塩濃度(イオン強度)の増加、 (B)リガンド上の陽性荷電を減少させるためのpHの上昇、 (C)陰性荷電の減少またはマトリックスに結合した物質上の電荷を逆転させるた
めのpHの低下、 (D)水性液体(I)の極性を減少させるためのリガンドアナログまたは試薬(例え
ば溶媒)の添加。 本発明に従い、R'1が−C(=NH)−である場合、セリンプロテアーゼが、
アニオン交換条件下で唯一脱着する。
な選択は (a)脱着する物質、 (b)アニオン交換体(リガンド、マトリックスの種類、スペーサーおよびリガンド
密度)、および (c)水性液体IIの種々の可変要素(組成、極性、温度、pH等) の特定の組合せに依存する。
がって、温度、pH、極性、イオン強度、可溶性リガンドアナログの含量等のよ
うな少なくとも一つの可変要素が異なるが、脱着が起こり得るように、他の条件
は未変化であることを意味するであろう。
少、上昇または一定のイオン強度を含む。
マトリックスはカラムまたは他の適当な容器中に、吸着液体(水性液体I)と接触
して存在する。液体により提供される条件を次いで上記のように所望の物質がマ
トリックスから溶出されるまで変える。吸着後、典型的な脱着工程は、イオン強
度以外の他の可変要素が変化しない場合、イオン強度が吸着中と比較して上昇し
、多くの場合、少なくとも0.4M NaCl、例えば、0.6M NaClに対応す
ることを意味する。実際の値は上記の種々の因子に依存する。
れる条件にあまり厳密に依存しない可能性がある。下記参照。 条件における変化は、1個以上の段階で(段階的勾配)または連続的に(連続的
勾配)達成できる。マトリックスと接触している液体の種々の可変要素は、一個
ずつまたは組み合わせて変え得る。 イオン強度を変えるために使用する典型的な塩は、アルカリ金属またはアンモ
ニウムイオンの塩化物、リン酸塩、硫酸塩等から選択される。
ンドに結合できない酸−塩基対、すなわち、ピペラジン、1,3−ジアミノプロ
パン、エタノールアミン等から選択する。段階(ii)におけるpHの低下は脱着す
る物質の陰性荷電を減少し、脱着を助け、したがって、マトリックスからの放出
に必要なイオン強度も減少する。使用するリガンドのpKaおよび放出する物質の
plに依存して、pHの上昇は物質の放出またはイオン交換マトリックスへのその
結合の増強をもたらし得る。
助けられ得る。これは、水混和性および/または低親水性有機溶媒の液体IIへの
包含により達成し得る。このような溶媒の例はアセトン、メタノール、エタノー
ル、プロパノール、ブタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド
、アクリロニトリル等である。水性液体IIの極性の減少(水性液体Iと比較して)
は、脱着を助け、したがって、またマトリックスからの物質の放出に必要なイオ
ン強度を減少するようである。
り助けられ得る。液体(II)におけるその濃度は、液体(I)におけるその濃度より
も大きくなければならない。「リガンドの構造類似体」または「リガンドアナロ
グ」は、リガンドと構造的類似性を有し、可溶性形でマトリックスに結合したリ
ガンドと除去する物質の間の結合を阻害する物質である。
える、例えば、80%を超える、または90%を超える回収を可能にする。回収
率は、吸着/脱着段階におけるアニオン交換体に適用した物質と比較した脱着物
質の量である。多くの場合、回収率は95%をさえ超え得、または本質的に定量
的である。典型的に、アニオン交換体に適用する物質の量は、その物質に対する
アニオン交換体の全結合能の10−80%、例えば、20−60%の間である。
の精製のために行なう。
構造単位を有する分子量が大きい物質を第一に意図している。適当な物質は、典
型的に、約1000ダルトン以上のおよび/または生物有機のおよび/または重
合体の分子量を有する。分子あたりの正味の陰性に荷電した基の数は、典型的に
1個以上である。好ましくは、物質の電荷はpHに依存する(すなわち、該物質は
両性化合物である)。生体分子の中で、ポリペプチド構造、核酸構造、脂質構造
、および炭水化物構造を有するものを本発明にしたがって液体から除去すること
は、一般的に可能である(ただし、それらが負電荷を有するか、または有するよ
うに提供できる場合)。原則として、本発明は、また、他の生体分子および有機
物質に適用可能である(ただし、それらが上で与えられた構造的な要求を満たす
場合)。
、例えばコロイドの大きさの形態であり得る。生体粒子の例証となる例はウイル
ス、細胞(細菌および他の単細胞生物体を含む)ならびに細胞塊および細胞オルガ
ネラを含む細胞内器官である。
性液体に適用可能であると考えられる。新規アニオン交換体は、例えば、最初に
pHを変え、吸着した物質の陽性電荷を減少させることで高いイオン強度での吸
着および低いイオン強度での脱着を可能にすることにより、脱塩において極めて
有用であるように見える。
の発酵ブロス/液、およびそれに由来する液である。該細胞は脊椎動物、例えば
哺乳動物、または無脊椎動物(例えばチョウおよび/またはその幼虫由来の細胞
のような培養昆虫細胞)、または微生物(例えば培養真菌、細菌、酵母等)から生
じ得る。また、植物細胞および他の種類の生細胞(好ましくは培養されたもの)も
含まれる。
ワードフローと共に新規アニオン交換リガンドを担持する流動化粒子状支持マト
リックスを利用することは有益であり得る。この種の水性液体(I)は、(a)細胞
の培養からの発酵ブロス/液、(b)溶解した細胞を含む液体、(c)細胞および/ま
たは組織ホモジネートを含む液体、ならびに(d)細胞から得られるペースト由来
であり得る。
ンドを含むアニオン交換体(1)が含まれる。スペーサーが結合したリガンドは、
式 −−SP−−−[Ar−R1−N+(R2R3R4)] (ここで、記号は前と同じ意味を有する。) に従う。 独特の特徴は、アニオン交換体(1)が少なくとも1つの対照タンパク質:Q−
交換体(−CH2CH(OH)CH2N+(CH3)3(アニオン交換体2))で得られ
た対応する最大貫流容量の200%以上、例えば300%以上または500%以
上または1000%以上である卵白アルブミン、コンアルブミン、ウシ血清アル
ブミン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、リゾチーム、IgG、
ダイズトリプシンインヒビター(STI)に関して、2−12のpH範囲のいずれ
かにおいて最大貫流容量を有することである。同一の支持マトリックス、置換度
、対イオン等は、上で議論したのと同一の意味で、本質的に同一である。好まし
い対照アニオン交換体は、上記のようにQ Sepharose Fast Flowである。ア
ニオン交換体(1)およびアニオン交換体(2)の貫流容量を測定するための稼動条
件(running condition)は、本明細書の他の部分で議論したのと本質的に同一で
ある。
る標題の箇所で定義したアニオン交換条件下で測定される。それぞれの対照物質
の相対的な貫流容量は、典型的な場合において、貫流容量が測定されるべき緩衝
液および対象物質からなる水性液体を用いて別々に測定される。
好適な変形に関して、SP、R'1およびR2−4の少なくとも1つは、本発明
の第1の態様のために上で定義したような、例えば、水素結合に関与する、電子
アクセプター−ドナー原子または基を含む。このような電子ドナー−アクセプタ
ー基または原子は、例えば、スペーサー(SP)における分枝側鎖に存在し得る。
性の試験(スクリーニング)の方法である。本方法は: (a) (i)各々がリガンドの種類(リガンド1、2、3、4、......n)の点で異
なる、試験する1個以上のアニオン交換体(試験アニオン交換体、交換体1、2
、3、4、......n;n=整数>0)、そして (ii)対照リガンドを有する対照アニオン交換体であり、支持マトリックス、対イ
オン等は、交換体1、2、3、4、......nと対照アニオン交換体で同一
であるもの; を含むライブラリーの提供 (b)予め決定した条件での物質に対する交換体1のpH2−12間のどこかでの最
大貫流容量の測定; (c)段階(b)のような、同じ条件での対照アニオン交換体のpH2−12間での最
大貫流容量の測定; (d)アニオン交換体(1)が物質の除去に適している場合、段階(b)と(c)において
得られた最大貫流容量の間の関係を用いた結論付け:そして (e)必要であれば、段階(b)−(c)の、交換体2、3、4、......nの少な
くとも一つでの反復: の段階を含む。
合、段階(d)を行なうときにこれを考慮しなければならない。これは、置換度の
変化が、アニオン交換体1、2..nに関して3、5または10倍より大きい場
合に特に適用される。
ン交換体/リガンドよりも大きい場合、試験アニオン交換体/リガンドが対照ア
ニオン/交換体を超える利点を有すると考えられる。この結論は、試験アニオン
交換体/リガンドで測定した最大貫流容量が、対照アニオン交換体/リガンドの
貫流容量の>200%、例えば>300%または>500%、または>1000
%である場合により明白である。
よび (c)本願と平行して、SE9904197−2に基づいて出願されている国際特
許出願(陰イオン交換吸着方法およびチオエーテル陰イオン交換体)において、 定義されている通りである、ライブラリーのスクリーニングに特に適している。
およびピリジン、ピロール、イミダゾール等のような陽性荷電窒素原子が芳香族
環の一部である、アニオン交換体を含む場合にも当てはまる。
る。 対照アニオン交換体は本発明の第一および/または第二の態様で定義したリガ
ンドを有し得る。
二の態様で概説のように行なうことができる。段階(b)および/または(c)は、0
.1M NaCl以上、好ましくは>0.25M NaClから成る水溶液のイオン強
度に対応するイオン強度で行ない得る。段階(b)および(c)はアニオン交換体条件
下で行ない得、または行ない得ない。
した貫流容量を使用し得る。したがって、本方法はまた、対照アニオン交換体ま
たは対照アニオン交換リガンドに関して外部由来の表にした値の使用を含む、異
なる時期におよび/または異なる個人または機械により行なった測定値も含む。
ような液体からの物質の除去に関する本発明の方法に、進歩性のある方法で使用
できる。
含む液体(I)からの塩の除去(脱塩)の方法を意図する。今後、液体の脱塩なる用
語は液体からの荷電物質の除去により減少する任意の種のイオン強度を包含する
。液体(I)のイオン強度により達成される最大の利点は、0.1M NaClまた
は0.15 NaClまたは0.2M NaClまたは0.5M NaClの水性液体の
イオン濃度を超える。
る、複数の混合モードアニオン交換リガンドを担持するベースマトリックスを含
む、アニオン交換体(1)と液体(I)を接触させる段階;および ii)液体(液体(II))の使用によって、当該物質を当該アニオン交換体から脱着さ
せる 段階を含む。
することができる;および (b)該物質について、2−12の範囲のpHで、Q−Sepharose Fast Flow(ア
ニオン交換体2、Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)につい
ての物質の貫流容量の>100%、例えば、>125%、または>200%、、
または>300%または>500%または>1000%の最大貫流容量が可能で
あり、 当該アニオン交換体(1)と(2)が本質的に同じリガンド密度を有し、貫流容量
が同一条件下で決定される。 B.アニオン交換体の低い正味の陽性荷電または低い正味の陰性、0または正味
の陰性電荷(可能な場合)、および/または、物質の低い正味の陰性、0または正
味の陽性荷電を意味し、それにより、必要な場合、液体(I)と比較して低下した
イオン強度および/または低下した極性を組み合わせることにより、および/ま
たは、中性構造類似体を包含させることにより、緩衝化酸−塩基対の使用により
段階(iii)における液体(II)のpHを調節する。 により特徴付けられる。
ミジニウム基であり得る。芳香族環に窒素原子が存在するヘテロ芳香族は、3級
アンモニウムなる用語に含まれる。同じ形式で、このようなヘテロ芳香族基のN
−アルキル化形は4級アンモニウム基に含まれる。リガンドのpKaは、4から上
の間に見られる。
許出願(陰イオン交換吸着方法およびチオエーテル陰イオン交換体)に、および (c)US6,090,288(Amersham Pharmacia Biotech AB)に 記載の混合モード種であり得る。 US6,090,288はWO−A−9729825(Amersham Pharmacia B
iotech)に対応し、(b)の特許出願と共に、引用して本明細書に包含させる。US
6,090,288は、酸素および陽性荷電アミン窒素から2−3炭素距離のアミ
ノ窒素が関与する電荷相互作用および水素結合に基づいた物質の促進された結合
を有する混合モードアニオン交換体を記載する。(b)のアニオン交換体は、本発
明でまた定義するように、陽性荷電原子の近くにチオエーテル官能基が存在する
リガンドを有する。
比較して、有意に低下したイオン強度を必要とすることを意味する。物質は、し
たがって、低濃度の塩、例えば、<100mM、または<10mMの溶液中でさえ
、濃縮形で溶出できる。典型的に、段階(ii)における適当なpHは、脱着する所
望の物質のpl+2またはpl+1、好ましくはpH<plであろう。関与する特定の
リガンドに依存して、使用するリガンド/アニオン交換体のpH<pKaを調節す
ることが好ましいことがあり得る。
非電荷である緩衝化酸−塩基対の使用により調節し得る。これは、緩衝成分が単
純に段階(ii)の後に除去できることを意味する。揮発性緩衝成分は、典型的に2
5℃で、>1mmHg、例えば、>10mmHgの飽和蒸気圧を有する。緩衝成分の選
択に関する一般的な規則は上記の通りである。
>10mmHg、例えば、>10mmHgの揮発性溶媒の液体(II)への包含により支持
され得る。構造的類似体は、中性でなければならず、好ましくは溶媒に関して定
義のように揮発性である。
合、陽性に荷電した部分および陰性に荷電した部分を形成する化合物を意味する
。各院生に荷電した部分は、分子当たり少ない数、例えば、1個、2個または3
個のの陰性に荷電した部分を担持し、好ましくは非重合体である。この態様の原
則をカチオン交換体での脱塩に適応する場合、塩におけるカチオンでの要求は、
アニオン交換体を使用する場合のアニオンに対応する。
塩できない上記の物質を含む液体、または、低い塩濃度または塩の非存在下を必
要とする工程、例えば、親和性吸着、マススペクトル等で取り扱う液体に特に有
用である。したがって、所望の物質を含む溶液を、ある種の分析を物質それ自体
に行なう前に、本発明にしたがって脱塩することが有利である。
チオン交換体は、2000年7月17日に出願のSE0002688−0(吸着
法およびリガンド)、WO996507(Amersham Pharmacia Biotech AB)
等に定義のものであり得る。
において定義される。
。グラムで与えられるマトリックスの重量は、吸引乾燥重量(suction dried wei
ght)を意味する。これらのマトリックスはまだ水で溶媒和された物質であると理
解される。規模が大きい反応に関して、マグネット・バー・スターラーの使用は
ビーズを傷つけるので、撹拌は懸垂型(suspended)の、モーター駆動スターラー
の使用を意味する。小規模の反応(20mlまで)は振動テーブル上で、密閉バイア
ル内で行われた。機能性およびアリル化、エポキシ化の程度、またはビーズ上の
イオン交換基の置換度の決定を通常の方法を用いて行った。ゲルの初歩的な分析
は、また、とりわけ硫黄含有量を分析するために行われた。
としてSepharose 6 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala
, Sweden)を用いて下記のように例示される。
たが、固体支持体上へのアリル基の導入は、臭化アリルを用いても同様に容易に
達成され得ることに注意せよ。80gのSepharose 6 Fast Flowを0.5gのN
aBH4、13gのNa2SO4および40mlの50%NaOH水溶液と混合した。
混合液を50℃で1時間撹拌した。100mlのアリルグリシジルエーテルの添加
後、懸濁液の温度を50℃に維持し、18時間撹拌した。混合液をろ過し、ゲル
を500mlの蒸留水、500mlのエタノール、200mlの蒸留水、200mlの0
.2M酢酸および500mlの蒸留水で連続的に洗浄した。
ゲル(100mlのゲルから75mlのゲル)から出発することにより0.45mmolの
ゲル置換度(アリル/ml)を得ることが可能であった。
オール含有誘導体における硫黄原子を介して直接的にマトリックス上に導入され
る。例えば、フェノールのような他の反応性のある求核性基を含む誘導体も同様
に使用し得る。マトリックスへのカップリングをアリル基のブロモ化および塩基
性条件下での求核置換を介して好ましく実施した。いくつかの場合において、そ
してチオール含有誘導体に関して、該アリルへのラジカル付加も同様に行った。
ゲルへの結合部位がアミン以外の求核性基を介して達成された場合、アミン基は
保護された形態として導入され得、その場合には脱保護の段階が必要となる。
る。
脱水済ゲル)の撹拌懸濁液に永続的な黄色が得られるまで臭素を加え、次いで、
4gのAcONaおよび100mlの蒸留水を加えた。次いで、ギ酸ナトリウム(sodi
um formiate)を懸濁液が完全に脱色されるまで加えた。反応混合液をろ過し、ゲ
ルを500mlの蒸留水で洗浄した。次いで活性化されたゲルの適当なアリコート
を反応容器に移し、下記の手順に従って適当なリガンドとカップリングさせた。
OH水溶液を加えることによりpH11.5に調節した、オクトパミン(2g)の水(
4ml)溶液を含む反応溶液に移した。反応液を50℃で17時間撹拌した。懸濁
液をろ過し、ゲルを3×10mlの蒸留水、3×10mlのEtOH、3×10mlの
0.5M塩酸および最後に3×10mlの蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの置換
度は、0.10mmolアミン基/mlであった。
ose 6 Fast Flowへのカップリング 6gの臭素活性化ゲル(0.4mmolアリル基/ml脱水済ゲル)を、50%のNaO
H水溶液を加えることによりpH11.5に調節した、2−アミノ―4−(トリフ
ルオロメチル)−ベンゼンチオール(2.5g)の水/DMF(2:1、4ml)溶液を
含む反応溶液に移した。反応液を60℃で18時間撹拌した。懸濁液をろ過し、
ゲルを3×10mlの蒸留水、3×10mlのEtOH、3×10mlの0.5M塩酸お
よび最後に3×10mlで連続的に洗浄した。ゲルの置換度は、0.07mmolアミ
ン基/mlであった。
カップリング 30gの量の臭素活性化ゲル(0.4mmolアリル基/ml脱水済ゲル)を2−(Boc
−アミノ)―エタンチオール−I(7.35g)の水/DMSO(1:3、40ml)溶
液を含む反応溶液に移した。1M NaOHでpHをpH11に調節した。反応液
を50℃で16時間撹拌した。反応混合液をろ過後、ゲルを3×50mlの蒸留水
、3×50mlのDMSO、3×50mlの蒸留水および最後に3×50mlのEtO
Hで連続的に洗浄した。
ンのカップリング Boc保護アミノエタンチオールゲル(6ml)(2.1.c.由来)をCH2Cl2(60
ml)中の10%トリフルオロ酢酸溶液で、室温で2時間処理した。懸濁液をろ過
し、ゲルを3×10mlのCH2Cl2、3×10mlのEtOH、および3×10ml
の蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの置換度は0.29mmolアミン基/mlであっ
た。
リル活性化Sepharose 6 Fast Flow(0.4mmolアリル基/ml脱水済みゲル)の
スラリーに加えた。反応混合液をUV照射し、40℃で16時間撹拌した。反応
混合液をろ過し、ゲルを3×10mlのMeOH、3×10mlの蒸留水、3×10m
lの0.5M塩酸および最後に3×10mlの蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの置
換度は0.34mmolアミン基/mlであった。
4g、1.2mmol)のDMF(2ml)溶液をDMF(5ml)中のシステアミンSepharos
e(4ml、0.2mmolアミン基/mlゲル)およびN,N−ジイソプロピルエチルアミ
ン(1mmol)の混合液に加えた。反応を室温で18時間継続した。反応混合物をろ
過し、ゲルを3×10mlのDMF、3×10mlのアセトン、および最後に3×1
0mlの蒸留水で連続的に洗浄した。滴定後のゲルの残余アミン基は、0.033m
molアミン基/mlと計算された。
1.d由来)をCH2Cl2(4ml)中の10%トリフルオロ酢酸溶液で、室温で2時
間処理した。反応混合液をろ過し、ゲルを3×10mlのCH2Cl2、3×10m
lのアセトン、および3×10mlの蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの生成物の
置換度は0.19mmolアミン基/mlであった。
DMF(3ml)溶液をDMF(5ml)中のシステアミンSepharose(3.3ml、0.3m
molアミン基/mlゲル)のスラリーに加えた。混合物を室温で18時間撹拌した。
懸濁液をろ過し、ゲルを3×10mlのDMFで洗浄した。
システアミンゲル(3.3ml)(3.3由来)をDMF(10ml)中の10%1,8−ジ
アザビシクロ[5,4,0]−ウンデカ−7−エン溶液で、室温で18時間処理した
。反応混合液をろ過し、ゲルを3×10mlのDMF、3×10mlのアセトン、お
よび3×10mlの蒸留水で連続的に洗浄した。ゲルの置換度は0.28mmolアミ
ン基/mlであった。
パク質を吸着することを確かめるため、ウシ血清アルブミン(BSA)の貫流容量
を測定した。本研究においてSepharose Fast Flowに結合した新規「高塩濃度
(high−salt)」アニオン交換リガンドをQ Sepharose Fast Flowと比較した
。また、3つのタンパク質、すなわちコンアルブミン(Con A)、ラクトアルブ
ミン(Lactalb)およびダイズトリプシンインヒビター(STI)の溶出伝導度(elu
tion conductivity)を、すべてのアニオン交換体に関して測定した。この機能テ
ストは、他のタンパク質と同様の高塩濃度の条件下での遅延を確かめるために使
用された。高い貫流容量を有する4つの「高塩濃度」アニオン交換体リガンドを
、また、アプライされたタンパク質(BSA)の回収に関して試験した。
Fast Flowに関して相対的に高い塩濃度(0.25M NaCl)で求めた。異なる
アニオン交換体のQb10%値を下記の前端分析法を用いて測定した。
に溶解させたBSAであった。BSAの濃度は4mg/mlであった。緩衝液および
サンプル溶液を、使用前に0.45μm Millipore Millex HAフィルターを
通してろ過した。
0クロマトグラフィーシステム(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsal
a, Sweden)を用いて室温で行った。サンプルを、150mlスーパーループ(supe
rloop)を介してカラムにアプライした。終始、1ml/分(約300cm/時)の流速
を使用した。溶出液を、10mmフローセルを用いて280nmでの吸収測定により
連続的に観測した。
1)に充填し、ピペラジン緩衝液(20mMピペラジン、pH=6.0、0.25M
NaClを有する)で平衡化させた。貫流容量(Qb)を10%の最大UV検出シグナ
ル(280nm)で評価した。最大UVシグナルは、試験溶液をUV検出器に直接注
入することにより評価された。貫流容量は、デッドボリュームの修正後、最大シ
グナルの10%の高さでの保持容積から計算された。
時)の流速でサンプル溶液を(150mlスーパーループを介して)送り込んだ。サ
ンプルの添加を、溶出液のA280がサンプル溶液のA280の10%のレベル
に達するまで継続した。そのようにして得られたデータ(すなわち、カラムに対
する充填ゲル吸着床の体積(Vc)、その空隙容量、流速およびBSAの濃度)に基
づいて、ゲルの貫流容量(Qb10%)を計算し得る。得られた結果は、複数の「
高塩濃度のリガンド」候補物質をスクリーニングするための基礎を形成し、その
結果を以下に提供する。
、式: QbBSA=(TR10%−TRD)xC/Vc ここで: TR10%=吸収最大の10%での保持時間(分) TRD=システムの不感時間(分) C=BSAの濃度(4mg/mL) Vc=カラム容積(mL) を用いて計算された。
のA−緩衝液(20mM リン酸緩衝液;pH6.8)で平衡化させた。50μlのタ
ンパク質混合物(6mg/mlのCon A、4mg/mlのラクトアルブミンおよび6mg/
mlのSTI)をカラムにアプライし、100%のB−緩衝液(A−緩衝液に2.0
M NaClを加えたもの)まで直線的勾配(勾配の容積=20カラム容積)で溶出
した。流速を0.3ml/分(100cm/時)に調節した。すべての実験をUnicorn
3.1 ソフトウエアを備えたAekta Explorer 100クロマトグラフィーシ
ステムを用いて室温で行った。
関する詳細は上で概説されたものである。ピペラジン緩衝液(20mMピペラジン
、pH=6.0、0.25M NaClを有する)で平衡化されたカラムに、貫流容量
の30%に相当する量がアプライされるまで50mlスーパーループからBSA溶
液をアプライした。次いで、カラムを2吸着床容積の平衡化緩衝液で洗浄し、結
合したBSAを適当な脱着緩衝液で溶出した。リガンド(チロシン)および(2−
アミノベンズイミダゾール)の場合には、吸着したBSAをピペラジン緩衝液(2
0mMピペラジン、pH=6.0、2.0M NaClを有する)で溶出した。さらに
、リガンド(オクトパミン)および(チロシノール)上に吸着したBSAをTRIS
緩衝液(0.2M TRIS、pH=9.0、2M NaClを有する)で溶出した。
れた結果を表1に要約し、リガンドの構造を第3部に記載する。これらの新規ア
ニオン交換体の大部分のリガンド置換度は、約0.05−0.3mmol/ml充填ゲル
である。対照のアニオン交換体として、商品として入手可能なQ Sepharose F
ast Flowを使用した。リガンドの密度は、アニオン交換体の新規シリーズと同
一の範囲内にある。その結果により、次の傾向が示唆される。 1. この進歩性のあるアニオン交換リガンドは、対照のアニオン交換体Q Seph
arose Fast Flowと比較して、3つのタンパク質すべての溶出伝導度がずっと
高い(表1)。 2. この進歩性のあるアニオン交換リガンドは、また、Q Sepharose Fast F
lowと比較してBSAの貫流容量(QbBSA)もずっと高い。最高のQb値を与え
たリガンドは、対照アニオン交換体に比べて4300%の増加に相当する。提供
されたリガンド(表1)の中で、最低のQb値を与えたものは、Q Sepharose Fa
st Flowと比較して500%の増加に相当する。 3. 優れたアニオン交換リガンドのすべては、第1級または第2級アミンである
か、あるいは両方とも第1級および第1級アミンである。第4級アミンに基づく
リガンドで優れたものは発見されていない。 4. 良好なアニオン交換リガンド(7、5、27および4)からの回収データは、
吸着BSAが塩段階(7および5)により、および/またはpHと塩段階の組合せ(
2および4)により、80%より高い回収率で溶出できることを示す(第III部参
照)。
度およびBSAの貫流容量(pH6および0.25M NaCl)
H(CH2OH)−、n=0、m=1、−CH2CH(OH)CH2O−で終わるS
P(アミノ基で結合)。
CH2CH(CH2OH)−、−CH2CH(OH)CH2O−で終わるSP(アミ
ノ基で結合)。回収率80%
H2CH(CH2OH)−、−CH2CH(OH)CH2O−で終わるSP(アミノ
基で結合)。
OH)CH2−、−CH2CH(OH)CH2O−−で終わるSP(アミノ基で結合
)。回収率80%
CH2CH(OH)−CH2O−で終わるSP(アミノ基で結合)。回収率82%
=−CH2CH<、−CONHCH2CH2SCH2−で終わるSP
2CH<、−CONHCH2−で終わるSP(カルボキシ基で結合)。回収率=9
8%
R'1=−CH2CH(CH2OH)−、−CH2CH(OH)CH2O−で終わる
SP(アミノ基で結合)。
=4−ヒドロキシフェニル、n=0、m=1、R'1=−CH(OH)CH(CH3)
−、−CH2CH(OH)CH2O−で終わるSP(アミノ基で結合)。
フェニル、m=0、−CH2CH(OH)CH2O−で終わるSP(アミノ基で結合
)。
で終わるSP(芳香族アミノ基で結合)。 Ar=4−アミノフェニル、n=0、m=1、R'1=−CH2CH2−、−CH
2CH(OH)CH2O−で終わるSP(脂肪族アミノ基で結合)
、R'1=−CH(OH)CH2−、−CH2CH(OH)CH2O−で終わるSP(
アミノ基で結合)。
'1=−CH2CH2SCH2CH<、−CONHCH2CH2SCH2−で終
わるSP
トロ(notro)フェニル、n=0、m=1、R'1=−CH(OH)CH(CH2OH)
−、−CH2CH(OH)CH2O−で終わるSP(アミノ基で結合)。
n=0、m=1、R'1=−CH2CH(CH2OH)−、アミノ基で結合し、−C
H2CH(OH)CH2O−で終わるSP(アミノ基で結合)。
トリフルオロメチルフェン−1,2−ジイル、m=0、R'1=−CH2CH(CH 2 OH)−、Arで結合し、−SCH2−で終わるSP(メルカプト基で結合)
ル、n=0、m=1、R'1=−CH2−、アミノで結合し、−CH2CH(OH)
CH2O−で終わるSP(アミノ基で結合)。
'1=−CH2CH<、−CONHCH2CH−で終わるSP。
6−イルまたは6−アミノ−ピリミド−2,4−ジイル、m=0、Arで結合し、
−SCH2−で終わるSP(メルカプト基で結合)。
1、R'1=−CH(OH)CH<、R'1で結合し、−CONHCH2CH2SC
H2−で終わるSP。QbBSA=14mg/ml
−CH2CH(CH2OH)−、アミノで結合し、−CH2CH(OH)CH2O−
で終わるSP(アミノ基で結合)。
CH2−で終わるSP(アミノ基で結合)。
'1=−CH(OH)CH<、R'1で結合し、−CONHCH2CH2SCH2−
で終わるSP。
−1−イル、m=0、アリールで結合し、−NHCH2CH(OH)CH2−で終
わるSP(アミノ基で結合)。
リアジン−2,6−ジイル、m=0、Arで結合し、−SCH2−で終わるSP(メ
ルカプト基で結合)。
で結合し、−NHCH2CH(OH)CH2−で終わるSP(アミノ基で結合)
結合し、−NHCH2CH(OH)CH2−で終わるSP(アミノ基で結合)。リガ
ンド密度:低い。
Claims (21)
- 【請求項1】 陰性荷電を担持し、水性液体(I)中に存在する物質を除去す
る方法であって、 (i)該液体を、陽性荷電構造(アニオン交換体)および疎水性構造を含む複数のリ
ガンドを担持するマトリックスと、リガンドと物質との間の結合をもたらす条件
下で、接触させる段階、および (ii)当該マトリックスから当該物質を脱着させる段階 の段階を含み、 (I)それぞれの当該リガンド・プラス・スペーサーが下記式を有し、 −−SP−−−[Ar−R1−N+(R2R3R4)] 式中、(A)[Ar−R1−N+(R2R3R4)]はリガンドを表し、ここに、 a)Arは芳香族環であり、 b)R1は[(L)nR'1]mであり、ここで、 ・nおよびmは零または1から選択される整数であり、 ・Lはアミノ窒素、エーテル酸素またはチオエーテル硫黄であり、 ・R'1は二価性リンカー基であって、 1)直鎖、分枝鎖または環式炭化水素基、 2)−C(=NH)−、 より選択され、 c)R2−4は水素および低級アルキルから選択され、 (B)SPは、Ar−R1N+(R2R3R4)に直接結合されている炭素、窒素、
硫黄または酸素を提供するスペーサーであり、 (C)−−−は、スペーサーが(Ar−R1−N+(R2R3R4)の水素を置換する
ことを表し、 (D)−−は、マトリックスへの結合を表し、そして (II)段階(ii)の脱着が、物質がセリンプロテアーゼであるとき、そして特に、R
'が−C(=NH)−であるとき、アニオン交換条件下で実施される、 ことを特徴とする方法。 - 【請求項2】 アニオン交換体(1)が、 (a)水性対照液体(II)中の所望の物質に、0.3M NaClに対応するイオン強度
のアニオン交換条件下で結合し、そして (b)Q−Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biothech, Uppsala,
Sweeden)についての該物質のpH範囲2ないし12での最大貫流容量の、200
%以上、例えば300%以上または500%以上または1000%以上である、
該物質についてのpH範囲2ないし12での最大貫流容量を許容する、 ことが可能であることを特徴とする請求項1に記載の方法であって、 当該アニオン交換体が、同じ条件下で決定されるときに、同じリガンド密度お
よび貫流容量を有する方法。 - 【請求項3】 m=1であり、そしてR'が、直鎖、分枝鎖または環式炭化水
素基から選択される二価性リンカー基であって、置換され得、そして/またはエ
ーテル酸素、チオエーテル硫黄またはアミノ窒素によって割り込まれている基で
あることを特徴とする、請求項1ないし2のいずれかに記載の方法。 - 【請求項4】 該複数のリガンドが12以下のpKaを有し、そして/または
第1級または第2級窒素であることを特徴とする、請求項1ないし3のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項5】 Ar、SP、R'1およびR2−4の少なくとも1つが、−N + (R2R3R4)の陽性窒素から1ないし7原子の距離に、1または2以上の電
子アクセプター−ドナー原子または基を含むことを特徴とする、請求項1ないし
4のいずれかに記載の方法であって、好ましくは当該アクセプター−ドナー原子
または基が水素結合に関係し、ただし、Arについてこの原子または基が、芳香
族構造のsp2−炭素ではない、方法。 - 【請求項6】 当該 (i)電子ドナー−アクセプター相互作用が、水素結合であり、そして/または (ii)ドナー原子/基が、 (a)電子の遊離対を有する酸素、例えばヒドロキシ、エーテル、カルボニル、
およびエステル(−O−および−CO−O−)およびアミド、 (b)遊離電子対を有する硫黄、例えば、チオエーテル(−S−)、 (c)電子の遊離対を有する窒素、例えばアミン、スルホナミドを含むアミド、 (d)ハロゲン(フッ素、塩素、臭素およびヨウ素)、および (e)sp−およびsp2−混成軌道を有する炭素、 から選択され、および/または (iii)アクセプター基が、電子不足原子、例えば水素および/または電子陰性原
子からなる群より選択される、 ことを特徴とする、請求項5に記載のいずれかの方法。 - 【請求項7】 当該1または2以上の水素結合原子の少なくとも1つが、S
P中の分枝性基として、またはベースマトリックスからリガンドへ伸長するSP
の鎖の一部として存在することを特徴とする、請求項5ないし6のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項8】 SPが、リガンドAr−R1−N+(R2R3R4)に直接的
に結合されている、 (a)炭素原子、好ましくはカルボニル炭素またはsp3−混成軌道を有する炭素、
または (b)窒素原子、好ましくはアミノまたはアミド窒素、または (c)硫黄原子、好ましくはチオエーテル硫黄原子、または (d)酸素、好ましくはエーテル酸素原子、 を含むことを特徴とする請求項1ないし7のいずれかに記載の方法; ただし、アイテム(b)ないし(d)は、スペーサーがArまたはR1に結合すると
きのみに該当する。 - 【請求項9】 n=0、m=1、R'=−C(=NH)−、R2−4=水素、A
r=p−C6H4−、SPが第2級アミノ窒素、例えば−NH−を介してArに結
合されていることを特徴とする、請求項1ないし2のいずれかに記載の方法。 - 【請求項10】 吸着/結合段階(i)中のイオン強度が、0.25M NaCl
水溶液のイオン強度より大きい、または同等であることを特徴とする、請求項1
ないし9のいずれかに記載の方法。 - 【請求項11】 アニオン交換体の、またはアニオン交換体中に存在するア
ニオン交換体リガンドの、水性液体(I)のpHが、pKa+2以下である、例えばp
Ka+1以下であることを特徴とする、請求項1ないし10のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項12】 物質の陰性荷電を減少させるために、水性液体(II)のpH
が、水性液体(I)のpHと異なることを特徴とする、請求項1ないし11のいず
れかに記載の方法。 - 【請求項13】 水性液体(II)の極性が、水性液体(I)の極性より低いこと
を特徴とする、請求項1ないし12のいずれかに記載の方法。 - 【請求項14】 Ar−R1−N+(R2R3R4)の構造類似体が、水性液
体(I)中よりも高濃度で、水性液体(II)に存在することを特徴とする、請求項1
ないし13のいずれかに記載の方法。 - 【請求項15】 それぞれがスペーサーを介して親水性ベースマトリックス
に結合されている、複数のアニオン交換リガンドを含むアニオン交換体(1)であ
って、 (a)リガンド・プラス・それらのスペーサーが下記式に従い、 −−SP−−−[Ar−R1−N+(R2R3R4)] ここで、記号は請求項1ないし10のいずれかと同じ意味を有し、そして (b)アニオン交換体(1)が、Q−交換体(−CH2CH(OH)CH2N+(CH3) 3 )(アニオン交換体2)について得られるpH範囲2ないし12での最大貫流容量
の、200%以上、例えば300%以上または500%以上または1000%以
上である、卵白アルブミン、コンアルブミン、ウシ胎児血清アルブミン、βラク
トグロブリン、αラクトアルブミン、リゾチーム、IgG、ダイズトリプシンイ
ンヒビター(STI)から選択される少なくとも1つの対照タンパク質について、
pH範囲2ないし13での最大貫流容量を有し、ここで、支持マトリックス、置
換の程度、対イオンおよび稼動条件が、アニオン交換体(1)およびアニオン交換
体(2)について同じである、 ことを特徴とする、アニオン交換体(1)。 - 【請求項16】 相対的貫流容量が、アニオン交換体条件下で測定されるこ
とを特徴とする、請求項15に記載のアニオン交換体。 - 【請求項17】 液体から物質を除去するための1または2以上のアニオン
交換体の適切性を試験する(スクリーニングする)ための方法であって、 (a)ライブラリーであって、 (i)試験すべき1または2以上のアニオン交換体(交換体1、2、3、4・・・
・・n;n=整数、>0)であって、それぞれのアニオン交換体がリガンドの種
類について異なるアニオン交換体、および (ii)交換体1、2、3、4・・・・nと、対照アニオン交換体とで本質的に同
じである、対照リガンド、支持マトリックス等を有する対照アニオン交換体 を含むライブラリーを提供する段階、 (b)予め決定した条件で、該物質について交換体1のpH範囲2ないし12での最
大貫流容量を決定する段階、 (c)段階(b)と同じ条件で、該物質について対照アニオン交換体のpH範囲2ない
し12での最大貫流容量を決定する段階、 (d)段階(b)および(c)で得られる最大貫流容量の間の関連性の助けにより、アニ
オン交換体1が、該物質を除去するための使用に適切であるか、結論付ける段階
、および (e)要すれば、段階(b)ないし(c)を、交換体2、3、4・・・nの少なくとも1
つについて反復する段階、 を含む方法。 - 【請求項18】 段階(b)および(c)が、アニオン交換体条件下で実施される
ことを特徴とする、請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 下記段階を含む、溶液(液体(I))中に存在するとき、陰性
に荷電した、好ましくは両性の物質から塩を除去する方法であって、 (i)液体(I)を、アニオン交換体と物質の間の結合をもたらす条件下で、陽性
に荷電している窒素が存在する、複数のリガンドを担持するベースマトリックス
を含む、アニオン交換体(1)と接触させる段階、 (ii)当該物質を、液体(液体(II))の使用によって当該アニオン交換体から脱着
する段階、 下記事項を特徴とする方法; (A)アニオン交換体であって、 (a)0.25M NaClに対応するイオン強度の水性対照液体中の所望の物質
を結合することが可能であり、そして (b)該物質についてpH範囲2ないし12での最大貫流容量が、Q−Sepharo
se Fast Flow(アニオン交換体2、Amersham Pharmacia Biothech, Uppsal
a, Sweeden)についての該物質の貫流容量の、200%以上、例えば300%以
上または500%以上または1000%以上の最大貫流容量が可能である、 アニオン交換体からアニオン交換体(1)を選択し、ここで当該アニオン交換体は
、同じ条件下で測定されるとき、本質的に同じリガンド密度および貫流容量を有
すること; (B)アニオン交換体上のより低い正味の陽性荷電、および/または該物質上の
より低い正味の陰性または陽性荷電を意味する、酸−塩基対の使用によって、段
階(ii)の液体(II)のpHを調節し、それによって液体(I)と比較してより低いイ
オン強度での溶出を可能とすること。 - 【請求項20】 酸−塩基対バッファーの少なくとも1のメンバーが、物質
より高い蒸気圧を有することを特徴とする、請求項19に記載の方法。 - 【請求項21】 段階(ii)で得られる低塩含量の液体中の物質が、質量分析
計でイオン化されることを特徴とする、請求項19ないし20のいずれかに記載
の方法。
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004532182A (ja) * | 2000-12-31 | 2004-10-21 | アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ | 低濃度の塩を含有する組成物の製造方法 |
JP2006242944A (ja) * | 2005-02-04 | 2006-09-14 | Showa Denko Kk | イオンクロマトグラフィー用充填剤 |
JP2008503754A (ja) * | 2004-06-24 | 2008-02-07 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | 分離マトリックス及び精製法 |
JP2008518885A (ja) * | 2004-10-21 | 2008-06-05 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | クロマトグラフィーリガンド |
Families Citing this family (42)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE0002688D0 (sv) | 2000-07-17 | 2000-07-17 | Amersham Pharm Biotech Ab | Adsorption method and ligands |
SE0004932D0 (sv) * | 2000-12-31 | 2000-12-31 | Apbiotech Ab | A method for mixed mode adsorption and mixed mode adsorbents |
SE0103084D0 (sv) * | 2001-09-14 | 2001-09-14 | Amersham Pharm Biotech Ab | Generation of ion exchange media |
SE0200543D0 (sv) | 2002-02-21 | 2002-02-21 | Amersham Biosciences Ab | Method of separation using aromatic thioether ligands |
JP4629660B2 (ja) * | 2003-03-05 | 2011-02-09 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | マルチモードアニオン交換リガンドの製造法 |
SE0300612D0 (sv) * | 2003-03-05 | 2003-03-05 | Amersham Biosciences Ab | A method of preparing ligands for hydrophobic interaction chromatography |
SE0300624D0 (sv) * | 2003-03-05 | 2003-03-05 | Amersham Biosciences Ab | A method of preparing affinity ligands |
SE0300791D0 (sv) * | 2003-03-20 | 2003-03-20 | Amersham Biosciences Ab | Use of ph-responsive polymers |
US7700743B2 (en) * | 2003-07-22 | 2010-04-20 | Millipore Corporation | Immobilised affinity medium and its use in separation |
US7045059B2 (en) * | 2003-07-28 | 2006-05-16 | Sielc Technologies Corp | Universal bonded phase material for chromatographic separation |
SG150501A1 (en) | 2004-02-05 | 2009-03-30 | Millipore Corp | Porous adsorptive or chromatographic media |
NZ548126A (en) * | 2004-02-27 | 2009-10-30 | Ge Healthcare Bio Sciences Ab | A process for the purification of antibodies involving addition of a second resin |
US9266041B2 (en) * | 2004-10-21 | 2016-02-23 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Chromatography ligand |
EP1693108A1 (en) * | 2004-12-04 | 2006-08-23 | MERCK PATENT GmbH | Mixed-modal anion-exchange type separation material |
WO2006078163A2 (en) * | 2005-01-18 | 2006-07-27 | Dolphys Technologies B.V. | High molecular weight non-ionic surfactants comprising nitrogen or phosphorus containing groups |
EP2489658B1 (en) | 2005-01-26 | 2014-04-09 | Allergan, Inc. | 3-Heteroaryl-3-hydroxy-2-amino-propyl amines and related compounds having analgesic and/or immuno stimulant activity |
WO2006127973A2 (en) * | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Waters Inverstments Limited | Methods for separating and analyzing anionic compounds |
KR101289911B1 (ko) | 2005-08-03 | 2013-07-26 | 메르크 파텐트 게엠베하 | 친수성 가교 중합체 |
EP1754534A1 (de) | 2005-08-03 | 2007-02-21 | MERCK PATENT GmbH | Hydrophiles vernetztes Polymer |
WO2007064281A1 (en) * | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Hydrophobic interaction chromatography |
AU2007272494B2 (en) | 2006-07-14 | 2011-07-28 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Adsorptive membranes for trapping viruses |
US8092683B2 (en) * | 2007-01-10 | 2012-01-10 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Multi-modal ion exchange chromatography resins |
US20100084343A1 (en) * | 2007-02-16 | 2010-04-08 | Mader Brian T | System and process for the removal of fluorochemicals from water |
US20140179925A1 (en) | 2009-09-04 | 2014-06-26 | Allergan, Inc. | Methods for treating cognitive disorders using 3-aryl-3-hydroxy-2-amino-propionic acid amides, 3-heteroaryl-3-hydroxy-2-amino-propionic acid amides and related compounds |
WO2008109285A1 (en) | 2007-03-06 | 2008-09-12 | Allergan, Inc. | Methods for treating cognitive disorders |
PT2481407T (pt) | 2007-03-06 | 2018-12-28 | Allergan Inc | Compostos para utilização no tratamento de distúrbios cognitivos |
US9314466B2 (en) | 2007-03-06 | 2016-04-19 | Allergan, Inc. | Methods for treating cognitive disorders using 1-benzyl-1-hydroxy-2,3-diamino-propyl amines, 3-benzyl-3-hydroxy-2-amino-propionic acid amides and related compounds |
AU2008279841B2 (en) | 2007-07-25 | 2013-05-02 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Separation matrix |
US9433922B2 (en) | 2007-08-14 | 2016-09-06 | Emd Millipore Corporation | Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same |
US8188242B2 (en) | 2008-04-08 | 2012-05-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Chromatography purification of antibodies |
WO2009145722A1 (en) * | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Separation method utilizing polyallylamine ligands |
CN102574102B (zh) | 2009-07-28 | 2015-11-25 | 尹思琪爱克什有限公司 | 用于结合蛋白质和肽的特异性吸附剂及使用其的分离方法 |
US20130186836A1 (en) * | 2010-10-05 | 2013-07-25 | Bio-Works Company Limited | Method For Removing Arsenic From Water Using Polymer Based Matrices With Chelating Groups Comprising Metal Ions |
US9669402B2 (en) | 2012-03-08 | 2017-06-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Anionic exchange-hydrophobic mixed mode |
US20130337027A1 (en) * | 2012-05-24 | 2013-12-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Medical Devices and Implements with Liquid-Impregnated Surfaces |
US9175279B1 (en) | 2013-03-15 | 2015-11-03 | Csl Limited | Method of purifying factor VII and/or factor VIIa |
CN114917884A (zh) | 2014-03-14 | 2022-08-19 | 思拓凡生物工艺研发有限公司 | 用于生物颗粒纯化的分离基质 |
US11584777B2 (en) * | 2017-08-31 | 2023-02-21 | Green Cross Corporation | Method for purifying a sulfatase protein |
US11045773B2 (en) | 2018-08-31 | 2021-06-29 | Pall Corporation | Salt tolerant porous medium |
US10737259B2 (en) | 2018-08-31 | 2020-08-11 | Pall Corporation | Salt tolerant anion exchange medium |
CN114650882A (zh) * | 2019-11-07 | 2022-06-21 | 沃特世科技公司 | 用于混合模式阴离子交换反相液相色谱的材料和方法 |
CN113101909B (zh) * | 2021-05-11 | 2023-07-18 | 博格隆(浙江)生物技术有限公司 | 一种层析介质及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2321932A1 (fr) * | 1975-08-28 | 1977-03-25 | Rhone Poulenc Ind | Procede de separation de proteines par echange d'ions |
US4229342A (en) * | 1977-05-18 | 1980-10-21 | Rhone-Poulenc Industries | Process for extracting proteins from milk using silica and anion exchange resins |
GB2050192A (en) * | 1979-07-18 | 1981-01-07 | Northern Eng Ind | Monitoring sodium content of condensates during polishing |
JPH0256253A (ja) * | 1988-08-18 | 1990-02-26 | Fuji Photo Film Co Ltd | アニオン交換能を有する高分子複合体 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3234199A (en) * | 1958-12-18 | 1966-02-08 | Allen F Reid | Ion exchange process for separating proteins |
JPS5521763B2 (ja) * | 1973-07-07 | 1980-06-12 | ||
JPS5412911B2 (ja) * | 1973-07-23 | 1979-05-26 | ||
US4100149A (en) * | 1975-08-28 | 1978-07-11 | Rhone-Poulenc Industries | Method of separating proteins by ion exchange |
DE2621974A1 (de) * | 1976-05-18 | 1977-11-24 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur herstellung eines zur kovalenten bindung mit biologisch aktivem material befaehigten traegermaterials |
NZ187301A (en) | 1977-05-18 | 1981-03-16 | Rhone Poulenc Ind | Extracting proteins from milk by anion-exchange resin and silica |
DE3127751A1 (de) | 1981-07-14 | 1983-02-03 | EC Erdölchemie GmbH, 5000 Köln | Verfahren zur hydrierung von kohlenwasserstoffen |
DE3411420A1 (de) | 1984-03-28 | 1985-10-10 | L. & C. Steinmüller GmbH, 5270 Gummersbach | Verfahren zur feststellung des durchbruchpunktes eines kationenaustauschers in einer anlage zur entsalzung von wasser oder waessrigen loesungen |
DD237844A1 (de) | 1985-05-29 | 1986-07-30 | Akad Wissenschaften Ddr | Verfahren zur herstellung von kationenaktiven ionenaustauschern |
NL8701915A (nl) * | 1987-08-14 | 1989-03-01 | Waander Riethorst | Adsorbensmateriaal en toepassing daarvan voor het isoleren van stollingsfaktoren. |
GB8912903D0 (en) * | 1989-06-05 | 1989-07-26 | Smith Kline French Lab | Compounds |
DE4010265C2 (de) | 1990-03-30 | 1997-07-24 | Karlsruhe Forschzent | Verfahren zur getrennten Gewinnung von Komplexbildern und unkomplexierten Metallionen aus Abwasser |
DE4028989C1 (ja) * | 1990-09-13 | 1991-08-22 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt, De | |
SE9004129D0 (sv) * | 1990-12-21 | 1990-12-21 | Pharmacia Lkb Biotech | Anion exchanger |
US20040214157A1 (en) | 1994-06-29 | 2004-10-28 | Simon C. Burton | Chromatographic resins and methods for using same |
US5652348A (en) | 1994-09-23 | 1997-07-29 | Massey University | Chromatographic resins and methods for using same |
SE9600590D0 (sv) * | 1996-02-19 | 1996-02-19 | Pharmacia Biotech Ab | Sätt för kromatografisk separation av peptider och nukleinsyra samt ny högaffin jonbytesmatris |
SE9700383D0 (sv) | 1997-02-04 | 1997-02-04 | Pharmacia Biotech Ab | An adsorption/separation method and a medium for adsorption/separation |
SE9802214D0 (sv) | 1998-06-18 | 1998-06-18 | Amersham Pharm Biotech Ab | Jonbytare och användning därav |
-
1999
- 1999-11-22 SE SE9904197A patent/SE9904197D0/xx unknown
-
2000
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-
2003
- 2003-11-26 US US10/723,362 patent/US20040079702A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2321932A1 (fr) * | 1975-08-28 | 1977-03-25 | Rhone Poulenc Ind | Procede de separation de proteines par echange d'ions |
US4229342A (en) * | 1977-05-18 | 1980-10-21 | Rhone-Poulenc Industries | Process for extracting proteins from milk using silica and anion exchange resins |
GB2050192A (en) * | 1979-07-18 | 1981-01-07 | Northern Eng Ind | Monitoring sodium content of condensates during polishing |
JPH0256253A (ja) * | 1988-08-18 | 1990-02-26 | Fuji Photo Film Co Ltd | アニオン交換能を有する高分子複合体 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2004532182A (ja) * | 2000-12-31 | 2004-10-21 | アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ | 低濃度の塩を含有する組成物の製造方法 |
JP2008503754A (ja) * | 2004-06-24 | 2008-02-07 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | 分離マトリックス及び精製法 |
JP4890453B2 (ja) * | 2004-06-24 | 2012-03-07 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | 分離マトリックス及び精製法 |
JP2008518885A (ja) * | 2004-10-21 | 2008-06-05 | ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ | クロマトグラフィーリガンド |
JP2006242944A (ja) * | 2005-02-04 | 2006-09-14 | Showa Denko Kk | イオンクロマトグラフィー用充填剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2389515A1 (en) | 2001-05-31 |
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