JP2003508061A - 植物由来の脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子 - Google Patents

植物由来の脂肪酸デサチュラーゼ遺伝子

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JP2003508061A JP2001520907A JP2001520907A JP2003508061A JP 2003508061 A JP2003508061 A JP 2003508061A JP 2001520907 A JP2001520907 A JP 2001520907A JP 2001520907 A JP2001520907 A JP 2001520907A JP 2003508061 A JP2003508061 A JP 2003508061A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、不飽和もしくは飽和脂肪酸の製造方法、および、不飽和もしくは飽和脂肪酸の含量を高めたトリグリセライドの製造方法に関する。さらにまた本発明は、核酸配列、ならびに、少なくとも1個の核酸配列または核酸構築物を含む核酸構築物、ベクター、および生物に関する。さらにまた本発明は、飽和もしくは不飽和脂肪酸、および、不飽和もしくは飽和脂肪酸の含量を高めたトリグリセライド、および、それらの利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、不飽和もしくは飽和脂肪酸の製造方法、および、不飽和もしくは飽
和脂肪酸の含量を高めたトリグリセライドの製造方法に関する。
【０００２】 更に本発明は、核酸配列、核酸構築物、１以上の核酸配列または核酸構築物を
含むベクターおよび生物に関する。更に本発明は、不飽和もしくは飽和脂肪酸、
および、不飽和もしくは飽和脂肪酸の含量を高めたトリグリセライド、および、
それらの利用に関する。
【０００３】 脂肪酸およびトリグリセライドは、食品工業、動物の栄養、化粧品および医薬
の分野において、数多くの用途がある。遊離の飽和もしくは不飽和脂肪酸である
か、不飽和もしくは飽和脂肪酸の含量を高めたトリグリセライドであるかによっ
て、非常に幅広い用途に適する；例えば、多価不飽和脂肪酸は、栄養価を高める
ために乳児用調合乳に添加される。様々な脂肪酸およびトリグリセライドが、Mo
rtierellaなどの微生物から、または、大豆、油糧菜種、ヒマワリ等の油脂生産
性植物から、主に得られ、その場合、主にトリアシルグリセライドの形態で得ら
れる。そのほか、魚などの動物からも有利に得ることができる。遊離脂肪酸は、
加水分解により有利に製造することができる。
【０００４】 不飽和脂肪酸を含む油脂と飽和脂肪酸を含む油脂とのどちらが好ましいかは、
目指す目的による。例えば、不飽和脂肪酸、とりわけ多価不飽和脂肪酸、を含む
脂質は、ヒトの栄養補給において好ましい。なぜなら、それらが血中コレステロ
ールレベルに対して好ましい効果があり、それゆえ心臓疾患の可能性に対して好
ましい効果があるためである。それらは、多種多様な栄養食または医薬において
利用されている。
【０００５】 特に有用であり、注目されている不飽和脂肪酸が、共役不飽和脂肪酸と呼ばれ
るもので、共役リノール酸などがある。共役脂肪酸には一連の好ましい効果が確
認されている。例えば、共役リノール酸の摂取は、ヒトおよび動物において体脂
肪を減少させ、動物において食餌から体重への変換を増大させる（WO 94/16690
、WO 96/06605、WO 97/46230、WO 97/46118）。共役リノール酸の摂取は、例え
ば、アレルギー(WO 97/32008)やガン(Banniら, Carcinogenesis, Vol.20, 1999:
pp.1019-1024, Thompsonら, Cancer Res., Vol.57, 1997: pp.5067-5072)に対
して好ましく作用する可能性もある。
【０００６】 共役脂肪酸、例えばカレンドラ酸（calendulic acid）や共役リノール酸、の
化学的な製造方法は、米国特許第3,356,699号および米国特許第4,164,505号に記
載されている。カレンドラ酸は、カレンドラ(Calendula officinalis)中におい
て天然に存在する(Ul’chenkoら, Chemistry of Natural Compounds, 34, 1998:
pp.272-274)。共役リノール酸は、例えば牛肉中で見られる(Chinら、Journal o
f Food Composition and Analysis, 5, 1992: pp.185-197)。カレンドラ酸の合
成に関する生化学的研究としては、Crombieらの研究（J. Chem. Soc. Chem. Com
mun., 15, 1984: pp.953-955、および、J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1985
: pp.2425-2434）がある。
【０００７】 その望ましい特性ゆえ、不飽和脂肪酸の含量を改変させた油脂を、様々な生物
において、製造するために、脂肪酸もしくはトリグリセライドの合成に関与する
遺伝子を利用する試みが、過去に絶え間なくなされてきた。例えば、WO 91/1397
2および対応米国特許には、Δ-9-デサチュラーゼが記載されている。WO 93/1124
5はΔ-15-デサチュラーゼを特許請求しており、WO 94/11516はΔ-12-デサチュラ
ーゼを特許請求している。Δ-6-デサチュラーゼは、WO 93/06712およびWO 96/21
022に記載されている。他のデサチュラーゼは、例えば、EP-A-0 550 162、WO 94
/18337、WO 97/30582、WO 97/21340、WO 95/18222、EP-A-0 794 250、Stukeyら,
J. Biol. Chem., 265, 1990: pp. 20144-20149、Wadaら, Nature 347, 1990: p
p.200-203、または、Huangら, Lipids 34, 1999: pp.649-659において、記載さ
れている。しかしながら、様々なデサチュラーゼの生化学的な特徴づけは未だ十
分でない。なぜなら、膜結合タンパク質である該酵素は、大変な困難を伴わなけ
れば、単離して分析することができないからである。(McKeonら, Methods in En
zymol. 71, 1981: pp.12141-12147、Wangら, Plant Physiol. Biochem., 26, 19
88: pp.777-792)。
【０００８】 酵母においては、脂肪酸のスペクトルが不飽和脂肪酸へと移動することと、生
産性の向上とが観察された（Huangら, Lipids 34, 1999: pp.649-659、Napierら
, Biochem. J., Vol. 330, 1998: pp.611-614参照）。しかしながら、トランス
ジェニック植物での様々なデサチュラーゼの発現では、所望の成功を収めている
ものはない。脂肪酸のスペクトルの不飽和脂肪酸への移動を示すことは可能であ
ったが、同時に、トランスジェニック植物の合成の生産性が著しく害されたので
ある。すなわち、元の植物よりも少ない量の油脂しか単離できなかったのである
。
【０００９】 したがって、不飽和脂肪酸の生合成に関与し、不飽和脂肪酸の、とりわけ共役
不飽和脂肪酸の、工業的規模での合成と生産を可能にする酵素をコードした新し
い遺伝子は依然として強く望まれている。
【００１０】 本発明の目的は、共役不飽和脂肪酸の合成のための、他のデサチュラーゼを提
供することである。
【００１１】 我々は、この目的が、デサチュラーゼ活性を持つポリペプチドをコードした単
離された核酸配列により達成されることを見出した。該核酸配列は、下記の群よ
り選択される： a)配列番号１に示す配列を有する核酸配列、 b)配列番号１に示す核酸配列から、遺伝子コードの縮重の結果として導かれる核
酸配列、 c)配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、当該ポリペ
プチドの酵素活性を実質的に低下させることのない、アミノ酸のレベルで少なく
とも75％の相同性を有する、配列番号１に示す核酸配列の誘導体。
【００１２】 誘導体とは、例えば、配列番号１によりコードされる酵素、もしくはその酵素
活性、の機能面での相同物、つまり、配列番号１によりコードされる酵素と同じ
酵素反応を触媒する酵素を意味すると解されたい。これらの遺伝子は、共役不飽
和脂肪酸の有利な製造を可能にする。以下の文中において、不飽和脂肪酸は、モ
ノまたは多価不飽和脂肪酸であり、二重結合は共役していても共役していなくて
もよい、と解されたい。配列番号１の配列は、カレンドラにおけるカレンドラ酸
の合成に関与する、新規の未知なデサチュラーゼをコードする。該酵素は、(9Z,
12Z)オクタデカジエン酸（リノール酸）を(8E, 10E, 12Z)オクタデカ共役トリ
エン酸（カレンドラ酸(calendulic acid)）に変換する。以下、本明細書中にお
いて、該酵素をカレンドラ酸デサチュラーゼと称する。
【００１３】 本発明に係る核酸配列またはその断片を利用して、相同性スクリーニングの手
法によって、更にゲノム配列を単離することもできる。
【００１４】 上述の誘導体は、例えば、他の真核生物、例えば、Calendula stellata、Oste
ospermum spinescensまたはOsteospermum hyoseroidesのような植物、藻類、原
生生物（例えば、渦鞭毛藻類）または菌類、から単離することができる。
【００１５】 配列番号１の配列の誘導体、または、機能を有する誘導体は、さらに、次の意
味を有するものと解されたい。すなわち、例えば、導かれるアミノ酸のレベルに
おいて、少なくとも７５％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、よ
り好ましくは少なくとも８５％の相同性、最も好ましくは少なくとも９０％の相
同性、を有する対立遺伝子変異体であってもよい。相同性は、アミノ酸全体に対
して計算した。使用したプログラムは、PileUp(J. Mol. Evolution., 25 (1987)
, pp.351-360, Higginsら, CABIOS, 5 1989: pp.151-153)であった。上述の核酸
から得たアミノ酸配列を、配列番号2の配列に示した。対立遺伝子変異体には、
特に、導かれる合成タンパク質の酵素活性は保持したままで、配列番号１で示す
配列から、核酸の欠失、挿入または置換によって得ることができる、機能を有す
る変異体も包含される。
【００１６】 そのようなDNA配列は、配列番号１記載のDNA配列またはその配列の一部から出
発して、例えば通常のハイブリダイゼーション法またはPCRの技法を用いること
で、上述した他の真核生物から単離できる。これらのDNA配列は、標準的な条件
下において、上述の配列とハイブリッドを形成する。ハイブリダイゼーションに
は、例えば、保存された領域から得られる短いオリゴヌクレオチドを利用するこ
とが有利である。保存された領域は、当業者が他のデサチュラーゼ遺伝子と比較
することで決定できる。
【００１７】 そのほか、本発明の核酸配列のより長い断片、または、全配列を、ハイブリダ
イゼーションに利用することも可能である。ハイブリダイゼーションに、オリゴ
ヌクレオチド、より長い断片、または全配列のうちのどの核酸を用いるかにより
、あるいは、DNAまたはRNAのどちらの種類の核酸を用いるかにより、標準的な条
件は異なる。例えば、DNA:DNAハイブリッドの融解温度は、同じ長さのDNA:RNAハ
イブリッドの融解温度よりもおよそ10℃低い。
【００１８】 核酸によって、標準的な条件は次の意味を有すると解されたい。すなわち、例
えば、0.1〜5×SSC（1×SSCは、0.15M塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム
、pH7.2）の濃度の緩衝水溶液中、あるいは、更に50%のホルムアミドの存在下に
おいて、温度は42℃〜58℃であり、例えば、5×SSC、50%ホルムアミド中42℃で
ある。DNA:DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、有利には
、0.1×SSC、かつ、約20℃〜45℃の温度、好ましくは約30℃〜45℃の温度である
。DNA:RNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、有利には、0.1
×SSC、かつ、約30℃〜55℃の温度、好ましくは約45℃〜55℃の温度である。ハ
イブリダイゼーションのために示したこれらの温度は、ホルムアミド不存在下に
おける約100ヌクレオチドの長さでG+C含量が50％の核酸について計算された融解
温度データの例である。DNAハイブリダイゼーションのための実験条件は、関連
する遺伝学の参考書（例えば、Sambrookら,”Molecular Cloning”, Cold Sprin
g Harbor Laboratory, 1989）に記載されており、また、当業者に知られた算式
（例えば、核酸の長さ、ハイブリッドの種類、または、G+C含量の関数）を使っ
て計算することができる。また、当業者は、次の参考書中に、更なるハイブリダ
イゼーションに関する情報を見出すことができる。すなわち、Ausubelら編, 198
5, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York、
HamesおよびHiggins編, 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical App
roach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford、Brown編, 1991, Esse
ntial Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Unive
rsity Press, Oxford である。
【００１９】 誘導体は、さらに、次の意味を有するものと解されたい。すなわち、配列番号
１の配列の相同体であり、例えば、真核生物の相同体、トランケートされた配列
、コードDNA配列または非コードDNA配列の一本鎖DNA、または、コードDNA配列ま
たは非コードDNA配列のRNAである。
【００２０】 配列番号１の配列の相同体はまた、プロモーター変異体等のような誘導体を意
味すると解されたい。これらの変異体は、挿入、および／または、欠失による、
1個以上のヌクレオチドの交換により、プロモーターの機能または効率に悪影響
を与えること無しに、改変されうる。更に、プロモーターの配列を変えることに
より、プロモーターの効率を向上させることが可能であり、または、他の種を含
めた他の生物から得たより効率の良いプロモーターにより、プロモーターを完全
に入れ替えることが可能である。
【００２１】 誘導体はまた、有利には次の意味を有すると解されたい。すなわち、開始コド
ンの上流 -1〜-2000の領域のヌクレオチド配列が、遺伝子の発現および／または
タンパク質の発現が変更（好ましくは増加）するように、改変されている変異体
である。さらにまた、誘導体は、3’末端が改変された変異体を意味すると解さ
れたい。
【００２２】 生物において異種起源の遺伝子の発現を最適化するためには、当該生物におい
て利用されている特異的なコドン使用頻度に従って核酸配列を変更することが有
利である。コドン利用頻度は、他の、問題となっている生物の既知の遺伝子につ
いての計算機による評価を利用して容易に決定することができる。
【００２３】 カレンドラ酸デサチュラーゼ遺伝子は、本発明の方法中において、他の脂肪酸
生合成遺伝子と有利に組み合わせることができる。
【００２４】 本発明のアミノ酸配列は、次の意味を有するものと解されたい。すなわち、配
列番号2に示したアミノ酸配列、または、その配列から、配列番号2に示したタン
パク質の酵素活性は保持したまま、または実質的な低下なしに、１個以上のアミ
ノ酸残基を、置換、逆位、挿入、欠失することで得られうる配列、を含んだタン
パク質である。「実質的な低下がない」とは、元の酵素に対して、少なくとも１
０％、好ましくは２０％、特に好ましくは３０％の酵素活性を持つ全ての酵素を
意味すると解されたい。例えば、アミノ酸は、物理化学的特性（空間的な大きさ
、塩基性、疎水性など）が似た他のアミノ酸で置換されていても良い。例えば、
アルギニン残基をリシン残基に交換し、バリン残基をイソロイシン残基に交換し
、アスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に交換する。また一方、１個以上のア
ミノ酸の配列の交換、または１個以上のアミノ酸の追加もしくは削除が可能であ
り、また、これらの手段を、お互いに２つ以上組み合わせてもよい。
【００２５】 本発明の核酸構築物または核酸断片は、次の意味を有すると解されたい。すな
わち、配列番号１の配列、遺伝子コードの結果の配列、および／または、それら
の機能性誘導体または非機能性誘導体がある。そして、それらすべてが、１個以
上の制御シグナルに、有利には遺伝子の発現を向上させるように、機能的に結合
される。これら制御配列は、例えば、インデューサーまたはリプレッサーが結合
して核酸の発現を制御する配列である。これらの新しい制御配列に加えて、また
は、その代わりに、実際の構造遺伝子の上流にある制御配列の天然の制御が、そ
のまま存続していてもよく、また望むならば、天然の制御を止めて遺伝子の発現
が増加するように、遺伝子が改変されていてもよい。しかしながら、当該遺伝子
構築物の発現は、より簡単な構造であってもよい。すなわち、配列もしくはその
誘導体の上流に制御シグナルの追加が無く、配列を制御する天然のプロモーター
が除去されていない。その代わり、天然の制御配列は、制御が起こらず遺伝子発
現が増えるように、突然変異を受けている。また、これら改変されたプロモータ
ーは天然の遺伝子の上流に存在し活性を高めることもできる。さらに、当該遺伝
子構築物は、プロモーターに機能的に連繋した１個以上のいわゆるエンハンサー
配列を含んでいることも有利である。エンハンサーは、核酸配列の発現の増加を
可能にする。また、当該DNA配列の3’末端に、制御因子またはターミネーターな
どの有利な配列を追加的に挿入することも可能である。当該遺伝子構築物には、
カレンドラ酸デサチュラーゼ遺伝子の１個以上のコピーが含まれていてもよい。
【００２６】 本発明の方法にとって有利な制御配列は、例えばcos、tac、trp、tet、trp-te
t、lpp、lac、lpp-lac、lacIq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ-PRまたは
λ-PLプロモーターなどのプロモーターに含まれ、これらは全て、グラム陰性細
菌において有利に利用できる。他の、有利な制御配列は、例えば、グラム陽性細
菌のプロモーター（amyおよびSPO2）、酵母または菌類のプロモーター（ADC1、M
Fα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH）、または、植物のプロモーター
（例えば、CaMV/35S [Franckら,Cell, 21 (1980) pp.285-294]、PRP1 [Wardら,
Plant. Mol. Biol. 22 (1993)]、SSU、OCS、lib4、STLS1、B33、nos）、または
、ユビキチンプロモーターに含まれる。他の有利な植物のプロモーターは、例え
ば、ベンゼンスルホンアミド誘導型(EP388186)、テトラサイクリン誘導型(Gatz
ら, (1992) Plant J. 2, pp.397-404)、アブシジン酸誘導型(EP335528)、および
、エタノールもしくはシクロヘキサノン誘導型(WO 9321334)、のプロモーターで
ある。他の植物のプロモーターとしては、例えば、ジャガイモ細胞質FBPアーゼ
プロモーター、ジャガイモST-LSIプロモーター(Stockhausら, EMBO J. 8 (1989)
pp.2445-245)、ダイズ(Glycine max)ホスホリボシルピロリン酸アミドトランス
フェラーゼプロモーター(gene bank accession number U87999参照)、または、E
P249676に記載の節特異的(node-specific)プロモーターがある。有利な植物のプ
ロモーターは、特に、油脂もしくはその前駆体の生合成が起こる植物の組織もし
くは部位において、発現を確実に引き起こすことができるプロモーターである。
とりわけ特筆すべきプロモーターは、種子特異的な発現を確実に引き起こすこと
ができるプロモーターであり、例えば、USPプロモーター、LEB4プロモーター、
ファセオリン(phaseolin)プロモーターまたはナピン(napin)プロモーターである
。
【００２７】 原則として、制御配列を持った上記の天然のプロモーターはすべて、本発明の
方法に用いることができる。加えて、合成プロモーターの利用もまた有利である
。
【００２８】 核酸断片（遺伝子構築物、核酸構築物と同じ）は、上述のとおり、生物に導入
される他の遺伝子を含んでいても良い。それらの遺伝子は、独立した制御を受け
ることも、本発明のデサチュラーゼ遺伝子と同じ制御を受ける領域にあることも
できる。それらの遺伝子は、例えば、有利には脂肪酸および脂質の生合成に関す
る他の生合成遺伝子であり、合成を増加させる。例示できるものとしては、Δ15
-、Δ12-、Δ9-、Δ6-、Δ5-デサチュラーゼ、各種ヒドロキシラーゼ、アセチレ
ナーゼ、アシル-ACPチオエステラーゼ、β-ケトアシル-ACPシンターゼ、アシル
トランスフェラーゼ（例えば、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ
、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ、または、リゾホスファチ
ジン酸アシルトランスフェラーゼ）、またはβ-ケトアシル-ACPリダクターゼが
ある。核酸構築物中のデサチュラーゼ遺伝子、とりわけΔ12-デサチュラーゼ遺
伝子、を利用することが有利である。
【００２９】 宿主生物（例えば、菌類などの微生物または植物）の内部で発現させるために
は、当該核酸断片は、例えば、プラスミド、ファージまたは他のDNAなどの、宿
主中で遺伝子の発現を最大化するベクター中に挿入されていることが有利である
。適したプラスミドの例としては、大腸菌においては、pLG338、pACYC184、pBR3
22、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR
290、pIN-III113-B1、λgt11、または、pBdCIであり、Streptomycesにおいては
、pIJ101、pIJ364、pIJ702、または、pIJ361であり、Bacillusにおいては、pUB1
10、pC194、または、pBD214であり、Corynebacteriumにおいては、pSA77、また
は、pAJ677であり、菌類においては、pALS1、pIL2、または、pBB116であり、酵
母2μMにおいては、pAG-1、YEp6、YEp13、または、pEMBLYe23であり、または、
植物においては、pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004、pVKH、または、pDH51で
あり、または、上記プラスミドの誘導体である。上記プラスミドは、利用可能な
プラスミドのうちのごく一部を抜粋したものである。その他のプラスミドは、当
業者には周知のものであり、例えば、書籍Cloning Vectors (Pouwels P.H.ら編,
Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)に記載され
たものである。とりわけ好適な植物のベクターは、「Methods in Plant Molecul
ar Biology and Biotechnology」(CRC Press), chapter6/7, pp.71-119に記載さ
れている。
【００３０】 ベクターはまた、プラスミドに加えて当業者に知られている他の全てのベクタ
ーを意味するものと解されたい。例えば、ファージ、ウィルス（例えば、SV40、
CMV、バキュロウィルス、アデノウィルス）、トランスポゾン、挿入配列(IS)因
子、ファスミド、ファージミド、コスミド、直鎖状または環状DNAである。これ
らのベクターは、宿主生物において自律複製されうるか、あるいは、染色体上で
複製されうる。染色体複製が好ましい。
【００３１】 該ベクターは、好ましくは、少なくとも１コピーの、本発明の核酸配列および
／または本発明の核酸断片を含む。
【００３２】 遺伝子のコピー数を増やすために、核酸配列またはそれに相同する遺伝子を、
例えば、核酸配列の断片、または、問題の遺伝子の制御遺伝子または類似の働き
をするプロモーター活性を好ましくは含んだベクターへ、導入することもできる
。特に用いられる制御配列は、遺伝子発現を増加させる制御配列である。
【００３３】 含有される他の遺伝子を発現するために、当該核酸断片は、発現を増加させる
3’-および／または5’-末端の制御配列を含んでいると有利である。当該制御配
列は、選ばれた宿主生物または遺伝子に応じて、発現が最大化するように選択さ
れる。
【００３４】 当該制御配列は、遺伝子およびタンパク質の、標的を定めた発現を可能にする
ものであるべきである。このことは、宿主生物によって、遺伝子が、誘導後にの
み発現および／または過剰発現されることを意味しても良く、また、遺伝子が、
直ちに発現および／または過剰発現されることを意味しても良い。
【００３５】 当該制御配列または因子は、導入された遺伝子の発現に対し、好ましくは、好
ましい効果を持ち、よって、それを増大させる。従って、制御に関わる要因の強
化は、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの強力な転写シグナルを用
いることにより、転写の段階において可能である。しかしながら更に、例えばmR
NAの安定性を向上させることなどにより、翻訳の強化もまた可能である。
【００３６】 該ベクターの別の実施形態としては、本発明の遺伝子構築物を、直鎖状DNAの
形態で生物に導入することも有利であり、そして、ヘテロロガスまたはホモロガ
スな組換えにより、宿主生物のゲノムに組み込むことも有利である。この直鎖状
DNAは、直鎖化されたプラスミドからなっていても良く、また、ベクターとして
の核酸断片もしくは本発明の核酸配列のみからなっていても良い。
【００３７】 本発明の核酸配列は、少なくとも１個のレポーター遺伝子とともに１個の核酸
構築物中にクローン化されることが有利であり、その核酸構築物はゲノム中に導
入される。このレポーター遺伝子は、増殖アッセイ、蛍光アッセイ、化学アッセ
イ、生物発光アッセイ、耐性アッセイ、または光度測定による検出が容易なもの
でなければならない。レポーター遺伝子として例示できるものとしては、抗生物
質または除草剤への抵抗性のための遺伝子、加水分解酵素の遺伝子、蛍光タンパ
ク質の遺伝子、生物発光の遺伝子、糖代謝の遺伝子、または、ヌクレオチド代謝
の遺伝子、または、生合成の遺伝子、であり、例えば、Ura3遺伝子、Ilv2遺伝子
、ルシフェラーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、gfp遺伝子、2-デオキシ
グルコース-6-ホスフェートホスファターゼ遺伝子、β-グルクロニダーゼ遺伝子
、β-ラクタマーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハ
イグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、または、BASTA(= グルホシネ
ート)耐性遺伝子がある。これらの遺伝子により、転写活性すなわち遺伝子発現
の測定および定量が容易になる。この方法により、ゲノムの部位による生産性の
違いが分かる。
【００３８】 更に有利な実施形態としては、本発明の核酸配列は、生物それ自体に導入され
ていても良い。
【００３９】 当該生物へ本発明の核酸配列に加えてその他の遺伝子を導入しようとする場合
、それら全てを１個のレポーター遺伝子を持つ１個のベクターにより当該生物へ
と導入することができ、または、それぞれの遺伝子を、ベクターあたりにレポー
ター遺伝子を１個つけて、個別に導入することができ、これら種々のベクターは
、同時に、または、続けて導入することが可能である。
【００４０】 宿主生物は、本発明の核酸、および／または、本発明の核酸構築物を少なくと
も１コピー含むことが有利である。
【００４１】 原則として、本発明の核酸、核酸構築物またはベクターは、当業者に知られた
全ての方法によって、植物などの生物へ導入することができる。
【００４２】 微生物の場合については、当業者は、参考書（Sambrookら, (1989) Molecular
cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press、F.M.
Ausubelら, (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley an
d Sons、D.M. Gloverら, DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-9
63476-9)、Kaiserら (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory Press、または、Guthrieら Guide to Yeast Genetics and Molecula
r Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press）において、適切な
方法を見出すことができる。
【００４３】 外来の遺伝子を植物のゲノムに移すことは、トランスフォーメーションと呼ば
れる。トランスフォーメーション、および植物組織もしくは植物細胞からの植物
の再生についての記載の方法は、一時的なあるいは安定なトランスフォーメーシ
ョンに利用される。適した方法は、ポリエチレングリコールに誘発されたDNA取
り込み、遺伝子銃の使用、エレクトロポレーション法、DNA含有溶液中での乾燥
した胚のインキュベーション、マイクロインジェクション、および、アグロバク
テリアを介した遺伝子の導入による、プロトプラストのトランスフォーメーショ
ンである。上記の方法は、例えば、Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering a
nd Utilization, S. D. KungおよびR. Wu編, Academic Press (1993) 128-143内
: B. Jenesら, Techniques for Gene Transfer、および、Potrykus, Annu. Rev.
Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225、において記載されて
いる。発現される構築物は、好ましくはAgrobacterium tumefacinesをトランス
フォームするのに適したベクター(例えば、pBin19 (Bevanら, Nucl. Acids Res.
12 (1984) 8711))へとクローン化する。Agrobacterium tumefacinesを用いた植
物のトランスフォーメーションは、例えばHofgenおよびWillmitzer, Nucl. Acid
Res. 16 (1988) 9877に記載されている。
【００４４】 本発明の発現ベクターによりトランスフォームされたアグロバクテリアはまた
、知られた方法により、植物（シロイヌナズナのような実験植物、または、農業
用植物、特に油脂含有植物であり、例えば、ダイズ、ピーナッツ、ヒマ、ヒマワ
リ、トウモロコシ、綿、亜麻、油糧菜種、ココヤシ、油ヤシ、ベニバナ（Cartha
mus tinctorius）、または、カカオ）をトランスフォームするのに利用できる。
例えば、アグロバクテリアの溶液中に、傷をつけた葉または葉の断片を浸し、引
き続いてそれらを適当な培地にて培養する方法がある。
【００４５】 遺伝子が改変された植物細胞は、当業者に知られた全ての方法によって、再生
されうる。適した方法は、上記の刊行物 (S. D. KungおよびR. Wu、Potrykus、
または、HofgenおよびWillmitzer) に見出すことができる。
【００４６】 本発明の核酸、核酸構築物もしくはベクターに適した生物もしくは宿主生物は
、原則として、脂肪酸とりわけ不飽和脂肪酸を合成できる全ての生物であって、
しかも、組み換え遺伝子の発現に適したものである。例示できるものとしては、
植物(シロイヌナズナ(Arabidopsis)、キク科植物（例えば、カレンドラ）、また
は、農業用植物（例えば、ダイズ、ピーナッツ、ヒマ、ヒマワリ、トウモロコシ
、綿、亜麻、油糧菜種、ココヤシ、油ヤシ、ベニバナ(Carthamus tinctorius)ま
たはカカオ）)、微生物(例えば菌類であって、Mortierella属、Saprolegnia属ま
たはPythium属など)、細菌(例えば、Escherichia属)、酵母(例えば、Saccharomy
ces属)、藻類、または、原生生物(例えば、Crypthecodiniumなどの渦鞭毛藻類な
ど)、である。好ましい生物は、天然で相当量の油脂を合成できる生物であり、
例えば、菌類(例えば、Mortierella alpina、Pythium insidiosum)、または、植
物（例えば、ダイズ、油糧菜種、亜麻、ココヤシ、油ヤシ、ベニバナ、ヒマ、カ
レンドラ、ピーナッツ、カカオ、またはヒマワリ）、または酵母(例えば、酵母
菌（Saccharomyces cerevisiae）)であって、ダイズ、油糧菜種、亜麻、ヒマワ
リ、カレンドラ、または、酵母菌は特に好ましい。トランスジェニック動物（例
えば、線虫）もまた、原則として宿主生物に適している。
【００４７】 本発明のもう一つの実施形態としては、上述のとおり、機能性もしくは非機能
性の核酸、または、機能性もしくは非機能性の核酸構築物を含むトランスジェニ
ック植物である。「非機能性の」とは、天然の遺伝子が不活性化されているため
に酵素活性のあるタンパク質が合成できないことを意味すると解されたい。さら
にまた、「非機能性の核酸または核酸構築物」とは、酵素活性が低下または欠失
したトランスジェニック植物を導く、いわゆるアンチセンスDNAを意味すると解
されたい。アンチセンス技術により、特にアンチセンスDNA中に本発明の核酸配
列と他の脂肪酸合成遺伝子とを組み合わせた場合、飽和脂肪酸の含量を高めたト
リグリセライドまたは飽和脂肪酸を合成することが可能になる。トランスジェニ
ック植物とは、固体培地または液体培地中の単独の植物細胞およびそれらを培養
したもの、植物の一部分、および、植物全体を意味すると解されたい。
【００４８】 従って、トランスジェニック植物を作り出すために、本発明の核酸配列および
本発明の核酸構築物を利用することもまた、本発明の目的である。
【００４９】 本発明はさらに、メチレン基によってお互いが隔離された２個の二重結合をも
つ構造Iの脂肪酸、
【化４】 を、共役した３個の二重結合をもつ構造IIのトリ不飽和脂肪酸、
【化５】 へと変換する酵素に関する。ここで、構造Iおよび構造IIにおいて、置換基およ
び変数は、下記の意味を有する。すなわち： R1は、水素、置換されたかもしくは無置換の不飽和もしくは飽和で分岐したかも
しくは分岐していないC1-C10-アルキル、または、
【化６】 であり、 R2は、置換されたかもしくは無置換で不飽和もしくは飽和のC1-C9-アルキルであ
り、 R3およびR4は、相互に独立して、水素、置換されたかもしくは無置換の飽和もし
くは不飽和で分岐したかもしくは分岐していないC1-C22-アルキルカルボニル、
または、リン酸基、であり、 nは、1〜14であり、好ましくは1〜8であり、より好ましくは4〜6であり、最も好
ましくは6である。
【００５０】 式IおよびIIの化合物中、R1は、水素、置換されたかもしくは無置換の不飽和
もしくは飽和で分岐したかもしくは分岐していないC1-C10-アルキル、または、
【化７】 である。
【００５１】 アルキル基は、置換されたかもしくは無置換の不飽和もしくは飽和で分岐した
かもしくは分岐していないC1-C10-アルキル鎖であり、例えば、メチル、エチル
、n-プロピル、1-メチルエチル、n-ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピ
ル、1,1-ジメチルエチル、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メ
チルブチル、2,2-ジメチルプロピル、1-エチルプロピル、n-ヘキシル、1,1-ジメ
チルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、
3-メチルペンチル、4-メチルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチ
ル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメ
チルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,
2,2-トリメチルプロピル、1-エチル-1-メチルプロピル、1-エチル-2-メチルプロ
ピル、n-ヘプチル、n-オクチル、n-ノニルまたはn-デシル、であってもよい。
【００５２】 好ましくは、R1は、水素、または、
【化８】 である。
【００５３】 式Iおよび式IIの化合物中、R2は、置換されたかもしくは無置換で不飽和もし
くは飽和のC1-C9-アルキルである。
【００５４】 アルキル基は、置換されたかもしくは無置換で分岐したかもしくは分岐してい
ないC1-C9-アルキル鎖であり、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、1-メチル
エチル、n-ブチル、1-メチルプロピル、2-メチルプロピル、1,1-ジメチルエチル
、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、2,2-ジメチ
ルプロピル、1-エチルプロピル、n-ヘキシル、1,1-ジメチルプロピル、1,2-ジメ
チルプロピル、1-メチルペンチル、2-メチルペンチル、3-メチルペンチル、4-メ
チルペンチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル
、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブ
チル、2-エチルブチル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル
、1-エチル-1-メチルプロピル、1-エチル-2-メチルプロピル、n-ヘプチル、n-オ
クチル、または、n-ノニル、であってもよい。C1-C5-アルキルが好ましく、C5-
アルキルが特に好ましい。
【００５５】 R3およびR4は、相互に独立して、水素、置換されたかもしくは無置換の飽和も
しくは不飽和で分岐したかもしくは分岐していないC1-C22-アルキルカルボニル
、または、リン酸基、である。
【００５６】 C1-C22-アルキルカルボニルは、例えば、メチルカルボニル、エチルカルボニ
ル、n-プロピルカルボニル、1-メチルエチルカルボニル、n-ブチルカルボニル、
1-メチルプロピルカルボニル、2-メチルプロピルカルボニル、1,1-ジメチルエチ
ルカルボニル、n-ペンチルカルボニル、1-メチルブチルカルボニル、2-メチルブ
チルカルボニル、3-メチルブチルカルボニル、1,1-ジメチルプロピルカルボニル
、1,2-ジメチルプロピルカルボニル、2,2-ジメチルプロピルカルボニル、1-エチ
ルプロピルカルボニル、n-ヘキシルカルボニル、1-メチルペンチルカルボニル、
2-メチルペンチルカルボニル、3-メチルペンチルカルボニル、4-メチルペンチル
カルボニル、1,1-ジメチルブチルカルボニル、1,2-ジメチルブチルカルボニル、
1,3-ジメチルブチルカルボニル、2,2-ジメチルブチルカルボニル、2,3-ジメチル
ブチルカルボニル、3,3-ジメチルブチルカルボニル、1-エチルブチルカルボニル
、2-エチルブチルカルボニル、1,1,2-トリメチルプロピルカルボニル、1,2,2-ト
リメチルプロピルカルボニル、1-エチル-1-メチルプロピルカルボニル、および
、1-エチル-2-メチルプロピルカルボニル、ヘプチルカルボニル、ノニルカルボ
ニル、デシルカルボニル、ウンデシルカルボニル、n-ドデシルカルボニル、n-ト
リデシルカルボニル、n-テトラデシルカルボニル、n-ペンタデシルカルボニル、
n-ヘキサデシルカルボニル、n-ヘプタデシルカルボニル、n-オクタデシルカルボ
ニル、n-ノナデシルカルボニル、または、n-エイコシルカルボニル、である。
【００５７】 R3およびR4の好ましい置換基は、飽和もしくは不飽和のC16-C22-アルキルカル
ボニルである。
【００５８】 上記の基を置換する基としては、例えば、フッ素もしくは塩素などのハロゲン
、アルキル基またはヒドロキシル基が例示できる。
【００５９】 本発明の酵素による変換では、１個の二重結合が脂肪酸に導入され、１個の二
重結合が移動する、そしてその結果、反応に関与する３個の二重結合が共役する
。さらに、１個の二重結合は(シスからトランスへ)異性化される。
【００６０】 該酵素（カレンドラ酸デサチュラーゼ）は、リノール酸(18:2, 9Z, 12Z)から
カレンドラ酸(18:3, 8E, 10E, 12Z)への変換を触媒するのに有利である。該酵素
はC8位にトランス二重結合を導入し、C9位のシス二重結合をC10位のトランス二
重結合へと特異的に移動させる。この異性化は位置特異的に起こる。推定反応機
構を図１に示す。リノール酸のC８での脱プロトン化とフリーラジカルのC10への
転位の後に、水の脱離がC11での脱プロトン化を引き起こす。こうしてカレンド
ラ酸が生じる。同時に、結合したFe(IV)は、還元されてFe(III)になる。図１は
、(8, 11)-リノレオイル(linoleoyl)デサチュラーゼ（カレンドラ酸デサチュラ
ーゼ）の推定機構であり、Svatos, Aら(Insect Biochemistry and Molecular Bi
ology 29, 1999: pp.225-232)に倣って、ヒマのΔ9デサチュラーゼの推定触媒機
構(Lindqvist, Yら, EMBO Journal 15, 1996: pp.4081-4092)を改変したもので
ある。適した基質は、6Z, 9Z, 12Zの18:3脂肪酸、および9Z, 12Z, 15Zの18:3脂
肪酸であり、それぞれは反応により、6Z, 8E, 10E, 12Z-脂肪酸、および8E, 10E
, 12Z, 15Z-脂肪酸となる。
【００６１】 さらに本発明は、不飽和脂肪酸の製造方法に関するものであり、当該方法は、
少なくとも１個の上述した本発明の核酸配列、もしくは、少なくとも１個の本発
明の核酸構築物の、好ましくは油脂生産性生物への導入、当該生物の育成、当該
生物に含まれる油脂の単離、および当該油脂に含まれる脂肪酸の遊離を含む。
【００６２】 また本発明は、不飽和脂肪酸の含量を高めたトリグリセライドの製造方法も含
んでおり、当該方法は、少なくとも１個の上述した本発明の核酸配列、もしくは
、少なくとも１個の本発明の核酸構築物の、油脂生産性生物への導入、当該生物
の育成、当該生物に含まれる油脂の単離を含む。
【００６３】 両方法は、脂肪酸の合成、または、カレンドラ酸などの不飽和脂肪酸の含量を
高めたトリグリセライドの合成を行うのに有利である。
【００６４】 さらに本発明は、飽和脂肪酸の製造方法に関するものであり、当該方法は、少
なくとも１個の上述した本発明の非機能性の核酸配列、もしくは、少なくとも１
個の本発明の非機能性の核酸構築物の、油脂生産性生物への導入、当該生物の育
成、当該生物に含まれる油脂の単離、および当該油脂に含まれる脂肪酸の遊離を
含む。また本発明は、飽和脂肪酸の含量を高めたトリグリセライドの製造方法に
関するものであり、当該方法は、少なくとも１個の上述した本発明の非機能性の
核酸配列、もしくは、少なくとも１個の本発明の非機能性の核酸構築物の、油脂
生産性生物への導入、当該生物の育成、当該生物に含まれる油脂の単離を含む。
両方法は、いわゆるアンチセンス技術(上記参照)の利用、または横方向(lateral
)の合成遺伝子の不活性化を含む。
【００６５】 上記の方法のための生物の例としては、植物(例えば、シロイヌナズナ(Arabid
opsis)、ダイズ、ピーナッツ、ヒマ、ヒマワリ、トウモロコシ、綿、亜麻、油糧
菜種、ココヤシ、油ヤシ、ベニバナ(Carthamus tinctorius)、またはカカオ)、
微生物(例えば菌類であって、Mortierella属、Saprolegnia属またはPythium属な
ど)、細菌(例えば、Escherichia属)、酵母(例えば、Saccharomyces属)、藻類、
または原生生物(例えば、Cryptheocodiniumなどの渦鞭毛藻類)がある。好ましい
生物は、天然で相当量の油脂を合成できる生物であり、例えば、菌類(例えば、M
ortierella alpina、Pythium insidiosum)、または、植物（例えば、ダイズ、油
糧菜種、亜麻、ココヤシ、油ヤシ、ベニバナ、ヒマ、カレンドラ、ピーナッツ、
カカオ、またはヒマワリ）、または酵母(例えば、酵母菌（Saccharomyces cerev
isiae）)であって、ダイズ、油糧菜種、亜麻、ヒマワリ、カレンドラ、または酵
母菌は特に好ましい。
【００６６】 当該方法に利用される生物は、当業者に知られた方法により、宿主生物に応じ
て育成し培養する。一般的には、微生物は、炭素源（通常は糖の形態）、窒素源
（通常は酵母抽出物などの有機窒素源の形態または硫酸アンモニウムなどの塩の
形態）、リン源（リン酸水素カリウムなど）、鉄塩、マンガン塩、マグネシウム
塩などの微量元素、および必要な場合はビタミンを含む液体培地中で、0℃〜100
℃の温度、好ましくは10℃〜60℃の温度において酸素を吹き込みながら培養する
。液体培地のpHを一定した値に保つことができる。つまり、培養中pHを制御する
。しかしながら、微生物をpHの制御を行わずに培養することもできる。培養は、
バッチ法、セミバッチ法、または連続的方法により行うことができる。栄養分は
、培養開始時に供給しても、半連続的または連続的に供給してもよい。
【００６７】 トランスフォーメーションの後、植物をまず上述の方法により再生し、続いて
通常の方法で増殖または栽培する。
【００６８】 該生物が成長した後、脂質を通常の方法により得る。この目的のために、該生
物は、まず収穫し続いて破砕することができ、もしくは直接利用し得る。非極性
溶媒（例えば、ヘキサン）または極性溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノ
ール）、または混合溶媒（例えば、ヘキサン／イソプロパノール、フェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール）などの適切な溶媒を用いて、０℃〜８０
℃の温度において、好ましくは20℃〜50℃の温度において、脂質を抽出すること
が有利である。一般的には、生体が過剰の溶媒により、例えば、生体に対して1
：4の過剰量の溶媒により、抽出される。続いて溶媒を、例えば蒸留によって、
除去する。また抽出は超臨界二酸化炭素により行うこともできる。抽出後、生体
の残留物はろ過などによって除去できる。植物または微生物からの脂肪酸の抽出
の標準的な方法は、Blighら(Can. J. Biochem. Physiol. 37, 1959: pp.911-917
)またはVickら(Plant Physiol. 69, 1982: pp.1103-1108)に記載されている。
【００６９】 このようにして得た未精製油は、その後更に精製することができる。例えば、
アセトンなどの極性溶媒またはクロロホルムなどの非極性溶媒の添加により曇り
を取り除き、続いてろ過または遠心分離することにより精製できる。カラムその
他の方法により更に精製を行うことも可能である。
【００７０】 トリグリセライドから遊離の脂肪酸を得るためには、トリグリセライドを、例
えばNaOHまたはKOHなどを用いた従来の方法により加水分解する。
【００７１】 さらに本発明は、上記方法により得られる、不飽和もしくは飽和脂肪酸、およ
び飽和もしくは不飽和脂肪酸の含量を高めたトリグリセライドに関するものであ
り、かつ、食品、動物飼料、化粧品、または医薬品の製造へのそれらの利用に関
する。この目的のためには、それらを、食品、動物飼料、化粧品、または医薬品
の中に通常の量で添加する。
【００７２】 本発明を、以下の実施例においてより詳細に説明する。
【００７３】実施例 RT-PCRおよびRACEの技術を用いて、カレンドラ(Calendula officinalis)のmRN
AからcDNAをクローン化した。このcDNAを酵母中で発現させると、リノール酸は
オクタデカ共役トリエンであるカレンドラ酸（8E, 10E, 12Z）に変換される。こ
れは、本発明者らが知る限り、カレンドラ酸デサチュラーゼが記載された最初の
例である。当該酵素は、C9位のシス二重結合をC10位のトランス二重結合に位置
特異的に移動させ、さらにC8位に新規にトランス二重結合を導入する。
【００７４】 カレンドラ酸デサチュラーゼcDNAの発現が増大されたトランスジェニック酵母
および植物では、その脂質中にカレンドラ酸が認められる。
【００７５】実施例1: カレンドラの種子からのRNAの単離 PCR法によりカレンドラ酸デサチュラーゼのcDNAクローンを単離出来るように
するために、カレンドラの種子からRNAを単離した。種子中の油分が非常に高い
ために、標準的なプロトコールを利用することは不可能であった。そこで、その
代わりに下記の方法を利用した。
【００７６】 乳棒と乳鉢を使って、20gの植物試料を液体窒素中ですりつぶし粉末を得た。1
00mlの抽出用緩衝液I [100mM トリス／塩酸, pH7.5, 20mM EDTA, 2%(w/v) ラウ
リルサルコシル, 4M グアニジウムチオシアネート, 5%(w/v) PVP(＝ポリビニル
ピロリドン), 1%(v/v) β-メルカプトエタノール]を加え、バッチをすぐに混合
しホモゲナイズした。その溶液を50ml容器に移し、約15分間振とうした。10-15
分間4000gにて遠心分離した後、上部に上昇してきた油層または油滴を除去し、
上清を新しい容器に移した。この後、１体積のフェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコール(= PCI, 25:24:1)によって抽出し、さらに、クロロホルムによ
って1回抽出した。どちらの抽出においても、混合液は15分間振とうしてから遠
心分離した。上清である水層を取り出し、8mlのCsCl溶液(5M CsCl)の上層に重層
し、18℃、100,000gにて18時間遠心分離した。上清はデカンテーションにより取
り除き、RNAの沈殿を短時間乾かした。70％エタノールで洗浄したのち、RNAを、
7.5mlの抽出用緩衝液II（100mM トリス／塩酸, pH8.8, 100mM NaCl, 5mM EDTA,
2% SDS）と10mlのPCIとの混合液中に溶解させ、15分間振とうさせたのち遠心分
離した。上清である水層をクロロホルムで抽出し、続いて等量の5M LiCl溶液を
加えた。RNAは、4℃にて一晩沈殿させた。混合液は12,000g、4℃にて60分間遠心
分離した。沈殿は70％エタノールで2回洗浄し、乾かし、最後に500μlの水に溶
解させた。
【００７７】 mRNAを、得られたカレンドラの全RNAから、Poly-Attract Kit（Promega, Mann
heim）を製造者の指示通りに使用して単離した。このmRNA 1μgを、200pmolのオ
リゴ-dT プライマーを利用し、製造者の指示に従って、SuperscriptII逆転写酵
素(Gibco BRL(Eggenstein))によりcDNAへと転写し、鋳型としてポリメラーゼ連
鎖反応(PCR)に供した。
【００７８】実施例2: カレンドラのカレンドラ酸デサチュラーゼの単離とクローニング カレンドラから、カレンドラ酸デサチュラーゼをコードするDNA配列を単離す
るために、種々のΔ12デサチュラーゼにおいて保存されたヒスチジンボックスの
アミノ酸配列から種々の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを導いた: プライマーA: 5’-CCD TAY TTC TCI TGG AAR WWH AGY CAY CG-3’ はフォワードプライマーであり、アミノ酸配列P Y F S W K Y/I S H Rより導い
た。
【００７９】 プライマーB: 5’-CCA RTY CCA YTC IGW BGA RTC RTA RTG-3’ はリバースプライマーであり、アミノ酸配列H Y D S S/T E W D/N Wより導いた
。
【００８０】 プライマーAおよびBにおける文字は、次の意味を有する： R = A/G Y = C/T W = A/T H = A/C/T B = C/G/T D = A/G/T I = イノシトール カレンドラの一本鎖cDNA（実施例１記載の方法で調製）を鋳型に用いたPCRに
て、プライマーAおよびBを用いて470bpの長さのDNA断片を増幅した。その際、次
のPCRプログラムを用いた： 1. 2分 94℃ 2. 30秒 94℃ 3. 45秒 50℃（アニーリング温度） 4. 1分 72℃ 2.から4.を10回 5. 0秒 94℃ 6. 45秒 50℃ 7. 1分 72℃、サイクル毎に5秒づつ時間を増やした 5.から7.を20回 8. 2分 72℃ Biozym(Hess. Oldendorf)のTfI DNAポリメラーゼを、増幅のために用いた。該
470bp DNA断片を、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA)を利用し
て、ベクターpCR 2.1-TOPOへクローン化し、配列を決定した。該470bp DNA断片
の配列は、配列番号１の466から893のヌクレオチド配列に一致した。
【００８１】実施例3：完全なcDNAクローンの取得および配列決定 完全長のクローンを得るために、上記断片を5’-および3’-RACE法(cDNA末端
迅速増幅法)により伸長させた。1μgのmRNA（実施例1記載の方法で単離）から開
始し、”Marathon cDNA Amplification Kit”(CLONTECH (Heiderberg))を利用し
て、二本鎖cDNAを調製した。アダプターを結合させた後、5’-および3’-RACE法
を次のプライマーを利用して行った： 5’-RACE法に用いる特異的なプライマー プライマーC 5’ - GTG AGG GAG TGA GAG ATG GGT GTG GTG C - 3’ プライマーD 5’ - AAC ACA CTT ACA CCT AGT ACT GGA ATT G - 3’ 3’-RACE法に用いる特異的なプライマー プライマーE 5’ -TAT TCC AAA CTT CTT AAC AAT CCA CCC G - 3’ プライマーF 5’ - CAA TTC CAG TAC TAG GTG TAA GTG TGT T - 3’ まず、アダプターを結合させた二本鎖cDNAとプライマーCまたはEとでPCR反応
を行った。次に、鋳型としてプライマーCまたはEを用いたPCR反応の産物を1:50
で希釈したものと共に、プライマーDまたはFを用いて第２のPCR反応を行った。
【００８２】 RACE-PCR反応は、次のプログラムを用いて行った： 1. 1分 94℃ 2. 30秒 94℃ 3. 45秒 68℃ 2.から3.を10回 4. 30秒 94℃ 5. 30秒 65℃ 6. 3分 68℃ 4.から6.を25回 7. 5分 68℃ 得られたDNA断片を、TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA)を利
用して、ベクターpCR 2.1-TOPOへクローン化し配列を決定した。5’-RACE法の産
物は、開始コドンを越えて5’-非翻訳領域(5’-UTR)まで伸長しており、3’-RAC
E法では、停止コドンを越えて3’-UTRまで伸長していた。
【００８３】 最初のPCR産物とRACE法の産物とからなる複合配列を、配列番号１に示した。
コード領域は、ヌクレオチド42(開始コドン)から1175（停止コドン）まで伸長し
ている。5’-および3’-UTRは、一本鎖でしか配列決定されなかった。したがっ
て、ここでは個別に配列決定の失敗があった可能性がある。
【００８４】 切れ目の無い完全長のクローンを得るために、Expand High Fidelity System
(Boehringer, Mannheim)とプライマーGおよびHを用い、カレンドラのcDNA(実施
例1参照)を鋳型としてPCR反応を行った。
【００８５】 プライマーG: 5’ - ATTAGAGCTCATGGGTGCTGGTGGTCGGATGTCG - 3’ フォワードプライマー（SacI切断部位を有する） プライマーH: 5’ - ATTACTCGAGTGACATACACCTTTTTGATTACATCTTG - 3’ リバースプライマー（XhoI切断部位を有する） PCR反応は、次のプログラムを用いて行った： 1. 2分 94℃ 2. 30秒 94℃ 3. 35秒 63℃ 4. 2分 72℃ 2.から4.を10回 5. 30秒 94℃ 6. 35秒 63℃ 7. 2分 72℃、サイクル毎に5秒づつ時間を増やした 5.から7.を15回 8. 2分 72℃ 1.2kbのPCR産物を、ベクターpGEM-T (Promega, Mannheim)へクローン化し、大
腸菌DH10Bへトランスフォームした。挿入したDNAは、373 DNAシークエンサー(Ap
plied Biosystems)を用いて、二本鎖の状態で配列決定した。この目的のために
、リバースプライマーおよび -21プライマーのほかに、次の配列特異的プライマ
ーを用いた： プライマーI: 5’ - CGG TCT TCT CGC TGT ATT - 3’ プライマーJ: 5’ - ATT ACC CAA GCT GCC C - 3’ カレンドラ酸デサチュラーゼ(CalDes)の完全なDNA配列は、配列番号１のヌク
レオチド42から1193までの部分と一致する。この配列は、コード領域および3’-
UTRの短い部分を含む。
【００８６】 SWISS-PROTおよびSP-TREMBLデータベースの注釈付きの(annotated)タンパク質
配列を使って導かれたCo-CalDes(配列番号２)のアミノ酸配列の比較を行ったと
ころ、コード領域全体では、Crepis alpinaのΔ12-アセチレナーゼ(SP_PL: 0819
31, 74%のアミノ酸が同一)、Crepis palaestinaのΔ12-エポキシゲナーゼ(SP_PL
: 065771, 73%のアミノ酸が同一)、およびBorago officinalisのΔ12-デサチュ
ラーゼ(SP_PL: 082729, 62%のアミノ酸が同一)が最も高い相同性を示した。配列
の比較は図２に示した。図２は、Co-CalDesと、Crepis alpinaのΔ12-アセチレ
ナーゼ(Ca-Acetyl)、Crepis palaestinaのΔ12-エポキシゲナーゼ(Cp-Epoxy)、
およびBorago officinalisのΔ12-デサチュラーゼ(Bo-Des)とのアミノ酸配列の
比較を示した。
【００８７】実施例4: 酵母中でのカレンドラ酸デサチュラーゼの発現 第一のアプローチとして、cDNAのコード領域を酵母の発現ベクターにクローン
化し、S. cerevisiae中で発現させて、CalDesの機能を確認した。酵母中で作ら
れたカレンドラ酸デサチュラーゼは添加したリノール酸をカレンドラ酸に変換さ
せ得た。なお、カレンドラ酸は加水分解した脂質抽出物中にHPLCにより確認する
ことができた。
【００８８】 第二のアプローチとして、酵母においてCalDesに加えてA. thalianaのΔ12-デ
サチュラーゼ（Kajiwaraら, Appl. Environ. Microbiol., 62, 1996: pp.4309-4
313）を発現させた。それにより、酵母細胞は内部においてリノール酸を生産で
き、そのリノール酸はCalDesの活性によりカレンドラ酸へ変換され得た。なお、
カレンドラ酸はHPLCにより確認することができた。
【００８９】 酵母用の固体および液体培地は全て、Ausubelらのプロトコール(Current Prot
ocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1995)により調製
した。
【００９０】 CalDesのcDNAをSacI/XhoIを用いた制限酵素による切断によってベクターpGEM-
Tから切り出し、SacI/XhoIで切断したシャトルベクターpYES2(Invitrogen, Carl
sbad, USA)へとクローン化した。そして、得られたベクターpYES2-CalDesを大腸
菌XL1 blueへとトランスフォームした。Plasmid Maxi Kit (QIAGEN)を使って別
のプラスミドを調製した後、ポリエチレングリコール法(Von Pein M., 博士論文
, Heinrich Heine大学, デュッセドルフ, 1992)により、pYES2-CalDesをS. cere
visiae INCSv1 (Invitrogen, Carlsbad, USA)へとトランスフォームした。ここ
で、CalDesのcDNAの発現はGAL1プロモーターの制御下にあった。
【００９１】 第二のアプローチにおいて、CalDesだけでなくFAD2も酵母にて発現させるため
に、まずFAD2遺伝子のコード領域を、TfIポリメラーゼ(Biozym)を利用して、A.
thalianaのcDNAからPCR反応(プライマーGとHのプロトコール参照)により増幅さ
せた。この目的のために、次のプライマーを用いた： プライマーK: 5’ - AAACTCGAGATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCCGG - 3’ フォワードプライマー(XhoI切断部位) プライマーL: 5’ - AAAAAGCTTTCATAACTTATTGTTGTACCAGTACACACC - 3’ リバースプライマー(HindIII切断部位) 得られたPCR産物をXhoI/HindIIIを用いて制限酵素により切断し、XhoI/HindII
Iで切断した酵素発現ベクターpESC-Leu (Stratagene)へクローン化した。ここで
、FAD2のDNAはGAL1プロモーターの制御下にあった。
【００９２】 S. cerevisiae INCSv1でのCalDesの発現は、Averyら(Appl. Environ. Microbi
ol., 62, 1996: pp.3960-3966)およびGirkeら(The Plant Journal, 5, 1998: pp
.39-48)の方法の改変法を利用して行った。種菌の準備のため、10mlのYPAD培地
に単一のコロニーを植菌し、その培地を30℃、200rpmにて48時間培養した。そし
て、その細胞培養物を1倍量の糖を含まないYPA培地で洗浄し、遠心分離した。ペ
レット状に固まった細胞を添加物および糖を含まない2mlの最少培地中で再び懸
濁させた。100mlの最少培地（ドロップアウト培地粉末、2%のラフィノース、1%
のテルジトール(Tergitol)NP40）へ500ml容エルレンマイヤーフラスコ中にて、1
mlのこの細胞懸濁液を植菌し、30℃、200rpmにて増殖させた。OD600が0.5の時点
で、2%(w/v)のガラクトースを添加し、（最初のバッチの場合はさらに、）0.003
%のリノール酸（５％テルジトールNP40中に３％リノール酸の濃厚溶液）を加え
た。細胞は、定常状態に達するまで増殖させた。その後、添加物を含まない最少
培地で洗浄し、-20℃で保存した。
【００９３】実施例5:脂質の抽出とトランスジェニック酵母から得られた脂肪酸のHPLC分析 酵母細胞は、30mlのHIP溶液(ヘキサン：イソプロパノール（3:2 (v/v)）中の0
.1mMの2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルフェノール)に懸濁させ、150μlの濃塩酸で
酸性にし、Ultra-Turrax（1分間、24,000rpm）でホモゲナイズした。そしてこの
サンプルを4℃にて10分間振とうし、5,000g、4℃にて10分間遠心分離した。上清
は新しい容器に移し、0.38MのK2SO4にて47.5mlにした。そしてこのサンプルを4
℃にて10分間振とうし遠心分離（上記）した。ヘキサン層を取り出し、窒素気流
下で乾燥するまで留去した。残留物を20μlのクロロホルムに溶解した。脂肪酸
エステルのアルカリ加水分解のために、400μlのメタノールと80μlの40%濃度KO
H(w/v)溶液を加え、このサンプルを60℃にて20分間アルゴン下でインキュベート
した。続いて、室温まで冷却し、35μlの濃塩酸でpH3.0へ酸性化し、HPLCにより
分離した。
【００９４】 遊離脂肪酸は、ET 250/4 Nucleosil 120-5 C18-カラム（Macherey & Nagel）
を用いて分離した。用いた移動相は、メタノール：水：氷酢酸 (85:15:0.1 v/v/
v)であった。分離は流速1ml/分、25℃で行い、268nmの吸収を測定して共役トリ
エンを検出した。
【００９５】 図３は、トランスフォームした酵母細胞から抽出された脂質のアルカリ加水分
解後の溶出パターン（図3B: A. thaliana FAD2のDNAでトランスフォームしたS.
cerevisiae INCSv1の溶出パターン、図3C:カレンドラのpYES2-CalDesでトランス
フォームしたS. cerevisiae INCSv1の溶出パターン）と、カレンドラ酸の標準物
質の溶出パターン（図3A）を示している。カレンドラ酸の保持時間は12分であり
共役トリエンに特徴的な268nmの強い吸収をもつ。ブランクのベクターpYES2でト
ランスフォームし0.003%のリノール酸と共に培養した酵母細胞の加水分解した抽
出脂質では、カレンドラ酸の保持時間をもつ脂肪酸は認められなかった（図なし
）。同様にまた、FAD2遺伝子を発現させた酵母細胞の加水分解した抽出脂質にお
いても、カレンドラ酸は含まれていなかった（図3B）。
【００９６】 一方、0.003%のリノール酸と共に培養した、pYES2-CalDesでトランスフォーム
した酵母細胞の抽出物のHPLC分析では、カレンドラ酸の保持時間を持つシグナル
が認められた（図3C）。そしてこのシグナルは、268nmに最大の吸収があり、258
および282nmに次に大きな吸収がある標準物質と同じ吸収スペクトルを示した（
図4A：標準物質、図4C: カレンドラのpYES2-CalDesでトランスフォームしたS. c
erevisiae INCSv1の溶出物）。この結果から、カレンドラ酸デサチュラーゼを酵
母中で発現させると、カレンドラ酸が生合成されることが示された。トランスフ
ォームした酵母細胞からのカレンドラ酸は、脂質の加水分解後にしか検出できな
かった。これらの細胞の遊離脂肪酸の中にはカレンドラ酸は検出されなかった。
したがって、酵母ではカレンドラ酸は脂質中に組み込まれているといえる。酵母
はトリアシルグリセライドを含んでいないため、検出されたカレンドラ酸は酵母
のリン脂質に結合していたものであることが推測される。
【００９７】 また、FAD2とCalDesとを同時に発現させたトランスジェニック酵母の抽出脂質
にもカレンドラ酸は含まれていた（図なし）。
【００９８】実施例6: Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）およびLinum usitatissimum （アマ）でのカレンドラ酸デサチュラーゼの発現 カレンドラのカレンドラ酸デサチュラーゼをトランスジェニック植物において
発現させることは、これらの植物中でのカレンドラ酸含有量を高めるのに有利で
ある。この目的のために、CalDesのcDNAをバイナリーベクターにクローン化し、
アグロバクテリウムにより仲介されるDNAの運搬により、A. thalianaおよびL. u
sitatissmiumへと運搬した。CalDesのcDNAの発現は、構成性のCaMV 35S プロモ
ーターまたは種子特異的なUSPプロモーターにより制御された。
【００９９】 発現ベクターには、ベクターpBinAR (HofgenおよびWillmitzer, Plant Scienc
e, 66, 1990: pp.221-230)およびpBinARの誘導体であるpBinAR-USP（CaMV 35S
プロモーターがソラマメUSPプロモーターへ換えられている）を利用した。再度
クローン化するために、CalDesのcDNAをベクターpGEM-Tから切出す必要があった
。そのために、まずベクターpGEM-TをNcoIにより切断し、クレノウを用いて平滑
末端にした。続いて、その挿入断片をSalIで切断し、SmaI/SalIで切断したベク
ターpBinARおよびpBinAR-USPへクローン化した。
【０１００】 得られたプラスミドであるpBinAR-CalDesおよびpBinAR-USP-CalDesを、アグロ
バクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)にトランスフォームした(Hofgenおよ
びWillmitzer, Nucl. Acids Res. 16, 1988: 9877)。シロイヌナズナは「floral
dip」法（CloughおよびBent, Plant Journal, 16, 1998: pp.735-743）により
トランスフォームし、アマは、アマ種子の胚軸の断片とトランスフォームしたア
グロバクテリウムの細胞とを一緒に培養することによりトランスフォームした。
【０１０１】 トランスジェニックしたシロイヌナズナおよびアマ植物におけるCalDes遺伝子
の発現は、ノーザンブロット分析により調べた。植物の一部を選択し、種子の油
脂中でのカレンドラ酸の含量を調べた。
【０１０２】 CalDesを種子特異的に発現させるために、USPプロモーターに類似したナピン
プロモーターを使用することも可能である。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】カレンドラ酸デサチュラーゼの反応触媒機構
【図２】Calendula officinalisのカレンドラ酸デサチュラーゼ(Co-CalDes)と、
Crepis alpinaのΔ12-アセチレナーゼ(Ca-Acetyl)、Crepis palaestinaのΔ12-
エポキシゲナーゼ(Cp-Epoxy)、およびBorago officinalisのΔ12-デサチュラー
ゼ(Bo-Des)とのアミノ酸配列の比較
【図３】トランスフォームした酵母細胞から抽出された脂質のアルカリ加水分解
後のHPLC溶出パターン
【図４】カレンドラ酸の吸収スペクトル
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１０月３１日（２００１．１０．３１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【化１】 を、共役した３個の二重結合をもつ構造IIのトリ不飽和脂肪酸、
【化２】 （構造Iおよび構造IIの化合物において、置換基および変数は下記の意味を有す
る。 すなわち： R1は、水素、置換されたかもしくは無置換の不飽和もしくは飽和で分岐したかも
しくは分岐していないC1-C10-アルキル、または、
【化３】 であり、 R2は、置換されたかもしくは無置換で不飽和もしくは飽和のC1-C9-アルキルであ
り、 R3およびR4は、相互に独立して、水素、置換されたかもしくは無置換の飽和もし
くは不飽和で分岐したかもしくは分岐していないC1-C22-アルキルカルボニル、
または、リン酸基、であり、 nは、1〜14である。） へと変換する酵素。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 9/02 5/10 Ｃ１２Ｐ 7/64 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 7/64 5/00 Ｂ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フリッチェ，カトリン ドイツ連邦共和国 ディー−6811 ハーエ ン アルンヘム， ローデンブルグシュト ラート 65 (72)発明者 パイツシュ，ニコラ ドイツ連邦共和国 ディー−39118マグデ ブルグ，ヴェー．−ゼーレンビンダー−シ ュトラーセ 34 (72)発明者 レンツ，アンドレアス ドイツ連邦共和国 ディー−67117 リン バーガーホフ，ハインリッヒ−フォン−ク ライスト−シュトラーセ ６ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD08 CA17 CA19 CB03 CD07 CD09 CD10 4B024 AA01 AA05 AA08 BA08 BA79 BA80 CA04 DA01 4B050 CC03 DD13 LL01 LL02 LL05 4B064 AD88 CA06 CA11 CA19 CC24 DA06 DA10 4B065 AA11X AA80X AA88X AA89X AA89Y AB01 BA02 BB10 CA13 CA28 CA41 CA43 CA53

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の群、 a)配列番号１に示す配列を有する核酸配列、 b)配列番号１に示す核酸配列から、遺伝子コードの縮重の結果として導かれる核
    酸配列、 c)配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、当該ポリペ
    プチドの酵素活性を実質的に低下させることのない、アミノ酸のレベルで少なく
    とも75％の相同性を有する、配列番号１に示す核酸配列の誘導体、 より選択される、デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離さ
    れた核酸配列。
  2. 【請求項２】請求項１に記載の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列。
  3. 【請求項３】配列番号１に示す配列によりコードされる、請求項２に記載のアミ
    ノ酸配列。
  4. 【請求項４】核酸配列が１個以上の制御シグナルに結合した請求項１に記載の核
    酸配列を含む核酸構築物。
  5. 【請求項５】請求項１に記載の核酸配列、または、請求項４に記載の核酸構築物
    を含むベクター。
  6. 【請求項６】少なくとも１個の請求項１に記載の核酸配列、または、少なくとも
    １個の請求項４に記載の核酸構築物を含む生物。
  7. 【請求項７】植物、微生物、または動物である、請求項６に記載の生物。
  8. 【請求項８】機能性もしくは非機能性の請求項１に記載の核酸配列、または、機
    能性もしくは非機能性の請求項４に記載の核酸構築物を含むトランスジェニック
    植物。
  9. 【請求項９】少なくとも１個の請求項１に記載の核酸配列、もしくは、少なくと
    も１個の請求項４に記載の核酸構築物の、油脂生産性生物への導入、当該生物の
    育成、当該生物に含まれる油脂の単離、および当該油脂に含まれる脂肪酸の遊離
    、を含む不飽和脂肪酸の製造方法。
  10. 【請求項１０】少なくとも１個の請求項１に記載の核酸配列、もしくは、少なく
    とも１個の請求項４に記載の核酸構築物の、油脂生産性生物への導入、当該生物
    の育成、当該生物に含まれる油脂の単離、を含む不飽和脂肪酸の含量を高めたト
    リグリセライドの製造方法。
  11. 【請求項１１】少なくとも１個の非機能性の請求項１に記載の核酸配列、もしく
    は、少なくとも１個の非機能性の請求項４に記載の核酸構築物の、油脂生産性生
    物への導入、当該生物の育成、当該生物に含まれる油脂の単離、および当該油脂
    に含まれる脂肪酸の遊離、を含む飽和脂肪酸の製造方法。
  12. 【請求項１２】少なくとも１個の非機能性の請求項１に記載の核酸配列、もしく
    は、少なくとも１個の非機能性の請求項４に記載の核酸構築物の、油脂生産性生
    物への導入、当該生物の育成、当該生物に含まれる油脂の単離、を含む飽和脂肪
    酸の含量を高めたトリグリセライドの製造方法。
  13. 【請求項１３】不飽和脂肪酸が、高いカレンドラ酸(calendulic acid)の含量を
    有する、請求項９または１０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】生物が、植物もしくは微生物である、請求項９〜１２のいずれか
    に記載の方法。
  15. 【請求項１５】請求項９に記載の方法により製造される不飽和脂肪酸。
  16. 【請求項１６】請求項１０に記載の方法により製造される、不飽和脂肪酸の含量
    を高めたトリグリセライド。
  17. 【請求項１７】請求項１１に記載の方法により製造される飽和脂肪酸。
  18. 【請求項１８】請求項１２に記載の方法により製造される、飽和脂肪酸の含量を
    高めたトリグリセライド。
  19. 【請求項１９】請求項１に記載の核酸配列、または、請求項4に記載の核酸構築
    物の、トランスジェニック植物を作り出すための利用。
  20. 【請求項２０】請求項１に記載の核酸配列、または、その断片の、相同性スクリ
    ーニングによりゲノム配列を単離するための利用。
  21. 【請求項２１】請求項１５もしくは１７に記載の不飽和もしくは飽和脂肪酸、ま
    たは、請求項１６もしくは１８に記載の不飽和もしくは飽和脂肪酸の含量を高め
    たトリグリセライドの、食品、動物飼料、化粧品、または医薬品の製造のための
    利用。
  22. 【請求項２２】メチレン基によってお互いが隔離された２個の二重結合をもつ構
    造Iの脂肪酸、 【化１】 を、共役した３個の二重結合をもつ構造IIのトリ不飽和脂肪酸、 【化２】 （構造Iおよび構造IIの化合物において、置換基および変数は下記の意味を有す
    る。 すなわち： R1は、水素、置換されたかもしくは無置換の不飽和もしくは飽和で分岐したかも
    しくは分岐していないC1-C10-アルキル、または、 【化３】 であり、 R2は、置換されたかもしくは無置換で不飽和もしくは飽和のC1-C9-アルキルであ
    り、 R3およびR4は、相互に独立して、水素、置換されたかもしくは無置換の飽和もし
    くは不飽和で分岐したかもしくは分岐していないC1-C22-アルキルカルボニル、
    または、リン酸基、であり、 nは、1〜14である。） へと変換する酵素。
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